WO2021137667A1 - 보툴리눔 신경독소를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물 및 이를 이용한 파킨슨병 치료 방법 - Google Patents

보툴리눔 신경독소를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물 및 이를 이용한 파킨슨병 치료 방법 Download PDF

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WO2021137667A1
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pharmaceutical composition
disease
brain
parkinson
botulinum
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PCT/KR2020/095158
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장성수
임일호
이학섭
신승진
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주식회사 에이티지씨
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    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating Parkinson's disease containing botulinum neurotoxin, a method for treating Parkinson's disease using the composition, and the like.
  • Botulinum neurotoxin is a neurotoxin (hereinafter, botulinum toxin) produced by Clostridium botulinum, a gram-positive anaerobic bacterium. Botulinum toxin is classified into eight neurotoxins, and seven of them (A, B, C, D, E, F, G) can cause nerve paralysis. Among them, the most effective botulinum toxin known as a natural biological agent is type A, and the toxin protein has a size of 150 kDa, and a non-toxin protein is bound to the toxin protein to form a complex. The size of the complex can be up to 900 kDa, depending on the type of neurotoxin.
  • botulinum toxin a neurotoxin (hereinafter, botulinum toxin) produced by Clostridium botulinum, a gram-positive anaerobic bacterium. Botulinum toxin is classified into eight neurotoxins, and seven
  • Botulinum toxin has the effect of causing temporary paralysis of muscles, and the mechanism causes local muscle paralysis by inhibiting the secretion of acetylcholine at the neuromuscular junction of the motor nerve terminal (which binds to the cholinergic terminal of the peripheral nerve and enters the nerve cell).
  • Botulinum toxin has a pain-suppressing effect such as chronic myofascial pain, back pain, muscle stiffness, and tension headache caused by local paralysis of muscles, which suppresses pain by blocking nerve signal transmission by inhibiting the secretion of acetylcholine.
  • Parkinson's disease is known to be caused by a complex action of genetic/environmental factors, etc., and the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta of the brain are selectively killed and the striatum.
  • Dopamine deficiency in the striatum occurs, which causes movement disorders such as arm, leg, and face tremor, muscle rigidity, and slow movement (bradykinesia).
  • movement disorders such as arm, leg, and face tremor, muscle rigidity, and slow movement (bradykinesia).
  • it exhibits various clinical features such as pain in non-motor disorders, cognitive dysfunction, mental abnormality, sensory abnormality, and the like.
  • levodopa a preparation of dopamine and exhibits a therapeutic effect in a way that supplements the deficient dopamine.
  • levodopa has been used as the most effective drug so far, it is not a fundamental treatment, but a drug that simply controls symptoms. It cannot cure Parkinson's disease, and when taken for a long time (5 to 10 years), it further promotes neuronal damage due to toxicity.
  • Dopamine receptor agonist Among other drugs, amantadine, and adenosine receptor inhibitors, it is recommended to be administered later, and even in the case of agents other than levodopa, it is used as a simple symptom control drug rather than a fundamental treatment (Republic of Korea Patent No. 10-2029090). Therefore, there is an urgent need to develop a therapeutic agent that can directly treat Parkinson's disease.
  • MAO-B Monoamine oxidase-B
  • COMT catechol-O-methyl transferase
  • anticholine Among other drugs, amantadine, and adenosine receptor inhibitors, it is recommended to be administered later, and even in the case of agents other than levodopa, it is used as a simple symptom control drug rather than a fundamental treatment (Republic of Korea Patent No. 10-2029090). Therefore, there is an urgent need to develop a therapeutic agent that can directly treat Parkinson's disease.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Parkinson's disease through brain administration.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Parkinson's disease comprising botulinum neurotoxin as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition is preferably for intracerebral administration, but is not limited thereto as long as it is used for topical administration.
  • the botulinum neurotoxin is preferably selected from the group consisting of botulinum type A, botulinum type B, botulinum type C, botulinum type D, botulinum type E, botulinum type F, and botulinum type G. It may be any one or more botulinum neurotoxin, more preferably botulinum type A. In addition, the botulinum neurotoxin may be a toxin protein alone or a complex protein.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered into the brain using a stereotaxic frame, but is not limited thereto as long as it is a known intracerebral administration method.
  • the pharmaceutical composition can increase the production of dopamine in the brain, alleviate the imbalance between the amount of dopamine and the amount of acetylcholine, and increase the production of tyrosine hydroxylase may do it In addition, it may reduce the production of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the brain or inhibit inflammation of the central nervous system.
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • the pharmaceutical composition may be administered at a concentration of preferably 0.001 ng/kg to 5 ng/kg, but it is the concentration of botulinum neurotoxin that is generally used and has a therapeutic effect.
  • concentration shown is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating Parkinson's disease, comprising administering to a subject a composition comprising botulinum neurotoxin as an active ingredient.
  • the administration may be intracerebral administration.
  • the present invention provides the use of a composition comprising botulinum neurotoxin as an active ingredient for preventing or treating Parkinson's disease.
  • the present invention provides the use of botulinum neurotoxin for producing a medicament used for the prevention or treatment of Parkinson's disease.
  • the therapeutic effect of Parkinson's disease can be obtained through brain administration of botulinum toxin. Furthermore, the present invention can apply the therapeutic effect of botulinum toxin for Parkinson's disease not only to the peripheral nerves but also to the central nervous system, so that botulinum toxin can be used as a useful therapeutic agent for Parkinson's disease. to present
  • botulinum toxin type A is a diagram showing the behavioral efficacy according to the administration.
  • Figure 2 relates to dopamine and acetylcholine levels obtained by performing ELISA analysis for dopamine and acetylcholine in a mouse model induced with Parkinson's disease using MPTP, according to an embodiment of the present invention
  • BoNT-A It is a diagram showing the mechanism of action of the therapeutic efficacy according to the administration of
  • Figure 3 shows the expression levels of TH and GFAP proteins obtained by Western blot analysis on a mouse model induced with Parkinson's disease using MPTP according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the mechanism of action of the treatment efficacy.
  • FIG. 4 is a result of TH and GFAP tissue analysis obtained by performing immunohistochemistry analysis on a mouse model induced with Parkinson's disease using MPTP according to an embodiment of the present invention, and administration of BoNT-A It is a diagram showing the mechanism of action of the behavioral treatment efficacy according to the
  • BoNT-A is a diagram showing
  • 6 is a behavioral evaluation (Rotarod, Pole, Gait test) results performed on a mouse model induced by Parkinson's disease using 6-OHDA, according to an embodiment of the present invention, according to the administration of BoNT-A It is a diagram showing the effect of behavioral treatment.
  • Figure 7 shows dopamine and acetylcholine levels obtained by performing an ELISA analysis for dopamine and acetylcholine in a mouse model induced with Parkinson's disease using 6-OHDA according to an embodiment of the present invention
  • BoNT It is a diagram showing the mechanism of action of the therapeutic efficacy according to the administration of -A.
  • FIG. 8 shows the expression levels of TH and GFAP proteins obtained by Western blot analysis on a mouse model induced with Parkinson's disease using 6-OHDA, according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the mechanism of action of therapeutic efficacy according to administration.
  • FIG. 9 is a result of TH and GFAP tissue analysis obtained by performing immunohistochemical analysis on a mouse model induced with Parkinson's disease using 6-OHDA according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the mechanism of action of the behavioral treatment efficacy.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Parkinson's disease comprising botulinum toxin as an active ingredient, wherein the botulinum toxin is administered into the brain.
  • the present invention provides a method for preventing or preventing Parkinson's disease, comprising administering a botulinum toxin to the brain of an individual in need thereof, that is, a high-risk group at risk of developing Parkinson's disease, or a Parkinson's disease patient provide a treatment method.
  • prevention refers to any action that blocks, suppresses or delays symptoms of Parkinson's disease by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which Parkinson's disease symptoms are improved or beneficially changed by administration of the composition according to the present invention.
  • the term "subject" refers to a subject in need of prevention or treatment of a disease.
  • the subject may be a human or a mammal, including non-human primates, mice, dogs, cats, horses, sheep and cattle.
  • the botulinum toxin may be a botulinum toxin selected from the group consisting of botulinum types A to G (A, B, C, D, E, F, G).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain botulinum toxin type A.
  • the botulinum toxin is administered into the brain, and for this purpose, it may be administered using a stereotaxic frame or stereotaxic injection.
  • the botulinum toxin included as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may exhibit the following characteristics:
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • botulinum toxin was administered to the brain of an animal model of Parkinson's disease, dopamine production in the brain was increased (see FIGS. 2 and 7 ), and the imbalance between the amount of dopamine and acetylcholine was alleviated (Fig. 2 and 7).
  • botulinum toxin when botulinum toxin is administered to the brain of an animal model of Parkinson's disease, the production of tyrosine hydroxylase, an enzyme synthesizing L-DOPA, a precursor of dopamine, is increased (FIGS. 3, 4, and 8). and 9), it was confirmed that the production of GFAP, a marker of astrocytes associated with neuroinflammation, was reduced (see FIGS. 3, 4, 8 and 9).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be a liquid injection.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it targets humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, dyes, fragrances, etc., for oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, and pain-free agents
  • a topical agent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc. can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, in the case of oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses. have.
  • it may be formulated and used as dragees, gels, pills, powders, granules, suppositories, external preparations, solutions, suspensions, sustained-release preparations, slurries, and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • the administration route of the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably intracerebral administration, but is not limited thereto.
  • buccal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, rectal, Intrasternal, intralesional, intracranial, and the like are included.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition may be administered to the brain in an amount of 0.001 to 5 ng/kg, 0.05 to 3.75 ng/kg, or 0.1 to 2.5 ng/kg once to several times a day.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination.
  • the preferred dosage may be selected according to the condition and weight of the subject, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration.
  • a Parkinson's disease (PD) mouse model was prepared using 6-OHDA (6-hydroxydopamine) and MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine). In this case, physiological saline in the same amount as that of 6-OHDA and MPTP was administered.
  • the detailed MPTP Parkinson's disease animal model was prepared as follows.
  • a mouse model was prepared by administering 15 mg/kg of MPTP into the abdominal cavity of C57BL/6 mice, and in the case of the botulinum toxin type A (BoNT-A) administered group, the right striatum (Striatum; AP: +0.5 mm, ML: - A dose of 25 pg/mouse of BoNT-A was injected into the brain by stereotaxic method (2.0 mm, DV: -4.5 mm). Then, behavioral evaluation (Rotarod test, Pole test, Gait test) was performed after BoNT-A injection.
  • BoNT-A botulinum toxin type A
  • 6-OHDA Parkinson's disease animal model used in this example was as follows.
  • Mouse model by injecting 6-OHDA (10 ⁇ g/mouse) into the right striatum (AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm, DV: -4.5 mm) of C57BL/6 mice using a stereotaxic method was manufactured, and 6-OHDA was injected, and a dose of 50 pg/mouse of BoNT-A was injected into the right striatum of the mouse 2 weeks later by stereotaxic fixation of the brain.
  • behavioral evaluation Apormorphine-induced rotation test, Rotarod test, Pole test, Gait test
  • apomorphine In the apomorphine-induced rotation test, on the 21st day after administration of BoNT-A, apomorphine (0.5 mg/kg) was administered intraperitoneally to measure the number of times the mouse rotates to the left for 30 minutes. method was evaluated. This experiment was performed to quantitatively measure the degree of damage to dopaminergic neurons.
  • each group of animals was trained at 14 rpm for two days before the experiment, and the duration of the test was measured at 14 rpm for 5 minutes.
  • the average stride length between one hind leg of the mouse and the average stride length between both hind legs were measured and analyzed for comparison. At this time, the average of 5 strides of each animal model was evaluated.
  • TH Tyrosine Hydroxylase
  • GFAP Glial fibrillary acidic protein
  • ⁇ -actin antibody Santa Cruz, sc-477778. Proteins (40 ⁇ g) extracted from brain tissue were separated using 10% or 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and then moved using a nitrocellulose membrane (100 V, 70 minutes). . Then, each antibody on the membrane was diluted in blocking buffer at an appropriate ratio according to the instructions and treated at 4° C. overnight.
  • the membrane was diluted with HRP-conjugated anti-mouse, goat, and sheep antibodies in a blocking buffer at an appropriate ratio according to the instructions and treated at room temperature for 1 hour. Thereafter, the target protein was detected using enhanced chemiluminescence (ECL) after washing (PBST, 10 minutes, 3 times).
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • the brain tissue of each animal model was used, and the protein (100 ⁇ g) extracted from the brain tissue was analyzed.
  • the ELISA kit dopamine assay kit [abnova, KA1887] and acetylcholine assay kit [abcam, ab65345]) capable of analyzing dopamine and acetylcholine was used. The material was measured.
  • the MPTP group (122.8 ⁇ 10.95 s) is more significant than the control group (vehicle group; 171.3 ⁇ 7.181 s) It showed a very low latency to fall, and the MPTP+BoNT-A group (164.1 ⁇ 5.734 s) had an increased latency than the MPTP group ( FIG. 1 ).
  • the MPTP group (8.400 ⁇ 0.4071 s) was the control group (Vehicle group; 6.300). ⁇ 0.1225 s) showed a higher fall time, and it was confirmed that the fall time was decreased in the MPTP+BoNT-A group (6.350 ⁇ 0.2507 s) than in the MPTP group ( FIG. 1 ).
  • the MPTP group (5.867 ⁇ 0.09085 cm; 3.412 ⁇ 0.04765 cm) was the control group (vehicle group; 7.250 ⁇ 0.1708 cm; 4.250 ⁇ 0.1118 cm) showed a narrower stride length and stance length values, and it was confirmed that the values of both stride lengths increased due to the administration of BoNT-A (7.333 ⁇ 0.1162 cm; 4.139 ⁇ 0.05432 cm) (FIG. 1).
  • Tyrosine Hydroxylase is an enzyme that synthesizes L-DOPA, a precursor of dopamine, and a lack of TH causes dopamine synthesis disorder. Accordingly, in order to evaluate TH, the result of confirming TH expression through Western blot using the brain tissue of the MPTP-induced PD animal model, as shown in FIG. 3 , in the brain (Striatum site) of the mouse due to the injection of MPTP, TH was decreased, and it was confirmed that the expression of TH in the brain of mice increased due to administration of BoNT-A ( FIG. 3 ).
  • GFAP neuroinflammation, including activation of astrocytes and microglia, which are major immune cells of the central nervous system, plays an important role in the progression of PD, so the level of GFAP, which is considered a marker of activated astrocytes.
  • FIG. 3 GFAP significantly increased in the mouse brain (Striatum site) due to the injection of MPTP. and it was confirmed that the expression of GFAP in the mouse brain was decreased due to the administration of BoNT-A (FIG. 3).
  • TH-positive fibers (TH) in the mouse brain (Striatum site) due to MPTP injection -positive fiber) was decreased, and it was confirmed that the number was recovered due to BoNT-A administration (FIG. 4).
  • the number of GFAP-positive cells in the mouse brain (Striatum site) increased due to MPTP injection, and decreased due to the administration of BoNT-A ( FIG. 4 ).
  • the vehicle injected group had an average of 0.2500 ⁇ 0.1637 times.
  • the 6-OHDA group rotated an average of 52.20 ⁇ 15.11 turns
  • the 6-OHDA+BoNT-A group rotated an average of 22.00 ⁇ 8.538 turns
  • the BoNT-A group rotated an average of 0.2222 ⁇ 0.1470 rotations.
  • the number of apomorphine-induced rotational movements increased with 6-OHDA decreased with BoNT-A administration (Fig. 5).
  • the 6-OHDA group (11.50 ⁇ 1.150 s) was the control group (Vehicle group; 7.000 ⁇ 0.5345 s), and the 6-OHDA+BoNT-A group (8.750 ⁇ 0.2500 s) showed a decrease in the fall time than the 6-OHDA group (FIG. 6).
  • the 6-OHDA group (6.600 ⁇ 0.2375 cm; 4.267 ⁇ 0.1498 cm) was the control group (vehicle group; 8.150 ⁇ 0.3914). cm; 5.438 ⁇ 0.1841 cm) showed narrow stride length and stance length values, and it was confirmed that the values of both stride lengths increased due to BoNT-A administration (7.650 ⁇ 0.1641 cm; 4.910 ⁇ 0.08622 cm) (FIG. 6). ).
  • the dopamine level was evaluated using the brain tissue (Striatum site) of the 6-OHDA-induced PD animal model.
  • the 6-OHDA group (181.3 ⁇ 6.931 ng/mg protein) showed a lower dopamine concentration than the control group (vehicle group; 302.7 ⁇ 42.97 ng/mg protein), indicating that the amount of dopamine decreased by administration of BoNT-A increased. It was confirmed (255.6 ⁇ 43.79 ng/mg protein) ( FIG. 7 ).
  • Tyrosine Hydroxylase is an enzyme that synthesizes L-DOPA, a precursor of dopamine, and a lack of TH causes dopamine synthesis disorder. Accordingly, in order to evaluate TH, the expression of TH was confirmed through Western blot using the brain tissue of the 6-OHDA-induced PD animal model, and as shown in FIG. 8, due to the injection of 6-OHDA, the mouse brain ( Striatum site and Substantia Nigra) significantly decreased TH, and it was confirmed that the expression of TH in the mouse brain was increased due to administration of BoNT-A ( FIG. 8 ).
  • GFAP which is considered a marker of activated astrocytes, because neuroinflammation, including activation of astrocytes and microglia, which are major immune cells of the central nervous system, plays an important role in the progression of PD, 6
  • GFAP was significantly increased in the mouse brain (Striatum site and Substantia Nigra) due to the injection of 6-OHDA. increased, and it was confirmed that the expression of GFAP in the brain of the mouse was decreased due to the administration of BoNT-A ( FIG. 8 ).
  • the pharmaceutical composition for intracerebral administration containing the botulinum neurotoxin of the present invention as an active ingredient exhibits a direct therapeutic effect on Parkinson's disease, it is expected to be used as a useful therapeutic agent for the treatment of Parkinson's disease.

Abstract

본 발명은 보툴리눔 신경독소의 뇌 투여에 의한 파킨슨병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 보툴리눔 독소의 뇌 투여를 통하여 파킨슨병의 치료 효과를 얻을 수 있다.

Description

보툴리눔 신경독소를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물 및 이를 이용한 파킨슨병 치료 방법
본 발명은 보툴리눔 신경독소를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물, 이를 이용한 파킨슨병 치료 방법 등에 관한 것이다.
보툴리눔 신경독소는 그람 양성 혐기성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에서 만들어내는 신경독소(이하, 보툴리눔 독소)이다. 보툴리눔 독소는 8가지 신경독소로 분류되며, 이중 7종(A, B, C, D, E, F, G)은 신경의 마비를 유발할 수 있다. 그 중 천연 생물학적 작용제로 알려진 가장 효과적인 보툴리눔 독소는 A형으로 독소 단백질의 크기는 150 kDa으로 구성되어 있으며, 독소 단백질 외에 비독소 단백질이 결합되어 복합체를 이루고 있다. 복합체의 크기는 신경 독소의 종류에 따라 최대 900 kDa까지 생성된다.
보툴리눔 독소는 근육의 일시적인 마비를 일으키는 효과가 있으며, 기전으로는 운동신경 말단(말초신경의 콜린성 말단에 결합하여 신경세포 내로 들어감)의 신경근 접합부에서 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 국소적인 근육 마비를 일으킨다. 보툴리눔 독소는 근육의 국소적 마비에 의한 만성 근막통, 요통, 근육 경직, 긴장성 두통 등 통증 억제 효과가 있으며, 이는 아세틸콜린의 분비를 억제함으로 신경신호 전달을 차단하여 통증을 억제하는 것이다.
한편, 파킨슨병(Parkinson's disease)은 유전적/환경적 요인 등이 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 알려져 있으며, 뇌의 흑색질(substantia nigra pars compacta)의 도파민 신경세포(dopaminergic neuron)가 선택적으로 사멸하여 선조체(striatum) 부분의 도파민의 결핍이 발생하며, 이로 인해 팔, 다리, 얼굴의 떨림(tremor), 근육 강직(rigidity), 동작이 느려지는 서동(bradykinesia) 등의 운동장애가 주된 특징인 질병이다. 이외에도, 비운동장애인 통증, 인지 기능 장애, 정신 이상, 감각 이상 등과 같은 다양한 임상적 특징을 나타낸다.
파킨슨병의 치료 목적은 운동 장애 및 비운동 장애를 경감시키는 것이다. 이에 대한 치료 방법으로 흔하게 사용되는 것은 레보도파(levodopa) 제제로, 이는 도파민의 전구체로서, 결핍된 도파민을 보충해주는 방식으로 치료 효과를 나타낸다. 레보도파 제제는 현재까지 가장 효과적인 약물로 사용되고는 있으나, 근본적인 치료가 아닌 단순히 증상을 조절하는 약물로서 파킨슨병을 완치하지 못하며, 장기간 복용(5 내지 10년) 시 독성에 의한 신경세포 손상을 더욱 촉진시키게 되어 행동장애 등의 심각한 부작용을 발생시키기 때문에, 현존하는 파킨슨병 치료제인 도파민 수용체 작용제(Dopamine receptor agonist), MAO-B(Monoamine oxidase-B) 억제제, COMT(catechol-O-methyl transferase) 억제제, 항콜린제, 아만타딘, 아데노신 수용체 억제제 중에 가장 나중에 투여를 권고하고 있으며, 레보도파 이외의 제제의 경우에도 근본적인 치료가 아닌 단순 증상조절 약물로서 사용되고 있다(대한민국 등록특허 제10-2029090호). 따라서, 파킨슨병을 직접적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 보툴리눔 독소를 뇌에 투여하는 방법을 통하여 보툴리눔 독소의 국소부위 작용 효과를 이용하면, 기존 파킨슨병 치료제의 전신 작용에 따른 부작용을 해결할 가능성이 크고, 이에 따라 파킨슨병 치료제로 개발될 가능성이 높을 것으로 예상하고, 파킨슨병 동물 모델에 보툴리눔 독소를 뇌 내 투여한 후의 파킨슨병 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 뇌 투여를 통하여 파킨슨병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다
본 발명은 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 뇌내 투여용이나, 국소투여를 위한 용도라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 보툴리눔 신경독소는 바람직하게는 보툴리눔 A형, 보툴리눔 B형, 보툴리눔 C형, 보툴리눔 D형, 보툴리눔 E형, 보툴리눔 F형, 및 보툴리눔 G형으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 보톨리눔 신경독소일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 보톨리눔 A형일 수 있다. 또한, 상기 보툴리눔 신경독소는 독소 단백질 단독 또는 복합체 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 뇌 정위 기구(stereotaxic frame)를 이용하여 뇌 내로 투여될 수 있으나, 알려져있는 뇌내 투여 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 뇌내 도파민 생성을 증가시킬 수 있으며, 도파민량과 아세틸콜린양 사이의 불균형을 완화시킬 수 있으며, 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase)의 생성을 증가시킬 수도 있다. 또한, 뇌내 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 생성을 감소시키거나, 중추신경계의 염증을 억제시킬 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 0.001 ng/kg 내지 5 ng/kg의 농도로 투여될 수 있으나, 일반적으로 사용되는 보톨리눔 신경독소의 농도이며, 치료 효과를 나타내는 농도라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 투여는 뇌 내 투여하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 조성물의 파킨슨병 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 보톨리눔 신경독소의 파킨슨병의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따르면, 보툴리눔 독소의 뇌 투여를 통하여 파킨슨병의 치료 효과를 얻을 수 있다. 나아가, 본 발명은 파킨슨병에 대한 보툴리눔 독소의 치료 효과를 말초신경에 적용하는 것만이 아닌, 중추신경계에도 적용할 수 있게 됨으로써, 보툴리눔 독소가 파킨슨병에 대한 유용한 치료제로 사용될 수 있다는 방향성 및 치료 방법을 제시한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, MPTP를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 이용하여 행동학적 평가(Rotarod, Pole, Gait test) 분석을 실시한 결과로서, 보툴리눔 독소 A형(BoNT-A)의 투여에 따른 행동학적인 효능을 보여주는 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, MPTP를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 도파민 및 아세틸콜린에 대한 ELISA 분석을 실시하여 얻은 도파민 및 아세틸콜린 레벨에 관한 것으로, BoNT-A의 투여에 따른 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, MPTP를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 Western blot 분석을 실시하여 얻은 TH 및 GFAP 단백질의 발현 정도를 보여주는 것으로, BoNT-A의 투여에 따른 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, MPTP를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 면역조직화학(Immunohistochemistry) 분석을 실시하여 얻은 TH 및 GFAP 조직 분석 결과로서, BoNT-A의 투여에 따른 행동학적인 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 6-OHDA를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 실시한 행동학적 평가(Rotation test) 결과로서, BoNT-A의 투여에 따른 행동학적인 치료 효능을 보여주는 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 6-OHDA를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 실시한 행동학적 평가(Rotarod, Pole, Gait test) 결과로서, BoNT-A의 투여에 따른 행동학적인 치료 효능을 보여주는 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, 6-OHDA를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 도파민 및 아세틸콜린에 대한 ELISA 분석을 실시하여 얻은 도파민 및 아세틸콜린 레벨을 보여주는 것으로서, BoNT-A의 투여에 따른 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, 6-OHDA를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 Western blot 분석을 실시하여 얻은 TH 및 GFAP 단백질의 발현 정도를 보여주는 것으로서, BoNT-A의 투여에 따른 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 6-OHDA를 사용하여 파킨슨병이 유도된 마우스 모델을 대상으로 면역조직화학 분석을 실시하여 얻은 TH 및 GFAP 조직 분석 결과로서, BoNT-A의 투여에 따른 행동학적인 치료 효능의 작용기전을 보여주는 도이다.
본 발명은 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 보툴리눔 독소는 뇌 내 투여되는 것인, 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 보툴리눔 독소를, 이를 필요로 하는 개체, 즉, 파킨슨병이 발병될 위험이 있는 고위험군, 또는 파킨슨병 환자의 뇌에 투여하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 파킨슨병 증상을 차단하거나, 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 파킨슨병 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "개체"란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 A형 내지 G형(A, B, C, D, E, F, G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 보툴리눔 독소일 수 있다. 일 특정예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 보툴리눔 독소 A형을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 뇌 내로 투여되며, 이를 위하여 뇌 정위 기구(stereotaxic frame) 또는 뇌 정위 주사 방법(stereotaxic injection)을 이용하여 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 보툴리눔 독소는 다음의 특성을 나타낼 수 있다:
(i) 뇌의 도파민 생성 증가,
(ii) 뇌에서의 도파민양과 아세틸콜린양 사이의 불균형 완화,
(iii) 뇌에서 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase)의 생성 증가,
(iv) 뇌에서 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 생성 감소, 또는
(v) 중추신경계의 염증 억제.
본 발명의 일 실시예에서는 파킨슨병 동물 모델의 뇌에 보툴리눔 독소를 투여한 경우 뇌의 도파민 생성이 증가되고(도 2 및 7 참조), 도파민과 아세틸콜린양 사이의 불균형이 완화됨을 확인하였다(도 2 및 7 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 파킨슨병 동물 모델의 뇌에 보툴리눔 독소를 투여한 경우 도파민의 전구물질인 L-DOPA를 합성하는 효소인 티로신 수산화효소의 생성이 증가되고(도 3, 4, 8 및 9 참조), 신경염증과 관련된 성상세포의 마커인 GFAP의 생성이 감소됨을 확인하였다(도 3, 4, 8 및 9 참조).
본 발명에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 액상의 주사제일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 당의정, 겔, 환제, 산제, 과립제, 좌제, 외용제, 용액, 현탁액, 서방형 제제, 슬러리 등으로 제형화하여 사용할 수도 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 뇌내 투여가 바람직하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 구강, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피내, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장, 흉골내, 병소내, 두개골내 등이 포함된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 5 ng/kg, 0.05 내지 3.75 ng/kg 또는 0.1 내지 2.5 ng/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 뇌에 투여 할 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다. 또한, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 선택될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
[실시예]
실험방법
실시예 1. 파킨슨병 유도 동물 모델 제작
6-OHDA(6-hydroxydopamine) 및 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 이용하여 파킨슨병(이하 PD) 마우스 모델을 제작하였으며, 대조군(Control) 그룹의 경우에는 6-OHDA 및 MPTP의 양과 동일한 양의 생리식염수를 투여하였다. 자세한 MPTP 파킨슨병 동물 모델의 제작 방법은 다음과 같았다. C57BL/6 마우스의 복강에 15 mg/kg의 MPTP를 투여하여 마우스 모델을 제작하였으며, 보툴리눔 독소 A형(BoNT-A) 투여군의 경우 마우스의 오른쪽 선조체(Striatum; AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm, DV: -4.5 mm)에 BoNT-A 25 pg/mouse의 용량을 뇌 정위 고정(stereotaxic) 방법으로 주입하였다. 이후 BoNT-A 주입 후에 행동학적 평가(Rotarod test, Pole test, Gait test)를 수행하였다.
더불어, 본 실시예에서 사용된 6-OHDA 파킨슨병 동물모델의 제작 방법은 다음과 같았다. C57BL/6 마우스의 오른쪽 선조체(AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm, DV: -4.5 mm)에 6-OHDA(10 μg/mouse)를 뇌 정위 고정(stereotaxic) 방법을 이용해 주입하여 마우스 모델을 제작하였으며, 6-OHDA를 주입하고, 2주 뒤에 마우스의 오른쪽 선조체에 BoNT-A 50 pg/mouse의 용량을 뇌 정위 고정 방법으로 주입하였다. 이후, BoNT-A 주입 3주 후에 행동학적 평가(Apormorphine-induced rotation test, Rotarod test, Pole test, Gait test)를 수행하였다.
실시예 2. 행동학적 평가
아포모르핀 유도 회전 검사(Apomorphine-induced rotation test) 시, BoNT-A를 투여한 후 21일째 되는 날에 아포모르핀(0.5 mg/kg)을 복강 투여하여 마우스가 왼쪽으로 회전하는 횟수를 30분간 측정하는 방법으로 평가하였다. 본 실험은 도파민 신경세포(Dopaminergic neuron)의 손상도를 정량적으로 측정하기 위하여 실시하였다.
로타로드 테스트(Rotarod test) 시, 실험 전 각 동물군은 이틀간 14 rpm에서 훈련되었으며, 테스트에서는 14 rpm으로 5분간 버티는 시간을 측정하였다.
폴 테스트(Pole test) 시, 표면이 거친 나무 기둥(직경 1 cm, 높이 55 cm)을 바닥에 수직으로 놓은 후, 마우스를 기둥 가장 윗부분에 머리를 위를 향하게 하여 놓아 바닥으로 내려오기까지의 시간을 측정하였다. 총 3번의 시험을 수행한 후 평균값을 활용하여 평가하였으며, 본 테스트는 선조체 도파민(Striatal dopamine)의 부족으로 인한 마우스의 운동 장애를 평가하기 위해 실시하였다.
보행 테스트(Gait test) 시, 마우스의 한쪽 뒷다리 사이의 평균 보폭(Stride length)과 양쪽 뒷다리 사이의 평균 보폭(Stance length)를 측정하여 비교 분석하였다. 이때, 각 동물 모델의 평균 5 개의 보폭으로 평가하였다.
실시예 3. Western blot 분석
Western blot 분석법의 경우, 각 동물 모델의 뇌 조직을 활용하였으며, TH(Tyrosine Hydroxylase) 항체(Millipore, AB1542), GFAP(Glial fibrillary acidic protein) 항체(Abcam, ab53554) 및 β-actin 항체(Santa Cruz, sc-47778)를 사용하였다. 뇌 조직으로부터 추출된 단백질(40 μg)을 10% 또는 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔을 사용하여 단백질을 분리한 다음, 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)을 사용하여 이동하였다(100 V, 70분). 이후, 본 막에 각 항체를 설명서에 따라 적절한 비율로 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 이후, 세척(PBST, 10분, 3번)을 진행한 후 본 막을 HRP-conjugated anti-mouse, goat, sheep 항체를 설명서에 따라 적절한 비율로 블로킹 버퍼에 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이후, 세척(PBST, 10분, 3번)을 진행한 후 enhanced chemiluminescence(ECL)를 사용하여 목표 단백질을 검출하였다.
실시예 4. 면역조직화학 분석
면역조직화학 분석법의 경우, MPTP, 6-OHDA PD 동물 모델의 뇌 조직을 활용하였으며, TH 항체(Millipore, AB1542) 및 GFAP 항체(Abcam, ab53554)를 사용하였다. 파라핀을 사용하여 포매(embedded)한 조직 절편을 사용하여, 각 항체를 설명서에 따라 적절한 비율로 블로킹 버퍼에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 이후, 세척(PBST, 10분, 3번)을 진행한 후 HRP-conjugated anti-sheet, anti-goat 항체를 설명서에 따라 적절한 비율로 블로킹 버퍼에 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이후, 세척(PBST, 10분, 3번)을 진행한 후 본 조직 절편을 3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 사용하여 염색한 뒤 광학 현미경을 통해 결과를 확인하였다.
실시예 5. 신경전달물질 분석
신경전달물질 분석법의 경우, 각 동물 모델의 뇌 조직을 활용하였으며, 뇌 조직으로부터 추출된 단백질(100 μg)을 분석하였다. 도파민(dopamine)과 아세틸콜린(acetylcholine)을 분석할 수 있는 ELISA 키트(dopamine assay kit [abnova, KA1887] 및 acetylcholine assay kit [abcam, ab65345])를 사용하여 진행하였으며, 키트의 사용절차에 따라 신경전달물질을 측정하였다.
실험결과
도 1에서 보는 바와 같이, MPTP 유도 PD 동물 모델을 활용하여 실시한 마우스의 운동능력을 평가하기 위한 로타로드 테스트 결과, MPTP 그룹(122.8±10.95 s)은 대조군(vehicle 그룹; 171.3±7.181 s)보다 현저하게 낮은 버틴 시간(latency to fall)을 보였으며, MPTP+BoNT-A 그룹(164.1±5.734 s)에서는 MPTP 그룹보다 버틴 시간이 증가하였다(도 1).
또한, 도 1에서 보는 바와 같이, 선조체 도파민(Striatal dopamine) 부족으로 인한 마우스의 운동 장애를 평가하기 위하여 실시한 폴 테스트(Pole test) 결과, MPTP 그룹(8.400±0.4071 s)은 대조군(Vehicle 그룹; 6.300±0.1225 s)보다 높은 하강시간을 보였으며, MPTP+BoNT-A 그룹(6.350±0.2507 s)에서는 MPTP 그룹보다 하강시간이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 1).
또한, 도 1에서 보는 바와 같이, 마우스의 운동능력을 평가하기 위하여 실시한 보행 테스트(Gait test) 결과, MPTP 그룹(5.867±0.09085 cm; 3.412±0.04765 cm)은 대조군(vehicle 그룹; 7.250±0.1708 cm; 4.250±0.1118 cm)에 비해 좁은 Stride length와 Stance length 값을 나타내었고, BoNT-A 투여로 인해 두 보폭의 값이 증가한 것을 확인할 수 있었다(7.333±0.1162 cm; 4.139±0.05432 cm)(도 1).
도 2에서 보는 바와 같이, 파킨슨병의 특징인 도파민 신경세포의 소실로 인한 도파민 부족을 평가하기 위하여, MPTP 유도 PD 동물 모델의 뇌조직(Striatum site)을 활용하여 실시한 도파민 레벨을 평가한 결과, MPTP 그룹(7.027±0.4985 ng/mg protein)은 대조군(vehicle 그룹; 17.76±1.588 ng/mg protein)에 비해 낮은 도파민 농도를 보였으며, BoNT-A를 투여함으로 인해 감소했던 도파민양이 증가한 것을 확인할 수 있었다(11.30±1.159 ng/mg protein)(도 2).
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, 파킨슨병의 특징인 아세틸콜린과 도파민의 불균형을 평가하기 위하여, MPTP 유도 PD 동물 모델의 뇌조직(Striatum site)을 활용하여 실시한 아세틸콜린 및 아세틸콜린/도파민 비율을 평가한 결과, MPTP 주입으로 인해 마우스의 뇌에서의 아세틸콜린과 아세틸콜린/도파민 비율은 대조군(vehicle 그룹)과 큰 차이가 없었으나, BoNT-A 주입으로 인해 아세틸콜린의 수준과 아세틸콜린/도파민 비율이 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 2).
Tyrosine Hydroxylase(TH)는 도파민의 전구물질인 L-DOPA를 합성하는 효소이며, TH의 부족은 도파민의 합성 장애를 일으킨다. 이에 따라, TH를 평가하기 위하여, MPTP 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 Western blot을 통한 TH 발현의 확인 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, MPTP의 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site)에서 TH가 감소하였으며, BoNT-A 투여로 인해 마우스의 뇌에서 TH의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 3).
또한, 중추신경계의 주요한 면역세포인 성상세포(Astrocyte)와 미세아교세포(Microglia)의 활성화를 포함한 신경염증은 PD의 진행에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 활성화된 성상세포의 마커로 간주되는 GFAP의 수준을 평가하기 위하여, MPTP 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 Western blot을 통한 GFAP 발현의 확인 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, MPTP의 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site)에서 GFAP가 상당히 증가하였으며, BoNT-A 투여로 인해 마우스의 뇌에서 GFAP의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 3).
도 4에서 보는 바와 같이, MPTP 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 면역조직화학 분석을 통한 TH 발현 변화를 분석한 결과, MPTP 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site)에서 TH-양성 섬유질(TH-positive fiber)의 수가 감소하였으며, BoNT-A 투여로 인해 회복된 것을 확인할 수 있었다(도 4). 더불어, MPTP 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site)에서 GFAP 양성 세포(GFAP-positive cell)의 수가 증가하였으며, BoNT-A 투여로 인해 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4).
도 5에서 보는 바와 같이, 도파민 신경세포의 손상도를 정량적으로 측정하기 위하여, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델을 활용하여 실시한 로테이션 테스트(Rotation test) 결과, vehicle을 주입한 그룹은 평균 0.2500±0.1637회, 6-OHDA 그룹은 평균 52.20±15.11회, 6-OHDA+BoNT-A 그룹은 평균 22.00±8.538회, BoNT-A 그룹은 평균 0.2222±0.1470회를 회전하였다. 6-OHDA로 인해 증가한 아포모르핀으로 유도된 회전 운동의 횟수가 BoNT-A 투여로 인해 감소하였다(도 5).
도 6에서 보는 바와 같이, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델을 활용하여 실시한 마우스의 운동능력을 평가하기 위한 로타로드 테스트 결과, 6-OHDA 그룹(38.67±6.227 s)은 대조군(vehicle 그룹; 215.0±39.16 s)보다 현저하게 낮은 버틴 시간(latency to fall)을 보였으며, 6-OHDA+BoNT-A 그룹(97.25±11.34 s)에서는 6-OHDA 그룹보다 버틴 시간이 증가하였다(도 6).
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, 선조체 도파민의 부족으로 인한 마우스의 운동 장애를 평가하기 위하여 실시한 폴 테스트(Pole test) 결과, 6-OHDA 그룹(11.50±1.150 s)은 대조군(Vehicle 그룹; 7.000±0.5345 s)보다 높은 하강시간을 보였으며, 6-OHDA+BoNT-A 그룹(8.750±0.2500 s)에서는 6-OHDA 그룹보다 하강시간이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6).
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, 마우스의 운동능력을 평가하기 위하여 실시한 보행 테스트(Gait test) 결과, 6-OHDA 그룹(6.600±0.2375 cm; 4.267±0.1498 cm)은 대조군(vehicle 그룹; 8.150±0.3914 cm; 5.438±0.1841 cm)에 비해 좁은 Stride length와 Stance length 값을 나타내었고, BoNT-A 투여로 인해 두 보폭의 값이 증가한 것을 확인할 수 있었다(7.650±0.1641 cm; 4.910±0.08622 cm)(도 6).
도 7에서 보는 바와 같이, 파킨슨병의 특징인 도파민 신경세포의 소실로 인한 도파민 부족을 평가하기 위하여, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델의 뇌조직(Striatum site)을 활용하여 도파민 레벨을 평가한 결과, 6-OHDA 그룹(181.3±6.931 ng/mg protein)은 대조군(vehicle 그룹; 302.7±42.97 ng/mg protein)에 비해 낮은 도파민 농도를 보였으며, BoNT-A를 투여함으로 인해 감소했던 도파민양이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (255.6±43.79 ng/mg protein)(도 7).
또한, 파킨슨병의 특징인 아세틸콜린과 도파민의 불균형을 평가하기 위하여, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 아세틸콜린 및 아세틸콜린/도파민 비율을 평가한 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 마우스의 뇌(Striatum site)에서 아세틸콜린의 수준은 그룹별로 큰 차이가 없었으나, 아세틸콜린/도파민의 비율은 6-OHDA 주입으로 인해 크게 증가하였고, BoNT-A 투여로 인해 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 7).
Tyrosine Hydroxylase(TH)는 도파민의 전구물질인 L-DOPA를 합성하는 효소이며, TH의 부족은 도파민의 합성 장애를 일으킨다. 이에 따라, TH를 평가하기 위하여, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 Western blot을 통한 TH 발현을 확인한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 6-OHDA의 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site 및 Substantia Nigra)에서 TH가 상당히 감소하였으며, BoNT-A 투여로 인해 마우스의 뇌에서 TH의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 8).
또한, 중추신경계의 주요한 면역세포인 성상세포와 미세아교세포의 활성화를 포함한 신경염증은 PD의 진행에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 활성화된 성상세포의 마커로 간주되는 GFAP의 수준을 평가하기 위하여, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 Western blot을 통한 GFAP 발현을 확인한 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 6-OHDA의 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site 및 Substantia Nigra)에서 GFAP가 상당히 증가하였으며, BoNT-A 투여로 인해 마우스의 뇌에서 GFAP의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 8).
도 9에서 보는 바와 같이, 6-OHDA 유도 PD 동물 모델의 뇌조직을 활용하여 면역조직화학 분석을 통한 TH 발현 변화를 분석한 결과, 6-OHDA 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site 및 Substantia Nigra)에서 TH-양성 섬유질(TH-positive fiber)의 수가 감소하였으며, BoNT-A 투여로 인해 회복된 것을 확인할 수 있었다(도 9). 더불어, 6-OHDA 주입으로 인해 마우스의 뇌(Striatum site)에서 GFAP 양성 세포 (GFAP-positive cell)의 수가 증가하였으며, BoNT-A 투여로 인해 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9).
상기 결과를 통하여, 보툴리눔 독소의 파킨슨병에 대한 증상 개선 및 치료 효과를 파킨슨병 마우스 모델을 통해 확인하였다. 이러한 결과를 통해 보툴리눔 독소가 파킨슨병에 대한 치료제로 사용할 수 있다는 방향성 및 치료 방법을 제시할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 보톨리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 뇌내 투여용 약학적 조성물은 파킨슨병에 직접적인 치료 효과를 나타내므로, 파킨슨병 치료에 유용한 치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (14)

  1. 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌내 투여용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 A형, 보툴리눔 B형, 보툴리눔 C형, 보툴리눔 D형, 보툴리눔 E형, 보툴리눔 F형, 및 보툴리눔 G형으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 보톨리눔 신경독소인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 보툴리눔 신경독소는 독소 단백질 또는 복합체 단백질인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌 정위 기구(stereotaxic frame)를 이용하여 뇌 내로 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌의 도파민 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌의 도파민량과 아세틸콜린양 사이의 불균형을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌에서 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뇌에서 GFAP(Glial fibrillary acidic protein)의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 중추신경계의 염증을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 0.001 ng/kg 내지 5 ng/kg의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료 방법.
  13. 보툴리눔 신경독소를 유효성분으로 포함하는 조성물의 파킨슨병 예방 또는 치료 용도.
  14. 보톨리눔 신경독소의 파킨슨병 예방 또는 치료용 약제의 생산 용도.
PCT/KR2020/095158 2019-12-30 2020-12-29 보툴리눔 신경독소를 포함하는 파킨슨병 치료용 조성물 및 이를 이용한 파킨슨병 치료 방법 WO2021137667A1 (ko)

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