WO2021100685A1 - Ｋｉｆ３モーターに基づく精神疾患の治療又は予防、及び薬物スクリーニング - Google Patents

Ｋｉｆ３モーターに基づく精神疾患の治療又は予防、及び薬物スクリーニング Download PDF

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kif3
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crmp2
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信隆 廣川
桃 森川
壮悟 吉原
田中　庸介
陽介 武井
覚之 小川
吉川　武男
泰人 國井
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国立大学法人東京大学
国立研究開発法人理化学研究所
公立大学法人福島県立医科大学
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    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a composition and method for treating or preventing a psychiatric disorder, and a method for screening a therapeutic agent or a therapeutic method for a psychiatric disorder and evaluating its effectiveness. Specifically, the present invention relates to the treatment or prevention of psychiatric disorders based on the KIF3 motor, as well as drug screening.
  • SCZ Schizophrenia
  • KIF3B a member of the kinesin superfamily (KIF) protein, forms a heterodimer with KIF3A.
  • This heterodimer binds to the kinesin superfamily-related protein 3 (KAP3) to form a heterotrimer (KIF3A / KIF3B / KAP3) complex (KIF3 complex).
  • KIF3 complex Loss of function of the KIF3 complex results in the determination of the left-right axis in mouse embryos at fetal age 7.5 days (d.p.c) (eg, Non-Patent Document 3) and the development of brain tumors in the embryo (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 adenomatous polyposis coli
  • the neurogenic process of neurite branching can be continuously followed in hippocampal neuronal dispersal cultures of rodents that undergo appropriate morphological development in vitro.
  • DIV days 1 in vitro
  • highly dynamic lamellipodia are formed and supported by F-actin bundles.
  • the microtubule-rich central domain (C-domain) and the more peripheral actin-rich domain (P-domain) dynamically co-regulate with each other to provide lamellipodia morphology and function, which are essential for proper neural morphogenesis. It supports (for example, Non-Patent Document 6).
  • elucidation of the regulatory mechanism of lamellipodia dynamics is considered to be effective in developing new therapeutic methods for neurite hyperbranching in schizophrenia.
  • Betaine is an anti-carbonyl stress metabolite, and plasma and brain expression levels tend to be down-regulated in SCZ patients (Non-Patent Document 8). Oral administration of betaine was able to improve the behavioral phenotype caused by the SCZ model created by antipsychotic treatment or betaine deficiency due to Chdh gene disruption (Non-Patent Document 8). However, elucidation of synergistic effects with other genetic or epigenetic defects may be key to understanding the molecular mechanism of SCZ development, as elevated carbonyl stress cannot simply lead to SCZ development.
  • an object of the present invention is to clarify the molecular mechanism related to SCZ and to provide a therapeutic or preventive means for SCZ and a method for screening a therapeutic or preventive means for SCZ.
  • the KIF3 motor subunit KIF3B presents the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) subunits 2A (NR2A) and APC (adenomatous), which are important for neuronal plasticity and synaptogenesis.
  • NMDAR N-methyl-D-aspartate receptor
  • NR2A N-methyl-D-aspartate receptor subunits 2A
  • APC adenomatous
  • the present invention includes, for example: [1] A composition for treating or preventing a psychiatric disorder, which comprises at least one of the following (a) to (d).
  • a composition for treating or preventing a psychiatric disorder which comprises at least one of the following (a) to (d).
  • C An expression vector containing a nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor.
  • composition The description in any one of [1] to [4], wherein the psychiatric disorder is at least one psychiatric disorder selected from the group consisting of schizophrenia, mood disorder, anxiety disorder, and developmental disorder.
  • Composition [6] The composition according to any one of [1] to [5], wherein the composition is a pharmaceutical composition, a functional food, a dietary supplement, or a supplement.
  • [7] Use as a psychiatric model animal for non-human mammals in which the expression of the functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor in the brain is reduced or inhibited.
  • KIF functional kinesin superfamily protein
  • [8] The use according to [7], wherein the reduction or inhibition of expression of the functional KIF3 motor is due to a heterozygous knockout of a gene encoding at least one subunit of the KIF3 motor.
  • [9] The use according to [7] or [8], wherein the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3 motor is due to the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3B.
  • Use of description. (I) Decline in sociality, (Ii) Overactivity or diminished interest in new objects, (Iii) Decreased prepulse inhibition, (Iv) Decreased spatial cognitive ability, learning ability, or ability to rewrite acquired memory [11] The use according to any one of [7] to [10], wherein the non-human mammal is a rodent. [12] The use according to any one of [7] to [11], wherein the non-human mammal is a mouse.
  • [13] A method of screening a drug or method for the treatment or prevention of a mental illness.
  • A Treatment of neurons with reduced or inhibited expression of the functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor with test factors,
  • B A method comprising the step of comparing the nerve cell with an untreated control cell or a wild-type nerve cell.
  • A Treatment of neurons with reduced or inhibited expression of the functional KIF3 motor with test factors.
  • B A method comprising the step of comparing the nerve cell with an untreated control cell or a wild-type nerve cell.
  • the method according to [13] wherein the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3 motor is due to the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3B.
  • [15] The transport activity of the NMDA receptor subunit NR2A in the nerve cell and / or the amount or activity of the KIF3 protein or the expression level of the gene encoding the KIF3 in the nerve cell is compared with that of the untreated control cell. [13] or [14], wherein the test factor is selected as a candidate for the drug or method when it is proliferated or equal to or higher than that of wild-type neurons. [16] (i) The above when the excess branching of the dendritic process in the nerve cell is reduced as compared with the untreated control cell or equal to or less than that as compared with the wild type nerve cell.
  • the test factor is selected as a candidate for the drug or method, and / or (ii) the number of spines in the nerve cell is increased compared to the untreated control cell or is equivalent or equivalent to that of the wild type nerve cell. If more, the test factor is selected as a candidate for the drug or method, and / or (iii) the kinetics of lamellipodia in the neuron is increased or wild compared to untreated control cells.
  • the test factor is selected as a candidate for the drug or method when it is equal to or better than the type neuron, and / or (iv) the density and / or of the actin bundle in the lamellipodia in the neuron.
  • the test factor is selected as a candidate for the drug or method and / or when the kinetics is increased compared to untreated control cells or equal to or greater than that of wild neurons.
  • V The test factor when the frequency of microtubule invasion into lamellipodia in the nerve cell is reduced as compared with the untreated control cell or equal to or less than that as compared with the wild type nerve cell. Is selected as a candidate for the drug or method. The method according to any one of [13] to [15].
  • [17] A method of screening a drug or method for the treatment or prevention of a mental illness.
  • C The step of treating a non-human mammal according to any one of [7] to [12] with a test factor.
  • D A method comprising the step of comparing the non-human mammal with an untreated control or wild-type animal.
  • steps (c) and (d) are performed after performing steps (a) and (b) of the method according to [13].
  • the test factor is referred to as the drug or.
  • [22] A method for evaluating the effectiveness of a drug or method for treating or preventing a psychiatric disorder.
  • A Treatment of nerve cells with reduced or inhibited expression of the functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor with the drug or method
  • B Non-human mammals comprising the step of comparing the neurons with untreated control cells or wild-type neurons and / or (c) any of [7]-[12]. Steps to treat with the drug or method,
  • (D) A method comprising the step of comparing the non-human mammal with an untreated control or wild-type animal.
  • the psychiatric disorder is at least one psychiatric disorder selected from the group consisting of schizophrenia, mood disorder, anxiety disorder, and developmental disorder.
  • A At least one subunit of the kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor or its functional variant
  • B Nucleic acid or fragments thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor
  • C An expression vector containing a nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor.
  • D A method for treating or preventing a psychiatric disorder in a nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor or a cell transformed with an expression vector containing the nucleic acid or fragment [25].
  • a method comprising administering to a subject in need an effective amount of a composition comprising at least one of (a)-(d) below.
  • A At least one subunit of the kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor or its functional variant
  • B Nucleic acid or fragments thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor
  • C An expression vector containing a nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor.
  • D A nucleic acid encoding at least one subunit of the KIF3 motor or a fragment thereof, or a cell transformed with an expression vector containing the nucleic acid or fragment.
  • the present invention provides compositions and methods for effectively treating or preventing psychiatric disorders such as schizophrenia. Further, the screening method and the disease model according to the present invention make it possible to easily and efficiently select and identify a drug or method for treating or preventing a psychiatric disorder. Therefore, the present invention is useful in fields such as medical treatment related to psychiatric disorders, drug development, and basic research.
  • 1A-I are diagrams showing that KIF3B binds to the NR2A complex.
  • 1A-C show co-immunoprecipitation (IP) of mouse whole brain extracts using anti-KIF3B antibody (A) and their vesicles using anti-NR2A antibody (B) and anti-APC antibody (C). Indicates co-IP.
  • Normal rabbit IgG (NRG) was used as a control.
  • n 4. 1D-I show the results of immunofluorescence microscopy.
  • FIG. 2A shows immunoblotting of adult mouse lysates of Kif3b +/+ and Kif3b +/- mice performed with the indicated antibodies, along with statistics.
  • Kif3b +/- The amount of protein in the brain is normalized by the amount of protein in the Kif3b +/+ brain and is expressed as% of the control.
  • the expression levels of plasticity-related proteins (NR2A, NR2B, PSD95) and KIF3-related proteins (APC) decreased, but the expression levels of ⁇ -catenin increased.
  • the center and error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • n 5.
  • FIG. 1 The center and error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • FIGS. 2C to 2G are representative micrographs of the distal dendrites of hippocampal neurons in DIV 16 to 18, immunostaining for surface NR2A (C), surface NR2B (D), and cytoplasmic APC (E), and normal.
  • Figures 3A-N show that KIF3B transports NR2A but not NR2B.
  • 3A-F show time-lapse imaging of NR2A-ECFP (AC) and NR2B-ECFP (DF) along the dendrites of hippocampal neurons represented by kymographs (A and D) of vesicles. Shown with statistics of velocity (B and E) and directionality (C and F). Note that NR2A vesicle transport was affected in Kif3b +/- neurons, but NR2B vesicle transport was unaffected. Scale bar 5 ⁇ m. P: Proximal of dendrites; D: Distal region.
  • 3GN show time-lapse fluorescence images of hippocampal neurons expressing NR2A-PA-GFP (G and K) or NR2B-PA-GFP (I and M) in the absence of the proteasome inhibitor MG132 (G and I). ) Or in the presence (K and M), and with statistics (H, J, L and N) showing the time course of degradation along the dendrites at 1 hour intervals after photoactivation at time 0. Note that this proteasome degradation of NR2A-PA-GFP, rather than NR2B-PA-GFP in the Kif3b +/- dendrites, occurred at a significantly faster rate than the Kif3b +/+ dendrites. The orange arrow in the photomicrograph is.
  • FIGS. 4A-G show that KIF3B is essential for synaptic plasticity.
  • FIG. 4D-G show electrophysiological analysis of Schaefer side branch CA1 synapses in acute hippocampal sections from Kif3b +/+ and Kif3b +/- mice.
  • FIGS. 4F to 4G show synaptic plasticity indicated by the time course of fEPSP gradient, which is accompanied by induction of LTP by high-frequency stimulation (F) and induction of LTD by low-frequency stimulation (G). Error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • n 9 sections of 9 mice. *** p ⁇ 0.001; Two-way ANOVA. 5A-J show schizophrenia-like behavior in Kif3b +/- mice.
  • 5C to 5D show the results of a 3-chamber social test (C) with an object, a center, and a mouse that has never encountered the same object region, together with statistics (D).
  • C 3-chamber social test
  • D a mouse that has never encountered the same object region
  • the black line C is a typical trace of mouse movement during the 10 minutes of the test.
  • the center and error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • n 6. * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01;Student's t-test.
  • FIG. 5E shows the result of the new object recognition test. Note that the Kif3b +/- mouse has less interest in new objects than the Kif3b +/+ mouse.
  • FIG. 5F shows the results of a prepulse inhibition (PPI) test.
  • PPI prepulse inhibition
  • Kif3b +/- mice had reduced suppression of startle response.
  • the pulse intensity was 115 dB.
  • n 28.
  • 5G-J show the results of the Burns maze test (G and H) showing spatial reference memory of both genotypes and the reverse Burns maze test showing learning flexibility (I and J), which are representative of mouse movements. Traces (G and I) and statistics (H and J) on time to evacuation and number of primary errors during training sessions and probe trials are shown.
  • Kif3b +/- mice took a long time to acquire spatial memory, but showed similar abilities to maintain memory compared to Kif3b +/+ mice.
  • the red frames of H and J correspond to the trial traces shown in G and I. Error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • n 6. * p ⁇ 0.05;Student's t-test. It is a continuation of FIG. 5G. It is a continuation of FIG. 5G. 6A-I show abnormal histology of Kif3b +/- mouse brain.
  • 6A-C show hematoxylin-eosin (HE) staining of adult mouse coronary sections and enlarged images (A) of the hippocampal CA3 region of the indicated genotype, along with statistics (B and C).
  • the square on the left panel is the enlarged area on the right panel.
  • CC corpus callosum; frame is the radiation zone in the hippocampal CA region.
  • Scale bar 100 ⁇ m.
  • the center and error bars indicate mean ⁇ standard error.
  • n 5.
  • NS p ⁇ 0.05; * p ⁇ 0.05;Student's t-test.
  • 6D-E show mouse brain weight development profiles (D) throughout neurogenesis (Neurogenesis), pruning (Pruning), and gliogenesis (Gilogenesis) from embryonic day 17 (E17) to old age (D).
  • the typical appearance (E) of the brain 0 days after birth (P0) is shown.
  • n 5. * p ⁇ 0.05; Student's t-test.
  • FIGS. 6F-I immunofluorescence merge micrographs were stained for F-actin (red) and ⁇ 3-tubulin (green), and axons from DIV1, 3, 5, and 6 of cultured hippocampal neurons (F).
  • FIG. 7C-D show surface NR2A along the Kif3b +/+ and Kif3b +/- dendrites of cultured hippocampal neurons at DIV 16-18 transfected with Empty-EYFP, KIF3B-EYFP, or KIF3Bmut-EYFP vectors.
  • 7E-F show a schematic diagram (E) of SCZ-related human KIF3B mutations in the KIF3 / KAP3 / APC / NR2A complex and a working hypothesis (F) of SCZ pathogenesis associated with KIF3B dysfunction.
  • 8A-H show that the SCZ-like behavior of Kif3b +/- mice is restored by a high betaine diet.
  • 8C-F show the social interaction test.
  • FIG. 8C-D show the results of the prepulse inhibition (PPI) test of the auditory startle response (ASR) under the conditions shown, and the startle response (G) and the degree of prepulse inhibition (PPI) at 82 dB (H) are simple.
  • PPI prepulse inhibition
  • 9A-J show that the neurite hyperbranched phenotype of Kif3b +/- neurons is restored by betaine administration.
  • 9A-H show the first cytomorphological analysis of pyramidal neurons (A) and MAP2-labeled cultured hippocampal neurons by Gordicox staining of sections of 11-week-old mouse prefrontal cortex of genotype shown in DIV3.
  • FIGS. 9A-D show phase-difference images (I) of nerve-induced GLO1 +/+ and GLO1 -/- human iPS cells and quantification of the number of branch points (J). Scale bar, 10 ⁇ m.
  • FIG. 10A-H show that betaine restores the lamélipodium actin bundles of Kif3b +/- neurons.
  • Scale bar 5 ⁇ m. Error bar, SEM.
  • FIG. 10EF 11A-E show that the inactivity of Kif3b +/- neuron lamélipodia induces microtubule invasion leading to dendrite hyperbranching. 11A-B show F-actin dynamics in lamellipodia of Lifeact-m Ruby transgenic hippocampal neurons in the framed region of the low-magnification visual field in the leftmost column of the genotype indicated by DIV1 with or without administration of 500 ⁇ M betaine.
  • Figures 11C-E show EB1-YFP expression of the genotypes shown in DIV1 (microtubule plus end, corresponding to cyan) and Lifeact-mRuby-transgenic (F-actin, corresponding to magenta) lamellipodia and phyllopodia in hippodia. Two-color time-lapse recording of microtubule invasion in the P domain of.
  • 12A shows the results of immunoprecipitation (IP) from mouse brain lysates using anti-KIF3B and anti-CRMP2 antibodies labeled with the indicated antibodies, as well as normal rabbit IgG (NRG). Note that the immunoco-precipitation of KIF3B and CRMP2 was mutually shown. 12B-C show yeast two-hybrid binding assays between cleavage mutants (B). The result is represented by a photomicrograph (C) of the yeast colony. Note that the tail domain of KIF3A (amino acids 600-701) can interact directly with the C-terminal domain of CRMP2 (amino acids 312-572).
  • 12D-G show immunofluorescence micrographs of Kif3b +/ + primary hippocampal neurons of DIV1.
  • KIF3A DF, yellow
  • CRMP2 labeled DF, magenta
  • normal rabbit IgG G, magenta
  • D low
  • E medium
  • F high magnification
  • F F-actin
  • Phaloidin cyan
  • ⁇ -tubulin green
  • the square of D is the target area of E and F.
  • the arrow E indicates that CRMP2 and KIF3A co-localize around the actin bundle in the P domain (white) and the C domain (orange).
  • FIG. 12H shows fluorescence micrographs of lamelipodia of Kif3b +/+ mouse hippocampal neurons. They were labeled with a proximity ligation assay for CRMP2 and KIF3A (magenta) and counterstained against F actin (cyan). Scale bar, 2 ⁇ m. 12I and K show immunofluorescence micrographs of lamellipodia of cultured hippocampal neurons of the genotype shown in DIV1 for CRMP2.
  • FIG. 12IJ Figures 12MP show MAP2-labeled hippocampal neurons (M) in DIV3 derived from Kif3b +/+ mice transduced with scrambled control (SC) or CRMP2 knockdown (KD) miRNA vectors, as well as ECFP alone or CRMP2-ECFP.
  • M MAP2-labeled hippocampal neurons
  • SC scrambled control
  • KD CRMP2 knockdown
  • N Cell morphological analysis of transduced Kif3b +/- mouse-derived MAP2-labeled hippocampal neurons (N) is shown with their respective quantifications by Sholl analysis (O and P). 10 ⁇ m scale bar. Error bar, SD.
  • 13A-K show that betaine-induced decarbonylation enhances the actin-binding activity of CRMP2.
  • 13A-D show anti-CML immunoblotting of lysates of cultured cortical neurons of the Kif3b +/+ (A, C) and Kif3b +/- (C) genotypes in DIV1.
  • A) with or without treatment with 200 ⁇ M glyoxal or 500 ⁇ M betaine is shown with their respective quantifications (B and D).
  • FIG. 13E shows the quantification of the CRMP2 size distribution in the brain cytoplasmic fraction (S3 fraction) of Kif3b +/+ mice fed CE-2 (blue dashed line) or HBD (green solid line).
  • S3 fraction brain cytoplasmic fraction
  • HBD green solid line
  • Gray dotted protein standards ferritin, 440 kD; aldolase, 158 kD; ovalbumin, 44 kD; ribonuclease A, 13.7 kD.
  • CRMP2 dot blot of each fraction (B) CRMP2 dot blot of each fraction.
  • C) Quantification of relative dot blot intensity of CRMP2 signal. Orange square and inset: Quantification with a retention capacity of 20-21 ml corresponds mostly to highly carbonylated CRMP2. Error bar, SEM. * p ⁇ 0.05, Welch's t-test, n 6, respectively. 13F-I show the biochemical properties of CRMP2 activity on actin.
  • FIG. 13H shows the time course of fluorescence in a pyrene-actin polymerization assay of 5 ⁇ M actin (containing 10% pyrene-labeled actin) with or without 20 ⁇ M CRMP2 or AGE-CRMP2. Note that CRMP2 and AGE-CRMP2 do not significantly affect actin polymerization.
  • FIG. 13H shows the time course of fluorescence in a pyrene-actin polymerization assay of 5 ⁇ M actin (containing 10% pyrene-labeled actin) with or without 20 ⁇ M CRMP2 or AGE-CRMP2. Note that CRMP2 and AGE-CRMP2 do not significantly affect actin poly
  • 14D shows the working hypothesis of the molecular mechanism underlying KIF3 / CRMP2-mediated neurite hyperbranching for SCZ pathogenesis.
  • Impaired actin bundling activity of CRMP2 in developing neuronal lamellipodia is induced by synergistic action between KIF3 motor dysfunction and basal level carbonyl stress and is ameliorated by betaine-induced protein decarbonylation.
  • the kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor can be used to detect symptoms and phenotypes of psychiatric disorders (particularly schizophrenia). It is based on improvement.
  • the KIF3 motor is a heterotrimer (KIF3A / KIF3B / KAP3) complex (KIF3 complex) composed of three subunits KIF3A, KIF3B and KAP3, and is referred to as "KIF3 motor” or "KIF3 motor” in the present specification. "KIF3” refers to at least one or any combination of these subunits.
  • An object of the present invention is to increase the abundance or activity of at least one subunit of a KIF3 motor.
  • at least one of the following (a) to (d) is used: (A) At least one subunit of the kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor or its functional variant, (B) Nucleic acid or fragments thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor, (C) An expression vector containing a nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor. (D) A nucleic acid encoding at least one subunit of the KIF3 motor or a fragment thereof, or a cell transformed with an expression vector containing the nucleic acid or fragment.
  • KIF kinesin superfamily protein
  • the KIF3 motor and its subunits are known, isolated from humans (Homo sapiens), mice (Mus musculus), etc., and their sequence information is open to the public.
  • the KIF3 motor is not particularly limited, but is preferably derived from a human or a mouse, particularly from a human.
  • sequence information of subunit KIF3A is, for example, ENA accession number AAH45542.1 and GeneID: 11127 (the amino acid sequences of isoforms 1, 2 and 3 are NCBI Reference Sequence: NP_001287720.1, NP_001287721.1 and NP_008985.
  • Mouse KIF3A has ENA accession number AAH52707 and Gene ID: 16568 (the amino acid sequences of isoform isoforms 1, 2 and 3 are NCBI Reference Sequence: NP_032469.2, NP_001277734.1 and NP_001277735, respectively). It is registered as (corresponding to 1) etc.
  • sequence information of the subunit KIF3B is registered as, for example, human KIF3B as ENA accession number AAI36311, Gene ID: 9371, etc., and mouse KIF3B as ENA accession number BAA05070, Gene ID: 16569, etc.
  • sequence and the nucleotide sequence encoding the same are shown in SEQ ID NOs: 4 and 3, respectively, and the amino acid sequence of the mouse KIF3B protein and the nucleotide sequence encoding the same are shown in SEQ ID NOs: 2 and 1, respectively.
  • the sequence information of subunit KAP3 is, for example, Gene ID: 22920 for human KAP3 (the amino acid sequences of isoforms 1 to 6 are NCBI Reference Sequence: NP_055785.2, NP_001191443.1, NP_001191445.1, NP_001191446.1, NP_001362759.1, respectively. And NP_001362760.1), etc., the mouse KAP3 isoform KAP3A has ENA accession number EY192739, Gene ID: 16579 (NP_001292572.1), etc., and the isoform KAP3B has Gene ID: 16579 (NP_034759.1), etc. It is registered as.
  • functional variants of the protein of the KIF3 motor can also be used and are particularly limited. It's not something.
  • a plurality of amino acid sequences of the proteins of the publicly available KIF3 motor may preferably occur in one or several amino acids.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 may be deleted and shown in SEQ ID NO: 4.
  • 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids may be added to the amino acid sequence, or 1 to 10, preferably 1 to 10 of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4.
  • Five amino acids, more preferably one to three substituted with other amino acids, can also be used in the present invention.
  • the homology or identity of the amino acid sequence can be easily determined by a method known in the art.
  • the function as a KIF3 motor refers to the function of transporting substances (cargo) along microtubules. This function can be confirmed by a method known in the art, for example, by in vitro microtubule gliding assay, immunofluorescence, live imaging, or the like.
  • the symptomatology or phenotype improving action of psychiatric disorders includes psychiatric symptomatology or phenotype (for example, decreased sociality, decreased interest in overactivity or new objects, decreased prepulse suppression, spatial cognitive ability, learning). Refers to the effect of improving at least one symptom or phenotype of (such as a decrease in ability or ability to rewrite acquired memory).
  • a subject human, laboratory animal, etc.
  • a psychiatric disorder for example, schizophrenia
  • the protein of the above KIF3 motor (at least one subunit) or a functional variant thereof may be obtained by isolation and purification from mouse or human cells, or a nucleic acid encoding the corresponding protein may be obtained. It can be produced by transforming a host with the drug and recovering the protein expressed in the host.
  • Nucleic acids encoding the KIF3 motor are screened from reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) or cDNA libraries using mRNA purified from RNA extracted from nervous system tissues or cells. Can be obtained by Extraction of mRNA from tissues or cells and preparation of a cDNA library can be performed according to a conventional method. Alternatively, a primer set designed based on the base sequence of the nucleic acid encoding the KIF3 motor (at least one subsystem) using DNA prepared from cells or tissues expressing the KIF3 motor (at least one subsystem) as a template is used. A desired nucleic acid can be obtained by carrying out a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR). Whether or not the obtained cDNA is a nucleic acid containing the target sequence can be confirmed by determining the base sequence.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • a nucleic acid encoding a functional variant can also be used as a nucleic acid encoding a KIF3 motor (at least one subunit).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and has a desired function (function as a KIF3 motor).
  • nucleic acid encoding a protein having a psychiatric symptom or phenotypic improving effect can be used. Any known method can be used to introduce a mutation into nucleic acid. Whether or not the recombinant protein produced by the mutated nucleic acid has a desired function can be confirmed in the same manner as described above.
  • a KIF3 motor hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of a sequence of a nucleic acid consisting of a publicly available base sequence. Nucleic acids encoding proteins having the same function (ie, functional subunits) can also be used.
  • the stringent condition is a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, it refers to a condition in which a polynucleotide having high homology (homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more) hybridizes, and can be conventionally set by those skilled in the art. It is possible.
  • a nucleic acid fragment encoding the KIF3 motor (at least one subunit) can also be used in the present invention.
  • nucleic acid may be either DNA or RNA, or may be a hybrid nucleic acid of DNA and RNA, or an artificial nucleic acid.
  • an expression vector for expressing a KIF3 motor (at least one subunit) can be obtained by linking the above nucleic acid or a fragment thereof to an appropriate vector. Further, in the transformed cell used in the present invention, the above nucleic acid or fragment or expression vector is introduced into a host cell so that the target KIF3 motor (at least one subunit) or a functional variant thereof can be expressed. Obtainable.
  • any known vector such as a plasmid, a phagemid, a virus-based vector, or an artificial chromosome can be used as the vector.
  • the plasmid DNA include a plasmid derived from a bacterium, a plasmid derived from yeast, and the like
  • examples of the phagemid DNA include ⁇ phage.
  • transformation is performed using animal viral vectors such as retrovirus, adenovirus and vaccinia virus, insect viral vectors such as baculovirus, bacterial artificial chromosome (BAC), yeast artificial chromosome (YAC), and human artificial chromosome (HAC). Cells can be produced.
  • the purified nucleic acid is cleaved with an appropriate restriction enzyme, then inserted into the restriction enzyme site or multi-cloning site of the appropriate vector DNA and ligated to the vector. Will be done.
  • the vector is autonomously replicated in the host cell, or the nucleic acid of interest on the vector is integrated into the host cell's genome so that the KIF3 motor (at least one subunit) or a functional variant thereof is expressed in the host cell. It is necessary to construct a vector in. Therefore, in addition to the promoter and nucleic acid, it is preferable to link a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selectable marker, a homologous sequence, or the like to the vector. Promoters and signal sequences may be selected to achieve tissue-specific or time-specific expression.
  • a KIF3 motor at least one subunit or a functional variant thereof is used to increase the expression of the KIF3 motor (at least one subunit) or a functional variant thereof in a subject (preferably human).
  • a targeting vector can be constructed by linking the encoding nucleic acid to a promoter capable of functioning in the subject (host) and incorporating this into a vector such as a viral vector.
  • promoters capable of functioning in a mammalian subject include a cytomegalovirus (CMV) promoter, an early or late promoter of Simian virus (SV40), a mouse papillomavirus (MMTV) promoter, and the like. It is not limited to.
  • the vectors that can be used include, but are not limited to, vector systems such as a plasmid vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpesvirus vector, a vaccinia virus vector, and a retrovirus vector.
  • a known DNA ligase is used to link the above various sequences to the vector DNA. Then, the above-mentioned various sequences and the vector DNA are annealed and then ligated to prepare an expression vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the nucleic acid to be introduced.
  • yeast, animal cells NCIH292 cells, COS cells, CHO cells, etc.
  • insect cells can be mentioned.
  • the transformed cells are directly administered to the subject (ex vivo method)
  • it is preferable to transform cells derived from the same species as the species to be administered for example, cells derived from human, mouse, etc.).
  • Methods for introducing a nucleic acid or expression vector into a host or cell are known in the art, and examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
  • the transformant is selected, for example, by utilizing the properties of the marker gene constructed in the gene to be introduced.
  • the KIF3 motor (at least one subunit) protein or a functional variant thereof cultivates the transformed cell into which the nucleic acid encoding the protein has been introduced, and the culture (culture supernatant, cultured cell) thereof. Alternatively, it can be obtained by collecting from (cell crushed product).
  • the method for culturing the transformed cells is carried out according to the usual method used for culturing the host, depending on the type of host used.
  • a KIF3 motor (at least one subunit) protein or a functional mutant thereof is produced inside the cell, the protein is extracted by disrupting the cell.
  • the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like.
  • general biochemical methods used for protein isolation and purification for example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like alone or in combination as appropriate, in the culture.
  • the KIF3 motor (at least one subunit) protein or functional variant thereof can be isolated and purified from.
  • Expression vector containing the encoding nucleic acid or fragment thereof; any cell transformed with the nucleic acid encoding the nucleic acid or fragment thereof encoding at least one subunit of the KIF3 motor or the expression vector containing the nucleic acid or fragment is a symptom of mental illness or Since it exhibits a phenotypic improving effect, it can be used in compositions and methods for the treatment or prevention of mental diseases according to the present invention.
  • composition according to the present invention may contain, as an active ingredient, a subunit of one kind of KIF3 motor or a nucleic acid encoding the same, or two or more kinds of KIF3 motors. It may contain a subunit of the above or a nucleic acid encoding the same in combination.
  • the composition according to the invention contains at least KIF3B or a functional variant thereof or a nucleic acid or fragment thereof encoding the same, an expression vector or transformed cells.
  • the composition may also contain other ingredients that are effective in treating or preventing mental illness.
  • the composition may be used or administered in combination with other ingredients effective in treating or preventing psychiatric disorders, and the composition may be provided as a combination drug with such other active ingredients.
  • Such other active ingredients are not particularly limited as long as they are known in the art, and for example, in the following examples, it has been shown that they are effective in improving the phenotype of schizophrenia.
  • Carbonyl stress scavengers eg, betaine, pyridoxamine or derivatives thereof, etc.
  • typical antipsychotics phenothiazines, butyrophenones, benzamides, etc.
  • atypical antipsychotics serotonin / dopamine blockers, etc.
  • the present composition when it is a pharmaceutical composition, it may contain both a pharmaceutically acceptable carrier or an additive in addition to the active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or an additive examples include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymers, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, etc.
  • examples include gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose and the like.
  • the additive used is selected from the above as appropriate or in combination depending on the dosage form.
  • the method of administering the present composition to the target cells is not particularly limited.
  • the present composition is added to a suspension or a medium containing the target cells, or the target cells are added to a solution containing the present composition.
  • Administration can be performed by a method known to those skilled in the art, such as immersion.
  • the administration method is not particularly limited, and oral administration or parenteral administration, for example, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, or intracerebral administration. , Intramuscular, transdermal administration, rectal administration, nasal administration, etc.
  • compositions when this composition is administered parenterally, for example, injections for intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, intracerebral injection, intrathecal injection and subcutaneous injection (for example, solution, Select formulation forms such as emulsions, suspensions), ointments (especially eye ointments), creams, suppositories, poultices, eye drops, nasal drops, inhalants, liniments, aerosols and other external preparations.
  • injectables can be provided in the form of unit dose ampoules or multidose containers.
  • compositions are excipients, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, pH regulators, preservatives, and solubilizers commonly used in pharmaceuticals.
  • An agent, a preservative, a flavoring agent, an absorption accelerator, a pain-relieving agent, a stabilizer, an isotonic agent and the like can be appropriately selected and produced by a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be blended in the present composition varies depending on the type of the active ingredient (protein, nucleic acid, etc.), its use, dosage form, administration route, etc., but in the case of protein, for example, 1 to 1 to the total weight is used as a reference. It can be 99% by weight, preferably 5 to 90%.
  • the present composition is a nucleic acid, an expression vector or a transformant encoding a protein of a KIF3 motor (at least one subunit) or a functional variant thereof, and the administration target is an animal, gene therapy is performed.
  • the KIF3 motor (at least one subunit) can be delivered to a subject by a variety of dosing methods used in the art.
  • a nucleic acid or expression vector may be directly administered to a subject (in vivo method), or introduced into cells (preferably nerve cells) collected from the subject to obtain the desired KIF3 motor (at least one subunit). Transformed cells expressing the above may be selected and then administered to the subject (ex vivo method).
  • Gene delivery mechanisms that can be used to administer an expression vector to a tissue or cell of interest include a colloidal dispersion system, a liposome induction system, an artificial viral envelope, and the like.
  • the delivery system can utilize macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, liposomes and the like.
  • Direct administration of the nucleic acid or expression vector can be performed, for example, by intravenous injection (including instillation), intramuscular injection, intracerebral injection, intrathecal injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • cell transfer (transformation) of the expression vector can be performed by using a general gene transfer method such as a calcium phosphate method, an electroporation method, or a lipofection method.
  • a general gene transfer method such as a calcium phosphate method, an electroporation method, or a lipofection method.
  • the amount of nucleic acid, expression vector or transformed cell used will vary depending on the route of administration, number of doses and type of subject, but can be appropriately determined using techniques conventional in the art.
  • the effective amount (dose) and administration interval of the composition include the type of active ingredient (protein, nucleic acid, etc.) contained in the composition, the subject (cell or animal), the age and body weight of the subject, and the route of administration. , It depends on the number of administrations and can be changed in a wide range.
  • This composition does not particularly limit the target (cell or animal) to be used.
  • the target in the case of cells, it can be administered to cells derived from mammals such as humans, mice, rats, horses, sheep, pigs, etc., or artificially established cell lines (iPS cells, etc.). ..
  • the target includes mammals such as humans, domestic animals (cattle, pigs, etc.), pet animals (dogs, cats, etc.), experimental animals (mouses, rats, monkeys, etc.) and the like.
  • the present composition is not limited to its use as a pharmaceutical composition, and may be blended with, for example, foods or feeds.
  • Foods or feeds containing this composition are useful as functional foods, health supplements or supplements for improving the symptoms of mental illness or preventing the onset of mental illness.
  • the form and type of the food containing the present composition are not particularly limited. For example, it can be blended in various forms of foods such as solid foods, jelly-like foods, liquid foods, and capsule-shaped foods.
  • the composition described above can treat or prevent psychiatric disorders by increasing the abundance or activity of at least one subunit of the KIF3 motor (preferably containing at least KIF3B).
  • mental disorders include, for example, schizophrenia, mood disorders (depression, bipolar disorder, etc.), anxiety disorders (general anxiety disorders, panic disorders, etc.), developmental disorders (learning disabilities, pervasive developmental disorders, etc.). Disorders, attention deficiencies, hyperactivity disorders, etc.).
  • the disease to be treated or prevented by the present composition may be a single disease, a concomitant disease, or a co-existing disease other than the above.
  • the subject to which this composition is administered is particularly preferably a subject for which treatment or prevention of psychiatric disorder is desired, for example, a subject having a genetic predisposition to psychiatric disorder, or a subject who has been diagnosed with psychiatric disorder.
  • Non-human mammals deficient in the KIF3 motor exhibit characteristics and phenotypes specific to psychiatric disorders such as schizophrenia.
  • Kif3b +/- neurons show reduced dendrite levels in both NR2A and NR2B due to impaired transport of NR2A and increased degradation of NR2B, and Kif3b +/- hippocampal sections have reduced electrophysiological NMDAR responses.
  • synaptic plasticity has collapsed, and these features correspond to the general features of schizophrenia (SCZ) (Example 1).
  • KIF3b +/- mouse brain Histological features of the Kif3b +/- mouse brain also mimic the features of SCZ, and Kif3b +/- mice exhibit behavioral deficits in prepulse inhibition (PPI), social interest, and cognitive flexibility (Example 1). ..
  • PPI prepulse inhibition
  • KIF3B was specifically identified in human SCZ patients, and rescue experiments revealed that it was functionally deficient (Example 1). Therefore, it is suggested that KIF3 motors (particularly KIF3B) transport the NR2A / APC complex and that its dysfunction is responsible for the SCZ pathogenesis.
  • the present invention relates to the use of a non-human mammal as a psychiatric model animal in which the expression of a functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor in the brain is reduced or inhibited.
  • KIF kinesin superfamily protein
  • the non-human mammal is preferably a mammal other than human, more preferably a rodent (mouse, rabbit, guinea pig, rat, etc.), and particularly preferably a mouse.
  • a rodent mouse, rabbit, guinea pig, rat, etc.
  • the "functional KIF3 motor” refers to a KIF3 motor that has the function of transporting substances (cargo) along microtubules. Therefore, “the expression of a functional KIF3 motor is reduced or inhibited” means that the expression of the whole KIF3 motor or at least one of its subunits (particularly KIF3B) is reduced, or the whole KIF3 motor or at least. Even if one of its subunits (particularly KIF3B) is expressed, it is either a variant that has lost its function as a KIF3 motor, or the entire functional KIF3 motor or at least one of its subunits (especially KIF3B). Even when KIF3B) is expressed, it means that its expression is substantially reduced or inhibited by means (such as siRNA) that inhibits the expression of the KIF3 motor (or its subunit).
  • means such as siRNA
  • “Expression is reduced or inhibited” means that the expression level of the entire KIF3 motor or at least one of its subunits (particularly KIF3B) is 70 relative to the corresponding animal individual (or cell) with normal (wild type) expression. % Or less, preferably 60% or less, more preferably 50% or less, still more preferably 40% or less, and most preferably its expression is substantially undetectable.
  • Animals with reduced or inhibited expression of the functional KIF3 motor can be obtained as knockout animals, for example by disrupting genes on the chromosome encoding the KIF3 motor or its subunits. Methods of making knockout animals are known to those of skill in the art.
  • the gene sequences encoding the subunits (KIF3A, KIF3B and KAP3) that make up the KIF3 motor are available from the database as described above. Based on this sequence, genomic DNA is cloned, integrated into a gene targeting vector according to a conventional method, introduced into a cell, and an individual is generated from the cell.
  • genomic DNA is cloned, integrated into a gene targeting vector according to a conventional method, introduced into a cell, and an individual is generated from the cell.
  • a KIF3B knockout mouse of a KIF3 motor can be produced by the method described in Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998).
  • heterozygous knockout animals i.e. mammals produced by heterozygous knockout of genes encoding at least one subunit of the KIF3 motor, are preferred.
  • Mammals with reduced or inhibited expression of the functional KIF3 motor exhibit at least one of (i)-(iv) below compared to the corresponding wild-type mammal: (I) Decline in sociality, (Ii) Overactivity or diminished interest in new objects, (Iii) Decreased prepulse inhibition, (Iv) Decreased spatial cognitive ability, learning ability, or ability to rewrite acquired memory.
  • compared to the corresponding wild-type mammal means that the phenotypes (i) to (iv) above express a functional KIF3 motor under the same conditions. It means that it is significantly reduced when compared with the mammals of.
  • the phenotypes (i)-(iv) above are equally low or less when compared to other model mammals of psychiatric disorders (particularly schizophrenia) under similar conditions. To say.
  • the phenotypes (i) to (iv) above are phenotypes or symptoms characteristic of psychiatric disorders (particularly schizophrenia), and those skilled in the art can evaluate them using known methods or means. it can. For example, a social interaction test, an elevated cross maze test, a new object recognition test, a hearing startle response test (ASR), a prepulse suppression test (PPI), a Burns maze test, a reverse Burns maze test, etc. as described in the following examples. Can be evaluated by.
  • Non-human mammals with reduced or inhibited expression of the functional KIF3 motor are at least one psychiatric disorder selected from the group consisting of psychiatric disorders such as schizophrenia, mood disorders, anxiety disorders, and developmental disorders. It can be useful as a model animal for the disease. Such model animals are used, for example, for screening drugs or methods for the treatment or prevention of psychiatric disorders and for evaluating the effectiveness of drugs or methods for the treatment or prevention of psychiatric disorders, as described below. Can be done.
  • a mammal or nerve cell lacking a functional KIF3 motor or a subsystem thereof is used to screen a drug or method for treating or preventing a psychiatric disorder, and to treat or prevent a psychiatric disorder.
  • the effectiveness of the drug or method for can be assessed.
  • the present invention is a method of screening a drug or method for treating or preventing a psychiatric disorder.
  • A Treatment of neurons with reduced or inhibited expression of the functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor with test factors,
  • B Provided is a method comprising a step of comparing the nerve cell with an untreated control cell or a wild-type nerve cell.
  • KIF functional kinesin superfamily protein
  • the present invention is also a method for screening a drug or method for treating or preventing a psychiatric disorder.
  • C The step of treating the non-human mammal with a test factor
  • D Provided is a method comprising the step of comparing the non-human mammal with an untreated control or wild-type animal.
  • the present screening method nerve cells in which the expression of a functional KIF3 motor is reduced or inhibited are treated with a test factor and / or functional.
  • Non-human mammals with reduced or inhibited expression of KIF3 motors are treated with test factors.
  • Nerve cells in which the expression of the functional KIF3 motor is reduced or inhibited can be prepared by a method known in the art.
  • the neurons of interest can be prepared by isolating the neurons from non-human mammals in which the expression of the functional KIF3 motor described above is reduced or inhibited.
  • a target nerve cell can be produced by knocking out or knocking down a gene encoding a KIF3 motor or its subunit in a nerve cell (see, for example, the following examples).
  • the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3 motor is preferably due to the reduction or inhibition of the expression of the functional KIF3B.
  • Non-human mammals in which the expression of the functional KIF3 motor is reduced or inhibited are as described in "2. Model animals for mental illness" above.
  • test factor that is the target of this screening method is not particularly limited.
  • the test factor can be any substance, specifically a naturally occurring molecule, such as an amino acid, peptide, oligopeptide, polypeptide, protein, nucleic acid, lipid, carbohydrate (sugar, etc.), steroid, glycopeptide, sugar. Proteins, proteoglycans, etc .; Synthetic analogs or derivatives of naturally occurring molecules, such as peptide mimetics, nucleic acid molecules (aptamers, antisense nucleic acids, double-stranded RNA (RNAi), etc.); Examples include organic compounds (inorganic and organic compound libraries, or combinatorial libraries, etc.); and mixtures thereof.
  • the test factor may be a single substance, a complex composed of a plurality of substances, a transcription factor, or the like.
  • the test factor may be an environmental factor such as radiation, ultraviolet light, carbon concentration, temperature and the like.
  • test factor a single test factor may be tested independently, or a mixture of several candidate test factors (including a library) may be tested.
  • library containing a plurality of test factors include a synthetic compound library (combinatorial library, etc.), a peptide library (combinatorial library, etc.), and the like.
  • treatment conditions such as the treatment amount, treatment period, and treatment route differ depending on the type of test factor and the like, but those skilled in the art can easily determine it.
  • the administration route is intramuscular injection, oral administration, intravenous injection, intracerebral injection, intrathecal injection, peritoneal injection, depending on the type of test substance, the type of animal used, and the like. Dosage forms such as internal injection, transdermal administration, and subcutaneous injection can be appropriately used.
  • the conditions for the treatment differ depending on the type of factor used, but can be easily determined by those skilled in the art.
  • such treatment involves culturing the nerve cells in a medium supplemented with the test substance, immersing the nerve cells in a solution containing the test substance, and laminating the test substance on the nerve cells. , Or by culturing nerve cells in the presence of test factors.
  • the effect and effectiveness of the test factor can be examined under several conditions.
  • Such conditions include time or duration of treatment or treatment with the test factor, amount (large or small), number of times, and the like.
  • a plurality of doses can be set by preparing a dilution series of the test substance.
  • the treatment or treatment period of the test factor can be appropriately set, and for example, the treatment can be performed over a period of one day to several weeks, months, or years.
  • test factors when examining the additive action, synergistic action, etc. of a plurality of factors, the test factors may be used in combination.
  • the transport activity of the NMDA receptor subunit NR2A in nerve cells is measured.
  • the measurement of this activity can be carried out by a method known in the art, and specifically, the method described in the following examples can be used. If the transport activity of NR2A in neurons is increased compared to untreated control cells, or if it is equal to or greater than that of wild-type neurons, then the test factor is a drug or method candidate. Select as.
  • the amount or activity of KIF3 protein (particularly KIF3B) or the expression level of a gene encoding KIF3 (particularly KIF3b) in nerve cells is measured.
  • the amount or activity of the KIF3 protein or the expression level of the gene encoding KIF3 can be measured by a method known in the art, and specifically, the method described in the following examples can be used.
  • the test factor is selected as a drug or method candidate.
  • test factor can be selected by any of the following: (I) Test factors are used when the excess branching of dendrites in neurons is reduced compared to untreated control cells, or equal to or less than that of wild-type neurons.
  • test factors as drug or method candidates ,;
  • V Test factors when the frequency of microtubule invasion into lamellipodia in neurons is reduced compared to untreated control cells, or equal to or less than that of wild-type neurons. Is selected as a drug or method candidate.
  • the non-human mammal exhibits at least one improvement of (i)-(iv) below as compared to the untreated control or wild-type animal: evaluate: (I) Decline in sociality, (Ii) Overactivity or diminished interest in new objects, (Iii) Decreased prepulse inhibition, (Iv) Decreased spatial cognitive ability, learning ability, or ability to rewrite acquired memory.
  • the phenotypes (i) to (iv) above are phenotypes or symptoms characteristic of psychiatric disorders (particularly schizophrenia), and those skilled in the art can evaluate them using known methods or means. it can.
  • a social interaction test for example, a social interaction test, an elevated cross maze test, a new object recognition test, a hearing startle response test (ASR), a prepulse suppression test (PPI), a Burns maze test, a reverse Burns maze test, etc. as described in the following examples.
  • ASR hearing startle response test
  • PPI prepulse suppression test
  • Burns maze test a reverse Burns maze test, etc. as described in the following examples.
  • test factors were selected as candidates by performing the above steps (a) and (b) as the primary screening, and then selected as the secondary screening as the above steps (c) and (d).
  • Non-human mammals may be treated with the test factor and the test factor may be further selected.
  • the efficacy of a test factor is confirmed at the cellular level, the efficacy is evaluated in experimental animals and even in humans by, for example, clinical trials.
  • the present inventor also biochemically identified the collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) as a cargo transported by the KIF3 motor, and at the same time identified it as a new carbonylation-sensitive actin bundling factor (Example 2).
  • Betaine with decarbonylation activity significantly reduces the carbonylation of CRMP2 and enhances the proper kinetics of lamellipodia and the F-actin bundling activity required for peripheral microtubule elimination and thus functionally KIF3 deficiency.
  • the deficiency of the functional KIF3 motor can be functionally compensated by suppressing carbonylation (decarbonylation).
  • the test factor has carbonylation suppressing activity. Further evaluation steps may be performed.
  • the evaluation of the carbonylation inhibitory activity can be performed by a method known in the art, and is not particularly limited. Further, in this screening method, a step of evaluating whether or not the test factor increases the amount or activity of the CRMP2 protein and / or a step of evaluating whether or not the test factor has an activity of suppressing the carbonylation of the CRMP2 protein is further performed. You may go.
  • the evaluation of whether to increase the amount or activity of the CRMP2 protein and the evaluation of the activity of suppressing the carbonylation of the CRMP2 protein can also be performed by a method known in the art, and are not particularly limited. .. For a specific method, refer to Example 2.
  • CRMP2 is also known in the art and is also known as dihydropyrimidinase-like 2 (DPYSL2).
  • sequence information of human CRMP2 is ENA accession numbers BC067109, BC056408, Gene ID: 1808 (isoform). 1 to 3 correspond to NP_001184222.1, NP_001377.1 and NP_001231533.1, respectively), and the sequence information of mouse CRMP2 is ENA accession number BC062955, Gene ID: 12934 (isoforms 1 and 2 correspond to NP_001365696.1, respectively). And NP_034085.2), etc.
  • the selected candidate test factor is administered to another model animal of psychiatric disorder so that the candidate test factor becomes a symptomatology or phenotype of mental illness in the model animal. It may be determined whether or not it affects.
  • the model animal is not particularly limited as long as it has a factor of the target mental illness (such as a genetic predisposition) or exhibits at least one symptom.
  • schizophrenia (SCZ) model mice (Ohnishi, T. et al., Ebiomedicine 45, 432-446 (2019), Koike, S. et al., Translational psychiatry 4, e379-e379 (2014), Duan, X.
  • test factor affects the psychiatric disorder in the model animal depends on the type, factor, symptom, etc. of the model animal's disease, but those skilled in the art can appropriately determine the effect on the disease. Can be done. For example, in order to determine the influence on sociality, a social interaction test or the like can be performed.
  • the test factor when the improvement of the characteristic (abnormality) in the nerve cell or the improvement of the symptom of the psychiatric disorder is observed can be selected as a candidate drug or method for the treatment or prevention of the psychiatric disorder. it can.
  • the steps of this screening method can also be used to assess the effectiveness of a drug or method for the treatment or prevention of psychiatric disorders. Therefore, the present invention is also a method of evaluating the effectiveness of a drug or method for the treatment or prevention of psychiatric disorders.
  • A Treatment of nerve cells with reduced or inhibited expression of the functional kinesin superfamily protein (KIF) 3 motor with the drug or method,
  • B a step of comparing the nerve cell with an untreated control cell or a wild-type nerve cell, and / or (c) a step of treating the non-human mammal with the drug or method.
  • KIF functional kinesin superfamily protein
  • D Provided is a method comprising the step of comparing the non-human mammal with an untreated control or wild-type animal.
  • Example 1 Production of mice with reduced functional KIF3B and evaluation of its schizophrenia-like phenotype (1) Materials and methods Mouse and behavior analysis Animal handling, housing, environmental settings, and nutritional design are all animals. The experiment was conducted under the restrictions of the University of Tokyo. Kif3b gene targeting for the production of Kif3b +/- mice and PCR genotyping for detecting disruption of the Kif3b gene using neo-cassettes have been previously studied (Nonaka S, et al., Cell 95: It is described in 829-837 (1998)). Kif3b mutant mouse strains were maintained by repeated backcrossing with C57BL / 6J mice. Adult littermate male mice aged 3 to 6 months were used for the analysis, and the behavioral test was conducted in a single blind with a habituation time of 10 minutes.
  • Elevated cross maze test The elevated cross maze was performed as previously reported (Holmes A, et al., Physiol Behav 71: 509-516 (2000)). Briefly, male mice were placed in the center of the plus maze and videotaped them for 5 minutes. The number of intrusions into the open arm and the time spent on the open arm were manually counted.
  • 3-chamber social test As previously reported, a 3-chamber social test was conducted (Silverman et al. (2010), supra). Briefly, the rectangular box is divided into three rooms, with an opening between them. I set cages on two of them and kept the central room empty. After acclimatizing the mice to the box for 10 minutes, they were encountered in a cage for 10 minutes with wild-type male mice that had never been encountered before. The time spent in each room was calculated using EthoVision software.
  • New object recognition test A new object recognition test was conducted as previously reported (Yin X, et al., Neuron 70: 310-325 (2011)). During the training session, two identical objects were placed in a rectangular box and the mouse was allowed to explore freely for 15 minutes. The time spent exploring each object as a nasal contact was recorded. In the retention test, the mice were returned to the same cage. In this cage, one of the familiar objects used during training was replaced with a new object and allowed to explore for 15 minutes. Using EthoVision software, we recorded the number of visits and time spent searching for new objects in our immediate surroundings.
  • ASR and PPI were performed as previously reported (Maekawa M, et al., J Neurochem 115: 1374-1385 (2010)).
  • ASR the pulses were set to 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120 dB and the startle response at each pulse was recorded.
  • PPI the pre-pulse (PP) was 70, 74, 78, 82, 86 dB, and the pulse (P) was 115 dB.
  • the PPI percentage was calculated as [(P amplitude-PP amplitude) / P amplitude] ⁇ 100. All excess amplitude mean ⁇ 2 ⁇ SEM were excluded to calculate the values.
  • Burns Maze Test The test was conducted as previously reported (Rosenfeld CS, Ferguson SA, J Vis Exp 84: e51194 (2014)).
  • the training device was a round table with 16 holes around it. Most of these holes lead to pits in the floor, but one hole leads to a pit containing food.
  • the study consisted of a 4-day training session (2 sessions daily) and probe trials on days 5, 12, and 29 from the start of the study. The time to drop box and the number of primary errors were monitored and counted using EthoVision software.
  • Antibodies The primary antibodies used in this study are: anti-KIF3B polyclonal antibodies (1: 500, Takeda S, et al., J Cell Biol 148: 1255-1265 (2000)), anti-KIF3A monoclonal antibodies (1: 500, Takeda S, et al., J Cell Biol 148: 1255-1265 (2000)). 1: 500, 611508, BD Transduction Laboratories, RRID: AB_398968), anti-KAP3A monoclonal antibody (1: 500, 610637, BD Transduction Laboratories, RRID: AB_397967), anti-KIF17 polyclonal antibody (1: 500, Yin X, et al.
  • anti-KIF5B polyclonal antibody (1: 500, RRID: AB_2571745), anti-NR2A (1: 300, GluRe1C-Rb-Af542, Frontier Institute, RRID: AB_2571605) and anti-NR2B polyclonal Antibodies (1: 300, GluRe2N-Rb-Af660, Frontier Institute, RRID: AB_2571761), anti-APC polyclonal antibodies (1: 300, sc-896, Santa Cruz Biotechnology, RRID: AB_2057493), anti-PSD95 monoclonal antibodies (1: 500) , MA1-046, Thermo Fisher Scientific, RRID: AB_2092361), anti- ⁇ -tubulin monoclonal antibody (1: 1,000, DM1A-T9026, Sigma-Aldrich, RRID: AB_477593), anti- ⁇ 3-tubulin polyclonal antibody (1: 500)
  • Normal rabbit IgG (55944, Cappel / ICN / MP, RRID: AB_2334717) and normal mouse IgG (02-6502, Thermo Fisher Scientific, RRID: AB_2532951) were used as negative controls.
  • Alexa Fluor 405-, 488-, and 647-binding goat anti-mouse IgG fluorescent antibodies (1: 500; A-31553, RRID: AB_221604; A-11029, RRID: AB_2534088; A-21236, RRID: AB_2535805) and Alexa Fluor 488- and 568-binding goat anti-rabbit IgG fluorescent antibodies (1: 500; A-11034, RRID: AB_2576217; A-11036, RRID: AB_10563566) were obtained from Invitrogen / Thermo Fisher Scientific.
  • Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin was used to stain F-actin (1: 1,000, A-12380, Thermo Fisher Scientific).
  • Horseradish peroxidase-binding goat anti-mouse antibody (1: 1,000, # NA931V, RRID: AB_772210) and horseradish peroxidase-binding goat anti-rabbit antibody (1: 1,000, # NA934V, RRID: AB_772206) were obtained from GE Healthcare.
  • pEGFP-N1 (Clontech) vector was applied to counter-label the amount of neurons.
  • Mouse full-length Nr2a and Nr2b cDNAs were ligated into pCMV-driven ECFP and PA-GFP N1 expression vectors for NR2A and NR2B live imaging and degradation assays (Yin et al. (2011), supra).
  • An untagged mouse NR1 expression vector was prepared by replacing the yellow fluorescent protein (YFP) sequence of pEYFP (Clontech) with mouse Nr1 cDNA as previously reported (Yin et al. (2011), supra).
  • a miRNA-based mammalian expression vector was prepared using the BLOCK-iT Pol II miR RNAi expression vector kit (Thermo Fisher) with the following oligonucleotides: 5'-TGCTGTCATCATAGAGCTCAAACTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAGTTTGCTCTATGATGA-3'(SEQ ID NO: 5) 5'-CCTGTCATCATAGAGCAAACTGCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGCAGTTTGAGCTCTATGATGAC-3'(SEQ ID NO: 6) All oligonucleotides were synthesized on each residue with a phosphorothioate group and inserted into the pcDNATM6.2-GW plasmid vector (Thermo Fisher).
  • mice were transfected with DIV 8-10 using a knockdown vector.
  • Mouse Kif3b cDNA (SEQ ID NO: 1) was ligated into the pEYFP-N1 vector (Clontech) for rescue assay.
  • the Arg653Ter point mutation was introduced into the KIF3B-EYFP expression vector using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) with the following oligonucleotides: 5'-AACTCGAGGCCACCATGTCCAAGTTAAAAAGCTCA-3' (SEQ ID NO: 7) 5'-ATGATGATTCGGCCAGAGCCCGAGGTACCAAA-3' (SEQ ID NO: 8) These were introduced into hippocampal neurons with DIV 16-21 and cultured for 48-72 hours for analysis.
  • FIGS. 1A-C For immunoprecipitation in FIGS. 1A-C, 6 ml RIPA buffer (FIG. 1A) or Hepes-sucrose buffer (10 mM Hepes pH 7.4, 320 mM sucrose, 5 mM EGTA 4 , 1 mM EGTA, protease inhibitor; FIG. 1B and Homogenized for C). It was passed through a syringe and centrifuged at 15,000 xg for 15 minutes for clarification. 2 ⁇ g of the primary antibody was pre-incubated with magnetic ⁇ MACS Protein A Microbeads (manufactured by MACS Miltenyi Biotec), mixed with 1 ml of brain lysate at 4 ° C. for 1 hour, washed, eluted and subjected to immunoblotting.
  • RIPA buffer FIG. 1A
  • Hepes-sucrose buffer 10 mM Hepes pH 7.4, 320 mM sucrose, 5 mM EG
  • hippocampal neurons Primary cultures of hippocampal neurons were prepared as previously reported (Takei Y, et al., J Cell Biol 150: 989-1000 (2000); Kaech S, Banker G, Nat Protoc 1: 2406). -2415 (2006)). Briefly, hippocampi isolated from 16.5 day embryonic mice were dissociated with 0.25% trypsin at 37 ° C. for 15 minutes. Next, neurons were plate-cultured on glass coverslips coated with polyethyleneimine (Sigma) and poly-L-lysine / laminin (Sigma).
  • the medium was the minimum essential medium (MEM), and 1 mM pyruvic acid (Gibco), 0.6% glucose, GlutaMAX TM- I (# 35050, Gibco), and 2% B27 auxiliary mixture (Gibco) were added.
  • the modified calcium phosphate protocol (Jiang M, Chen G, Nat Protoc 1: 695-700 (2006)) was used to transfect in vitro days (DIV) 7-16. After 2 or 3 days of transfection, hippocampal cells were fixed for immunocytochemistry or subjected to direct live imaging. To visualize the spines of the neurons, EGFP-transfected neurons were observed using an LSM780 confocal laser scanning microscope equipped with an Airyscan device (ZEISS).
  • Time-lapse imaging hippocampal neurons were used in DIV 7-9.
  • the NR2A-ECFP or NR2B-ECFP expression vector was introduced into cultured neurons carrying the unlabeled full-length NR1 expression vector using a modified calcium phosphate transfection method.
  • a modified calcium phosphate transfection method Under an inverse ZEISS light microscope with a CSU-W1 spindle disk confocal laser scanning unit (Yokogawa), a cooled iXon EM-CCD camera (Andor) and an LSM780 confocal laser scanning microscope (ZEISS) 3-5 days after transfection. Live imaging of neurons was performed in. The movement of NR2A-ECFP or NR2B-ECFP clusters along the dendrites was monitored every 4 seconds.
  • mice were anesthetized and transcardiac perfused with 4% PFA-PBS.
  • the brain was dissected and post-fixed with FEA solution (70% ethanol, 5% formalin, 5% acetic acid). After dehydration with ethanol, the tissue was paraffin-embedded and serially sectioned to a thickness of 7 ⁇ m (HM-355; rotating microtome).
  • HE hematoxylin-eosin
  • the fixed brain was subjected to a LEICA Z6 APO microscope for observation and quantification.
  • Oxygenated cleavage solution [15 mM KCl, 130 mM K-gluconate, 0.05 mM EGTA, 20 mM Hepes (pH 7.4), 25 mM D-glucose] or artificial CSF (119 mM NaCl, 2.6 mM KCl, in aCSF, Cut with 1.3 mM DDL 4 , 1.0 mM NaH 2 PO 4 , 26 mM LVDS 3 , 2.5 mM CaCl 2 , in 11 mM D-glucose), incubate in a chamber at 32.5 ° C., hyperfused with oxygenated aCSF, pre-recording.
  • NMDAR-mediated EPSCs were isolated by blocking AMPA current with 2,3-dioxo-6-nitro-1,2,3,4 tetrahydrobenzo [f] quinoxaline-7-sulfonamide (NBQX, 10 ⁇ M).
  • the ratio measurement of NMDA / AMPA current was calculated from the peak amplitudes of the holding potentials at +40 and -90 mV.
  • Both stimulation and recording electrodes were placed in the radiation layer in the CA1 region to record the excitatory postsynaptic potential (fEPSP).
  • the stimulus intensity (test pulse duration 0.1 ms) was set to induce a maximum fEPSP of approximately 50% at a frequency of 0.1 Hz.
  • LTP long-term potentiation
  • LTD long-term depression
  • NR2A / NR2B degradation assay Hippocampal neurons were used in DIV 7-9.
  • Photoactivated (PA) -GFP was fused to NR2A or NR2B to create an NR2A-PA-GFP or NR2B-PA-GFP expression vector driven by the CMV promoter.
  • Unlabeled NR1 and NR2A-PA-GFP or NR2B-PA-GFP were introduced into cultured neurons with RFP using the modified Ca 2+ -phosphate transfection method as described above (Jiang & Chen (2006). Above).
  • live neurons NR2A or NR2BPA-GFP were locally photoactivated with a 405 nm laser and observed under 488 nm excitation using an LSM780 confocal laser scanning microscope (ZEISS). If necessary, neurons were pretreated with MG132 (10 ⁇ M) for 24 hours. Images were taken every hour and each cell was observed for 6 hours.
  • KIF3B, KIF3A, KAP3A, NR2A, and PSD95 were all found to be immunoprecipitated by an anti-APC antibody (Fig. 1C), suggesting an interaction between these proteins and APC as a complex.
  • Kif3b -/- mutant mice are lethal at 10.5 dpc (Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998)) and lack sufficient levels for analysis of neural function.
  • the function of KIF3B was investigated using Kif3b +/- mutant mice through the trials of the examples.
  • KIF3B is essential for postsynaptic localization of NR2A and NR2B in hippocampal neurons Kif3b +/- In immunoblotting of crude mouse brain extracts, KIF3B, NR2A, NR2B, APC, compared to Kif3b +/+ brain, A decrease in the expression level of PSD95 and an increase in the expression level of ⁇ -catenin were observed (Fig. 2A), suggesting the involvement of KIF3B function in both NR2A and NR2B. Levels of ⁇ -actin, ⁇ -tubulin, and KIF5B did not differ between genotypes (Fig. 2A).
  • NR2A was significantly reduced in the hippocampal CA1 tip dendritic region of Kif3b +/- mouse brain, suggesting that KIF3B is involved in the postsynaptic localization of NR2A (Fig. 2B).
  • NR2A, NR2B, and APC were further investigated using semi-ultra-high resolution immunocytochemistry of cultured hippocampal neurons.
  • NR2A or NR2B-containing patches located on the surface of dendrite spines counter-labeled with EGFP and anti-PSD95 antibody were clearly visualized (FIGS. 2C and D).
  • the density and size of these plaques in the Kif3b +/- dendrites were significantly smaller than in the Kif3b +/+ control dendrites (FIGS. 2C, D and G).
  • NR2APA-GFP or NR2B-PA-GFP was introduced into cultured hippocampal neurons, and after photoactivation at 0 o'clock, changes in signal intensity along the dendrites or in cells were examined every hour (Fig. 3G). ⁇ N).
  • the decay of fluorescence intensity of the NR2B-PA-GFP cluster with time was significantly and specifically accelerated (Fig. 3G-J). Since this attenuation was inhibited by the application of the proteasome inhibitor MG132, it was considered to be due to ubiquitin-proteasome degradation (FIGS. 3K to N).
  • Mushroom-type spine The number of spines on the head increased significantly in the Kif3b +/- neuronal dendrites, and the average head size and neck length also increased in the Kif3b +/- mushroom-type spine (Fig. 4C). ..
  • NMDAR-dependent NMDAR-dependent types of synaptic plasticity at excitatory postsynaptic potentials were compared.
  • LTP long-term potentiation
  • LTD long-term depression
  • Kif3b +/- Because these abnormal neuronal plasticity characteristics with reduced transport of NR2A in schizophrenia-like behavior abnormalities Kif3b +/- neurons in mice, it was decided to study the behavior of the mutant mice. A series of behavioral analyzes were performed (Fig. 5). In an open field study, we compared the frequency of social interactions between Kif3b +/+ and Kif3b +/- genotypes. Kif3b +/- mice showed lower social activity (contact and follow-up) than Kif3b +/+ mice. In addition, the level of exploratory and repetitive behaviors such as jumping and rotational activity was high, and a large amount of time was spent on hairdressing, suggesting the existence of locomotion hyperactivity (Fig. 5A).
  • histological examination was performed. Continuous paraffin sections of the brain were prepared, HE stained and examined. Kif3b +/- The thickness of the corpus callosum (CC) and radiation layer in the hippocampal CA3 region of mice was significantly reduced (FIGS. 6A and B), consistent with previously reported phenotypes in mouse models of SCZ and intellectual impairment. .. Cell densities in the CA1, CA2, and CA3 regions did not change between the Kif3b +/+ and Kif3b +/- genotypes (Fig. 6C).
  • Kif3b +/+ mice From the developmental profile of whole brain weight of Kif3b +/+ and Kif3b +/- mice, Kif3b +/- mice have lower brain weight in the early stage of development (Fig. 6D and E), but after 14 days of age, "pruning period (pruning period (Fig. It was revealed that the brain weight increased during the prunting period) (Fig. 6D). The developmental profile of this brain weight is also similar to that of SCZ mouse brains.
  • KIF3B used SCZ-specific mutations in human KIF3B-related genes using the functionally impaired exome sequence GeneBook database (Fromer et al., 2014; Purcell et al, 2014) in rescue assays.
  • this KIF3B mutation was identified by heterozygosity in only 1 of 2000 SCZ patients, but not in 2000 normal controls. This mutation was present in only 1 of 119,956 controls unscreened from the Exac database and not in any of the approximately 3000 controls unscreened from the Tommo database. It appears to be very rare, suggesting that this mutation may affect the etiology in some of the SCZ patient population.
  • KIF3B-EYFP transfection significantly increased the number of spines along the 40 ⁇ m dendrites compared to Empty-EYFP transfection in both genotypes.
  • the KIF3Bmut-EYFP expression vector with the Arg654Ter nonsense mutation did not rescue the total spine count of Kif3b +/- neurons and further reduced the total spine count of Kif3b +/+ neurons (Fig. 7B).
  • stubby spines which are mostly functionally mature, were significantly reduced by KIF3B deficiency. It was rescued again by KIF3B-EYFP, but not by KIF3Bmut-EYFP.
  • NR2A was examined using an immunofluorescence microscope (FIGS. 7C and D).
  • the density and size of NR2A-positive clusters along the 40 ⁇ m dendrites were significantly reduced in KIF3B-deficient neurons. This phenotype was rescued by KIF3B-EYFP expression, but not by Empty-EYFP or KIF3Bmut-EYFP expression (Fig. 7D).
  • KIF17 The loss of function of KIF17 impairs the transport of NR2B, but not the transport of NR2A, suggesting that another molecular motor may be transporting NR2A.
  • KIF3B forms a multimolecular complex with NR2A, APC, and PSD95 (Fig. 1).
  • NR2A transport changes (Fig. 2).
  • KIF3B deficiency also alters NR2B turnover, similar to KIF17 knockout accelerated degradation of NR2A (Fig. 3).
  • the decay of NR2B was significantly promoted in the Kif3b +/- dendrites (Fig. 3J).
  • KIF3B forms a heterotrimer with KIF3A and KAP3.
  • KAP3 interacts with APC via armadillo repeats, and APC has been reported to be a binding partner for the PSD95-NR2A complex.
  • the data in this example suggest that this protein complex is the basis for the transport of NR2A by the KIF3B motor along the dendrite microtubules (Fig. 7E).
  • KIF3B has a nonsense mutation (p.Arg654Ter).
  • Functional defects in this KIF3B mutant protein were revealed by rescue assays for spine number and morphology (FIGS. 7A and B) and surface NR2A expression (FIGS. 7C and D), and experiments with this mutation as the cause of human SCZ pathogenesis. Provide proof.
  • Kif3b +/- remained questions regarding the cause of the SCZ-like phenotype in the molecular pathogenesis Kif3b +/- mice in the mouse brain. This is one of the first studies to show that Kif3b haploinsufficiency results in defective transport of NR2A to the postsynaptic membrane (FIGS. 2B-D and 3A-D).
  • One prominent feature of the molecular pathology of Kif3b +/- neurons is decreased synaptic NR2A levels, which may contribute to decreased NMDAR response and dysregulation of synaptic plasticity and NMDA receptor-dependent forms of LTP and LTD. Has been done.
  • LTP levels were found to be up-regulated and LTD levels were found to be down-regulated (FIGS. 4D-F). Changes in this species of LTP and LTD in hippocampal CA1 have been reported in many other animal models of SCZ.
  • LTP induced by high-frequency stimulation is up-regulated in the brains of Shank2 ⁇ ex7 mutant mice.
  • Infrequent stimulation-induced LTD is down-regulated in Mecp2 knockout mice and Tsc2 +/- rats.
  • DHPG-induced LTD has also been shown to be down-regulated in Tsc2 +/- mice. This dysregulation of synaptic plasticity should represent the pathophysiological basis of the schizophrenic behavioral phenotype in these SCZ model animals.
  • the second feature of Kif3b +/- mice was a change in the function of the APC complex, with decreased APC levels and increased ⁇ -catenin levels in the Kif3b +/- mouse brain (FIGS. 2A, E, F).
  • the APC / ⁇ -catenin complex is an essential regulator of the Wnt signaling pathway and is important for the formation of neuronal circuits.
  • Wnt signaling pathway Recently, the relationship between Wnt signaling pathway and SCZ has been clarified.
  • Previous studies have shown that stabilization of cortical ⁇ -catenin, which enhances standard Wnt signaling, leads to increased cycling of neural progenitor cells and brain overgrowth through the production of postmitotic neurons. ing.
  • this example provides a new crosstalk mechanism between NR2A and Wnt signaling via KIF3-mediated transport that may have a secondary effect on SCZ pathogenesis.
  • the inventor's research proposes a new mechanism of SCZ onset due to KIF3 dysfunction via genetic variation (Table 1) or other factors such as epigenetic mechanism or post-translational modification, and its molecular mechanism. It was highly possible that NR2A transport deficiency was involved. It is very surprising to clarify how the cargo transport activity of kinesin superfamily protein molecular motors regulates higher brain function and its pathology, and this example is a good way to approach this question. Provides an exciting framework.
  • Example 2 Improvement of schizophrenia-like phenotype by compensating for CRMP2 transport based on KIF3
  • Lifeact-mRuby mice (Riedl et al., 2010) were provided by Michael Sixt and Roland Wedlich-Soldner (Max Planck Institute for Biochemistry, Germany) and crossed with the Kif3b +/- strain.
  • CE-2 pellets supplemented with 0.2% (w / w) betaine (Wako) were specifically prepared for administration of a high betaine diet (HBD) (CLEA Japan) and freely fed to post-weaned mice at 4 weeks of age. Feeded (FIGS. 8A and 8B).
  • GAPDH protein levels were quantified according to a slightly modified manufacturer's protocol by sandwich ELISA using anti-GAPDH monoclonal antibody (Abnova) and anti-GAPDH monoclonal antibody HRP-DirecT and used as a normalized control.
  • Plasma and Behavioral Analysis To measure plasma betaine concentration, whole blood was collected from heparin-anesthetized mice at 8-10 am and the presence of 1.0 mg / ml EDTA-2Na (1000 x g, 20 minutes, 4 ° C). Plasma was separated by centrifugation underneath and subjected to LC / MS measurements as previously reported (Onishi et al., 2019). For behavioral analysis, 10-week-old male mice were used, and the following tests were carried out as described in Example 1 and previously reported (Morikawa et al. (2016), supra). The mouse was placed in the center of a new rectangular box (52 x 39 cm) for open field testing.
  • the traces were videotaped for 10 minutes and quantified with EthoVision XT 11.0 software (Noldus Information Technology).
  • EthoVision XT 11.0 software Noldus Information Technology
  • the mouse was placed in the center of a new crossing box with two open arms and two closed arms (27 x 6 cm) extending from the central platform (6 x 6 cm) for 5 minutes. Recorded on videotape. Traces were manually quantified for the number of breaks into the open arm and the length of time it stayed there.
  • two male strange mice of the same genotype were placed in the center of a new rectangular box (30 x 16.5 cm).
  • the traces were videotaped for 10 minutes and quantified by Icy software (de Chaumont, F.
  • mice were placed in the central zone and 10 minute traces were quantified with EthoVision XT 11.0 software.
  • ASR auditory startle response
  • PPI prepulse inhibition
  • a coronal cut with a thickness of 100 ⁇ m between 1.10 mm and 1.30 mm of rostral-caudal bregma corresponding to the prefrontal area was performed, and 40 ⁇ / 0.75 PlanApochromat ( Photographed with a DM 3000 microscope (Leica) using a Leica objective lens or a BZ-X700 microscope (Keyence) using a 20 ⁇ / 0.75 PlanApochromat (Keyence) objective lens.
  • hippocampal neurons The primary culture of hippocampal neurons was basically prepared as previously reported (eg, Ichinose, S. et al., Neuron 87, 1022-1035 (2015)). E17.5 cultured hippocampal neurons in 0.3 ml of MEM (Gibco) supplemented with 10% horse serum, 1 mM pyruvate, 0.6% glucose, and 2 mM GlutaMAX (Gibco) at a density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well polyethyleneimine And poly-L-lysine pre-coated on 8-well chamber cover glass (Nunc) in a 5% CO 2 atmosphere.
  • Anti-KIF3A monoclonal antibody (1: 500, BD Transduction Laboratories, # 611508, RRID: AB_398968), anti-MAP2 polyclonal antibody (1: 200, Abcam, RRID: AB_2138153), anti-Prox1 monoclonal antibody (1: 2,000, Millipore, MAB5654, RRID: AB_2170714), anti-CRMP2 monoclonal (1: 50,000, Abcam, ab129082, RRID: AB_11154701), anti- ⁇ -actin monoclonal antibody (1: 2,500, Sigma-Aldrich, AC15-A5441, RRID: AB_476744), anti-CML monoclonal antibody (1: 200, Trans Genic, KH001, RRID: AB_1964188), Anti-GAPDH monoclonal antibody for immunobrotting (1: 2500-10,000, Wako, 5A12, RRID: AB_2814991), Alexa-488 binding anti-
  • CRMP2-ECFP and KIF3B-TagRFP Mammalian Expression Vectors To obtain plasmids, each full-length mouse cDNA was ligated into pECFP-C1 (Clontech) and pTagRFP-N1 (Evrogen) vectors and endotoxin-free. Prepared using the plasmid DNA purification kit (MACHEREY-NAGEL) of.
  • a CRMP2-pET-21b vector was constructed as previously described (Toyoshima et al. (2019) supra).
  • mouse Kif3a amino acids 369-701, amino acids 600-701
  • Kif3b amino acids 470-747, amino acids 592-747
  • cDNA fragments were amplified by PCR, respectively, and used as baits in the pGBKT7 vector (Takara Bio). Ligation was performed, and the CRMP2 (amino acids 1-249, amino acids 312-572) cDNA fragments were amplified by the PCR method and ligated to the pGADT7 vector (Takara Bio) as a play.
  • Neon buffer 25 mM Hepes (pH 7.4), 2 mM EGTA, 5 mM MgCl 2 , 250 mM trehalose, 2 mM glutathione, 5 mM potassium phosphate, 2 mM ATP, 1% DMSO.
  • Neon buffer 25 mM Hepes (pH 7.4), 2 mM EGTA, 5 mM MgCl 2 , 250 mM trehalose, 2 mM glutathione, 5 mM potassium phosphate, 2 mM ATP, 1% DMSO.
  • Immunofluorescence Microscopy was basically performed as previously reported (Ichinose et al. (2015), supra). DIV1-3 primary hippocampal neurons were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) / phosphate buffered saline (PBS) for 20 minutes at room temperature (RT) and in 0.1% Triton X-100 for 2 minutes (for MAP2). Or after permeabilization for 3 minutes (for actin, CRMP2 and quadruple staining), 4% skim milk / PBS (for MAP2) or 1% bovine serum albumin (for BSA; Roche) / PBS (actin, CRMP2 and 4).
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS phosphate buffered saline
  • Live Imaging of Lamelipodia in Neurons For live imaging of cell membranes, cultured hippocampal neurons were loaded with 50 nM calcein AM (DOJINDO) at 37 ° C. and 5% CO 2 for 30 minutes, washed twice in medium and followed every 10 seconds for 10 minutes.
  • Lifeact-mRuby-expressing neurons were optionally transduced with adenovirus encoding EB1-YFP (Nakata, T., and Hirokawa, N., Cell Biology 162, 1045-1055). (2003)), followed every 10 seconds for 10 minutes. Images were obtained with an LSM780 confocal laser scanning microscope equipped with an Airyscan detector and a 63 ⁇ / 1.4 PlanApocramat objective (ZEISS).
  • Proximity ligation assay For the proximity ligation assay, hippocampal cultures at DIV1 were treated overnight at 4 ° C. as dual immunocytochemistry with mouse and rabbit primary antibodies. They were basically treated with the Duolink in situ PLA kit (Sigma) according to the manufacturer's protocol and observed with an LSM780 confocal laser scanning microscope equipped with an Airyscan detector and a 63 ⁇ / 1.4 PlanApochromat objective (ZEISS).
  • Measurement of lamellipodia dynamics The vertical displacement of the lame podia at a single position was manually measured every 10 seconds for 10 minutes, and the mean square was graphed. In addition, the average displacement of 10 seconds in each direction was calculated.
  • EB1 infiltration rate Live imaging of Lifeact-mRuby and EB1-YFP co-expressing hippocampal neurons was performed every 10 seconds for 10 minutes. All images were stacked and measured using ImageJ software (NIH) for the relative EB1 occupied area relative to the 3 ⁇ m wide area around each from the Lamelipodia edge.
  • NASH ImageJ software
  • Biochemical yeast two-hybrid binding assay As previously reported, yeast two-hybrid was performed using Gal4 Two-Hybrid system 3 (Takara Bio) (Takeda et al. (2000), supra). After transfecting both vectors into the Y187 strain, cells were grown on a color selection plate.
  • IP Immunoprecipitation
  • Immunoblotting To sample cultured neuronal lysates, DIV1 cortical neurons were treated, ground at 10% TCA, and centrifuged at 4 ° C. for 30 minutes at 15,000 rpm. Then, it was eluted with a sample buffer and boiled at 98 ° C. for 5 minutes. Electrophoresis was performed on a 10% or 7.5% polyacrylamide gel with a constant current of 20 mA. Gels were transferred to Immobilon-P membranes (Merck Millipore) using a semi-dry blotter for 30 minutes at a constant current of 200 mA. Membranes were blocked with 1% BSA in TBS-T and incubated with the appropriate primary antibody in Can Get Signal Solution 1 for 1 hour at RT.
  • HiRes-SEC Assay The HiRes-SEC assay was performed as previously reported in the AKTA Pure System (GE Healthcare) using a tandem column consisting of two Superdex 200 Increase 10/300 columns (GE Healthcare) (eg, Ogawa, T., and Hirokawa, N., Biophysical reviews 10, 299-306 (2018)).
  • the mouse brain lysate S3 fraction was loaded onto a column containing assay buffer [20 mM PIPES pH 6.5, 200 mM KCl, 1 mM MgCl 2].
  • the eluted fraction was analyzed by dot blotting. Dots were made on the polyvinyl fluoride membrane and dried at RT.
  • Membranes were then blocked at RT with 4% skim milk in TBS-T for 30 minutes and incubated overnight at 4 ° C with anti-CRMP2 antibody in 4% skim milk in TBS-T. Washed 3 times, incubated with suitable secondary antibody in 4% skim milk in TBS-T for 1 hour at RT and washed again.
  • the signal was visualized by chemiluminescence according to the manufacturer's protocol. The intensity of each dot signal was quantified by ImageJ software.
  • Actin binding assay Turbidity assay Actin was extracted from porcine myocardial acetone powder, purified as previously reported (Pardee, JD, and Spudich, JA, Cell Biology 24, 271-289 (1982)) and desalted using the AKTA Pure System. Unmodified CRMP2 and AGE-modified CRMP2 proteins were prepared as previously reported (Toyoshima et al. (2019), supra). 20 ⁇ M G-actin was mixed with 0, 10, 20, 40 ⁇ M CRMP2 or AGE-CRMP2 in G-buffer [2 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM CaCl 2, 0.2 mM ATP, 1 mM DTT].
  • the actin-CRMP2 coprecipitation assay was performed basically in the same manner as previously reported (Mische, SM et al., Journal of Cell Biology 105, 2837-2845 (1987)). G-actin was polymerized at 37 ° C. for 1.5 hours by the addition of 1/10 volume of F-buffer containing 0.2 mM ATP and 1 mM DTT. 5 ⁇ M F-actin was incubated with the indicated concentrations of unmodified or AGE modified CRMP2 protein in buffer consisting of 20 mM Hepes pH 7.25, 110 mM KCl, 2 mM MgCl 2, and 10 mM imidazole pH 7.0 for 30 minutes at 27 ° C.
  • Kif3b +/- mice reduced nasal-to-nasal interaction time with strange mice of the same genotype, which was significantly restored by HBD feeding (FIGS. 8C and E).
  • Kif3b +/- mice had a shorter residual duration in an unknown mouse chamber than Kif3b +/+ mice and were significantly recovered by HBD feeding (FIGS. 8D and F).
  • the degree of ASR did not change (Fig. 8G), but the PPI of Kif3b +/- mice was significantly impaired and recovered by HBD feeding (Fig. 8H).
  • Kif3b +/- mouse anxiety-like behavior in open field trials and hyperactivity in elevated cross maze trials tend not to be restored or even enhanced by HBD feeding, especially Kif3b. +/- It was suggested that at least the central behavioral phenotype of SCZ could be reduced in mouse sociality and PPI.
  • Betain improves neurite hyperbranched phenotype of Kif3b +/- neurons As a cytobiological basis for these behavioral improvements in the coronary cross section of the prefrontal cortex (FIGS. 9A) and in primary hippocampal cultures (FIGS. 9B-D) The degree of neurite branching of pyramidal neurons was examined. A typical hyperneurite phenotype similar to SCZ or other mouse models of autism was detected. Branch levels were quantified using the Sholl analysis (Sholl, DA, Journal of Anatomy 87, 387-406 (1953)), which described the number of branch points as a function of distance from the cell body. Therefore, 11-week-old Kif3b +/- mice with pyramidal neurons in the prefrontal cortex 4-5 layers (FIGS. 9A and E) and stage 2-3 DIV3 cultured Kif3b +/- hippocampal neurons (FIGS. 9B and F). ), A significant increase in branching was detected in the vicinity of 5 to 20 ⁇ m from the cell body.
  • GLO1 zinc metal enzyme glyoxalase 1
  • Betaine restores proper kinetics of lamellipodia in Kif3b +/- neurons Significantly reduced lamellipodia kinetics during early development of cultured hippocampal neurons in stages 1-2 of DIV1 as the most upstream phenomenon to neurite hyperbranching was detected.
  • the cell membrane was labeled with calcein-AM and observed by time-lapse imaging (Fig. 10A).
  • the width of the drift at the lamellipodia end of the Kif3b +/- neuron is from the Kif3b +/+ neuron, as represented by the camera lucida in three continuous planes (Fig. 10B) or the mean square displacement analysis of lamellipodia dynamics (Fig. 10C). Also tended to be small. This drift was partially but significantly recovered by betaine treatment in Kif3b +/- neurons, of which the mean displacement in both directions increased significantly (Fig. 10D).
  • stage 1-2 live hippocampal neurons F-actin with Lifeact-mRuby transgene Fluorescently labeled (FIGS. 11A-E).
  • Kif3b +/+ neurons and Kif3b +/- neurons were compared using a time-lapse microscope every 10 seconds with or without 500 ⁇ M betaine administration (FIGS. 11A and 11B).
  • actin bundles often undergo a rotational folding motion (arrow in FIG. 11A), accompanied by local regression of the lamellipodia end, which then re-elongates shortly after regression.
  • KIF3-mediated actin bundle formation was considered essential to prevent the dynamics of lamellipodia against microtubule invasion into the P domain, and thus the stabilization of excess lamellipodia against neurite overbranching.
  • Betaine treatment compensated for the KIF3 deficiency for this actin bundling, so the molecular mechanism was then investigated by identifying the cargo associated with the KIF3 motor.
  • the primary carbonylation target CRMP2 is a novel KIF3 cargo
  • CRMP2 is one of the major targets for carbonyl stress in human SCZ iPS cells (Toyoshima et al. (2019) supra)
  • CRMP2 acts to regulate the cytoskeleton.
  • Fukata, Y. et al., Nat Cell Biol 4, 583-591 (2002) we sought to examine the physical relationship between the KIF3 motor and the CRMP2.
  • yeast two-hybrid analysis was performed to examine the ability of direct interaction between truncated mutants of KIF3A, KIF3B, and CRMP2 (FIGS. 12B and C).
  • the tail domain of KIF3A amino acids 600-701
  • CRMP2 amino acids 312-572; FIG. 12C.
  • the inventor performed quadruple semi-super-resolution immunocytochemistry of stage 1-2 Kif3b +/+ cultured hippocampal neurons to investigate colocalization of KIF3, CRMP2, F-actin, and microtubules. It provides a specific signal as compared to a negative control (FIG. 12G) (FIGS. 12D-F).
  • KIF3A and CRMP2 co-localized with each other in both the P-domain and C-domain, but their relationship to the cytoskeletal system was pleiomorphic. In the P domain, their co-localization points were associated with the actin cytoskeleton, suggesting that KIF3 plays some direct role in the function of lamellipodia CRMP2 (Fig. 12E, white arrow). ).
  • KIF3 performed immunofluorescence microscopy of stage 1-2 cultured hippocampal neurons to determine peripheral CRMP2 levels that maintain lamellipodia CRMP2 levels against neurite hyperbranching.
  • CRMP2 tended to accumulate in the outermost region of the Kif3b +/+ neuron lamélipodia.
  • the density of CRMP2 in this most peripheral 1 ⁇ m region of the lamellipodia of Kif3b +/- neurons was significantly lower than that of Kif3b +/+ neurons (FIGS. 12I and K). Therefore, a proximity ligation assay was performed to evaluate the level of interaction between lamélipodia actin and CRMP2, which was counter-stained against F-actin.
  • KIF3 deficiency was evaluated.
  • Kif3b +/- neurons have lower CML-modified protein levels than Kif3b +/+ neurons, either due to an unexplained compensatory mechanism or reduced expression of the CRMP2 protein, the main target of carbonylation.
  • This reduction suggested that KIF3B deficiency and carbonyl stress were likely independent of impaired CRMP2 function in lamellipodia.
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • CRMP2 protein above a certain local concentration can induce F-actin bundling, but not F-actin polymerization, and the F-actin bundling activity of CRMP2 is highly sensitive to carbonylation. It has been suggested.
  • CRMP2 is the major effector cargo of KIF3 that prevents neurite hyperbranching in schizophrenia (Fig. 12).
  • the direct interaction between the KIF3 motor and CRMP2 is supported (FIGS. 12A-C), and KIF3B deficiency results in a significant reduction in pericellular CRMP2 (FIGS. 12I and K).
  • CRMP2 knockdown neurons copied the neurite overbranch phenotype as a phenotype (FIGS. 12M and O), and CRMP2 overexpression partially eliminated the neurite overbranch phenotype of Kif3b +/- neurons. (FIGS. 12N and P).
  • CRMP2 is one of the major targets for dysfunctional multimerization of carbonylation (Toyoshima et al. (2019) supra).
  • CRMP2 and hypercarbonylated human GLO1 -/- neurons Mouse hippocampal neurons deficient in iPS cells consistently resulted in hyperbranching of neurites (FIGS. 9I and J; and FIGS. 12M and O).
  • Betaine was able to reduce the carbonylation capacity of cells by acting as a substrate for homocysteine through the betaine-homocysteine methyltransferase (BHMT) reaction.
  • Betaine has other proposed functions (eg, because the previously established anti-carbonylation reagent pyridoxamine can be replaced by betaine due to its ability to rescue Kif3b +/- neuronal morphology (FIGS. 9C and G). , Knight, LS et al., Neurochemical research 42, 3490-3503 (2017)), but could act primarily as an anti-carbonylation reagent in this scheme. Since betaine has long been used as a supplement for homocystinuria, the procedure for drug relocation in SCZ patients is expected to be relatively well available and is suitable to supplement the adverse effects of pyridoxamine. There will be.
  • the data of this example are genetically and cytobiologically based on the intracellular transport of CRMP2 by the [1] KIF3 molecular motor complex in the CRMP2-related neuroprotective molecular pathway for schizophrenia SCZ pathogenesis.
  • [2] We supported a new synergistic relationship with decarbonylation of CRMP2 by carbonyl stress scavengers.
  • High betaine diet (HBD) feeding to Kif3b +/- mice significantly abolished their schizophrenic behavior and neuronal morphological changes (FIGS. 8 and 9), so betaine-induced CRMP2 activity against KIF3-mediated CRMP2 transport deficiency.
  • This functional cost of is a good candidate for a general and basic platform for analyzing the effects of betaine-mediated SCZ therapeutics.
  • SEQ ID NO: 5-9 Artificial sequence (synthetic oligonucleotide)

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Abstract

本発明は、精神疾患の治療又は予防のための組成物及び方法、並びに精神疾患の治療薬若しくは治療方法のスクリーニング及びその有効性評価方法に関する。具体的には、本発明は、KIF3モーターに基づく精神疾患の治療又は予防、並びに薬物スクリーニングに関する。

Description

ＫＩＦ３モーターに基づく精神疾患の治療又は予防、及び薬物スクリーニング
　本出願は、2019年11月19日出願の米国特許仮出願62/937,396号の優先権を主張するものであり、その開示内容を参照により本明細書に援用する。
　本発明は、精神疾患の治療又は予防のための組成物及び方法、並びに精神疾患の治療薬若しくは治療方法のスクリーニング及びその有効性評価方法に関する。具体的には、本発明は、KIF3モーターに基づく精神疾患の治療又は予防、並びに薬物スクリーニングに関する。
　統合失調症（Schizophrenia, SCZ）は最も一般的な精神疾患の1つであり、様々な遺伝因子と密接に関連している。全ゲノム研究により検出されたSCZ関連遺伝子は、シナプス形成、シナプス伝達、シナプス可塑性に関連する分子をコードしており、シナプス機能の調節異常がSCZの表現型の基礎となっていることが示唆されている（非特許文献１）。例えば、ニューロンの可塑性とシナプス形成にきわめて重要であるN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）について、その発現の減少がSCZ様表現型を引き起こすことが知られている（非特許文献２）。
　キネシンスーパーファミリー（KIF）タンパク質のメンバーであるKIF3Bは、KIF3Aとヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体はキネシンスーパーファミリー関連タンパク質3（KAP3）に結合して、ヘテロ三量体（KIF3A/KIF3B/KAP3）複合体（KIF3複合体）を形成している。KIF3複合体の機能喪失は、胎齢7.5日（d.p.c）のマウス胚における左右軸の決定（例えば、非特許文献３）及び胚における脳腫瘍の発生（非特許文献４）をもたらす。しかし、その機能や、ニューロンに豊富に発現しているにもかかわらず、ニューロンの軸索や樹状突起で輸送されるカーゴについてはほとんど知られていない。これまでに、APC（adenomatous polyposis coli）がKIF3B複合体の結合パートナーであることが報告されており、神経回路の発達に必須であることがわかっている（例えば、非特許文献５）。
　神経突起分枝の神経発生プロセスは、in vitroで適切な形態学的発生を受けるげっ歯類の海馬ニューロン分散培養で連続的に追跡することができる。in vitroでの日数（DIV）1のステージ1では、非常に動的なラメリポディアが形成され、F-アクチン束によって支持されている。微小管に富む中心ドメイン（C-ドメイン）とより周辺のアクチンに富むドメイン（P-ドメイン）は、互いに動的に共調節して、適切な神経形態形成に必須であるラメリポディアの形態と機能を支持している（例えば、非特許文献６）。このように、ラメリポディア動態の調節機構の解明は、統合失調症の神経突起過剰分枝に対する新しい治療法の開発に有効であると考えられる。
　一方、細胞骨格コーディネーターであるCRMP2の機能がその残基のカルボニル化により障害され、CRMP2の多量体化終末糖化産物（AGEs）が生成されることが報告されている（例えば、非特許文献７）。カルボニルストレスに至る酸化ストレスの上昇はSCZの病因であると提唱されていることから、このAGE-CRMP2の解析によりSCZの病因経路を解明できると期待される。
　また、ベタインは抗カルボニルストレス代謝産物であり、血漿及び脳の発現レベルはSCZ患者でダウンレギュレートされる傾向がある（非特許文献８）。ベタインの経口投与は、精神病薬治療によって作出されたSCZモデル、あるいはChdh遺伝子破壊によるベタイン欠損によって生じた行動表現型を改善することができた（非特許文献８）。しかし、カルボニルストレス上昇はSCZ発症を単に導くことはできないため、他の遺伝的又はエピジェネティックな欠陥との相乗作用の解明は、SCZ発症の分子機構を理解するための鍵となると考えられる。
Lee J, Green MF, Trends Neurosci 39: 587-596 (2016) Dean B, et al., Synapse 32: 67-69 (1999) Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998) Teng J, et al., Nat Cell Biol 7: 474-482 (2005) Senda T, et al., Anat Sci Int 80: 121-131 (2005) Cammarata, G.M., et al., Cytoskeleton 73, 461-476 (2016) Toyoshima, M. et al., Life science alliance 2, e201900478 (2019) Ohnishi, T. et al., Ebiomedicine 45, 432-446 (2019)
　統合失調症（SCZ）は、その発症メカニズムの全容が解明されていないため、その根本的な治療法は確立されていない。現状では、抗精神病薬による薬物対症療法と、心理社会療法により症状の緩和が行われている。しかしながら、一旦SCZを発症すると慢性的な経過をとり、患者のクオリティオブライフは著しく低下するため、根本的な治療法の開発が望まれている。
　そこで本発明は、SCZに関係する分子メカニズムを明らかにし、SCZのための治療又は予防手段、及びSCZの治療又は予防手段をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
発明を解決するための手段
　本発明者は、KIF3モーターのサブユニットKIF3Bが、海馬ニューロンにおいて、ニューロンの可塑性とシナプス形成に重要なN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）のサブユニット2A（NR2A）とAPC（adenomatous polyposis coli）複合体を同時に含む小胞を輸送することを示唆する証拠を得、また脳内の正常なKIF3Bレベルの減弱がニューロンの構造及び機能の重大な変化をもたらし、この変化した構造及び機能は統合失調症（SCZ）に特徴的な表現型、例えば行動の欠陥をもたらすという知見を得た。また本発明者は、Kif3b+/-マウスをSCZモデルとして用いて、ベタインがニューロン形態形成と社会的行動におけるSCZ様表現型を有意に改善でき、ベタイン投与がコラプシン反応媒介タンパク質2（CRMP2）のカルボニル化を有意に減少させ、ラメリポディアの適正な動態と周辺部微小管排除に必要なF-アクチン束化活性を増強し、したがってKIF3欠損を機能的に代償する可能性があるという知見も得た。上記の知見に基づき、KIF3モーターの存在量又は活性を増強することによって統合失調症を含む精神疾患を治療又は予防し得、また機能的なKIF3モーターを欠損する動物又は細胞を使用することにより統合失調症を含む精神疾患の治療又は予防手段をスクリーニングし得るという結論に至り、本発明を完成するに至った。
　本発明は、例えば以下を包含する：
［１］以下の（a）～（d）の少なくとも1つを含むことを特徴とする精神疾患の治療又は予防のための組成物。
（a）キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの少なくとも1つのサブユニット若しくはその機能的変異体、
（b）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片、
（c）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター、
（d）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞
［２］前記KIF3モーターが、KIF3A、KIF3B、及びKAP3からなる群より選択される少なくとも1つのサブユニットを含む、［１］に記載の組成物。
［３］前記KIF3モーターが、少なくともKIF3Bを含む、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記KIF3モーターがヒト又はマウス由来である、［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］前記精神疾患が、統合失調症、気分障害、不安障害、及び発達障害からなる群より選択される少なくとも1種の精神疾患である、［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］前記組成物が、医薬組成物、機能性食品、健康補助食品、又はサプリメントである、［１］～［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］脳における機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物の精神疾患モデル動物としての使用。
［８］前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする遺伝子のヘテロ接合ノックアウトによるものである、［７］に記載の使用。
［９］前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、機能的なKIF3Bの発現の低減又は阻害によるものである、［７］又は［８］に記載の使用。
［１０］前記非ヒト哺乳動物が、対応する野生型哺乳動物に比較して、以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つを示す、［７］～［９］のいずれかに記載の使用。
（i）社会性の低下、
（ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
（iii）プレパルス抑制の低下、
（iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下
［１１］前記非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、［７］～［１０］のいずれかに記載の使用。
［１２］前記非ヒト哺乳動物がマウスである、［７］～［１１］のいずれかに記載の使用。
［１３］精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
（a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を被験因子で処理するステップ、
（b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
を含む方法。
［１４］前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、機能的なKIF3Bの発現の低減又は阻害によるものである、［１３］に記載の方法。
［１５］前記神経細胞におけるNMDA受容体のサブユニットNR2Aの輸送活性、及び／あるいは前記神経細胞における前記KIF3タンパク質の量若しくは活性又は前記KIF3をコードする遺伝子の発現量が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、［１３］又は［１４］に記載の方法。
［１６］（i）前記神経細胞における樹状突起の過剰分枝が、非処理対照細胞と比較して減少している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
（ii）前記神経細胞におけるスパイン数が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
（iii）前記神経細胞におけるラメリポディアの動態が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
（iv）前記神経細胞におけるラメリポディア内のアクチン束の密度及び／又は動態が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
（v）前記神経細胞におけるラメリポディア内への微小管侵入頻度が、非処理対照細胞と比較して減少している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、
［１３］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
（c）［７］～［１２］のいずれかに記載されている非ヒト哺乳動物を被験因子で処置するステップ、
（d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
を含む方法。
［１８］［１３］に記載の方法のステップ（a）及び（b）を行った後に、ステップ（c）及び（d）を行う、［１７］に記載の方法。
［１９］前記非ヒト哺乳動物が、非処置対照動物又は野生型動物と比較して以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つの改善を示す場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、［１７］又は［１８］に記載の方法。
（i）社会性の低下、
（ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
（iii）プレパルス抑制の低下、
（iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下
［２０］前記被験因子がカルボニル化抑制活性を有するか否かを評価するステップをさらに含む、［１３］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記被験因子が、CRMP2タンパク質の量若しくは活性を増大させるか否か、及び／又はCRMP2タンパク質のカルボニル化を抑制する活性を有するか否かを評価するステップをさらに含む、［１３］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性を評価する方法であって、
（a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を前記薬物又は方法で処理するステップ、
（b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
を含む、並びに／あるいは
（c）［７］～［１２］のいずれかに記載されている非ヒト哺乳動物を前記薬物又は方法で処置するステップ、
（d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
を含む方法。
［２３］前記精神疾患が、統合失調症、気分障害、不安障害、及び発達障害からなる群より選択される少なくとも1種の精神疾患である、［１３］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］精神疾患の治療又は予防に使用するための、以下の（a）～（d）の少なくとも1つを含む組成物。
（a）キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの少なくとも1つのサブユニット若しくはその機能的変異体、
（b）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片、
（c）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター、
（d）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞
［２５］対象における精神疾患の治療又は予防方法であって、その必要がある対象に、以下の（a）～（d）の少なくとも1つを含む組成物の有効量を投与することを含む方法。
（a）キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの少なくとも1つのサブユニット若しくはその機能的変異体、
（b）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片、
（c）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター、
（d）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞
　本発明により、統合失調症などの精神疾患を効果的に治療又は予防するための組成物及び方法が提供される。また本発明に係るスクリーニング方法及び疾患モデルによって、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法を簡便かつ効率的に選択・同定することが可能となる。よって、本発明は、精神疾患に関する医療、薬物開発、基礎研究などの分野に有用である。
図１Ａ～Ｉは、KIF3BがNR2A複合体に結合することを示す図である。図１Ａ～Ｃは、抗KIF3B抗体（Ａ）を用いたマウス全脳抽出物の共免疫沈降（IP）、並びに抗NR2A抗体（Ｂ）及び抗APC抗体（Ｃ）を用いたそれらの小胞の共IPを示す。対照として正常ウサギIgG（NRG）を用いた。示された抗体に対するイムノブロッティング（IB）。n = 4。 図１Ｄ～Ｉは、免疫蛍光顕微鏡法の結果を示す。海馬ニューロンのPSD95陽性スパインにおけるKIF3B、APC、及びNR2A（Ｄ及びＥ）又はNR2B（Ｆ及びＧ）の細胞内共局在を陰性対照（Ｈ）及び統計（Ｉ）とともに示す。矢印：共局在化の位置。ＤとＦの四角は、それぞれＥとＧの拡大領域である。スケールバー2μm。 図１Ｄ－Ｅの続きである。 図１Ｄ－Ｅの続きである。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 10。***p < 0.001；スチューデントのt検定。 図２Ａ～Ｇは、Kif3b+/-海馬ニューロンにおけるNR2A、NR2B及びAPCの発現低下を示す。図２Ａは、示された抗体を用いて行ったKif3b+/+マウス及びKif3b+/-マウスの成体マウス溶解物のイムノブロッティングを、統計とともに示す。Kif3b+/-脳内のタンパク質量は、Kif3b+/+脳内のタンパク質量で正規化し、対照の％として表される。可塑性関連タンパク質（NR2A、NR2B、PSD95）とKIF3関連タンパク質（APC）の発現レベルは減少したが、β-カテニンの発現レベルは増加したことに注目されたい。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 5。NS、p≧0.05； ** p<0.01； *** p<0.001；一元配置分散分析。 図２Ｂは、抗NR2A抗体を用いたKif3b+/+及びKif3b+/-マウス脳冠状断面の海馬CA1先端領域の免疫蛍光組織化学、並びに蛍光強度の統計を示す。スケールバー50μm。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 5。*p＜0.05；対応のあるt検定。 図２Ｃ～Ｇは、DIV16～18における海馬ニューロンの遠位樹状突起の代表的顕微鏡写真で、表面NR2A（Ｃ）、表面NR2B（Ｄ）、細胞質APC（Ｅ）に対して免疫染色し、正常なウサギ及びマウスIgG（それぞれＦ中のNRG及びNMG）を用いた陰性対照とともに、また表面NR2A及びNR2B陽性クラスタの密度及びサイズ、並びにAPCの蛍光強度についての統計（Ｇ）とともに示す。ニューロンはAPC染色（Ｅ）でのみ透過化された。Kif3b+/-ニューロンでは、Kif3b+/+ニューロンと比較して、NR2AとNR2Bのクラスタの大きさと密度、及びAPC発現レベルが影響を受けたことに注目されたい。矢印：PSD95陽性スパインにおけるシグナル。スケールバー5μm。 図２Ｃ－Ｄの続きである。 図２Ｃ－Ｄの続きである。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 20～21。***p < 0.001；スチューデントのt検定。 図３Ａ～Ｎは、KIF3BはNR2Aを輸送するが、NR2Bは輸送しないことを示す。図３Ａ～Ｆは、カイモグラフ（ＡとＤ）に代表される海馬ニューロンの樹状突起に沿ったNR2A-ECFP（Ａ～Ｃ）とNR2B-ECFP（Ｄ～Ｆ）のタイムラプスイメージングを、小胞の速度（ＢとＥ）と方向性（ＣとＦ）の統計とともに示す。NR2A小胞の輸送はKif3b+/-ニューロンで影響を受けたが、NR2B小胞の輸送は影響を受けなかったことに注目されたい。スケールバー5μm。P：樹状突起の近位；D：遠位領域。矢印は順行性に移動する小胞で、矢尻は非可動性又は拡散性の小胞である。Ｂ及びＥのボックスプロットは、中央値、第1及び第3の四分位を表し、ヒゲは最小値から最大値を表す。n = 18ニューロンからの240～316小胞。NS、P≧0.05；*p <0.05；*** p<0.001；スチューデントのt検定（Ｂ及びＥ）及びカイ二乗検定（Ｃ及びＦ）。 図３Ａ－Ｃの続きである。 図３Ｇ～Ｎは、NR2A-PA-GFP（Ｇ及びＫ）又はNR2B-PA-GFP（Ｉ及びＭ）を発現する海馬ニューロンのタイムラプス蛍光画像を、プロテアソーム阻害剤MG132の非存在下（Ｇ及びＩ）又は存在下（Ｋ及びＭ）、並びに時間0での光活性化後1時間間隔での樹状突起に沿った分解の経時変化を示す統計（Ｈ、Ｊ、Ｌ及びＮ）とともに示す。Kif3b+/-樹状突起におけるNR2B-PA-GFPではなく、NR2A-PA-GFPのこのプロテアソーム分解は、Kif3b+/+樹状突起よりも有意に速い速度で起こったことに注目されたい。顕微鏡写真の橙色の矢印は。光活性化によって刺激された分解クラスタ。統計学の赤色の矢印は光活性化の時点。スケールバー、5μm。エラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 10。***p < 0.001；二元配置分散分析。 図３Ｇ－Ｈの続きである。 図３Ｇ－Ｈの続きである。 図３Ｇ－Ｈの続きである。 図４Ａ～Ｇは、KIF3Bがシナプス可塑性に必須であることを示す。図４Ａ～Ｃは、DIV17における海馬ニューロンのEGFP発現Kif3b+/+及びKif3b+/-樹状突起の蛍光顕微鏡写真（Ａ）、40μm樹状突起あたりの総数及び分類したスパイン数（Ｂ）、並びに棘（spinule）数、頭部の大きさ、頸部の大きさを含む形態学的特徴（Ｃ）を統計とともに示す。Kif3b+/-ニューロンでは、太型スパインとフィロポディアスパインの数が減少し、キノコ型スパインの数が増加したことに注目されたい。スケールバー、10μm。中心と誤差バーは平均±標準誤差を示す。n = 5匹のマウスの18個のニューロンの446～642スパイン。NS、P≧0.05；*p <0.05；** p<0.01；*** p<0.001；スチューデントのt検定。 図４Ａの続きである。 図４Ｄ～Ｇは、Kif3b+/+マウス及びKif3b+/-マウス由来の急性海馬切片におけるシェーファ側枝CA1シナプスの電気生理学的解析を示す。Kif3b+/+及びKif3b+/-切片で記録したNMDARチャネル電流の代表的なトレース（Ｄ）及び電流-電位相関（Ｅ）を用いて、+40mV及び-90mVのEPSCで記録したAMPA電流を上回るシナプスNMDA電流をそれぞれ記録した。電流振幅は+40mV EPSCでの値に正規化した。中心及びエラーバーは、平均±標準誤差を示し、n=6匹のマウス由来の12個の細胞。NS、P≧0.05；*** p<0.001；スチューデントのt検定（Ｄ）と二元配置分散分析（Ｅ）。 図４Ｆ～Ｇは、fEPSP傾斜の経時変化により示されるシナプス可塑性を示し、高頻度刺激によるLTPの誘導（Ｆ）及び低頻度刺激によるLTDの誘導（Ｇ）を伴うものである。エラーバーは平均±標準誤差を示す。n = マウス9匹の9の切片。***p < 0.001；二元配置分散分析。 図５Ａ～Ｊは、Kif3b+/-マウスは統合失調症様行動を示す。図５Ａは、2匹の遭遇したことのない成体雄マウスを用いたソーシャルインタラクション試験の結果を示す。10分間の試験で示された事象（#1～6）の数を手動でカウントした。Kif3b+/-マウスは社会的関心の障害を示した。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 8。NS、P≧0.05；*p <0.05； ** p<0.01；スチューデントのt検定。 図５Ｂは、高架式十字迷路試験の結果を示す。Kif3b+/-マウスは不安の低下と活動の上昇を示したことに注目されたい。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 8。*p < 0.05；**p < 0.01； スチューデントのt検定。 図５Ｃ～Ｄは、同一物体領域に物体、中心、遭遇したことのないマウスによる3チャンバー型社会性試験（Ｃ）の結果を、統計（Ｄ）とともに示す。Kif3b+/-マウスは、見知らぬ場所ではあまり時間を費やさないことに注目されたい。Ｃの黒線は試験の10分間におけるマウスの動きの代表的な痕跡である。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 6。*p < 0.05；**p < 0.01； スチューデントのt検定。 図５Ｅは、新規物体認識試験の結果を示す。Kif3b+/-マウスは、Kif3b+/+マウスと比較して、新規物体への関心が少ないことに注目されたい。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 8。*p < 0.05； ** p < 0.01；スチューデントのt検定。 図５Ｆは、プレパルス抑制（PPI）試験の結果を示す。Kif3b+/-マウスは驚愕反応の抑制が低下した。パルス強度は115dBとした。n = 28。***p < 0.001；二元配置分散分析。 図５Ｇ～Ｊは、両遺伝子型の空間参照記憶を示すバーンズ迷路試験（Ｇ及びＨ）と、学習柔軟性を示す逆バーンズ迷路試験の結果（Ｉ及びＪ）を、マウスの動きの代表的な痕跡（Ｇ及びＩ）と、トレーニングセッション及びプローブトライアル中の退避までの時間及びプライマリエラーの回数に関する統計（Ｈ及びＪ）とともに示す。Kif3b+/-マウスは、空間記憶を獲得するのに長い時間を必要としたが、Kif3b+/+マウスと比較して記憶を維持するのに類似した能力を示したことに注目されたい。ＨとＪの赤枠はＧとＩに示したトライアル痕跡に対応する。エラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 6。*p < 0.05； スチューデントのt検定。 図５Ｇの続きである。 図５Ｇの続きである。 図５Ｇの続きである。 図６Ａ～Ｉは、Kif3b+/-マウス脳の異常組織像を示す。図６Ａ～Ｃは、成体マウス脳冠状切片のヘマトキシリン-エオジン（HE）染色及び示された遺伝子型の海馬CA3領域の拡大画像（Ａ）を、統計（Ｂ及びＣ）とともに示す。左パネルの四角は、右パネルの拡大領域。CC、脳梁；枠は海馬CA領域における放射層。スケールバー100μm。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 5。NS、p≧0.05； *p<0.05； スチューデントのt検定。 図６Ｄ～Ｅは、胎生17日（E17）から老齢（D）までの神経新生期（Neurogenesis）、刈り込み期（Pruning）、神経膠形成期（Gilogenesis）を通してのマウス脳重量の発達プロファイル（Ｄ）と、出生後0日（P0）の脳の代表的な外観（Ｅ）を示す。スケールバー5mm。エラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 5。*p <0.05； スチューデントのt検定。 図６Ｆ～Ｉは、免疫蛍光マージ顕微鏡写真がF-アクチン（赤）とβ3-チューブリン（緑）に対して染色され、培養海馬ニューロン（Ｆ）のDIV1、3、5、6からの軸索成長円錐（GC）の形態と発達に焦点を当てており、統計（Ｇ～Ｉ）とともに示す。Ｉにおける矢印はMTドメインとLEとの間の測定距離。MT：微小管、LE：先導端、NRG：正常ウサギIgG、NMG：正常マウスIgG。スケールバー5μm。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 18。*p < 0.05； ** p < 0.01；スチューデントのt検定。 図６Ｆの続きである。 図７Ａ～Ｆは、KIF3Bの発現がスパイン形態とNR2A表面発現を回復させるが、変異KIF3Bの発現は回復させないことを示す。図７Ａ～Ｂは、DIV16～18での培養海馬ニューロンにおけるEmpty-EYFP、KIF3B-EYFP、又はKIF3Bmut-EYFPベクターを発現するKif3b+/+及びKif3b+/-樹状突起の蛍光顕微鏡写真（Ａ）を、40μm樹状突起あたりの総数及び分類したスパイン数の統計（Ｂ）とともに示す。スケールバー10μm。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 3匹のマウス由来の5～15個のニューロンの98～535個のスパイン。p≧0.05； *p <0.05； *** p<0.001；スチューデントのt検定。 図７Ｃ～Ｄは、Empty-EYFP、KIF3B-EYFP、又はKIF3Bmut-EYFPベクターをトランスフェクトした、DIV16～18での培養海馬ニューロンのKif3b+/+及びKif3b+/-樹状突起に沿った表面NR2Aを示す免疫蛍光顕微鏡写真及びグラフを示す。矢印：PSD95陽性スパインにおけるシグナル。スケールバー5μm。中心及びエラーバーは平均±標準誤差を示す。n = 16～17。NS、p≧0.05； *** p<0.001；スチューデントのt検定。 図７Ｅ～Ｆは、KIF3/KAP3/APC/NR2A複合体におけるSCZ関連ヒトKIF3B変異の模式図（Ｅ）とKIF3B機能障害に関連するSCZ発症機序の作業仮説（Ｆ）を示す。 図８Ａ～Ｈは、Kif3b+/-マウスのSCZ様行動が高ベタイン食により回復することを示す。図８Ａ～Ｂは、マウスモデルに対する高ベタイン食（HBD）投与パラダイムのマウス給餌のスケジュール（Ａ）と、示された遺伝子型及び摂食のマウスの血漿中ベタイン濃度のグラフ（Ｂ）を示す。エラーバー、SEM。Welchのt検定、n=9～12。 図８Ｃ～Ｆは、ソーシャルインタラクション試験を示す。相互性ソーシャルインタラクション試験（Ｃ）と示された条件上の3チャンバーソーシャルインタラクション試験（Ｄ）における追跡経路の代表的画像を、相互性ソーシャルインタラクション試験（Ｅ）における鼻と鼻の接触時間、並びに空、中央、及び見知らぬマウス領域における探索時間に対するそれらの定量化（Ｆ）とともに示す。エラーバー、SEM。*p＜0.05、Welchのt検定、n = 5～17。 図８Ｃ－Ｄの続きである。 図８Ｇ～Ｈは、示した条件での聴覚驚愕反応（ASR）のプレパルス抑制（PPI）試験の結果を示し、驚愕反応（Ｇ）と82dBでのプレパルス抑制（PPI）の程度（Ｈ）の単純定量化で表される。エラーバー、SEM。*p＜0.05、** p<0.01、Welchのt検定、n=20～25。 図９Ａ～Ｊは、Kif3b+/-ニューロンの神経突起過剰分枝表現型はベタイン投与により回復することを示す。図９Ａ～Ｈは、DIV3での示した遺伝子型の11週齢のマウス前頭前皮質の切片のゴルジコックス染色による錐体ニューロン（Ａ）及びMAP2標識培養海馬ニューロンの細胞形態学的分析を、最初の24時間に500μMのベタイン（Ｂ）若しくは500μMのピリドキサミンの投与あり若しくはなし（Ｃ）で、又はTagRFP若しくはKIF3B-TagRFP cDNA発現ベクターの形質導入（Ｄ）を伴って行い、Sholl解析（Ｅ～Ｈ）による定量化とともに示す。スケールバー、10μm。エラーバー、SD。*p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、+/+対+/-；#p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001、+/-対+/-HBD又はベタイン；各間隔でのWelchのt検定、n =3匹のマウスからの90細胞（Ｅ）、n =60（Ｆ及びＨ）、n=24～28（Ｇ）。 図９Ａ－Ｄの続きである。 図９Ｉ～Ｊは、神経誘導GLO1+/+及びGLO1-/-ヒトiPS細胞の位相差画像（Ｉ）と分枝点の数に関する定量化（Ｊ）を示す。スケールバー、10μm。エラーバー、SEM。それぞれ***p＜0.001、Welchのt検定、n = 50。 図１０Ａ～Ｈは、ベタインがKif3b+/-ニューロンのラメリポディウムアクチン束を回復させることを示す。500μMベタインを投与した又は投与しない（Ａ）、DIV1での示した遺伝子型のカルセイン-AM標識初代培養海馬ニューロンのライブ細胞イメージング。80秒間隔で連続3時点のラメリポディア端のカメラルシダ（Ｂ）に代表される、ラメリポディア動態の平均二乗変位分析（Ｃ）、及び10秒間の各方向の正味変位の定量化（Ｄ）。スケールバー、5μm。エラーバー、SEM。*p < 0.05、*** p < 0.001、Welchのt検定、n = 6～7細胞由来の12～14。 図１０Ｅ～Ｈは、（Ａ）と同じ条件セットにおけるDIV1の一次海馬ニューロンのラメリポディアにおけるアクチン細胞骨格の、ファロイジンで標識した後のAiryscan超分解能顕微鏡によるイメージングを、幅1μmのラメリポディアにおけるアクチン束数の定量化（Ｅ及びＦ）、ファロイジンで標識した後の誘導放出抑制（STED）超分解能顕微鏡（Ｇ）、透過後の固定による走査電子顕微鏡（SEM）によるイメージング（Ｈ）とともに示す。スケールバー、5μm（E）及び2μm（F及びG）。エラーバー、SEM。*p＜0.05、*** p<0.001、Welchのt検定、n=19～23。 図１０Ｅ－Ｆの続きである。 図１１Ａ～Ｅは、Kif3b+/-ニューロンラメリポディアの不活性が、樹状突起過剰分枝を導く微小管侵入を誘発することを示す。図１１Ａ～Ｂは、500μMベタインの投与あり又はなしの、DIV1で示された遺伝子型の、左端の欄の低倍率視野の枠付き領域におけるLifeact-mRubyトランスジェニック海馬ニューロンのラメリポディアにおけるF-アクチン動態のタイムラプス記録（Ａ）を、幅と時間の単位あたりのアクチン束折りたたみ数に関するその定量化（Ｂ）とともに示す。矢印は、非処理Kif3b+/-ニューロンではほとんど見られなかったアクチン束の回転折りたたみ運動。スケールバー、5μm。エラーバー、SEM。それぞれ**p＜0.01、Welchのt検定、n = 11。 図１１Ｃ～Ｅは、DIV1における示された遺伝子型のEB1-YFP発現（微小管プラス端、シアンに相当）及びLifeact-mRuby-トランスジェニック（F-アクチン、マゼンタに相当）海馬ニューロンにおけるラメリポディア及びフィロポディアのPドメインにおける微小管侵入の2色タイムラプス記録。タイムラプスシーケンス（Ｃ）、10分間の時間スタック（Ｄ）、及び時間スタックにおけるEB1-YFP占有面積の定量化（Ｅ）で表される。Ｃの点線：EB1-YFPの典型的な点の痕跡（矢印）。Ｄの四角は、Ｃのタイムラプスシーケンスの領域。Ｄの矢印は微小管が侵入したフィロポディア。スケールバー、5μm。エラーバー、SEM。それぞれ*p＜0.05、Welchのt検定、n = 5。P、C、各ドメイン。 図１２Ａ～Ｐは、CRMP2が統合失調症性神経突起過剰分枝を防止するKIF3モーターと直接関連することを示す。図１２Ａは、示された抗体によって標識された、抗KIF3B抗体及び抗CRMP2抗体、並びに正常ウサギIgG（NRG）を用いた、マウス脳溶解物からの免疫沈降（IP）の結果を示す。KIF3BとCRMP2の免疫共沈降が相互に示されたことに注目されたい。 図１２Ｂ～Ｃは、切断型変異体間の酵母ツーハイブリッド結合アッセイを示す（Ｂ）。その結果は、酵母コロニーの顕微鏡写真（Ｃ）で表される。KIF3Aの尾部ドメイン（アミノ酸600～701）はCRMP2のC末端ドメイン（アミノ酸312～572）と直接的に相互作用しうることに注目されたい。 図１２Ｄ～Ｇは、DIV1のKif3b+/+初代海馬ニューロンの免疫蛍光顕微鏡写真を示す。CRMP2に対して標識した（Ｄ～Ｆ、赤紫）又は正常ウサギIgG（Ｇ、赤紫）を用いて、KIF3A（Ｄ～Ｆ、黄）に対して、又は正常マウスIgG（Ｇ、黄）を用いて、F-アクチン（ファロイジン；シアン）に対して、そしてα-チューブリン（緑）に対して、低（Ｄ）、中（Ｅ）、高倍率（Ｆ）。Ｄの四角は、ＥとＦの対象領域。Ｅの矢印は、CRMP2とKIF3AがPドメイン（白）のアクチン束とCドメイン（オレンジ）の周辺に共局在。Ｆの緑色の矢印は、CRMP2とKIF3Aの神経突起軸における共局在。スケールバー、2μm。 図１２Ｈは、Kif3b+/+マウス海馬ニューロンのラメリポディアの蛍光顕微鏡写真を示す。CRMP2とKIF3A（赤紫）に対する近接ライゲーションアッセイで標識し、Fアクチン（シアン）に対して対比染色した。スケールバー、2μm。 図１２Ｉ及びＫは、CRMP2に対するDIV1における示された遺伝子型の培養海馬ニューロンのラメリポディアの免疫蛍光顕微鏡写真を示す。低倍率像（Ｉの上段）及び高倍率像（Ｉの下段）並びに相対的周辺部CRMP2強度に関するその定量化を、平均野生型レベルで正規化して示す（Ｋ）。スケールバー、2μm。エラーバー、SEM。***p＜0.001、Welchのt検定、n = 14～15。図１２Ｊ及びＬは、近接ライゲーションアッセイを示す。示された遺伝子型のマウス海馬ニューロンラメリポディアにおけるCRMP2とβ-アクチン（Ｊ、赤紫）の相互作用点を示す蛍光顕微鏡写真。F-アクチン（Ｊ、シアン）に対して対比染色した。その定量化（Ｌ）も示す。スケールバー、2μm。エラーバー、SEM。***p＜0.001、Welchのt検定、n=30-31。 図１２Ｉ－Ｊの続きである。 図１２Ｍ～Ｐは、スクランブル対照（SC）又はCRMP2ノックダウン（KD）miRNAベクターを形質導入したKif3b+/+マウス由来のDIV3におけるMAP2標識海馬ニューロン（Ｍ）、並びにECFPのみ又はCRMP2-ECFPを形質導入したKif3b+/-マウス由来のMAP2標識海馬ニューロン（Ｎ）の細胞形態学的分析を、Sholl解析（Ｏ及びＰ）によるそれぞれの定量化とともに示す。10μmスケールバー。エラーバー、SD。*p <0.05、*** p<0.001、各区間におけるWelchのt検定。SC及びKD形質導入、それぞれn = 100（O）、n = 17～20（P）。 図１３Ａ～Ｋは、ベタイン誘導脱カルボニル化がCRMP2のアクチン束化活性を増強することを示す。図１３Ａ～Ｄは、DIV1におけるKif3b+/+（Ａ、Ｃ）及びKif3b+/-（Ｃ）遺伝子型の培養皮質ニューロンの溶解物の抗CMLイムノブロッティング。200μMグリオキサール又は500μMベタインで処理し又は処理せず（Ａ）を、それぞれの定量（Ｂ及びＤ）とともに示す。細胞タンパク質のカルボニル化レベルはグリオキサールによって有意に増加し、ベタインによって減少したことに注目されたい。エラーバー、SEM。それぞれ*p＜0.05、** p<0.001、Welchのt検定、n = 3。 図１３Ｅは、CE-2（青い破線）又はHBD（緑色の実線）を与えたKif3b+/+マウスの脳細胞質画分（S3画分）におけるCRMP2サイズ分布の定量化を示す。（a）高分離能サイズ排除クロマトグラフィー（HiRes-SEC）からの溶出画分のA280クロマトグラム。灰色の点線のタンパク質標準:フェリチン、440kD；アルドラーゼ、158kD；オボアルブミン、44kD；リボヌクレアーゼA、13.7 kD。（b）各分画のCRMP2ドットブロット。（c）CRMP2シグナルの相対ドットブロット強度の定量化。オレンジ色の四角及び挿入図：保持容量20～21mlの定量は、大部分が高度にカルボニル化されたCRMP2に相当する。エラーバー、SEM。*p < 0.05、Welchのt検定、それぞれn = 6。 図１３Ｆ～Ｉは、アクチンに対するCRMP2活性の生化学的特性を示す。図１３Ｆ及びＧは、アクチン及びCRMP2（Ｆ、Ｇ）又はAGE-CRMP2（Ｇ；それぞれn = 3）の示した用量によるアクチン濁度アッセイにおけるA350の経時変化を示す。CRMP2はアクチン濁度を増加させたが、AGE-CRMP2は増加させなかったことに注目されたい。図１３Ｈは、20μMのCRMP2又はAGE-CRMP2あり又はなしでの、5μMのアクチン（ピレン標識アクチン10％を含む）のピレン-アクチン重合アッセイにおける蛍光時間経過を示す。CRMP2とAGE-CRMP2はアクチン重合に有意に作用しないことに注目されたい。図１３Ｉは、CRMP2及びAGE-CRMP2のF-アクチン共沈降アッセイの自由結合プロットを示す。上清及びペレット中のタンパク質濃度に応じて、1部位モデル関数で適合させる。エラーバー、SDカルボニル化はCRMP2のF-アクチン結合能を損なったことに注目されたい。 図１３Ｊ～Ｋは、蛍光ファロイジンで標識し、TIRF蛍光顕微鏡写真（Ｊ）並びにアクチン束の長さ及び強度に関する定量によってそれぞれ表される、2μMのF-アクチン、並びにCRMP2、AGE-CRMP2及びウシ血清アルブミン（BSA、陰性対照）の各8μMを用いたアクチン束化活性アッセイ（Ｋ；n = 50）を示す。スケールバー、5μm。エラーバー、SEM。*** p<0.001、クラスカル・ウォリス検定、Dunnの多重比較検定。 図１４Ａ～Ｃは、KIF3がヒトSCZ脳において減少する傾向があることを示す。KIF3A（Ｂ）及びKIF3B（Ｃ）に対するBA10（前頭前野；Ａ：青）及びBA22（上側頭回；Ａ：緑）領域の死後脳溶解物ELISA分析で、GAPDHレベルで正規化した。SCZ患者の前頭前皮質におけるKIF3タンパク質レベルはいずれも正常対照より低い傾向があったことに注目されたい。エラーバー、SEM。Welchのt検定、n=24～30。 図１４Ｄは、SCZ病因のためのKIF3/CRMP2媒介神経突起過剰分枝の基礎となる分子機構の作業仮説を示す。発生中のニューロンのラメリポディアにおけるCRMP2のアクチン束化活性の障害は、KIF3モーター機能障害と基底レベルのカルボニルストレス間の相乗作用によって誘発され、ベタイン誘発性タンパク質脱カルボニル化によって回復する。
　本出願は、2019年11月19日出願の米国特許仮出願第62/937,396号の優先権を主張するものであり、その開示内容の全体を参照により本明細書に援用する。
１．精神疾患の治療又は予防
　本発明に係る精神疾患の治療又は予防のための組成物及び方法は、キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターが、精神疾患（特に統合失調症）の症状及び表現型を改善することに基づいている。なお、KIF3モーターは、3つのサブユニットKIF3A、KIF3B及びKAP3から構成されるヘテロ三量体（KIF3A/KIF3B/KAP3）複合体（KIF3複合体）であり、本明細書中、「KIF3モーター」又は「KIF3」は、これらのサブユニットの少なくとも1つ又は任意の組み合わせを指す。
　本発明においては、KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットの存在量又は活性を増大することを目的とする。具体的には、本発明に係る精神疾患の治療又は予防のための組成物及び方法においては、以下の（a）～（d）の少なくとも１つを用いる：
（a）キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの少なくとも1つのサブユニット若しくはその機能的変異体、
（b）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片、
（c）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター、
（d）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞。
　KIF3モーター及びそのサブユニットは公知であり、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）などから単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、KIF3モーターは、特に限定されるものではないが、ヒト又はマウス由来、特にヒト由来であることが好ましい。
　サブユニットKIF3Aの配列情報は、例えばヒトKIF3AはENAアクセッション番号AAH45542.1やGeneID:11127（アイソフォーム1、2及び3のアミノ酸配列はそれぞれNCBI Reference Sequence: NP_001287720.1、NP_001287721.1及びNP_008985.3に対応する）等として、マウスKIF3AはENAアクセッション番号AAH52707やGene ID: 16568（アイソフォームアイソフォーム1、2及び3のアミノ酸配列はそれぞれNCBI Reference Sequence: NP_032469.2、NP_001277734.1及びNP_001277735.1に対応する）等として登録されている。サブユニットKIF3Bの配列情報は、例えばヒトKIF3BはENAアクセッション番号AAI36311、Gene ID: 9371等として、マウスKIF3BはENAアクセッション番号BAA05070、Gene ID: 16569等として登録されており、ヒトKIF3Bタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号4及び3に示し、マウスKIF3Bタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列をそれぞれ配列番号2及び1に示す。サブユニットKAP3の配列情報は、例えばヒトKAP3はGene ID: 22920（アイソフォーム1～6のアミノ酸配列はそれぞれNCBI Reference Sequence: NP_055785.2、NP_001191443.1、NP_001191445.1、NP_001191446.1、NP_001362759.1及びNP_001362760.1に対応する）等として、マウスKAP3のアイソフォームKAP3AはENAアクセッション番号EY192739、Gene ID: 16579（NP_001292572.1）等として、アイソフォームKAP3BはGene ID: 16579（NP_034759.1）等として登録されている。
　本発明においては、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質であれば、その機能的変異体（例えば、変異型、短縮型、スプライスバリアント、相同体など）も用いることができ、特に限定されるものではない。また、目的の機能、すなわちKIF3モーターとしての機能又は精神疾患の症状若しくは表現型の改善作用を示す限り、公開されているKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質のアミノ酸配列において、複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、ヒトKIF3Bとして、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1～10個、好ましくは1～5個、より好ましくは1～3個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号4に示されるアミノ酸配列に1～10個、好ましくは1～5、より好ましくは1～3個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1～10個、好ましくは1～5個のアミノ酸、より好ましくは1～3個が他のアミノ酸に置換したものも、本発明において用いることができる。
　また例えば、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質のアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、好ましくは80％、特に好ましくは90％の配列相同性又は同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、目的の機能（KIF3モーターとしての機能又は精神疾患の症状若しくは表現型の改善作用）を有すると考えられるため、本発明において機能的変異体として用いることができる。なお、アミノ酸配列の相同性又は同一性は、当技術分野で公知の方法により容易に求めることができる。
　ここで、KIF3モーターとしての機能とは、微小管に沿って物質（カーゴ）を輸送する機能を指す。この機能は、当技術分野で公知の方法により確認することができ、例えば、インビトロ微小管滑走アッセイ、蛍光抗体法、ライブイメージング等により確認することができる。また精神疾患の症状若しくは表現型の改善作用とは、精神疾患の症状若しくは表現型（例えば、社会性の低下、過活動又は新規物体への興味の低下、プレパルス抑制の低下、空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下など）のうち少なくとも1つの症状又は表現型を改善する作用を指す。この作用は、例えば、精神疾患（例えば統合失調症）を発症した又は発症するリスクがある対象（ヒト、実験動物など）に投与した後、上記症状又は表現型が改善されるか否かを慣用的に評価することによって確認することができる。
　上記のKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質又はその機能的変異体は、マウス又はヒト細胞などから単離・精製して入手してもよいし、あるいはそれぞれ対応するタンパク質をコードする核酸を用いて宿主を形質転換し、該宿主において発現されるタンパク質を回収することにより生成することができる。
　KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）をコードする核酸は、神経系の組織又は細胞より抽出したRNAから精製したmRNAを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）又はcDNAライブラリーからのスクリーニングにより得ることができる。組織又は細胞からのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。あるいは、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）を発現する細胞又は組織から調製したDNAを鋳型として、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマーセットを用いて核酸増幅反応（例えばPCRなど）を行うことにより、所望の核酸を得ることができる。得られたcDNAが目的の配列を含む核酸であるか否かは、塩基配列を決定することにより確認することができる。
　また、本発明においては、機能的変異体をコードする核酸もまたKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）をコードする核酸として用いることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法等によって得られる、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）の機能を保持するが、変異を有するタンパク質（すなわち機能的変異体）をコードする核酸を使用することができる。例えば、限定されるものではないが、配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ目的の機能（KIF3モーターとしての機能又は精神疾患の症状若しくは表現型の改善作用）を有するタンパク質をコードする核酸を用いることができる。なお、核酸に変異を導入するには公知の任意の手法を採用することができる。変異した核酸により作製される組換えタンパク質が目的の機能を有するか否かは、上述と同様に確認することができる。
　さらに、本発明においては、公開されている塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）の機能を有するタンパク質（すなわち機能的変異体）をコードする核酸も用いることができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいい、当業者であれば慣用的に設定することが可能である。
　また、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）の機能を保持するタンパク質をコードする限り、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）をコードする核酸の断片もまた本発明において使用することができる。
　本発明において「核酸」とは、DNA又はRNAのいずれであってもよいし、DNA及びRNAのハイブリッド核酸、人工核酸であってもよい。
　本発明において、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）を発現させるための発現ベクターは、上記核酸又はその断片を適当なベクターに連結することにより得ることができる。また本発明において用いる形質転換細胞は、上記核酸若しくは断片又は発現ベクターを、目的のKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）又はその機能的変異体が発現し得るように宿主細胞中に導入することにより得ることができる。
　ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスに基づくベクター、人工染色体などの公知のベクターであれば任意のものを用いることができる。プラスミドDNAとしては、細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージミドDNAとしてはλファージが挙げられる。さらに、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、ヒト人工染色体（HAC）などを用いて形質転換細胞を作製することができる。
　ベクターに目的の核酸を挿入するには、まず、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
　ベクターが宿主細胞において自律複製されて、又はベクター上の目的の核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主細胞においてKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）又はその機能的変異体が発現されるようにベクターを構築する必要がある。そこで、ベクターには、プロモーター、核酸のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、相同配列などを連結することが好ましい。組織特異的発現や時期特異的発現を達成することができるように、プロモーターやシグナル配列を選択してもよい。
　発現ベクターを対象に投与する場合、又は発現ベクター若しくは核酸で形質転換した細胞を対象に投与する場合には、対象の種類、投与方法などに応じて適切なターゲティングベクターを構築する必要がある。本発明においては、対象（好ましくはヒト）におけるKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）又はその機能的変異体の発現を増大させるため、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）又はその機能的変異体をコードする核酸を対象（宿主）において機能可能なプロモーターと連結させ、これをウイルスベクターなどのベクターに組み込むことにより、ターゲティングベクターを構築することができる。哺乳動物被験体において機能可能なプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、シミアンウイルス（SV40）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（MMTV）プロモーター等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、使用し得るベクターには、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのベクター系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
　上記の各種配列とベクターDNAとを連結させるには、公知のDNAリガーゼを用いる。そして、上記各種配列とベクターDNAとをアニーリングさせた後に連結させ、発現ベクターを作製する。
　形質転換に使用する宿主としては、導入される核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、酵母、動物細胞（NCIH292細胞、COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。また、形質転換細胞をそのまま対象に投与する場合（ex vivo法）には、投与対象の生物種と同じ種に由来する細胞（例えばヒト、マウスなどに由来する細胞）を形質転換することが好ましい。特に、投与対象から細胞（例えば神経細胞）を単離し、その自己由来の細胞を形質転換した後、当該細胞を用いることが好ましい。
　宿主又は細胞への核酸又は発現ベクターの導入方法は、当技術分野で公知であり、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。形質転換体は、例えば、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。
　本発明において、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）タンパク質又はその機能的変異体は、該タンパク質をコードする核酸が導入された前記形質転換細胞を培養し、その培養物（培養上清、培養細胞又は細胞破砕物）から採取することにより得ることができる。形質転換細胞を培養する方法は、使用する宿主の種類に応じて、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
　培養後、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）タンパク質又はその機能的変異体が細胞内に生産される場合には、細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）タンパク質又はその機能的変異体を単離精製することができる。
　上述のように得られる、KIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質若しくはその機能的変異体；KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片；KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター；KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞は、いずれも精神疾患の症状若しくは表現型の改善作用を示すため、本発明に係る精神疾患の治療又は予防のための組成物及び方法において用いることができる。
　本発明に係る組成物（本組成物）は、有効成分として、1種のKIF3モーターのサブユニット又はそれをコードする核酸などを含有するものであってもよいし、あるいは2種以上のKIF3モーターのサブユニット又はそれをコードする核酸などを組み合わせて含有するものであってもよい。好ましくは、本発明に係る組成物は、少なくともKIF3B若しくはその機能的変異体又はそれをコードする核酸若しくはその断片、発現ベクター又は形質転換細胞を含有する。
　また本組成物は、精神疾患の治療又は予防に有効な他の成分を含むものであってもよい。あるいは、本組成物は、精神疾患の治療又は予防に有効な他の成分と組み合わせて使用若しくは投与されてもよく、本組成物はかかる他の有効成分との組合せ医薬として提供されてもよい。そのような他の有効成分としては、当技術分野で公知のものであれば特に限定されるものではなく、例えば、以下の実施例において統合失調症の表現型の改善に有効であることが示されたカルボニルストレススカベンジャー（例として、ベタイン、ピリドキサミン又はその誘導体等）、定型抗精神病薬（フェノチアジン系、ブチロフェノン系、ベンズアミド系等）、非定型抗精神病薬（セロトニン・ドパミン遮断薬等）などが挙げられる。
　本組成物が医薬組成物である場合、有効成分の他、薬学的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
　本組成物の対象細胞への投与方法は特に限定されるものではなく、例えば、対象細胞を含む懸濁液又は培地に本組成物を添加したり、本組成物を含有する溶液に対象細胞を浸漬したりするなど、当業者に公知の方法で投与を行うことができる。また本組成物を対象に投与する場合にもその投与方法は特に限定されるものではなく、経口投与、又は非経口投与、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、脳内、髄腔内、経皮投与、直腸投与、経鼻投与などにより行うことができる。
　本組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセルなど）、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などのいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本組成物を非経口投与する場合は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、脳内注射、髄腔内注射及び皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）、軟膏剤（特に眼軟膏剤）、クリーム剤、座剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、リニメント剤、エアゾル剤などの外用剤などの製剤形態を選択することができ、注射剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
　これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、pH調整剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、吸収促進剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤などを適宜選択し、常法により製造することができる。
　本組成物に配合する有効成分の量は、有効成分の種類（タンパク質、核酸など）、その用途、剤形、投与経路などにより異なるが、例えばタンパク質の場合には、総重量を基準として1～99重量％、好ましくは5～90％としうる。
　また、本組成物がKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）のタンパク質若しくはその機能的変異体をコードする核酸、発現ベクター又は形質転換体であって、投与対象が動物である場合には、遺伝子治療の分野で用いられている種々の投与方法で対象にKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）を送達することができる。例えば、核酸又は発現ベクターを対象に直接投与（in vivo法）してもよいし、又は対象から採取した細胞（好ましくは神経細胞）に導入して、目的のKIF3モーター（少なくとも1つのサブユニット）を発現する形質転換細胞を選択してからその細胞を対象に投与してもよい（ex vivo法）。目的の組織又は細胞に発現ベクターを投与するために使用し得る遺伝子送達機構には、コロイド分散系、リポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープなどが含まれる。例えば、送達系は巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を利用することができる。核酸又は発現ベクターの直接投与は、例えば静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、脳内注射、髄腔内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより行うことができる。また、発現ベクターの細胞導入（形質転換）は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法を用いて行うことができる。核酸、発現ベクター又は形質転換細胞の使用量は、投与経路、投与回数、対象の種類によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。
　また、本組成物の有効量（投与量）及び投与間隔は、該組成物に含まれる有効成分の種類（タンパク質、核酸など）、投与対象（細胞又は動物）、対象の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変更することができる。
　本組成物は、使用する対象（細胞又は動物）を特に限定するものではない。例えば、細胞の場合には、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ブタなどに由来する細胞、又は人工的に確立された細胞系統（iPS細胞等）などに投与することができる。また、対象としては、哺乳動物、例えばヒト、家畜（ウシ、ブタなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、サルなど）などが挙げられる。
　本組成物は、医薬組成物としての用途に限定されず、その他、例えば食品又は飼料などに配合されてもよい。本組成物が配合された食品又は飼料は、精神疾患の症状を改善するため又は精神疾患の発症を予防するための機能性食品、健康補助食品又はサプリメントとして有用である。本組成物を配合する食品の形態及び種類は特に限定されるものではない。例えば、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品など様々な形態の食品に配合することができる。
　上述した組成物は、KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニット（好ましくは少なくともKIF3Bを含む）の存在量又は活性を増大することにより、精神疾患を治療又は予防することができる。本発明において「精神疾患」としては、例えば、統合失調症、気分障害（うつ病、双極性障害など）、不安障害（全般的不安障害、パニック障害など）、発達障害（学習障害、広汎性発達障害、注意欠陥・多動性障害など）が挙げられる。本組成物により治療又は予防の対象となる疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
　また、本組成物を投与する対象は、特に、精神疾患の治療又は予防が望まれる対象、例えば精神疾患の遺伝的素因を有する対象、精神疾患の診断を受けた対象であることが好ましい。
２．精神疾患のモデル動物
　KIF3モーター（特にKIF3B）を欠損する非ヒト哺乳動物は、統合失調症などの精神疾患に特有の特徴及び表現型を示す。例えば、Kif3b+/-ニューロンは、NR2Aの輸送障害とNR2Bの分解増加により、NR2AとNR2Bの両方の樹状突起レベルの減少を示し、Kif3b+/-海馬切片では、電気生理学的NMDAR反応が低下し、シナプス可塑性が崩壊しており、これらの特徴は、統合失調症（SCZ）の一般的な特徴に相当している（実施例１）。またKif3b+/-マウス脳の組織学的特徴もSCZの特徴を模倣し、Kif3b+/-マウスはプレパルス抑制（PPI）、社会的関心、及び認知柔軟性における行動欠陥を示す（実施例１）。またヒトSCZ患者ではKIF3Bの変異が特異的に同定され、レスキュー実験では機能的に欠損していることが明らかになった（実施例１）。したがって、KIF3モーター（特にKIF3B）はNR2A/APC複合体を輸送し、その機能障害がSCZ病因の原因であることを提唱する。
　本発明は、脳における機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物の精神疾患モデル動物としての使用に関する。
　本明細書中、非ヒト哺乳動物とは、好ましくはヒト以外の哺乳動物であり、さらに好ましくは、げっ歯動物（マウス、ウサギ、モルモット、ラット等）であり、特に好ましくはマウスである。
　本明細書中「機能的なKIF3モーター」とは、微小管に沿って物質（カーゴ）を輸送する機能を有しているKIF3モーターを指す。したがって、「機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている」とは、KIF3モーターの全体又は少なくとも1つのそのサブユニット（特にKIF3B）の発現が低減されているか、KIF3モーターの全体又は少なくとも1つのそのサブユニット（特にKIF3B）が発現している場合でも、それがKIF3モーターとしての機能を消失した変異体であるか、あるいは機能的なKIF3モーターの全体又は少なくとも1つのそのサブユニット（特にKIF3B）が発現している場合であっても、KIF3モーター（又はそのサブユニット）の発現を阻害する手段（例えばsiRNAなど）によってその発現が実質的に低減又は阻害されていることを指す。
　「発現が低減又は阻害されている」とは、KIF3モーターの全体又は少なくとも1つのそのサブユニット（特にKIF3B）の発現量が正常（野生型）の対応する動物個体（または細胞）に対して70％以下、好ましくは60％以下、より好ましくは50％以下、さらに好ましくは40％以下、最も好ましくはその発現が実質的に検出されない程度であることを指す。機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている動物は、例えばKIF3モーター又はそのサブユニットをコードする染色体上の遺伝子を破壊することによりノックアウト動物として得ることができる。ノックアウト動物の作製方法は当業者には公知である。KIF3モーターを構成するサブユニット（KIF3A、KIF3B及びKAP3）をコードする遺伝子配列は、上述のようにデータベースから入手可能である。この配列に基づいて、ゲノムDNAをクローニングし、常法に従って、遺伝子ターゲティングベクターに組込み、細胞に導入して、該細胞から個体を発生させる。遺伝子破壊によるノックアウト動物の作製方法は種々の公知文献が多数存在しており、当業者は容易に作製することができる。例えば、KIF3モーターのKIF3Bノックアウトマウスは、Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998)に記載の方法により作出することができる。本発明に用いる場合、ヘテロノックアウト動物、すなわちKIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする遺伝子のヘテロ接合ノックアウトにより作出された哺乳動物が好ましい。
　機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている哺乳動物は、対応する野生型哺乳動物に比較して、以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つを示す：
（i）社会性の低下、
（ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
（iii）プレパルス抑制の低下、
（iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下。
　本明細書中、「対応する野生型哺乳動物に比較した」とは、上記（i）～（iv）の表現型が、同様の条件下にある機能的なKIF3モーターを発現する野生型の同系の哺乳動物と比較した場合に、有意に低下していることをいう。あるいは、上記（i）～（iv）の表現型が、同様の条件下にある精神疾患（特に統合失調症）の他のモデル哺乳動物と比較した場合に、同等に低い又はそれ以下であることをいう。
　上記（i）～（iv）の表現型は、精神疾患（特に統合失調症）に特徴的な表現型又は症状であり、当業者であれば、公知の方法又は手段を用いて評価することができる。例えば、以下の実施例に記載するようなソーシャルインタラクション試験、高架式十字迷路試験、新規物体認識試験、聴覚驚愕反応試験（ASR）、プレパルス抑制試験（PPI）、バーンズ迷路試験及び逆バーンズ迷路試験などにより評価することができる。
　機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物は、精神疾患、例えば、統合失調症、気分障害、不安障害、及び発達障害からなる群より選択される少なくとも1種の精神疾患のモデル動物として有用であり得る。このようなモデル動物は、例えば、後述するような、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法のスクリーニングや、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性の評価に用いることができる。
３．スクリーニング方法及び薬物有効性の評価方法
　機能的なKIF3モーター又はそのサブユニットを欠損する哺乳動物は、上の「２．精神疾患のモデル動物」に記載の通り、精神疾患（特に統合失調症）に特徴的な表現型又は症状を示す。また機能的なKIF3モーター又はそのサブユニットを欠損する神経細胞は、NMDA受容体のサブユニットNR2Aの輸送活性の低下、樹状突起の過剰分枝、スパイン数の低下、ラメリポディア動態の低下、ラメリポディア内のアクチン束の密度及び／又は動態の低下、ラメリポディア内への微小管侵入頻度の増加などの特徴を示す（以下の実施例１及び２）。したがって、本発明では、機能的なKIF3モーター又はそのサブユニットを欠損する哺乳動物又は神経細胞を使用して、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法のスクリーニング、及び精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性の評価を行うことができる。
　したがって、本発明は、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
（a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を被験因子で処理するステップ、
（b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
を含む方法を提供する。
　また本発明は、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
（c）前記非ヒト哺乳動物を被験因子で処置するステップ、
（d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
を含む方法を提供する。
　本発明に係るスクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」ともいう）においては、機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を被験因子で処理する、並びに／あるいは、機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物を被験因子で処置する。
　機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞は、当技術分野で公知の方法により調製することができる。例えば、上述した機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物から神経細胞を単離することにより、目的の神経細胞を調製することができる。あるいは、神経細胞においてKIF3モーター又はそのサブユニットをコードする遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることにより、目的の神経細胞を作製することができる（例えば、以下の実施例を参照）。ここで、機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害は、機能的なKIF3Bの発現の低減又は阻害によるものであることが好ましい。
　機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物は、上の「２．精神疾患のモデル動物」に記載の通りである。
　本スクリーニング方法の対象となる被験因子の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験因子は、任意の物質、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない分子、例えば低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験因子は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。さらに、被験因子は、放射線、紫外線、炭素濃度、温度などの環境因子であってもよい。
　また、被験因子としては単一の被験因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
　動物を被験因子で処置する場合には、その処置量、処置期間、処置経路などの処置条件は、被験因子の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、動物に被験物質を投与する場合の投与経路は、被験物質の種類、使用する動物の種類などに応じて、筋肉内注射、経口投与、静脈注射、脳内注射、髄腔内注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
　神経細胞を被験因子で処理する場合、その処理の条件は、使用する因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、そのような処理は、神経細胞を被験物質を添加した培地中で培養することにより、神経細胞を被験物質を含む溶液中に浸漬することにより、神経細胞上に被験物質を積層することにより、又は神経細胞を被験因子の存在下で培養することにより行うことができる。
　また、被験因子の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験因子で処置又は処理する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験因子の処置又は処理期間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うことができる。
　さらに、複数の因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験因子を組み合わせて用いてもよい。
　続いて、非ヒト哺乳動物又は神経細胞を被験因子で処置又は処理した後、適当な時期に、非処置対照動物若しくは野生動物、又は非処理対照細胞若しくは野生型神経細胞と比較する。例えば、処置又は処理の直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2～10日後、10～20日後、20～30日後、1ヶ月～6ヵ月後に比較を行う。
　一実施形態においては、前記処理後、神経細胞におけるNMDA受容体のサブユニットNR2Aの輸送活性を測定する。この活性の測定は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、具体的には以下の実施例に記載の方法を使用することができる。神経細胞におけるNR2Aの輸送活性が、非処理対照細胞と比較して増大している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合には、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する。
　別の実施形態においては、前記処理後、神経細胞におけるKIF3タンパク質（特にKIF3B）の量若しくは活性又はKIF3をコードする遺伝子（特にKIF3b）の発現量を測定する。KIF3タンパク質の量若しくは活性又はKIF3をコードする遺伝子の発現量は、当技術分野で公知の方法により測定することができ、具体的には以下の実施例に記載の方法を使用することができる。神経細胞におけるKIF3タンパク質の量若しくは活性又はKIF3をコードする遺伝子の発現量が、非処理対照細胞と比較して増大している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合には、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する。
　また別の実施形態においては、前記処理後、神経細胞における樹状突起の過剰分枝、スパイン数、ラメリポディアの動態、ラメリポディア内のアクチン束の密度及び／又は動態、並びにラメリポディア内への微小管侵入頻度のうちの少なくとも1つの特徴を測定する。これらの特徴は、当技術分野で公知の方法により測定することができ、具体的には以下の実施例に記載の方法を使用することができる。具体的な実施形態では、以下のいずれかにより被験因子を選択することができる：
（i）神経細胞における樹状突起の過剰分枝が、非処理対照細胞と比較して減少している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する；
（ii）神経細胞におけるスパイン数が、非処理対照細胞と比較して増大している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する；
（iii）神経細胞におけるラメリポディアの動態が、非処理対照細胞と比較して増大している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する；
（iv）神経細胞におけるラメリポディア内のアクチン束の密度及び／又は動態が、非処理対照細胞と比較して増大している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する、；
（v）神経細胞におけるラメリポディア内への微小管侵入頻度が、非処理対照細胞と比較して減少している場合、又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する。
　一実施形態においては、前記処置後、非ヒト哺乳動物が、非処置対照動物又は野生型動物と比較して以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つの改善を示すか否かを評価する：
（i）社会性の低下、
（ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
（iii）プレパルス抑制の低下、
（iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下。
　上記（i）～（iv）の表現型は、精神疾患（特に統合失調症）に特徴的な表現型又は症状であり、当業者であれば、公知の方法又は手段を用いて評価することができる。例えば、以下の実施例に記載するようなソーシャルインタラクション試験、高架式十字迷路試験、新規物体認識試験、聴覚驚愕反応試験（ASR）、プレパルス抑制試験（PPI）、バーンズ迷路試験及び逆バーンズ迷路試験などにより評価することができる。処置後の非ヒト哺乳動物が、上記（i）～（iv）のうちの少なくとも1つの改善を示す場合には、被験因子を薬物又は方法の候補として選択する。
　また、本発明においては、一次スクリーニングとして、上記ステップ（a）及び（b）を行って被験因子を候補として選択した後に、二次スクリーニングとして、上記ステップ（c）及び（d）として、選択した被験因子で非ヒト哺乳動物を処置し、被験因子をさらに選択してもよい。一般的には、細胞レベルにおいて被験因子の有効性が確認された後に、実験動物、さらにはヒトにおいて、例えば臨床試験などにより有効性の評価が行われる。
　本発明者はまた、コラプシン反応媒介タンパク質2（CRMP2）をKIF3モーターによって輸送されるカーゴとして生化学的に同定し、同時に新たなカルボニル化感受性アクチン束化因子として同定した（実施例２）。脱カルボニル化活性を有するベタインは、CRMP2のカルボニル化を有意に減少させ、ラメリポディアの適切な動態と周辺部微小管排除に必要なF-アクチン束化活性を増強し、したがってKIF3欠損を機能的に代償する可能性があるという知見も得た（実施例２）。このように、機能的なKIF3モーターの欠損を、カルボニル化の抑制（脱カルボニル化）により機能的に代償し得ることから、本スクリーニング方法では、被験因子がカルボニル化抑制活性を有するか否かを評価するステップをさらに行ってもよい。カルボニル化抑制活性の評価は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、特に限定されるものではない。また本スクリーニング方法では、被験因子が、CRMP2タンパク質の量若しくは活性を増大させるか否かを評価するステップ、及び／又はCRMP2タンパク質のカルボニル化を抑制する活性を有するか否かを評価するステップをさらに行ってもよい。CRMP2タンパク質の量若しくは活性を増大させるか否かの評価、及びCRMP2タンパク質のカルボニル化を抑制する活性の評価もまた、当技術分野で公知の方法により行うことができ、特に限定されるものではない。具体的な方法については、実施例２を参照されたい。
　なお、CRMP2もまた当技術分野で公知であり、ジヒドロピリミジナーゼ様2（DPYSL2）としても知られ、例えば、ヒトCRMP2の配列情報はENAアクセッション番号BC067109、BC056408、Gene ID: 1808（アイソフォーム1～3はそれぞれNP_001184222.1、NP_001377.1及びNP_001231533.1に対応する）等として、マウスCRMP2の配列情報はENAアクセッション番号BC062955、Gene ID: 12934（アイソフォーム1及び2はそれぞれNP_001365696.1及びNP_034085.2に対応する）等として公開されている。
　さらに、上記の治療又は予防薬物又は方法のスクリーニングにおいては、選択された候補被験因子を、別の精神疾患のモデル動物に投与して、候補被験因子がモデル動物における精神疾患の症状又は表現型に影響を及ぼすか否かを判定してもよい。モデル動物は、目的とする精神疾患の要因（遺伝的素因など）を有するか又は少なくとも1つの症状を示すものであれば特に限定されるものではない。例えば、統合失調症（SCZ）モデルマウス（Ohnishi, T. et al., Ebiomedicine 45, 432-446 (2019)、Koike, S. et al., Translational psychiatry 4, e379-e379 (2014)、Duan, X. et al., Cell 130, 1146-1158 (2007)、Jang, S. et al., Biochemical and biophysical researchcommunications 490, 460-465 (2017) 等）、自閉症モデルマウス（Pathania, M. et al., Translational Psychiatry 4, e374 (2014)、Peca, J. et al., Nature 472, 437-442 (2011)等）などを用いることができる。
　被験因子がモデル動物における精神疾患に影響を及ぼすか否かの判定は、モデル動物の疾患の種類、要因、症状などにより異なるが、当業者であれば、その疾患に及ぼす影響を適宜判定することができる。例えば、社会性に及ぼす影響を判定する場合には、ソーシャルインタラクション試験などを行うことができる。
　上述のようにして、神経細胞における特徴（異常）の改善や精神疾患の症状の改善が認められる場合の被験因子は、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の候補として選択することができる。
　また本スクリーニング方法のステップは、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性を評価するためにも使用することができる。したがって、本発明はまた、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性を評価する方法であって、
（a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を前記薬物又は方法で処理するステップ、
（b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
を含む、並びに／あるいは
（c）前記非ヒト哺乳動物を前記薬物又は方法で処置するステップ、
（d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
を含む方法を提供する。
　以上から、機能的なKIF3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物又は神経細胞を用いることにより、精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の候補を見出し、さらには薬物又は方法の有効性を評価することが可能となる。
　以下に実施例を例示し、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のために提供するものであり、本出願において開示する発明の範囲を限定又は制限するものではない。
［実施例１］機能的なKIF3Bが低減したマウスの作出及びその統合失調症様表現型の評価
（１）材料及び方法
マウスと行動解析
　動物の取扱い、住居、環境設定、栄養設計はすべて、動物実験に関する東京大学の制限のもとで行われた。Kif3b+/-マウスの作製のためのKif3b遺伝子ターゲティング、及びneo-カセットを用いたKif3b遺伝子の破壊を検出するためのPCR遺伝子型タイピングは、以前の研究（Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998)）で記述されている。Kif3b変異マウス系統は、C57BL/6Jマウスとの反復戻し交配により維持した。解析には3～6ヶ月齢の成体同腹仔雄マウスを用い、行動試験は10分間の馴化時間をあけてシングルブラインドで実施した。
ソーシャルインタラクション試験
　ソーシャルインタラクション試験は、既報のとおり実施した（Silverman JL, et al., Nat Rev Neurosci 11: 490-502 (2010)）。同じ遺伝子型を持つ2匹の雄マウスを新規の長方形箱の中心に置き、それらの痕跡を10分間ビデオ撮影した。鼻接触及び反復行動としてのそれらの相互性ソーシャルインタラクションをICY及びEthoVisionソフトウェアで定量化した。
高架式十字迷路試験
　高架式十字迷路は、既報のように実施した（Holmes A, et al., Physiol Behav 71: 509-516 (2000)）。簡単に説明すると、雄マウスをプラス迷路の中心に置き、それらを5分間ビデオ撮影した。オープンアームへの侵入回数及びオープンアームに費やした時間を手動でカウントした。
3チャンバー社会性試験
　既報のように3チャンバーによる社会性試験を行った（Silverman et al. (2010), 前掲）。簡単に説明すると、長方形の箱は3つの部屋に分かれ、それらの間に開口部がある。そのうち2つにケージをセットし、中央の部屋を空に保った。マウスを10分間箱に馴化させた後、10分間ケージ内で今まで遭遇したことのない野生型雄マウスと遭遇させた。各部屋で過ごした時間はEthoVisionソフトウエアを用いて算出した。
新規物体認識試験
　既報のように新規物体認識試験を行った（Yin X, et al., Neuron 70: 310-325 (2011)）。トレーニングセッション中に、2つの同一物体を長方形の箱に入れ、マウスを15分間自由に探索させた。鼻接触として各物体を探索するのに費やした時間を記録した。保持試験では、マウスを同じケージに戻した。このケージでは、トレーニング中に使用した身近な物体の1つを新規の物体に置き換え、15分間探索させた。EthoVisionソフトウエアを用いて、身近で新規物体の探索に費やした来訪回数と時間を記録した。
聴覚驚愕反応試験（ASR）及びプレパルス抑制試験（PPI）
　既報のようにASR及びPPIを実施した（Maekawa M, et al., J Neurochem 115: 1374-1385 (2010)）。ASR試験では、パルスを70、75、80、85、90、95、100、110、120dBに設定し、各パルスでの驚愕反応を記録した。PPI試験では、プレパルス（PP）を70、74、78、82、86dB、パルス（P）を115dBとした。PPIパーセンテージは［（P振幅- PP振幅）/P振幅］×100として算出した。値を算出するために、振幅超過平均±2×SEMをすべて除外した。
バーンズ迷路試験
　試験は既報のように実施した（Rosenfeld CS, Ferguson SA, J Vis Exp 84: e51194 (2014)）。トレーニング装置は、周囲に16個の穴がある丸い台とした。これらの穴の大部分は床に開いた落とし穴につながるが、1つの穴から食物が入った落とし箱につながる。試験は4日間のトレーニングセッション（毎日2セッション）と試験開始から5日目、12日目、29日目のプローブトライアルから構成された。落とし箱に入る時間とプライマリエラーの数は、EthoVisionソフトウェアを使用してモニターしカウントした。
抗体
　本研究で使用した一次抗体は、以下の通りである：抗KIF3Bポリクローナル抗体（1:500, Takeda S, et al., J Cell Biol 148: 1255-1265 (2000)）、抗KIF3Aモノクローナル抗体（1:500, 611508, BD Transduction Laboratories, RRID:AB_398968）、抗KAP3Aモノクローナル抗体（1:500, 610637, BD Transduction Laboratories, RRID:AB_397967）、抗KIF17ポリクローナル抗体（1:500, Yin X, et al., Neuron 70: 310-325 (2011)）、抗KIF5Bポリクローナル抗体（1:500, RRID:AB_2571745）、抗NR2A（1:300, GluRe1C-Rb-Af542, Frontier Institute, RRID:AB_2571605）及び抗NR2Bポリクローナル抗体（1:300, GluRe2N-Rb-Af660, Frontier Institute, RRID:AB_2571761）、抗APCポリクローナル抗体（1:300, sc-896, Santa Cruz Biotechnology, RRID:AB_2057493）、抗PSD95モノクローナル抗体（1:500, MA1-046, Thermo Fisher Scientific, RRID:AB_2092361）、抗α-チューブリンモノクローナル抗体（1:1,000, DM1A-T9026, Sigma-Aldrich, RRID:AB_477593）、抗β3-チューブリンポリクローナル抗体（1:500, T5076, Sigma-Aldrich, RRID:AB_532291）、抗MAP2モノクローナル抗体（1:200, HM2-M4403, Sigma-Aldrich, RRID:AB_477193）、抗Tau-1モノクローナル抗体（1:500, MAB3420, Millipore, RRID:AB_94855）、抗β-アクチンモノクローナル抗体（1:1,000, AC15-A5441, Sigma-Aldrich, RRID:AB_476744）、及び抗β-カテニンモノクローナル抗体（1:1,000, 610153, BD Biosciences, RRID:AB_397554）。
　正常ウサギIgG（55944, Cappel/ICN/MP, RRID:AB_2334717）及び正常マウスIgG（02-6502, Thermo Fisher Scientific, RRID:AB_2532951）を陰性対照として用いた。Alexa Fluor 405-、488-、及び647-結合ヤギ抗マウスIgG蛍光抗体（1:500；A-31553, RRID:AB_221604；A-11029, RRID:AB_2534088；A-21236, RRID:AB_2535805）並びにAlexa Fluor 488-及び568-結合ヤギ抗ウサギIgG蛍光抗体（1:500；A-11034, RRID:AB_2576217；A-11036, RRID:AB_10563566）をInvitrogen/Thermo Fisher Scientificから入手した。F-アクチンを染色するために、Alexa Fluor 568結合ファロイジンを用いた（1:1,000, A-12380, Thermo Fisher Scientific）。
　西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（1:1,000, #NA931V, RRID:AB_772210）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（1:1,000, #NA934V, RRID:AB_772206）をGE Healthcareから入手した。
発現ベクター
　ニューロン量のカウンター標識には、pEGFP-N1（Clontech）ベクターを適用した。NR2A及びNR2Bライブイメージング及び分解アッセイのために、マウス全長Nr2a及びNr2b cDNAをpCMV駆動ECFP及びPA-GFP N1型発現ベクターに連結した（Yin et al. (2011), 前掲）。pEYFP（Clontech）の黄色蛍光タンパク質（YFP）配列を、既報（Yin et al. (2011), 前掲）のようにマウスNr1 cDNAで置換することにより、タグなしマウスNR1発現ベクターを作製した。Kif3b遺伝子の細胞ノックダウンのため、以下のオリゴヌクレオチドを有するBLOCK-iT Pol II miR RNAi発現ベクターキット（Thermo Fisher）を用いて、miRNAベースの哺乳動物発現ベクターを調製した：
　5’-TGCTGTCATCATAGAGCTCAAACTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAGTTTGCTCTATGATGA-3’（配列番号5）
　5’-CCTGTCATCATAGAGCAAACTGCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGCAGTTTGAGCTCTATGATGAC-3’（配列番号6）
　すべてのオリゴヌクレオチドを各残基上にホスホロチオエート基で合成し、pcDNATM6.2-GWプラスミドベクター（Thermo Fisher）に挿入した。ノックダウンベクターを用いて、培養ニューロンをDIV8～10でトランスフェクトした。レスキューアッセイのために、マウスKif3b cDNA（配列番号1）をpEYFP-N1ベクター（Clontech）に連結した。Arg653Ter点変異を、以下のオリゴヌクレオチドと共にQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて、KIF3B-EYFP発現ベクターに導入した：
　5’-AACTCGAGGCCACCATGTCCAAGTTAAAAAGCTCA-3’（配列番号7）
　5’-ATGATGATTCGGCCAGAGCCCGAGGTACCAAA-3’（配列番号8）
　これらをDIV16～21で海馬ニューロンに導入し、48～72時間培養して解析に供した。
免疫沈降及びイムノブロッティング
　全マウス脳溶解物を調製し、基本的には既報（Yin et al. (2011) 前掲；Morikawa M, et al., Cell Rep 23: 3864-3877 (2018)）と同様にイムノブロッティング及び免疫沈降（IP）に用いた。図２Ａにおけるイムノブロッティングのために、成体マウス脳を、50mM Tris pH 8.0、1％Triton X-100（Sigma-Aldrich）、0.1％SDS（Wako）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（PI）（cOmpleteTM mini EDTA不含、Roche Diagnostics）を含む150mM NaClを含むRIPAバッファーに対してホモジナイズし、清澄化し、SDS-PAGEに供し、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）Immobilonトランスファーメンブレン（EMD Millipore）に移し、対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに適当な一次抗体でイムノブロットした。Amersham ECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬（RPN2232、GE Healthcare）を用いてシグナルを検出した。ImageJソフトウエア（NIH）を用いてバンドシグナルを定量化するために密度測定分析を行った。
　図１Ａ～Ｃにおける免疫沈降のために、マウス脳を6mlのRIPAバッファー（図１Ａ）又はHepes-スクロースバッファー（10mM Hepes pH 7.4、320mMスクロース、5mM MgSO4、1mM EGTA、プロテアーゼ阻害剤；図１Ｂ及びＣ）に対してホモジナイズした。シリンジを通過させ、15,000×gで15分間遠心して清澄化した。一次抗体2μgを磁性μMACS Protein A Microbeads（MACS Miltenyi Biotec社製）とプレインキュベートし、1mlの脳溶解物と4℃で1時間混合し、洗浄後、溶出してイムノブロッティングに供した。
神経細胞培養及びトランスフェクション
　海馬ニューロンの初代培養は、既報の通りに調製した（Takei Y, et al., J Cell Biol 150: 989-1000 (2000)；Kaech S, Banker G, Nat Protoc 1: 2406-2415 (2006)）。簡単に説明すると、胎生16.5日のマウスから単離した海馬は、37℃で15分間0.25％トリプシンで解離した。次に、ポリエチレンイミン（Sigma）とポリ-L-リジン/ラミニン（Sigma）でコーティングしたガラスカバースリップ上にニューロンを平板培養した。培地は最小必須培地（MEM）とし、1mMピルビン酸（Gibco）、0.6％グルコース、GlutaMAXTM-I（#35050、Gibco）、及び2％B27補助混合物（Gibco）を添加した。修正リン酸カルシウムプロトコール（Jiang M, Chen G, Nat Protoc 1: 695-700 (2006)）を用いて、in vitroでの日数（DIV）7～16にトランスフェクトした。トランスフェクションの2又は3日以上後に、海馬細胞を免疫細胞化学のために固定するか、又は直接ライブイメージングに供した。ニューロンのスパインを可視化するために、EGFPトランスフェクトニューロンを、Airyscan装置（ZEISS）を備えたLSM780共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて観察した。IMARISソフトウエア（BITPLANE）を用いて、スパインの数を計数し、スパインの形態学的分類を行った。IMARIS Filament Tracer及びClassify Spinesエクステンションを用いて、太型（stubby）、キノコ型、長細型（long-thin）、及びフィロポディア（filopodia）の4つの既定クラスのリストを取得した。
タイムラプスイメージング
　海馬ニューロンはDIV7～9で使用した。NR2A-ECFP又はNR2B-ECFP発現ベクターを、修正リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、非標識全長NR1発現ベクターを有する培養ニューロンに導入した。トランスフェクションの3～5日後に、CSU-W1紡錘ディスク共焦点レーザ走査ユニット（Yokogawa）と冷却iXon EM-CCDカメラ（Andor）とLSM780共焦点レーザ走査顕微鏡（ZEISS）を備えた逆ZEISS光学顕微鏡下でニューロンのライブイメージングを行った。樹状突起に沿ったNR2A-ECFP又はNR2B-ECFPクラスタの動きを4秒毎にモニターした。
　ImageJとIMARISソフトウェアを用いて解析とグラフィック表示を行った。NR2A-ECFPとNR2B-ECFP小胞の速度と方向性を測定するために、大きさが0.30μm2より大きい点状シグナルをモニターした。動きの方向とモード、対象物の速度、移動距離を検出するために、ImageJを、単一粒子追跡（SPT）のためにTrackMate Simple高速LAPトラッカーで使用した（ROIの閾値：128）。IMARISスポット作成ウィザード、3D時間プロット（X、Y、Z）エクステンションを用いて結果を確認した。
免疫細胞化学
　培養海馬ニューロン（図２Ｃ～Ｆ及び図６Ｆ）の免疫細胞化学のために、細胞をpEGFP-N1で2日間トランスフェクトし、4％PFA-PBSで37℃で10分間固定し、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロッキングし、4℃で一晩グルタミン酸受容体の細胞外ドメインに対して前標識し、PBS中で洗浄し、0.1％Triton X-100で室温（RT）で5分間透過処理し、5％BSA-PBS中の細胞質タンパク質に対する一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、次いで5％BSA-PBS中のAlexa Fluor 488、568若しくは647の二次抗体及び/又はAlexa Fluor 568-ファロイジンとRTで1時間インキュベートした。
　4重カラー画像（図１Ｄ～Ｈ及び図７Ｃ）については、ウサギ抗KIF3B、抗NR2A、抗NR2B、抗APC抗体を、それぞれAlexa Fluor 488、555、555、647で、Zenon Rabbit IgG Labeling Kit（Z-25360、Molecular Probes）を製造者の指示に従って用いて直接標識した。簡単に説明すると、キット中の成分A、B、及びCの5μlを1μgの一次抗体に別々に加え、続いてRTで5分間インキュベートした。次いで、5μlの成分Dを添加した後、RTで5分間インキュベートした。溶液を5％BSA-PBSで希釈し、暗所でRTで1時間ニューロンに適用した。ニューロンをマウス一次抗PSD95抗体で対比染色した後、Alexa Fluor 405標識二次抗体で対比染色した。Airyscan（ZEISS）を備えたLSM780共焦点レーザ走査顕微鏡を用いて画像を得た。
　共局在性（図１Ｉ）を解析するために、IMARISソフトウェアを用いた。IMARISスポット作成ウィザード（閾値：127.50）及びSpotsXTを使用して、スポット対象物をマルチチャンネル画像で生成する。大きさが0.30μm2を超える点状スポット（punctate spot）は陽性シグナルと定義した。定量化には、Pearsonの相関係数（PCC）を用い、スポットの共局在化の程度と共局在化パーセンテージを定量化した。
　表面NMDARクラスタ（図２Ｇ及び図７Ｄ）の数を測定するために、点状シグナルはEGFP標識スパインでPSD95シグナルと共局在し、その大きさが0.30μm2より大きいものをシナプス表面クラスタと定義した。10μm樹状突起におけるクラスタの密度を比較した。樹状突起APCの蛍光強度（図２Ｅ）にはImageJソフトウエアを用いた。
免疫組織化学
　図２Ｂにおける免疫組織化学のために、成体マウスを麻酔し、4％PFA-PBSで経心潅流した。脳を切開し、固定し、脱水し、凍結し、25μm厚切片にマイクロスライスした。切片を抗NR2A抗体と4℃で一晩インキュベートした後、Alexa Fluor 568二次抗体とRTで2時間インキュベートした。画像はLSM780共焦点レーザー走査顕微鏡（ZEISS）を用いて取得した。染色強度はImageJソフトウェアを用いて解析した。
組織学的研究
　成体マウスを麻酔し、4％PFA-PBSで経心潅流した。脳を解剖し、FEA溶液（70％エタノール、5％ホルマリン、5％酢酸）で後固定した。エタノールによる脱水後、組織をパラフィン包埋し、7μmの厚さで連続切片化した（HM-355；回転ミクロトーム）。脳切片の染色にはヘマトキシリン-エオジン（HE）法を用いた。観察及び定量のために立位光学顕微鏡LEICA DM3000に供した。肉眼的脳分析（図６Ｅ）のために、固定した脳を観察及び定量のためにLEICA Z6 APO顕微鏡に供した。
電気生理学
　出生後日（P）21～27のマウスから、既報（Morikawa et al. (2018) 前掲）のように急性解剖した海馬の横断切片（400μm厚）を作製した。切片を酸素添加切断液［15 mM KCl、130mM K-グルコン酸塩、0.05mM EGTA、20mM Hepes（pH 7.4）、25mM D-グルコース中］又は人工CSF（aCSF中に、119mM NaCl、2.6mM KCl、1.3mM MgSO4、1.0mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、2.5mM CaCl2、11mM D-グルコース中）で切断し、32.5℃のチャンバー中でインキュベートし、酸素添加aCSFと過融合させ、記録前に少なくとも60分間平衡化させた。1つの切片を浸漬記録チャンバーに移し、aCSFで連続潅流した。
　CA1錐体ニューロンにおける興奮性シナプス後電流（EPSC）をホールセルパッチクランプ法を用いて記録した。ピクロトキシン（100μM）をaCSFに慣用的に添加した。ピペットパッチ電極（2～8MΩ）に内液（122.5mMグルコン酸Cs、17.5mM CsCl、10mM HEPES、0.2mM EGTA、8mM NaCl、2mM Mg-ATP、0.3mM Na3-GTP、pH 7.2、300mOsm中）を充填した。2,3-ジオキソ-6-ニトロ-1,2,3,4テトラヒドロベンゾ［f］キノキサリン-7-スルホンアミド（NBQX、10μM）でAMPA電流を遮断することによりNMDAR媒介EPSCを単離した。保持電位の+40及び-90mVでのピーク振幅からNMDA/AMPA電流のレシオ測定を計算した。
　興奮性シナプス後場電位（fEPSP）を記録するために、刺激電極と記録電極の両方をCA1領域の放線層に配置した。刺激強度（試験パルス持続時間0.1ms）は、0.1Hzの周波数で約50％の最大fEPSPを誘発するように設定した。fEPSPの安定したベースラインを20分間記録した後、長期増強（LTP）又は長期抑制（LTD）を、強縮刺激（それぞれ1秒間の100Hz又は15分間の1Hz）により誘導した。
NR2A/NR2B分解アッセイ
　海馬ニューロンはDIV7～9で使用した。光活性化可能な（PA）-GFPをNR2A又はNR2Bに融合させて、CMVプロモーターによって駆動されるNR2A-PA-GFP又はNR2B-PA-GFP発現ベクターを作製した。非標識NR1及びNR2A-PA-GFP又はNR2B-PA-GFPを、前述のように修正Ca2+-リン酸トランスフェクション法を用いて、RFPとともに培養神経細胞に導入した（Jiang & Chen (2006) 前掲）。トランスフェクションの3～5日後に、生きているニューロンのNR2A又はNR2BPA-GFPを405nmレーザーで局所的に光活性化し、LSM780共焦点レーザー走査顕微鏡（ZEISS）を用いて488nm励起下で観察した。必要に応じて、ニューロンをMG132（10μM）で24時間前処理した。画像を1時間毎に取得し、各細胞を6時間観察した。
統計解析
　すべてのデータは平均±標準誤差で示し、対応のないスチューデントのt検定又は対応のあるt検定を用いて解析した。二元配置分散分析又はカイ二乗検定を用いて、多重比較の有意性を算出した。
（２）結果
KIF3分子モーターはNR2A及びAPCと相互作用する
　これまでに、NMDA受容体のNR2Bサブユニットが樹状突起において微小管に沿って分子モーターKIF17により輸送されることを報告している（例えば、Setou M, et al., Science 288: 1796-1802 (2000)）。
　NR2Aの輸送はKIF17の非存在下でも無傷であることが示されており、このことはNR2AがKIF17によって媒介される機構とは異なる機構によって輸送されることを示唆している。今回、マウス脳溶解物を用いて、NR2Aが抗KIF3B抗体により特異的に免疫沈降し（図１Ａ）、KIF3A、KIF3B、KAP3Aが抗NR2A抗体により特異的に免疫沈降することを見出した（図１Ｂ）。これらのデータは、KIF3A/KIF3B/KAP3複合体がNR2BではなくNR2Aと優位に相互作用することを示唆し、KIF3BがNR2Aを輸送することを提案している。また、KIF3B、KIF3A、KAP3A、NR2A、PSD95はいずれも抗APC抗体（図１Ｃ）により免疫沈降することが認められ、これらのタンパク質とAPCとの複合体としての相互作用が示唆された。Kif3b-/-変異マウスは10.5d.p.c.での致死性のため（Nonaka S, et al., Cell 95: 829-837 (1998)）、神経機能の解析に十分な水準を欠いていることから、本実施例の試験を通してKif3b+/-変異マウスを用いてKIF3Bの機能を調べた。
　Kif3b+/+マウスの培養海馬ニューロンを用いた免疫細胞化学により、KIF3B点（puncta）は樹状突起軸（図１Ｄ）及びPSD95陽性スパイン（図１Ｅ）においてAPC及びNR2Aと共局在することが示された。10μm Kif3b+/+樹状突起中のKIF3B、APC、及びNR2Aを含む共局在点の数は、KIF3B、APC、及びNR2Bを含む点よりも有意に多かった（図１Ｆ～Ｉ）。
KIF3Bは海馬ニューロンにおけるNR2A及びNR2Bのシナプス後局在に必須である
　Kif3b+/-マウス脳の粗抽出物のイムノブロッティングでは、Kif3b+/+脳と比較して、KIF3B、NR2A、NR2B、APC、PSD95の発現レベルの低下とβ-カテニンの発現レベルの上昇が認められ（図２Ａ）、NR2A、NR2BともにKIF3B機能の関与が示唆された。β-アクチン、α-チューブリン、KIF5Bのレベルは遺伝子型間で差はなかった（図２Ａ）。
　NR2Aの発現はKif3b+/-マウス脳の海馬CA1先端樹状領域で有意に減少しており、KIF3BがNR2Aのシナプス後局在に関与していることが示唆された（図２Ｂ）。
　そこで、培養した海馬ニューロンのセミ超高解像免疫細胞化学を用いて、NR2A、NR2B、APCの局在をさらに検討した。非透過条件で、EGFPと抗PSD95抗体でカウンター標識した樹状突起スパインの表面に位置するNR2A又はNR2B含有斑（patch）を明瞭に可視化した（図２Ｃ及びＤ）。Kif3b+/-樹状突起におけるこれらの斑の密度及びサイズは、Kif3b+/+対照樹状突起よりも有意に小さかった（図２Ｃ、Ｄ及びＧ）。このKif3b+/-ニューロンの表面NR2Aレベルの低下は、野生型培養海馬ニューロンを用いたKif3bノックダウン実験により再現された。透過条件下では、Kif3b+/-スパインのAPC発現レベルもKif3b+/+ニューロンより有意に小さかった（図２Ｅ～Ｇ）。
樹状突起におけるNR2AとNR2Bの動態におけるKIF3Bの役割
　Kif3b+/-ニューロンにおけるNR2A及びNR2Bの動態に起こりうる変化を調べるために、EGFP結合NR2A及びNR2BをそれぞれKif3b+/+培養海馬ニューロン及びKif3b+/-培養海馬ニューロンに導入し、タイムラプスライブイメージングにより観察した（図３Ａ～Ｆ）。NR2A-ECFP小胞の平均速度は減少したが、Kif3b+/-樹状突起ではNR2B-ECFP小胞の速度は変化しなかった（図３Ｂ及びＥ）。NR2A-ECFPで標識された順行性又は逆行性に移動する小胞の割合は、Kif3b+/-ニューロンで有意に減少したが、NR2B-ECFPの場合はほとんど変化しなかった（図３Ｃ及びＦ）。これらのデータは、KIF3BがNR2Bの輸送よりもNR2Aの輸送に関与することを示唆した。
　次に、Kif3b+/-ニューロンにおけるNR2A及びNR2Bのレベルが低下した理由を検討するため（図２）、光活性化可能な緑色蛍光タンパク質（PA-GFP）で標識したNR2A/2B発現ベクターを用いて、Kif3b+/+ニューロンとKif3b+/-ニューロン間のNR2A及びNR2Bの両方の安定性を比較した。
　NR2APA-GFP又はNR2B-PA-GFPを培養海馬ニューロンに導入し、0時における光活性化後、1時間ごとに樹状突起に沿ったクラスタ又は細胞体内のシグナル強度の変化を調べた（図３Ｇ～Ｎ）。Kif3b+/-樹状突起では、NR2B-PA-GFPクラスタの蛍光強度の減衰経時変化が有意かつ特異的に加速した（図３Ｇ～Ｊ）。この減衰はプロテアソーム阻害剤MG132の適用により阻害されたため、ユビキチン-プロテアソーム分解によるものと考えられた（図３Ｋ～Ｎ）。Kif3b+/-樹状突起におけるその加速は、NR2A、APC、及びPSD95などのNR2B結合パートナーの有意な低下に起因する分解経路への遊離NR2Bタンパク質の誤標的化によって説明される可能性がある（図２）。Kif3b+/-神経細胞体では、NR2A-PA-GFPシグナルの蛍光強度の減衰経時変化が有意かつ特異的に減速した。これは、Kif3b+/-神経細胞体に非輸送NR2Aが蓄積すると分解機構が飽和するためと考えられる。これらの考えられる機序により、Kif3b+/-ニューロンにおけるNR2A輸送の特異的低下は、それぞれのNMDA受容体の分解動態の部位特異的変化を異なった様式で提供する可能性がある。興味深いことに、NR2B輸送KIF17欠損ニューロンの場合には、これまで相補的な表現型が観察されており（Yin et al. (2011) 前掲）、この現象の普遍性と一貫性が保証された。
Kif3b+/-ニューロンのスパイン形態とシナプス機能の変化
　NR2A、NR2B、APCは樹状突起スパインの形態や機能と強固に関連していることから（例えば、Rao A, Craig AM, Neuron 19:801-812 (1997)）、KIF3B欠損がスパインの形態に及ぼす影響を検討した。我々は、EGFPをトランスフェクトした培養海馬ニューロンを調べ（図４Ｂ）、既報のようにスパインの形態を太型（stubby）、キノコ型（mushroom）、長細型（long-thin）、フィロポディア（philopodia）スパインに分類した（図４Ｂ）。Kif3b+/-ニューロンでは、太型スパインの密度は有意に減少したが、キノコ型スパインの密度はわずかに増加した（図４Ａ及びＢ）。キノコ型スパイン頭部上のスパイン数はKif3b+/-ニューロン樹状突起で有意に増加し、Kif3b+/-キノコ型スパインでも平均頭部の大きさと頸部の長さが増加した（図４Ｃ）。
　次に、電気生理学的解析を行い、Kif3b+/-変異マウスのシナプス機能に起こりうる変化を調べた。両遺伝子型の海馬の急性切片のシェーファ側枝CA1シナプスを試験した。NMDARを介した興奮性シナプス後電流（EPSC）は、NMDAとAMPA振幅の比率として表され、Kif3b+/-切片において有意に減少した（図４Ｄ）。NMDARチャネル電流の電流-電圧関係は、Kif3b+/+とKif3b+/-切片間で差はなかった（図４Ｅ）。興奮性シナプス後場電位（fEPSP）におけるシナプス可塑性の2種類のNMDAR依存型：長期増強（LTP）と長期抑制（LTD）を比較した。Kif3b+/-切片では、Kif3b+/+切片と比較してLTPの程度が増加し、LTDの程度が有意に減少した（図４Ｆ及びＧ）。このような活動依存的シナプス可塑性の変化パターン、すなわちLTPの高値とLTDの低値の組合せは、SCZの動物モデルにおいて既報の表現型と極めて類似していた。
Kif3b+/-マウスにおける統合失調症様行動異常
　Kif3b+/-ニューロンにおけるNR2Aの輸送の減少を伴うこれらの異常なニューロン可塑性の特徴のため、変異マウスの挙動を検討することにした。一連の行動解析を行った（図５）。オープンフィールド試験において、Kif3b+/+とKif3b+/-遺伝子型の間のソーシャルインタラクション頻度を比較した。Kif3b+/-マウスは、Kif3b+/+マウスよりも低い社会的活動（接触及び追跡）を示した。また、跳躍や回転活動などの探索行動や反復行動のレベルが高く、毛づくろいに多くの時間を費やしていたことから、運動亢進（locomotion hyperactivity）の存在が示唆された（図５Ａ）。高架式十字迷路試験では、Kif3b+/-マウスはKif3b+/+対照マウスよりもオープンアームではるかに長時間を費やし、不安の程度が低いことが示唆された（図５Ｂ）。Kif3b+/-マウスの社会的関心における障害をさらに確認するために、3チャンバー型のソーシャルインタラクション試験を実施し、Kif3b+/-マウスが再度より低い社会的関心レベルを示した（図５Ｃ及びＤ）。新規物体認識試験において、Kif3b+/-マウスはKif3b+/+マウスよりも新規物体への関心が低く、Kif3b+/-マウスの認知機能の変化が示唆された（図５Ｅ）。プレパルス抑制試験では、Kif3b+/+マウスとKif3b+/-マウス間で聴覚驚愕反応は類似していたが、Kif3b+/-マウスのプレパルスによる抑制の程度はKif3b+/+マウスよりも有意に小さかった（図５Ｆ）。バーンズ迷路試験では、Kif3b+/-マウスは脱出位置を記憶するのに時間がかかった（トレーニングセッションとプローブトライアルの5日目；図５Ｇ及びＨ）。しかし、いったん位置を認識すると、記憶は持続した（プローブトライアル12日目と29日目；図５Ｇ及びＨ）。このことは、Kif3b +/-マウスは空間記憶生成は障害されていたが、長期記憶は維持できたことを示唆している。逆バーンズ迷路試験では、Kif3b+/-マウスは脱出の新たな位置に到達するまでに有意に長い時間を要したことから、SCZの他のマウスモデルと一致して学習柔軟性が潜在的に低いことが示唆された（図５Ｉ及びＪ）。
Kif3b+/-マウスは統合失調症様の組織学的表現型を示す
　次に、組織学的検査を行った。脳の連続パラフィン切片を作製し、HE染色し、検査した。Kif3b+/-マウスの海馬CA3領域における脳梁（CC）及び放線層の厚さは有意に減少し（図６Ａ及びＢ）、これはSCZ及び知能障害のマウスモデルにおける既報の表現型と一致した。CA1、CA2、CA3領域の細胞密度は、Kif3b+/+とKif3b+/-遺伝子型の間で変化しなかった（図６Ｃ）。Kif3b+/+及びKif3b+/-マウスの全脳重量の発育プロファイルから、Kif3b+/-マウスでは発育初期に脳重量が低くなるが（図６Ｄ及びＥ）、生後14日以降は「刈り込み期（prunting period）」に脳重量が増加することが明らかになった（図６Ｄ）。この脳重量の発育プロファイルもSCZマウス脳と類似している。
Kif3b+/-ニューロンの異常成長円錐形態
　SCZ様行動及び組織学的特徴の細胞基盤を明らかにするために、両遺伝子型の海馬培養ニューロンを観察した。蛍光ファロイジン及び抗β3-チューブリン抗体をそれぞれ用いてF-アクチン及びβ3-チューブリンを検出した（図６Ｆ）。Kif3b+/-ニューロンにおける成長円錐の平均の大きさは、わずかではあるが有意に拡大していた（図６Ｇ）。成長円錐上のフィロポディアの数は、Kif3b+/-ニューロンで有意に減少した（図６Ｈ）。Kif3b+/-ニューロンでは、先導端（LE）と微小管ドメイン（MT）の周辺部との間の距離で表される成長円錐の幅が有意に短縮された（図６Ｉ）。これらの成長円錐表現型は、KIF3Bが軸索機能にも関与する可能性を示唆した。
ヒト統合失調症患者における変異KIF3Bはレスキューアッセイにおいて機能的に障害された
　エキソームシーケンスGeneBookデータベース（Fromer et al.、2014；Purcell et al、2014）を用いてヒトKIF3B関連遺伝子におけるSCZ特有の変異を探索し、C末端ドメインの欠失を伴うKIF3Bコード領域における著しいArg654Terナンセンス変異並びにKIF3A、KAP3及びNR2A遺伝子におけるSCZ特有の変異を同定した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このKIF3B変異は、スウェーデンの症例対照研究（Purcell et al. (2014) 前掲）では、SCZ患者2000例中1例のみでヘテロ接合で同定されたが、正常対照2000例では同定されなかった。この突然変異は、Exacデータベースからのスクリーニングを受けていない対照119,956例のうち1例のみに存在し、Tommoデータベースからのスクリーニングを受けていない対照約3000例のいずれにも存在しなかったことから、非常に稀であると思われ、この変異がSCZ患者集団の一部において病因に影響を及ぼしうることが考えられた。
　SCZ様表現型におけるこのKIF3B変異の生理学的関連性を確認するために、両遺伝子型の培養海馬ニューロンを用いて、スパイン形態と表面NR2Aレベルのレスキュー実験を行った（図７Ａ～Ｄ）。
　まず、Kif3b+/-及びKif3b+/-ニューロンの樹状突起スパインを、トランスフェクションの2～3日後に観察した（図７Ａ及びＢ）。KIF3B-EYFPトランスフェクションは両遺伝子型においてEmpty-EYFPトランスフェクションと比較して40μm樹状突起に沿ったスパイン数を有意に増加させた。しかしながら、Arg654Terナンセンス変異を有するKIF3Bmut-EYFP発現ベクターは、Kif3b+/-ニューロンの総スパイン数をレスキューせず、また、Kif3b+/+ニューロンの総スパイン数をさらに減少させた（図７Ｂ）。特に、大部分が機能的に成熟している太型（stubby）スパインは、KIF3B欠損により有意に減少した。これは再びKIF3B-EYFPによってレスキューされたが、KIF3Bmut-EYFPによってはレスキューされなかった。
　次に、免疫蛍光顕微鏡を用いてNR2Aの表面発現を調べた（図７Ｃ及びＤ）。40μm樹状突起に沿ったNR2A陽性クラスタの密度とサイズは、KIF3B欠損ニューロンで有意に減少した。この表現型はKIF3B-EYFP発現によってレスキューされたが、Empty-EYFP又はKIF3Bmut-EYFP発現によってはレスキューされなかった（図７Ｄ）。
　したがって、KIF3Bmut-EYFPは、Kif3b+/-ニューロンにおけるスパインの形態又はNR2Aの表面レベルを十分に回復させることができなかったことから、SCZ患者におけるこのヒトKIF3B変異は、シナプス後部におけるSCZを引き起こす機能的欠損をもたらしうることが示唆される（図７Ｅ）。これらのデータは総合的に、KIF3BがNR2A複合体をシナプス表面に輸送し、KIF3B活性の消失によるこの輸送の欠損が、SCZにおけるスパインの機能不全、シナプス可塑性の障害、神経精神障害をもたらすことを示唆した（図７Ｆ）。
（３）考察
KIF3複合体によるNR2A複合体の輸送
　微小管に沿ったグルタミン酸受容体の細胞内輸送は、学習・記憶のためのシナプス可塑性を維持するための基本的なプロセスである。このプロセスは微小管に基づく分子モーター複合体によって行われる。例えば、分子モーターのKIFファミリーのメンバーであるKIF17含有タンパク質複合体は、NR2B含有小胞を輸送することが報告されている（例えば、Setou et al. (2000) 前掲）。さまざまな分子モータータンパク質がどのように協調してNMDA受容体のさまざまなサブユニットの輸送の基礎を形成できるのかはよくわかっていない。KIF17の機能喪失はNR2Bの輸送に障害をもたらすが、NR2Aの輸送には障害をもたらさないことから、別の分子モーターがNR2Aを輸送している可能性が示唆される。今回の研究では、KIF3BがNR2A、APC、PSD95と多分子複合体を形成することを示した（図１）。KIF3Bレベルが低下すると、NR2Aの輸送が変化する（図２）。興味深いことに、KIF3Bの欠損も、NR2AのKIF17ノックアウト加速分解と同様に、NR2Bの代謝回転を変化させる（図３）。Kif3b+/-樹状突起ではNR2Bの減衰（decay）が有意に促進された（図３Ｊ）。
　ここでは、KIF3-NR2A輸送複合体を構成する分子間の相互作用の可能性について示す（図１Ａ～Ｆ）。KIF3Bは、KIF3A及びKAP3とヘテロ三量体を形成する。KAP3はarmadilloリピートを介してAPCと相互作用し、APCはPSD95-NR2A複合体の結合パートナーであることが報告されている。本実施例のデータは、このタンパク質複合体が樹状突起の微小管に沿ったKIF3BモーターによるNR2Aの輸送の基礎であることを示唆している（図７Ｅ）。
統合失調症（SCZ）スペクトラム障害及びKif3b変異マウス
　SCZ患者のゲノムに見出された変異に基づく遺伝子工学により、様々なSCZモデルが作製されている（例えば、Jones CA, et al., Br J Pharmacol 164: 1162-1194 (2011)）。Kif3b+/-変異マウスは、行動学的、組織学的、電気生理学的実験により明らかにされたように、SCZ患者及びそれらのマウスSCZモデルと一致した表現型を有する。Kif3b+/-変異マウスは、SCZの一連の行動特性を示した。すなわち、聴覚驚愕反応のプレパルス抑制の低下（図５Ｆ）、ソーシャルインタラクションのレベル低下（図５Ａ、Ｃ及びＤ）、反復行動のレベル上昇（図５Ａにおける毛づくろい及び回転）、及び不安のレベル低下（図５Ｂ）。バーンズ迷路の逆学習版では、これらのマウスは学習柔軟性の低下を示し、SCZの表現型も模倣していた。組織学的には、Kif3b+/-マウスでは海馬CA3領域の脳梁及び放線層の厚さが減少していた（図６Ａ及びＢ）。これらの組織学的特徴は、SCZの他のマウスモデルで報告されている。また、脳発達の刈り込み期におけるKif3b+/-全脳の過剰な体重増加は、シナプス刈り込みの障害によるSCZの脳発達異常に類似している。
　ヒトエクソーム配列におけるSCZ特有の変異のデータベース検索によれば、KIF3Bはナンセンス変異（p.Arg654Ter）を有していることが判明した。このKIF3B変異タンパク質の機能的欠陥は、スパイン数及び形態（図７Ａ及びＢ）並びに表面NR2A発現（図７Ｃ及びＤ）のレスキューアッセイによって明らかにされ、ヒトSCZ病因の原因としてのこの突然変異の実験的証拠を提供する。
Kif3b+/-マウス脳における分子病態
　Kif3b+/-マウスにおけるSCZ様表現型の原因に関して疑問が残った。これは、Kif3bハプロ不全がNR2Aのシナプス後膜への輸送の欠陥をもたらすことを示した最初の研究の1つである（図２Ｂ～Ｄ及び図３Ａ～Ｄ）。Kif3b+/-ニューロンの分子病態の一つの顕著な特徴は、シナプスNR2Aレベルの低下であり、NMDARの反応低下や、シナプス可塑性、LTP及びLTDのNMDA受容体依存形態の調節異常の一因と考えられている。Kif3b+/-海馬切片では、LTPレベルはアップレギュレートされ、LTDレベルはダウンレギュレートされることがわかった（図４Ｄ～Ｆ）。海馬CA1におけるこの種のLTP及びLTDの変化は、SCZの他の多くの動物モデルで報告されている。高頻度刺激により誘導されるLTPは、Shank2Δex7変異マウス脳でアップレギュレートされる。低頻度刺激により誘導されるLTDは、Mecp2ノックアウトマウス及びTsc2+/-ラットにおいてダウンレギュレートされている。DHPGにより誘導されるLTDは、Tsc2+/-マウスにおいてもダウンレギュレートされることが示されている。このシナプス可塑性の調節異常は、これらのSCZモデル動物における統合失調症行動表現型の病態生理学的基礎を表すはずである。
　Kif3b+/-マウスの第2の特徴はAPC複合体の機能の変化であり、Kif3b+/-マウス脳ではAPCレベルが低下し、βカテニンレベルが上昇した（図２Ａ、Ｅ、Ｆ）。APC/βカテニン複合体は、Wntシグナル伝達経路の必須の調節因子であり、ニューロン回路の形成に重要である。最近、Wntシグナル伝達成分とSCZとの関連が明らかにされている。これまでの研究では、標準的なWntシグナル伝達を上昇させる皮質のβカテニンの安定化が、神経前駆細胞のサイクリングの亢進と有糸分裂後ニューロンの産生による脳の過成長につながることが示されている。このように、本実施例は、SCZ病因に副次的に影響する可能性がある、KIF3媒介輸送を介したNR2AとWntシグナル伝達の間の新たなクロストーク機構を提供する。
　したがって、本発明者の研究は、遺伝的変異（表１）又はエピジェネティック機構若しくは翻訳後修飾などの他の因子を介したKIF3機能不全による新たなSCZ発症機構を提案しており、その分子機構としてNR2A輸送欠損が関与している可能性が高かった。キネシンスーパーファミリータンパク質分子モーターのカーゴ輸送活性がどのように高次脳機能とその病態を調節するかを明らかにすることは非常に驚くべきことであり、本実施例はこの疑問に近づくための良好で刺激的な枠組みを提供する。
［実施例２］KIF3に基づくCRMP2輸送の補償による統合失調症様表現型の改善
（１）材料及び方法
ヒト死後脳
　死後脳サンプル分析は、東京大学（#G10017）、福島県立医科大学（#1685及び2381）、理化学研究所（#wako3 2019-2）、新潟大学（G2015-827）、免疫生物学研究所の倫理委員会の承認のもとに実施した。SCZ患者並びに年齢及び性別を一致させた対照被験者由来のブロードマン領野10及び22の死後脳組織を、精神医学研究のための福島の死後脳バンク及び日本の新潟大学脳研究所（対照は合計n = 30、SCZはn = 24）から以前に記載されているように入手した（Ohnishi, T. et al., Ebiomedicine 45, 432-446 (2019)）。各SCZ患者はDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（DSM-IV）により診断され、他の神経障害や物質乱用の病歴はなかった。対照被験者については、精神神経障害又は物質乱用の既往はなかった。
マウス
　すべての動物実験は、東京大学医学部動物実験委員会（#MP15-118）及び理研（#H29-2-204）の承認の下、東京大学の動物実験制限の下で雄マウスを用いて実施した。Kif3bノックアウトマウスは、既報（Nonaka, S. et al., Cell 95, 829-837 (1998)）のように、C57BL6/Jバックグラウンド（CLEA Japan）において、14時間明/10時間暗のサイクル下で食物及び水を自由に摂取できるようにして、特定の無病原体環境下で維持した。
　Lifeact-mRubyマウス（Riedlら、2010）はMichael Sixt及びRoland Wedlich-Soldner（マックスプランク生化学研究所、ドイツ）により提供を受け、Kif3b+/-系統と交配した。高ベタイン飼料（HBD）投与のために、0.2％(w/w)ベタイン（Wako）を添加したCE-2ペレットを特異的に調製し（CLEA Japan）、4週齢で離乳後マウスに自由に給餌した（図８Ａ及び８Ｂ）。
ヒトiPS細胞
　GLO1+/+及びGLO1-/-ヒトiPS細胞については既報のとおり（Toyoshima, M. et al., Life science alliance 2, e201900478 (2019)）であり、理化学研究所倫理委員会（#Wako-daisan 25-14）の承認のもとに解析を行った。
ヒト死後脳分析
　BA10及び22の脳溶解物を、既報のとおりに（Nagaoka, A. et al., Journal of Psychiatric Research 123, 119-12 (2020)）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Calbiochem）及びPhosSTOPホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加したN-PER（#87792、Thermo Fisher）を用いて調製し、その後4℃で40,000×gで30分間遠心して清澄化した。KIF3A及びKIF3Bのタンパク質レベルは、基本的には既報のとおり（Crowther, J.R. (2001). The ELISA guidebook. (Springer Science & Business Media)）、直接ELISA法により定量した。
　GAPDHタンパク質レベルは、抗GAPDHモノクローナル抗体（Abnova）と抗GAPDHモノクローナル抗体HRP-DirecTを用いたサンドイッチELISA法により、わずかに修正した製造業者のプロトコールに従って定量し、正規化対照とした。
血漿及び行動解析
　血漿ベタイン濃度の測定には、ヘパリンで麻酔したマウスから午前8～10時に全血を採取し、1.0mg/mlのEDTA-2Na（1000×g、20分、4℃）の存在下で遠心して血漿を分離し、既報のようにLC/MS測定に供した（大西ら、2019）。
　行動解析には、10週齢の雄マウスを用い、実施例１及び既報（Morikawa et al. (2018) 前掲）のとおり以下の試験を実施した。オープンフィールド試験のために、マウスを新規の長方形ボックス（52×39cm）の中心に置いた。それらのトレースを10分間ビデオ録画し、EthoVision XT 11.0ソフトウェア（Noldus Information Technology）で定量した。
　高架式十字迷路試験のために、マウスを2つのオープンアームと中央プラットホーム（6×6cm）から伸びた2つの閉じたアーム（27×6cm）を備えた新規交差ボックスの中央に配置し、5分間ビデオテープに録画した。トレースは、オープンアームへの侵入回数及びそこに滞在した時間について手動で定量化した。相互性ソーシャルインタラクション試験のために、同じ遺伝子型の2匹の雄の見知らぬマウスを、新しい長方形ボックス（30×16.5cm）の中心に配置した。それらのトレースを10分間ビデオ録画し、Icyソフトウェア（de Chaumont, F. et al.,Nat Methods 9, 690-696 (2012)）で定量した。
　3チャンバーソーシャルインタラクション試験のために、長方形ボックスを空のマウスゾーン、中央ゾーン、及び見知らぬマウスゾーン（18×39cm）に分け、そこで10週齢のC57B6/J雄マウスを見知らぬものとして配置した。被験マウスを中央ゾーンに配置し、10分間のトレースをEthoVision XT 11.0ソフトウェアで定量した。聴覚驚愕反応（ASR）とプレパルス抑制（PPI）試験のために、マウスをプレパルス聴覚刺激の標準プロトコルに供し、驚愕反応の振幅を既報のように測定した（Maekawa et al. (2010) 前掲）。PPIのパーセンテージは［（パルス振幅-プレパルス振幅）/パルス振幅］×100で算出した。平均値±2×標準誤差を超える振幅はいずれも定量から除外した。
脳組織学
　ゴルジ-コックス染色のために、11週齢マウスを麻酔し、ラットリンゲル［156mM NaCl、5.4mM KCl、5mM Hepes、10mMグルコース、4mM EGTA、6mM MgCl2、0.5mM NaH2PO4］で潅流した。脳を解剖し、製造元のプロトコールに従い、スーパーゴルジキット（Bioenno Lifesciences社）を用いてゴルジ-コックス染色を行った。次に、マイクロスライサーDTK-1000（Dosaka-EM）を用いて、前頭前野に相当する吻側-尾側ブレグマ1.10mmと1.30mmの間の厚さ100μmで冠状断し、40×/0.75 PlanApochromat（Leica）対物レンズを用いたDM 3000顕微鏡（Leica）又は20×/0.75 PlanApochromat（Keyence）対物レンズを用いたBZ-X700顕微鏡（Keyence）で撮影した。
細胞培養
　海馬ニューロンの初代培養は、基本的に既報のとおり作製した（例えば、Ichinose, S. et al., Neuron 87, 1022-1035(2015)）。E17.5の培養海馬ニューロンを10％ウマ血清、1mMピルビン酸、0.6％グルコース、及び2mM GlutaMAX（Gibco）を添加したMEM（Gibco）0.3ml中で1.5×104細胞/ウェルの密度でポリエチレンイミンとポリ-L-リジンでプレコートした8ウェルチャンバーカバーガラス（Nunc）上に5％CO2雰囲気中で平板培養した。3～4時間のインキュベーション後、培地を1mMピルビン酸、0.6％グルコース、2mM GlutaMAX、及び2％B27（Gibco）を添加したMEMに置換した。錐体ニューロンは形態と抗Prox1免疫染色における陰性により選択し、解析に供した。
　皮質ニューロンの初代培養を、以前に記載されているように実施した（Ichinose, S. et al.,. Cell Reports 28, 2413-2426 (2019)）。薬理学的処置のために、500μMのベタイン（Wako）、500μMのピリドキサミン（Sigma-Aldrich）、及び200μMのグリオキサール（Wako）を、平板培養後の最初の24時間の間、それぞれ培養培地に添加した。
抗体と蛍光ファロイジン
　ウサギ抗KIF3Bポリクローナル抗体は、以前に記載されている（Yamazaki, H. et al., Journal of Cell Biology 130, 1387-1399 (1995)）（RRID:AB_2715472）。
　抗KIF3Aモノクローナル抗体（1:500、BD Transduction Laboratories、#611508、RRID:AB_398968）、抗MAP2ポリクローナル抗体（1:200、Abcam、RRID:AB_2138153）、抗Prox1モノクローナル抗体（1:2,000、Millipore、MAB5654、RRID:AB_2170714）、抗CRMP2モノクローナル（1:50,000、Abcam、ab129082、RRID:AB_11154701）、抗β-アクチンモノクローナル抗体（1:2,500、Sigma-Aldrich、AC15-A5441、RRID:AB_476744）、抗CMLモノクローナル抗体（1:200、Trans Genic、KH001、RRID: AB_1964188）、イムノブロッティング用抗GAPDHモノクローナル抗体（1:2500-10,000、Wako、5A12、RRID:AB_2814991）、Alexa-488結合抗α-チューブリンモノクローナル抗体クローンDM1A（1:1,000、Abcam、ab195887、RRID:AB_2241126）、抗GAPDHモノクローナル抗体（Abnova、H00002597-AP51、RRID:AB_10549815）、ELISA用抗GAPDHモノクローナル抗体-HRPDirecT（MBL、M171-7、RRID:AB_10699462）、正常ウサギIgG（Cappel/ICN/MP、#55944、RRID:AB_2334717）、正常マウスIgG（Thermo Fisher Scientific、#02-6502、RRID:AB_2532951）、Alexa Fluor 405-、568-及び647結合ヤギ抗マウス、ウサギ及びニワトリIgG抗体（1:1,000、Thermo Fisher、A-31553、RRID:AB_221604；A-11004、RRID:AB_2534072；A-11036、RRID:AB_10563566；A-11039、RRID:AB_2534096；A-21245、RRID:AB_2535813）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗マウス及びウサギIgG抗体（1:10,000、GE Healthcare、#NA931V、RRID:AB_772210；#NA934V、RRID:AB_772206）、抗ウサギ及びマウスIgG (H+L) ヤギ Fab’-HRP（125ng/ml、IBL、#17502、RRID:AB_494707；#17508、RRID:AB_494709）、並びにAlexa-Fluor 488及び568結合ファロイジン（1:200-1,000、Thermo Fisher、A12379及びA12380）を製造業者から市販品として入手した。
発現及びノックダウンベクター
　CRMP2-ECFP及びKIF3B-TagRFP哺乳動物発現ベクタープラスミドを得るために、それぞれの全長のマウスcDNAをpECFP-C1（Clontech）及びpTagRFP-N1（Evrogen）ベクターに連結し、エンドトキシン不含のプラスミドDNA精製キット（MACHEREY-NAGEL）を用いて調製した。
　大腸菌における組換えCRMP2タンパク質発現のために、CRMP2-pET-21bベクターを以前に記載されたように構築した（Toyoshima et al. (2019) 前掲）。
　標的配列CATGATCATTGACCATGTTGT（配列番号9）を含むmiRNAベースのマウスCRMP2ノックダウンベクターを設計し、BLOCK-iT RNAi Designerツール（Thermo Fisher Scientific）とBLOCK-iT Pol II miR RNAi発現ベクターキット（Thermo Fisher）からのpcDNA6.2-GW/miRベクターを用いて調製した。ノックダウン効率を免疫蛍光顕微鏡で検証した。
　酵母ツーハイブリッドについて、マウスKif3a（アミノ酸369～701、アミノ酸600～701）及びKif3b（アミノ酸470～747、アミノ酸592～747）cDNA断片をPCR法によりそれぞれ増幅し、pGBKT7ベクター（Takara Bio）にベイトとしてライゲーションし、CRMP2（アミノ酸1～249、アミノ酸312～572）cDNA断片をPCR法により増幅し、pGADT7ベクター（Takara Bio）にプレイとしてライゲーションした。
海馬ニューロンのトランスフェクションと形質導入
　ノックダウン及び過剰発現実験のために、培養ニューロンを、DIV0において既報のようにアデノウイルスで形質導入するか（Tanaka, Y. et al., Neuron 90, 1215-1229 (2016)）、又はDIV0において製造業者のプロトコールに従いNeonトランスフェクションシステム（Thermo Fisher Scientific社）を用いてプラスミドエレクトロポレーションでトランスフェクトし、DIV3において表現型を分析した。エレクトロポレーションのために、1μgの哺乳動物発現ベクタープラスミドを、Neonバッファー［25mM Hepes（pH 7.4）、2mM EGTA、5mM MgCl2、250mMトレハロース、2mMグルタチオン、5mMリン酸カリウム、2mM ATP、1％DMSO]中の1×105個のニューロンと混合し、混合物を10μlNeonチップ中にロードした。次いで、エレクトロポレーションを1パルス、1,400 V、20msのパルス幅で行った。
蛍光顕微鏡
免疫蛍光顕微鏡法：
　免疫蛍光顕微鏡検査は、基本的に既報のとおり実施した（Ichinose et al. (2015) 前掲）。DIV1～3の一次海馬ニューロンを4％パラホルムアルデヒド（PFA）/リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で20分間室温（RT）で固定し、0.1％Triton X-100で2分間（MAP2の場合）又は3分間（アクチン、CRMP2及び4重染色の場合）透過処理した後、4％スキムミルク/PBS（MAP2の場合）又は1％ウシ血清アルブミン（BSAの場合；Roche）/PBS（アクチン、CRMP2及び4重染色の場合）で室温（RT）で30分間ブロッキングした。
　次に、一次抗体をブロッキングバッファー（MAP2の場合）又はCan Get Signal溶液1（TOYOBO；アクチン、CRMP2及びフルコロレド染色の場合）でRTで1時間（MAP2）又は4℃で一晩（アクチン、CRMP2及び4重染色）インキュベートした後、RTで5分間、PBSで3回洗浄し、二次抗体及び/又は蛍光ファロイジンをブロッキングバッファー（MAP2）又はCan Get Signal溶液2（TOYOBO；アクチン、CRMP2及び4重染色）でRTで1時間、場合によりAlexa-488結合抗α-チューブリン抗体（Abcam）で1時間インキュベートした。Airyscan検出器と40×/1.3又は63×/1.4 PlanApochromat対物レンズ（ZEISS）を搭載したLSM780又はLSM880共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた。
STED顕微鏡法：
　DIV1における培養海馬ニューロンを半カルノフスカイ固定液中でRTで20分間固定し、PBS中0.1％TritonX100でRTで3分間透過処理し、1％BSA/PBSでRTで30分間ブロッキングし、Can Get Signal溶液2中でAlexa-488結合ファロイジン（1:200）とともにインキュベートし、東京大学IRCNで誘導放出抑制（STED）顕微鏡（Leica、FALCON）に供した。
ニューロンのラメリポディアのライブイメージング：
　細胞膜のライブイメージングのために、培養海馬ニューロンに50 nMのカルセインAM（DOJINDO）を37℃と5％CO2で30分間負荷し、培地で2回洗浄し、10秒ごとに10分間追跡した。細胞骨格のライブイメージングのために、Lifeact-mRuby発現ニューロンを、場合により、EB1-YFPをコードするアデノウイルスで形質導入し（Nakata, T., and Hirokawa, N., Cell Biology 162, 1045-1055 (2003)）、10秒ごとに10分間追跡した。Airyscan検出器と63×/1.4PlanApocramat対物レンズ（ZEISS）を備えたLSM780共焦点レーザ走査顕微鏡により画像を得た。
近接ライゲーションアッセイ：
　近接ライゲーションアッセイのために、DIV1での海馬培養物を、マウス及びウサギ一次抗体による二重免疫細胞化学として4℃で一晩処理した。それらは基本的にメーカーのプロトコルに従ってDuolink in situ PLAキット（Sigma）により処理し、Airyscan検出器と63×/1.4 PlanApochromat対物レンズ（ZEISS）を備えたLSM780共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
細胞形態学的定量化
神経突起の分枝の程度の測定：
　錐体ニューロンについては、http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html（コンピュータ神経生物学と画像診断マウントシナイ医科大学センター（CNIC））からダウンロードしたNeuronStudioソフトウエアを用いてSholl解析を実施した。
1605520914182_0.html
　iPS由来神経細胞については、細胞あたりの分枝点数を手動で計測した。結果はWelchのt検定で統計学的に検定した。データは平均± S.D又はSEMとしてプロットした。
ラメリポディア動態の測定：
　ラメリポディアの単一位置での垂直変位を10秒毎に10分間手動で測定し、平均二乗部をグラフで示した。また、各方向における10秒の平均変位をそれぞれ計算した。
アクチン束密度の測定：
　ラメリポディアのμm幅当たりのアクチン束の数を手動で計数した。
アクチン動態の形態学的測定：
　ラメリポディアのμm幅当たりのアクチン束折りたたみ現象の数を、10秒ごとに手作業で10分間計数した。
EB1浸潤率の測定：
　Lifeact-mRuby及びEB1-YFP共発現海馬ニューロンのライブイメージングを10秒毎に10分間行った。すべての画像を積み重ね、Image Jソフトウェア（NIH）を用いて、ラメリポディア縁からのそれぞれの周辺3μm幅面積に対する相対的EB1占有面積について測定した。
周辺部CRMP2強度の比較：
　DIV1の海馬ニューロンを抗CRMP2抗体で染色し、Image Jソフトウェアを用いて、平均野生型レベルで正規化した、ラメリポディア端から1μm幅の領域のCRMP2強度の相対量を測定した。平均±2×標準誤差を超えるサンプルは定量から除外した。
走査型電子顕微鏡（SEM）：
　ラメリポディアF-アクチンのSEMは、基本的に既報（He, Y.P. et al., Molecular biology of the cell 26, 3229-3244 (2015)）と同様に行った。DIV1の培養海馬ニューロンを、RTで45秒間、Membrane Extraction Buffer [80mM PIPES (pH 7.9）、1mM MgCl2、5mM EGTA、4％ポリエチレングリコール（MW 35kDa）、1 μMファロイジン、1％Triton X-100］で抽出し、RTで半カルノフスキー固定液で20分間固定し、0.15 Mカコジル酸バッファー中の2％タンニン酸でRTで20分間、0.15 Mカコジル酸バッファー中の1％OsO4でRTで1時間かけて後固定した。サンプルをエタノール系列で脱水し、臨界点乾燥し、3～7nm厚の白金によるイオンスパッタリングを行い、GeminiSEM 300顕微鏡（ZEISS）による観察に供した。
生化学
酵母ツーハイブリッド結合アッセイ：
　Gal4 Two-Hybrid system 3（Takara Bio）を用いて、既報のように酵母ツーハイブリッドを行った（Takeda et al. (2000) 前掲）。両ベクターをY187株にトランスフェクトした後、細胞を色選択プレート上で増殖させた。
免疫沈降（IP）：
　IPは、基本的に既報のとおり施行した（Ichinose et al. (2019) 前掲）。簡単に説明すると、ポッターホモジナイザーを用いて、cOmplete Mini EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）及びPhosSTOPホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むIPバッファー［50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％Triton-X 100］でマウス全脳をホモジナイズし、4℃で1000×gで10分間、4℃で10,000×gで15分間、4℃で100,000×gで30分間の一連の遠心分離でS3画分を調製した。抗体5μgと混合して4℃で1時間インキュベートした。次いで、混合物をプロテインAセファロースビーズ（GE Healthcare）によって4℃で30分間捕捉した。続いて、ビーズを2回洗浄し、2×サンプルバッファーで98℃で5分間溶出し、イムノブロッティングに供した。
イムノブロッティング：
　培養ニューロン溶解物をサンプリングするために、DIV1の皮質ニューロンを処理し、10％TCAで摩砕し、4℃で30分間15,000rpmで遠心分離した。その後、サンプルバッファーで溶出し、98℃で5分間煮沸した。定電流20mAの10％又は7.5％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。ゲルを、200mAの定電流で30分間、半乾燥ブロット装置を用いてImmobilon-P膜（Merck Millipore）に移した。TBS-T中の1％BSAで膜をブロッキングし、適当な一次抗体とともにCan Get Signal溶液1でRTで1時間インキュベートした。それらを洗浄し、Can Get Signal溶液2でRTで1時間にわたり適切な二次抗体とともにインキュベートし、再度洗浄した。メーカーのプロトコールに従い、増強ECLプライムキット（GE Healthcare）とImageQuant LAS4000 Mini画像解析装置（GE Healthcare）を用いて、化学発光法でシグナルを可視化した。
HiRes-SECアッセイ：
　HiRes-SECアッセイは、AKTAピュアシステム（GE Healthcare）において2つのSuperdex 200 Increase 10/300カラム（GE Healthcare）から成る縦列連結カラムを用いて、既報のように実施した（例えば、Ogawa, T., and Hirokawa, N., Biophysical reviews 10, 299-306 (2018)）。評価のために、アッセイバッファー［20mM PIPES pH 6.5、200mM KCl、1mM MgCl2］を含むカラムにマウス脳溶解物S3画分をロードした。溶出画分をドットブロットにより分析した。ポリフッ化ビニル膜上にドットし、RTで乾燥した。次に、TBS-T中の4％スキムミルクでRTで30分間膜をブロッキングし、TBS-T中の4％スキムミルク中の抗CRMP2抗体と4℃で一晩インキュベートした。3回洗浄し、TBS-T中4％スキムミルク中で適当な二次抗体とともにRTで1時間インキュベートし、再度洗浄した。増強ECLプライムキットとImageQuant LAS4000 Mini画像解析装置を用いて、メーカーのプロトコルに従い、化学発光法でシグナルを可視化した。各ドットシグナルの強度はImageJソフトウェアにより定量化した。
アクチン結合アッセイ
濁度アッセイ：
　ブタ心筋のアセトン粉末からアクチンを抽出し、既報のように精製し（Pardee, J.D., and Spudich, J.A., Cell Biology 24, 271-289 (1982)）、AKTAピュアシステムを用いて脱塩した。未修飾CRMP2及びAGE修飾CRMP2タンパク質は、それぞれ既報のとおり調製した（Toyoshima et al. (2019) 前掲）。20μM G-アクチンをG-バッファー［2mM Tris-HCl pH 8.0、0.1mM CaCl2、0.2mM ATP、1mM DTT]中で0、10、20、40μM CRMP2又はAGE-CRMP2と混合した。F-バッファー［20mM MgCl2、1M KCl］の1/10容量を加え、反応混合物の200μlを350nm波長での吸収についてFP-777Win分光蛍光計（JASCO）において37℃で140秒ごとに12,000秒間モニタリングした。
　ピレン重合アッセイアクチン重合アッセイは、以前に記載されたように基本的に行われた（Cooper, J.A., et al., Journal of Muscle Research and Cell Motility 4, 253-262 (1983)）。5μMの10％ピレン標識G-アクチンを、20μMの未修飾CRMP2又はAGE修飾CRMP2の存在下又は非存在下で、1/10容量のF-バッファーを添加したG-バッファー中で重合した。ピレン蛍光の増加を、FP-8600分光蛍光計（JASCO；365nmでの励起と407nm波長での発光）でRTで30秒ごとに2000秒間モニターした。
共沈アッセイ：
　アクチン-CRMP2共沈アッセイは、基本的に既報（Mische, S.M. et al., Journal of Cell Biology 105, 2837-2845 (1987)）と同様に実施した。G-アクチンは、37℃で1.5時間、0.2mM ATPと1mM DTTを含むF-バッファー1/10容量の添加により重合した。5μM F-アクチンは、20mM Hepes pH 7.25、110mM KCl、2mM MgCl2、及び10mMイミダゾールpH 7.0からなるバッファー中で、示した濃度の非修飾又はAGE修飾CRMP2タンパク質と27℃で30分間インキュベートした。各濃度について3つの独立したアッセイを行い、反応サンプルを100,000×gで30分間遠心し、その後SDS-PAGE分析用に処理した。上清及びペレット中のタンパク質濃度は、Image Jソフトウェアを用いてCBB染色ゲルのデンシトメトリーにより定量した。結合タンパク質量を非結合タンパク質量の関数としてプロットし、結合方程式にPrism7ソフトウェア（GraphPad Software）を用いて1部位モデルを当てはめた。
TIRF顕微鏡を用いたフィラメント束化アッセイ：
　TIRFイメージのために、サンプル調製は、基本的に既報（Harris, E.S. et al., Journal of Biological Chemistry 281, 14383-14392 (2006)）と同様に実施した。重合バッファー［2mM Tris-HCl (pH 8.0）、1mM MgCl2、0.2mM ATP、1mM DTT、100mM KCl、1mM EGTA、10mMイミダゾール］中で4μM G-アクチンをRTで1時間重合した。16μMの未修飾CRMP2、AGE修飾CRMP2、又はBSA対照のいずれか10μlを、10μlのアクチンフィラメントと軽くフリッキングすることによって混合した。蛍光ファロイジン（最終1μM）を含有する20μlの重合バッファーを添加した後、サンプルを直ちに1mlの蛍光バッファー［4mM MgCl2、0.1mM DTT、25mM KCl、1mM EGTA、25mMイミダゾール、0.5％メチルセルロース、15mMグルコース、100mg/mlグルコースオキシダーゼ、20mg/mlカタラーゼ］で希釈した。反応混合物は、観察チャンバーを用いてTIRFモードでELYRA P.1システム（ZEISS）を用いて観察した。アクチンフィラメントを領域（1μm×2.5μm）でランダムに観察し、F-アクチン束の長さと平均強度をそれぞれImage Jソフトウェアを用いて測定した。統計解析はPrism 5ソフトウェア（GraphPad Software）を用いて行った。
定量化と統計解析
　図中の値は、それぞれ図の脚に示されているように、平均値±標準誤差又は標準偏差を表している。すべてのサンプルサイズ及び統計的有意水準は、片側Welchのt検定又はDunnの多重比較によるクラスカル・ウォリス（Kruskal Wallis）で算出した、それぞれの図の説明に記載した。統計解析にはGraphPad Prism 5又は7ソフトウエアを用いた。
（２）結果
Kif3b+/-マウスのSCZ様行動表現型は高ベタイン食により軽減される
　Kif3b+/-マウスモデルを用いて、カルボニルストレスとKIF3モーター欠損の関連性を検討することを試みた。カルボニルストレススカベンジャーであるベタインがKif3b+/-マウスのSCZ様表現型を解消できるかどうかを調べるために、通常のCE-2飼料の成分に0.2％ベタイン（トリメチルグリシン）を補給して高ベタイン飼料（HBD）のペレットを調製し、このベタイン含量は通常飼料の約3倍になった。Kif3b+/-マウス及びKif3b+/+マウス（実施例１）に離乳後6～7週間CE-2又はHBD飼料を自由摂取させた（図８Ａ）。LC/MS分析（図８Ｂ）により、HBD摂取マウスの血漿ベタイン濃度はCE-2摂取マウスに比べて有意に上昇した。そこで、これらの食餌を与えたマウスに一連の行動試験（図８Ｃ～Ｈ）を負荷した。通常CE-2給餌Kif3b+/-マウスはSCZ様行動変化を大きく再現したため（実施例１）、HBD給餌の影響をさらに検討した。
　相互性ソーシャルインタラクション試験において、Kif3b+/-マウスは、同じ遺伝子型の見知らぬマウスとの鼻対鼻インタラクション時間を減少させ、これはHBD給餌により有意に回復した（図８Ｃ及びＥ）。3チャンバーソーシャルインタラクション試験では、未知のマウスチャンバーにおけるKif3b+/-マウスの滞在（residual）期間はKif3b+/+マウスより短く、HBD給餌によって有意に回復した（図８Ｄ及びＦ）。PPI試験では、ASRの程度は変化しなかったが（図８Ｇ）、Kif3b+/-マウスのPPIは有意に障害され、HBD給餌により回復した（図８Ｈ）。しかし、オープンフィールド試験におけるKif3b+/-マウスの不安様行動と高架式十字迷路試験における多動性は、HBD給餌によって回復しないか、増強されることさえある傾向があり、HBD給餌は、とりわけKif3b+/-マウスの社会性とPPIにおいて、少なくともSCZの中心的な行動表現型を軽減できることを示唆した。
ベタインはKif3b+/-ニューロンの神経突起過剰分枝表現型を改善する
　これらの行動改善の細胞生物学的基盤として、前頭前野の冠状断面（図９Ａ）と海馬初代培養（図９Ｂ～Ｄ）における錐体ニューロンの神経突起分枝の程度を検討した。SCZ又は自閉症の他のマウスモデルと同様の典型的な神経突起過剰分枝表現型を検出した。分枝点の数を細胞体からの距離の関数として記述したSholl解析（Sholl, D.A., Journal of Anatomy 87, 387-406 (1953)）を用いて分枝レベルを定量した。したがって、11週齢のKif3b+/-マウスの前頭前野4～5層の錐体ニューロン（図９Ａ及びＥ）と、ステージ2～3のDIV3の培養したKif3b+/-海馬ニューロン（図９Ｂ及びＦ）のいずれにおいても、細胞体から5～20μm近傍で分枝の有意な増大が検出された。
　非常に有意に、この過剰分枝表現型は、行動改善と並行して、in vivoとin vitroの両方でベタイン投与により改善された（図９Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦ）。Kif3b+/-マウスへのHBD給餌は、対照のCE-2給餌と比較して、皮質錐体ニューロンの過剰分枝の程度を有意に低下させた（図９Ａ及びＥ）。平板培養の最初の24時間において培地に500μMのベタインを添加すると、Kif3b+/-培養海馬錐体ニューロンの過剰分枝の程度が有意に低下し、明らかな有害作用は認められなかった（図９Ｂ及びＦ）。この表現型は、500μMのピリドキサミン処理によってもレスキューされ、これはカルボニルストレススカベンジャー（図９Ｃ及びＧ）として、又はKIF3B-TagRFP過剰発現（図９Ｄ及びＨ）として十分に特徴付けられた。これらのデータは、ベタインが以前に提唱された様々な機能の中でカルボニルストレススカベンジャーとしてここで最も役立っている可能性が高く、KIF3Bタンパク質の欠損が実際に表現型の原因であることを示唆した。
　過剰なカルボニルストレスと神経突起過剰分枝の間の因果関係を調べる別の細胞モデルとして、カルボニルストレスの減少に必須の役割を果たす亜鉛金属酵素グリオキサラーゼ1（GLO1）遺伝子の標的不活性化の存在下又は不在下で、神経的に誘導されたヒトiPS細胞の神経突起樹状突起を調べた。GLO1-/-ニューロン細胞は、親GLO1+/+細胞（図９Ｉ及びＪ）と比較して、神経突起の分枝の程度を有意に増加させ、過剰なカルボニルストレスがヒトニューロン細胞においても神経突起の過剰分枝を生じ得ることを支持した。これらのデータはまとめて、KIF3欠損とカルボニルストレスの両方が、カルボニルストレススカベンジャーによって改善され得る樹状突起過剰分枝をもたらすことを示唆した。
ベタインはKif3b+/-ニューロンにおけるラメリポディアの適切な動態を回復する
　神経突起過剰分枝までの最も上流の現象として、DIV1のステージ1～2での培養海馬ニューロンの初期発生過程におけるラメリポディア動態の有意な減少を検出した。細胞膜をカルセイン-AMで標識し、タイムラプスイメージングで観察した（図１０Ａ）。
　Kif3b+/-ニューロンのラメリポディア端のドリフトの幅は、3つの連続平面のカメラルシダ（図１０Ｂ）又はラメリポディアの動態の平均二乗変位解析（図１０Ｃ）で表されるように、Kif3b+/+ニューロンよりも小さい傾向があった。このドリフトは、Kif3b+/-ニューロンにおいてベタイン処理により部分的ではあるが有意に回復し、そのうち両方向の平均変位量はそれぞれ有意に増加した（図１０Ｄ）。
　アクチン細胞骨格の変化の可能性を調べるために、まず固定した状態で、Airyscanセミ超高解像顕微鏡を用いて蛍光ファロイジン標識ニューロンを観察した（図１０Ｅ）。Kif3b+/-ニューロンのフィロポディアアクチン束の密度は、ベタイン投与によって回復したKif3b+/+ニューロンの密度よりも有意に低かった（図１０Ｅ、矢印；図１０Ｆ）。このF-アクチン表現型は、誘導放出抑制（STED）超分解顕微鏡（図１０Ｇ）及び透過処理したサンプルの走査型電子顕微鏡（SEM）（図１０Ｈ）によってさらに詳細に調べ、どちらにおいても対象ニューロンにおける太い束の一貫した消失が明らかになった。
ベタインは過剰な神経突起を抑制するラメリポディアアクチン束化を増強する
　ラメリポディアアクチン束動態を調べるために、ステージ1～2の生きている海馬ニューロンのF-アクチンをLifeact-mRuby導入遺伝子で蛍光標識した（図１１Ａ～Ｅ）。まず、500μMベタイン投与のあり又はなしで、Kif3b+/+ニューロンとKif3b+/-ニューロンを10秒ごとのタイムラプス顕微鏡を用いて比較した（図１１Ａ及びＢ）。Kif3b+/+ニューロンでは、アクチン束はしばしば回転性の折りたたみ運動（図１１Ａの矢印）を行い、これはラメリポディア端の局所的な退縮を伴っており、その後、退縮の直後に再び伸長した。Kif3b+/-ニューロンでは、フィロポディアアクチン束の密度が有意に減少したが、これはベタイン処理により回復し、ファロイジン標識固定細胞像で上記の結果を再現した（図１０）。そして、それらのラメリポディア膜は断裂と分離の頻度が少なく、Kif3b+/-ニューロンにおけるフィロポディアアクチン束の折りたたみ運動の頻度は、Kif3b+/+ニューロン及びベタイン処理Kif3b+/-ニューロンよりも有意に少なかった（図１１Ｂで定量化）。アクチン束のこれらのKIF3B/ベタイン依存性反復折りたたみと伸長サイクルが、ラメリポディア動態の駆動力である可能性が高かった。
　次に、EB1-YFPで標識した微小管プラス端を用いて、ラメリポディアの微小管侵入動態を観察した（図１１Ｃ～Ｅ）。
　タイムラプススタック（図１１Ｃ、矢印、トレース）に示すように、Kif3b+/-ニューロンの微小管プラス端は、Kif3b+/+ニューロンよりも、Cドメイン周囲を水平方向に移動する頻度が低い傾向にあったが、Pドメイン及びフィロポディアに垂直方向に侵入する頻度が高かった。この傾向は、Kif3b+/-ニューロンのPドメインがKif3b+/+ニューロンよりも微小管プラス端によって、より徹底的に探索された10分間にわたる時間投影画像（図１１Ｄ）においてより顕著に表された（図１１Ｅで定量化）。
　まとめると、Pドメインへの微小管侵入に対するラメリポディアの動態、ひいては神経突起の過剰分枝に対する過剰なラメリポディアの安定化を防ぐためには、KIF3を介したアクチン束形成が不可欠であると考えられた。ベタイン処理はこのアクチン束化に対するKIF3欠損を補償したので、次にKIF3モーターに関係するカーゴの同定によりその分子機構を検討した。
主要なカルボニル化標的CRMP2は新規のKIF3カーゴである
　CRMP2がヒトSCZ iPS細胞におけるカルボニルストレスの主要な標的の1つであり（Toyoshima et al. (2019) 前掲）、CRMP2が細胞骨格の調節に働くという最近の知見（例えば、Fukata, Y. et al., Nat Cell Biol 4, 583-591 (2002)）を踏まえ、KIF3モーターとCRMP2の物理的な関連を検討しようとした。マウス脳溶解物に対する抗CRMP2抗体及び抗KIF3B抗体を用いた免疫沈降実験では、KIF3BとCRMP2の間の有意な程度の相互作用が、正常ウサギIgGを用いた陰性対照と比較して、相互に検出された（図１２Ａ）。また、酵母ツーハイブリッド解析を実施し、KIF3A、KIF3B、CRMP2の切断型変異体間の直接的相互作用の能力を調べた（図１２Ｂ及びＣ）。その結果、KIF3Aの尾部ドメイン（アミノ酸600～701）はCRMP2の尾部ドメイン（アミノ酸312～572；図１２Ｃ）と特異的に関連していた。
　本発明者は、ステージ1～2のKif3b+/+培養海馬ニューロンの4重セミ超解像免疫細胞化学を実施し、KIF3、CRMP2、F-アクチン、微小管の共局在を調べ、これは陰性対照（図１２Ｇ）と比較して特異的なシグナルを提供する（図１２Ｄ～Ｆ）。KIF3AとCRMP2は、P-ドメインとC-ドメインの両方で互いに共局在したが、細胞骨格系との関係は多形性（pleiomorphic）であった。Pドメインでは、それらの共局在点はアクチン細胞骨格と関連していたことから、KIF3はラメリポディアCRMP2の機能においていくつかの直接的な役割を果たしていることが示唆された（図１２Ｅ、白矢印）。Cドメインの周辺部では、F-アクチンと微小管の両方を含む不定形な集合体上に共局在しており（図１２Ｅ、橙色の矢印）、これは微小管とアクチンに基づく輸送の間の中継点を表していると考えられる。Cドメインの中心部と神経突起シャフトでは、微小管に基づく輸送小胞を表していると思われる共局在粒子も同定した（図１２Ｆ、緑の矢印）。また、KIF3とCRMP2の相互作用を、2つの異なる抗体が16nmの近接内で結合すると点状シグナルを提供する近接ライゲーションアッセイを用いて調べた。ステージ1～2の培養海馬ニューロンのラメリポディアと細胞質の両方でシグナルを検出した（図１２Ｈ）。これらのデータを総合すると、KIF3モーターはCRMP2と有意に関連していることが示唆された。
KIF3は神経突起過剰分枝に対してラメリポディアのCRMP2レベルを維持する
　周辺部CRMP2レベルを調べるために、ステージ1～2の培養海馬ニューロンの免疫蛍光顕微鏡検査を行った。CRMP2はKif3b+/+ニューロンラメリポディアの最周辺領域に蓄積する傾向があった。しかし、Kif3b+/-ニューロンのラメリポディアのこの最も周辺部の1μm領域におけるCRMP2の密度は、Kif3b+/+ニューロンよりも有意に低かった（図１２Ｉ及びＫ）。そこで、F-アクチンに対して対比染色した、ラメリポディアアクチンとCRMP2相互作用のレベルを評価するために、近接ライゲーションアッセイを行った。Kif3b+/-ニューロンのラメリポディアアクチン束上のシグナル点の密度は、Kif3b+/+ニューロンよりも有意に低かった（図１２Ｊ及びＬ）。この表現型は、微小管に基づくCRMP2輸送の障害によって大きく説明できた。
　このCRMP2活性の周辺部での消失が、Kif3b+/-ニューロンの神経突起過剰分枝をもたらしうるかどうかを精査するために、海馬ニューロンにおけるCRMP2の発現レベルを双方向的に変化させた（図１２Ｍ～Ｐ）。まず、Kif3b+/+ニューロンに対するmiRNA媒介CRMP2ノックダウン（KD）試験を実施した（図１２Ｍ及びＯ）。非常に興味深いことに、CRMP2 KDベクターの形質導入は、スクランブル対照（SC）ベクターのもの（Kif3b+/-ニューロンを表現型コピーしたもの）と比較して、有意な神経突起過剰分枝をもたらした。次に、CRMP2を過剰発現させることにより、Kif3b+/-ニューロンの神経突起過剰分枝表現型を回復させることができるかどうかを検討した（図１２Ｎ及びＰ）。結果として、CRMP2-ECFP過剰発現は、ECFP単独発現と比較して、適切な程度の神経突起分枝を有意に回復したことから、CRMP2がKIF3B機能に下流で又は並行して作用することが示唆された。この回復はおそらく、過剰発現したカーゴが細胞周辺に拡散し、長い軸索を持たずにこのような小細胞のモーター欠損を十分に補うことができるためと考えられる。このように、CRMP2のノックダウンは、KIF3欠損ニューロンの神経突起過剰分枝表現型の表現型をコピーし、CRMP2の過剰発現によってこの表現型のKIF3欠損が代償されたことから、CRMP2が、神経発達の過程で過剰分枝防止分子経路のためのKIF3モーターのエフェクターとして作用するというわれわれの仮説が裏付けられた可能性が高い。
ベタインはCRMP2のカルボニル化レベルを減少させる
　マウス脳のCRMP2タンパク質に対するベタイン投与の効果を生化学的に評価した（図１３Ａ～Ｅ）。最初に、カルボニル化試薬であるグリオキサール、及びカルボニルストレススススカベンジャーであるベタインによりそれぞれin vitroで処理したKif3b+/+マウスの培養皮質ニューロン溶解物における全タンパク質カルボニル化レベルを調べた。AGEsのカルボニル化残基の1つであるCML（N-カルボキシメチルリジン）に対するイムノブロッティングにより、非処理ニューロンでもあるレベルのタンパク質カルボニル化が本質的に存在することが明らかになった。このタンパク質カルボニル化レベルはグリオキサール処理によって有意に上昇したが、全分子量範囲にわたってベタイン処理によって有意に低下した（図１３Ａ及びＢ）。
　さらに、タンパク質カルボニル化に対するKIF3欠損の影響を評価した。興味深いことに、Kif3b+/-ニューロンのCML修飾タンパク質レベルはKif3b+/+ニューロンよりも低く、これは未解明の代償機序又は、カルボニル化作用の主ターゲットであるCRMP2タンパク質の発現量低下によるものと考えられた（図１３Ｃ及びＤ）。この減少は、KIF3B欠損とカルボニルストレスがラメリポディアにおけるCRMP2機能の障害とは独立している可能性が高いことを示唆した。
　次に、ベタイン投与によるマウス脳内CRMP2複合体の変化の可能性について検討した。脳溶解物タンパク質のサイトゾル画分（画分S3）を高分離能サイズ排除クロマトグラフィー（HiRes-SEC、図１３Ｅの（a））に供し、続いてドットブロッティングを行った。その結果、ベタイン投与後にCRMP2複合体が有意に減少した（図１３Ｅの（b））。高ベタイン餌（HBD）給餌はCRMP2のサイズ分布曲線を右側に有意にシフトさせた（図１３Ｅの（c））。特に、最も重度に多量体化した形態（図１３Eの（c）、挿入グラフ）に相当する保持容量20～21mlのCRMP2レベルは有意に減少した（図１３Ｅの（b）及び（c）、橙色の四角）。以前に、多量体化の程度がCRMP2カルボニル化のレベルに大部分比例することを同定しているため（Toyoshima et al. (2019) 前掲）、これらのデータは、HBD摂食が脳における脱カルボニル化によるCRMP2多量体化のレベルをin vivoで低下させることを示唆した。
CRMP2の脱カルボニル化はそのF-アクチン束化活性を増強する
　アクチン細胞骨格上のCRMP2活性を調べるために、組換えCRMP2タンパク質（アミノ酸残基1～532）を精製し、さらにカルボニル化してAGE-CRMP2を調製した（Toyoshima et al. (2019) 前掲）。まず、アクチンとCRMP2の間のさまざまなモル比のもとで、CRMP2のアクチン濁度上昇能を評価した（図１３Ｆ）。CRMP2のモル濃度がアクチンの2倍以上の場合にのみ、濁度の有意な増加が誘発された（図１３Ｆ）。しかし、同じモル比におけるAGE-CRMP2は、アクチン重合又は束化活性のいずれかを表す可能性がある容量において有意に損なわれていた（図１３Ｇ）。次に、ピレン共役アクチン重合アッセイ（図１３Ｈ）を行ったが、この結果から、アクチン重合はCRMP2又はAGE-CRMP2のいずれによっても、陰性対照と同程度にほとんど促進されないことが示唆された。そこで、従来の高速共沈アッセイを用いてF-アクチンに対する親和性を比較した（図１３Ｉ）。その結果、CRMP2はF-アクチンと用量依存的に共沈降したが、この共沈降はAGE-CRMP2の場合に有意に低下した。最後に、全反射照明蛍光（TIRF）顕微鏡（図１３Ｊ及びＫ）を用いて、これらのタンパク質のF-アクチン束化活性を形態学的に評価した。興味深いことに、CRMP2存在下でのアクチン束の長さと強度は、AGE-CRMP2又は陰性対照タンパク質の存在下よりも有意に高かった（図１３Ｊ及びＫ）。
　これらの結果をまとめると、ある局所濃度以上のCRMP2タンパク質はF-アクチン束化を誘導できるが、F-アクチン重合を誘導できず、CRMP2のF-アクチン束化活性はカルボニル化に高感受性であることが示唆された。
SCZ脳はKIF3モーター発現が低減する傾向にある
　ヒトSCZ病因におけるKIF3分子モーターの関連性を評価するために、死後脳サンプルにおけるKIF3タンパク質レベルを比較した。SCZ患者の前頭前野（BA10）と後上側頭回（BA22）であるSCZ感受性皮質領域（図１４Ａ）と、年齢と性別を一致させた対照被験者のものの溶解物を、それぞれELISAアッセイで測定した。興味深いことに、SCZ患者のBA10における正常化KIF3Aレベルは対照よりも有意に低く（図１４Ｂ）、KIF3Bレベルもこの領域で低下する傾向があった（図１４Ｃ）。しかし、BA22におけるこれらのタンパク質レベルには明らかな差異は認められず、Kif3b+/-マウス脳で明らかになったのと同様の分子機序を導く可能性のある、ヒトSCZ脳における領域特異的KIF3ダウンレギュレーションの存在が示唆された。
　最後に、ベタインによるその治療の根底にあるSCZ分子病因のモデルをここに提案する（図１４Ｄ）。KIF3モーターの遺伝的又はエピジェネティックなダウンレギュレーションは、ニューロンのラメリポディアへのCRMP2輸送を障害する。その上、カルボニルストレスの上昇によるCRMP2のAGE修飾もCRMP2活性を障害する。これらの2つの量的及び質的欠陥は、相乗的にラメリポディアのCRMP2活性を低下させ、F-アクチン束化の障害、ラメリポディアの異常な安定化、ラメリポディアのP-ドメイン及びフィロポディアへの過剰な微小管侵入、並びに脳の神経回路及び興奮抑制性バランスを乱す可能性のある神経突起の過剰分枝をもたらす。ベタイン処置はCRMP2のカルボニル化レベルを低下させて脱抑制するため、これらの表現型を逆転させることができる。したがって、CRMP2の高カルボニル化と輸送欠損は神経発達を相乗的に妨げ、SCZ形質を悪化させると仮定した。
（３）考察
　本実施例では、SCZの病態モデルであるKif3b+/-マウス（実施例１）を用いることにより、SCZの新たな治療法に至る分子経路を同定した。新しいKIF3カーゴとしてCRMP2を決定し、そのカルボニル化感受性アクチン束化活性を、神経突起過剰分枝に対するベタイン投与の可能な標的として明らかにした。精製CRMP2タンパク質は、α-アクチニン及びファシンの場合と同様に、有意なアクチン束化活性を示したが、アクチン重合活性を示さなかった（図１３）。上記の証拠から、KIF3媒介CRMP2輸送欠損及び/又は高カルボニル化媒介CRMP2機能欠損に基づくSCZ病因のサブセットを機能的に補償する可能性があるベタインの主要な細胞標的としてCRMP2のこのアクチン束化活性を提案する。
　まず、今回の解析から、CRMP2は統合失調症の神経突起過剰分枝を防止するKIF3の主要なエフェクターカーゴであることが示唆された（図１２）。本実施例の生化学アッセイでは、KIF3モーターとCRMP2の直接的な相互作用が裏付けられ（図１２Ａ～Ｃ）、KIF3B欠損は細胞周辺部のCRMP2の有意な減少をもたらす（図１２Ｉ及びＫ）。CRMP2ノックダウンニューロンは、神経突起の過剰分枝を表現型としてコピーし（図１２Ｍ及びＯ）、CRMP2の過剰発現は、Kif3b+/-ニューロンの神経突起過剰分枝表現型を部分的に解消した（図１２Ｎ及びＰ）。一方、CRMP2の発現又は機能を破壊したモデルマウスは、SCZ様行動及び脳ニューロンの複雑な樹状突起の分枝を有意に示す。さらに、CRMP2をコードするヒトDPYSL2遺伝子は、ゲノムワイド連鎖研究においてSCZの感受性の責任領域を含んでいることが知られている染色体8p21.2に位置している。以上より、Kif3b+/-ニューロンのCRMP2輸送欠損は、統合失調症性の神経突起の過剰分枝をもたらすことが示唆された。
　第二に、セミ超高解像タイムラプス顕微鏡（図１１）と高分離能サイズ排除クロマトグラフィー（HiRes-SEC；図１３）を用いた本実施例の細胞生物学的観察によれば、CRMP2のカルボニル化感受性アクチン束化活性が神経突起の過剰分枝を防止するために必須であることを提案する。これらのアッセイによって、CRMP2の高カルボニル化がアクチンに基づくラメリポディアの動態をどのように乱すのか、またその動態が発生中のニューロンにおける過剰な神経突起形成を通常どのように抑制するのかという新たな洞察が促進された（図１０、１１及び１３）。Kif3b+/-ニューロンラメリポディアのPドメインへの微小管侵入事象の増大（図１１Ｂ～E）は、低レベルのサイトカラシンB処理によるアクチン束の除去も周辺部微小管侵入を増強することを示唆する以前の研究と並行して、おそらくアクチン束の著しい消失を伴う異常なラメリポディアの安定性によるものと思われる。移動する微小管によるフィロポディア突起の異常な安定化が、神経突起の過剰分枝の原因である可能性がある。これらのラメリポディア機能不全表現型は、実施例１の成熟Kif3b+/-ニューロンにおける軸索成長円錐欠損を説明することもできる。Cyfip1、DISC1、及びKif3bなどの自閉症及びSCZ関連遺伝子自体が欠損したマウスモデルは、適切な樹状突起の形態形成及びスパイン形成がしばしば損なわれ、その両方がアクチン動態に依存するため、アクチンに基づく事象における問題は、統合失調症（SCZ）病因の神経発生病因にとって基本的であると考えられている。
　第三に、本実施例のデータは、ベタインがCRMP2活性を阻害しないことを示唆した。マウス皮質ニューロンへのベタイン補充は、全体的なタンパク質カルボニル化のレベル、特にCRMP2多量体画分のレベルを低下させた（図１３）。これまでのデータによると、CRMP2は機能不全的に多量体化するカルボニル化の主要な標的の一つである（Toyoshima et al. (2019) 前掲）。CRMP2及び高カルボニル化ヒトGLO1-/-ニューロンiPS細胞を欠損したマウス海馬ニューロンは、一貫して神経突起の過剰分枝を生じた（図９Ｉ及びＪ；並びに図１２Ｍ及びＯ）。また、ベタイン補充は、Kif3b+/-皮質ニューロンにおける適切な程度のラメリポディア動態と神経突起分枝を解消した；そして、Kif3b+/-マウスの行動表現型を抑制した（図８及び９）。Chdh-/-マウス（Ohnishi, T. (2019) 前掲）、PCP誘発SCZモデルマウス（Ohnishi, T. (2019) 前掲）、ヒト死後SCZ脳（Ohnishi, T. (2019) 前掲）、SCZ患者の血漿中代謝物（Koike, S. et al., Translational psychiatry 4, e379-e379 (2014)）、GLO1欠損iPS由来神経細胞とそのノックアウトマウス（例えばOhnishi, T. (2019) 前掲）を用いることで、ベタインがカルボニルストレスとSCZの表現型を抑制するために必須かつ十分であることを示唆している。ベタインは、ベタイン-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（BHMT）反応によりホモシステインの基質として働くことにより、細胞のカルボニル化能を低下させることができた。以前に確立された抗カルボニル化試薬ピリドキサミンは、Kif3b+/-ニューロン形態のレスキュー能力のためにベタインで代替することができるため（図９Ｃ及びＧ）、ベタインは、他の提案された機能（例えば、Knight, L.S. et al., Neurochemical research 42, 3490-3503 (2017)）のためではなく、本スキームにおいて主として抗カルボニル化試薬として働く可能性があった。ベタインは長い間ホモシスチン尿症のサプリメントとして使用されてきたため、SCZ患者への薬物再配置の手順は比較的良好に利用可能であると予想され、ピリドキサミンの有害作用を補完するのに適しているであろう。
　最後に、ヒトSCZ患者におけるKIF3欠損又は機能不全の証拠を見出した。SCZ患者のヒトゲノムデータベースから、これまでに特徴づけられている患者特有の稀な機能不全型KIF3B変異に加えて、ヒトSCZ死後脳前頭前野において、KIF3モータータンパク質のダウンレギュレーション傾向が検出された（図１４Ａ～Ｃ）。これらのデータをまとめると、KIF3B遺伝子は、エピジェネティック/ジェネティック/翻訳後機構によるその遺伝的変化及び/又はダウンレギュレーションを介して、少なくとも部分的にヒトSCZの病因に関与しており、今後の研究が行われるであろうことが示唆された。
　結論として、本実施例のデータは、遺伝学的及び細胞生物学的に、統合失調症SCZ病因に対するCRMP2関連神経保護分子経路において、［1］KIF3分子モーター複合体によるCRMP2の細胞内輸送と、［2］カルボニルストレススカベンジャーによるCRMP2の脱カルボニル化との間の新しい相乗的関係を支持した。Kif3b+/-マウスへの高ベタイン餌（HBD）給餌は、それらの統合失調症的行動とニューロン形態変化を有意に解消した（図８及び９）ので、KIF3媒介CRMP2輸送欠損に対するベタインによるCRMP2活性のこの機能的代償は、ベタイン媒介SCZ治療薬の作用を分析するための一般的で基本的なプラットホームの良好な候補になるであろう。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列フリーテキスト
配列番号5～9：人工配列（合成オリゴヌクレオチド）

Claims (23)

  1. 　以下の（a）～（d）の少なくとも1つを含むことを特徴とする精神疾患の治療又は予防のための組成物。
    （a）キネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの少なくとも1つのサブユニット若しくはその機能的変異体、
    （b）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片、
    （c）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片を含む発現ベクター、
    （d）KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする核酸若しくはその断片又は該核酸若しくは断片を含む発現ベクターで形質転換された細胞
  2. 　前記KIF3モーターが、KIF3A、KIF3B、及びKAP3からなる群より選択される少なくとも1つのサブユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記KIF3モーターが、少なくともKIF3Bを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　前記KIF3モーターがヒト又はマウス由来である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　前記精神疾患が、統合失調症、気分障害、不安障害、及び発達障害からなる群より選択される少なくとも1種の精神疾患である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 　前記組成物が、医薬組成物、機能性食品、健康補助食品、又はサプリメントである、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 　脳における機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている非ヒト哺乳動物の精神疾患モデル動物としての使用。
  8. 　前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、KIF3モーターの少なくとも1つのサブユニットをコードする遺伝子のヘテロ接合ノックアウトによるものである、請求項７に記載の使用。
  9. 　前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、機能的なKIF3Bの発現の低減又は阻害によるものである、請求項７又は８に記載の使用。
  10. 　前記非ヒト哺乳動物が、対応する野生型哺乳動物に比較して、以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つを示す、請求項７～９のいずれか１項に記載の使用。
    （i）社会性の低下、
    （ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
    （iii）プレパルス抑制の低下、
    （iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下
  11. 　前記非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の使用。
  12. 　前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項７～１１のいずれか１項に記載の使用。
  13. 　精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
    （a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を被験因子で処理するステップ、
    （b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
    を含む方法。
  14. 　前記機能的なKIF3モーターの発現の低減又は阻害が、機能的なKIF3Bの発現の低減又は阻害によるものである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記神経細胞におけるNMDA受容体のサブユニットNR2Aの輸送活性、及び／あるいは前記神経細胞における前記KIF3タンパク質の量若しくは活性又は前記KIF3をコードする遺伝子の発現量が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. （i）前記神経細胞における樹状突起の過剰分枝が、非処理対照細胞と比較して減少している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
    （ii）前記神経細胞におけるスパイン数が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
    （iii）前記神経細胞におけるラメリポディアの動態が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
    （iv）前記神経細胞におけるラメリポディア内のアクチン束の密度及び／又は動態が、非処理対照細胞と比較して増大している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以上である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、並びに／あるいは
    （v）前記神経細胞におけるラメリポディア内への微小管侵入頻度が、非処理対照細胞と比較して減少している又は野生型神経細胞と比較して同等若しくはそれ以下である場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、
    請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法をスクリーニングする方法であって、
    （c）請求項７～１２のいずれか１項に記載されている非ヒト哺乳動物を被験因子で処置するステップ、
    （d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
    を含む方法。
  18. 　請求項１３に記載の方法のステップ（a）及び（b）を行った後に、ステップ（c）及び（d）を行う、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記非ヒト哺乳動物が、非処置対照動物又は野生型動物と比較して以下の（i）～（iv）のうちの少なくとも1つの改善を示す場合に、前記被験因子を前記薬物又は方法の候補として選択する、請求項１７又は１８に記載の方法。
    （i）社会性の低下、
    （ii）過活動又は新規物体への興味の低下、
    （iii）プレパルス抑制の低下、
    （iv）空間認知能力、学習能力、又は獲得した記憶の書き換え能力の低下
  20. 　前記被験因子がカルボニル化抑制活性を有するか否かを評価するステップをさらに含む、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　前記被験因子が、CRMP2タンパク質の量若しくは活性を増大させるか否か、及び／又はCRMP2タンパク質のカルボニル化を抑制する活性を有するか否かを評価するステップをさらに含む、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　精神疾患の治療又は予防のための薬物又は方法の有効性を評価する方法であって、
    （a）機能的なキネシンスーパーファミリータンパク質（KIF）3モーターの発現が低減又は阻害されている神経細胞を前記薬物又は方法で処理するステップ、
    （b）前記神経細胞を、非処理対照細胞又は野生型神経細胞と比較するステップ
    を含む、並びに／あるいは
    （c）請求項７～１２のいずれか１項に記載されている非ヒト哺乳動物を前記薬物又は方法で処置するステップ、
    （d）前記非ヒト哺乳動物を、非処置対照動物又は野生型動物と比較するステップ
    を含む方法。
  23. 　前記精神疾患が、統合失調症、気分障害、不安障害、及び発達障害からなる群より選択される少なくとも1種の精神疾患である、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
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