WO2021066552A1 - 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a tissue fusion agent having increased adhesion and avidity to biological tissues using cells with increased expression of adhesion-related genes.
  • Bioadhesives and sealants are used to suture or apply tissue during surgery, as an anti-bleeding agent, as a body fluid and blood blocker, etc., and require biocompatibility because they come into contact with the skin frame, and must be free from toxicity and risk in the body. It should not interfere with the healing of the living body.
  • Medical adhesive materials currently in practical use include cyanoacrylate, dermal glue, gelatin glue, and polyurethane. Closure Medical of the United States commercialized a medical tissue adhesive of octyl cyanoacrylate called Dermabond in 1997. After obtaining approval for the sale of the European Community in August 2010, it was approved by the US FDA in 1998.
  • the cyanoacrylate adhesive may interfere with wound healing because the solidified material is insufficient in flexibility and is hard, and it is difficult to decompose in a living body, and thus there is a problem that it is easily covered by a foreign substance.
  • Fibrin glue has a very low adhesion, so the resulting skin lump may fall from the tissue, and because it is a blood product, there is a problem of viral infection.
  • gelatin glue was developed as a tissue adhesive derived from a living body, formulated with gelatin-resorcinol-formalin.
  • tissue adhesives such as gelatin-glutaaldehyde were developed, but formalin or glutaaldehyde used as a crosslinking agent was developed.
  • formalin or glutaaldehyde used as a crosslinking agent was developed.
  • the present invention provides an adhesion-related gene having tissue adhesion and avidity, and may be used to develop an adhesive for regeneration treatment of damaged tissues or organs after tissue damage or surgical operation of organs by using the gene.
  • the present invention contains cells with increased expression of one or more genes selected from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2, and KRT19 as an active ingredient, and increases adhesion and avidity to biological tissues.
  • the present invention provides a composition for adding a tissue fusion agent containing one or more genes selected from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19 as an active ingredient.
  • the present invention includes the steps of inserting one or more genes from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19 into cells; First culturing the cells into which the gene is inserted in a medium containing a cartilage differentiation medium for 5 to 10 days; Culturing the first cultured cells in a second monolayer; And obtaining a cell membrane in which the secondary monolayer cultured cells and the extracellular matrix are combined.
  • the cartilage tissue fusion agent composition produced from stem cells derived from fetal cartilage tissue with increased expression by inserting VCAN, CTGF or EXT1 is fusion made from stem cells derived from fetal cartilage tissue to which the gene is not inserted.
  • the cell composition in which the expression of VCAN, CTGF or EXT1 was increased may be prepared as a tissue bonding agent composition having increased bio-tissue adhesion and avidity, and VCAN , CTGF or EXT1 may be provided as a composition for adding a tissue fusion agent.
  • FIG. 2 is a microarray analysis comparing genes related to adhesion control mechanisms expressed in adhesive sheet cultured using human fetal cartilage tissue-derived cells and adhesion-related genes expressed when cells derived from human adult cartilage tissue are cultured by a general cell culture method. It is the result.
  • 3 is a microarray comparing genes related to adhesion control mechanisms expressed in adhesive sheet cultured using human fetal cartilage tissue-derived cells and adhesion-related genes expressed when human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are cultured by a general cell culture method. This is the result of the analysis.
  • FIG. 5 is an image result of human chondrocytes inserted into a target gene and cultured under the same conditions.
  • FIG. 7 is an image result of inserting a target gene into stem cells derived from fetal cartilage tissue and culturing under the same conditions.
  • FIG. 9 is an image result of culturing under the same conditions after processing the stem cells derived from fetal cartilage tissue of the present invention through siRNA insertion of a target gene.
  • Figure 10 is a result of confirming the gene expression level by performing RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) after culturing by inserting siRNA of the target gene into the fetal cartilage tissue-derived stem cells of the present invention.
  • RT-PCR Real Time Polymerase Chain Reaction
  • TEP-C cartilage tissue fusion agent composition
  • FIG. 12 is a result of confirming the adhesion strength of a cartilage tissue bonding agent composition made using human chondrocytes and fetal cartilage tissue-derived stem cells (FCPC) with or without CTGF or EXT1 gene inserted.
  • FCPC fetal cartilage tissue-derived stem cells
  • the present invention contains genes derived from human fetal cartilage tissue and extracellular matrix derived from fetal cartilage tissue as an active ingredient, and the genes related to adhesion control mechanisms with increased expression in a tissue adhesive in the form of a gel-type cell sheet It is intended to provide a conjugate for conjugation of damaged tissues by confirming and using it.
  • the present invention contains cells with increased expression of one or more genes selected from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2, and KRT19 as an active ingredient, and increases adhesion and avidity to biological tissues.
  • a tissue blender composition can be provided.
  • the cells may be selected from the group consisting of human cartilage tissue cells and human fetal cartilage tissue-derived stem cells.
  • the tissue bonding agent composition may be used as a tissue adhesive, a tissue sealant, an anti-adhesion agent, a hemostatic agent, or a wound coating agent.
  • the present invention can provide a composition for adding a tissue fusion agent containing as an active ingredient one or more genes selected from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19.
  • TAP tissue fusion agent composition
  • a jig with a diameter of 5 mm was attached to the inserted TAP and pulled at a speed of 1.3 mm/min to check the resistance until the jig was separated from the TAP.
  • Stem cells derived from fetal cartilage tissue were As a result of comparison with the cartilage tissue fusion agent composition (TAP-C) produced using, as shown in FIG.
  • the cell composition with increased expression of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19 can be provided as a tissue coalescence composition with increased biotissue adhesion and avidity, and the gene It was confirmed that they can be provided as a composition for adding a tissue bonding agent.
  • the present invention includes the steps of inserting one or more genes from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19 into cells; First culturing the cells into which the gene is inserted in a medium containing a cartilage differentiation medium for 5 to 10 days; Culturing the first cultured cells in a second monolayer; And it is possible to provide a method for producing a tissue fusion agent comprising the step of obtaining a cell membrane in which the secondary monolayer cultured cells and the extracellular matrix are combined.
  • the cells may be selected from the group consisting of human cartilage tissue cells and human fetal cartilage tissue-derived stem cells.
  • the step of second monolayer culturing the primary cultured cells may be monolayer cultivation of the primary cultured cells in a growth medium for 15 to 20 days.
  • the cell membrane includes cells with increased expression of one or more genes selected from the group consisting of CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 and KRT19, and may have increased tissue adhesion and avidity. .
  • the "union agent" of the present invention refers to a drug that promotes healing and healing of skin or muscle tissue.
  • cartilage tissue separated from the knee joint was phosphated buffered saline (PBS), 0.2% (w/v) collagenase (collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) containing DMEM (DMEM) Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) medium was added and incubated for 4 hours in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • the cartilage tissue-derived stem cells released after the cartilage tissue was completely digested were centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes to obtain precipitated cartilage tissue cells, and placed in a tissue culture dish [150 mm (dia.) ⁇ 20 mm (h)]. It was inoculated at a 1 ⁇ 10 6 cell density.
  • FCPC stem cells
  • cartilage tissue-derived stem cells released after the cartilage tissue was completely digested were centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes to obtain precipitated cartilage-derived progenitor cells (FCPC), and a tissue culture dish [150 mm ( dia.) ⁇ 20 mm (h)] was inoculated at a cell density of 1 ⁇ 10 6.
  • Example 3 Preparation of a composition for fusion of tissues having tissue adhesion and differentiation properties (TAP)
  • cartilage differentiation medium 1% antibiotic-antimycotic, 1.0 mg/mL insulin, 0.55 mg/ mL human transferrin, 0.5 mg/mL sodium selenite, 50 ⁇ g/mL Ascorbic acid, 1.25 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 100 nM dexamethasone (dexamethasone), 40 ⁇ g/mL proline and 10 ng/ml TGF- ⁇ -added DMEM-HG] were incubated in 6 wells for one week at 37°C in a 5% CO 2 incubator.
  • cartilage differentiation medium 1% antibiotic-antimycotic, 1.0 mg/mL insulin, 0.55 mg/ mL human transferrin, 0.5 mg/mL sodium selenite, 50 ⁇ g/mL Ascorbic acid, 1.25 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 100 nM dexamethasone (dexamethasone), 40 ⁇ g/mL proline and 10 ng/ml TGF-
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 50 units/mL penicillin
  • 50 ⁇ g/mL streptomycin 50 units/mL penicillin
  • streptomycin 50 units/mL
  • the gene expression profile of the TAP prepared in Example 3 was compared. Genes with very high expression were selected from the two TAPs prepared in Example 3 using a whole human genome Agilent 4 ⁇ 44K Oligonucleotide Microarray (Macrogen, Korea).
  • the gene expression as shown in FIG. 1 was compared with the gene expressed when the human fetal cartilage tissue-derived cells were cultured in a sheet with excellent bioadhesiveness and the electrodeposition-related gene expressed when the human adult cartilage tissue-derived cells were cultured as a sheet. Confirmed.
  • FIG. 1 As a result of comparing the expression of the gene expressed when human fetal cartilage tissue-derived cells are cultured in a sheet with excellent bioadhesiveness and the adhesion-related gene expression expressed when the human adult cartilage tissue-derived cells are cultured by a general cell culture method, FIG. The same gene expression results were confirmed.
  • Example 5 Preparation of a composition for tissue fusion with tissue adhesion and differentiation properties treated with a target gene (TAP)
  • CTGF CCN2
  • EXT1 identified in Example 4 were combined with a vector as indicated in FIG. 4 and then cloned to prepare an inserted gene.
  • Gene knock-in was performed using Gene Transfection Reagent (Lipofectamine 3000 Thermo). Each gene was treated with siRNA (bionics) under the same conditions to perform a gene knock-down experiment.
  • FCPC fetal cartilage tissue-derived stem cells
  • EXT1 and CTGF were increased in the chondrocytes into which the target gene was inserted as shown in FIG. 6, and the expression of EXT1 and CTGF was also increased in the stem cells derived from fetal cartilage tissue into which the target gene was inserted as shown in FIG. I could confirm that.
  • the expression of EXT1 and CTGF was suppressed in the stem cells derived from fetal cartilage tissue into which the siRNA of the target gene was inserted as shown in FIG. 7.
  • EXT1 and CTGF were effectively inserted into chondrocytes and stem cells derived from fetal cartilage tissue, thereby obtaining a cell membrane with increased expression of EXT1 and CTGF genes.
  • the adhesive strength was compared to confirm the adhesive strength of the TAP prepared in Examples 3 and 5 and the composition for tissue fusion treated with each gene.
  • cartilage injury model was produced using a 6mm biopsy punch on the cartilage tissue surface of the donated patient, and the prepared fusion composition was inserted.
  • cartilage tissue fusion agent composition (TAP-C) produced using fetal cartilage-derived stem cells and the cell membranes treated with each gene, as shown in FIG. 12, no distinct differences were found in the first week of culture and the second week of culture. However, at the 3rd week of culture, it was confirmed that the adhesion strength was very excellent in the gene insertion group compared to the TAP-C group, and adhesion of the cartilage tissue fusion agent composition made of gene knock-down cells through siRNA insertion. It was confirmed that the intensity was significantly decreased compared to the TAP-C group.

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Abstract

본 발명은 접착 관련 유전자를 이용하여 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 삽입하여 발현이 증가된 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작한 연골 조직 유합제 조성물은 상기 유전자가 삽입되지 않은 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물과 비교하여 현저하게 우수한 접착 강도를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 발현 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제조될 수 있으며, VCAN, CTGF 또는 EXT1은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법
본 발명은 접착 관련 유전자의 발현을 증가시킨 세포를 이용한 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제에 관한 것이다.
생체 접착제(bioadhesive) 및 실란트는 수술시 조직을 봉합 또는 도포하거나, 출혈 방지제, 체액과 혈액 차단제 등으로 사용되는 것으로, 피부테 접촉하므로 생체 적합성이 요구되며, 생체 내에서 독성과 위해성이 없어야 하고, 생체의 치유를 방해하지 않아야 한다.
현재 실용화되고 있는 의료용 접착 소재로는 시아노아크릴레이트계, 피부린 글루계, 젤라틴 글루계, 폴리우레탄계 등이 있으며, 미국의 Closure Medical사는 Dermabond라는 옥틸시아노아크릴레이트의 의료용 조직접착제를 상품화하여 1997년 8월 유럽공동체의 판매승인을 얻은 데 이어 1998년 미국 FDA로부터 승인을 받은바 있다.
그러나, 시아노아크릴레이트계 접착제는 고화물이 유연성이 부족하고 단단하므로 창상 치유를 방해하는 경우가 있고, 또한 생체 내에서 분해되기 어려우므로 피포화되어 이물질이 되기 쉬운 문제가 있다. 피브린 글루는 접착력이 상당히 낮아 생성된 피부린 덩어리가 조직으로부터 떨어지는 경우가 있으며, 혈액 제제이므로 바이러스 감염이 우려되는 문제가 있다.
또한, 젤라틴 글루는 생체 유래의 조직 접착제로 젤라틴-레조시놀-포르말린으로 가료시킨 것이 개발되었으며, 그 외에 젤라틴-글루타알데하이드와 같은 조직접착제가 개발되었으나, 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드가 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 단점이 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위해 생체 적합성이 우수하고 수분 존재하에서 우수한 기계적 강도와 빠르고 강한 접착력을 갖는 생체 조직 접착제에 대한 개발 필요성이 요구되고 있다.
본 발명은 조직 접착력 및 결합력을 갖는 접착 관련 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 이용하여 조직 손상 또는 장기의 외과 수술 후 손상된 조직 또는 장기의 재생 치료용 접착제 개발에 이용될 수 있다.
본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며, 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물을 제공한다.
본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 함유하는 조직 유합제 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 세포에 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자를 삽입하는 단계; 상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및 상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하는 조직 유합제 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, VCAN, CTGF 또는 EXT1을 삽입하여 발현이 증가된 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작한 연골 조직 유합제 조성물은 상기 유전자가 삽입되지 않은 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물과 비교하여 현저하게 우수한 접착 강도를 나타내는 것을 확인함에 따라, 상기 VCAN, CTGF 또는 EXT1을 발현 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제조될 수 있으며, VCAN, CTGF 또는 EXT1은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 2는 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 3은 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 배양된 접착제에서 발현된 접착 제어 기전 관련 유전자와 사람 골수유래 중간엽 줄기세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현된 접착 관련 유전자를 비교한 마이크로 어레이 분석 결과이다.
도 4는 접착력에 관련한 목표 유전자인 CTGF, EXT1 또는 VCAN을 pCMV-HA 백터에(Vector) 각각 결합한후 유전자 클로닝을(DNA Cloning) 진행한 결과이다.
도 5는 사람 연골세포을 목표 유전자 삽입하고 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 6은 사람 연골 세포에서 목표 유전자를 삽입하고 RT-PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction)로 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자를 삽입하고 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 8은 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자를 삽입하고 RT-PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction) 실험을 한 결과이다.
도 9는 본 발명의 태아 연골조직 유래 줄기 세포를 목표 유전자의 siRNA 삽입을 통하여 처리한후 똑같은 조건하에 배양한 이미지 결과이다.
도 10은 본 발명의 태아 연골조직 유래 줄기세포에 목표 유전자의 siRNA 삽입하여 배양한 후 RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 만든 연골 조직 유합제 조성물(TAP-C)의 접착 강도를 확인한 과정이다.
도 12는 CTGF 또는 EXT1 유전자가 삽입되거나 삽입되지 않은 사람 연골 세포(chondrocyte) 및 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)를 각각 이용하여 만든 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도를 확인한 결과이다.
도 13은 접착관련 유전자 VCAN을 이용하여 제조된 생체 조직 접합체의 조직 접합능을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하며 젤 형태(gel type)인 세포 시트(sheet) 형태의 조직 접착제에서 발현이 증가된 접착 제어 기전 관련 유전자를 확인하고 이를 이용한 손상된 조직의 접합용 접합체를 제공하고자 한다.
본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며, 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 세포는 사람 연골조직 세포 및 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 조직 유합제 조성물은 조직 접착제, 조직 봉합제, 유착 방지제, 지혈제 또는 창상 피복제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 함유하는 조직 유합제 첨가용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, VCAN, CTGF 또는 EXT1 유전자를 삽입시켜 발현 증가시킨 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 제조된 조직 유합제 조성물(TAP)을 기증받은 환자의 연골조직으로 제작된 연골손상 모델에 삽입한 후 직경 5 mm의 지그가 삽입된 TAP에 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분으로 속도로 끌어 당기면서 지그가 TAP와 분리될 때까지의 저항력을 확인하였으며, 태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 제작된 연골 조직 유합제 조성물 (TAP-C)과 비교한 결과, 도 9와 같이 배양 1주차 및 배양 2주차에서는 뚜렷한 차이점이 확인되지 않았으나, 배양 3주차에서 TAP-C 군과 비교하여 유전자 삽입군에서 접착 강도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었으며, siRNA 삽입을 통하여 유전자 넉다운(Knock-down)된 세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도는 TAP-C 군보다 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19 발현을 증가시킨 세포 조성물은 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 유전자들은 조직 유합제 첨가용 조성물로 제공될 수 있음이 확인되었다.
또한, 본 발명은 세포에 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자를 삽입하는 단계; 상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및 상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하는 조직 유합제 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 세포는 사람 연골조직 세포 및 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계는 성장배지에서 1차 배양된 세포를 15 내지 20일간 단층배양하는 것일 수 있다.
상기 세포막은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 포함하며, 조직 접착성 및 결합력이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 "유합제" 는 피부나 근육 조직이 나아서 아물어 붙는 것을 촉진하는 약물을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 사람 연골조직 세포의 분리 및 배양
무릎 관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충식염수(phosphated buffered saline: PBS)로 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골조직 유래 줄기세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 연골조직 세포를 수득하였으며, 조직 배양접시[150 mm(dia.) × 20 mm(h)]에 1 × 106 세포 밀도로 접종하였다.
<실시예 2> 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)의 분리 및 배양
12~15주된 태아(출처: 아주대학교병원 윤리위원회에서 승인한 IRB NO. AJIRB-CRO-07-139)의 무릎 관절로부터 연골조직 유래 줄기세포를 분리하였다. 간략하게, 무릎 관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충식염수(phosphated buffered saline; PBS)로 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골조직 유래 줄기세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 연골조직 유래 줄기세포(fetal cartilage derived progenitor cell; FCPC)를 수득하였으며, 조직 배양접시[150 mm(dia.) × 20 mm(h)]에 1 × 106 세포 밀도로 접종하였다.
<실시예 3> 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 제조(TAP)
상기 실시예 1 및 2에서 수득한 연골 세포를 1 × 106 세포 밀도로 희석한 후, 연골 분화배지[1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β가 첨가된 DMEM-HG]가 포함된 배지를 이용하여 6 웰에서 일주일동안 37℃, 5% CO2 배양기로 배양하였으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 units/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 15~18일 동안 단층 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, PBS을 첨가하여 세포외기질과 결합된 시트(sheet) 형태의 세포막을 수득하였다.
<실시예 4> 마이크로 어레이 분석
실시예 3에서 제조된 TAP의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다. 전체 사람 게놈 Agilent 4 × 44K Oligonucleotide Microarray (Macrogen, Korea)를 이용하여 실시예 3에서 제조된 두 개의 TAP에서 매우 발현이 증가된 유전자들을 선택하였다.
간략하게, TAP, 사람 연골세포 또는 골수 기질 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 마이크로 어레이 칩 하이드리드화에 적용하였다. 건강한 사람 연골 세포와 TAP의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위해, 조직 적합에 대한 대표 유전자를 선택하고 마이크로 어레 분석을 수행하였다.
이후, 사람 태아 연골조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 시트로 배양하였을 때 발현된 전착 관련 유전자를 비교하여 도 1과 같은 유전자 발현을 확인하였다.
또한, 사람 태아연골 조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 성인 연골조직 유래 세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자 발현 비교한 결과, 도 2와 같은 유전자 발현 결과를 확인하였다.
마지막으로 사람 태아연골 조직 유래 세포를 생체 접착성이 뛰어난 시트로 배양하였을 때 발현하는 유전자와 사람 골수유래 중간엽 줄기세포를 일반적인 세포배양법으로 배양하였을 때 발현하는 접착 관련 유전자 발현 비교하여, 도 3과 같은 유전자 발현 결과를 확인하였다.
상기 결과들로부터 사람 태아연골조직 유래 세포를 이용하여 시트 형태로 배양하였을 때 발현된 유전자를 확인하여 하기 표 1과 같이 특이적으로 발현된 접착 관련 유전자를 확인할 수 있었다.
유전자 유전자 번호 Sequence
CTGF CCN2 또는 connective tissue growth factor HM015591
NDST1 Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 1 U17970
EXT1 Exostosin-1 Q16394
ITGA3 Integrin alpha-3 AC002401
CYTL1 Cytokine-like protein 1 BC031391
TGFB1 Transforming growth factor beta-1 proprotein BT007245
SOCS3 Suppressor of cytokine signaling 3 AF159854
VCAN Versican U26555
CHI3L2 Chitinase-3-like protein 2 U49835
KRT19 Keratin, type I cytoskeletal 19 AF202321
<실시예 5> 목표 유전자를 처리한 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 제조(TAP)
상기 실시예 4에서 확인된 CTGF(CCN2) 및 EXT1을 도 4에서 표기된 것과 같이 벡터와 결합한 후 클로닝을 통하여 삽입 유전자를 제조하였다. 유전자 삽입(gene knock-in)은 Gene Transfection Reagent(Lipofectamine 3000 Thermo)을 이용하여 수행하였다. 동일한 조건으로 각 유전자의 siRNA(바이오닉스) 처리하여 유전자 넉다운 (Knock-down) 실험을 수행하였다.
도 5 및 도 7과 같이 사람 연골세포(chondrocyte)와 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)에 상기 삽입 유전자를 3일 동안 처리하여 세포에 삽입하고 실시예 3과 같은 방법으로 세포막 수득하였다.
상기 과정으로 제조된 조직 유합용 조성물에서 유전자 발현을 확인하기 위해, 각 유전자를 처리하여 배양한 연골세포와 태아 연골조직 유래 줄기세포(FCPC)로부터 수득된 세포막을 이용하여 실시간 PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하였다.
그 결과, 도 6과 같이 목표 유전자가 삽입된 연골세포에 EXT1와 CTGF 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 도 8과 같이 목표 유전자가 삽입된 태아 연골조직 유래 줄기세포에서도 EXT1와 CTGF 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 7과 같이 목표 유전자의 siRNA가 삽입된 태아 연골조직 유래 줄기세포에서는 EXT1와 CTGF 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 EXT1와 CTGF이 연골세포와 태아 연골조직 유래 줄기세포에 효과적으로 삽입되어 EXT1와 CTGF 유전자의 발현이 증가된 세포막이 수득된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 조직 유합용 조성물의 접착강도 확인
상기 실시예 3 및 5에서 제조된 TAP 및 각 유전자를 처리한 조직 유합용 조성물의 접착강도를 확인하기 위해 접착력을 비교하였다.
먼저, 인공관절 수술 후 폐기되는 환자의 연골조직을 동의서와 함께 기증받았다. 기증받은 환자의 연골조직 표면에 6mm biopsy punch를 이용하여 연골손상 모델을 제작하고, 제조된 유합용 조성물을 삽입하였다.
다음으로 도 11과 같은 과정으로 직경 5 mm의 지그가 삽입된 TAP에 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분으로 속도로 끌어 당기면서 지그가 TAP와 분리될 때까지의 저항력을 확인하였다.
태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 제작된 연골 조직 유합제 조성물 (TAP-C)와 각 유전자를 처리한 세포막을 비교한 결과, 도 12와 같이 배양 1주차 및 배양 2주차에서는 뚜렷한 차이점이 확인되지 않았으나, 배양 3주차에서 TAP-C 군과 비교하여 유전자 삽입군에서 접착 강도가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었으며, siRNA 삽입을 통하여 유전자 넉다운(Knock-down)된 세포로 제작된 연골 조직 유합제 조성물의 접착 강도는 TAP-C 군보다 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 동일한 방법으로 VCAN을 연골세포에 삽입한 후 생체 조직 접합체를 제조하고 접착능을 확인한 결과, 도 13과 같이 생체 조직 접합체의 연골-뼈 접착력이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

Claims (8)

  1. CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 유효성분으로 함유하며, 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 사람 연골조직 세포 및 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 유합제 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조직 유합제 조성물은 조직 접착제, 조직 봉합제, 유착 방지제, 지혈제 또는 창상 피복제로 사용되는 것을 특징으로 하는 조직 유합제 조성물.
  4. CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 함유하는 조직 유합제 첨가용 조성물.
  5. 세포에 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 하나 이상의 유전자를 삽입하는 단계;
    상기 유전자가 삽입된 세포를 연골분화 배지가 포함된 배지에서 5 내지 10일 간 1차 배양하는 단계;
    상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계; 및
    상기 2차 단층배양된 세포와 세포외기질이 결합된 세포막을 수득하는 단계를 포함하는 조직 유합제 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포는 사람 연골조직 세포 및 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직 유합제 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 1차 배양된 세포를 2차 단층배양하는 단계는 성장배지에서 1차 배양된 세포를 15 내지 20일간 단층배양하는 것을 특징으로 하는 조직 유합제 제조방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 세포막은 CTGF, EXT1, NDST1, ITGA3, CYTL1, TFGB1, SOCS3, VCAN, CHI3L2 및 KRT19로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 세포를 포함하며, 조직 접착성 및 결합력이 증가된 것을 특징으로 하는 조직 유합제 제조방법.
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US20090305415A1 (en) * 2008-06-05 2009-12-10 Huang Lynn L H Method for preserving proliferation and differentiation potential of undifferentiated cells

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