WO2021066134A1 - イヌｃｄ２０に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント - Google Patents

イヌｃｄ２０に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント Download PDF

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    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20. More specifically, it relates to a monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20, which is more effective than existing antibodies.
  • CHOP therapy which is a combination anticancer drug therapy
  • CHOP therapy has been used for B-cell lymphoma in dogs, but the 2-year survival rate is as low as 20%, and most of them recur after remission, so chemotherapy is sufficient treatment. I could't. Therefore, in recent years, an antibody drug targeting CD20 has been developed as a new therapeutic method.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose monoclonal antibodies or antibody fragments against the extracellular region of canine CD20 having a heavy chain variable region consisting of a specific amino acid sequence and a light chain variable region consisting of a specific amino acid sequence. There is.
  • Patent Documents 3 and 4 a humanized monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to CD20 containing an L-chain variable region and an H-chain variable region represented by a specific amino acid sequence, CDR1, CDR2 and QQCDR3
  • a chimeric or humanized monoclonal antibody that binds to CD20 or an antigen-binding fragment thereof, which comprises an L-chain variable region and an H-chain variable region is disclosed.
  • Patent Documents 5 to 7 disclose monoclonal antibodies containing a specific amino acid sequence also in the light chain constant region and the heavy chain constant region.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody against canine CD20, which is more effective than existing antibodies.
  • This monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20 exhibits a superior effect as compared with the existing antibody.
  • the invention was completed.
  • This monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20 is a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a light chain variable region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the SEQ ID NO:
  • the present invention for solving the above problems relates to a monoclonal antibody against canine CD20, an antibody fragment, and the like shown in the following (1) to (11).
  • the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a composition for reducing canine B cells which comprises the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (3) above as an active ingredient.
  • a composition for treating a disease caused by an increase in canine B cells which comprises the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (3) above as an active ingredient.
  • the therapeutic composition according to (5) above, wherein the disease is either B-cell lymphoma, leukemia or an autoimmune disease.
  • a dog B cell detection kit containing the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (3) above.
  • a kit for diagnosing a disease caused by an increase in canine B cells which comprises the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (3) above.
  • the present invention makes it possible to provide a monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20, which is more effective than existing antibodies.
  • the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment” of the present invention is an antibody or antibody fragment that recognizes a canine CD20 molecule, and is 1 or a number in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • One or several amino acids are deleted or substituted in the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted or added, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • it has a light chain variable region consisting of an added amino acid sequence, and one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • several pieces are 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 pieces. means.
  • "Several" means 5, 4, 3, or 2 and so on.
  • the "anti-canine CD20 monoclonal antibody or antibody fragment" of the present invention can bind well to the extracellular region of canine CD20, and is positive for CD20 by FACS analysis using live canine cells and tissues, fluorescence microscopy, and the like. It can be used for analysis of cell dynamics and the like.
  • the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment” of the present invention may be a monoclonal antibody or antibody fragment against defucosylated dog CD20.
  • composition for reducing dog B cells refers to a composition for reducing dog B cells containing the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment" of the present invention as an active ingredient. If it is useful for the reduction of canine B cells, it may contain other components in addition to these active ingredients, or may further contain a drug such as an anticancer agent or a radionuclide. In addition, it may contain a pharmaceutically acceptable additive, and examples of such an additive include a solvent such as water, a surfactant, sodium chloride, sodium citrate, anhydrous citric acid, a pH adjuster and the like. Be done.
  • composition for treating a disease caused by an increase in canine B cells comprises the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment" of the present invention as an active ingredient for treating a disease caused by an increase in canine B cells.
  • diseases include canine B cell lymphoma caused by an increase in canine B cells, leukemia in which the increased B cells become tumors, and an autoimmune disease caused by an excessive increase in normal B cells.
  • the active ingredient "antibody” can be administered by administering the "composition for treating a disease due to an increase in canine B cells" of the present invention to an affected dog.
  • ADCC Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity
  • CDC Complement-Dependent Cytotoxicity
  • composition for treating a disease caused by an increase in canine B cells may be a composition comprising an active ingredient "anti-canine CD20 monoclonal antibody or antibody fragment", and in addition to these active ingredients.
  • Anti-cancer agents, radionuclides and other other components and agents may be further included.
  • any form of the agent may be used as long as it is effective in treating a disease caused by an increase in canine B cells, and may be provided as a liquid or powder for intravenous injection or infusion, tablets, capsules or the like.
  • the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment" of the present invention is adjusted to 1 to 10 mg / kg per week. Examples thereof include administration at intervals of about once.
  • the “dog B cell detection kit” of the present invention is a kit for detecting whether or not a sample contains dog B cells using the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment” of the present invention.
  • the “kit for diagnosing diseases caused by an increase in canine B cells” of the present invention refers to whether the target dog is affected by a disease caused by an increase in canine B cells such as canine B cell lymphoma, leukemia and autoimmune disease. It is a kit for diagnosing whether or not it is present.
  • kits include at least the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment” of the present invention as one of the constituents.
  • the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment” included in the kit of the present invention may be unlabeled or labeled with a conventionally known labeling substance such as an enzyme, a fluorescent substance or a radioactive substance.
  • labeling substances include peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, lactate dehydrogenase, amylase and the like as enzymes.
  • fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), Cy3, Cy5, R-phycoerythrin, B-phycoerythrin, Alexafluoro488 or Alexafluoro647, and examples of the radioactive substance are tritium. , Iodine-125, iodine-131 and the like.
  • biotin, streptavidin and the like may be used.
  • kits for detecting canine B cells and “kit for diagnosing diseases caused by an increase in canine B cells” of the present invention conventionally known useful for detecting canine B cells and diagnosing diseases caused by an increase in canine B cells. Any of the following reagents, devices, etc. may be used. Lymphocytes are isolated from living tissues such as canine blood to be diagnosed, and the "anti-dog CD20 monoclonal antibody or antibody fragment" contained in these kits is allowed to act on them. By observing the dynamics and morphology of CD20-positive cells by FACS analysis or fluorescence microscope observation, it is possible to detect canine B cells and diagnose diseases due to an increase in canine B cells. By using these kits, living cells can be detected or diagnosed, and cell fixation operations and the like are not required, so that detection or diagnosis can be performed accurately and easily.
  • Example preparation 1) Cell preparation and culture (1) CLBL-1 as a canine B cell lymphoma cell line (distributed by Dr. Rutgen (Yamaguchi University)), UL-1 cell as a canine T cell lymphoma cell line (Yamaguchi University), Nody-1 cells (Yamaguchi University), Ema cells (Yamaguchi University), CLK cells (Yamaguchi University), CLC cells (Yamaguchi University), CLGL-90 (distributed by Dr. Wellman (Ohaio State University)), 17-71 ( (Provided by Dr.
  • Rat kidney cell line (NRK cell line) (Cosmobio), human kidney cell line (HEK293T cell) (Cosmobio) and packaging cell line (PLAT-E cell line, PLAT-gp cell line and PG13 cell line) ( Cosmobio) used a humidified incubator (5% CO 2 , 37 ° C) in D10 medium (DMEM medium supplemented with 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 55 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol). Cultivated using.
  • D10 medium D10 medium supplemented with 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 55 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol.
  • PBMCs cells Canine peripheral blood mononuclear cells
  • Lymphoprep TM Lymphoprep TM
  • Some of the isolated PBMCs cells were directly stained by flow cytometry or inoculated into mice as effector cells.
  • R10 medium supplemented with 1,000 IU / ml human recombinant IL-2 (Proleukin®, Chiron Therapeutics, Emeryville) for use in ADCC assays as lymphokine-activated killer (LAK) effector cells.
  • the cells were cultured in a humidified incubator (5% CO 2 , 37 ° C.) for 7 days.
  • Tumor cells Primary lymphoma cells were obtained from enlarged lymph nodes in dogs who visited the Yamaguchi University Animal Medical Center for diagnosis and treatment. After confirming by cytology that all samples contained 90% or more of lymphoblasts, the samples were centrifuged and used for flow cytometric staining with the consent of the owner.
  • CD20 canine CD20
  • IgG heavy chain constant region and light chain constant region was performed.
  • the CD20, IgG heavy chain region and IgG ⁇ light chain region were amplified by PCR using the nucleotide sequence of canine CD20 (NCBI registration number: AB210085) as a template and each primer shown in Table 1. All the primers used in this example were obtained by consignment.
  • PCR uses KOD DNA polymerase-Plus (TOYOBO) and undergoes a denaturation step at 95 ° C for 2 minutes, followed by 30 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 to 1.5 minutes. I went there. It was then incubated at 72 ° C. for 10 minutes in the presence of Taq DNA polymerase.
  • KOD DNA polymerase-Plus TOYOBO
  • the amplification product was ligated to a vector using TOPO TA cloning kit (Thermo Fisher Scientific), and the plasmid ligated with CD20 was linked with pCR-cCD20, and the plasmid ligated with IgGB among the plasmids linked with the IgG heavy chain region.
  • the plasmid in which pCR-HB and IgGC were linked was named pCR-HC
  • the plasmid in which the IgG ⁇ light chain region was linked was named pBS- ⁇ .
  • the nucleotide sequences of the amplification products in these plasmids were analyzed using the ABI PRISM 3100-Avant sequencer (DNA Core Facility, Genetic Research Center, Yamaguchi University).
  • CMV-cCD20-Flag-IP # 4 was introduced into packaging cell line PLAT-gp or HEK293T cells.
  • NRK cells, Jurkat cells and EL-4 cells are infected with the produced retrovirus and cultured in the presence of puromycin (10 ⁇ g / ml and 4 ⁇ g / ml) to generate NRK / cCD20 as canine CD20 overexpressing cells.
  • Lymphocytes were collected from the lymph nodes and fused with P3U1 cells, a mouse myeloma cell line.
  • hybridoma culture supernatant was collected, and a hybridoma producing a monoclonal antibody reactive with NRK / cCD20 cells and Jurkat / cCD20 cells was screened by flow cytometry (FACS). Finally, a single hybridoma clone (4E1-7) was isolated by the limiting dilution method, and then the medium was adapted to serum-free medium, hybridoma SFM (Thermo Fisher Scientific K.K.). The supernatant was pooled and the monoclonal antibody was purified by HiTrap Protein A HP column (GE Healthcare UK Ltd). Finally, antibody subclasses were determined by flow cytometry.
  • 4E1-7 reacts with NRK / cCD20 cells but not with NRK cells and binds to the canine B-cell lymphoma cell line CLBL-1 in a concentration-dependent manner, but other canine lymphoma cell lines (GL-1, It did not bind to CL-1, Ema, UL-1, CLC, CLK, CLGL90 and 17-71 cell lines). Furthermore, it reacted with Jurkat / cCD20 cells but not with Jurkat cells.
  • Anti-Flag antibody detected a band of appropriate molecular weight (37 kDa) of canine CD20 in the cell lysate of Jurkat / cCD20 cells. Similar bands were also detected in 4E1-7 immunoprecipitated cell lysates from Jurkat / cCD20 cells. However, 4E1-7 did not detect bands in cell lysates from Jurkat / cCD20 cells, suggesting that 4E1-7 recognizes non-linear epitopes. From these results, it was confirmed that 4E1-7 is a monoclonal antibody specific for the canine CD20 molecule.
  • DCTP was added to the 5'end of the obtained cDNA using terminal transferase (TOYOBO), followed by PCR reaction using primers YTM166 and YTM171 or YTM172 having poly G at the 3'end. This amplification product was further amplified with primers YTM166 and YTM173 or YTM174.
  • the PCR product was ligated to the SmaI site of the pBluescript SK (-) plasmid (Promega KK), and the nucleotide sequence was determined by a gene analyzer (ABI PRISM 3100-Avant sequencer (DNA core facility, Yamaguchi University Genetic Research Center)).
  • the variable region (SEQ ID NO: 2) of 4E1-7 ( ⁇ chain) and the constant region (pBS- ⁇ ) (SEQ ID NO: 3) of the canine IgG light chain ( ⁇ chain) were assembled by overlapping PCR, and pCAGGS- It was ligated to the MCS vector to obtain pCAGGS-4E1-7V ⁇ C ⁇ # 25.
  • variable regions of 1E4 heavy chain and 1E4 light chain were synthesized based on the description in Reference Material 1 and Patent Document 1 below (Genscript). ..
  • the plasmid encoding the chimeric antibody 1E4-B is the 1E4 scFV plasmid, the constant region (pBS- ⁇ ) of the canine IgG light chain ( ⁇ chain) (SEQ ID NO: 3), or IgG-B (pBS) of the canine IgG heavy chain. It was constructed by overlapping PCR of the constant region (SEQ ID NO: 4) of -HB).
  • NRK / cCD20 cells were first stained with anti-dog CD20 antibody (4E1-7) and then with biotin-labeled anti-rat IgG- ⁇ or anti-rat IgG- ⁇ . Then, anti-rat IgG1 antibody, anti-rat IgG2a antibody, or anti-rat IgG2b antibody was added and incubated with streptavidin-PE (ebioscience). After the reaction, the results were analyzed by BD Accuri C5 (BD Biosciences) by FlowJo v.10 software (Tree Star Inc.).
  • Anti-Flag M2 antibody (Sigma-Aldrich Japan) and anti-actin mouse monoclonal antibody (Sigma-Aldrich Japan) are used as the primary antibody, and HRP-binding anti-rat Ab (Zymed) or anti-mouse Ab (Biorad) is used as the secondary antibody. ) was used.
  • the membrane was immersed in a Western Illumination chemiluminescent reagent (Perkin Elmer), and the results were confirmed using a Luminescent Image Analyzer LAS 3000 mini (FIJIFILM).
  • FIJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS 3000 mini
  • the cell lysate prepared above was pre-clarified with 10 ⁇ l of protein A / G agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) at 4 ° C.
  • CLBL-1 cells (2 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l) were seeded on a 96-well microtiter plate containing each antibody obtained in 7) above. The CLBL-1 cells and each antibody were then incubated on ice for 15 minutes, followed by the addition of 10 ⁇ g / ml anti-dog IgG Fc-specific antibody (Jackson Immunoresearch). After incubating this for 72 hours, 10 ⁇ l of CCK-8 solution (DOJINDO) was added to each well and incubated for another 2 hours. Then, the absorbance at 450 nm was measured with an ARVO X 4 microplate reader (Perkin Elmer).
  • both 4E1-7-B and 4E1-7-C induced cell lysis of CLBL-1 / luc cells in a concentration-dependent manner. This activity was stronger in 4E1-7-B than in 4E1-7-C. In contrast, the 1E4-B antibody showed no ADCC activity. Furthermore, as shown in FIG. 7, both 4E1-7-B and 4E1-7-B_f antibodies induced cytopathic effects in CLBL-1 / luc cells, whereas 4E1-7-B_f was 4E1-7-. It showed almost 10 times more cytotoxic effect than B.
  • 4E1-7-C did not induce cell death of CLBL-1 / luc cells like 1E4-B, but 4E1-7-B did not induce cell death in a concentration-dependent manner. It was confirmed that it induces death. Further, as shown in FIG. 9, it was confirmed that both 4E1-7-B and 4E1-7-B_f induce cell death in a concentration-dependent manner.
  • Apoptosis assay CLBL-1 cells (1 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l) were seeded on a 24-well plate containing either rat IgG2a or 4E1-7 antibody. After 72 hours of incubation, cells were stained with FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) and analyzed by flow cytometry.
  • canine PBMCs (5 ⁇ 10 6 cells) freshly isolated from healthy beagle dogs were suspended in 60 ⁇ l PBS and injected around the tumor to complement NK cell activity. Mice were sacrificed when the tumor reached 2,000 mm 3 or 13 days after the start of treatment.
  • mice to which PBMC alone was administered showed a slight delay in tumor growth as compared with the mice to which PBS alone was administered as a control (FIG. 10A).
  • FIGS. 10A and 10B the mice to which PBMC alone was administered
  • FIGS. 10A and 10B showed a slight delay in tumor growth as compared with the mice to which PBS alone was administered as a control (FIG. 10A).
  • 4E1-7-B and PBMC-treated mice (Fig. 11A) delayed tumor growth in 2 of the 4 mice
  • 4E1-7-Bf and PBMC-treated mice were all 4 mice. It was confirmed that the tumor growth of the mouse was suppressed.
  • a heavy chain consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by going through the steps 1) to 16) above. It has a variable region and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and A monoclonal antibody or antibody against canine CD20 having a light chain constant region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Fragments were obtained.
  • the present invention makes it possible to provide a monoclonal antibody or antibody fragment against canine CD20, which is more effective than existing antibodies.

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Abstract

既存の抗体と比べて、より効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体の提供を課題とする。　配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを提供する。

Description

イヌＣＤ２０に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント
　本発明はイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。さらに詳しくは既存の抗体と比べて、より効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントに関する。
　イヌのB細胞型リンパ腫において多剤併用抗がん剤療法であるCHOP療法が行われてきたが、2年生存率は20％と低く、ほとんどが寛解後に再発するため、化学療法では十分な治療ができなかった。そこで、新たな治療方法として近年では、CD20をターゲットとした抗体医薬が開発されている。例えば、特許文献１、２において、特定のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び特定のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有するイヌCD20の細胞外領域に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント等が開示されている。
　また、特許文献３、４において、特定のアミノ酸配列で表されるL鎖可変領域とH鎖可変領域を含んでなるCD20と結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントや、CDR１、CDR２及びQQCDR３を有するL鎖可変領域とH鎖可変領域を含んでなる、CD20と結合するキメラ又はヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが開示されている。さらに、特許文献５～７においては、軽鎖定常領域や重鎖定常領域においても特定のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体が開示されている。
　このように様々なCD20に対する抗体が開発されているものの、抗体によって効果がまちまちであり、優れた効果を有する抗体が得られているとは言えなかった。そこで、本発明者らは、イヌCD20に対するラットイヌキメラ抗体を開発し（特許文献８、参照）、本発明において、さらに効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体の作製を試みた。
特表2014-532649号公報 特開2016-13104号公報 特表2006-500904号公報 特開2009-291197号公報 特開2016-41750号公報 特開2019-507128号公報 特開2015-501146号公報 特開2019-26625号公報
　本発明は、既存の抗体と比べて、さらに効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体の提供を課題とする。
　本発明の課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、次のイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントが、既存の抗体と比べて、より優れた効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。このイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントである。
　即ち、上記の課題を解決するための本発明は、次の（１）～（１１）に示されるイヌCD20に対するモノクローナル抗体、抗体フラグメント等に関する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（２）配列番号４或いは５に記載のアミノ酸配列又は配列番号４或いは５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を有する上記（１）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（３）脱フコシル化されている上記（１）又は（２）に記載の抗体又は抗体フラグメント。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の減少用組成物。
（５）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物。
（６）疾患が、B細胞性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患のいずれかである上記（５）に記載の治療用組成物。
（７）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌB細胞検出用キット。
（８）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌB細胞の増加による疾患の診断用キット。
（９）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする組成物を用いるイヌB細胞の減少方法。
（１０）上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする組成物を用いるイヌB細胞の増加による疾患の治療方法。
（１１）疾患が、B細胞性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患のいずれかである上記（１０）に記載の治療方法。
　本発明によって既存の抗体と比べてさらに効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントの提供が可能となる。また、このモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の減少用組成物やイヌB細胞の減少方法、又はB細胞性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患等のイヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物やイヌB細胞の増加による疾患の治療方法等の提供が可能となる。
4E1-7-B抗体及び4E1-7-C抗体が濃度依存的にCLBL-1細胞に結合することを示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-C抗体がEL-4/cCD20細胞に結合することを示した図である（実施例）。 4E1-7-B_f抗体が4E1-7-B抗体と同様にCLBL-1細胞に結合することを示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-C抗体のCLBL-1細胞の増殖に及ぼす効果を示した図である（実施例）。 4E1-7-B_f抗体のCLBL-1細胞の増殖に及ぼす効果を示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-C抗体のCLBL-1/luc細胞の細胞溶解に及ぼす効果を示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-B_f抗体のCLBL-1/luc細胞の細胞変性効果を示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-C抗体のCLBL-1/luc細胞に対する細胞死誘導効果を示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-B_f抗体のCLBL-1/luc細胞に対する細胞死誘導効果を示した図である（実施例）。 Ａ．PBS投与によるマウスの腫瘍増殖への影響を示した図である（実施例）。Ｂ．PBMC投与によるマウスの腫瘍増殖への影響を示した図である（実施例）。 Ａ．4E1-7-B抗体とPBMC投与によるマウスの腫瘍増殖への影響を示した図である（実施例）。Ｂ．4E1-7-B_f抗体とPBMC投与によるマウスの腫瘍増殖への影響を示した図である（実施例）。 4E1-7-B抗体及び4E1-7-B_f抗体投与によるイヌ末梢血中のCD21+B細胞発現への影響を示した図である（実施例）。
　本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」とは、イヌのCD20分子を認識する抗体又は抗体フラグメントであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントのことをいう。
　ここで、数個とは、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個又は2個を意味する。数個とは、5個、4個、3個又は2個等を意味する。
　本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」は、イヌCD20の細胞外領域に良好に結合することができ、イヌの生きた細胞や組織を用いたFACS解析、蛍光顕微鏡観察等によるCD20陽性細胞の動態等の解析に用いることができる。
　本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」は脱フコシル化されているイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントであってもよい。
　本発明の「イヌB細胞の減少用組成物」とは、本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」を有効成分とする、イヌB細胞を減らすための組成物のことをいう。イヌB細胞の減少に有用であれば、これらの有効成分に加えて、その他の成分を含むものであってもよく、抗癌剤、放射性核種等の薬剤をさらに含むものであってもよい。また、薬学的に許容可能な添加物を含んでいてもよく、このような添加物として、水等の溶媒、界面活性剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、無水クエン酸、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
　本発明の「イヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物」は、本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」を有効成分とする、イヌB細胞の増加による疾患の治療をするための組成物のことをいう。
　このような疾患として、たとえば、イヌB細胞の増加により生じるイヌB細胞リンパ腫、増加したB細胞が腫瘍化した白血病や、正常なB細胞が増えすぎて起こる自己免疫疾患等が挙げられる。
　例えば、治療の対象となる疾患がB細胞性リンパ腫である場合、本発明の「イヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物」を罹患したイヌに投与することにより、有効成分である「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」がB細胞性リンパ腫細胞の表面に過剰発現しているCD20に結合することで、抗体依存性細胞傷害（Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity、ADCC）活性、補体依存性細胞障害（Complement-Dependent Cytotoxicity、CDC）活性、アポトーシス誘導等の機構により、イヌB細胞性リンパ腫細胞の殺傷等が可能となる。
　本発明の「イヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物」は、有効成分である「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」からなる組成物であってもよく、これらの有効成分に加えて、抗癌剤、放射性核種等のその他の成分や薬剤をさらに含むものであってもよい。
　また、イヌB細胞の増加による疾患の治療に有効な形態であればどのような形態の剤としてもよく、静脈注射や点滴用の液体や粉末、錠剤、カプセル剤等として提供されてもよい。
　本発明の治療用組成物を用いた治療方法としては、例えば、静脈注射、点滴等により、本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」が1～10mg/kgとなるように１週間に１回程度の間隔で投与する等が挙げられる。
　本発明の「イヌB細胞検出用キット」とは、本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」を用いて、試料にイヌB細胞が含まれているか否かを検出するためのキットのことをいう。また、本発明の「イヌB細胞の増加による疾患の診断用キット」とは、イヌB細胞リンパ腫、白血病や自己免疫疾患等のイヌB細胞の増加による疾患に対象となるイヌが罹患しているか否か等を診断するためのキットのことをいう。
　これらのキットは少なくとも本発明の「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」を構成物のひとつとして含む。
　本発明のキットに含まれる「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」は非標識であってもよく、酵素、蛍光物質又は放射性物質等の従来知られている標識物質で標識されていてもよい。
　このような標識物質としては、酵素ではペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ又はアミラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、Cy3、Cy5、R-フィコエリトリン、B-フィコエリトリン、アレクサフルオロ488又はアレクサフルオロ647等が挙げられ、放射性物質としてはトリチウム、ヨウ素125、ヨウ素131等が挙げられる。また、ビオチン、ストレプトアビジン等を用いても良い。
　本発明の「イヌB細胞検出用キット」や「イヌB細胞の増加による疾患の診断用キット」の使用にあたり、イヌB細胞の検出やイヌB細胞の増加による疾患の診断に有用な従来知られているいずれの試薬、機器等を用いても良い。
　診断の対象となるイヌの血液等の生体組織からリンパ球を分離し、これらのキットに含まれる「抗イヌCD20モノクローナル抗体又は抗体フラグメント」を作用させる。FACS解析や蛍光顕微鏡観察等により、CD20陽性細胞の動態や形態を観察することにより、イヌB細胞の検出やイヌB細胞の増加による疾患の診断が可能となる。
　これらのキットを用いることにより、生きた細胞を検出又は診断の対象とでき、細胞の固定操作等も不要であるため、正確かつ簡便に検出又は診断を行うことが可能となる。
　以下に本発明の実施例等を示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
抗イヌCD20モノクローナル抗体の作製
＜試料の調製＞
１）細胞の調製・培養
（１）イヌB細胞リンパ腫細胞株としてCLBL-1（Rutgen博士（ウィーン獣医科大学）より分与）、イヌT細胞リンパ腫細胞株としてUL-1細胞（山口大学）、Nody-1細胞（山口大学）、Ema細胞（山口大学）、CLK細胞（山口大学）、CLC細胞（山口大学）、CLGL-90（Wellman博士（オハイオ州立大学）より分与）、17-71（Kurzman博士（ウィスコンシン大学）より分与）、ヒトリンパ芽球様細胞系（Jurkat細胞）（ATCC：American Type Culture Collection）、マウスリンパ芽球様細胞系（EL-4細胞）（ATCC）、及びマウス骨髄腫細胞系（P3U1細胞）（ATCC）を用いた。これらの細胞はいずれもR10培地（10％FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び55μMのβ-メルカプトエタノールを添加したRPMI1640倍地）中で加湿インキュベーター（5%CO2、37℃）を用いて培養した。
　ラット腎臓細胞株（NRK細胞）（コスモバイオ社）、ヒト腎臓細胞株（HEK293T細胞）（コスモバイオ社）及びパッケージング細胞株（PLAT-E細胞株、PLAT-gp細胞株及びPG13細胞株）（コスモバイオ社）はいずれもD10培地（10％FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び55μMのβ-メルカプトエタノールを添加したDMEM培地）中で加湿インキュベーター（5%CO2、37℃）を用いて培養した。
　イヌ末梢血単核細胞（PBMCs細胞）は山口大学動物医療センターにおいて、健康なビーグル犬から、Lymphoprep（商標）（Axis-Shield Ltd.社）を用いて常法に従って単離した。単離したPBMCs細胞の一部はそのままフローサイトメトリー染色や、マウスにエフェクター細胞として接種した。また、リンホカイン活性化キラー（LAK）エフェクター細胞としてADCCアッセイに使用するために1,000IU/mlのヒト組換えIL-2（Proleukin（登録商標）、Chiron Therapeutics、Emeryville社）を添加したR10培地中で加湿インキュベーター（5%CO2、37℃）を用いて7日間培養した。
（２）腫瘍細胞
　原発性リンパ腫細胞は、診断及び治療のために山口大学動物医療センターを訪問したイヌの拡大リンパ節から得た。細胞診により、すべての試料がリンパ芽球を90％以上含むことを確認した後、試料を遠心分離し、所有者の同意を得てフローサイトメトリー染色に使用した。
２）分子クローニング
　健康なビーグル犬の子宮頸部リンパ節又は脾臓を用いてイヌCD20（以下、単にCD20と示す場合がある）、IgG重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の分子クローニングを行った。
　CD20、IgG重鎖領域及びIgGκ軽鎖領域は、イヌCD20のヌクレオチド配列（NCBI登録番号：AB210085）を鋳型として、表１に記載の各プライマーを用いてPCRにより増幅した。なお、本実施例において用いたプライマーはいずれも委託により得た。
　PCRはKOD DNAポリメラーゼ-Plus（TOYOBO社）を用いて、95℃で2分間の変性工程を経た後、95℃で30秒間、56℃で30秒間及び72℃で1～1.5分間を30サイクル繰り返すことで行った。その後Taq DNAポリメラーゼの存在下で、72℃で10分間インキュベートした。
　増幅生成物はTOPO TAクローニングキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてベクターに連結し、CD20を連結したプラスミドをpCR-cCD20、IgG重鎖領域を連結したプラスミドのうち、IgGBを連結したプラスミドをpCR-H-B、IgGCを連結したプラスミドをpCR-H-C、IgGκ軽鎖領域を連結したプラスミドをpBS-κと命名した。これらのプラスミドにおける増幅生成物の塩基配列はABI PRISM 3100-Avantシーケンサー（山口大学遺伝子研究センターDNAコアファシリティ）を用いて解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３）発現プラスミドの作製
（１）FLAGでタグ付けされたイヌCD20発現プラスミド作製
　上記２）で作製したpCR-cCD20を表２に記載のYTM1233プライマー及びYTM1234プライマーを用いてPCRにより増幅した後、YTM1233プライマー及びYTM838プライマーを用いて次のPCRを行った。
　増幅生成物はBamHIで切断し、pMXs-IP（Kurzman博士（ウィスコンシン大学）より分与）のBamHI及びSnaBI部位に連結し、pMx-IP-cCD20-flag＃4を得た。このpMx-IP-cCD20-flag＃4のBamHI-HincIIフラグメントをCSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd（DNA Bank、茨城、理化学研究所バイオリソースセンターより分与）のBamHI-HpaI部位に挿入し、レンチウイルス発現プラスミドとしてCSII-CMV-cCD20-Flag-IP＃4を作製した。
（２）ルシフェラーゼのレトロウイルス発現プラスミドの作製
　表２に記載のプライマーYTM912及びYTM913を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅し、AgeIで切断してpGL4.50luc2のHindIII-AgeIフラグメントを有するpBluescript SK(-)プラスミド（Promega KK社）のHindIII-EcoRV部位に連結しpBS-luc2を得た。このpBS-luc2のXhoI-NotIフラグメントを切り出し、pMX-IP（Kurzman博士（ウィスコンシン大学）より分与）のXhoI-NotI部位に挿入し、ルシフェラーゼのレトロウイルス発現プラスミドとしてpMX-luc-IP＃9を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
４）細胞株の樹立
　上記３）（１）で作製したpCAGGS-VSVGを有するpMx-IP-cCD20-flag#4、又は同じく上記３）（１）で作製したpCVSVG及びp8.9QVを有するCSII-CMV-cCD20-Flag-IP＃4を、パッケージング細胞系PLAT-gp又はHEK293T細胞に導入した。 
　NRK細胞、Jurkat細胞及びEL-4細胞は産生されたレトロウイルスを用いて感染させ、ピューロマイシン（10μg/ml及び4μg/ml）の存在下で培養して、イヌCD20過剰発現細胞としてNRK/cCD20細胞、Jurkat/cCD20細胞、及びEL-4/cCD20細胞を得た。
　また、ルシフェラーゼ遺伝子発現CLBL-1細胞株を得るために上記３）（２）で作製したpMX-luc-IP＃9をPLAT-E細胞に導入した。産生されたレトロウイルスをPG13パッケージング細胞株（PG13/luc）に添加し、さらにPG13により産生されたレトロウイルスをCLBL-1細胞に添加し、続いて0.5μg/mlのピューロマイシンの存在下で選択してCLBL-1/luc細胞を得た。
５）モノクローナル抗体の作製
　本発明者らの先行特許出願（特開2019-26625号公報）と同様に、イヌCD20に対するモノクローナル抗体として4E1-7抗体を作製した。
　即ち、上記４）にて樹立したNRK/cCD20細胞をSDラットに免疫した。即ち、NRK/cCD20細胞をアジュバントであるTiter Max（登録商標） Gold（CytRx社）と混合し、6週齢のSprague-Dawley（SD）ラット（Kyudo社）の皮下に注射した。該ラットは山口大学動物愛護ガイドラインに基づき、特定の病原菌が存在しない場所に生息させた。免疫から10日後、1×107細胞を足蹠にさらに注射し、2日後に膝窩リンパ節を切除した。リンパ節からリンパ球を回収し、マウスミエローマ細胞株であるP3U1細胞と融合した。
　得られたハイブリドーマの培養上清を回収し、フローサイトメトリー（FACS）により、NRK/cCD20細胞及びJurkat/cCD20細胞に対して反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。限界希釈法により、最終的に単一のハイブリドーマクローン（4E1-7）を単離し、続いて培地を無血清培地、ハイブリドーマSFM(Thermo Fisher Scientific K.K.社)に適合させた。上清をプールし、モノクローナル抗体をHiTrap Protein A HPカラム（GE Healthcare UK Ltd社）により精製した。最後に、抗体のサブクラスをフローサイトメトリーによって決定した。
　その結果、得られた抗イヌCD20モノクローナル抗体（4E1-7）はサブクラスがラットIgG2aであることが確認された。4E1-7はNRK/cCD20細胞と反応するが、NRK細胞とは反応せず、イヌB細胞リンパ腫細胞株CLBL-1に濃度依存的に結合したが、他のイヌリンパ腫細胞株（GL-1、CL-1、Ema、UL-1、CLC、CLK、CLGL90及び17～71細胞株）には結合しなかった。さらに、Jurkat/cCD20細胞と反応するが、Jurkat細胞とは反応しなかった。
　抗Flag抗体によりJurkat/cCD20細胞の細胞溶解物中にイヌCD20の適切な分子量(37kDa)のバンドを検出した。また、Jurkat/cCD20細胞からの4E1-7免疫沈降細胞溶解物中にも同様のバンドが検出された。しかし、4E1-7はJurkat/cCD20細胞からの細胞溶解物中のバンドを検出せず、これは4E1-7がノンリニアエピトープを認識することを示唆していた。
　これらの結果から4E1-7がイヌCD20分子に特異的なモノクローナル抗体であることが確認できた。
６）キメラ抗CD20抗体発現ベクターの作製
　上記５）で得たモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を得るために、遺伝子特異的プライマーを用いてハイブリドーマクローン（4E1-7）の5'RACEを行った。
　即ち、4E-7ら全RNAを抽出し、Superscript II(Thermo Fisher Scientific KK社)及び表３に記載の遺伝子特異的プライマーYTM171（κ軽鎖用）を用いて逆転写した。以下、使用したプライマーの配列も表３に示した。
　5'RACEにはYTM172（重鎖用）プライマーを用いた。得られたcDNAの5'末端にターミナルトランスフェラーゼ（TOYOBO社）を用いてdCTPを加え、続いて3'末端にポリGを有するプライマーYTM166及びYTM171又はYTM172を用いてPCR反応を行った。この増幅産物をプライマーYTM166及びYTM173又はYTM174を用いてさらに増幅した。
　PCR産物をpBluescript SK(-)プラスミド（Promega KK社）のSmaI部位に連結し、塩基配列を遺伝子分析器（ABI PRISM 3100-Avantシーケンサー（山口大学遺伝子研究センターDNAコアファシリティ））によって決定した。
　4E1-7（κ鎖）の可変領域（配列表配列番号２）及びイヌIgG軽鎖（κ鎖）の定常領域(pBS-κ)（配列表配列番号３）をオーバーラップPCRによって組み立て、pCAGGS-MCSベクターに連結し、pCAGGS-4E1-7VκCκ#25を得た。
　4E1-7（重鎖）の可変領域（配列表配列番号１）及びイヌIgG重鎖のうちIgG-B(pBS-HB)の定常領域（配列表配列番号４）又はIgG-C(pBS-HC)の定常領域（配列表配列番号５）をそれぞれオーバーラップPCRによって組み立て、pCAGGS-MCSベクターに連結し、それぞれpCAGGS-4E1-7VH-CHB#31又はpCAGGS-4E1-7VH-CHC#6を得た。
　なお、抗体機能の比較として公知の抗体（1E4-B）を得るために、下記参考資料１及び特許文献１の記載に基づいて1E4重鎖及び1E4軽鎖の可変領域を合成した（Genscript社）。
　キメラ抗体1E4-Bをコードするプラスミドは、1E4 scFVプラスミド、イヌIgG軽鎖（κ鎖）の定常領域(pBS-κ)（配列表配列番号３）又はイヌIgG重鎖のうちIgG-B(pBS-HB)の定常領域（配列表配列番号４）のオーバーラップPCRによって構築した。
参考資料１：
Rue SM, Eckelman BP, Efe JA, Bloink K, Deveraux QL, Lowery D, et al. Identification of a candidate therapeutic antibody for treatment of canine B-cell lymphoma. Vet Immunol Immunopathol 2015;164:148-159.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
７）抗体の製造及び精製
　上記６）で得た各発現プラスミドをxpi293発現系(Thermo Fisher Scientific KK社)を用いてHEK293細胞又はPDIS-5（コアフコースKO CHO-S）細胞（Sigma-Aldrich Japan社）に導入した。
　各プラスミド導入後、培養した細胞の上清を回収し、HiTrap ProteinA HPカラム（GE Healthcare社）を用いて精製し、さらにPD10カラム（GE Healthcare社）で脱塩した。
　精製して得られた各抗体は4E1-7、イヌIgG重鎖のうちIgG-Bの定常領域を有する抗体は4E1-7-B、IgG-Cの定常領域を有す抗体は4E1-7-C、比較用の抗体は1E4-Bと示した。また、脱フコシル化抗体は4E1-7-B_fと示した。
８）フローサイトメトリー
　上記７）において培養した各細胞を収集し、緩衝液（2%FBS及び0.1%NaN3を含むPBS）で洗浄した後、2×105細胞を第一抗体（PE標識抗CD21抗体（Biorad、Hercules、CA））で染色した。アイソタイプコントロールにはラットIgG2a（バイオレジェンドジャパン社）を用いた。次に、二次抗体（PE標識抗ラットIgG（SouthernBiotech社）、Dylight 649標識抗ラットIgG（BioLegend社）、又はAlexa 647標識抗犬IgG（JacksonImmunoresearch社）で染色した。
　4E1-7のサブクラスを決定するために、まずNRK/cCD20細胞を抗イヌCD20抗体（4E1-7）で染色し、次にビオチン標識抗ラットIgG-κ又は抗ラットIgG-λで染色した。その後、抗ラットIgG1抗体、抗ラットIgG2a抗体、又は抗ラットIgG2b抗体を加え、ストレプトアビジン-PE（ebioscience社）とともにインキュベートした。反応後、FlowJo v.10ソフトウェア（Tree Star Inc.社）によってBD Accuri C5（BD Biosciences社）により結果を分析した。
　その結果、図１に示すように、4E1-7-B及び4E1-7-Cのいずれの抗体もCLBL-1細胞株に濃度依存的に結合することが確認された。また図２に示すように、これらの抗体は1E4-Bと比べて強くEL-4/cCD20細胞に結合することが確認できた。
　さらにまた、図３に示すように、4E1-7-B_fも、4E1-7-Bと同様にCLBL-1細胞株に結合した。
９）ウェスタンブロッティングと免疫沈降
　上記７）において培養した各細胞を1% NP40緩衝液中で15分間、4℃で溶解した。細胞溶解物を15,000×g、4℃で15分間遠心分離した。Pierce BCAタンパク質アッセイ（Thermo Fisher Scientific K.K.社）によってタンパク質濃度を調べウェスタンブロッティング及び免疫沈降に用いた。
　参考資料２の記載に基づき、定法によりSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングを行った。一次抗体として抗Flag M2抗体（Sigma-Aldrich Japan社）、抗アクチンマウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich Japan社）を用い、二次抗体としてHRP結合抗ラットAb（Zymed社）又は抗マウスAb（Biorad社）を用いた。反応後メンブレンをウエスタン照明化学発光試薬（Perkin Elmer社）に浸漬し、Luminescent Image Analyzer LAS 3000 mini（FIJIFILM社）を用いて結果を確認した。
　免疫沈降にあたり、上記において調製した細胞溶解物を回転させながら4℃で1時間、10μlのプロテインA/Gアガロース（Santa Cruz Biotechnology、Inc.社）で予備清澄化した。この上清10μlと、上記７）において得た各抗体をプロテインA/Gアガロースと混合したもの1μgを4℃で一晩混合した。その後、免疫沈降物をPBSで３回洗浄し、上記のようにウェスタンブロッティングに用いた。
参考資料２：
Okawa T, Kurio Y, Morimoto M, Hayashi T, Nakagawa T, Sasaki N, et al. Calreticulin expression in neoplastic versus normal dog mammary glands: A cDNA subtraction-based study. Res Vet Sci 2012;92:80-91.
１０）細胞増殖アッセイ
　CLBL-1細胞（2×104cells/100μl）を、上記７）において得た各抗体を含む96ウェルマイクロタイタープレートに播種した。その後、CLBL-1細胞及び各抗体を氷上で15分間インキュベートし、続いて10μg/mlの抗イヌIgG Fc特異的抗体（Jackson Immunoresearch社）を添加した。これを72時間インキュベートした後、10μlのCCK-8溶液（DOJINDO社）を各ウェルに添加し、さらに2時間インキュベートした。その後、ARVO X 4マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer社）で450nmでの吸光度を測定した。
　その結果、図４に示されるように、4E1-7-B及び4E1-7-CによってCLBL-1細胞を処理したところ、4E1-7と比較して細胞増殖の非常に弱い抑制を示した。この効果は、抗イヌ抗体による4E1-7-B及び4E1-7-Cの架橋によって増強された。一方、1E4-Bは抗イヌIgG架橋の存在下でさえも直接的な細胞殺傷を示さなかった。
　また、図５に示されるように、4E1-7-B_fはCLBL-1細胞の細胞増殖の抑制を示し、これは抗イヌIgGの添加によって増強された。細胞増殖の抑制率は4E1-7-B_f処理CLBL‐1細胞でわずかに高かった。
１１）ADCCアッセイ
　CLBL-1/luc細胞（5×103 cells/well）を、ラットIgG2a(ebioscience社)又は上記７）において得た各抗体のいずれかを含有する96ウェルマイクロタイタープレートに播種した。これを氷上で15分間インキュベートした後、エフェクター細胞としてIL-2で刺激したPBLを20：1のエフェクター/標的比で添加した。この培養物をさらに4時間インキュベートした後、ONE-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega KK社）を用いて細胞溶解した。ルシフェラーゼ活性はARVO X4システム（PerkinElmer社）によって検出した。
　細胞媒介性細胞傷害性は次の式に従って計算した。溶解パーセントは3ウェルを平均して求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　その結果、図６に示されるように、4E1-7-B及び4E1-7-Cはいずれも濃度依存的にCLBL-1/luc細胞の細胞溶解を誘導した。この活性は4E1-7-Bの方が4E1-7-Cよりも強かった。これに対して1E4-B抗体はいかなるADCC活性も示さなかった。
　さらに、図７に示されるように、4E1-7-B及び4E1-7-B_f抗体は両方ともCLBL-1/luc細胞において細胞変性効果を誘導したが、4E1-7-B_fは4E1-7-Bよりもほぼ10倍多い細胞毒性効果を示した。
１２）CDCアッセイ
　CLBL-1細胞(1×105cells/100μl)を、ラットIgG2a抗体又は上記７）において得た4E1-7のいずれかを含有する96ウェルマイクロタイタープレートに播種した。これを氷上で20分間インキュベートした後、LOW-TOX（登録商標）-Hウサギ補体（CEDALANE社;最終濃度1:40）を各ウェルに添加し、さらに90分間インキュベートした。その後、生細胞及び死細胞をトリパンブルー色素排除アッセイによって計数した。
　また、CLBL-1/luc1細胞(1×105cells/100μl)を用い、4E1-7-B又は4E1-7のいずれかを含有する96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、上記と同様に処理し、生細胞及び死細胞を上記１１）のADCCアッセイに示される方法により調べた。
　その結果、図８に示されるように、4E1-7-Cは1E4-Bと同様にCLBL-1/luc細胞の細胞死を誘導しなかったが、4E1-7-Bは濃度依存的に細胞死を誘導することが確認できた。
　また、図９に示されるように、4E1-7-B及び4E1-7-B_fもいずれも濃度依存的に細胞死を誘導することが確認できた。
１３）アポトーシスアッセイ
　CLBL-1細胞(1×105cells/500μl)を、ラットIgG2a又は4E1-7抗体のいずれかを含有する24ウェルプレートに播種した。72時間インキュベートした後、細胞をFITCアネキシンVアポトーシス検出キットI(BDバイオサイエンス社）を用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。
１４）in vivo試験（マウス）
　6～8週齢のNOD.CB17-Prkdcscid/J（NOD/SCID）マウス(Charles river laboratories Japan、Inc社）を特定の病原菌が存在しない場所に生息させた。このNOD/SCIDマウスの側腹部にCLBL-1細胞（1×106cells/30μl PBS）を皮下移植した。接種後、腫瘍の大きさ（２つの垂直方向の寸法）を毎日ノギスで測定した。腫瘍の体積は次の式に従って計算した。腫瘍が150～250mm3に達した段階で、4日ごとに上記７）において得た各抗体（150μg/500μl PBS）を腹腔内注射した。抗体の注射に合わせて、健康なビーグル犬から新たに単離したイヌPBMC（5×106cells)を60μlのPBSに懸濁し、NK細胞活性の補完のために腫瘍の周囲に注射した。腫瘍が2,000mm3に達した場合又は治療開始後13日が経過した後マウスを屠殺した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　その結果、図１０Ａ、Ｂに示されるように、コントロールとしてPBSのみを投与したマウス（図１０Ａ）と比較して、PBMCのみを投与したマウス（図１０Ｂ）では腫瘍増殖のわずかな遅れを示した。さらに4E1-7-BとPBMCを投与したマウス（図１１Ａ）は4匹のうち2匹の腫瘍増殖を遅らせ、4E1-7-BfとPBMCを投与したマウス（図１１Ｂ）では４匹すべてのマウスの腫瘍増殖を抑制することが確認できた。
１５）in vivo試験（イヌ）
　健康なビーグル犬（日本全薬工業株式会社）を4つのグループ（各グループ4匹）に分け、上記７）において得た4E1-7-B又は4E1-7-B_fを0.5mg/kg、5.0mg/kg又は25mg/kgとなるように静脈内注射により投与した。末梢血中のCD21+B細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー分析（Animal Allergy Clinical LABORATORIES社）によってモニターした。
　抗体投与後14日目及び28日目に、各グループの1匹のイヌからリンパ節を得て、3μmの厚さにスライスし、抗CD79a抗体（クローンHM57、希釈1:50、Dako社）で染色し、免疫組織病理学的分析を行った。
　その結果、図１２に示すように、いずれの抗体を投与した場合も投与後1日目のCD21+B細胞のパーセンテージはほぼゼロに減少し、投与後3日目もCD21+B細胞を有さなかった。
　4E1-7-Bを0.5mg/kg投与したグループのイヌではこの状態は投与後7日目まで続き、投与後14日目も１匹は依然としてCD21+B細胞を示さなかった。また、4E1-7-Bを5.0mg/kg投与したグループのイヌは投与後14日目にもCD21+B細胞を示さず、投与後21日目には2匹において若干増加が見られたが、1匹は投与後28日目においてもCD21+B細胞を有さなかった。いずれのグループにおいても、CD21+B細胞のパーセンテージは投与後119日目まで元のパーセンテージに回復せず、いずれもB cells(% of lymphocytes)の値が減少したまま推移していた。従って、この結果から、抗体の効果が長期的に維持されることが示された。4E1-7-B_fを投与したグループも同様の反応を示した。
　また、免疫組織化学的染色の結果、4E1-7-Bを5.0mg/kgを投与した場合、投与後14日目及び28日目に試料中の陽性領域の縮小が確認された。
１６）統計分析
　全てのデータ分析は、JMP14.0ソフトウェア（JMP Japan社）を用いて行った。一元配置分散分析とそれに続くTukey-Kramer多重比較検定を用いてデータを分析した。その結果、P<0.05であれば、有意に異なると判断した。
　上記１）～１６）の工程を経ることにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントが得られた。
　本発明によって既存の抗体と比べてさらに効果が優れたイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメントの提供が可能となる。また、このモノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の減少用組成物やイヌB細胞の減少方法、又はB細胞性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患等のイヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物やイヌB細胞の増加による疾患の治療方法等の提供が可能となる。

Claims (8)

  1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列或いは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２に記載のアミノ酸配列或いは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有し、かつ、配列番号３に記載のアミノ酸配列又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域を有するイヌCD20に対するモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
  2. 配列番号４或いは５に記載のアミノ酸配列又は配列番号４或いは５に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖定常領域を有する請求項1に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  3. 脱フコシル化されている請求項１又は２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の減少用組成物。
  5. 請求項１～３のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを有効成分とする、イヌB細胞の増加による疾患の治療用組成物。
  6. 疾患が、B細胞性リンパ腫、白血病又は自己免疫疾患のいずれかである請求項５に記載の治療用組成物。
  7. 請求項１～３のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌB細胞検出用キット。
  8. 請求項１～３のいずれかに記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イヌB細胞の増加による疾患の診断用キット。
     
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