WO2021132808A1 - 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물 - Google Patents

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dipping
bath composition
hydrogel droplets
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PCT/KR2020/005104
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신재하
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주식회사 팡세
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    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Definitions

  • the present invention relates to a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets, and more particularly, to a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent.
  • 3D bioprinting is a technology to create a three-dimensional artificial structure or support implantable in the human body by printing living cells with bio-ink. -a-chip) and tissue and organ analogues for animal experimental replacement, various studies that can help cure diseases are being actively conducted.
  • the spheroids made by the conventional agglomeration method have a problem that the uniformity is low, and the hanging drop method can produce a uniform spheroid, but the difficulty of the operation is high, so there is a problem that an error is highly likely to occur depending on the researcher performing it. have.
  • an object of the present invention is to provide a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent, which is a composition that can implement the spheroid.
  • a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant and a thickener.
  • the surfactant may be one selected from the group consisting of polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, sorbitan ester, polyoxyethylene sorbitan, polyoxyethylene ether, and mixtures thereof.
  • the surfactant may be included in an amount of 1 to 10% by weight based on the total weight of the composition.
  • the thickening agent is selected from the group consisting of gellan gum, carrageenan gum, locust bean gum, xanthan gum, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl starch phosphate, poloxamer, and mixtures thereof. can be all day
  • the thickener may be included in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition.
  • the liquid bath composition for dipping the droplet may additionally include a curing agent.
  • the curing agent is transglutaminase, genipin, glutaraldehyde, diisocyanates, carbodiimides, calcium chloride, thrombin ( thrombin), and may be one selected from the group consisting of mixtures thereof.
  • the curing agent may be included in an amount of 1 to 10% by weight based on the total weight of the composition.
  • the liquid bath composition for dipping hydrogel droplets of the present invention may include poloxamer (polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer), gellan gum and transglutaminase.
  • the liquid bath composition for dipping hydrogel droplets of the present invention contains 1 to 10% by weight of poloxamer (polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer), 0.001 to 10% by weight of gellan gum, and trans, based on the total weight of the composition. It may contain 1 to 10% by weight of glutaminase.
  • a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent receives the droplets discharged from the nozzle of the hydrogel discharge device and separates from the nozzle.
  • the liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent of the present invention can obtain a three-dimensional spherical spheroid in a uniform size in the field of spheroid production such as the cell culture field. technology can be useful.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a summary of the spheroid fabrication method.
  • A549 lung cancer cell line
  • HT29 colon cancer cell line
  • FIG. 4 is a photograph of A549 [lung cancer cell line] spheroids observed under a fluorescence microscope [top left: Bright Field image, top right: Merged fluorescence image, bottom left: Calein AM (Green Fluorescence) image, live cells, bottom right: Ethidium homodimer-1 (Red Fluorescence) image, dead cells].
  • FIG. 5 is a photograph of observing DU145 (prostate cancer cell line) spheroids [upper left: Bright Field image, upper right: Merged fluorescence image, lower left: Calein AM (Green Fluorescence) image, live cells, lower right: Ethidium homodimer-1 (Red) Fluorescence) image, dead cells].
  • FIG. 6 is a photograph of observing HT29 (colon cancer cell line) spheroids [upper left: Bright Field image, upper right: Merged fluorescence image, lower left: Calein AM (Green Fluorescence) image, live cells, lower right: Ethidium homodimer-1 (Red) Fluorescence) image, dead cells].
  • HCT116 colon cancer cell line
  • MCF-7 breast cancer cell line
  • upper left Bright Field image
  • upper right Merged fluorescence image
  • lower left Calein AM (Green Fluorescence) image
  • live cells live cells
  • lower right Ethidium homodimer-1 ( Red Fluorescence) image, dead cells.
  • FIG. 9 is a photograph of various sizes of A549 spheroids fabricated with a 3D bioprinter.
  • FIG. 10 is a first-day photograph of an organoid fabricated by a 3D bioprinter (inset is a photograph of an organoid formed by a conventional technique).
  • 11 is a 7-day photograph of organoids fabricated with a 3D bioprinter.
  • FIG. 12 is a graph showing the size of organoids and the distribution of standard deviations (Size uniformity) of an aggregation-based organoid and a bioprintin-based organoid.
  • droplet refers to any bound volume of a hydrogel material (which may be a liquid or a gel).
  • the volume of a droplet of water is generally less than 1.0 mL, but may be greater than this for viscous substances, and the single bound volume of the medium is referred to as a droplet.
  • centroid refers to a three-dimensional structure formed to such an extent that cells are aggregated and generally have a circular or elliptical cross-section.
  • the present invention provides a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant and a thickener.
  • the liquid bath composition in order to obtain a three-dimensional spherical cell structure, which is difficult to implement on a flat substrate, as a spheroid close to a spherical shape, by receiving the droplets discharged from the nozzle of the hydrogel discharge device using a liquid bath. It is a liquid bath composition implementing spheroids, which are spherical cell structures.
  • the surfactant included in the liquid bath composition in the present invention may be one selected from the group consisting of polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, sorbitan ester, polyoxyethylene sorbitan, polyoxyethylene ether, and mixtures thereof. have.
  • the surfactant is a polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer [eg, poloxamer (Poloxamer), pluronic F-127 (Pluronic) F-127)], sorbitan esters, for example, Span TM (Span TM)], polyoxyethylene sorbitan [e.g., Tween TM (Tween TM)], polyoxyethylene ethers [for example, Breeze TM (Brij TM )] and the like.
  • Span TM Polyoxyethylene sorbitan
  • polyoxyethylene sorbitan e.g., Tween TM (Tween TM)
  • polyoxyethylene ethers for example, Breeze TM (Brij TM )] and the like.
  • the surfactant may be included in an amount of 1 to 10% by weight, preferably 2 to 8% by weight, more preferably 4 to 6% by weight based on the total weight of the composition.
  • the thickener included in the composition of the present invention adjusts the viscosity of the bath composition to an appropriate range to maintain a spherical spheroid shape at the time the droplets discharged from the nozzle of the hydrogel discharge device are separated from the nozzle and minimize the impact. It serves to float inside the bath composition.
  • suitable thickeners examples include gellan gum, carrageenan gum, locust bean gum, xanthan gum, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl starch phosphate, poloxamer, and mixtures thereof. It may be one type selected from the group.
  • the thickener may be included in an amount of 0.001 to 10% by weight, preferably 0.005 to 5% by weight, more preferably 0.01 to 1% by weight based on the total weight of the composition.
  • the liquid bath composition for dipping the droplet may additionally include a curing agent.
  • the curing agent serves to harden the hydrogel droplets discharged from the nozzle of the hydrogel discharge device.
  • the curing agent may be used without limitation as long as it is a material capable of ultimately curing the hydrogel droplet by curing the material included in the hydrogel droplet, for example, transglutaminase, genipin. gelatin hardeners such as , glutaraldehyde, diisocyanates, and carbodiimides; alginate curing agents such as calcium chloride; fibrinogen curing agents such as thrombin; And it may be one selected from the group consisting of mixtures thereof.
  • the curing agent may be included in an amount of 1 to 10% by weight, preferably 2 to 5% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the liquid bath composition for dipping hydrogel droplets of the present invention may include poloxamer (polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer), gellan gum and transglutaminase as a preferred composition, and most preferred As a composition, 1 to 10% by weight of poloxamer (polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer), 0.001 to 10% by weight of gellan gum, and 1 to 10% by weight of transglutaminase may be included with respect to the total weight of the composition. .
  • the container used does not require a special container, but users can put the bath in the container they have been using, and this technology can be applied as long as it is a device that can put the bio-ink drop according to the position of the water surface of the bath.
  • composition of the liquid bath is shown in Table 1 below, and the composition of the bio-ink is shown in Table 2 below.
  • Pluronic F-127 was used for mixing a solution dissolved in DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) at 15%, and transglutaminase at 10% DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)
  • DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
  • a solution dissolved in DPBS was used for mixing .
  • Gellan gum was used by mixing a solution dissolved in tertiary distilled water at 1% to finally achieve the above mixing ratio.
  • Transglutaminase used as a curing agent is included in the liquid bath composition to harden the gelatin component of the bio-ink, and may be removed from the composition or replaced with another curing material depending on the characteristics of the bio-ink to be output into the liquid bath.
  • the liquid bath composition can be adjusted by varying the ratio of the thickener according to the viscosity of the bio-ink used.
  • the combination of liquid bath and bioink is important for the formation of spheres.
  • the manufacturing method is shown in summary in FIG. 1, and the manufacturing sequence is as follows.
  • the ink was discharged to the size of the spheroid to be produced and made to form as droplets (Beading step). At this time, the size of the droplets can be adjusted according to the discharge conditions such as the nozzle diameter, the discharge time, and the pressure, and it must be optimized and used according to the specifications of the discharge device to be used.
  • Cancer cell spheroids were prepared as follows with a 3D bioprinter.
  • the pellet (10 8 cells) of cells to be printed on spheroids is suspended in 1 mL of bioink (0.67% gellan gum + 6% gelatin in DPBS) preheated at 37 °C and loaded into the output barrel of the 3D bioprinter. did.
  • a 24-well plate was prepared by filling 400 ⁇ l/well of a liquid bath (gellan gum 0.1%, pluronic F-127 5%, transglutaminase 3% in DPBS).
  • the nozzle was 30G (blunt tip) and the pressure was 20 kPa, which was printed on a 24-well plate filled with a liquid bath.
  • FIG. 2 Pictures of the culture plate containing the spheroids are shown in FIG. 2 (A549, lung cancer cell line) and FIG. 3 (HT29, colorectal cancer cell line).
  • the nozzle was 30G (blunt tip) and the pressure was 20 kPa, which was printed on a 24-well plate filled with a liquid bath.
  • the spheroids were cultured in a low adhesion well plate. 1 mL/well of the culture medium (RPMI + 10% FBS + 1% antibiotic antimycotic solution) was used and cultured for 24 hours (37 °C, 5% CO 2 ).
  • the culture medium was removed, washed twice with 1 mL/well of DPBS, and treated with a fluorescence reagent (Fluorescence reagent: DPBS solution with an Ethidium homodimer-1 concentration of 4 ⁇ M and Calcein AM concentration of 1 ⁇ M).
  • Fluorescence reagent DPBS solution with an Ethidium homodimer-1 concentration of 4 ⁇ M and Calcein AM concentration of 1 ⁇ M.
  • A549 (lung cancer cell line) is shown in Figure 4 a photograph of observing the spheroids.
  • FIG. 5 A photograph of observing DU145 (prostate cancer cell line) spheroids is shown in FIG. 5 .
  • FIG. 6 A photograph of observing HT29 (colon cancer cell line) spheroids is shown in FIG. 6 .
  • FIG. 7 A photograph of observing HCT116 (colon cancer cell line) spheroids is shown in FIG. 7 .
  • FIG. 8 A photograph of observing MCF-7 (breast cancer cell line) spheroids is shown in FIG. 8 .
  • the nozzle was 30G (blunt tip) and the pressure was 20 kPa, which was printed on a 24-well plate filled with a liquid bath.
  • Human embryonic stem cells human embryonic stem cell, H9 of the pellet (10 8 cells) was a bio-ink (0.67% gellan gum + 6% gelatin in DPBS) was suspended in 1 mL pre-heating at 37 °C output of the 3D bio printer loaded into the barrel.
  • a 24-well plate was prepared by filling the liquid bath at 400 ⁇ l/well.
  • the nozzle was 30G (blunt tip) and the pressure was 20 kPa, which was printed on a 24-well plate filled with a liquid bath.
  • the spheroids were cultured in the culture medium.
  • CERO benchtop incubator & bioreactor
  • the first day photograph (inset is a photograph of the organoid formed by the existing technology) of the organoid produced by the 3D bioprinter is shown in FIG. 10, and the 7th day photograph of the organoid produced by the 3D bioprinter in FIG. 11 is shown. indicated.
  • FIG. 12 a graph showing the size of organoids and the standard deviation (Size uniformity) distribution of an aggregation-based organoid and a bioprintin-based organoid produced by a bioprinter is shown in FIG. 12 . .
  • the organoid size is more uniform in the case of the bioprintin-based organoid compared to the conventional aggregation-based organoid.
  • a liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent receives the droplets discharged from the nozzle of the hydrogel discharge device and separates from the nozzle.
  • the liquid bath composition for dipping hydrogel droplets comprising a surfactant, a thickener and, if necessary, a curing agent of the present invention can obtain a three-dimensional spherical spheroid in a uniform size in the field of spheroid production such as the cell culture field. It is expected that the technology will be usefully used.

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Abstract

본 발명은 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물을 제공한다. 본 발명의 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물에 의해 평면 기판에서 구현하기 어려운 3차원 구형의 스페로이드를 성공적으로 구현해 내고, 스페로이드의 크기 또한 균일하게 얻을 수 있으므로, 세포 배양 분야에서 3차원 구형의 스페로이드를 균일한 크기로 얻을 수 있는 기술로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물
본 발명은 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스(bath) 조성물에 관한 것이다.
최근 전세계적으로 인체 내 손상된 장기나 조직을 재생 또는 대체하기 위하여 장기 및 조직 이식이 증가하고 있는 추세이다. 하지만, 장기 이식을 위한 기증자 부족은 점점 증가하고 있고, 따라서 이를 해결하기 위하여 인공 조직 및 장기를 개발하려는 연구가 진행되고 있다. 일 예로서, 인공 조직 및 장기를 개발하기 위하여 제작하고자 하는 조직 및 장기에 적합한 세포를 3차원 지지체에 주입하고, 주입된 세포에 적절한 배양 환경을 제공하여 최종적인 인공 조직 및 장기를 제작하는 방법이 사용되고 있다. 또한, 세포와 함께 바이오잉크를 출력하는 3D 바이오프린팅 기술이 주목받고 있다.
3D 바이오프린팅은 살아있는 세포를 바이오 잉크와 함께 프린트하여, 인체에 이식 가능한 3 차원 인공 구조체 또는 지지체를 만드는 기술로서, 이러한 3D 바이오프린팅 기술을 이용하여 오가노이드(organoid), 장기유사 칩(organ-on-a-chip), 동물 실험대체를 위한 조직 및 장기 유사체 등과 같이 질병의 치유에 도움을 줄 수 있는 여러 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
최근에는, 종양 스페로이드(spheroid), 줄기세포 오가노이드(organoid) 및 3D 바이오프린팅을 통한 조직 공학과 같은 진보된 3D 세포 배양 방법을 사용하여 실제 생체내 세포 반응이 보다 면밀한 모델링으로 구현되고 있다. 이러한 과정에서 다양한 구조의 3D 바이오프린팅 시스템이 시도되고 있으며, 이와 함께 세포 배양 과정에서 발생되는 세밀한 문제점이 대두되고 있다.
즉, 기존의 응집방식으로 만들진 스페로이드는 균일성이 낮다는 문제점이 있고, 행잉드랍 방식은 균일한 스페로이드 제작은 가능하나 조작의 난이도가 높아 수행하는 연구자에 따라 오차가 발생할 가능성이 높다는 문제점이 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국특허 공개 제10-2018-0117179호 (2018년10월26일)
본 발명의 발명자들은 균일한 스페로이드를 신속하게 제작할 수 있는 기술에 대하여 연구하던 중, 액체 배스(liquid bath)를 사용하여 평면 기판에서는 구현하기 어려운 3차원 구형의 세포구조체인 스페로이드(spheroid)를 구현함으로써, 특별한 용기가 아닌 사용자들이 사용하던 기존 용기에 배스 조성물을 넣어 사용하여 3차원 구형의 구조체를 재현성 있게 구현할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 스페로이드(spheroid)를 구현할 수 있는 조성물인, 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스(bath) 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 계면활성제 및 점증제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스(bath) 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 솔비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 계면활성제는 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 점증제는 젤란검, 카라기난검, 로커스트콩검, 잔탄검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 스타치포스페이트, 폴록사머, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 점증제는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량%로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 경화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 경화제는 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 게니핀(genipin), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 다이아이소사이아네이트(diisocyanates), 카보다이이미드(carbodiimides), 염화칼슘, 트롬빈(thrombin), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 경화제는 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 젤란검 및 트랜스글루타미나제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체) 1 ~ 10 중량%, 젤란검 0.001 ~ 10 중량% 및 트랜스글루타미나제 1 ~ 10 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 의해, 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물이 하이드로겔 토출 장치의 노즐에서 토출되는 액적을 받아내어 노즐로부터 분리되는 시점에 구형의 스페로이드 형태를 유지하고 충격을 최소화하면서 배스 조성물에 내부 부유되도록 함으로써, 스페로이드 제작 기술에서 기존에 바이오리액터 또는 low attachment plate를 사용하던 기술인 응집방식 또는 행잉드랍방식에 비하여 빠르고 균일하게 스페로이드 제작이 가능하며, 연구자의 기술 성숙도와 관계없이 자동화된 방법으로도 활용할 수 있어 High-throughput screening (HTS) 분석에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 평면 기판에서 구현하기 어려운 3차원 구형의 스페로이드를 성공적으로 구현해 낼 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 세포 배양 분야 등 스페로이드 제작 분야에서 3차원 구형의 스페로이드를 균일한 크기로 얻을 수 있는 기술로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 스페로이드 제작 방법을 요약하여 도시한 개략도이다.
도 2는 배양 플레이트에서 배양되는 A549 (폐암 세포주)의 스페로이드 사진이다.
도 3은 배양 플레이트에서 배양되는 HT29(대장암 세포주)의 스페로이드 사진이다.
도 4는 A549[폐암 세포주] 스페로이드를 형광현미경으로 관찰한 사진이다[좌상: Bright Field image, 우상: Merged fluorescence image, 좌하: Calein AM(Green Fluorescence) image, live 세포, 우하: Ethidium homodimer-1(Red Fluorescence) image, dead 세포].
도 5는 DU145(전립선암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진이다[좌상: Bright Field image, 우상: Merged fluorescence image, 좌하: Calein AM(Green Fluorescence) image, live 세포, 우하: Ethidium homodimer-1(Red Fluorescence) image, dead 세포].
도 6은 HT29(대장암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진이다[좌상: Bright Field image, 우상: Merged fluorescence image, 좌하: Calein AM(Green Fluorescence) image, live 세포, 우하: Ethidium homodimer-1(Red Fluorescence) image, dead 세포].
도 7은 HCT116(대장암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진이다[좌상: Bright Field image, 우상: Merged fluorescence image, 좌하: Calein AM(Green Fluorescence) image, live 세포, 우하: Ethidium homodimer-1(Red Fluorescence) image, dead 세포].
도 8은 MCF-7(유방암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진이다[좌상: Bright Field image, 우상: Merged fluorescence image, 좌하: Calein AM(Green Fluorescence) image, live 세포, 우하: Ethidium homodimer-1(Red Fluorescence) image, dead 세포].
도 9는 3D 바이오프린터로 제작된 A549 스페로이드의 다양한 크기의 사진이다.
도 10은 3D 바이오프린터로 제작된 오가노이드의 1일차 사진이다(삽입도는 기존 기술에 의해 형성된 오가노이드의 사진임).
도 11은 3D 바이오프린터로 제작된 오가노이드의 7일차 사진이다.
도 12는 응집 기반 오가노이드(Aggregation-based organoid) 및 바이오프린터로 제작된 오가노이드(Bioprintin-based organoid)의 크기(Size of organoids) 및 표준편차(Size uniformity) 분포를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "액적(droplet)"은 하이드로겔 재료(액체 또는 겔일 수 있음)의 임의의 결속 부피를 지칭한다. 물 액적의 부피는 일반적으로 1.0 mL 미만이나, 점성 물질의 경우 이보다 큰 부피일 수 있으며, 매질의 단일 결속 부피를 액적으로 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "스페로이드(spheroid)"는 세포가 응집되어 대체적으로 단면이 원형 또는 타원형으로 보일 수 있을 정도로 형성된 입체 구조를 의미한다.
본 발명은 계면활성제 및 점증제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스(bath) 조성물을 제공한다.
상기 액체 배스 조성물은, 평면 기판에서 구현하기 어려운 3차원 구형의 세포구조체를 구형에 가까운 스페로이드로 얻기 위하여, 하이드로겔 토출 장치의 노즐에서 토출되는 액적을 액체 배스(liquid bath)를 사용하여 받아냄으로써 구형의 세포구조체인 스페로이드를 구현하는 액체 배스 조성물이다.
본 발명에서 액체 배스 조성물에 포함되는 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 솔비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다. 구체적으로, 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체[예를 들어, 폴록사머(Poloxamer), 플루로닉　 F-127(Pluronic　 F-127)], 솔비탄 에스테르[예를 들어, 스판TM(SpanTM)], 폴리옥시에틸렌 솔비탄[예를 들어, 트윈TM(TweenTM)], 폴리옥시에틸렌 에테르[예를 들어, 브리즈TM(BrijTM)] 등을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 계면활성제는 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 2 ~ 8 중량%, 더욱 바람직하게는 4 ~ 6 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 상기 점증제는 배스 조성물의 점도를 적절한 범위로 조절하여 하이드로겔 토출 장치의 노즐에서 토출되는 액적이 노즐로부터 분리되는 시점에 구형의 스페로이드 형태를 유지하고 충격을 최소화하면서 배스 조성물에 내부 부유되도록 하는 역할을 한다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 적절한 점증제의 예는 젤란검, 카라기난검, 로커스트콩검, 잔탄검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 스타치포스페이트, 폴록사머, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 점증제는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.005 ~ 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 1 중량%로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 경화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이 때 상기 경화제는 하이드로겔 토출 장치의 노즐에서 토출되는 하이드로겔 액적을 경화시키는 역할을 한다.
상기 경화제는 하이드로겔 액적에 포함되어 있는 물질을 경화시킴으로써 종국적으로 하이드로겔 액적을 경화시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 게니핀(genipin), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 다이아이소사이아네이트(diisocyanates), 카보다이이미드(carbodiimides) 등의 젤라틴 경화제; 염화칼슘 등의 알지네이트 경화제; 트롬빈(thrombin) 등의 피브리노겐 경화제; 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 경화제는 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 2 ~ 5 중량%로 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 바람직한 조성으로서 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 젤란검 및 트랜스글루타미나제를 포함할 수 있으며, 가장 바람직한 조성으로서, 조성물 총 중량에 대하여 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체) 1 ~ 10 중량%, 젤란검 0.001 ~ 10 중량% 및 트랜스글루타미나제 1 ~ 10 중량%를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 스페로이드 제작
(1) 개요
평면의 기판에서 구현하기 어려운 3차원 구형의 세포구조체를 액체 배스(liquid bath)를 사용하여 구현하기 위하여 하기 방법을 수행하였다. 사용되는 용기는 특별한 용기가 필요한 것이 아니라 사용자들이 기존 사용하던 용기에 배스를 넣어 사용할 수 있으며, 바이오잉크 액적(drop)을 배스의 수면 위치에 맞추어 넣어줄 수 있는 장치라면 본 기술을 적용 가능하다.
(2) 기술 내용
액체 배스의 조성은 하기 표 1과 같고, 바이오잉크의 조성은 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2020005104-appb-T000001
Figure PCTKR2020005104-appb-T000002
플루로닉 F-127은 15%로 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 녹인 용액을 혼합에 사용하였고, 트랜스글루타미나제는 10%로 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 녹인 용액을 혼합에 사용하였다.
젤란검은 3차 증류수에 1%로 녹인 용액을 최종적으로 상기 혼합 비율이 되도록 혼합하여 사용하였다.
경화제로 사용된 트랜스글루타미나제는 바이오잉크의 젤라틴 성분을 경화시키기 위하여 액체 배스 조성에 포함시킨 것으로, 액체 배스 안으로 출력할 바이오잉크의 특성에 따라 조성에서 제거되거나 다른 경화 물질로 대체 가능하다.
사용하는 바이오잉크의 점도에 따라 점증제의 비율을 달리하여 액체 배스 조성물을 조정할 수 있다. 액체 배스와 바이오잉크의 조합이 구형의 형성에 중요하다.
2. 스페로이드 제작 방법
(1) 개요
평면 기판에서 3차원 구형의 세포구조체를 균일하게 제작하기에는 어려움이 있으며, 이를 액체 배스와 바이오잉크 토출 장치로 해결하고자 하였다. 이러한 방법에 의하여 반복재현성을 가지는 3차원 구형 세포구조체의 제작이 가능하게 되었으며, 노즐의 직경에 따라 구형의 크기를 조절할 수 있고, 마이크로피펫 사용이 어려운 점성 소재를 바이오프린팅을 사용함으로써 균일한 토출이 가능하도록 하였다.
(2) 기술 내용
제작 방법을 도 1에 요약하여 도시하였고, 제작 순서는 하기와 같다.
① 출력 배스를 출력할 용기에 넣어 준비하고, 세포가 혼합된 바이오잉크(하이드로겔)를 출력용 배럴에 넣고 프린터에 장착하였다.
② 잉크를 제작하고자 하는 스페로이드의 크기로 토출하여 방울(droplet)로 맺히게 하였다(Beading 단계). 이 때, 노즐 직경과 토출 시간, 압력 등의 토출 조건에 따라 방울의 크기를 조절할 수 있으며, 사용하는 토출 장치의 사양에 따라 최적화하여 사용해야 한다.
③ 잉크가 맺힌 노즐을 출력 배스의 수면까지 내려 잉크 방울이 출력 배스 안으로 들어가게 하였다(Dipping Gelation 단계). 형성된 바이오잉크 방울이 디핑(dipping)에 의한 표면장력의 변화로 노즐로부터 분리되었다. 노즐의 끝이 잉크 방울의 크기보다 더 수면 안쪽으로 들어가는 경우 구형이 손상되므로, 제작 크기에 따라 노즐의 위치를 최적화할 필요가 있다. 이 단계는 디핑(dipping)에 의한 표면장력 변화로 바이오잉크 액적을 분리하는 원리이며, 이 때 배스 외부에서 만들어진 액적의 형상이 그대로 유지되면서 분리되기 위하여 액체 배스와 바이오잉크의 조합이 중요하다.
④ 출력 노즐을 원점으로 이동시켜 방울을 노즐과 분리하였다.
⑤ 필요에 따라, 37 ℃에서 30분간 경화시켰다. 이 때, 사용하는 바이오잉크의 특성에 따라 경화조건이 달라질 수 있다.
3. 스페로이드 제작
3D 바이오프린터로 하기와 같이 암세포 스페로이드를 제작하였다.
① 스페로이드를 출력할 세포의 펠렛(108 세포)을 37 ℃에서 예열한 바이오잉크(0.67% 젤란검 + 6% 젤라틴 in DPBS) 1 mL에 현탁시켜(suspension) 3D 바이오프린터의 출력 배럴에 로딩하였다. 24웰 플레이트에 액체 배스(젤란검 0.1%, 플루로닉 F-127 5%, 트랜스글루타미나제 3% in DPBS)를 400 ㎕/웰로 채워 준비하였다.
② 노즐은 30G(blunt tip)을 사용하였고 압력은 20 kPa로 액체 배스가 채워진 24웰 플레이트에 출력하였다.
③ 배양기(37 ℃)에서 30분간 경화시켰다.
④ 액체 배스를 제거하고 DPBS 1 mL로 세척한 후 스페로이드를 저부착 웰 플레이트(Low attachment well plate)에서 배양하였다.
- 배양액: RPMI + 10% FBS + 1% antibiotic antimycotic solution, 1 mL/웰
- 배양 조건: 37 ℃, 5% CO2
스페로이드가 담겨진 배양 플레이트의 사진을 도 2(A549, 폐암 세포주) 및 도 3(HT29, 대장암 세포주)에 나타내었다.
4. 3D 바이오프린터로 제작된 암세포 스페로이드의 생/사 분석(Live/Dead assay)
① 스페로이드를 출력할 세포의 펠렛(108 세포)을 37 ℃에서 예열한 바이오잉크(0.67% 젤란검 + 6% 젤라틴 in DPBS) 1 mL에 현탁하여 3D 바이오프린터의 출력 배럴에 로딩하였다. 24웰 플레이트에 액체 배스를 400 ㎕/웰로 채워 준비하였다.
② 노즐은 30G(blunt tip)을 사용하였고 압력은 20 kPa로 액체 배스가 채워진 24웰 플레이트에 출력하였다.
③ 37 ℃에서 30분간 경화시켰다.
④ 액체 배스를 제거하고 DPBS 1 mL로 세척한 후 스페로이드를 저부착 웰 플레이트에서 배양하였다. 배양액(RPMI + 10% FBS + 1% antibiotic antimycotic solution)을 1 mL/웰 사용하고 24시간 배양하였다(37 ℃, 5% CO2).
⑤ 배양액을 제거하고 DPBS 1 mL/웰로 2회 세척한 후 형광염료(fluorescence reagent)를 처리하였다(Fluorescence reagent: Ethidium homodimer-1 농도 4 μM, Calcein AM 농도 1 μM의 DPBS 용액).
⑥ 상온에서 30분간 반응 후 형광현미경으로 관찰하였다(Ex/Em: Calcein=494/517 nm, Ethidium homodimer-1 528/617 nm).
A549(폐암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진을 도 4에 나타내었다.
DU145(전립선암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진을 도 5에 나타내었다.
HT29(대장암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진을 도 6에 나타내었다.
HCT116(대장암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진을 도 7에 나타내었다.
MCF-7(유방암 세포주) 스페로이드를 관찰한 사진을 도 8에 나타내었다.
5. 3D 바이오프린터로 제작된 A549 스페로이드 크기 분포 분석
<실험방법>
① 스페로이드를 출력할 세포의 펠렛(108 세포)을 37 ℃에서 예열한 바이오잉크(0.67% 젤란검 + 6% 젤라틴 in DPBS) 1 mL에 현탁하여 3D 바이오프린터의 출력배럴에 로딩하였다. 24웰 플레이트에 액체 배스를 400 ㎕/웰로 채워 준비하였다.
② 노즐은 30G(blunt tip)을 사용하였고 압력은 20 kPa로 액체 배스가 채워진 24웰 플레이트에 출력하였다.
③ 37 ℃에서 30분간 경화시켰다.
④ 액체 배스를 제거하고 DPBS 1 mL로 세척한 후 현미경 관찰하여 각 스페로이드의 이미지를 얻었다. 얻어진 이미지를 도 9에 나타내었다.
⑤ 이미지(image) J 소프트웨어를 이용하여 스페로이드의 직경을 측정한 후 평균값과 표준편차를 구하였다. 그 결과, 평균 직경은 645.78 μm, 표준편차는 49.46 μm로 측정되었다.
6. 3D 바이오프린터로 제작된 오가노이드(organoid) 배양 및 크기 균일도 분석
① 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cell, H9)의 펠렛(108 세포)을 37 ℃에서 예열한 바이오잉크(0.67% 젤란검 + 6% 젤라틴 in DPBS) 1 mL에 현탁하여 3D 바이오프린터의 출력 배럴에 로딩하였다. 24웰 플레이트에 액체 배스를 400 ㎕/웰로 채워 준비하였다.
② 노즐은 30G(blunt tip)을 사용하였고 압력은 20 kPa로 액체 배스가 채워진 24웰 플레이트에 출력하였다.
③ 37 ℃에서 30분간 경화시켰다.
④ 액체 배스를 제거하고 DPBS 1 mL/웰로 2회 세척한 후 스페로이드를 배양액에서 배양하였다.
- 배양액: Essential8 (Gibco)
- 배양조건: CERO(benchtop incubator & bioreactor), 37℃, 5% CO2
도 10에 3D 바이오프린터로 제작된 오가노이드의 1일차 사진(삽입도는 기존 기술에 의해 형성된 오가노이드의 사진임)을 나타내었고, 도 11에 3D 바이오프린터로 제작된 오가노이드의 7일차 사진을 나타내었다.
또한, 도 12에 응집 기반 오가노이드(Aggregation-based organoid) 및 바이오프린터로 제작된 오가노이드(Bioprintin-based organoid)의 크기(Size of organoids) 및 표준편차(Size uniformity) 분포를 나타낸 그래프를 나타내었다.
도 10, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 기존기술인 응집 기반 오가노이드(Aggregation-based organoid)에 비하여 바이오프린터로 제작된 오가노이드(Bioprintin-based organoid)의 경우에 오가노이드 크기가 더욱 균일하다는 것을 알 수 있다.
본 발명에 의해, 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물이 하이드로겔 토출 장치의 노즐에서 토출되는 액적을 받아내어 노즐로부터 분리되는 시점에 구형의 스페로이드 형태를 유지하고 충격을 최소화하면서 배스 조성물에 내부 부유되도록 함으로써, 스페로이드 제작 기술에서 기존에 바이오리액터 또는 low attachment plate를 사용하던 기술인 응집방식 또는 행잉드랍방식에 비하여 빠르고 균일하게 스페로이드 제작이 가능하며, 연구자의 기술 성숙도와 관계없이 자동화된 방법으로도 활용할 수 있어 High-throughput screening (HTS) 분석에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 평면 기판에서 구현하기 어려운 3차원 구형의 스페로이드를 성공적으로 구현해 낼 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 계면활성제, 점증제 및 필요에 따라 경화제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물은 세포 배양 분야 등 스페로이드 제작 분야에서 3차원 구형의 스페로이드를 균일한 크기로 얻을 수 있는 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 계면활성제 및 점증제를 포함하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스(bath) 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 솔비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제가 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 점증제가 젤란검, 카라기난검, 로커스트콩검, 잔탄검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 스타치포스페이트, 폴록사머, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 점증제가 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 액적 디핑용 액체 배스 조성물이 경화제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 경화제가 트랜스글루타미나제(transglutaminase), 게니핀(genipin), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 다이아이소사이아네이트(diisocyanates), 카보다이이미드(carbodiimides), 염화칼슘, 트롬빈(thrombin), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 경화제가 조성물 총 중량에 대하여 1 ~ 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체)이고, 상기 증점제는 젤란검이고 상기 경화제는 트랜스글루타미나제인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 폴록사머(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체) 1 ~ 10 중량%, 젤란검 0.001 ~ 10 중량% 및 트랜스글루타미나제 1 ~ 10 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물.
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