WO2021048504A1 - Genotyping method suitable for processing a large number of samples, in particular in cases of high polymorphism - Google Patents

Genotyping method suitable for processing a large number of samples, in particular in cases of high polymorphism Download PDF

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WO2021048504A1
WO2021048504A1 PCT/FR2020/051568 FR2020051568W WO2021048504A1 WO 2021048504 A1 WO2021048504 A1 WO 2021048504A1 FR 2020051568 W FR2020051568 W FR 2020051568W WO 2021048504 A1 WO2021048504 A1 WO 2021048504A1
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sequence
primers
sequencing
sequences
universal
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PCT/FR2020/051568
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Pascal Herve
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Bionobis
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the invention relates to a genotyping method for simultaneously processing a large number of DNA samples. More particularly, it relates to a genotyping method comprising a first step of amplification by indexed PCR in a microfluidic system then a second step of high throughput sequencing, this method is simple, rapid and less expensive than the methods of the state of the art. technical.
  • High throughput sequencing (also called NGS for Next Generation Sequencing) allows a very large number of short sequences to be operated in parallel.
  • the principle of this technique is as follows: The sequences to be analyzed are first of all prepared by adding adapter sequences to the ends. They are then fixed on a solid support via these adapter sequences and each fragment is enriched to form clonal “clusters” which will be sequenced subsequently. At each cycle, the addition of a nucleotide results in a fluorescent signal associated with each of the four nucleotides of DNA. These signals are then analyzed by data processing software which reproduces the result of the reading of the sequences. This method is fast and precise.
  • LNA TM bases Locked Nucleix Acid
  • These bases are modified oligonucleotides which obey Watson-Crick base pairing rules and form duplexes, which are significantly more stable than similar duplexes formed by unmodified oligonucleotides.
  • This technique is particularly suitable when the polymorphism is very high.
  • This NGS technology is widely used in research and diagnostics. It makes it possible to sequence entire genomes. It thus constitutes a very powerful tool and represents an aid in the diagnosis of genetic and oncological diseases for example.
  • a library of sequences is prepared upstream of the sequencing in order to enrich the library with sequences of interest.
  • This sequence amplification is carried out by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • NGS sequencing allows a large number of sequences to be read simultaneously, it is beneficial to mix samples from different patients.
  • they can be labeled during the amplification step by adding label or “index” sequences.
  • the indexed PCR method is known to those skilled in the art and described for example in the article by Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No. 11)
  • Document EP 2599877 describes a sequencing method comprising a first PCR step during which the sequences are marked using an index then a second second generation sequencing step. During sequencing, a strategy of incomplete DNA shearing is implemented to increase the amplitude of the reading of the sequences.
  • Document WO2016 / 138080 relates to a method for detecting, identifying and / or quantifying target nucleic acids in a sample making it possible to limit the error rate when using the NGS method.
  • This method operates using stem-loop or hairpin primers comprising unique identifier (UID) or barcode sequences and adapter sequences, referred to herein as “hairpin barcode primers” which are "hidden”, “protected” or “sequestered” during the first cycles of PCR amplification, thus allowing multiplexing while reducing non-specific PCR reactions.
  • UID unique identifier
  • hairpin barcode primers which are "hidden”, “protected” or “sequestered” during the first cycles of PCR amplification, thus allowing multiplexing while reducing non-specific PCR reactions.
  • NGS sequencing although very powerful in terms of sequencing capacity has drawbacks.
  • the main obstacle is the length of time it takes to perform genotyping from sample preparation to obtaining the result, which takes several days.
  • the present invention relates to a method of genotyping from DNA samples comprising: a. a DNA amplification step by a polymerase chain reaction (PCR) indexed in low multiplexing condition carried out in a microfluidic system, o in which the specific primers comprise in 3 'a stabilizing sequence comprising between 8 and 12 nucleotides among which 45% to 65% are G or C; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA TM base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention also relates to a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of a high throughput sequencing of the NGS type, as well as a reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA TM bases. .
  • the genotyping method according to the invention has several advantages: it is simple, rapid and inexpensive and makes it possible to process, simultaneously, a large series of samples.
  • This method is simple because it is 100% automated. It is offered as a ready-to-use kit. This format limits the manipulations by the experimenter and therefore the risks of error. It also saves time by reducing the number of actions to be performed.
  • a first object of the invention relates to a method of genotyping from DNA samples comprising: at. a DNA amplification step by a polymerase chain reaction (PCR) indexed in low multiplexing condition and carried out in a microfluidic system, o in which the specific primers comprise in 3 'a stabilizing sequence comprising from 8 to 12 nucleotides of which 45 to 65% are G or C; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA TM base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the term “stabilizer sequence” means a sequence of 8 to 12 nucleotides, namely 8, 9, 10, 11 or 12 nucleotides. In addition, these sequences are rich in G and C, that is to say they contain between 45% and 65% of G and / or C bases. Examples of stabilizing sequences which can be used according to the invention are the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2. These examples are non-limiting since a person skilled in the art will know how to combine the bases in order to modify the sequence of the stabilizing sequence.
  • the stabilizer sequences are sequences of 10 nucleotides. In another preferred embodiment, the stabilizer sequences contain 50% to 60% G and / or C bases. For example, a 10 nucleotide sequence contains 5 to 6 G and / or C bases.
  • low multiplexing conditions are understood to mean conditions making it possible to amplify a single target, or even 2, 3 or 4 targets simultaneously in the same reaction mixture.
  • universal sequence within the meaning of the invention, is meant a defined sequence which will be used in all the amplicons. The method actually implements two types of universal sequences, a sense sequence and an antisense sequence so as to be able to define the orientation of the amplified sequences.
  • Examples of universal sequences which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.3 and SEQ ID No.4. These examples are non-limiting since those skilled in the art will know how to use other sequences as universal sequences.
  • Step a amplification of the sequences of interest is based on an indexed PCR technology making it possible to simultaneously generate the amplicons and to label them using a specific label of the sample. In addition, it is implemented in a microfluidic system.
  • Amplification reaction of the sequences by PCR preferably in a microfluidic system (to save time and material), and addition of sample-specific labels to each amplified sequence.
  • This reaction uses two types of primers simultaneously: i. pairs of primers specific to the sequences to be amplified, these sense and antisense primers each comprising a universal sequence located at their 3 'end, characterized in that the universal sequences contain at the 5' end (between the specific primer and the universal sequence) a stabilizing sequence of around ten nucleotides (generally between 8 and 12 nucleotides) consisting of 45% to 65% of G or C nucleotides; ii.
  • sense and antisense primer pairs comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sense and antisense sequences respectively and a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
  • Such a technology may for example be based on that developed by the company Fluidigm (“Integrated Fluidic Circuit” or IFC). Using such technology, in addition to saving time, makes it possible to work under standardized conditions.
  • Fluidigm Integrated Fluidic Circuit
  • the specific primers further comprise a universal sequence located 3 'of said stabilizer sequence.
  • the amplification step also implements pairs of primers intended for indexing the amplified sequences (called “indexing primers”), said primers comprising: a. at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and b. a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
  • index within the meaning of the invention, is meant a sequence used as label or bar code. In the context of NGS sequencing, indexes are polymorphic short sequences. A unique particular index is associated with samples from the same patient and allows the labeling of the sequences of this patient during the amplification step.
  • indexes are used to know which patient to associate the sequences with after analysis.
  • indexes which can be used according to the invention are the sequences SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 and SEQ ID No.7. These examples are non-limiting because those skilled in the art will know how to modify these indexes to provide a multitude of unique sequences.
  • adapter necessary for sequencing within the meaning of the invention is understood to mean a sequence allowing the sequences to be fixed on a support with a view to their sequencing.
  • binding sequences necessary for the sequencing which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.8 and SEQ ID No.9.
  • the amplification of the DNA sequences in a microfluidic system makes it possible to carry out 48 PCRs per sample and to process 48 different samples simultaneously (i.e. a total of 2304 reaction chambers treated at one time), the PCR products each carrying a specific specific label. of the sample. Thus, it is possible to pool and mix all the PCR products in order to perform a single sequencing reaction. The result of the sequencing then provides two pieces of information per sequence: the reading of the sequence of interest and the identification of the sample from which this sequence originates. Thus, it is possible to perform genotyping for 48 patients simultaneously.
  • the genotyping method according to the invention can be carried out either from DNA of human or animal origin.
  • Step b. sequencing is based on a high throughput sequencing technology such as the NGS technology developed in particular by the company Illumina.
  • This type of technology implies a determined Tm (imposed by the technology used, in other words set by the supplier). This Tm turns out to be too high if it is desired to sequence amplicons obtained via an indexed PCR in a microfluidic system. Indeed, these primers configured to operate in a microfluidic system, and whose complementary sequences are then used during the amplification step generally have a lower Tm (in particular because they are short), which generate problems of 'instability. In such a case, it is classically recommended to integrate LNA TM bases. in the sequences during amplification so that the duplexes formed with the primers for sequencing and reading the indexes during sequencing are stable. However, the addition of these LNA TM bases is expensive and constitutes additional steps in the method.
  • stabilizing sequences make it possible to maintain a sufficient degree of hybridization for the NGS sequencing to take place correctly even when the half-hybridization temperature ( Tm) is high.
  • Tm half-hybridization temperature
  • the present invention proposes for the first time to combine an indexed PCR in a microfluidic system with NGS sequencing in a method that is simple and quick to implement, and the cost of which is controlled.
  • the simplicity and speed are all the more remarkable as a ready-to-use kit for the implementation of this method is proposed.
  • Step b. of the method according to the invention is carried out using the sequencing and index reading primers, none of which contains LNA TM bases but each of which contains a stabilizing sequence, namely: a pair of sequencing primers hybridizing to the universal sequences and comprising a stabilizer sequence positioned at the 5 'end; these primers make it possible to amplify the sequences of interest for the sequencing; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence; this primer allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
  • the sequencing and index reading primers none of which contains LNA TM bases but each of which contains a stabilizing sequence, namely: a pair of sequencing primers hybridizing to the universal sequences and comprising a stabilizer sequence positioned at the 5 'end; these primers make it possible to amplify the sequences of interest for the sequencing; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence; this primer allows the
  • stabilizing sequences of the sequencing primers and of the index reading primer are complementary to the stabilizing sequences present on the sequences amplified with a view to sequencing. In other words, these stabilizing sequences have the same sequences as those present in the specific primers.
  • the index reading primer is complementary to the universal antisense sequence and the stabilizing sequence is positioned at its 3 ′ end.
  • the reverse primer is used as a sense primer upstream of the index.
  • sequences of sequencing primers which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.10 and SEQ ID No.11. These examples are not limiting because the man of profession can provide other sequencing primers as a function of the universal sequences surrounding the sequences to be amplified.
  • One specificity of the present method lies in the high number of amplified targets which thus provides a great diversity of amplified sequences. Therefore, it is not necessary to use a base diversity control when sequencing.
  • a second object of the invention relates to a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of high throughput sequencing of the NGS type without the use of an LNA TM base
  • a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of high throughput sequencing of the NGS type without the use of an LNA TM base
  • a PCR plate comprising Pre-aliquoted indexing primers mixed with the master mix, said indexing primers comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and at least a second part comprising a sequence for a necessary adapter in sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts
  • a PCR plate comprising specific primers (diluted in a buffer suitable for use in microfluidics) pairs of primers specific for the sequences to be amplified, these primers comprising in 3 'a stabilizing sequence compris
  • this kit further comprises at least one of the following elements: a buffer solution, preferably presented in tubes of the reaction mixtures for NGS sequencing without LNA TM base, preferably presented in tubes, a user manual
  • Master Mix a mixture comprising Taq polymerase, a buffered solution containing MgCh, dNTPs (mixture of the four deoxyribonucleotides: dATP (deoxy-adenine tri-phosphate), dCTP (deoxy-cytosine tri-phosphate) , dGTP (deoxyguanine tri-phosphate), dTTP (deoxy-thymine tri-phosphate), a solution of DMSO and a buffer which reduces the adhesion of molecules to the plastic.
  • the PCR plates are placed on the same support, said support being a microfluidic plate comprising reaction wells and nanochamps. It is possible to use an IFC (Integrated Fluidic Circuit) support plate from the company Fluidigm.
  • the invention relates to a kit as defined above in which the PCR plates in which the primers are deposited are placed on a microfluidic plate for the implementation of indexed PCR, said microfluidic plate comprising two 48-well zones for depositing, on the one hand, specific primers and, on the other hand, primers allowing indexing and reaction micro-chambers.
  • a third object of the invention relates to a reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA TM base comprising the following primers: a forward sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 5 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizer sequence at its 5 'end; an antisense sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 3 'of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5' end; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence positioned at one of its ends.
  • the index reading primer is a forward primer hybridizing to the universal sequence located at 3 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence positioned at its 3 ′ end.
  • the two sequencing primers capable of hybridizing to the universal sequences located on either side of the sequence to be analyzed allow the amplification of the latter while the sense primer hybridizes downstream of the sequence. to be analyzed allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
  • the reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA TM base comprises: a sense sequencing primer of sequence SEQ ID No.10; an antisense sequencing primer of sequence SEQ. ID No.11; and a SEQ ID No. 12 sequence index read primer.
  • the method according to the invention, as well as the associated kit are particularly suitable for genotyping to treat a large number of sequences in a single reaction (between 48 and 96), especially in case of high polymorphism.
  • the amplicons should not be too long (preferably ⁇ 500bp) and the multiplexing should be moderate (between 2 and 3 targets per PCR reaction). It thus makes it possible to answer complex organizational questions in laboratories by simultaneously treating a large number of patients.
  • Figure 1 Schematic representation of the primers used according to a particular embodiment of the present invention.
  • A Specific Primers
  • B Universal and Stabilizer Sequences
  • C P5-P7 and Index Adapters
  • D Sense Sequencing Primer
  • E Antisense Sequencing Primer
  • E Index Read Primer .
  • Figure 2 Representation of an amplified sequence as a description of a particular embodiment.
  • sequences of interest are identified for genotyping.
  • Primer pairs specific for the allelic or mutant sequences to be amplified are designed and validated. These primers will allow the amplification of the sequences of interest. As the amplification reactions are carried out by multiplexing, reaction mixtures combining several pairs of primers are prepared. The biological samples to be analyzed are prepared for PCR, the DNA is extracted and purified. This preparation step is well known to those skilled in the art and results in samples exhibiting standardized DNA concentrations.
  • the actual amplification reaction is carried out in a microfluidic plate of the IFC type from Fluidigm.
  • the reaction mixtures containing the specific primers are deposited in a first zone of 48 wells and the primers intended for indexing as well as the Master Mix are deposited in a second zone of 48 wells.
  • the amplification reaction takes place under standard conditions, in a Juno type automaton from the company Fuidigm for example.
  • sequences are recovered, purified and quantified in order to be sequenced.
  • the sequencing is carried out in an NGS sequencer from the company Illumina.
  • Sequencing is carried out using the pair of sequencing primers to amplify the sequences to be analyzed and the index reading primer to identify the patient to which the sequence relates.

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Abstract

The invention relates to a genotyping method making it possible to process a large number of DNA samples simultaneously. More particularly, it relates to a method of genotyping involving a first step of indexed PCR amplification followed by a second step of high throughput sequencing, this method being simple, fast and inexpensive.

Description

PROCEDE DE GENOTYPAGE ADAPTE AU TRAITEMENT D'UN GRAND NOMBRE D'ECHANTILLONS, NOTAMMENT EN CAS DE POLYMORPHISME ELEVE GENOTYPING PROCESS SUITABLE FOR THE TREATMENT OF A LARGE NUMBER OF SAMPLES, ESPECIALLY IN CASE OF HIGH POLYMORPHISM
L'invention a trait à un procédé de génotypage permettant de traiter simultanément un grand nombre d'échantillons d'ADN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de génotypage comportant une première étape d'amplification par PCR indexée en système microfluidique puis une seconde étape de séquençage à haut débit, ce procédé est simple, rapide et moins coûteux que les procédés de l'état de la technique. The invention relates to a genotyping method for simultaneously processing a large number of DNA samples. More particularly, it relates to a genotyping method comprising a first step of amplification by indexed PCR in a microfluidic system then a second step of high throughput sequencing, this method is simple, rapid and less expensive than the methods of the state of the art. technical.
Domaine technique Technical area
Le séquençage à haut débit (aussi appelé NGS pour Next Génération Sequencing) permet d'opérer en parallèle un très grand nombre de séquences courtes. Le principe de cette technique est le suivant : Les séquences à analyser sont tout d'abord préparées par ajout de séquences adaptatrices aux extrémités. Elles sont ensuite fixées sur un support solide via ces séquences adaptatrices et chaque fragment est enrichi pour former des « clusters » clonaux qui seront séquencés par la suite. À chaque cycle, l'ajout d'un nucléotide se traduit par un signal fluorescent associé à chacun des quatre nucléotides de l'ADN. Ces signaux sont ensuite analysés par un logiciel de traitement de données qui restitue le résultat de la lecture des séquences. Cette méthode est rapide et précise. High throughput sequencing (also called NGS for Next Generation Sequencing) allows a very large number of short sequences to be operated in parallel. The principle of this technique is as follows: The sequences to be analyzed are first of all prepared by adding adapter sequences to the ends. They are then fixed on a solid support via these adapter sequences and each fragment is enriched to form clonal “clusters” which will be sequenced subsequently. At each cycle, the addition of a nucleotide results in a fluorescent signal associated with each of the four nucleotides of DNA. These signals are then analyzed by data processing software which reproduces the result of the reading of the sequences. This method is fast and precise.
Afin de permettre un multiplexage élevé et dans ce contexte assurer la stabilité des duplex d'ADN hydridés lorsque la température de demi-dénaturation (Tm) est élevée, des bases LNA™ (Locked Nucleix Acid) sont ajoutées, notamment dans la méthode NGS développée par la société Fluidigm. Ces bases sont des oligonucléotides modifiés qui obéissent aux règles d'appariement des bases de Watson-Crick et forment des duplex, lesquels sont significativement plus stables que des duplex similaires formés par des oligonucléotides non modifiés. Ainsi, la sensibilité de discrimination entre des allèles ne présentant que des différences mineures, voire un seul nucléotide différent, est possible. Cette technique est particulièrement adaptée lorsque le polymorphisme est très élevé. In order to allow high multiplexing and in this context to ensure the stability of the hybridized DNA duplexes when the half-denaturation temperature (Tm) is high, LNA ™ bases (Locked Nucleix Acid) are added, in particular in the NGS method developed. by the company Fluidigm. These bases are modified oligonucleotides which obey Watson-Crick base pairing rules and form duplexes, which are significantly more stable than similar duplexes formed by unmodified oligonucleotides. Thus, the sensitivity of discrimination between alleles exhibiting only minor differences, or even a single different nucleotide, is possible. This technique is particularly suitable when the polymorphism is very high.
Cette technologie NGS est largement utilisée en recherche, comme en diagnostic. Elle permet de séquencer des génomes entiers. Elle constitue ainsi un outil très performant et représente une aide au diagnostic de maladies génétiques et oncologiques par exemple. This NGS technology is widely used in research and diagnostics. It makes it possible to sequence entire genomes. It thus constitutes a very powerful tool and represents an aid in the diagnosis of genetic and oncological diseases for example.
Afin de permettre la lecture de séquences cibles, comme ceci est le cas pour le diagnostic, une librairie de séquences est préparée en amont du séquençage afin d'enrichir la librairie en séquences d'intérêt. Cette amplification de séquences est réalisée par réaction de polymérase en chaîne (PCR). Comme le séquençage NGS permet de lire un grand nombre de séquences simultanément, il est intéressant de mélangerdes échantillons provenant de patients différents. Afin d'identifier les séquences provenant d'un même échantillon, celles-ci peuvent être étiquetées lors de l'étape d'amplification par l'ajout de séquences étiquettes ou « index ». La méthode de PCR indexée est connue de l'homme du métier et décrite par exemple dans l'article de Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No.11) In order to allow the reading of target sequences, as is the case for diagnosis, a library of sequences is prepared upstream of the sequencing in order to enrich the library with sequences of interest. This sequence amplification is carried out by polymerase chain reaction (PCR). As NGS sequencing allows a large number of sequences to be read simultaneously, it is beneficial to mix samples from different patients. In order to identify the sequences coming from the same sample, they can be labeled during the amplification step by adding label or “index” sequences. The indexed PCR method is known to those skilled in the art and described for example in the article by Stahlberg A. et al. (Nucleic Acid Research, 2016, vol.44, No. 11)
Le document EP 2599877 décrit une méthode de séquençage comprenant une première étape de PCR pendant laquelle les séquences sont marquées à l'aide d'un index puis une seconde étape de séquençage de deuxième génération. Lors du séquençage, une stratégie de cisaillement incomplet de l'ADN est mise en œuvre pour augmenter l'amplitude de lecture des séquences. Document EP 2599877 describes a sequencing method comprising a first PCR step during which the sequences are marked using an index then a second second generation sequencing step. During sequencing, a strategy of incomplete DNA shearing is implemented to increase the amplitude of the reading of the sequences.
Le document W02016/138080 concerne un procédé de détection, d'identification et / ou de quantification d'acides nucléiques cibles dans un échantillon permettant la limitation du taux d'erreur lors d'utilisation de la méthode NGS. Ce procédé fonctionne en utilisant des amorces en tige-boucle ou en épingle à cheveux comprenant des séquences d’identifiant unique (UID) ou de code-barres et des séquences adaptatrices, appelées ici "amorces à code-barres en épingle à cheveux" qui sont "cachés", "protégés" ou "séquestrés" pendant les premiers cycles d'amplification PCR, permettant ainsi le multiplexage tout en réduisant les réactions de PCR non spécifique. Document WO2016 / 138080 relates to a method for detecting, identifying and / or quantifying target nucleic acids in a sample making it possible to limit the error rate when using the NGS method. This method operates using stem-loop or hairpin primers comprising unique identifier (UID) or barcode sequences and adapter sequences, referred to herein as "hairpin barcode primers" which are "hidden", "protected" or "sequestered" during the first cycles of PCR amplification, thus allowing multiplexing while reducing non-specific PCR reactions.
Le séquençage NGS bien que très puissant en termes de capacité de séquençage présente des inconvénients. Le principal obstacle est la durée de réalisation d'un génotypage depuis la préparation de l'échantillon jusqu'à l'obtention du résultat qui s'étale sur plusieurs jours. NGS sequencing although very powerful in terms of sequencing capacity has drawbacks. The main obstacle is the length of time it takes to perform genotyping from sample preparation to obtaining the result, which takes several days.
Il existe un besoin de disposer d'une méthode de séquençage précise et rapide à coût raisonnable. There is a need for an accurate and rapid sequencing method at reasonable cost.
Exposé de l'invention Disclosure of the invention
La présente invention concerne une méthode de génotypage à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a. une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée en condition de multiplexage faible réalisée en système microfluidique, o dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3' une séquence stabilisatrice comprenant entre 8 et 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ; b. une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice. Pour stabiliser les duplex lors du séquençage, les inventeurs ont introduit des séquences d'une dizaine de nucléotides aux extrémités des amorces. Cet ajout permet de se passer des bases modifiées tout en conservant une grande fiabilité de lecture lors du séquençage. The present invention relates to a method of genotyping from DNA samples comprising: a. a DNA amplification step by a polymerase chain reaction (PCR) indexed in low multiplexing condition carried out in a microfluidic system, o in which the specific primers comprise in 3 'a stabilizing sequence comprising between 8 and 12 nucleotides among which 45% to 65% are G or C; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA ™ base but a sequence complementary to said stabilizing sequence. To stabilize the duplexes during sequencing, the inventors introduced sequences of around ten nucleotides at the ends of the primers. This addition makes it possible to do without modified bases while maintaining high reading reliability during sequencing.
La présente invention concerne également un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée en système microfluidique et d'un séquençage à haut débit de type NGS, ainsi qu'un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de bases LNA™. The present invention also relates to a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of a high throughput sequencing of the NGS type, as well as a reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA ™ bases. .
Avantages de l'invention Advantages of the invention
La méthode de génotypage selon l'invention présente plusieurs avantages : elle est simple, rapide et peu coûteuse et permet de traiter, en simultané, une grande série d'échantillons. The genotyping method according to the invention has several advantages: it is simple, rapid and inexpensive and makes it possible to process, simultaneously, a large series of samples.
Elle combine une PCR indexée réalisée dans un système microfluidique (gain de temps et de matériel) avec un système de séquençage NGS (précision, rapidité). It combines an indexed PCR performed in a microfluidic system (saving time and material) with an NGS sequencing system (precision, speed).
Cette méthode est simple car 100% automatisée. Elle est proposée sous la forme d'un kit prêt à l'emploi. Ce format limite les manipulations par l'expérimentateur et donc les risques d'erreur. Il permet aussi de gagner du temps en diminuant le nombre de gestes à effectuer. This method is simple because it is 100% automated. It is offered as a ready-to-use kit. This format limits the manipulations by the experimenter and therefore the risks of error. It also saves time by reducing the number of actions to be performed.
Cette méthode est rapide puisque le résultat est obtenu en moins de 48 heures. En effet, il faut compter 6hl5 pour la préparation de la banque, 32h pour le séquençage et 3h30 environ pour l'analyse, et ceci quel que soit le nombre de patients diagnostiqués. This method is quick since the result is obtained in less than 48 hours. Indeed, it takes 6h5 for the preparation of the bank, 32h for the sequencing and approximately 3h30 for the analysis, and this regardless of the number of patients diagnosed.
Elle est peu coûteuse et permet de proposer une solution de génotypage efficace et très fiable, accessible au plus grand nombre. Elle a vocation à être déployée dans tous les laboratoires où un génotypage est pratiqué, par exemple dans les centres de recherches, dans les centres hospitaliers, les banques de sang et les centres de transfusion sanguine où elle s'inscrit dans une démarche de maîtrise des coûts de santé publique et de productivité. It is inexpensive and makes it possible to offer an efficient and very reliable genotyping solution, accessible to as many people as possible. It is intended to be deployed in all laboratories where genotyping is carried out, for example in research centers, hospitals, blood banks and blood transfusion centers where it is part of a process of controlling public health and productivity costs.
Elle permet le traitement d'un grand nombre d'échantillons en même temps, ce qui est rentable à la fois en termes de temps et de coût. Dans la version actuelle du kit, il est possible de génotyper en même temps 48 patients. It allows the processing of a large number of samples at the same time, which is profitable both in terms of time and cost. In the current version of the kit, it is possible to genotype 48 patients at the same time.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne une méthode de génotypage à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a. une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) indexée en condition de faible multiplexage et réalisée dans un système microfluidique, o dans laquelle les amorces spécifiques comprennent en 3' une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45 à 65 % sont des G ou C ; b. une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice. A first object of the invention relates to a method of genotyping from DNA samples comprising: at. a DNA amplification step by a polymerase chain reaction (PCR) indexed in low multiplexing condition and carried out in a microfluidic system, o in which the specific primers comprise in 3 'a stabilizing sequence comprising from 8 to 12 nucleotides of which 45 to 65% are G or C; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA ™ base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
Par « séquence stabilisatrice » au sens de l'invention, on entend une séquence de 8 à 12 nucléotides, à savoir 8, 9, 10, 11 ou 12 nucléotides. De plus, ces séquences sont riches en G et C c'est-à-dire qu'elles contiennent entre 45% et 65% de bases G et/ou C. Des exemples de séquences stabilisatrices utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ ID No.l et SEQ ID No.2. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier saura combiner les bases pour modifier la séquence de la séquence stabilisatrice. For the purposes of the invention, the term “stabilizer sequence” means a sequence of 8 to 12 nucleotides, namely 8, 9, 10, 11 or 12 nucleotides. In addition, these sequences are rich in G and C, that is to say they contain between 45% and 65% of G and / or C bases. Examples of stabilizing sequences which can be used according to the invention are the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2. These examples are non-limiting since a person skilled in the art will know how to combine the bases in order to modify the sequence of the stabilizing sequence.
Dans un mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices sont des séquences de 10 nucléotides. Dans un autre mode de réalisation préféré, les séquences stabilisatrices contiennent de 50% à 60% de bases G et/ou C. Par exemple, une séquence de 10 nucléotides contient 5 à 6 bases G et/ou C. In a preferred embodiment, the stabilizer sequences are sequences of 10 nucleotides. In another preferred embodiment, the stabilizer sequences contain 50% to 60% G and / or C bases. For example, a 10 nucleotide sequence contains 5 to 6 G and / or C bases.
Les conditions de « faible multiplexage » s'entendent de conditions permettant d'amplifier une seule cible, voire 2, 3 ou 4 cibles simultanément dans un même mélange réactionnel. The "low multiplexing" conditions are understood to mean conditions making it possible to amplify a single target, or even 2, 3 or 4 targets simultaneously in the same reaction mixture.
Par « séquence universelle » au sens de l'invention, on entend une séquence définie qui sera utilisée dans tous les amplicons. La méthode met en réalité en œuvre deux types de séquences universelles, une séquence sens et une séquence antisens de sorte à pouvoir définir l'orientation des séquences amplifiées. Des exemples de séquences universelles utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ. ID No.3 et SEQ ID No.4. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier saura utiliser d'autres séquences en tant que séquences universelles. By “universal sequence” within the meaning of the invention, is meant a defined sequence which will be used in all the amplicons. The method actually implements two types of universal sequences, a sense sequence and an antisense sequence so as to be able to define the orientation of the amplified sequences. Examples of universal sequences which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.3 and SEQ ID No.4. These examples are non-limiting since those skilled in the art will know how to use other sequences as universal sequences.
L'étape a. d'amplification des séquences d'intérêt repose sur une technologie de PCR indexée permettant de générer simultanément les amplicons et de les marquer à l'aide d'une étiquette spécifique de l'échantillon. De plus, elle est mise en œuvre en système microfluidique. Step a. amplification of the sequences of interest is based on an indexed PCR technology making it possible to simultaneously generate the amplicons and to label them using a specific label of the sample. In addition, it is implemented in a microfluidic system.
Elle peut être résumée comme suit : 1. Conception des couples d'amorces spécifiques des séquences alléliques à amplifier et préparation de mélanges réactionnels pouvant combiner plusieurs couples d'amorces (simplexage ou multiplexage faible)It can be summarized as follows: 1. Design of the pairs of primers specific for the allelic sequences to be amplified and preparation of reaction mixtures that can combine several pairs of primers (simplexing or weak multiplexing)
2. Préparation des échantillons biologiques à analyser (normalisation de la concentration) 2. Preparation of biological samples to be analyzed (normalization of the concentration)
3. Réaction d'amplification des séquences par PCR, de préférence dans un système microfluidique (pour gain de temps et de matériel), et ajout d'étiquettes spécifiques de l'échantillon sur chaque séquence amplifiée. Cette réaction met en œuvre deux types d'amorces simultanément : i. des couples d'amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces sens et antisens comprenant chacune une séquence universelle située à leur extrémité 3', caractérisées en ce que les séquences universelles contiennent à l'extrémité 5' (entre l'amorce spécifique et la séquence universelle) une séquence stabilisatrice d'une dizaine de nucléotides (généralement entre 8 et 12 nucléotides) constituée de 45% à 65% de nucléotides G ou C; ii. des couples amorces sens et antisens comprenant au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles sens et antisens respectivement et une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties. 3. Amplification reaction of the sequences by PCR, preferably in a microfluidic system (to save time and material), and addition of sample-specific labels to each amplified sequence. This reaction uses two types of primers simultaneously: i. pairs of primers specific to the sequences to be amplified, these sense and antisense primers each comprising a universal sequence located at their 3 'end, characterized in that the universal sequences contain at the 5' end (between the specific primer and the universal sequence) a stabilizing sequence of around ten nucleotides (generally between 8 and 12 nucleotides) consisting of 45% to 65% of G or C nucleotides; ii. sense and antisense primer pairs comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sense and antisense sequences respectively and a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
4. Récupération, purification et quantification des produits de PCR indexés (amplicons) en vue de leur séquençage. 4. Recovery, purification and quantification of the indexed PCR products (amplicons) for their sequencing.
Une telle technologie peut être par exemple basée sur celle développée par la société Fluidigm (« Integrated Fluidic Circuit » ou IFC ). Utiliser une telle technologie outre le gain de temps, permet de travailler dans des conditions standardisées. Such a technology may for example be based on that developed by the company Fluidigm (“Integrated Fluidic Circuit” or IFC). Using such technology, in addition to saving time, makes it possible to work under standardized conditions.
Dans un mode de réalisation préféré, les amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3' de ladite séquence stabilisatrice. In a preferred embodiment, the specific primers further comprise a universal sequence located 3 'of said stabilizer sequence.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, l'étape d'amplification met en outre en œuvre des couples d'amorces destinés à l'indexation des séquences amplifiées (dites « amorces d'indexation »), lesdites amorces comprenant : a. au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et b. une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties. Par « index » au sens de l'invention, on entend une séquence utilisée en tant qu'étiquette ou code-barre. Dans le contexte d'un séquençage NGS, les index sont des séquences courtes polymorphes. Un index particulier unique est associé aux échantillons provenant d'un même patient et permet l'étiquetage des séquences de ce patient lors de l'étape d'amplification. Les échantillons provenant de différents patients étant mélangés lors du séquençage, ces index servent à savoir à quel patient associer les séquences après analyse. Des exemples d'index utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 et SEQ ID No.7. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier saura modifier ces index pour proposer une multitude de séquences uniques. In an even more preferred embodiment, the amplification step also implements pairs of primers intended for indexing the amplified sequences (called “indexing primers”), said primers comprising: a. at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and b. a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts. By “index” within the meaning of the invention, is meant a sequence used as label or bar code. In the context of NGS sequencing, indexes are polymorphic short sequences. A unique particular index is associated with samples from the same patient and allows the labeling of the sequences of this patient during the amplification step. The samples from different patients being mixed during sequencing, these indexes are used to know which patient to associate the sequences with after analysis. Examples of indexes which can be used according to the invention are the sequences SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 and SEQ ID No.7. These examples are non-limiting because those skilled in the art will know how to modify these indexes to provide a multitude of unique sequences.
Par « adaptateur nécessaire au séquençage » au sens de l'invention, on entend une séquence permettant la fixation des séquences sur un support en vue de leur séquençage. Des exemples de séquences de fixation nécessaires pour le séquençage utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ. ID No.8 et SEQ ID No.9. Il s'agit des adapteurs « P5 » et « P7 » proposés par la société Illumina® et adaptés au séquençage NGS. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier peut utiliser d'autres systèmes adaptateurs en fonction de la technologie NGS employée. The term “adapter necessary for sequencing” within the meaning of the invention is understood to mean a sequence allowing the sequences to be fixed on a support with a view to their sequencing. Examples of binding sequences necessary for the sequencing which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.8 and SEQ ID No.9. These adapters "P5" and "P7" proposed by Illumina ® company and adapted to the NGS sequencing. These examples are nonlimiting because the person skilled in the art can use other adapter systems depending on the NGS technology employed.
L'amplification des séquences d'ADN dans un système microfluidique permet de réaliser 48 PCR par échantillon et de traiter 48 échantillons différents simultanément (soit un total de 2304 chambres réactionnelles traitées en une seule fois), les produits PCR portant chacun une étiquette particulière spécifique de l'échantillon. Ainsi, il est possible de regrouper et mélanger tous les produits PCR afin d'effectuer une seule réaction de séquençage. Le résultat du séquençage fournit alors deux informations par séquence : la lecture de la séquence d'intérêt et l'identification de l'échantillon d'où provient cette séquence. Ainsi, il est possible de réaliser un génotypage pour 48 patients simultanément. The amplification of the DNA sequences in a microfluidic system makes it possible to carry out 48 PCRs per sample and to process 48 different samples simultaneously (i.e. a total of 2304 reaction chambers treated at one time), the PCR products each carrying a specific specific label. of the sample. Thus, it is possible to pool and mix all the PCR products in order to perform a single sequencing reaction. The result of the sequencing then provides two pieces of information per sequence: the reading of the sequence of interest and the identification of the sample from which this sequence originates. Thus, it is possible to perform genotyping for 48 patients simultaneously.
La méthode de génotypage selon l'invention peut être réalisée indifféremment à partir d'ADN d'origine humaine ou animale. The genotyping method according to the invention can be carried out either from DNA of human or animal origin.
L'étape b. de séquençage repose sur une technologie de séquençage à haut débit telle que la technologie NGS développée notamment par la société Illumina. Step b. sequencing is based on a high throughput sequencing technology such as the NGS technology developed in particular by the company Illumina.
Ce type de technologie implique une Tm déterminée (imposée par la technologie utilisée, en d'autres termes paramétrée par le fournisseur). Cette Tm s'avère trop élevée si l'on souhaite séquencer des amplicons obtenus via une PCR indexée en système microfluidique. En effet, ces amorces configurées pour fonctionner en système microfluidique, et dont les séquences complémentaires sont ensuite utilisées lors de l'étape d'amplification ont généralement une Tm plus faible (notamment parce qu'elles sont courtes), ce qui génèrent des problèmes d'instabilité. Dans un tel cas, il est classiquement recommandé d'intégrer des bases LNA™ dans les séquences lors de l'amplification pour que les duplex formés avec les amorces de séquençage et de lecture des index lors du séquençage soient stables. Or, l'ajout de ces bases LNA™ est coûteux et constituent des étapes supplémentaires dans la méthode. This type of technology implies a determined Tm (imposed by the technology used, in other words set by the supplier). This Tm turns out to be too high if it is desired to sequence amplicons obtained via an indexed PCR in a microfluidic system. Indeed, these primers configured to operate in a microfluidic system, and whose complementary sequences are then used during the amplification step generally have a lower Tm (in particular because they are short), which generate problems of 'instability. In such a case, it is classically recommended to integrate LNA ™ bases. in the sequences during amplification so that the duplexes formed with the primers for sequencing and reading the indexes during sequencing are stable. However, the addition of these LNA ™ bases is expensive and constitutes additional steps in the method.
De manière très intéressante, les inventeurs ont démontré que des séquences d'une dizaine de nucléotides, appelées « séquences stabilisatrices » permettent de conserver un degré d'hybridation suffisant pour que le séquençage NGS se déroule correctement même lorsque la température de demi-hybridation (Tm) est élevée. Ainsi, ils ont montré que l'effet stabilisateur des bases LNA™ peut être remplacé par l'ajout d'une séquence stabilisatrice et que cette séquence est suffisante pour le résultat du séquençage soit aussi fiable que lorsque des bases LNA™ sont utilisées. Le fait de s'affranchir de l'utilisation de bases LNA™ rend la méthode plus simple et moins coûteuse. Ainsi, la présente invention propose pour la première fois de combiner une PCR indexée en système microfluidique avec un séquençage NGS dans une méthode simple et rapide à mettre en œuvre, et dont le coût est maîtrisé. La simplicité et la rapidité sont d'autant plus remarquables qu'un kit prêt à l'emploi pour la mise en œuvre de cette méthode est proposé. Very interestingly, the inventors have demonstrated that sequences of around ten nucleotides, called “stabilizing sequences” make it possible to maintain a sufficient degree of hybridization for the NGS sequencing to take place correctly even when the half-hybridization temperature ( Tm) is high. Thus, they have shown that the stabilizing effect of LNA ™ bases can be replaced by the addition of a stabilizing sequence and that this sequence is sufficient for the result of the sequencing to be as reliable as when LNA ™ bases are used. The fact of dispensing with the use of LNA ™ bases makes the method simpler and less expensive. Thus, the present invention proposes for the first time to combine an indexed PCR in a microfluidic system with NGS sequencing in a method that is simple and quick to implement, and the cost of which is controlled. The simplicity and speed are all the more remarkable as a ready-to-use kit for the implementation of this method is proposed.
L'étape b. de la méthode selon l'invention est réalisée à l'aide des amorces de séquençage et de lecture d'index, dont aucune ne contient de bases LNA™ mais dont chacune contient une séquence stabilisatrice, à savoir : un couple d'amorces de séquençage s'hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l'extrémité 5' ; ces amorces permettent d'amplifier les séquences d'intérêt pour le séquençage ; une amorce de lecture d'index s'hybridant à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprenant une séquence stabilisatrice; cette amorce permet l'amplification de l'index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée. Step b. of the method according to the invention is carried out using the sequencing and index reading primers, none of which contains LNA ™ bases but each of which contains a stabilizing sequence, namely: a pair of sequencing primers hybridizing to the universal sequences and comprising a stabilizer sequence positioned at the 5 'end; these primers make it possible to amplify the sequences of interest for the sequencing; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence; this primer allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
Il est à noter que les séquences stabilisatrices des amorces de séquençage et de l'amorce de lecture d'index sont complémentaires des séquences stabilisatrices présentes sur les séquences amplifiées en vue du séquençage. En d'autres termes, ces séquences stabilisatrices ont les mêmes séquences que celles présentes dans les amorces spécifiques. It should be noted that the stabilizing sequences of the sequencing primers and of the index reading primer are complementary to the stabilizing sequences present on the sequences amplified with a view to sequencing. In other words, these stabilizing sequences have the same sequences as those present in the specific primers.
Dans un mode de réalisation particulier où l'index est positionné en 3' de la séquence à analyser, l'amorce de lecture d'index est complémentaire de la séquence universelle antisens et la séquence stabilisatrice est positionnée à son extrémité 3'. En d'autres termes, l'amorce antisens est utilisée en tant qu'amorce sens en amont de l'index. In a particular embodiment where the index is positioned at 3 ′ of the sequence to be analyzed, the index reading primer is complementary to the universal antisense sequence and the stabilizing sequence is positioned at its 3 ′ end. In other words, the reverse primer is used as a sense primer upstream of the index.
Des exemples de séquences d'amorces de séquençage utilisables selon l'invention sont les séquences SEQ. ID No.10 et SEQ ID No.11. Ces exemples sont non limitatifs car l'homme du métier peut proposer d'autres d'amorces de séquençage en fonction des séquences universelles encadrant les séquences à amplifier. Examples of sequences of sequencing primers which can be used according to the invention are the sequences SEQ. ID No.10 and SEQ ID No.11. These examples are not limiting because the man of profession can provide other sequencing primers as a function of the universal sequences surrounding the sequences to be amplified.
Une spécificité de la présente méthode réside dans le nombre élevé de cibles amplifiées qui apporte ainsi une grande diversité de séquences amplifiées. Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'utiliser de témoin de diversité de bases lors du séquençage. One specificity of the present method lies in the high number of amplified targets which thus provides a great diversity of amplified sequences. Therefore, it is not necessary to use a base diversity control when sequencing.
Un second objet de l'invention concerne un kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée en système microfluidique et d'un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant : une plaque PCR comprenant des amorces d'indexation pré-aliquotées mélangées au Master mix, lesdites amorces d'indexation comprenant au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; une plaque PCR comprenant des amorces spécifiques (diluées dans un tampon approprié à l'utilisation en microfluidique) des couples d'amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces comprenant en 3' une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C, la dite séquence stabilisatrice étant précédée d'une séquence universelle ; un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA™ comprenant un couple d'amorce pour le séquençage s'hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l'index, chacune de ces amorces comprenant une séquence s'hybridant avec une séquence stabilisatrice. A second object of the invention relates to a genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR in a microfluidic system and of high throughput sequencing of the NGS type without the use of an LNA ™ base comprising: a PCR plate comprising Pre-aliquoted indexing primers mixed with the master mix, said indexing primers comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and at least a second part comprising a sequence for a necessary adapter in sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts; a PCR plate comprising specific primers (diluted in a buffer suitable for use in microfluidics) pairs of primers specific for the sequences to be amplified, these primers comprising in 3 'a stabilizing sequence comprising from 8 to 12 nucleotides, of which 45% at 65% are G or C, said stabilizing sequence being preceded by a universal sequence; a reaction mixture for NGS sequencing without LNA ™ base comprising a pair of primer for sequencing hybridizing to the universal sequences and a primer for reading the index, each of these primers comprising a sequence hybridizing with a stabilizing sequence .
Dans un autre mode de réalisation préféré, ce kit comprend en outre au moins un des éléments suivants : une solution tampon, préférentiellement présentée en tubes des mélanges réactionnels pour le séquençage NGS sans base LNA™, préférentiellement présentés en tubes, une notice d'utilisation In another preferred embodiment, this kit further comprises at least one of the following elements: a buffer solution, preferably presented in tubes of the reaction mixtures for NGS sequencing without LNA ™ base, preferably presented in tubes, a user manual
Par « Master Mix », on entend un mélange comprenant de la Taq polymérase, une solution tamponnée contenant du MgCh, des dNTPs (mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy- guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate), une solution de DMSO et un tampon qui réduit l'adhésion des molécules sur le plastique. De manière tout à fait préférée, les plaques PCR sont disposées sur un même support, ledit support étant une plaque microfluidique comprenant des puits et des nano-chambres de réaction. Il est possible d'utiliser une plaque de type IFC (Integrated Fluidic Circuit) support de la société Fluidigm. By “Master Mix” is meant a mixture comprising Taq polymerase, a buffered solution containing MgCh, dNTPs (mixture of the four deoxyribonucleotides: dATP (deoxy-adenine tri-phosphate), dCTP (deoxy-cytosine tri-phosphate) , dGTP (deoxyguanine tri-phosphate), dTTP (deoxy-thymine tri-phosphate), a solution of DMSO and a buffer which reduces the adhesion of molecules to the plastic. Most preferably, the PCR plates are placed on the same support, said support being a microfluidic plate comprising reaction wells and nanochamps. It is possible to use an IFC (Integrated Fluidic Circuit) support plate from the company Fluidigm.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un kit tel que défini précédemment lequel les plaques PCR dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d'une part des amorces spécifiques et d'autre part des amorces permettant l'indexation et des micro-chambres réactionnelles. Thus, in a particular embodiment, the invention relates to a kit as defined above in which the PCR plates in which the primers are deposited are placed on a microfluidic plate for the implementation of indexed PCR, said microfluidic plate comprising two 48-well zones for depositing, on the one hand, specific primers and, on the other hand, primers allowing indexing and reaction micro-chambers.
Un troisième objet de l'invention concerne un mélange réactionnel pour le séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes : une amorce de séquençage sens s'hybridant à la séquence universelle située en 5' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' ; une amorce de séquençage antisens s'hybridant à la séquence universelle située en 3' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' ; une amorce de lecture d'index s'hybridant à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l'une de ses extrémités. A third object of the invention relates to a reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA ™ base comprising the following primers: a forward sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 5 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizer sequence at its 5 'end; an antisense sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 3 'of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5' end; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence positioned at one of its ends.
Dans un mode de réalisation particulier, l'amorce de lecture d'index est une amorce sens s'hybridant à la séquence universelle située en 3' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à son extrémité 3'. In a particular embodiment, the index reading primer is a forward primer hybridizing to the universal sequence located at 3 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence positioned at its 3 ′ end.
Dans ce mélange, les deux amorces de séquençage aptes à s'hybrider aux séquences universelles situées de part et d'autre de la séquence à analyser permettent l'amplification de cette dernière tandis que l'amorce sens s'hybridant en aval de la séquence à analyser permet l'amplification de l'index pour identifier le patient duquel provient la séquence analysée. In this mixture, the two sequencing primers capable of hybridizing to the universal sequences located on either side of the sequence to be analyzed allow the amplification of the latter while the sense primer hybridizes downstream of the sequence. to be analyzed allows the amplification of the index to identify the patient from which the analyzed sequence originates.
Dans un mode de réalisation particulier, le mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprend : une amorce de séquençage sens de séquence SEQ ID No.10; une amorce de séquençage antisens de séquence SEQ. ID No.11; et une amorce de lecture d'index de séquence SEQ ID No. 12. In a particular embodiment, the reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA ™ base comprises: a sense sequencing primer of sequence SEQ ID No.10; an antisense sequencing primer of sequence SEQ. ID No.11; and a SEQ ID No. 12 sequence index read primer.
La méthode selon l'invention, ainsi que le kit associé sont particulièrement adaptés au génotypage pour traiter en une seule réaction un grand nombre de séquences (entre 48 et 96), notamment en cas de polymorphisme élevé. Toutefois les amplicons ne doivent pas être trop longs (de préférence < 500pb) et le multiplexage doit être modéré (entre 2 et 3 cibles par réaction PCR). Elle permet ainsi de répondre à des questions complexes d'organisation dans les laboratoires en traitant simultanément un grand nombre de patients. The method according to the invention, as well as the associated kit are particularly suitable for genotyping to treat a large number of sequences in a single reaction (between 48 and 96), especially in case of high polymorphism. However, the amplicons should not be too long (preferably <500bp) and the multiplexing should be moderate (between 2 and 3 targets per PCR reaction). It thus makes it possible to answer complex organizational questions in laboratories by simultaneously treating a large number of patients.
Les différents modes de réalisation préférés décrits précédemment peuvent être combinés entre eux, deux par deux ou de manière plus étendue, jusqu'à constituer un mode de réalisation préféré combinant tous les modes préférés. The various preferred embodiments described above can be combined with one another, in pairs or in a more extensive manner, until constituting a preferred embodiment combining all the preferred embodiments.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. The present invention will be better understood on reading the examples which follow, provided by way of illustration and should in no way be considered as limiting the scope of the present invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique des amorces utilisées selon un mode de réalisation particulier de la présente invention. (A) amorces spécifiques, (B) séquences universelles et stabilisatrices, (C) Adaptateurs P5-P7 et Index, (D) amorce de séquençage Sens, (E) amorce de séquençage Anti sens, (E) amorce de lecture d'index. Figure 1: Schematic representation of the primers used according to a particular embodiment of the present invention. (A) Specific Primers, (B) Universal and Stabilizer Sequences, (C) P5-P7 and Index Adapters, (D) Sense Sequencing Primer, (E) Antisense Sequencing Primer, (E) Index Read Primer .
Figure 2 : Représentation d'une séquence amplifiée en tant que descriptif d'un mode de réalisation particulier. Figure 2: Representation of an amplified sequence as a description of a particular embodiment.
EXEMPLE EXAMPLE
EXEMPLE 1 : Principe de la méthode de génotypage NGS sans base LNA EXAMPLE 1: Principle of the NGS genotyping method without LNA base
1. Amplification des séquences d'intérêt par PCR indexée 1. Amplification of sequences of interest by indexed PCR
A partir de variants alléliques ou de mutations connus dans un système biologique défini, des séquences d'intérêt sont identifiées en vue du génotypage. From known allelic variants or mutations in a defined biological system, sequences of interest are identified for genotyping.
Des couples d'amorces spécifiques des séquences alléliques ou mutants à amplifier sont conçus et validés. Ces amorces permettront l'amplification des séquences d'intérêt. Les réactions d'amplification étant réalisées en multiplexage, des mélanges réactionnels combinant plusieurs couples d'amorces sont préparés. Les échantillons biologiques à analyser sont préparés en vue de la PCR, l'ADN est extrait et purifié. Cette étape de préparation est bien connue de l'homme du métier et aboutit à des échantillons présentant des concentrations en ADN normalisées. Primer pairs specific for the allelic or mutant sequences to be amplified are designed and validated. These primers will allow the amplification of the sequences of interest. As the amplification reactions are carried out by multiplexing, reaction mixtures combining several pairs of primers are prepared. The biological samples to be analyzed are prepared for PCR, the DNA is extracted and purified. This preparation step is well known to those skilled in the art and results in samples exhibiting standardized DNA concentrations.
La réaction d'amplification proprement dite est réalisée dans une plaque microfluidique de type IFC de Fluidigm. Les mélanges réactionnels contenant les amorces spécifiques sont déposées dans une première zone de 48 puits et les amorces destinées à l'indexation ainsi que le Master Mix sont déposés dans une seconde zone de 48 puits. The actual amplification reaction is carried out in a microfluidic plate of the IFC type from Fluidigm. The reaction mixtures containing the specific primers are deposited in a first zone of 48 wells and the primers intended for indexing as well as the Master Mix are deposited in a second zone of 48 wells.
La réaction d'amplification se déroule en conditions standard, dans un automate de type Juno de la société Fuidigm par exemple. The amplification reaction takes place under standard conditions, in a Juno type automaton from the company Fuidigm for example.
Une fois amplifiées, les séquences sont récupérées, purifiées et quantifiées pour être séquencées. Once amplified, the sequences are recovered, purified and quantified in order to be sequenced.
2. Séquençage NGS 2. NGS sequencing
Le séquençage est réalisé dans un séquenceur NGS de la société Illumina. The sequencing is carried out in an NGS sequencer from the company Illumina.
Le séquençage est réalisé à l'aide du couple d'amorces de séquençage pour amplifier les séquences à analyser et de l'amorce de lecture d'index pour identifier le patient auquel se rapporte la séquence. Sequencing is carried out using the pair of sequencing primers to amplify the sequences to be analyzed and the index reading primer to identify the patient to which the sequence relates.
Tableau 1 : Récapitulatif des séquences décrites
Figure imgf000012_0001
Table 1: Summary of the sequences described
Figure imgf000012_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de génotypage à partir d'échantillons d'ADN comprenant : a . une étape d'amplification de l'ADN par une réaction de polymérisation en chaîne indexée en condition de faible multiplexage réalisée dans un système microfluidique, o dans laquelle les couples amorces spécifiques comprennent en 3' une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels 45% à 65% sont des G ou C ; b . une étape de séquençage à haut débit de type NGS dans laquelle les amorces de séquençage ne contiennent pas de base LNA™ mais une séquence complémentaire de ladite séquence stabilisatrice. 1. Method of genotyping from DNA samples comprising: a. a DNA amplification step by an indexed polymerase chain reaction under low multiplexing condition carried out in a microfluidic system, o in which the specific primer pairs comprise at 3 ′ a stabilizing sequence comprising from 8 to 12 nucleotides among which 45% to 65% are G or C; b. a high-throughput NGS-type sequencing step in which the sequencing primers do not contain an LNA ™ base but a sequence complementary to said stabilizing sequence.
2. Méthode selon la revendication 1 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice comprend 10 nucléotides dont 5 à 6 nucléotides sont des G ou C. 2. Method according to claim 1 wherein said stabilizing sequence comprises 10 nucleotides of which 5 to 6 nucleotides are G or C.
3. Méthode selon la revendication 2 dans laquelle ladite séquence stabilisatrice est choisie parmi les séquences SEQ. ID NO. 1 et SEQ ID NO.2 3. Method according to claim 2, in which said stabilizing sequence is chosen from the sequences SEQ. ID NO. 1 and SEQ ID NO.2
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle lesdites amorces spécifiques comprennent en outre une séquence universelle située en 3' de ladite séquence stabilisatrice. 4. Method according to one of claims 1 to 3 wherein said specific primers further comprise a universal sequence located 3 'of said stabilizer sequence.
5. Méthode selon la revendication 4 dans laquelle ladite étape d'amplification d'ADN met en outre en œuvre des couples d'amorces destinés à l'indexation et au séquençage des séquences amplifiées comprenant : au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties. 5. Method according to claim 4 wherein said DNA amplification step further implements pairs of primers intended for indexing and sequencing of the amplified sequences comprising: at least a first part capable of hybridizing. with the universal sequences amplified by virtue of the specific primers and at least a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts.
6. Méthode selon l'une des revendications précédentes dans laquelle l'étape de séquençage est réalisée à l'aide des amorces suivantes : un couple d'amorces de séquençage s'hybridant aux séquences universelles et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l'extrémité 5' ; une amorce de lecture d'index s'hybridant à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprenant une séquence stabilisatrice. 6. Method according to one of the preceding claims, in which the sequencing step is carried out using the following primers: a pair of sequencing primers hybridizing to the universal sequences and comprising a stabilizing sequence positioned at the end. 5 '; an index read primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizer sequence.
7. Kit de génotypage pour la mise en œuvre successive d'une PCR indexée et d'un séquençage à haut débit de type NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant : une plaque PCR comprenant des amorces d 'indexation pré-aliquotées mélangées au Master mix, lesdites amorces d'indexation comprenant au moins une première partie capable de s'hybrider avec les séquences universelles amplifiées grâce aux amorces spécifiques et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; une plaque PCR comprenant des amorces spécifiques ; o des couples d'amorces spécifiques des séquences à amplifier, ces amorces comprenant en 3' une séquence stabilisatrice comprenant de 8 à 12 nucléotides parmi lesquels au moins 45% à 65% sont des G ou C, précédée d'une séquence universelle ; o des couples d'amorces permettant l'indexation et le séquençage des séquences amplifiées, ces amorces comprenant au moins une première partie capable de s'hybrider aux séquences universelles et au moins une seconde partie comprenant une séquence pour un adaptateur nécessaire au séquençage, l'une des amorces sens ou antisens comprenant en outre un index positionné entre ces deux parties ; d'un mélange réactionnel pour séquençage NGS sans base LNA comprenant un couple d'amorce pour le séquençage s'hybridant aux séquences universelles et une amorce pour la lecture de l'index, chacune de ces amorces comprenant une séquence stabilisatrice. 7. Genotyping kit for the successive implementation of an indexed PCR and high-throughput NGS-type sequencing without the use of LNA ™ base comprising: a PCR plate comprising pre-aliquoted indexing primers mixed with the master mix, said indexing primers comprising at least a first part capable of hybridizing with the universal sequences amplified by means of the specific primers and at least a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, one of the forward or reverse primers further comprising an index positioned between these two parts; a PCR plate comprising specific primers; o pairs of primers specific for the sequences to be amplified, these primers comprising at 3 ′ a stabilizing sequence comprising from 8 to 12 nucleotides among which at least 45% to 65% are G or C, preceded by a universal sequence; o pairs of primers allowing indexing and sequencing of the amplified sequences, these primers comprising at least a first part capable of hybridizing to the universal sequences and at least a second part comprising a sequence for an adapter necessary for sequencing, l one of the sense or antisense primers further comprising an index positioned between these two parts; of a reaction mixture for NGS sequencing without LNA base comprising a pair of primer for sequencing hybridizing to the universal sequences and a primer for reading the index, each of these primers comprising a stabilizing sequence.
8. Kit selon la revendication 7 dans lequel lesdites plaques dans lesquelles sont déposées les amorces, sont disposées sur une plaque microfluidique pour la mise en œuvre de la PCR indexée, ladite plaque microfluidique comportant deux zones de 48 puits pour dépôt d'une part des amorces spécifiques et d'autre part des amorces permettant l'indexation et des micro-chambres réactionnelles. 8. Kit according to claim 7, in which said plates in which the primers are deposited are placed on a microfluidic plate for the implementation of the indexed PCR, said microfluidic plate comprising two 48-well zones for depositing on the one hand the specific primers and on the other hand primers allowing indexing and reaction micro-chambers.
9. Mélange réactionnel pour séquençage NGS sans utilisation de base LNA™ comprenant les amorces suivantes : une amorce de séquençage sens s'hybridant à la séquence universelle située en 5' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' ; une amorce de séquençage antisens s'hybridant à la séquence universelle située en 3' de la séquence à analyser et comprenant une séquence stabilisatrice à son extrémité 5' ; une amorce de lecture d'index s'hybridant à la séquence universelle juxtaposant l'index et comprenant une séquence stabilisatrice positionnée à l'une de ses extrémités 3'. 9. Reaction mixture for NGS sequencing without the use of LNA ™ base comprising the following primers: a forward sequencing primer hybridizing to the universal sequence located at 5 ′ of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5 ′ end; an antisense sequencing primer hybridizing to the universal sequence located 3 'of the sequence to be analyzed and comprising a stabilizing sequence at its 5' end; an index reading primer hybridizing to the universal sequence juxtaposing the index and comprising a stabilizing sequence positioned at one of its 3 'ends.
10. Mélange selon la revendication 9 dans lequel : ladite amorce de séquençage sens est de séquence SEQ. ID No.10 ; ladite amorce de séquençage antisens est de séquence SEQ ID No.11; et ladite amorce de lecture d'index est de séquence SEQ. ID No.12. 10. Mixture according to claim 9 wherein: said forward sequencing primer is of sequence SEQ. ID No.10; said antisense sequencing primer is of sequence SEQ ID No.11; and said index read primer is of sequence SEQ. ID No.12.
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STAHLBERG A. ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 44, no. 11, 2016

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