WO2021121646A2 - Bestimmung der kapselspezifität für spezifische zelltypen - Google Patents

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WO2021121646A2
WO2021121646A2 PCT/EP2020/000212 EP2020000212W WO2021121646A2 WO 2021121646 A2 WO2021121646 A2 WO 2021121646A2 EP 2020000212 W EP2020000212 W EP 2020000212W WO 2021121646 A2 WO2021121646 A2 WO 2021121646A2
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nanocapsules
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capsules
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Irina Nazarenko
Holger Klapproth
Arnold Martin
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Capco Bio Gmbh
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
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Definitions

  • WO 002019020665 A1 Polyelectrolyte nanocapsules as a transport medium for biomolecules and “small molecular compounds” in cells are described in WO 002019020665 A1. These can be built up around solid or liquid cores using the so-called layer-by-layer technique. The size of the nanocapsules depends on the size In addition to the surface design, the size of the nanoparticles is also important for the selection and the efficiency of uptake in specific cells. In WO 002019020665 A1 it is described that the capsules are formed around cores made of calcium carbonate, these cores being formed by a Precipitation reaction can be formed from a solution of calcium nitrate and sodium carbonate. Various solvents influence the precipitation and ensure different sizes of the precipitated calcium carbonate cores.
  • the size of the particles can be precisely set to approx. 10 to a maximum of 20 nm, so that uptake in undesired cells can be reduced.
  • hematopoietic cells can be transfected primarily with nanocapsules with a size of 20-60 nm, and sizes of 100-200 nm are preferred for tumor cells. That is, in order to avoid unspecific effects due to unspecific intake, the nanocapsules must be the right size.
  • Another significant problem in the art is the toxicity of particles above 100 nm to cells of hematopoietic origin such as CD34 + hematopoietic progenitor cells and T cells. So far, such cells can only be transduced or electroporated through the use of viruses. With all the problems that come with it.
  • CONFIRMATION COPY Stability can be improved significantly.
  • a cell- or organ-specific introduction can be achieved via these modifications.
  • the particles produced so far in the bottom-up process have the problem that they have a broad size distribution and the production process is very variable.
  • the process is therefore not suitable for the technical production of nanoparticles of the same size.
  • particles produced in the top-down process are easy and inexpensive to obtain, but have the problem of non-uniform shapes.
  • the first object of the invention is thus to provide a capsule which is taken up by the target cell type and which permanently or transiently modifies the target cell without exerting toxic effects on the specific target cell type.
  • the second task is to stabilize long-term storage through the chemical modifications mentioned above.
  • the capsules according to the invention consist in the use of monodisperse nanoparticles in order to produce polyelectrolyte nanocapsules with cell-specific sizes and, if required, chemically modified, the sizes for hematopoietic cells being in a range of 20-80 nm, preferably in a range of 40-60 nm, for epithelial cells and non-hematopoietic cells of 60-280 nm as described in W00020199020665.
  • the sizes of the particles must be in a very narrow range in order to prevent toxic effects from occurring.
  • Biodegradable polymers such as dextran and poly-L-arginine, which are used for capsule construction, can be chemically modified as required (by attaching functional groups such as hydrocarbon, oxygen, nitrogen, sulfur or phosphate-containing functional groups; Methods for this are known from the prior art) in order to prevent the spontaneous aggregation and the spontaneous cargo diffusion of the capsules and to improve the stability of the capsule.
  • functional groups such as hydrocarbon, oxygen, nitrogen, sulfur or phosphate-containing functional groups
  • nanoparticles and nanocapsules with a narrow, defined size distribution of ⁇ 15 nm or optionally ⁇ 25% around the mean value, preferably ⁇ 10 nm (or ⁇ 20% around the mean value) are referred to as monodisperse.
  • the problem of the size of the cores cannot be solved by using mechanically produced nanoparticles sorted by size. For example, by grinding calcium carbonate in ball mills, nanoparticles with a size of 15-60 nm can be generated and then by fractionation (by sedimentation or centrifugation) uniform fractions ( ⁇ 10 nm) can be generated.
  • These particles can then be coated with polymers in a layer-by-layer process.
  • the non-uniform shape of these particles is, however, disruptive because it disrupts the sorting of the particles. Only the further purification of these particles, for example by cross-flow filtration after the cores have been dissolved, enables a sufficiently precise size selection.
  • Nanocapsules can be produced using the well-known layer-by-layer method.
  • Molecules such as chemotherapeutic drugs, small molecules and macromolecules such as nucleic acids and proteins can be inserted between the layers, which can then be released in the cell.
  • chimeric T-cell receptors can be generated by introducing DNA-loaded nanocapsules into T-cells.
  • RNA molecules can also be introduced into cells in order to produce only a transient modification of the cells.
  • all of the named molecules and macromolecules can be introduced either individually or in any imaginable combination. This property enables, for example, the transfection of CRISPR / Cas complexes.
  • the chemical modifications mentioned can be used both for the capsule polymers and for the cargo in order to regulate the stability and consequently the release in the target cells.
  • Primary cells are cells that have been taken from the body and have not lost their tissue-specific properties through cultivation. Primary cells are, for example, but not exclusively, stem cells, germ cells, hematopoietic cells, tumor cells, or else mesenchymal stem cells, tissue cells in vivo and ex vivo.
  • stem cells that can differentiate into different cell types or tissues are generally referred to as stem cells. Depending on the type of stem cell and how it is influenced, they have the potential to develop in any tissue (embryonic stem cells) or in certain specified types of tissue (adult stem cells / precursors).
  • Polycations and polyanions which alternately form the layers of the nanocapsules, are suitable polymers for building up layers of the nanocapsules. Due to the opposing charge, the polymers can form the layers through self-organization. After the formation of each layer, the unused portion of the polymers has to be separated from the nanocapsules.
  • Polymers within the meaning of the invention also include classical polymers and copolymers as well
  • Biopolymers such as macromolecules with an ordered structure of amino acids, nucleic acids and poly- or oligosaccharides.
  • polycations are: polyethylenimine (PEI), chitosan (CS), poly (L-lysine) (PLL),
  • PAA Poly (amido amines) s
  • polyanions examples include poly (methacrylic acid) (PMA) poly (N-vinylpyrrolidone) (PVP) tannic acid (TA) poly (2-n-propyl-2-oxazoline) s (PnPropOx)
  • Substances that can be used to stabilize the nucleic acids are substances that are applied together with the nucleic acids in the capsules or substances that diffuse into the capsules and into the lumen of the capsules through incubation with the finished capsules and there until the capsules enter the Cells linger at least partially. Examples of such substances are:
  • nanoparticles that are suitable as cores for the production of nanocapsules:
  • Iron nanoparticles including magnetites
  • the surface of the nanoparticles can be modified by further groups in order to improve the penetration of the target cells.
  • groups are e.g. folic acid groups, COOH groups, NH3 groups. These groups are also suitable for bioconjugation in order to bind specific binding molecules such as ligands and receptors including antibodies to them.
  • Calcium carbonate nanoparticles were purchased from SkySpring Nanomaterials. The average particle size was 15-40 nm. A 10 mg / ml suspension in PBS was created with the particles. Ultrasound was used for 5 minutes to separate the particles. These were then purified by size by fractionated centrifugation in an Eppendorf centrifuge. 2 ml of suspension were centrifuged at 500 RCF, 1000 RCF, 2000 RCF, 5000 RFC, 10000 RCF, 15000 RFC and 20000 RCF. It started with the lowest RCF, removed the supernatant and centrifuged with the next higher RCF. The centrifugation pellet was then measured. The 500 RCF fraction was discarded (particles were aggregated or too large).
  • dextran sulfate as sodium salt
  • poly-L-arginine hydrochloride as described in WO 002019020665 A1.
  • nucleic acids plus additional biomolecules
  • the nucleic acids adhere to the capsule wall by electrostatic bonding, so that it is sufficient to incubate the capsules with the biomolecules. The procedure is described in W0002019020665A1.
  • Example 3 Purification of the Finished Nanocapsules by Tangential Flow Filtration Finished nanocapsules were then purified using a KrosFlo Research 11 / system with a 50 nm filter module to remove any larger nanocapsules that might be present. Particles larger than 50 nm in size were retained. For this purpose, 50 ml of a 10 mg / ml suspension of the nanocapsules in PBS were produced. This was filtered according to the manufacturer's instructions.
  • Finished nanocapsules were then cleaned up with an Eclipse AF4 from Wyatt Technology to remove any larger nanocapsules that might be present. Particles were separated according to charge and size. For this purpose, 50 ml of a 10 mg / ml suspension of the nanocapsules in PBS were produced. This was separated according to the manufacturer's instructions.
  • nanocapsules with a size of 40-80 nm are significantly more advantageous.
  • Protein, DNA, mRNA, miRNA and siRNA were used as cargo for nanocapsules between 50 nm and 80 nm in size.
  • CD 34+ hematopoietic stem cells, CD4 + and CD8 + T cells were incubated with the capsules for 48 hours. 10 capsules / cell were used. Successful introduction was checked by means of confocal microscopy in the case of the fluorescence-labeled capsules and PCR.
  • iPS cells For embryonic stem cells as well as for induced pluripotent stem cells (iPS cells) nanocapsules with a size of 50-120 nm were produced. Protein, DNA, mRNA, miRNA and siRNA were used as cargo for nanocapsules 50 to 120 nm in size. Embryonic stem cells and iPS cells were incubated with the capsules for 48 hours. 20 capsules / cell were used. Successful introduction was checked by means of confocal microscopy in the case of the fluorescence-labeled capsules and PCR.
  • Example 7 Stabilization and storage at room temperature (RT) of capsules.
  • Example 9 targeted introduction: with the help of AK, peptides, proteins
  • Example 10 Stabilization of capsules with small molecules as cargo
  • the small molecules or chemotherapeutic drugs were immobilized in the capsules using click chemistry, thus preventing diffusion effects.

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Abstract

Die Aufgabe der Erfindung ist damit die Bereitstellung eines von Transferkapseln die vom Zielzelltyp aufgenommen werden und die Zielzelle dauerhaft oder transient modifizieren, ohne dabei toxische Effekte auf die Zelle auszuüben. Die Erfindungsgemäße Lösung besteht in der Verwendung von monodispersen Kernen, um daraus Polyelektrolyt Nanokapseln mit zellspezifischen Größen herzustellen, wobei sich die Größen für hämatopoetische Zellen in einem Bereich von 20-80 nm befinden, bevorzugt in einem Bereich von 40-60 nm. Die Größen der Partikel müssen dabei in einem sehr engen Bereich sein, um zu verhindern, dass toxische Effekte auftreten. Um die Toxizität der Nanokapseln gering zu halten ist es zudem wichtig, die Nanopartikel, um die herum die Kapseln aufgebaut wurden (Kerne) vor der Verwendung zu entfernen. Verfahren dazu sind aus dem Stand der Technik bekannt (Z.B. Auflösen durch EDTA). Eine weitere Aufgabe ist die Stabilisierung der Transferkapseln. Die erfindungsgemäße Lösung besteht in der Modifikation der Kapseln, der Layer und/oder des zu verpackenden Cargos durch funktionelle Gruppen, was eine Stabilisierung und somit eine Langzeitlagerung bei Raumtemperatur ermöglicht. Die dritte Aufgabe ist das zielgerichtete Einbringen der Transferkapseln. Die erfindungsgemäße Lösung ist eine Funktionalisierung der Layer über chemische Modifikationen und/oder Ergänzung der Layer mit Antikörpern, Proteinen oder Peptiden.

Description

Bestimmung der Kapselspezifität für spezifische Zelltypen
Polyelektrolyt Nanokapseln als Transportmedium für Biomoleküle und „Small molecular compounds" in Zellen sind in der WO 002019020665 A1 beschrieben. Diese können durch die sog. Layer by Layer Technik um feste oder flüssige Kerne herum aufgebaut werden. Die Größe der Nanokapseln hängt dabei von der Größe der verwendeten Kerne ab. Für die Auswahl und die Effizienz der Aufnahme in spezifische Zellen ist neben der Oberflächengestaltung auch die Größe der Nanopartikel wichtig. In der WO 002019020665 A1 wird beschrieben, dass die Kapseln um Kerne aus Calciumcarbonat gebildet werden, wobei diese Kerne durch eine Fällungsreaktion aus einer Lösung vom Calciumnitrat und Natriumcarbonat gebildet werden. Diverse Ff i Ifsmittel beeinflussen die Fällung und sorgen für verschiedene Größen der gefällten Calciumcarbonat- Kerne.
Ein Problem dabei ist, dass es eine sehr große Spanne in der Größenverteilung gibt, d.h. bei der Herstellung von Partikeln mit 60 nm entstehen auch Partikel mit über 100 nm und umgekehrt. Nun ist es aber für die erfolgreiche Anwendung bei bestimmten Zelltypen dieser Nanokapseln unerlässlich, dass die Größe der Partikel auf ca. 10- bis max 20 nm genau festgelegt werden kann, so dass die Aufnahme in ungewünschte Zellen reduziert werden kann. Denn hämatopoetische Zellen lassen sich vor allem mit Nanokapseln einer Größe von 20-60 nm transfizieren, und für Tumorzellen sind Größen von 100-200 nm bevorzugt. D.h., um unspezifische Wirkungen durch eine unspezifische Aufnahme zu vermeiden müssen die Nanokapseln die richtige Größe aufweisen.
Ein weiteres bedeutendes Problem im Stand derTechnik besteht in derToxizität von Partikeln über 100 nm für Zellen hämatopoetischen Ursprungs wie z.B. CD34+ hämatopoetische Vorläufer Zellen und T-Zellen. Solche Zellen lassen sich bisher nur durch die Verwendung von Viren transduzieren oder elektroporieren. Mit all den damit verbundenen Problemen.
Ein weiteres bedeutendes Problem im aktuellen Stand der Technik ist eine vergleichsweise geringe Stabilität der mit Cargo gefüllten Kapseln. Bisweilen haben sich nur siRNA-beladene Kapseln als äußerst stabil herausgestellt; andere Moleküle, vor allem mRNA und DNA sind in Kapseln instabil und verhindern eine Langzeitlagerung, die in der Degradation des genomischen Cargos und/oder der Kapselaggregation resultiert. Außerdem kommt es bei der Langzeitlagerung zu Diffusionseffekten bei small Molecules und chemotherapeutischen Medikamenten was eine effektive Anwendung dieser Stoffklassen zum momentanen Zeitpunkt ebenso nicht ermöglicht. Durch eine chemische Modifikation der Kapsel-Layer und/oder der RNAs oder DNA kann die
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BESTÄTIGUNGSKOPIE Stabilität deutlich verbessert werden. Zudem kann über diese Modifikationen ein zell- bzw. organspezifisches Einbringen erreicht werden.
Die bisher im Bottom-up Verfahren hergestellten Partikel haben das Problem, dass sie eine breite Größenverteilung haben und der Herstellungsprozess sehr variabel ist. Für eine technische Herstellung von gleichbleibend großen Nanopartikeln ist das Verfahren deswegen nicht geeignet. Im Top-Down Vwerfahren hergestellte Partikel dagegen sind einfach und preiswert erhältlich, haben aber das Problem der uneinheitlichen Form.
Die erste Aufgabe der Erfindung ist damit die Bereitstellung einer Kapsel, die vom Zielzelltyp aufgenommen wird und die Zielzelle dauerhaft oder transient modifiziert, ohne dabei toxische Effekte auf den spezifischen Zielzelltyp auszuüben. Die zweite Aufgabe ist die Stabilisierung der Langzeitlagerung durch die oben angesprochenen chemischen Modifikationen.
Die erfindungsgemäßen Kapseln bestehen in der Verwendung von monodispersen Nanopartikeln, um daraus Polyelektrolyt Nanokapseln mit zellspezifischen Größen und nach Bedarf chemisch modifiziert herzustellen, wobei sich die Größen für hämatopoetische Zellen in einem Bereich von 20-80 nm befinden, bevorzugt in einem Bereich von 40-60 nm, für Epithelzellen und nicht hämatopoetische Zellen von 60-280 nm wie in W00020199020665 beschrieben. Die Größen der Partikel müssen dabei in einem sehr engen Bereich sein, um zu verhindern, dass toxische Effekte auftreten. Bioabbaubare Polymere, z.B. Dextran und poly-L-Arginin, die für Kapselaufbau benutzt werden, können nach Bedarf chemisch modifiziert werden (durch die Anbindung der Funktionalgruppen, wie z.B. Kohlenwasserstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel oder Phosphat-beinhaltende funktionelle Gruppen; Verfahren dazu sind aus dem Stand der Technik bekannt), um die spontane Aggregation und die spontane Cargo-Diffusion der Kapseln zu verhindern und die Stabilität der Kapsel zu verbessern. Um die Toxizität der Nanokapseln gering zu halten ist es zudem in manchen Fällen vorteilhaft, die Nanopartikel, um die herum die Kapseln aufgebaut wurden (sogenannte Kerne) vor der Verwendung zu entfernen. Verfahren dazu sind aus dem Stand der Technik bekannt (z.B. Auflösen durch EDTA)
Eine hinreichend enge Größenselektion lässt sich mit dem durch Fällung gewonnenen Kerne nicht effizient durchführen, da die Verteilung der Größe sehr breit ist. Im Rahmen dieser Erfindung werden Nanopartikel und Nanokapseln mit einer engen definierten Größenverteilung von ±15 nm oder wahlweise ±25% um den Mittelwert, bevorzugt ±10 nm (oder±20% um den Mittelwert) als monodispers bezeichnet. Das Problem der Größe der Kerne lässt sich auch überraschenderweise nicht allein durch die Verwendung größensortierter mechanisch erzeugter Nanopartikel lösen. So lassen sich durch das Mahlen von Calciumcarbonat in Kugelmühlen Nanopartikel einer Größe von 15-60 nm Größe erzeugen und dann durch Fraktionieren (durch Sedimentation bzw. Zentrifugation) einheitliche Fraktionen erzeugen (±10 nm). Diese Partikel können dann im Layer-by-Layer Verfahren mit Polymeren beschichtet werden. Die uneinheitliche Form dieser Partikel ist aber störend, da die Sortierung der Partikel dadurch gestört wird. Erst die weitere Aufreinigung dieser Partikel, etwa durch Cross-Flow Filtration nach der Auflösung der Kerne ermöglicht eine ausreichend genaue Größenselektion.
Nanokapseln lassen sich durch die bekannte Layer-by-Layer Methode herstellen. Zwischen die Layer lassen sich Moleküle wie chemotherapeutische Medikamente, small Molecules und Makromoleküle wie Nukleinsäuren und Proteine einbringen, die dann in der Zelle freigesetzt werden können. So lassen sich z.B. chimäre T-Zell Rezeptoren durch Einbringen von mit DNA beladenen Nanokapseln in T-Zellen erzeugen. Auch lassen sich RNA Moleküle in Zellen einführen, um nur eine transiente Modifikation der Zellen zu erzeugen. Zudem können alle genannten Moleküle und Makromoleküle entweder einzeln oder in jeder erdenklichen Kombination eingebracht werden. Diese Eigenschaft ermöglicht beispielsweise die Transfektion von CRISPR/Cas Komplexen. Die genannten chemischen Modifikationen können sowohl für die Kapselpolymere als auch für das Cargo verwendet werden, um die Stabilität und folglich die Freisetzung in den Zielzellen zu regulieren.
Primäre Zellen sind Zellen die dem Körper entnommen wurden und nicht durch Kultivierung ihre gewebespezifischen Eigenschaften verloren haben. Primäre Zellen sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Stammzellen, Keimzellen, hämatopoetische Zellen, Tumorzellen, oder auch mesenchymale Stammzellen, Gewebezellen in vivo und ex vivo.
Als Stammzellen werden allgemein Körperzellen bezeichnet, die sich in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können. Je nach Art der Stammzelle und ihrer Beeinflussung haben sie das Potenzial, sich in jegliches Gewebe (embryonale Stammzellen) oder in bestimmte festgelegte Gewebetypen (adulte Stammzellen/ Vorläufer) zu entwickeln.
Geeignete Polymere um Lagen (layer) der Nanokapseln aufzubauen sind Polykationen und Polyanionen, die abwechselnd die Lagen der Nanokapseln bilden. Durch die gegensätzliche Ladung könne die Polymere die Lagen durch Selbstorganisation ausbilden. Nach der Ausbildung jeder Schicht ist dabei der unverbrauchte Anteil der Polymere von den Nanokapseln abzutrennen. Polymere im Sinne der Erfindung umfassen neben klassischen Polymeren und Copolymerem auch
Biopolymere wie z.B. Makromoleküle mit geordnetem Aufbau aus Aminosäuren, Nukleinsäuren und Poly- bzw. Oligosaccharide.
Beispiele für Polykationen sind: polyethylenimine (PEI), chitosan (CS), poly(L-lysine) (PLL),
Poly(amido amine)s (PAA),
Oligolysine poly- (I) -ornithine (PLO)
(poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDAC)
Histidin und lysinreiche Peptide und Proteine z.B. Cys-Gly-Ala-Gly-Pro-(Lys)3-Arg-Lys-Val- Cys
Beispiele für Polyanionen sind: poly(methacrylic acid) (PMA) poly(N-vinylpyrrolidone) (PVP) tannic acid (TA) poly(2-n-propyl-2-oxazoline)s (PnPropOx)
Poly( 1 -vinylimidazole) poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) dextran sulfate, polyethylene glycol, bovine serum albumin,
Human serum albumin Protamine sulfate
1 -ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
Substanzen die zur Stabilisierung der Nukleinsäuren eingesetzt werden können, sind Substanzen die mit den Nukleinsäuren in den Kapseln zusammen aufgebracht werden oder Substanzen die durch Inkubation mit den fertigen Kapseln in die Kapseln und in das Lumen der Kapseln diffundieren und dort bis zum Eintritt der Kapseln in die Zellen zumindest teilweise verweilen. Beispiele für solche Substanzen sind:
Protamine sulfate
Cell penetrating peptide
Glutation
TAT protein
RNAse Inhibitoren
DNAse Inhibitoren Beispiele für Nanopartikel, die als Kerne für die Herstellung von Nanokapseln geeignet sind:
Eisen Nanopartikel (inklusive Magnetite)
Silica Nanopartikel
Kommerziell erhätliche CaCÜ3 Nanopartikel Andere Carbonat-Nanopartikel wie MgCÜ3 Vesikel
Gold Nanopartikel Latex Nanopartikel
Die Oberfläche der Nanopartikel kann durch weitere Gruppen modifiziert sein, um die Penetration der Zielzellen zu verbessern. Solche Gruppen sind z.B. Folsäuregruppen, COOH-Gruppen, NH3- Gruppen. Diese Gruppen bieten sich auch zur Biokonjugation an um spezifische Bindemoleküle wie z.B. Liganden und Rezeptoren inklusive Antikörper daran zu binden.
Beispiel 1 : Fraktionieren von Calciumcarbonat Nanopartikeln
Calciumcarbonat Nanopartikel wurden von SkySpring Nanomaterials erworben. Die durchschnittliche Partikelgröße betrug 15-40nm. Mit den Partikeln wurde eine 10 mg/ml Suspension in PBS erstellt. Um die Partikel zu vereinzeln wurde für 5 Minuten Ultraschall angewendet. Diese wurden dann durch fra tioniertes Zentrifugieren in einer Eppendorf- Zentrifuge nach Größen aufgereinigt. Es wurden 2 ml Suspension mit bei 500 RCF, 1000 RCF, 2000 RCF 5000 RFC, 10000 RCF, 15000 RFC und 20000 RCF zentrifugiert. Dabei wurde mit der niedrigsten RCF begonnen, der Überstand abgenommen und mit der nächst höheren RCF zentrifugiert. Das Pellet der Zentrifugation wurde anschließend vermessen. Die 500 RCF Fraktion wurde verworfen (Partikel waren aggregiert oder zu groß).
Beispiel 2: Herstellung der Polyelektrolyt Nanokapseln
Um die Nanopartikel zu beschichten wurde Dextransulfat (als Natriumsalz) und Poly-L-Arginin hydrochlorid verwendet wie in der WO 002019020665 A1 beschrieben. Zwischen die Lagen können dabei eine oder mehrere Nukleinsäuren (plus zusätzliche Biomoleküle) eingebracht werden. Die Nukleinsäuren haften durch elektrostatische Bindung an die Kapselwand, so daß das Inkubieren der Kapseln mit den Biomolekülen ausreichend ist. Das Verfahren ist in der W0002019020665A1 beschrieben.
Diese konnten chemisch modifiziert werden, um die Stabilität bei der Lagerung und die Abbauzeit in der Zelle zu verändern. Chemische Modifikationen durch die Anwendung einer oder verschiedenen funktionelle Gruppen, wie z.B. Hydrocarbone, Sauerstoff-haltige, Stickstoff-haltige Gruppen, Sulfur (S/SH)-, N/ NH - und andere P- haltige Gruppen wurden eingebracht und getestet. Die chemischen Modifikationen zeigten in ersten Versuchen, daß eine Lagerung für einen größeren Zeitraum gewährleistet werden konnte. Darüber hinaus konnten die Kapseln nun auch für einen Zeitintervall bei Raumtemperatur gelagert werden, was insbesondere für den Transport (Fracht) eine massive Erleichterung darstellt, in dem es Kosten und der administrative Aufwand (Stichtwort Zollregularien bei Trockeneis und Kühlprodukten) senken wird.
Beispiel 3: Aufreinigung der fertigen Nanokapseln durch Tangentialflussfiltration Fertige Nanokapseln wurden dann zur Entfernung der eventuell vorhandenen größeren Nanokapseln mit einem KrosFlo Research 11/ System mit einem 50 nm Filtermodul aufgereinigt. Partikel mit einer Größe von mehr als 50 nm wurden zurückgehalten. Dazu wurden 50 ml einer 10mg/ml Suspension der Nanokapseln in PBS hergestellt. Diese wurde nach Anweisungen des Herstellers filtriert.
Beispiel 4 Auftrennung nach asymmetrischer Fluss- Feldflussfraktionierung (AF4):
Fertige Nanokapseln wurden dann zur Entfernung der eventuell vorhandenen größeren Nanokapseln mit einem Eclipse AF4 von Wyatt Technology aufgereinigt. Partikel wurden dabei nach Ladung und Größe aufgetrennt. Dazu wurden 50 ml einer 10mg/ml Suspension der Nanokapseln in PBS hergestellt. Diese wurde nach Anweisungen des Herstellers separiert.
Beispiel 5: Transfektion von primären Zellen
Vor allem für hämatopoetische Zellen sind Nanokapseln mit einer Größe von 40-80 nm deutlich vorteilhafter. Protein, DNA, mRNA, miRNA und siRNA wurden als Cargo für Nanokapsel der Größe 50 nm bis 80 nm verwendet. CD 34+ hematopoetische Stammzellen, CD4+ und CD8+ T Zellen wurden mit den Kapseln für 48 Stunden in kubiert. Dabei wurden 10 Kapseln/Zelle verwendet. Das erfolgreiche Einbringen wurde mittels Konfokalmikroskopie im Falle der fluoreszenzmarkierten Kapseln und PCR kontrolliert.
Beispiel 6: Transfektion von weiteren primären Zellen
Für embryonale Stammzellen, sowie für induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) wurden Nanokapseln mit der Größe von 50-120 nm hergestellt. Protein, DNA, mRNA, miRNA und siRNA wurden als Cargo für Nanokapseln der Größe 50 bis 120 nm verwendet. Embryonale Stammzellen und iPS-Zellen wurden mit den Kapseln für 48 Stunden inkubiert. Dabei wurden 20 Kapseln/Zelle verwendet. Das erfolgreiche Einbringen wurde mittels Konfokalmikroskopie im Falle der fluoreszenzmarkierten Kapseln und PCR kontrolliert. Beispiel 7: Stabilisierung und Lagerung bei Raumtemperatur (RT) von Kapseln.
Für alle in den vorherigen Beispielen aufgeführten Kapseln wurden weitere Modifikationen an den Kernen oder an den Layern durch Einbringen von funktionellen Gruppen wie Hydrocarbone, Sauerstoff-haltige, Stickstoff-haltige Gruppen, Sulfur (S/SH)-, N/ NH - und andere P-haltige Gruppen durchgeführt, wodurch eine Stabilisierung der Kapseln und somit das gewünschte Ziel der Lagerung bei RT erreicht werden konnte.
Beispiel 8: Beeinflussung des natürlichen Abbaus der Kapseln
Uber die in Beispiel 2 und 7 eingeführten Modifikationen von funktionellen Gruppen am Kern, sowie an den Layern konnte der natürliche Abbau der Kapseln nach Einbringen in die jeweilige Zielzelle beeinflusst werden. Hierfür ergaben sich Abbauzeiten pro Layer bei 4 Stunden beispielsweise in mesenchymalen- und Tumorzelllinien, sowie Abbauzeiten von 24 Stunden in Zellen von hämatopoetischen Ursprungs.
Beispiel 9: zielgerichtetes Einbringen: mit Hilfe von AK, Peptide, Proteine
Zur weiteren Spezifizierung des zielgerichteten Einbringens von Cargo in gewünschte Zielzellen, wurde in die außenliegenden Layer der Kapseln entsprechende Antikörper, Peptide oder Proteine eingebracht
Beispiel 10: Stabilisierung von Kapseln mit small Molecules als Cargo
Um die Kapseln, welche mit small molecules oder chemotherapeutischen Medikamenten beladen sind zu stabilisieren wurden die small Molecules oder chemotherapeutischen Medikamente in den Kapseln mittels Click-Chemie immobilisiert und somit Diffusionseffekte verhindert.

Claims

Ansprüche:
1 . Nanokapseln geeignet zum Einbringen von Zielmolekülen von primären Zellen und Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Kapseln aus mindestens zwei biodegradierbaren Lagen bestehen
- zwischen diesen mindestens zwei Lagen sich mindestens eine Nukleinsäure, Protein und/oder small Molecule, oder anderes Zielmolekül befindet
- die Nanopartikel-Kerne eine fest definierte Größe mit einer Varianz von maximal 25% aufweisen
- ebenso können die Nanopartikel- Kerne zusätzlich zu der Größe nach Ladung aufgetrennt werden
- nach Bedarf kann die Kapseloberfläche und/oder einzelne Layer innerhalb der Kapsel mit funktionellen Gruppen modifiziert werden.
- ebenso können Cargo-Elemente zwischen den Layern oder die Layer selber modifiziert werden.
2. Nanopartikel-Kerne gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel einer festen Größe aus dem Größenbereich von 20-80 nm ausgewählt werden.
3. Nanopartikel-Kerne gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel aus dem Größenbereich von 30-60 nm ausgewählt werden
4. Verfahren zum Einbringen von Cargo in primäre Zellen oder Zelllinien, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanokapseln mit Zellen in Kontakt gebracht werden, wobei
- die Nanopartikel-Kerne eine fest definierte Größe mit einer Varianz von maximal 25% aufweisen
- die Nanokapseln aus mindestens zwei biodegradierbaren Lagen bestehen
- zwischen diesen mindestens zwei Lagen sich mindestens eine Nukleinsäure, Protein, small Molecule und/oder chemotherapeutische Medikamente befindet
- ein oder mehrere Layer oder Cargo können durch die Anbindung der funktionellen Gruppen modifiziert werden um die Stabilität bei der Lagerung, oder Degradationszeit in den Zellen zu regulieren.
5. Nanokapseln gemäß Anspruch 1 , verändert durch funktionelle Gruppen zu Stabilisierungszwecken
6. Nanokapseln gemäß Anspruch 1 , für den gezielten Transfer
7. Verfahren nach Anspruch 5. wobei die Zellen gesunde oder maligne Zellen eines hämatopoetischen Ursprungs sind .
8. Verfahren nach Anspruch 6 wobei die Zellen transient transfiziert werden
9. Verfahren nach Anspruch 6 wobei die Zellen stabil transfiziert werden
10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zellen embryonale Zellen oder iPS-Zellen sind.
1 1. Verfahren zur Herstellung von Nanokapseln, dadurch gekennzeichnet, dass die Kerne zum Aufbau der Nanokapseln monodisperse Nanopartikel sind und dass die Nanokapseln mit Nukleinsäuren, Proteinen, small molecules oder chemotherapeutischen Medikamenten beladen sind und modifiziert mit funktionellen Gruppen oder nicht-modifiziert angewendet werden
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