WO2021130815A1 - 三次元構造体及び三次元構造体の製造方法 - Google Patents

Abstract

多層膜が三次元湾曲して内部空間を形成している、三次元構造体であって、前記多層膜は、炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記炭素単原子層物質を含む層が前記内部空間に接し、且つ前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、三次元構造体。

Description

三次元構造体及び三次元構造体の製造方法

　本発明は、三次元構造体及び三次元構造体の製造方法に関する。

　グラフェンに代表される炭素原子による単原子層物質は、高い電気伝導性、熱伝導性および化学安定性に加えて、生体適合性を備える。そのため、生体計測デバイスのセンサーを構成する材料として近年期待が高まっている。生体計測デバイスの計測対象となる生体組織のスケールは、ヒトや動物の個体レベルから、細胞レベルまで幅広く需要がある。また、生体計測デバイスにより計測される信号は、生体電気信号から、タンパク質及びアミノ酸に代表される生体分子まで多岐にわたる。

　グラフェンを用いた生体計測デバイスとしては、例えば、グラフェンを電極として脳内の神経細胞の発火に伴う細胞外電位を計測した例が存在する。また、生体分を検出可能な分子により、酸化グラフェンからなるセンサー感部を修飾した例が存在する（特許文献１）。

　しかしながら、炭素単原子層は平面であるという特徴から、計測対象である生体分子及び電流が周囲に拡散しやすい。また、平面であるセンサー部と細胞との接触面積が小さいため、細胞の放出する微量な信号を効率的に計測することが難しい。さらに、三次元的な生体組織に対して、センサー部を接触させることができない。以上のような問題点から、炭素単原子層の力学的強度、及び機械的柔軟性を利用して、様々な形状に炭素単原子層を変形させて、細胞を内包化する方法が検討されている。

　炭素単原子層の湾曲を誘導する方法として、炭素単原子層の表面をポリマーにより処理する方法が報告されている（非特許文献１）。また、連続した単層グラフェンと高分子薄膜とを張り合わせて多層薄膜を形成し、多層薄膜自身の厚み方向に剛直性の勾配を生じさせることにより、多層薄膜を屈曲させる方法が報告されている（非特許文献２）。
　また、細胞を内包可能な三次元構造体を形成する方法としては、シルクフィブロインゲル層と高分子薄膜とを張り合わせた多層薄膜を形成し、シルクフィブロインゲル層を膨潤させることにより、多層薄膜を屈曲させる方法が報告されている（特許文献２）。

特開２０１３－２５３８２５号公報 国際公開第２０１７／２０４２３５号

W. Xu et al., Ultrathin thermoresponsive self-folding 3D graphene. Sci. Adv., 2017, 3 (10), e1701084. K. Sakai et al., Graphene-based neuron encapsulation with controlled axonal outgrowth. Nanoscale, 2019, 11 (28), 13249-13259.

　しかしながら、非特許文献１の方法では、炭素単原子層をポリマーで修飾しているため、細胞が、直接、炭素単原子層に接触することができない。また、炭素単原子層への細胞の生着を制御する上では、炭素単原子層の表面を修飾しないことが望ましい。
　また、非特許文献２の方法では、単層グラフェンを外側にして、多層薄膜が屈曲する。そのため、屈曲構造体内に細胞を内包させた場合に、細胞が、単層グラフェンに接触することができない。
　また、特許文献１の方法では、三次元構造体が炭素単原子層を含まないため、細胞の活動電位又は生体分子を、直接、計測することができない。

　上記事情に鑑み、本発明は、炭素単原子層物質を含む層を内側にして三次元湾曲した構造を有する三次元構造体、及び前記三次元構造体の製造方法を提供することを目的とする。

　本発明の一態様は、多層膜が三次元湾曲して内部空間を形成している、三次元構造体であって、前記多層膜は、炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記炭素単原子層物質を含む層が前記内部空間に接し、且つ前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、三次元構造体である。

　本発明の一態様は、（ａ）炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、多層膜を形成する工程と、（ｂ）前記多層膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記多層膜に、自己組織的に、前記炭素単原子層物質を含む層が内側となる三次元湾曲形状を形成させる工程と、を含む、三次元構造体の製造方法である。

　本発明の一態様は、基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、前記湾曲誘導層上に積層された支持層と、前記支持層上に積層された炭素単原子層物質を含む層と、を含む積層体である。

　本発明により、炭素単原子層物質を含む層を内側にして三次元湾曲した構造を有する三次元構造体、及び前記三次元構造体の製造方法が提供される。

本発明の一態様に係る三次元構造体の概念図である。多層膜１（左図）を湾曲させることにより、三次元構造体１００（右図）が形成される。 本発明の一態様に係る三次元構造体の概念図である。細胞２を表面に存在させた状態で多層膜１（左図）を湾曲させることにより、細胞２を内包する三次元構造体１００（右図）が形成される。 多層膜の構成例を示す。 多層膜の構成例を示す。 多層膜の構成例を示す。 生体分子検出プローブを有する三次元構造体の一例を示す。 本発明の一態様に係る電気信号検出デバイスの一例を示す。 本発明の一態様に係る電気信号検出デバイスの一例を示す。 本発明の一態様に係る三次元構造体の製造方法の一例を説明する概略図である。 炭素単原子層物質を含む層を単層グラフェンとし、湾曲誘導層を複層グラフェン（２層）とした多層膜が、湾曲して三次元構造体を形成する過程を示す位相差顕微鏡像である。ＥＤＴＡ添加から、０秒後、１０秒後、及び２７秒後の位相差顕微鏡像を示す。 炭素単原子層物質を含む層を酸化グラフェンフレークとし、湾曲誘導層を単層グラフェン（２層）とした多層膜が、湾曲して三次元構造体を形成する過程を示す位相差顕微鏡像である。ＥＤＴＡ添加から、０秒後、２０秒後、及び４０秒後の位相差顕微鏡像を示す。 湾曲誘導層におけるグラフェンの層数と、三次元構造体の曲率半径との関係を示す。湾曲誘導層におけるグラフェンの層数の増加に伴い、三次元構造体の曲率半径が小さくなることが確認できる。 湾曲誘導層におけるグラフェンの層数、支持層の厚み、及び三次元構造体の曲率半径の関係を示すグラフである。湾曲誘導層におけるグラフェンの層数、及び支持層の厚みの増加に伴い、三次元構造体の曲率半径が小さくなることが確認できる。 細胞を内包化させた三次元構造体の位相差顕微鏡像である。細胞の播種直後に、犠牲層を溶解し、多層膜の湾曲を誘導した。

　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。

＜三次元構造体＞
　本発明の一態様に係る三次元構造体は、多層膜が三次元湾曲して内部空間を形成している、三次元構造体である。前記多層膜は、炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記炭素単原子層物質を含む層が前記内部空間に接し、且つ前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置することを特徴とする。
　以下に、本発明の好ましい一態様を示す図面を挙げ、本態様に係る三次元構造体について説明する。

　図１Ａは、本発明の一態様にかかる三次元構造体（右図）と、前記三次元構造体を形成する多層膜（左図）の一例を示す図である。三次元構造体１００は、多層膜１が三次元湾曲して形成され、多層膜１により区画される内部空間Ｓを有している（図１Ａ右図）。多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０と、支持層１１と、多層膜１の三次元湾曲を誘導する湾曲誘導層１２と、を有する。支持層１１は、炭素単原子層物質を含む層１０と湾曲誘導層１２との間に位置している（図１Ａ左図）。

　多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして湾曲し、内部空間Ｓを有する三次元構造体１００を形成する。そのため、三次元構造体１００において、炭素単原子層物質を含む層１０は、内部空間Ｓに接している。一方、湾曲誘導層１２は、外側に位置し、三次元構造体１００の外部空間に接している。

　図１Ｂは、三次元構造体１００に、細胞２を内包させたものである。多層膜１の炭素単原子層物質を含む層１０の表面に細胞２を存在させた状態で（図１Ｂ左図）、多層膜１を湾曲させることにより、三次元構造体１００に細胞２を内包させることができる（図１Ｂ右図）。

　図１Ａ及び図１Ｂの例では、長方形の多層膜１が湾曲することにより、筒状の三次元構造体１００を形成しているが、三次元構造体の形状はこれに限定されない。多層膜の厚さ及び形状を変化させることで、様々な三次元湾曲形状を有する三次元構造体を形成することができる。三次元湾曲形状の例としては、例えば、球状、回転楕円体等が挙げられる。また、筒状の三次元構造体は、円形状の横断面を有するものに限定されず、楕円形状、多角形状（三角形状、四角形状、五角形状、六角形状など）等の横断面を有するものであってもよい。三次元構造体１００が有する内部空間の形状は、前記三次元湾曲形状に応じて変化し、例えば、円柱状、球状、回転楕円形状、多角柱形状、多角錐形状、円錐形状等が例示される。

≪多層膜≫
　多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２を有している。多層膜１において、支持層１１は、炭素単原子層物質を含む層１０と湾曲誘導層１２との間に位置している。すなわち、多層膜１は、湾曲誘導層１２、支持層１１、及び炭素単原子層物質を含む層１０が、この順で積層された積層体である。

（炭素単原子層物質を含む層）
　炭素単原子層物質を含む層１０は、炭素単原子層物質を含む層である。「炭素単原子層物質」とは、１層の炭素原子の層からなる物質を意味する。「炭素単原子層物質を含む層」とは、１層の炭素原子の層からなる物質を含む層を意味する。炭素単原子層物質を含む層１０に用いられる炭素単原子層物質は、１層の炭素単原子の層からなるものであれば特に限定されない。炭素単原子層物質としては、薄膜形状に加工が可能なナノマテリアル（少なくとも一次元が１００ｎｍ以下の材料）が挙げられる。炭素単原子層物質は、溶液中に浸漬された際に大きな体積変化を誘導しない材料が好ましい。三次元構造体１００の内部の観察が可能になることから、炭素単原子層物質は、光透過性が高い材料が好ましい。三次元構造体１００に細胞を内包させる場合、炭素単原子層物質は、生体適合性の高い材料が好ましい。さらに、炭素単原子層物質は、支持層１１に含まれる化合物と、π－π相互作用をするものが好ましい。そのような炭素単原子層物質を選択することにより、炭素単原子層物質を含む層１０と支持層１１との密着性を高めることができる。

　炭素単原子層物質としては、例えば、グラフェン、及びグラフェン誘導体等が挙げられる。炭素単原子層物質を含む層１０に含まれ炭素単原子層物質は、１種であってもよく、２種以上であってもよいが、１種であることが好ましい。炭素単原子層物質を含む層１０は、例えば、グラフェン又はグラフェン誘導体から構成されてもよい。

　炭素単原子層物質としては、グラフェン又はグラフェン誘導体が好ましい。グラフェン誘導体としては、例えば、酸化グラフェン、及び酸化グラフェン還元体等が挙げられる。グラフェン及びその誘導体は、生体適合性が高いため、三次元構造体１００に細胞を内包させて長期間培養することができる。また、三次元構造体１００を生体内に埋植した場合に、埋植後の炎症を引き起こしにくい。さらに、グラフェン及びその誘導体は、透明性が高いため、イメージングを併せた評価も可能となる。

　炭素単原子層物質を含む層１０が、炭素単原子層物質としてグラフェンを含む場合、炭素単原子層物質を含む層１０は、単層グラフェンから構成されてもよく、複数枚の単層グラフェン（以下、「複層グラフェン」ともいう）から構成されていてもよい。
　炭素単原子層物質を含む層１０は、炭素単原子層物質のフレークから構成されてもよい。炭素単原子層物質を含む層１０は、単層グラフェン又はグラフェン誘導体（酸化グラフェン、酸化グラフェン還元体等）のフレークから構成されてもよい。
　連続した単層グラフェンは、フレークと比較して、導電性に優れる。そのため，炭素単原子層物質を含む層１０を、電気信号を検出するための電極又は導線として用いる場合には，単層グラフェン又は複層グラフェンを用いることが好ましい。
　一方で、グラフェン誘導体（酸化グラフェン、酸化グラフェン還元体等）のフレークは，簡便かつ安価に炭素単原子層物質を含む層１０を形成することができるため，光学的な分子プローブを用いた生体分子の測定に適している。

　炭素単原子層物質を含む層１０が複層グラフェンから構成される場合、層数は特に限定されないが、１～３０層から構成されることが好ましい。多層膜１の透明性を保つ観点からは、炭素単原子層物質を含む層１０は、１～４層の単層グラフェンから構成されることがより好ましい。

　炭素単原子層物質を含む層１０の厚みは、０．３～１０ｎｍであることが好ましい。安定な三次元湾曲形状形成の観点から、炭素単原子層物質を含む層１０の厚みは、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～５ｎｍであることがより好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがさらに好ましい。

（支持層）
　支持層１１は、分子内に芳香環を多く有し、炭素単原子層物質を含む層１０が含む炭素単原子層物質とπ－π相互作用する高分子化合物を含むことが好ましい。そのような高分子化合物を用いることにより、支持層１１の炭素単原子層物質を含む層１０に対する密着性が高くなる。また、支持層１１は、炭素単原子層物質を含む層１０と湾曲誘導層１２との間の導通を防ぐために、絶縁性を有することが好ましい。また、支持層１１は、光透過性が高く、生体適合性の高い材料で構成されることが好ましい。例えば、支持層１１は、光透過性が高く、細胞毒性のない高分子化合物を用いることができる。そのような高分子化合物としては、例えば、ポリパラキシレン又はその誘導体等が挙げられる。ポリパラキシレンの誘導体としては、例えば、ハロゲン化パラキシレン（クロロパラキシレン、フルオロパラキシレンなど）のポリマー等が挙げられる。

　中でも、支持層１１に用いる高分子化合物としては、ポリパラキシレンが好ましい。ポリパラキシレンは、生体適合性および絶縁性が高い。また、透明性が高いため、イメージングを併せた評価も可能となる。さらに、ポリパラキシレンの薄膜は、柔軟かつ堅牢である。そのため、ナノメートルレベルの薄膜であっても、多層膜１が形成する三次元湾曲構造を維持することができる。さらに、炭素単原子層物質を含む層１０からの剥離及び断裂が生じにくく、導通性を失うことなく所望の三次元湾曲形状を形成することができる。

　支持層１１が含む高分子化合物は、１種であってもよく、２種以上であってもよいが、１種であることが好ましい。支持層１１は、高分子化合物の薄膜から構成されていてもよい。前記高分子化合物の薄膜は、単層であってもよく、複数層であってもよい。

　支持層１１の厚みは、１０～９００ｎｍであることが好ましい。支持層１１が複数層の薄膜から構成される場合、それら複数層の薄膜を合計した厚みが、支持層１１の厚みとなる。安定な三次元湾曲形状形成の観点から、支持層１１の厚みは、４０～４００ｎｍであることが好ましく、５０～２５０ｎｍであることがより好ましい。

（湾曲誘導層）
　湾曲誘導層１２は、変形能を有する材料（以下、「変形材料」ともいう）から構成される。変形材料は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。変形材料は、単独で変形能を有するものであってもよく、炭素単原子層物質を含む層１０及び支持層１１との相互作用により変形能を有するものであってもよい。変形材料としては、例えば、膨潤により体積変化を起こすハイドロゲル（シルクフィブロインゲル、ゼラチン等）、架橋密度に勾配を有する高分子薄膜；及び連続した単原子層等が挙げられる。

　湾曲誘導層１２は、支持層１１に対する密着性を有する材料を含むことが好ましい。例えば、支持層１１が芳香環を含む高分子化合物を含む場合、湾曲誘導層１２は、前記高分子化合物とπ－π相互作用する物質を含むことが好ましい。支持層１１と湾曲誘導層１２との密着性を高めることにより、支持層１１と湾曲誘導層１２とが剥離することなく、多層膜１を湾曲させることができる。

　湾曲誘導層１２は、生体適合性の高い材料で構成されることが好ましい。また、湾曲誘導層１２は、透明性の高い材料で構成されることが好ましい。湾曲誘導層１２を透明性の高い材料で構成することにより、光学的な観察手法を適用することができる。特に、生体分子検出プローブを用いて生体分子を検出する場合には、生体分子検出プローブの検出シグナルを光学的に観察するために、透過性の高い材料を用いることが好ましい。

　中でも、湾曲誘導層１２は、グラフェンを含むことが好ましい。グラフェンは生体適合性及び光透過性が高い。また、層数による厚みの調整が容易であるため、湾曲後の曲率を制御しやすい。湾曲誘導層１２にグラフェンを用いる場合、湾曲誘導層１２は、単層グラフェンで構成されてもよく、複層グラフェンで構成されていてもよい。湾曲誘導層１２がグラフェンから構成される場合、層数は特に限定されない。炭素単原子層物質を含む層１０もグラフェンから構成される場合、湾曲誘導層１２のグラフェンの層数は、炭素単原子層物質を含む層１０のグラフェンの層数よりも多いことが好ましい。湾曲誘導層１２の層数を多くすることにより、多層膜１内に応力の勾配が生じ、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にした湾曲が生じやすくなる。
　炭素単原子層物質を含む層１０がグラフェンのフレーク又はグラフェン誘導体のフレークから構成される場合、湾曲誘導層１２は、単層グラフェンで構成されてもよい。この場合、炭素単原子層物質を含む層１０のフレークでは湾曲に寄与する応力を生じないため、多層膜１内に応力の勾配が生じ、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして多層膜１を湾曲させることができる。
　多層膜１の透明性を保つためには、湾曲誘導層１２は、１～４層のグラフェンから構成されることが好ましい。

　湾曲誘導層１２の厚みは、０．３～１０ｎｍであることが好ましい。安定な三次元湾曲形状形成の観点から、湾曲誘導層１２の厚みは、０．３～７ｎｍであることが好ましく、０．３～５ｎｍであることがより好ましく、０．３～１．２ｎｍであることがさらに好ましい。

　炭素単原子層物質を含む層１０と支持層１１との厚みの比率（炭素単原子層物質を含む層１０の厚み／支持層１１の厚み）は、１／３０００～１／１の範囲であることが好ましく、１／１２００～１／４の範囲であることがより好ましい。湾曲誘導層１２と支持層１１との厚みの比率（湾曲誘導層１２の厚み／支持層１１の厚み）は、１／３０００～１／１の範囲であることが好ましく、１／１２００～１／４の範囲であることがより好ましい。

　前記範囲内で炭素単原子層物質を含む層１０の厚みを大きくすると、三次元構造体１００の三次元湾曲形状の曲率半径を大きくすることができる。一方、湾曲誘導層１２の厚みを大きくすると、三次元構造体１００の三次元湾曲形状の曲率半径を小さくすることができる。また、支持層１１の厚みを大きくすると、三次元構造体１００の三次元湾曲形状の曲率半径を大きくすることができる。

　多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２に加えて、他の層を有していてもよく、有していなくてもよいが、有していないことが好ましい。すなわち、多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２からなる積層体であって、湾曲誘導層１２、支持層１１、及び炭素単原子層物質を含む層１０がこの順で積層されていることが好ましい。前記積層体では、炭素単原子層物質を含む層１０と支持層１１とが隣接し、且つ支持層１１と湾曲誘導層１２とが隣接する。

（多層膜の構成例）
　図２Ａ～２Ｃに、多層膜の構成例を示す。

　図２Ａの多層膜１ａは、炭素単原子層物質を含む層１０が単層グラフェン２０で構成されており、湾曲誘導層１２がハイドロゲル２３で構成されている。ハイドロゲル２３としては、例えば、シルクフィブロインゲルを用いることができる。ハイドロゲル２３は、水分により膨潤し、体積が変化する。一方、炭素単原子層物質を含む層１０の単層グラフェン２０は水分で膨潤しない。そのため、多層膜１ａを水分に接触させると、ハイドロゲル２３の体積変化により、多層膜１に応力勾配が生じる。その結果、多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして湾曲する。

　図２Ｂの多層膜１ｂは、炭素単原子層物質を含む層１０が単層グラフェン２０で構成されており、湾曲誘導層１２が複層グラフェン２１で構成されている。複層グラフェン２１は、複数枚の単層グラフェン２０から構成される。湾曲誘導層１２の複層グラフェン２１は、炭素単原子層物質を含む層１０の単層グラフェン２０よりも湾曲する駆動力が強いため、多層膜１に応力勾配が生じる。その結果、多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして湾曲する。

　図２Ｃの多層膜１ｃは、炭素単原子層物質を含む層１０がグラフェン誘導体のフレーク２２で構成されており、湾曲誘導層１２が単層グラフェン２０で構成されている。グラフェン誘導体のフレーク２２としては、例えば、酸化グラフェンフレークを用いることができる。炭素単原子層物質を含む層１０のフレーク２２は、応力が生じない一方、湾曲誘導層１２の単層グラフェン２０は応力が生じるため、多層膜１に応力勾配が生じる。その結果、多層膜１は、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして湾曲する。

　図２Ａ～２Ｃにおいて、支持層１１は、芳香環を多く有する高分子化合物で構成することができる。支持層１１は、例えば、ポリパラキシレン又はその誘導体で構成される。

≪他の構成≫
　本実施形態の三次元構造体は、上記構成に加えて、他の構成を有していてもよい。

（細胞）
　本実施形態の三次元構造体は、その内部空間Ｓに、細胞が存在していてもよい。「内部空間に存在している」とは、多層膜により規定される内部空間に、細胞の少なくとも一部が存在していることを意味する。細胞は、必ずしも細胞全体が内部空間Ｓに存在している必要はない。細胞を内包する三次元構造体は、生体への移植組織として用いることができる。生体に移植された三次元構造体は、移植組織及びホスト組織の電気活動のモニタリングに用いることができる。

　細胞は、動物細胞でもよく、植物細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、哺乳類細胞が好ましい。哺乳類細胞としては、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳類の細胞が挙げられる。ヒト以外の哺乳類の細胞としては、霊長類細胞（チンパンジー、ゴリラ、サルなど）、家畜動物の細胞（ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなど）、げっ歯類の細胞（マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、ペット類の細胞（イヌ、ネコ、ウサギなど）が挙げられる。

　細胞の細胞種は特に限定されず、生体内のいかなる細胞であってもよい。細胞２としては、例えば、神経細胞、グリア細胞、心筋細胞、線維芽細胞、血管上皮細胞等が挙げられる。三次元構造体を移植用の神経組織とする場合、細胞２としては、例えば、神経細胞及びグリア細胞が挙げられる。細胞は、１種類の細胞であってよく、複数種類の細胞の混合物であってもよい。細胞の混合物としては、例えば、神経細胞及びグリア細胞の混合物が挙げられる。

　三次元構造体の内部空間Ｓに内包される細胞の数は、特に限定されない。細胞の数は、内部空間Ｓの大きさに応じた任意の数であってよい。細胞は、三次元構造体に内包されたまま培養可能であり、内部空間Ｓで増殖し得る。そのため、最初に内包される細胞の数に関わらず、培養を続けることにより、内部空間Ｓを適正な数の細胞で満たすことができる。

　三次元構造体が細胞を内包する場合、細胞は、炭素単原子層物質を含む層に接触していることが好ましい。本実施形態の三次元構造体では、炭素単原子層物質を含む層が内側に配置されるため、内部空間Ｓに存在する細胞が炭素単原子層物質を含む層に接触することができる。細胞が炭素単原子層物質を含む層に接触していることにより、細胞から生じる電気信号を感度よく検出することができる。さらに、三次元構造体は、三次元湾曲構造を有するため、炭素単原子層物質を含む層が平面である場合に比べて、細胞と接触する炭素単原子層物質を含む層の面積を大きくすることができる。

（孔）
　本実施形態の三次元構造体は、その内部空間Ｓと外部空間とを連通する孔を有していてもよい。三次元構造体が孔を有する場合、孔は多層膜に形成される。多層膜が孔を有することにより、三次元構造体の内部空間と外部空間との間の物質交換が可能となる。そのため、三次元構造体に細胞が内包されている場合には、栄養成分及び酸素の透過性が向上し、細胞の生育環境が良好になる。

　多層膜が孔を有する場合、孔からの細胞の流出を防ぐため、孔の孔径は、細胞２よりも小さいことが好ましい。孔の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。孔の横断面形状としては、例えば、円形状、楕円形状、多角形状（三角形、四角形、六角形など）等が挙げられるが、これらに限定されない。形成の容易性等から、孔の横断面形状は、円形状又は楕円形状が好ましい。

（生体分子検出プローブ）
　三次元構造体は、生体分子検出プローブを有していてもよい。生体分子検出プローブは、生体分子の濃度に応じて、シグナル強度が変化する機能を有する。生体分子検出プローブは、細胞から分泌される生体分子の検出等に用いることができる。生体分子検出プローブとしては、例えば、特開２０１３－２５３８２５号公報に記載のもの等が挙げられる。

　図３は、生体分子検出プローブを含む三次元構造体の一例を示す図である。三次元構造体１００’は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２からなる多層膜１が、三次元湾曲して形成されている。三次元構造体１００’は、内部空間Ｓに細胞２を内包している。炭素単原子層物質を含む層１０は、生体分子検出プローブ６を有している。

　生体分子検出プローブ６は、検出対象である生体分子に特異的に結合する特異的結合物質６１と、シグナル分子６０とから構成されている。

　特異的結合物質６１は、検出対象である生体分子に対して特異的に結合可能な物質であれば、特に限定されない。特異的結合物質６１としては、例えば、アプタマーが挙げられる。アプタマーは、特定の分子に特異的に結合する機能を有する核酸（核酸アプタマー）又はペプチド（ペプチドアプタマー）である。特異的結合物質６１に用いるアプタマーは、核酸アプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーであってもよい。核酸アプタマーとしては、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡ及びＤＮＡからなるＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー等が挙げられる。核酸アプタマーは、人工核酸（ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ等）を含んでいてもよい。標的分子に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法又はＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等の公知の方法により選択することができる。
　特異的結合物質６１の結合標的は、特に限定されず、任意の生体分子であってよい。結合標的としては、例えば、各種タンパク質、酵素、抗体、レセプター、ホルモン、ペプチド、脂質、アミノ酸，抗生物質等が挙げられるが、これらに限定されない。

　シグナル分子６０は、蛍光等のシグナルを発生する分子である。シグナル分子６０が発生するシグナルは、炭素単原子層物質を含む層１０によりクエンチングされる。炭素単原子層物質を含む層１０のシグナルクエンチング能力は、シグナル分子６０と炭素単原子層物質を含む層１０との距離に応じて変化する。シグナル分子６０と炭素単原子層物質を含む層１０との距離が近いと、クエンチング効率が上昇し、シグナル強度が低下する。一方、シグナル分子６０と炭素単原子層物質を含む層１０との距離が遠いと、クエンチング効率が低下し、シグナル強度が上昇する。
　シグナル分子６０としては、蛍光分子が挙げられる。蛍光分子としては、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ等が挙げられるが、これらに限定されない。

　生体分子検出プローブ６は、炭素単原子層物質を含む層１０に、接着されていることが好ましい。例えば、特異的結合物質６１の一端にシグナル分子６０を結合し、特異的結合物質６１の他端を、炭素単原子層物質を含む層１０に接着してもよい。接着方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。接着方法としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を有する接着分子等の接着分子を用いる方法等が挙げられる（特開２０１３－２５３８２５号公報）。

　三次元構造体１００’において、細胞２が放出した生体分子が特異的結合物質６１に結合すると、特異的結合物質６１の構造が変化する。これにより、シグナル分子６０と炭素単原子層物質を含む層１０との距離が変化し、シグナル強度が変化する。シグナル分子６０が蛍光分子である場合、シグナル強度の変化は、蛍光顕微鏡により検出することができる。

　三次元構造体１００’では、炭素単原子層物質を含む層１０は、シグナル分子６０が発生するシグナルのクエンチング能力があればよい。そのため、簡易かつ安価に製造できる観点から、グラフェンのフレーク又はグラフェン誘導体（酸化グラフェン、酸化グラフェン還元体等）のフレークを用いることができる。

　本実施形態の三次元構造体は、炭素単原子層物質を含む層を内側にして湾曲し、炭素単原子層物質を含む層が内部空間に接している。また、湾曲の際に、炭素単原子層物質を含む層の表面を化学的に修飾する必要がない。そのため、三次元構造体の内部空間で、細胞が炭素単原子層物質を含む層に接触した状態で、細胞を培養することができる。これにより、内部空間に内包された細胞からの生体信号を簡易に計測することができる。
　また、本実施形態の三次元構造体は、三次元湾曲構造を有するため、炭素単原子層物質を含む層が平面である場合と比較して、細胞又は生体分子との接触面積が大きくなる。その結果、細胞の生体信号又は生体分子に起因する電流の増幅が見込まれる。
　さらに、本実施形態の三次元構造体は、三次元形状の細胞塊組織からの生体信号計測が可能になる。
　本実施形態の三次元構造体によれば、グラフェン等の炭素単原子層物質を電極として、細胞の発火に伴う細胞外電位変動を計測することができる。さらに、炭素単原子層物質を含む層（酸化グラフェンのフレーク又は酸化グラフェン還元体のフレークから構成されることが好ましい）に、生体分子検出プローブを接着することにより、生体分子の計測を効率的に行うことができる。

＜電気信号検出デバイス＞
　本発明の一態様に係る電気信号検出デバイスは、上記態様に係る三次元構造体と、前記三次元構造体の炭素単原子層物質を含む層に接続する導線と、を備える。

　図４は、本実施形態の電気信号検出デバイスの一例を示す図である。図４では、多層膜１が、三次元構造体１００を形成する前の状態を示している。多層膜１に厚み方向の歪みの勾配を発生させることにより、前記歪みの勾配を駆動力として、多層膜１に三次元構造体１００を形成させることができる。これにより、三次元構造体１００を備える電気信号検出デバイスを得ることができる。

　電気信号検出デバイス２００は、三次元構造体１００を形成する前の多層膜１と、導線３０，３１と、前記多層膜１に導線３０，３１が接続する導線接続部１’と、これらの部材が載置される基板１４とを有している。基板１４の材料としては、後述の＜三次元構造体の製造方法＞で挙げるものと同様のものが挙げられる。

　導線接続部１’では、基板１４上に、導線３１、湾曲誘導層１２、支持層１１、導線３０、及び導線３１がこの順で積層されている。導線３０は、導線接続部１’を介して、三次元構造体１００（湾曲前は多層膜１）の炭素単原子層物質を含む層１０に接続する。そのため、導線３０に計測装置のプローブ５ａを接続することにより、炭素単原子層物質を含む層１０の電気特性を測定することができる。また、導線３１は、導線接続部１’を介して、三次元構造体１００（湾曲前は多層膜１）の湾曲誘導層１２に接続する。そのため、湾曲誘導層１２が導電性材料を含む場合、導線３１に計測装置のプローブ５ｂを接続することにより、湾曲誘導層１２の電気特性を測定することができる。湾曲誘導層１２が導電性材料を含まない場合、又は湾曲誘導層１２の電気特性を測定する必要がない場合には、導線３１は設けなくてもよい。

　支持層１１に絶縁性の高い材料を用いることで、導線３０，３１が混線することなく、炭素単原子層物質を含む層１０及び湾曲誘導層１２の電気特性を独立して計測することができる。支持層１１を構成する材料としては、ポリパラキシレンが挙げられる。

　電気信号検出デバイス２００は、基板１４上に、導線３１、湾曲誘導層１２、支持層１１、導線３０、及び炭素単原子層物質を含む層１０をこの順で積層することにより、作製することができる。前記各層を形成しながら、フォトリソグラフィ技術等を用いて、各層を任意の形状にパターニングすることができる。これにより、三次元構造体１００を形成させるための多層膜１を任意の形状及び配置にすることができる。また、導線３０，３１、及び導線接続部１’を、任意の形状及び配置にすることができる。
　前記積層体を作製した後、多層膜１に厚み方向の応力分布を発生させることにより、多層膜１を湾曲させて、三次元構造体１００を形成する。このとき、湾曲前と湾曲後の炭素単原子層物質を含む層１０及び湾曲誘導層１２の抵抗値を測定することで、多層膜１の変形による電気特性の変化を評価することができる。

≪他の実施形態≫
　図５は、電気信号検出デバイスの他の実施形態を示す図である。図５の電気信号検出デバイス２０１は、三次元構造体１００と、前記三次元構造体１００の炭素単原子層物質を含む層１０に接続する導線３０と、前記炭素単原子層物質を含む層１０に導線３０が接続する導線接続部１０’と、前記三次元構造体１００の支持層１１が延長して形成される支持層延長部１１’と、絶縁層４とを有している。三次元構造体１００の内部空間Ｓには、細胞２が存在している。

　電気信号検出デバイス２０１では、三次元構造体１００の支持層１１が延長して形成される支持層延長部１１’上に導線３０が形成されている。導線３０は、三次元構造体１００の炭素単原子層物質を含む層１０が延長して形成される導線接続部１０’を介して、炭素単原子層物質を含む層１０に接続している。導線３０に、計測装置のプローブ５を接続することにより、炭素単原子層物質を含む層１０の電気特性を計測することができる。また、細胞２の活動により生じる電気特性の変化を検出することができる。

　導線３０は、絶縁層４により覆われている。絶縁層４を形成することにより、導線３０からの電流の漏出を防止することができる。導線３０がプローブ５と接続する部位では絶縁層４は存在せず、導線３０が露出していることが好ましい。

　電気信号検出デバイス２０１は、湾曲誘導層１２、支持層１１、導線３１、炭素単原子層物質を含む層１０、及び絶縁層４をこの順で積層することにより、作製することができる。前記各層を形成しながら、フォトリソグラフィ技術等を用いて、各層を任意の形状にパターニングすることができる。これにより、三次元構造体１００を形成させるための多層膜１を任意の形状及び配置にすることができる。また、導線３０，導線接続部１０’、支持層延長部１１’、及び絶縁層４を、任意の形状及び配置にすることができる。
　前記積層体を作製した後、多層膜１に厚み方向の応力分布を発生させることにより、多層膜１を湾曲させて、三次元構造体１００を形成する。このとき、炭素単原子層物質を含む層１０上に細胞２を存在させて多層膜１を湾曲させることにより、細胞２を三次元構造体１００に内包させることができる。

　電気信号検出デバイス２００，２０１において、導線３０，３１、及び絶縁層４としては、以下のようなものを用いることができる。

（導線）
　導線３０，３１は、炭素単原子層物質を含む層１０又は湾曲誘導層１２と、電気特性計測装置とを接続するために用いられる。導線３０，３１は、導電性を有するものであれば、材質は特に限定されない。導線３０，３１の材料としては、支持層１１上に成膜できるものが好ましい。そのような材料としては、例えば、金属、及び合金が挙げられる。また、三次元構造体１００の内部空間Ｓで細胞２を長期間培養しても、酸化被膜の形成が起こりにくいものが好ましい。さらに、細胞２の光学的観察を行う場合には、導線３０，３１は透明であることが好ましい。
　導線３０，３１の材料として使用可能な金属の具体例としては、例えば、金、銅、白金、アルミ、チタン、及びクロム等が挙げられる。また、合金の具体例としては、例えば、インジウム酸化スズ等が挙げられる。

　導線３０，３１の厚みは、特に限定されないが、１０～１０００ｎｍ程度が好ましい。導線３０，３１の具体例としては、例えば、５０ｎｍ程度の厚みを有する金の導線、及び３００ｎｍ程度の厚みを有するインジウム酸化スズの導線等が挙げられるが、これらに限定されない。

（絶縁層）
　絶縁層４は、導線３０からの電流の漏出を防ぐためのものである。絶縁層４は、絶縁性を有する材料で構成されていればよく、材質は特に限定されない。絶縁層４の材料としては、生体適合性が高く、細胞生着性の高いものが好ましい。また、細胞２の光学的観察を行う場合には、絶縁層４は透明であることが好ましい。
　絶縁層４の材料としては、例えば、フォトレジストをはじめとする高分子化合物が挙げられる。前記高分子化合物の具体例としては、ＯＦＰＲ－８００（東京応化工業株式会社製）、ＳＵ－８（日本化薬株式会社製）などのフォトレジスト；ポリパラキシレン；及びポリイミド等が挙げられる。

　絶縁層４の厚みは、特に限定されないが、０．１～２０μｍ程度が好ましい。絶縁層４の具体例としては、例えば、上記のような高分子化合物から構成される、２μｍ程度の厚みを有する高分子化合物層が挙げられる。

　本実施形態の電気信号検出デバイスは、上述の三次元構造体と、前記三次元構造体の炭素単原子層物質を含む層に接続する導線とを備えているため、三次元構造体の内部空間の電気特性を直接計測することができる。また、三次元構造体に細胞を内包させた場合に、細胞が炭素単原子層物質を含む層に接触することができるため、細胞の活動電位を感度よく検出することができる。

＜三次元構造体の製造方法＞
　本発明の一態様に係る三次元構造体の製造方法は、（ａ）炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、多層膜を形成する工程と、（ｂ）前記多層膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記多層膜に、自己組織的に、前記炭素単原子層物質を含む層が内側となる三次元湾曲形状を形成させる工程と、を含む。
　本実施形態の製造方法により得られる三次元構造体は、前記多層膜の三次元湾曲形状による内部空間を有しており、前記炭素単原子層物質を含む層が前記内部空間に接している。したがって、本実施形態の製造方法により、上記実施形態の三次元構造体を得ることができる。

　図６は、三次元構造体の製造方法の概略を示す図である。
　まず、炭素単原子層物質を含む層１０と、支持層１１と、湾曲誘導層１２とを有する多層膜１を形成する（図６（ａ）～（ｅ）：工程（ａ））。図６（ａ）～（ｅ）の例では、基板１４上に犠牲層１３を形成し、犠牲層１３上に湾曲誘導層１２、支持層１１、及び炭素単原子層物質を含む層１０を順に積層して多層膜１を形成している。
　次いで、任意に、パターニング（図６（ｆ）～（ｇ））、及び細胞２の播種（図６（ｈ）～（ｉ）））等を行う。
　次いで、多層膜１の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、多層膜１に、自己組織的に、炭素単原子層物質を含む層１０が内側となる三次元湾曲形状を形成させる（図６（ｉ）～（ｊ）：工程（ｂ））。図６（ｉ）～（ｊ）の例では、多層膜１が変形能を有する湾曲誘導層１２を有することで、多層膜１の厚み方向に応力分布が形成される。そのため、犠牲層１３を分解して多層膜１を基板１４から遊離させることで、多層膜１の面内方向に歪みの勾配が形成される（図６（ｉ））。この歪みの勾配を駆動力として、炭素単原子層物質を含む層１０を内側にして多層膜１が屈曲し（図６（ｉ））、炭素単原子層物質を含む層１０が内側となる三次元湾曲形状が自己組織的に組み立てられる（図６（ｊ））。その結果、三次元構造体１００を得ることができる。
　以下、本実施態様に係る電極の製造方法の各工程について説明する。

［工程（ａ）］
　工程（ａ）は、炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、多層膜を形成する工程である。

　多層膜１は、湾曲誘導層１２、支持層１１、及び炭素単原子層物質を含む層１０を、この順で積層することにより形成することができる。多層膜１を形成する方法は、特に限定されないが、例えば、基板１４及び犠牲層１３を利用する方法が挙げられる。図６（ａ）～（ｇ）の例では、基板１４上に犠牲層１３を形成し（図６（ａ）～（ｂ））、次いで犠牲層１３上に湾曲誘導層１２を形成し（図６（ｃ））、次いで湾曲誘導層１２上に支持層１１を形成し（図６（ｄ））、次いで支持層１１上に炭素単原子層物質を含む層１０を形成することにより（図６（ｅ））、多層膜１を形成している。基板１４及び犠牲層１３上に多層膜１を形成することで、二次元平面構造を維持した状態で多層膜１を形成することができる。

（基板）
　基板１４は、多層膜１の形成の便宜のために用いられるものであり、材質は特に限定されない。基板１４の材料としては、表面の平坦性が高いものが好ましい。また、三次元構造体１００を製造後、三次元構造体１００を基板１４上に保持したまま細胞２を蛍光顕微鏡等で観察する場合、基板１４は、蛍光顕微鏡による観察を妨げないものが好ましい。
　基板１４の材料としては、例えば、シリコン、ソーダガラス、石英、酸化マグネシウム、及びサファイア等が挙げられる。

　基板１４の厚みは、特に限定されないが、５０～２００μｍ程度が好ましい。基板１４の具体例としては、例えば、１００μｍ程度の厚みを有するガラス基板等が挙げられる。

（犠牲層）
　犠牲層１３は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２を有する多層膜１を、基板１４から遊離するための一時的な接着層としての役割を有する。犠牲層１３は、化学物質、温度変化、及び光照射などの外部からの刺激に応答して溶解する性質を有する材料で構成される。犠牲層１３の材質は、外部刺激に応答して溶解するものであれば、特に限定されない。
　犠牲層１３としては、例えば、物理ゲルの１種であるアルギン酸カルシウムゲルなどが利用可能である。アルギン酸カルシウムゲルは、アルギナーゼなどの酵素、又はキレート剤を添加することで、ゲルからゾルへと転移して溶解する。アルギン酸カルシウムゲルの溶解に使用可能なキレート剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。前記のような酵素及びキレート剤は、細胞などの生体試料に対して毒性を示さない。そのため、細胞２を、炭素単原子層物質を含む層１０上に存在させた状態で、これらの試薬を添加して、犠牲層１３の溶解を行うことができる。これにより、三次元構造体１００の内部空間に、簡易に効率よく、細胞２を内包させることができる。

　犠牲層１３の厚みは、特に制限されない。犠牲層１３の厚みは、例えば、速やかに溶解させる観点から、２０～１０００ｎｍとすることができる。
　基板１４上に犠牲層１３を形成する方法は、特に限定されず、犠牲層１３の材料に応じて、薄膜形成に一般的に用いられる方法を適宜選択することができる。犠牲層１３の形成方法としては、例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、蒸着法、及びエレクトロスプレイ法等が挙げられる。

（湾曲誘導層、支持層、炭素単原子層物質を含む層）
　湾曲誘導層１２、支持層１１、及び炭素単原子層物質を含む層１０は、上記「＜三次元構造体＞」の項で記載したものと同様である。

　湾曲誘導層１２の形成方法は特に限定されず、水面を用いた転写法、化学気層成長法（ＣＶＤ）、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、熱蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。湾曲誘導層１２がハイドロゲルから構成される場合、ハイドロゲルの種類に応じて、前記のような方法を適宜選択することができる。
　湾曲誘導層１２が単層グラフェンから構成される場合、例えば、以下のような方法を用いることができる。まず、銅箔などの金属膜の表面にＣＶＤを用いて単層グラフェンを形成する。次いで、前記金属膜を溶解して水面上で洗浄を繰り返したのち、前記単層グラフェンを犠牲層１３の表面に転写する。これにより、単層グラフェンからなる湾曲誘導層１２を形成することができる。さらに、前記操作を繰り返すことで、複層グラフェンからなる湾曲誘導層１２を形成することができる。

　支持層１１の形成方法は特に限定されず、ＣＶＤ、スピンコーティングやインクジェットプリンティング、蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。例えば、支持層１１がポリパラキシレン又はその誘導体から構成される場合、パラキシレン又はその誘導体のダイマをＣＶＤにより成長していくことで、支持層１１を形成することができる。

　炭素単原子層物質を含む層１０の形成方法は特に限定されず、水面を用いた転写法、化学気層成長法（ＣＶＤ）、スピンコーティング、インクジェットプリンティング、熱蒸着法、エレクトロスプレイ法などが利用可能である。炭素単原子層物質を含む層１０がグラフェンから構成される場合、上記湾曲誘導層１２で説明した方法と同様に単層グラフェンを形成し、これを支持層１１の表面に転写することで、炭素単原子層物質を含む層１０を形成することができる。

　炭素単原子層物質を含む層１０が、グラフェン誘導体（酸化グラフェン、酸化グラフェン還元体等）のフレークから構成される場合、グラフェン誘導体のフレークを含む分散液を支持層１１に塗布することにより、炭素単原子層物質を含む層１０を形成することができる。前記分散液の塗布方法は、特に限定されず、スピンコーティング、及びキャスト法等が挙げられる。グラフェン誘導体フレークの分散液は、特開２０１３－２５４８２５号公報等に記載される公知の方法により、作製することができる。

［工程（ｂ）］
　工程（ｂ）は、多層膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記多層膜に、自己組織的に、炭素単原子層物質を含む層が内側となる三次元湾曲形状を形成させる工程である。

　膜の厚み方向の歪みの勾配は、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２の積層構造により得ることができる。図６の例では、犠牲層１３上に、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、及び湾曲誘導層１２を有する多層膜１を形成することで、多層膜１の厚み方向に歪みの勾配が発生する。ここで、犠牲層１３を溶解することにより（図６（ｉ））、前記歪みの勾配を駆動力として、多層膜１に、自己組織的に、炭素単原子層物質を含む層１０が内側となる三次元湾曲形状を形成させることができる（図６（ｊ））。その結果、三次元湾曲形状の内部空間に炭素単原子層物質を含む層１０が接する、三次元構造体１００を得ることができる。

　犠牲層１３の溶解は、犠牲層１３の材料に応じて、適宜行うことができる。例えば、犠牲層１３がアルギン酸カルシウムゲルで構成される場合には、前記のようなキレート剤、又はアルギナーゼ等を添加することで、犠牲層１３を溶解することができる。

　一実施形態において、本実施態様に係る製造方法は、基板上に、犠牲層を形成する工程と、前記犠牲層上に、湾曲誘導層、支持層、及び炭素単原子層物質を含む層がこの順で積層された多層膜を形成する工程と、前記犠牲層を溶解して、前記多層膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記多層膜に、自己組織的に、炭素単原子層物質を含む層を内側とする三次元湾曲形状を形成させる工程と、を含むものであってもよい。

［他の工程）
　本実施形態の製造方法は、上記工程（ａ）及び工程（ｂ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、細胞を存在させる工程、多層膜１をパターニングする工程、及び細胞を培養する工程等が挙げられる。

（細胞を存在させる工程）
　本実施態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）と前記工程（ｂ）との間に、前記炭素単原子層物質を含む層の表面に、細胞を存在させる工程を有していてもよい。

　図６（ｈ）は、炭素単原子層物質を含む層１０の表面に、細胞２を存在させた状態を示す概略図である。細胞２は、炭素単原子層物質を含む層１０の表面の垂直位置上のいずれかの位置に存在していればよい。細胞２は、炭素単原子層物質を含む層１０の表面上に浮遊していてもよく、炭素単原子層物質を含む層１０の表面に接着していてもよい。前記工程（ｂ）により自己組織的に組み立てられる三次元構造体１００の内部空間に細胞２を内包させるために、炭素単原子層物質を含む層１０の表面から細胞２までの距離は、炭素単原子層物質を含む層１０の短軸方向の長さの１／２よりも小さいことが好ましい。

　炭素単原子層物質を含む層１０の表面に細胞２を存在させる方法は特に限定されず、任意の方法と用いることができる。炭素単原子層物質を含む層１０の表面に細胞２を存在させる方法としては、例えば、細胞２の培養液又は懸濁液を、炭素単原子層物質を含む層１０の表面に滴下する方法、及び炭素単原子層物質を含む層１０を細胞２の培養液又は懸濁液に浸漬する方法等が挙げられる。
　炭素単原子層物質を含む層１０の表面に存在させる細胞２の数は、前記細胞２の培養液又は懸濁液中の細胞２の濃度により制御することができる。

（パターニング工程）
　本実施態様の製造方法は、多層膜１をパターニングする工程を含んでいてもよい。パターニング工程は、前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に行うことが好ましい。多層膜１をパターニングする方法は特に限定されず、公知のパターニング方法を用いることができる。パターニング方法としては、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、及びドライエッチング法等の微細加工技術を適用することが可能である。

　図６（ｆ）～（ｇ）は、パターニング工程の一例を説明する図である。図６（ｆ）～（ｇ）では、レジスト層１５を用いて多層膜１のパターニングを行っている。図６（ｆ）は、多層膜１上にレジスト層１５を形成した状態を示している。レジスト層１５の形成方法は特に限定されず、スピンコート法等の公知の方法を用いることができる。レジスト層１５を、任意の形状のフォトマスクを通して露光し、現像液を用いて現像することにより、任意の形状のレジストパターンを得ることができる。前記レジストパターンを物理マスクとして、多層膜１及び犠牲層１３をエッチングすることにより、任意の形状にパターニングされた多層膜１を得ることができる（図６（ｇ））。犠牲層１３は、多層膜１とともにパターニングしてもよいし、パターニングしなくてもよい。パターニングの容易性及び犠牲層１３の分解性等の観点から、犠牲層１３は、炭素単原子層物質を含む層１０とともにパターニングすることが好ましい。

　基板１４及び犠牲層１３上に多層膜１を形成することにより、多層膜１は二次元平面形状に維持される。そのため、多層膜１に対して、微細な構造のパターニングを行うことができる。

　パターニングにより形成するパターン形状は特に限定されない。例えば、筒状の三次元構造体を得る場合には、多層膜１は長方形状にパターニングすることが好ましい。前記長方形の大きさは、内包する細胞の大きさ、及び三次元構造体の使用目的等に応じて適宜選択すればよく、例えば、縦４００～４０００μｍ、横２０～４００μｍ等とすることができる。また、パターニングにより、多層膜１に孔を形成してもよい。

（培養工程）
　本実施態様の製造方法は、細胞を培養する工程を含んでいてもよい。培養工程は、前記細胞を存在させる工程の後に行うことができる。培養工程は、工程（ｂ）の前に行ってもよく、工程（ｂ）の後に行ってもよい。細胞２が接着性を有する細胞である場合、工程（ｂ）の前に培養工程を行うことで、多層膜１に細胞を接着させることができる。そのため、工程（ｂ）において、多層膜１に三次元湾曲形状を形成させる際に、三次元湾曲形状の内部空間に細胞を確実に内包させることができる。
　また、工程（ｂ）の後に培養工程を行うことで、三次元構造体１００の三次元湾曲形状に沿って細胞を増殖させることができる。細胞の培養条件は、細胞の種類に応じて、当該細胞の培養に一般的に用いられる条件を用いることができる。

　本実施態様の方法によれば、簡易な方法で、上記実施形態の三次元構造体を得ることができる。

＜積層体＞
　本発明の一態様にかかる積層体は、基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された湾曲誘導層と、前記湾曲誘導層上に積層された支持層と、前記支持層上に積層された炭素単原子層物質を含む層と、を含む。

　本実施態様にかかる積層体の具体例としては、図６（ｇ）に例示される積層体が挙げられる。
　基板１４、犠牲層１３、湾曲誘導層１２、支持層１１、炭素単原子層物質を含む層１０は、上記「＜三次元構造体の製造方法＞」の項で説明したものと同様である。

　本実施態様にかかる積層体は、上記実施形態の三次元構造体の製造に用いることができる。

　以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

［実施例１］湾曲誘導層をシルクフィブロインゲルにより構成した多層膜の作製
　図６（ａ）～（ｇ）のプロセスに従い、多層膜１を作製した。多層膜１は、図２Ａの多層膜１ａと同様の構成とした。すなわち、炭素単原子層物質を含む層１０を単層グラフェンとし、湾曲誘導層１２をハイドロゲルとした。ハイドロゲルとしては、シルクフィブロインゲルを用いた。

　基板１４として、ガラス基板を用いた。ガラス基板上で、アルギン酸ナトリウム溶液をスピンコーティングし、その後塩化カルシウム溶液の中に浸漬することでアルギン酸カルシウムゲルの犠牲層１３を形成した。

　次に、犠牲層１３の表面に、湾曲誘導層１２を形成した。シルクフィブロインを水に溶解させ、シルクフィブロイン溶液を調整した。シルクフィブロイン溶液を犠牲層１３上にスピンコーティングし、シルクフィブロインゲルを形成した。

　次に、湾曲誘導層１２の表面に、支持層１１を形成した。湾曲誘導層１２上でパラキシレンダイマーをＣＶＤにより成長していくことで、にポリパラキシレン（パリレン）からなる支持層１１を形成した。支持層１１の厚さは、５０ｎｍ～２００ｎｍとした。

　次に、支持層１１上に、炭素単原子層物質を含む層１０として単層グラフェンを転写した。銅箔の表面にＣＶＤを用いて単層グラフェンを作製し、これを支持層１１の表面に転写した。

　次に、炭素単原子層物質を含む層１０の表面にフォトレジストをスピンコーティングし、レジスト層１５を形成した。任意形状のフォトマスクを介してレジスト層１５に紫外光を照射し、任意形状の物理マスクをパターニングした。その後、酸素プラズマにより、炭素単原子層物質を含む層１０、支持層１１、湾曲誘導層１２、及び犠牲層１３をエッチングした。エッチングは、基板１４上に成膜した犠牲層１３に届くまで行った。最後に、アセトンによりレジスト層１５を除去した。

［実施例２］湾曲誘導層として複層グラフェンを用いた多層膜の作製
　実施例１と同様に、図６（ａ）～（ｇ）のプロセスに従い、多層膜１を作製した。多層膜１は、図２Ｂの多層膜１ｂと同様の構成とした。すなわち、炭素単原子層物質を含む層１０を単層グラフェンとし、湾曲誘導層１２を複層グラフェンとした。

　実施例１と同様の方法で、基板１４として選定したガラス基板上に、犠牲層１３としてアルギン酸カルシウムゲル層を形成した。
　次に、犠牲層１３の表面に、湾曲誘導層１２として複層グラフェンを転写した。実施例１の炭素単原子層物質を含む層１０の形成工程において述べた単層グラフェンを転写する作業を繰り返すことで、複数の単層グラフェンを犠牲層１３の表面に積層した。複層グラフェンの層数は、２層とした。
　次に、実施例１と同様に、支持層１１としてポリパラキシレンを蒸着した。
　次に、実施例１と同様に、支持層１１の表面に、炭素単原子層物質を含む層１０として単層グラフェンを転写した。
　最後に、実施例１と同様に、フォトリソグラフィ技術を用いて、多層膜１及び犠牲層１３のエッチングを行い、任意の物理パターンを形成した。

［実施例３］炭素単原子層物質を含む層として酸化グラフェンフレークを用いた多層膜の作製
　実施例１と同様に、図６（ａ）～（ｇ）のプロセスに従い、多層膜１を作製した。多層膜１は、図２Ｃの多層膜１ｃと同様の構成とした。すなわち、炭素単原子層物質を含む層１０をグラフェン誘導体のフレークとし、湾曲誘導層１２を単層グラフェンとした。グラフェン誘導体としては、酸化グラフェンを用いた。

　実施例１と同様の方法で、基板１４として選定したガラス基板上に、犠牲層１３としてアルギン酸カルシウムゲル層を形成した。
　次に、実施例１の炭素単原子層物質を含む層１０の形成工程と同様の方法で、犠牲層１３の表面に、湾曲誘導層１２として単層グラフェンを転写した。
　次に、実施例１と同様に、支持層１１としてポリパラキシレンを蒸着した。
　次に、支持層１１の表面に、酸化グラフェンフレークを塗布し、炭素単原子層物質を含む層１０を形成した。
　最後に、実施例１と同様に、フォトリソグラフィ技術を用いて、多層膜１及び犠牲層１３のエッチングを行い、任意の物理パターンを形成した。

［実施例４］多層膜の自発的湾曲の誘導
　実施例１～３のプロセスにより作製した各多層膜は、アルギン酸カルシウムゲルで構成される犠牲層１３を、ＥＤＴＡにより溶解することで湾曲を誘導することができる。ＥＤＴＡにより犠牲層１３を溶解したところ、実施例１～３のいずれにおいても、長方形の多層膜は代表的な湾曲構造として筒状構造体を形成した。実施例２で作製した多層膜の湾曲前後の画像を図７Ａに示した。実施例３で作製した多層膜の湾曲前後の画像を図７Ｂに示した。
　図７Ｂに示すように、筒状構造体を形成するための長方形パターンに、蝶番として細長い長方形を繋げた場合には、湾曲した多層薄膜の流動を防ぐことができる。そのため、同一視野での顕微鏡観察が容易になる。

［実施例５］単層グラフェンの枚数による曲率半径の影響
　三次元構造体の曲率半径は、湾曲誘導層１２と支持層１１との厚みにより決定される。本実施例では、湾曲誘導層１２をグラフェンとし、グラフェンの層数を変化させた。また、支持層１１をポリパラキシレン層とし、炭素単原子層物質を含む層１０を単層グラフェンとした。支持層１１の厚みは、図８Ａの三次元構造体では、１０７．５ｃｍとし、図８Ｂの三次元構造体では、７５．５ｃｍ、４４．０ｃｍ、又は１１２．８ｃｍとした。多層膜１の形成は、図６（ａ）～（ｅ）のプロセスに従って行った。次いで、フォトリソグラフィ技術を用いて、多層膜を３００μｍ×６００μｍの長方形に切り出した。次いで、ＥＤＴＡにより犠牲層１３を溶解し、多層膜１の湾曲を誘導した。

　図８Ａは、三次元構造体の位相差顕微鏡像である。湾曲誘導層１２におけるグラフェン層数の増加に伴い、三次元構造体の曲率半径が小さくなることが確認された。
　図８Ｂは、湾曲誘導層１２におけるグラフェンの層数、支持層１１の厚み、及び三次元構造体の曲率半径の関係を示すグラフである。図８Ｂでも、湾曲誘導層１２におけるグラフェン層数の増加に伴い、三次元構造体の曲率半径を小さくなることが確認された。また、支持層１１の厚みが増しても、三次元構造体の曲率半径が小さくなることが確認された。

［実施例６］多層膜による細胞の内包化
　図６（ｈ）～（ｊ）のプロセスに従い、三次元構造体の内部空間に培養細胞を内包化した。多層膜１は、図２Ｂの多層膜１ｂと同様の構成とした。すなわち、炭素単原子層物質を含む層１０を単層グラフェンとし、湾曲誘導層１２を複層グラフェンとした。支持層１１は、ポリパラキシレン層とした。

　多層膜上にラット胎児から採取した初代培養海馬神経細胞を播種し、直後に、ＥＤＴＡを添加して、アルギン酸カルシウムゲルにより構成される犠牲層１３を溶解した。その結果、炭素単原子層物質を含む層に生着した神経細胞が、筒状の三次元構造体に内包化された。図９に、培養初日と３日目における同一の筒状構造体における細胞の顕微鏡像を示した。神経細胞の外部への遊走は湾曲構造により抑えられる。そのため、図９に示すように、神経細胞は、筒状の三次元構造体の内部空間に接する炭素単原子層物質を含む層との接触を維持したまま培養することができる。また、三次元構造体の湾曲構造内部で、三次元的に増殖した神経細胞に対して、グラフェンを接触させることが可能である。

　本発明によれば、炭素単原子層等の炭素単原子層物質を含む層を内側にして三次元湾曲した構造を有する三次元構造体、及び前記三次元構造体の製造方法が提供される。前記三次元構造体は、三次元構造体の内部空間に炭素単原子層物質を含む層が接しているため、前記内部空間の電気特性を感度よく検出することができる。前記内部空間で細胞が存在する場合には、前記細胞を、炭素単原子層物質を含む層に接触させることができるため、細胞の活動電位等の検出、及び細胞が放出生体分子の検出に適用可能である。

　１　　多層膜
　２　　細胞
　４　　絶縁層
　５ａ，５ｂ　　プローブ
　６　　生体分子検出プローブ
　１０　炭素単原子層物質を含む層
　１１　支持層
　１２　湾曲誘導層
　１３　犠牲層
　１４　基板
　１５　レジスト層
　２０　単層グラフェン
　２１　複層グラフェン
　２２　グラフェン誘導体のフレーク
　２３　ハイドロゲル
　３０　炭素単原子層物質を含む層１０に接続する導線
　３１　湾曲誘導層１１に接続する導線
　６０　シグナル分子
　６１　特異的結合物質
　１００，１００’　三次元構造体
　２００，２０１　電気信号検出デバイス
　Ｓ　　三次元構造体の内部空間

Claims (8)

1. 　多層膜が三次元湾曲して内部空間を形成している、三次元構造体であって、
   　前記多層膜は、炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、前記三次元湾曲を誘導する湾曲誘導層と、を有し、
   　前記炭素単原子層物質を含む層が前記内部空間に接し、且つ前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、
   　三次元構造体。
2. 　前記炭素単原子層物質がグラフェン又はその誘導体である、請求項１に記載の三次元構造体。
3. 　前記内部空間に細胞が存在している、請求項１又は２に記載の三次元構造体。
4. 　前記炭素単原子層物質を含む層が前記細胞に接触している、請求項３に記載の三次元構造体。
5. 　前記炭素単原子層物質を含む層が生体分子検出プローブを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の三次元構造体。
6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の三次元構造体と、
   　前記炭素単原子層物質を含む層に接続する導線と、
   　を備える、電気信号検出デバイス。
7. 　（ａ）炭素単原子層物質を含む層と、支持層と、湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、を有し、前記支持層が前記炭素単原子層物質を含む層と前記湾曲誘導層との間に位置する、多層膜を形成する工程と、
   　（ｂ）前記多層膜の厚み方向の歪みの勾配を駆動力として、前記多層膜に、自己組織的に、前記炭素単原子層物質を含む層が内側となる三次元湾曲形状を形成させる工程と、
   　を含む、三次元構造体の製造方法。
8. 　基板と、前記基板上に積層された犠牲層と、前記犠牲層上に積層された湾曲構造を誘導する湾曲誘導層と、前記湾曲誘導層上に積層された支持層と、前記支持層上に積層された炭素単原子層物質を含む層と、を含む積層体。

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