WO2021144487A1 - Material nanoestructurado con propiedades interferométricas para la detección visual de ensayos de bioreconocimiento sin marcaje - Google Patents

Material nanoestructurado con propiedades interferométricas para la detección visual de ensayos de bioreconocimiento sin marcaje Download PDF

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WO2021144487A1
WO2021144487A1 PCT/ES2021/070009 ES2021070009W WO2021144487A1 WO 2021144487 A1 WO2021144487 A1 WO 2021144487A1 ES 2021070009 W ES2021070009 W ES 2021070009W WO 2021144487 A1 WO2021144487 A1 WO 2021144487A1
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biosensor according
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PCT/ES2021/070009
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José Miguel Avellà Oliver
Gabriel Sancho Fornes
Javier Carrascosa Rubio
Ángel MAQUIEIRA CATALA
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Universidad Politecnica de Valencia
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Universidad Politecnica de Valencia
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention refers to a biosensor that allows chemical and biochemical analyzes to be carried out and their result determined by direct visual detection, without using labels (label-free) and without requiring any type of instrumentation.
  • the material is made up of a layer of bioreceptors that selectively interact with the analytes, and that is arranged on an interferometric layer deposited on a substrate. The incubation of samples on the material generates changes in its interferometric response, which are translated into color changes that are directly visible visually under illumination with natural or artificial light, and whose magnitude depends on the concentration of the analyte present in the sample.
  • Biosensors are chemical and biological analysis devices based on generating a response (signal) due to a biointeraction. They are characterized by their sensitivity and selectivity, and are generally designed to be simple, compact, portable, fast and inexpensive.
  • One of the key objectives of biosensors is to allow obtaining analytical results at the same time and place in which they are required, by non-specialized users, which is known as point of care. This gives them great potential in a multitude of fields such as clinical diagnosis, food safety and agri-food control, among others.
  • Some paradigmatic examples of biosensors with great commercial repercussion are the glucometer and the human fertility test.
  • patent EP0727038B1 describes methods for analyzing an optical surface for an analyte of interest in a sample and related instruments. The method involves the use of a thin film optical immunoassay device whereby an analyte of interest is detected in a sample through spectral changes in light affecting the surface before and after binding of the analyte to the layers of reactive substrate.
  • the device includes a substrate that has a first color in response to light striking it.
  • document WO9403774A1 belonging to the same family claims a tool to detect the presence of a certain analyte, as well as to measure its concentration. The result can be determined by a color change detectable with the naked eye or by devices designed for this purpose.
  • This utensil is made up of a multilayer structure. The outermost layer contains molecules capable of binding to the analyte. The inner layers have such optical characteristics that they will show a color change in the presence of bound analyte.
  • Maier Irene et al. (Anal. Chem., 2008, 80 (8), 2694-2703) describe biosensor chips, which are used for the detection of a certain analyte.
  • the chips comprise a support containing gold nanoparticles.
  • On this layer there is another one that contains biomolecules capable of recognizing and binding the analyte. This union results in a color change on the chip, which can be seen with the naked eye.
  • the present invention consists of a material that allows chemical and biological tests to be carried out and to detect the result through color changes directly observable with the eye, without the need for marking, without requiring any type of instrumentation for the process of analysis, and being the material manufacturable on an industrial scale.
  • These capabilities result in a simple and portable biosensor, well suited for point of care applications where end users perform chemical and biochemical analyzes in a single step (incubating the sample on the material) and visually determine the result by color change.
  • the present invention comprises a substrate on which an interferometric layer is arranged, on which a recognition layer composed of bioreceptors is immobilized for the recognition of analytes.
  • the present invention refers to a biosensor that allows the direct visual detection of analytes in a sample, comprising: i) A substrate (a) that acts as a support for the interferometric layer (b), which is made of steel; ii) An interferometric layer (b) consisting of one or more superimposed films, with an arrangement designed to generate constructive and / or destructive interferometric phenomena in the visible range and to modify this interferometric response depending on the properties (thickness, index of refraction, density, etc.) of the recognition layer; iii) A recognition layer (c) composed of biological receptors that bind to the last film of the interferometric layer (b), and that specifically recognize the analytes present in the sample.
  • the substrate (a) is a solid material, typically flat, which acts as a support for the interferometric layer (b).
  • the thickness of the substrate layer (a) is between 50 microns and 5 millimeters, and more preferably between 500 microns and 1.2 millimeters.
  • the substrate (a) consists of a polycarbonate sheet, and more preferably a polycarbonate sheet with a thickness of between 100 microns and 3 millimeters, and even more preferably a polycarbonate sheet of 600 pm thickness.
  • the interferometric layer (b) is constituted by one or more superimposed films that independently consist of a material that is selected from among metals, alloys, metallic compounds, silicon, and silicon compounds; provided that when the substrate (a) of the biosensor and the first film of the interferometric layer (b) consist of a metal, these metals are different.
  • the metals of one or more of the films of the interferometric layer (b) are selected from gold, silver, platinum and chromium. In a more preferred embodiment the metal is gold.
  • the bottom gold film is omitted.
  • the alloys of one or more of the films of the interferometric layer (b) are selected from Ni-Va, Ni-Fe, Ni-Cr, Fe-Co, Fe-Co-Ta-Zr, Co- Ta-Zr, Cu-Ga, Cu-ln, Cu-ln-Ga, Ti-AI, Ai-Cu, Al-Sn-Cu and W-Ti.
  • the alloy consists of Ag-ln-Sb-Te.
  • the metal compounds of one or more of the films of the interferometric layer (b) are selected from zinc sulphide, titanium oxide, germanium oxide, phosphorous oxide, boron oxide and tantalum pentoxide. In a more preferred embodiment the metal compound is zinc sulfide. In another preferred embodiment, the silicon compounds of one or more of the films of the interferometric layer (b) are selected from silicon oxide, silicon nitride, and quartz.
  • the arrangement of the different films that comprises the interferometric layer (b) is designed to generate constructive and / or destructive interferometric phenomena in the visible range, and to modify this interferometric response as a function of the properties (thickness, refractive index, density, etc.) of the recognition layer (c).
  • the films that make up the interferometric layer (b) generate destructive interferometric phenomena, and consist of a 50 nm film of gold, followed by a 60 nm film of zinc sulfide, followed by a film of 15 nm of the Ag-ln-Sb-Te alloy, followed by a 65nm zinc sulphide film, and finally a 5nm gold film.
  • the films that make up the interferometric layer (b) generate constructive interferometric phenomena, and consist of a 50 nm film of gold, followed by an 85 nm film of zinc sulfide, followed by a film of 20 nm of the Ag-ln-Sb-Te alloy, followed by an 85 nm zinc sulfide film, and finally a 5 nm gold film.
  • configurations of constructive interferometric materials together with destructive interferometric materials are used in combination, in the same test, and the signals of both systems are considered in order to increase the reliability of the results.
  • the biological receptors of the recognition layer (c) are selected from among antibodies, enzymes, other proteins, nucleic acids, molecular imprinting polymers, polysaccharides, protein-hapten complexes, bacteria, viruses and tissues.
  • the arrangement of the biological receptors on the interferometric layer can be carried out through covalent anchoring processes or through physisorption.
  • the recognition layer (c) can be arranged over the entire surface of the interferometric layer (b), or in discrete portions thereof.
  • a recognition layer (c) made up of a monolayer of specific antibodies covalently immobilized on the interferometric layer is used to detect protein analytes in biological samples.
  • the recognition layer (c) consists of a monolayer of proteins immobilized by physisorption, to detect specific antibodies present in the samples.
  • the recognition layer (c) is arranged according to a microarray structure, in which each site contains different biological receptors to determine multiple analytes in a sample.
  • these microarray-type assays are grouped into sets of three points (assay, positive control, and negative control) and the resulting combination is considered to evaluate the result of the analysis.
  • analyte refers to a substance or group of substances whose presence or concentration is to be determined in the sample.
  • examples of analytes include, but are not limited to, organic molecules, biomacromolecules (proteins, enzymes, antibodies, nucleic acids, carbohydrates, etc.), and microorganisms (bacteria, viruses, cells), among others.
  • these analytes can be drugs, metabolites, biomarkers, allergens, drugs, phytosanitary, pollutants, pathogens, chemical and biological weapons, allergens, etc.
  • alloy refers to a combination or mixture of two or more chemical elements, where at least one of which is a metal.
  • Another aspect of the invention is a procedure for obtaining the biosensor of the invention that comprises the following steps: i) Design of the films that make up the substrate (a) and the interferometric layer (b) from theoretical calculations based on the equations Fresnel; ii) Preparation of the multilayer structure of the interferometric layer (b) by sputtering the films that make it up; iii) Immobilization of bioreceptors by covalent anchorage or by physisorption on the surface of the interferometric layer (b), forming the recognition layer (c).
  • a sample is incubated on the recognition layer of the material.
  • the bioreceptors interact with the analytes present in the sample, which generates a change in the amount of matter that constitutes the recognition layer. This change modifies the interferometric response of the material and results in a visually detectable color change, the magnitude of which depends on the concentration of the analyte in the sample.
  • a third aspect of the invention is a method for detecting analytes that comprises the following steps: i) Contacting the biosensor of the invention with the sample to be analyzed; ii) Incubate said sample on the biosensor of the invention; and iii) Visually evaluating the color change of the recognition layer (c) of the biosensor after removing the solution.
  • these three stages can be carried out in parallel on points made up of different bioreceptors, so that a microarray made up of groups of three points is obtained, with a point dedicated to the test of interest of According to the process described above, another point as a negative control, and a third as a positive control.
  • Fig. 1 Diagram of the superimposed film configuration that constitutes the interferometric layer with destructive configuration (I) and constructive (II), including the substrate and the recognition layer.
  • Fig. 2. Scheme of a biosensor of interferometric material with destructive (I) and (II) constructive configurations, both with a receptor microarray, after incubating samples with different analyte concentrations. In these schemes the highest concentration of analyte has been incubated at the point located in the upper left corner, this concentration decreases sequentially point by point towards the right (first) and downwards (second), the least concentrated point being that of the lower left corner, with a concentration of 0 pg / rnL.
  • Fig. 3. Scheme of the test configuration to quickly and intuitively discriminate false positives and false negatives by means of tests in microarray format, in interferometric materials with destructive and (II) constructive configuration (I).
  • the thickness of each of the material's films is simulated and optimized to obtain the desired response in recognition tests carried out on the surface of the outermost layer of the material.
  • These theoretical calculations use Fresnel equations, calculate the variations in intensity of reflected light at a given wavelength, and consider the thickness and refractive index of each film, together with the changes generated by varying the thickness of the recognition layer. 0 to 20 nanometers (taking a refractive index of 1.47). From these results, the multilayer configurations to be manufactured are selected.
  • 1.5 x 1.2 cm chips are first cut from 600 ⁇ m thick polycarbonate sheets, using a numerical control milling machine. These chips are cleaned with ethanol, distilled water, and blown dry.
  • the chips are then coated with the different layers that make up the material, one by one and sequentially, using sputtering equipment (ultra-high vacuum magnetron) and a particular target for each deposited material.
  • sputtering equipment ultra-high vacuum magnetron
  • the Layer thicknesses during fabrication are characterized by X-ray reflectometry / diffractometry, refractive indices by ellipsometry, and the resulting multilayer structures by FIB-FESEM.
  • a 600 pm thick polycarbonate sheet is used as the substrate, on which an interferometric layer consisting of a 50 nm film of gold, followed by a 60 nm film of gold, is deposited by sputtering. zinc sulfide, followed by a 15 nm film of Ag-ln-Sb-Te alloy, followed by a 65 nm zinc sulfide film, and finally a 5 nm film of gold.
  • This configuration is designed to generate a destructive interferometric response to recognition tests, so that the material interacts with white light and reflects a light purple color that changes to a deep blue color in positive tests.
  • the biosensing capacity of these materials was experimentally demonstrated with an immunochemical model system based on BSA protein (bovine serum albumin) as a bioreceptor, and specific anti-BSA immunoglobulins G as analytes.
  • BSA protein bovine serum albumin
  • specific anti-BSA immunoglobulins G as analytes.
  • the receptor was immobilized by passive adsorption on the upper gold surface, according to a microarray arrangement (12 dots per chip, ⁇ 1mm diameter per dot).
  • a solution containing the analyte was incubated on the material, and the color change was visually assessed after removal of the solution.
  • Figure 2 (I) shows the schematic of a chip after incubating the analyte (anti-BSA IgG) at different concentrations on the points of a microarray in which the receptor (BSA) has been immobilized.
  • the expected color change from purple to blue is observed, detectable directly with the eye for positive tests.
  • All the individuals surveyed were able to identify as positive the four most intense analyte concentrations analyzed in this experiment (upper row of the microarray), which represents a detection limit of around 30 pg / mL of analyte for this immunochemical system and this configuration of the material.
  • This invention allows the visual detection of analytical tests, in a single stage, without marking and without the need for any type of instrumentation for the analysis process.
  • this invention is compatible with a strategy that makes it possible to increase in a very simple way the reliability of the results obtained by direct visual detection.
  • This strategy consists of creating microarrays made up of groups of three points, with one point dedicated to the test of interest, another point as a negative control, and a third as a positive control. In this way, as shown in Figure 3 (I), false negatives and false positives can be discriminated quickly and intuitively.
  • BSA is printed
  • ovalbumin protein is printed
  • positive control an anti-rabbit immunoglobulin antibody is printed (40 pL to 100 pg / mL in carbonate buffer in all cases).
  • Example 3 Biosensor with constructive interferometric response.
  • a 600 pm thick polycarbonate sheet is used as a substrate, on which an interferometric layer consisting of a 50 nm gold film is deposited by sputtering, followed by a film 85 nm zinc sulfide, followed by a 20 nm film of the Ag-ln-Sb-Te alloy, followed by an 85 nm zinc sulfide film, and finally a 5 nm gold film, as shown in Figure 1 (II).
  • This configuration is designed to generate a constructive interferometric response to recognition tests, so that the material interacts with white light and reflects a silver color that changes to red in positive tests, as outlined in Figure 2 (II) .
  • the biosensing capacity of these materials was experimentally demonstrated with an immunochemical model system based on BSA protein (bovine serum albumin) as a bioreceptor, and specific anti-BSA immunoglobulins G as analytes.
  • BSA protein bovine serum albumin
  • specific anti-BSA immunoglobulins G as analytes.
  • the receptor was immobilized by passive adsorption on the upper gold surface, according to a microarray arrangement (12 dots per chip, ⁇ 1mm diameter per dot). Then it A solution containing the analyte was incubated on the material, and the color change was visually assessed after removal of the solution.
  • Figure 2 (II) shows the scheme of a chip after incubating the analyte (anti-BSA IgG) at different concentrations on the points of a microarray in which the receptor (BSA) has been immobilized. The expected color change from silver to red is observed, detectable directly with the eye for positive tests.
  • This invention allows the visual detection of analytical tests, in a single stage, without marking and without the need for any type of instrumentation for the analysis process.
  • this invention is compatible with a strategy that makes it possible to increase in a very simple way the reliability of the results obtained by direct visual detection.
  • This strategy consists of creating microarrays made up of groups of three points, with one point dedicated to the test of interest, another point as a negative control, and a third as a positive control. In this way, as shown in Figure 3 (II), false negatives and false positives can be discriminated quickly and intuitively.
  • Example 4 Detection of the analyte
  • samples dissolved in PBS-T phosphate buffer saline with polysorbate 20
  • PBS-T phosphate buffer saline with polysorbate 20
  • samples dissolved in PBS-T 60-120 microliters of sample are dispensed onto the biosensor.
  • Individual drops can also be incubated on the different spots (1 microliter / spot) to analyze different samples on a single biosensor.
  • the biosensor is washed with PBS-T, followed by water, and dries in a stream of air. The result of the analysis is known by visual inspection of the resulting color at the matrix points.

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Abstract

La presente invención se refiere a un nanomaterial que permite realizar análisis químicos y bioquímicos y determinar su resultado mediante detección visual directa, sin usar marcadores (label-free) y sin requerir ningún tipo de instrumentación. El material está conformado por una capa de bioreceptores que interaccionan selectivamente con los analitos, y que se dispone sobre una capa interferométrica depositada sobre un sustrato. La incubación de muestras sobre el material, genera cambios en su respuesta interferométrica, que se traducen en cambios de color directamente observables visualmente bajo iluminación con luz natural o artificial, y cuya magnitud depende de la concentración del analito presente en la muestra

Description

DESCRIPCIÓN
Material nanoestructurado con propiedades interferométricas para la detección visual de ensayos de bioreconocimiento sin mareaje
La presente invención se refiere a un biosensor que permite realizar análisis químicos y bioquímicos y determinar su resultado mediante detección visual directa, sin usar marcadores (label-free) y sin requerir ningún tipo de instrumentación. El material está conformado por una capa de bioreceptores que interaccionan selectivamente con los analitos, y que se dispone sobre una capa interferométrica depositada sobre un sustrato. La incubación de muestras sobre el material, genera cambios en su respuesta interferométrica, que se traducen en cambios de color directamente observables visualmente bajo iluminación con luz natural o artificial, y cuya magnitud depende de la concentración del analito presente en la muestra.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los biosensores son dispositivos de análisis químico y biológico basados en generar una respuesta (señal) debida a una biointeracción. Se caracterizan por su sensibilidad y selectividad, y generalmente están diseñados para ser simples, compactos, portables, rápidos y económicos. Uno de los objetivos clave de los biosensores es permitir la obtención de los resultados analíticos en el mismo momento y lugar en que éstos son requeridos, por parte de usuarios no especializados, lo que es conocido como point of care. Esto les confiere un gran potencial en multitud de campos como el diagnóstico clínico, la seguridad alimentaria y el control agroalimentario, entre otros. Algunos ejemplos paradigmáticos de biosensores con gran repercusión comercial son el glucómetro y el test de fertilidad en humanos.
La capacidad de los biosensores point of care se encuentra fuertemente comprometida por la complejidad y precio de la instrumentación que involucran estos desarrollos (detectores, fuentes de radiación, baterías, circuitos electrónicos, etc.). Otra cuestión importante en este sentido es reducir al máximo el número de operaciones (diluciones, preparación de muestra, incubaciones, etc.) necesarias para realizar el análisis, con el fin de simplificar al máximo el proceso analítico, así como para minimizar la instrumentación requerida para automatizar los ensayos. En esta línea, los sistemas para detección sin mareaje (label-free) permiten el análisis directo de muestras, evitando así etapas adicionales relacionadas con incubaciones de bioreactivos secundarios marcados y desarrollo de señal. Esto aporta importantes ventajas porque simplifica en gran medida el proceso analítico. Sin embargo, los sistemas label-free suelen basarse en materiales con nanoestructuras no escalables a nivel industrial, así como en instrumentación compleja para medir las biointeracciones.
Se han encontrado artículos que reportan el uso de este tipo de materiales junto con instrumentación específica para cuantificar los cambios interferométricos generados por los eventos de bioreconocimiento (ACS Nano, 2008, 2, 1885-1895; Anal. Chem. 2009, 81 , 4963-4970), destacando que en ambos los desarrollos descritos no contemplan la detección visual directa, sino a través de instrumentación específica. Por otro lado, la patente EP0727038B1 describe métodos para analizar una superficie óptica para un analito de interés en una muestra e instrumentos relacionados. El método implica el uso de un dispositivo de inmunoensayo óptico de película delgada mediante el cual se detecta un analito de interés en una muestra a través de cambios espectrales en la luz que afectan la superficie antes y después de la unión del analito a las capas de sustrato reactivo. El dispositivo incluye un sustrato que tiene un primer color en respuesta a la luz que incide sobre él.
Asimismo, el documento WO9403774A1 perteneciente a la misma familia reivindica un utensilio para detectar la presencia de un determinado analito, así como para medir su concentración. El resultado se puede determinar mediante un cambio de color detectable a simple vista o mediante aparatos destinados a ese fin. Este utensilio está conformado por una estructura multicapa. La capa más externa contiene moléculas capaces de ligar al analito. Las capas internas tienen unas características ópticas tales, que van a mostrar un cambio de color en presencia de analito ligado.
Finalmente, Maier Irene et al. (Anal. Chem., 2008, 80 (8), 2694-2703) describen unos chips biosensores, que se utilizan para la detección de un determinado analito. Los chips comprenden un soporte que contiene nanopartículas de oro. Sobre esta capa existe otra que contiene biomoléculas capaces de reconocer y unirse al analito. Esta unión se traduce en un cambio de color en el chip, que puede observarse a simple vista. Sin embargo, para la detección emplean una configuración interferométrica para amplificar la señal basada en resonancia de plasmón superficial, y además usan un mareaje (nanopartículas coloidales de oro conjugadas a anticuerpos), lo que diferencia este biosensor de la presente invención donde el ensayo de bioreconocimiento genera por sí mismo los cambios de color, sin usar marcadores, gracias al diseño de los materiales interferométricos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Teniendo en cuenta estos antecedentes, la presente invención consiste en un material que permite realizar ensayos químicos y biológicos y detectar el resultado a través de cambios de color observables directamente con el ojo, sin necesidad de mareaje, sin requerir ningún tipo de instrumentación para el proceso de análisis, y siendo el material fabricable a escala industrial. Estas capacidades resultan en un biosensor simple y portátil, muy adecuado para aplicaciones tipo point of care en las que los usuarios finales realicen análisis químicos y bioquímicos en un único paso (incubar la muestra sobre el material) y determinen el resultado visualmente por cambio de color. Así, la presente invención comprende un sustrato sobre el que se dispone una capa interferométrica, sobre la cual se inmoviliza una capa de reconocimiento compuesta de bioreceptores para el reconocimiento de los analitos.
Por lo tanto, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un biosensor que permite la detección visual directa de analitos en una muestra, que comprende: i) Un sustrato (a) que actúa como soporte de la capa interferométrica (b), que es de acero; ii) Una capa interferométrica (b) que consiste en una o varias películas superpuestas, con una disposición diseñada para generar fenómenos interferométricos constructivos y/o destructivos en el intervalo visible y para modificar esta respuesta interferométrica en función de las propiedades (grosor, índice de refracción, densidad, etc.) de la capa de reconocimiento; iii) Una capa de reconocimiento (c) compuesta de receptores biológicos que se fijan a la última película de la capa interferométrica (b), y que reconocen de forma específica a los analitos presentes en la muestra. En una realización preferida el sustrato (a) es un material sólido, típicamente plano, que actúa como soporte de la capa interferométrica (b).
En otra realización preferida el grosor de la capa de sustrato (a) es de entre 50 micrómetros y 5 milímetros, y más preferiblemente de entre 500 micrómetros y 1.2 milímetros.
En otra realización más preferida el sustrato (a) consiste en una lámina de policarbonato, y más preferiblemente en una lámina de policarbonato con un grosor de entre 100 micrómetros y 3 milímetros, y aún más preferentemente una lámina de policarbonato de 600 pm de grosor.
En otra realización preferida la capa interferométrica (b) está constituida por una o varias películas superpuestas que independientemente consisten en un material que se selecciona de entre metales, aleaciones, compuestos metálicos, silicio, y compuestos de silicio; con la condición de que cuando el sustrato (a) del biosensor y la primera película de la capa interferométrica (b) consisten en un metal, estos metales son diferentes.
En otra realización preferida los metales de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se seleccionan de entre oro, plata, platino y cromo. En una realización más preferida el metal es oro.
En otra realización preferente, cuando se emplea como sustrato una lámina de acero pulido, se omite la película inferior de oro. En otra realización preferida las aleaciones de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se seleccionan de entre Ni-Va, Ni-Fe, Ni-Cr, Fe-Co, Fe-Co-Ta-Zr, Co-Ta-Zr, Cu-Ga, Cu-ln, Cu-ln-Ga, Ti-AI, Ai-Cu, Al-Sn-Cu y W-Ti. En una realización más preferida la aleación consiste en Ag-ln-Sb-Te. En otra realización preferida los compuestos metálicos de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se seleccionan de entre sulfuro de zinc, óxido de titanio, óxido de germanio, óxido de fosforo, óxido de boro y pentóxido de tántalo. En una realización más preferida el compuesto metálico es sulfuro de zinc. En otra realización preferida los compuestos de silicio de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se seleccionan de entre óxido de silicio, nitruro de silicio, y cuarzo.
La disposición de las diferentes películas que comprende la capa interferométrica (b) se diseña para generar fenómenos interferométricos constructivos y/o destructivos en el intervalo visible, y para modificar esta respuesta interferométrica en función de las propiedades (grosor, índice de refracción, densidad, etc.) de la capa de reconocimiento (c).
En una realización más preferida, las películas que conforman la capa interferométrica (b) generan fenómenos interferométricos destructivos, y consisten en una película de 50 nm de oro, seguido de una película de 60 nm de sulfuro de zinc, seguido de una película de 15 nm de la aleación Ag-ln-Sb-Te, seguido de una película de sulfuro de zinc de 65 nm, y finalmente una película de 5 nm de oro.
En una realización más preferida, las películas que conforman la capa interferométrica (b) generan fenómenos interferométricos constructivos, y consisten en una película de 50 nm de oro, seguido de una película de 85 nm de sulfuro de zinc, seguido de una película de 20 nm de la aleación Ag-ln-Sb-Te, seguido de una película de sulfuro de zinc de 85 nm, y finalmente una película de 5 nm de oro.
En una realización más preferente se usan de forma combinada, en un mismo ensayo, configuraciones de materiales interferométricos constructivos junto con materiales interferométricos destructivos y se consideran las señales de ambos sistemas con el fin de incrementar la fiabilidad de los resultados.
En otra realización preferida los receptores biológicos de la capa de reconocimiento (c) se seleccionan de entre anticuerpos, enzimas, otras proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de impronta molecular, polisacáridos, complejos proteína-hapteno, bacterias, virus y tejidos.
En otra realización preferida la disposición de los receptores biológicos sobre la capa interferométrica puede realizarse a través de procesos de anclaje covalente o mediante fisisorción. Asimismo, la capa de reconocimiento (c) puede disponerse en la totalidad de la superficie de la capa interferométrica (b), o en porciones discretas de la misma. En una realización más preferida se emplea una capa de reconocimiento (c) constituida por una monocapa de anticuerpos específicos inmovilizados de forma covalente sobre la capa interferométrica, para detectar analitos proteicos en muestras biológicas. En otra realización preferida, la capa de reconocimiento (c) consiste en una monocapa de proteínas inmovilizadas por fisisorción, para detectar anticuerpos específicos presentes en las muestras.
En otra realización preferida, la capa de reconocimiento (c) se dispone según una estructura de micromatriz, en la que cada punto contiene receptores biológicos diferentes para determinar múltiples analitos en una muestra.
En otra realización preferida, estos ensayos tipo micromatriz se agrupan en conjuntos de tres puntos (ensayo, control positivo, y control negativo) y se considera la combinación resultante para evaluar el resultado del análisis.
En la presente invención el término “analito” se refiere a una sustancia o grupo de sustancias cuya presencia o concentración se quiere determinar en la muestra. Ejemplos de analitos incluyen, pero no se limitan a moléculas orgánicas, biomacromoléculas (proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, carbohidratos, etc.) y microorganismos (bacterias, virus, células), entre otros. En cuanto a su función e interés en su determinación, estos analitos pueden ser fármacos, metabolitos, biomarcadores, alérgenos, drogas, fitosanitarios, contaminantes, patógenos, armas químicas y biológicas, agentes alergénicos, etc.
En la presente invención, el término “aleación” se refiere a una combinación o mezcla de dos o más elementos químicos, donde al menos uno de los cuales es un metal.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento de obtención del biosensor de la invención que comprende las siguientes etapas: i) Diseño de las películas que conforman el sustrato (a) y la capa interferométrica (b) a partir de cálculos teóricos basados en las ecuaciones de Fresnel; ii) Preparación de la estructura multicapa de la capa interferométrica (b) mediante depositado por sputtering de las películas que la conforman; iii) Inmovilización de los bioreceptores mediante anclaje covalente o mediante fisisorción sobre la superficie de la capa interferométrica (b), conformando la capa de reconocimiento (c).
Por otro lado, para el proceso de análisis se incuba una muestra sobre la capa de reconocimiento del material. Los bioreceptores interaccionan con los analitos presentes en la muestra, lo que genera un cambio en la cantidad de materia que constituye la capa de reconocimiento. Este cambio modifica la respuesta interferométrica del material y resulta en un cambio de color detectable visualmente, cuya magnitud depende de la concentración del analito en la muestra.
Por lo tanto, un tercer aspecto de la invención es un procedimiento de detección de analitos que comprende las siguientes etapas: i) Poner en contacto el biosensor de la invención con la muestra a analizar; ii) Incubar dicha muestra sobre el biosensor de la invención; y iii) Evaluar visualmente el cambio de color de la capa de reconocimiento (c) del biosensor tras retirar la disolución.
Opcionalmente, con el objetivo de mejorar la fiabilidad del proceso, se pueden realizar en paralelo estas tres etapas sobre puntos constituidos por distintos bioreceptores, de manera que se obtenga una micromatriz conformada por grupos de tres puntos, con un punto dedicado al ensayo de interés de acuerdo con el proceso descrito anteriormente, otro punto como control negativo, y un tercero como control positivo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Esquema de la configuración de películas superpuestas que constituye la capa interferométrica con configuración (I) destructiva y (II) constructiva, incluyendo el sustrato y la capa de reconocimiento. Fig. 2. Esquema de un biosensor de material interferométrico con configuración (I) destructiva y (II) constructiva, ambos con un microarray de receptor, tras incubar muestras con diferentes concentraciones de analito. En estos esquemas la concentración más alta de analito se ha incubado en el punto situado en la esquina superior izquierda, esta concentración disminuye secuencialmente punto a punto hacia la derecha (primero) y hacia abajo (segundo), siendo el punto menos concentrado el de la esquina inferior izquierda, con una concentración de 0 pg/rnL. Fig. 3. Esquema de la configuración de ensayo para discriminar falsos positivos y falsos negativos de forma rápida e intuitiva mediante ensayos en formato de micromatriz, en los materiales interferométricos con configuración (I) destructiva y (II) constructiva.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustra la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Materiales y métodos
En primer lugar, se simula y optimiza el grosor de cada una de las películas del material para obtener la respuesta deseada en ensayos de reconocimiento realizados sobre la superficie de la capa más externa del material. Estos cálculos teóricos utilizan las ecuaciones de Fresnel, calculan las variaciones de intensidad de luz reflejada a una longitud de onda dada, y consideran el grosor e índice de refracción de cada película, junto con los cambios generados al variar el grosor de la capa de reconocimiento de 0 a 20 nanómetros (tomando un índice de refracción de 1 ,47). A partir de estos resultados, se seleccionan las configuraciones multicapa a fabricar. Para fabricar los nanomateriales, se cortan primero chips de 1 ,5 x 1 ,2 cm a partir de planchas de policarbonato de 600 pm de grosor, empleando una fresadora de control numérico. Estos chips se limpian con etanol, con agua destilada y se secan con aire a presión. A continuación, los chips se recubren con las diferentes capas que conforman el material, una a una y de forma secuencial, empleando un equipo de sputtering (magnetrón de ultra alto vacío) y un target particular para cada material depositado. Los grosores de capa durante la fabricación se caracterizan por reflectometría/difractometría de rayos X, los índices de refacción por elipsometría, y las estructuras multicapa resultantes por FIB-FESEM.
Para preparar la capa de reconocimiento sobre la superficie de la capa interferométrica, se imprimen matrices de 4 x 3 gotas de 40 nL de una disolución de bioreceptor, en tampón carbonato, mediante un microimpresor sin contacto, y se incuban 16 horas a 4 eC para que el receptor quede inmovilizado por fisisorción (BSA a 100 pg/mL para el sistema BSA/anti-BSA). Tras la incubación, los biosensores se lavan con tampón PBS- T, se enjuagan con agua y se secan con aire.
Ejemplo 1. Diseño de los materiales
Se seleccionaron soportes planos de policarbonato (600 pm de grosor) como sustrato, por ser un material fabricado a escala industrial de forma muy barata y homogénea. Por otro lado, se eligen películas de oro para la capa interferométrica, por la versatilidad de este metal para inmovilizar bioreceptores, así como su alta reflexividad y fácil deposición en capas nanométricas de grosor controlado. También se selecciona sulfuro de zinc (ZnS) y la aleación Ag-ln-Sb-Te, por ser dos materiales conocidos en el estado del arte que presentan índices de refracción muy distintos y permiten fabricar estructuras que generan las reflexiones multicapa necesarias para la respuesta interferométrica deseada.
Los cálculos teóricos dieron lugar a una capa interferométrica estructurada según la configuración mostrada en la Figura 1.
Ejemplo 2. Biosensor con respuesta interferométrica destructiva
Se fabricaron, por sputtering, chips cuadrados de 1 x 1 cm con la estructura multicapa que se muestra en la Figura 1 (I) y se obtuvieron experimentalmente materiales con la respuesta interferométrica mostrada en la Figura 2(l).
En una realización preferente se emplea como sustrato una lámina de policarbonato de 600 pm de grosor, sobre la que se depositan por sputtering una capa interferómetrica constituida por una película de 50 nm de oro, seguido de una película de 60 nm de sulfuro de zinc, seguido de una película de 15 nm de la aleación Ag-ln-Sb-Te, seguido de una película de sulfuro de zinc de 65 nm, y finalmente una película de 5 nm de oro. Esta configuración se diseña para generar una respuesta interferométrica destructiva frente a ensayos de reconocimiento, de manera que el material interaccione con la luz blanca y refleje un color morado claro que cambie a color azul intenso en ensayos positivos.
Se demostró experimentalmente la capacidad de biosensado de estos materiales con un sistema modelo inmunoquímico basado en la proteína BSA (albúmina de suero bovino) como bioreceptor, e inmunoglobulinas G específicas anti-BSA como analitos. Tras fabricar la capa interferométrica sobre el sustrato, se inmovilizó el receptor por adsorción pasiva sobre la superficie superior de oro, según una disposición de micromatriz (12 puntos por chip, ~1 mm de diámetro por punto). A continuación, se incubó sobre el material una disolución que contiene el analito, y se evaluó visualmente el cambio de color tras retirar la disolución.
La interacción entre el bioreceptor y el analito incrementa la cantidad de materia que conforma la capa de receptor. Así pues, parte de la interfase que antes estaba ocupada por aire (índice de refracción = 1), queda ahora ocupada por biomacromoléculas (índice de refracción entre 1 ,35 y 1 ,47). Este incremento en el índice de refracción modifica la respuesta interferométrica del material, lo que cambia la respuesta policromática de la radiación reflejada por éste, y como consecuencia se observa un cambio de color en los puntos con ensayos positivos. En este caso, el material está diseñado para generar cambios de color desde morado claro para ensayos negativos, hasta azul oscuro en ensayos positivos.
La Figura 2 (I) muestra el esquema de un chip tras incubar el analito (IgG anti-BSA) a diferentes concentraciones sobre los puntos de una micromatriz en la que se ha inmovilizado el receptor (BSA). Se observa el cambio de color esperado de morado a azul, detectable directamente con el ojo para ensayos positivos. Todos los individuos encuestados fueron capaces de identificar como positivas las cuatro concentraciones de analito más intensas analizadas en este experimento (fila superior de la micromatriz), lo que supone un límite de detección de alrededor de 30 pg/mL de analito para este sistema inmunoquímico y esta configuración del material. Esta invención permite la detección visual de ensayos analíticos, en una única etapa, sin mareaje y sin necesidad de ningún tipo de instrumentación para el proceso de análisis. Por otro lado, esta invención es compatible con una estrategia que permite incrementar de forma muy simple la fiabilidad de los resultados obtenidos mediante detección visual directa. Esta estrategia consiste en crear micromatrices conformadas por grupos de tres puntos, con un punto dedicado al ensayo de interés, otro punto como control negativo, y un tercero como control positivo. De esta manera, tal y como se muestra en la Figura 3 (I), se pueden discriminar falsos negativos y falsos positivos de forma rápida e intuitiva.
En este ejemplo de realización, para el punto dedicado al ensayo de interés se imprime BSA, para el control negativo se imprime la proteína ovoalbúmina, y para el control positivo se imprime un anticuerpo anti inmunoglobulinas de conejo (40 pL a 100 pg/mL en tampón carbonato en todos los casos). De esta manera, tal y como se muestra en la Figura 3, se pueden discriminar falsos negativos y falsos positivos de forma rápida e intuitiva.
Ejemplo 3. Biosensor con respuesta interferométrica constructiva En otra realización preferente se emplea como sustrato una lámina de policarbonato de 600 pm de grosor, sobre la que se depositan por sputtering una capa interferómetrica constituida por una película de 50 nm de oro, seguido de una película de 85 nm de sulfuro de zinc, seguido de una película de 20 nm de la aleación Ag-ln-Sb-Te, seguido de una película de sulfuro de zinc de 85 nm, y finalmente una película de 5 nm de oro, como se muestra en la Figura 1 (II). Esta configuración se diseña para generar una respuesta interferométrica constructiva frente a ensayos de reconocimiento, de manera que el material interaccione con la luz blanca y refleje un color plateado que cambie a color rojo en ensayos positivos, como se esquematiza en la Figura 2 (II). Se demostró experimentalmente la capacidad de biosensado de estos materiales con un sistema modelo inmunoquímico basado en la proteína BSA (albúmina de suero bovino) como bioreceptor, e inmunoglobulinas G específicas anti-BSA como analitos. Tras fabricar la capa interferométrica sobre el sustrato, se inmovilizó el receptor por adsorción pasiva sobre la superficie superior de oro, según una disposición de micromatriz (12 puntos por chip, ~1 mm de diámetro por punto). A continuación, se incubó sobre el material una disolución que contiene el analito, y se evaluó visualmente el cambio de color tras retirar la disolución.
La interacción entre el bioreceptor y el analito incrementa la cantidad de materia que conforma la capa de receptor. Así pues, parte de la interfase que antes estaba ocupada por aire (índice de refracción = 1 ), queda ahora ocupada por biomacromoléculas (índice de refracción entre 1 ,35 y 1 ,47). Este incremento en el índice de refracción modifica la respuesta interferométrica del material, lo que cambia la respuesta policromática de la radiación reflejada por éste, y como consecuencia se observa un cambio de color en los puntos con ensayos positivos. En este caso, el material está diseñado para generar cambios de color desde color plateado para ensayos negativos, hasta color rojo en ensayos positivos.
La Figura 2 (II) muestra el esquema de un chip tras incubar el analito (IgG anti-BSA) a diferentes concentraciones sobre los puntos de una micromatriz en la que se ha inmovilizado el receptor (BSA). Se observa el cambio de color esperado de plateado a rojo, detectable directamente con el ojo para ensayos positivos.
Esta invención permite la detección visual de ensayos analíticos, en una única etapa, sin mareaje y sin necesidad de ningún tipo de instrumentación para el proceso de análisis. Por otro lado, esta invención es compatible con una estrategia que permite incrementar de forma muy simple la fiabilidad de los resultados obtenidos mediante detección visual directa. Esta estrategia consiste en crear micromatrices conformadas por grupos de tres puntos, con un punto dedicado al ensayo de interés, otro punto como control negativo, y un tercero como control positivo. De esta manera, tal y como se muestra en la Figura 3 (II), se pueden discriminar falsos negativos y falsos positivos de forma rápida e intuitiva.
Ejemplo 4. Detección del analito Para realizar los ensayos, se incuban muestras disueltas en PBS-T (tampón fosfato salino con polisorbato 20) sobre la superficie del chip, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para incubar una única muestra, se dispensan entre 60 y 120 microlitros de muestra sobre el biosensor. Pueden también incubarse gotas individuales sobre los diferentes puntos (1 microlitro/punto) para analizar muestras diferentes en un único biosensor. Tras incubar la muestra, el biosensor se lava con PBS-T, seguido de agua, y se seca en corriente de aire. El resultado del análisis se conoce por inspección visual del color resultante en los puntos de la matriz.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biosensor que permite la detección visual directa de analitos en una muestra, que comprende: i) Un sustrato (a) que actúa como soporte de la capa interferométrica (b), que es de acero; ii) Una capa interferométrica (b) que consiste en una o varias películas superpuestas, con una disposición diseñada para generar fenómenos interferométricos constructivos y/o destructivos en el intervalo visible y para modificar esta respuesta interferométrica en función de las propiedades de la capa de reconocimiento; iii) Una capa de reconocimiento (c) compuesta de receptores biológicos que se fijan a la última película de la capa interferométrica (b), y que reconocen de forma específica a los analitos presentes en la muestra.
2. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el grosor de la capa de sustrato (a) es de entre 50 micrómetros y 5 milímetros.
3. Biosensor según la reivindicación 2, donde el grosor del sustrato (a) es de 600 pm.
4. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la capa interferométrica (b) está constituida por una o varias películas superpuestas que independientemente consisten en un material que se selecciona de entre metales, aleaciones, compuestos metálicos, silicio, y compuestos de silicio; con la condición de que cuando el sustrato (a) del biosensor y la primera película de la capa interferométrica (b) consisten en un metal, estos metales son diferentes.
5. Biosensor según la reivindicación anterior, donde el metal de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se selecciona de entre oro, plata, platino y cromo
6. Biosensor según la reivindicación anterior, donde el metal es oro.
7. Biosensor según la reivindicación 4, donde la aleación de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se selecciona de entre Ni-Va, Ni-Fe, Ni-Cr,
Fe-Co, Fe-Co-Ta-Zr, Co-Ta-Zr, Cu-Ga, Cu-ln, Cu-ln-Ga, Ti-AI, Al-Cu, Al-Sn-Cu y W- Ti.
8. Biosensor según la reivindicación 4, donde la aleación de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) consiste en Ag-ln-Sb-Te.
9. Biosensor según la reivindicación 4, donde el compuesto metálico de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se selecciona de entre sulfuro de zinc, óxido de titanio, óxido de germanio, óxido de fosforo, óxido de boro y pentóxido de tántalo.
10. Biosensor según la reivindicación anterior, donde el compuesto metálico es sulfuro de zinc.
11. Biosensor según la reivindicación 4, donde el compuesto de silicio de una o varias de las películas de la capa interferométrica (b) se selecciona de entre óxido de silicio, nitruro de silicio y cuarzo.
12. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las películas de la capa interferométrica se disponen para provocar fenómenos interferométricos constructivos junto con fenómenos interferométricos destructivos.
13. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los receptores biológicos de la capa de reconocimiento (c) se seleccionan de entre anticuerpos, enzimas, proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de impronta molecular, polisacáridos, complejos proteína-hapteno, bacterias, virus y tejidos.
14. Procedimiento de obtención de un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las siguientes etapas: i) Diseño de las películas que conforman el sustrato (a) y la capa interferométrica (b) a partir de cálculos teóricos basados en las ecuaciones de Fresnel; ii) Preparación de la estructura multicapa de la capa interferométrica (b) mediante depositado por sputtering de las películas que la conforman; iii) Sobre la superficie de la capa interferométrica (b) se inmovilizan los bioreceptores mediante anclaje covalente o mediante fisisorción, conformando la capa de reconocimiento (c).
15. Procedimiento de detección de analitos que comprende las siguientes etapas: i) Poner en contacto el biosensor descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 con la muestra a analizar; ii) Incubar dicha muestra sobre el biosensor; y
Ni) Evaluar visualmente el cambio de color de la capa de reconocimiento (c) del biosensor tras retirar la disolución.
16. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde se llevan a cabo y en paralelo las etapas i), ii) y iii) sobre puntos constituidos por distintos bioreceptores, de manera que se obtenga una micromatriz conformada por grupos de tres puntos, con un punto dedicado al ensayo de interés de acuerdo con el proceso descrito anteriormente, otro punto como control negativo, y un tercero como control positivo.
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