WO2021039909A1 - 蛍光色素の発光強度の増強方法 - Google Patents

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WO2021039909A1
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fluorescent dye
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reaction
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absorption wavelength
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陽輔 仁子
慎悟 波多野
渡辺　茂
沢 中山
啓史 井上
和弘 花▲崎▼
益臣 兼子
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国立大学法人高知大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a method capable of enhancing the emission intensity of a fluorescent dye even when light having a peak wavelength other than the maximum absorption wavelength is used.
  • Fluorophore is an organic compound with a highly ⁇ -conjugated structure, and when it absorbs and excites light of a specific wavelength, its energy is not spent on vibration or rotational movement in the molecule, and it is emitted as light of a specific wavelength. To do. Fluorophores have different absorption wavelengths and emission wavelengths, and because of their sensitivity to lasers and their ability to convert between light energy and electrical energy, they can be used as dyes for optical recording media and photoelectric conversion dyes. It is expected to be applied in various fields such as displays and solar cells. In addition, due to its high visibility, it is also used as a fluorescent labeling dye in the biotechnology field.
  • Patent Document 1 states that when 5-aminolevulinic acid (ALA) or a derivative thereof is administered into the body, protoporphyrin IX (PpIX) derived from ALAs accumulates in cancer tissues and fluoresces when irradiated with light.
  • a tumor diagnostic agent developed based on the above findings is disclosed, and Patent Document 2 discloses a tumor diagnostic agent that administers ALAs in vivo and measures PpIX in serum or urine that fluoresces when irradiated with light.
  • Patent Document 3 a sensitizer which is an orally administered agent for detecting bladder cancer including ALAs is disclosed.
  • the fluorescent dye is excited by absorbing light of a specific wavelength to emit fluorescence of a specific wavelength, but it may be desirable to change the wavelength of the excitation light.
  • short wavelength light has a large energy.
  • long-wavelength light has the advantages of less harm and high transparency.
  • the maximum absorption wavelength of the above PpIX is 405 nm of purple, and red light having a maximum fluorescence wavelength of 635 nm is emitted.
  • the phototoxicity of violet light which has a short wavelength, is strong, and because of its low biopermeability, only surface cancer tissue can be detected.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of enhancing the emission intensity of a fluorescent dye even when light having a peak wavelength other than the maximum absorption wavelength is used, and a method for detecting cancer tissue to which the method is applied.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems.
  • the excitation light energy of the fluorescent dye is accumulated by using the fine particles, and the excitation light energy is transferred to the nearby fluorescent dye by using Förster resonance energy transfer (FRET) to excite it.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the present invention has been completed by finding that the fluorescence intensity of a fluorescent dye can be enhanced even if a peak wavelength different from the wavelength is used.
  • the present invention will be shown.
  • a method for enhancing the emission intensity of a fluorescent dye The fluorescent dye (I), at least a fat-soluble compound having a functional group that causes a bioorthogonal reaction with the fluorescent dye (I), and a maximum absorption wavelength different from the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I) and a maximum fluorescence wavelength
  • the bioorthogonal reaction includes a reaction between an ethenyl group and a nitrile oxide group, a reaction between an ethynyl group and an azido group, a reaction between a 2-methoxycarbonyltriphenylphosphine and an azido group, and a cyclooctynyl group and a tetrazinyl group.
  • the step of administering 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof to a subject A step of enhancing the luminescence intensity derived from the above protoporphyrin IX at a place where the presence of cancer tissue is suspected by the method described in the above [5], and A method comprising the step of detecting luminescence derived from the protoporphyrin IX.
  • the fluorescent dye can be emitted even when light having a peak wavelength different from the maximum absorption wavelength is used, and the fluorescence intensity can be enhanced. Therefore, the present invention is extremely valuable as a technique capable of emitting a fluorescent dye using short-wavelength light having higher energy or long-wavelength light having higher safety and transparency.
  • FIG. 1 shows an absorption wavelength curve and a fluorescence wavelength curve of protoporphyrin IX (PpIX).
  • the absorption wavelength curve is shown by a solid line
  • the fluorescence wavelength curve is shown by a dotted line.
  • FIG. 2 is a fluorescence spectrum when a mixture of an O / W emulsion containing no fat-soluble nitrile oxide (CNO) and protoporphyrin IX (PpIX) is irradiated with excitation light having a maximum peak wavelength of 473 nm.
  • CNO fat-soluble nitrile oxide
  • PpIX protoporphyrin IX
  • FIG. 3 shows a case where a mixture of an O / W emulsion containing CNO having a ratio of the oil phase component to the total of CNO of about 9.1% by mass and PpIX is irradiated with excitation light having a maximum peak wavelength of 473 nm. It is a fluorescence spectrum.
  • FIG. 4 shows a case where a mixture of an O / W emulsion containing CNO having a ratio of the oil phase component to the total of CNO of about 16.7% by mass and PpIX is irradiated with excitation light having a maximum peak wavelength of 473 nm. It is a fluorescence spectrum.
  • FIG. 4 shows a case where a mixture of an O / W emulsion containing CNO having a ratio of the oil phase component to the total of CNO of about 16.7% by mass and PpIX is irradiated with excitation light having a maximum peak wavelength of 473 nm. It is a fluorescence spectrum.
  • FIG. 5 is an excitation spectrum of a mixture of a CNO-free O / W emulsion and PpIX with respect to fluorescence near 635 nm.
  • FIG. 6 is an excitation spectrum regarding fluorescence of a mixture of an O / W emulsion containing CNO and PpIX in which the ratio of the oil phase component to the total of CNO is about 9.1% by mass at around 635 nm.
  • FIG. 7 is an excitation spectrum regarding fluorescence of a mixture of an O / W emulsion containing CNO and PpIX in which the ratio of the oil phase component to the total of CNO is about 16.7% by mass at around 635 nm.
  • the fluorescent dye (I), at least a fat-soluble compound having a functional group that causes a bioorthogonal reaction with the fluorescent dye (I), and the maximum absorption wavelength are the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I). It is mixed with an O / W type emulsion containing the fluorescent dye (II) which is different and has the maximum fluorescent wavelength in the absorption wavelength range of the fluorescent dye (I) in the oil droplets.
  • the fluorescent dye (I) is the main fluorescent dye that emits light in the present invention, and is not particularly limited except that it has a functional group that causes a bioorthogonal reaction with a fat-soluble compound.
  • the bioorthogonal reaction can chemically modify a target biomolecule under in vivo or in vitro conditions without impairing its function, and is highly chemically selective, high yield, and high speed that is not affected by the surrounding environment. It is defined as a reaction, and the present invention utilizes a functional group that causes a biomolecular reaction.
  • the combination of functional groups that cause a bioorthogonal reaction is not particularly limited, and is, for example, a reaction between an ethenyl group (vinyl group) and a nitrile oxide group, a reaction between an ethynyl group and an azido group, and 2-methoxycarbonyltriphenylphosphine.
  • reaction with an azido group reaction with a cyclooctynyl group and a tetrazinyl group, reaction with a cyclooctenyl group and a tetrazinyl group, reaction with a methylcyclopentenyl group and a tetradinyl group, and reaction with a thiol group and a maleimide group.
  • a nitrile oxide group reaction with a nitrile oxide group
  • [3 + 2] cycloaddition occurs between the nitrile oxide group, which is a 1,3-dipole, and a CC double bond, and a heterocyclic compound is produced. ..
  • a copper catalyst for the reaction between the ethynyl group and the azide group.
  • a copper catalyst is not required in the reaction of 2-methoxycarbonyltriphenylphosphine with an azide group or the reaction of a cyclooctenyl group with a tetrazinyl group.
  • a fluorescent dye having a functional group that causes a bioorthogonal reaction may be used from the beginning, or if the fluorescent dye does not have a functional group that causes a bioorthogonal reaction, the fluorescent dye (I) may be used.
  • a functional group that causes a bioorthogonal reaction may be introduced into the body.
  • protoporphyrin IX PpIX
  • PpIX which is biosynthesized by administration of 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof and accumulates in cancer tissues, has two ethenyl groups (vinyl groups).
  • the fluorescent dye (I) if it is water-soluble, it can be used for a living body or a biological sample, and if it is oil-soluble, it is taken into an oil droplet by mixing with an O / W type emulsion and Felster. Resonant energy transfer (FRET) can occur more efficiently.
  • Water-soluble means that when 1 g or 1 mL of a powdered object is added to water and shaken vigorously at 20 ⁇ 5 ° C. every 5 minutes for 30 seconds, the amount of water required to dissolve within 30 minutes is less than 30 mL. The amount is preferably less than 10 mL.
  • Oil-soluble means that when 1 g or 1 mL of a powdered object is added to water and shaken vigorously at 20 ⁇ 5 ° C for 30 seconds every 5 minutes, the amount of water required to dissolve within 30 minutes is 1000 mL or more. It shall be said that.
  • fluorescent dye (I) examples include water-soluble fluorescein dyes such as eosin and uranin, in addition to the above-mentioned protoporphyrin IX (PpIX).
  • the concentration in the O / W emulsion is preferably 50 ⁇ M or more, more preferably 75 ⁇ M or more, and even more preferably 100 ⁇ M or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be, for example, 5000 ⁇ M or less.
  • the fat-soluble compound is contained in the oil droplet of the O / W type emulsion and has a functional group that causes a bioorthogonal reaction with the fluorescent dye (I).
  • the fat-soluble compound has a functional group that causes a bioorthogonal reaction of the fluorescent dye (I) and a functional group that causes a bioorthogonal reaction.
  • the fluorescent dye (I) has an ethenyl group (vinyl group)
  • the fat-soluble compound preferably has a nitrile oxide group.
  • the fat-soluble compound examples include a benzene compound having a functional group that causes a bioorthogonal reaction as a substituent.
  • the fat-soluble compound may have a long-chain hydrocarbon group or a long-chain alkoxy group, for example, a C 12-24 alkyl group or a C 12-24 alkoxy group as a substituent in order to improve the fat solubility.
  • the amount of the fat-soluble compound used is specifically such that Förster resonance energy transfer (FRET) occurs between the fluorescent dye (II) and the fluorescent dye (I) contained in the oil droplets of the O / W type emulsion.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the ratio of the fat-soluble compound to the total of the oil phase component and the fat-soluble compound constituting the O / W type emulsion can be 1% by mass or more and 25% by mass or less.
  • the ratio is 1% by mass or more, the fluorescent dye (I) can be surely brought closer to the oil droplets of the O / W type emulsion by the bioorthogonal reaction.
  • the ratio is 25% by mass or less, the relative ratio of the fluorescent dye (II) in the oil droplet is sufficient.
  • 2% by mass or more is more preferable, 5% by mass or more is further preferable, 20% by mass or less is more preferable, and 18% by mass or less is further preferable.
  • the fluorescent dye (II) is fat-soluble to the extent that it is contained in the oil droplets of the O / W type emulsion, its maximum absorption wavelength is different from the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I), and its maximum fluorescence wavelength is Those included in the absorption wavelength range of the fluorescent dye (I) are used.
  • the fluorescent dye (II) a fat-soluble one is used, or even if it is water-soluble, a highly fat-soluble fluorescent dye (II) is used as its counter anion or counter cation.
  • the fluorescent dye (II) include naphthalene-based fluorescent dyes; anthracene-based fluorescent dyes; pyrene-based fluorescent dyes; cyanine-based fluorescent dyes such as Cy3, Cy5, and Cy7; loadamine-based fluorescent dyes such as Rhodamine B and TMR; BODIPY-based. Fluorophore; Nile Red fluorescent dye; Chromon fluorescent dye.
  • the fluorescent dye (II) it is preferable to use a fluorescent dye having a charge as long as possible, for example, a C 12-24 alkyl group.
  • highly lipophilic counter anions include tetraphenyl borate and tetrakis (pentafluorophenyl) borate.
  • Examples of the fluorescent dye (II) that forms a salt with a highly lipophilic counter anion include DiI, Dilinelol DiI, Dilinelol DiO, Dio, DiOC14 (3), DiOC16 (3), Neuro-DiI, Neuro-Dio and the like. Oxycarbocyanine dyes can be mentioned.
  • the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I) is set in addition to the fluorescent dye (I).
  • a fluorescent dye (II) different from the maximum absorption wavelength is used. For example, when the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (II) is lower than the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I), the fluorescent dye (I) is indirectly excited by low-wavelength light having high energy to emit light. I can let you.
  • the fluorescent dye (II) when the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (II) is on the higher wavelength side than the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I), the fluorescent dye (I) is produced by the higher wavelength light having higher safety and high transparency. It can be indirectly excited to emit light.
  • the fluorescent dye (II) is present in the oil droplets of the O / W type emulsion and causes Förster resonance energy transfer (FRET) with the fluorescent dye (I) in the vicinity of the oil droplets.
  • FRET is a phenomenon in which energy is transferred from one fluorescent molecule to another when two fluorescent molecules are present in close proximity to each other. More specifically, when the fluorescence peak of one fluorescent molecule overlaps with the excitation peak of the other fluorescent molecule, when one fluorescent molecule is excited by the excitation light, the excitation energy is transferred to the other fluorescent molecule. The other fluorescent molecule emits light.
  • the fluorescence intensity by FRET is generally lower than that by direct excitation without FRET, but in the present invention, it is compared with direct excitation due to the fluorescent dye (II) present in the oil droplets of the O / W type emulsion.
  • a large amount of light energy can be collected, and the collected large amount of light energy is transferred from the fluorescent dye (II) to the fluorescent dye (I), so that a stronger fluorescence intensity than that of normal direct excitation can be obtained. .. Therefore, as the fluorescent dye (II), one whose maximum fluorescence wavelength is included in the absorption wavelength range of the fluorescent dye (I) is used, and the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I) is included in the fluorescence wavelength range of the fluorescent dye (II). Is not necessarily included, but it is preferable that the fluorescence wavelength range of the fluorescent dye (II) includes an absorption peak wavelength other than the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (I).
  • PpIX shows a maximum absorption wavelength of 405 nm, which is purple light, and a maximum fluorescence wavelength of 635 nm, which is red light. It also has absorption wavelength peaks at 510 nm, 545 nm, 580 nm and 630 nm. Therefore, when PpIX is used as the fluorescent dye (I), if the fluorescent dye (II) whose maximum fluorescence wavelength overlaps with the maximum absorption wavelength of PpIX is used as the fluorescent dye (II), the fluorescence of PpIX is extremely efficient. Can be enhanced.
  • the fluorescent dye since the fluorescent dye generally absorbs light of a shorter wavelength and emits fluorescence of a longer wavelength, its maximum absorption wavelength is shorter than 405 nm for excitation of the fluorescent dye (II). There is no choice but to use light of wavelength.
  • a fluorescent dye (II) whose maximum fluorescence wavelength overlaps with the absorption wavelength peak of PpIX, 510 nm, 545 nm, 580 nm and / or 630 nm, is used, the fluorescence enhancing effect may be relatively reduced, but more. Fluorescence intensity can be enhanced with safe long wavelength light.
  • the amount of the fluorescent dye (II) used is such that the fluorescent dye (I) can be sufficiently excited by FRET, and the fluorescent dye (I) can be emitted with higher intensity than in the case of direct excitation of the fluorescent dye (I). If it can be done, there are no particular restrictions.
  • the ratio of the fluorescent dye (II) to the total of the oil phase component constituting the O / W type emulsion and the fluorescent dye (II) can be 5% by mass or more and 40% by mass or less. When the ratio is 5% by mass or more, the fluorescent dye (I) can be sufficiently indirectly excited.
  • the ratio is 40% by mass or less, the relative ratio of the fat-soluble compound in the oil droplet is sufficient. As the ratio, 8% by mass or more is more preferable, 12% by mass or more is further preferable, 30% by mass or less is more preferable, and 20% by mass or less is further preferable.
  • a surfactant to the O / W type emulsion in order to stabilize oil droplets and the like.
  • the surfactant any of anionic surfactant, cationic surfactant, nonionic surfactant and amphoteric surfactant can be used, but nonionic surfactant is preferable.
  • the nonionic surfactant include glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyglycerin condensed ricinoleic acid ester, decaglycerin ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and polyoxy. Examples thereof include ethylene sorbit fatty acid ester, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene cured castor oil, propylene glycol fatty acid ester, and sucrose fatty acid ester.
  • the amount of the surfactant used may be appropriately adjusted within a range in which the oil droplets in the O / W emulsion can be stabilized.
  • the concentration of the surfactant in the O / W emulsion is 1% by mass or more and 10 It can be mass% or less.
  • the ratio is 1% by mass or more, the oil droplets can be more reliably stabilized.
  • the ratio is 10% by mass or less, the relative ratio of the fluorescent dye (II) and the fat-soluble compound in the oil droplet is sufficient.
  • 2% by mass or more is more preferable, 3% by mass or more is further preferable, 8% by mass or less is more preferable, and 6% by mass or less is further preferable.
  • the components of the oil phase constituting the O / W type emulsion are not particularly limited, but those having high safety to the living body are preferable.
  • the oil phase component include triglycerides such as triolein, trilinolein, tripalmitin, tristearic acid, trimyristin and triarachidonin; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalene, squalane and pristane; myristic acid and stearic acid, Long-chain fatty acids such as oleic acid; ethylhexyl palmitate, isononyl isononanoate, isopropyl myristate, ethyl oleate, tri (caprylic acid / capric acid) glyceryl, cetyl 2-ethylhexanoate, glyceryl tri2-ethylhexanoate, Esters such as diisopropyl sebacate and cholesteryl hydroxystearate; silicone oils such as
  • oil phase component Only one type of oil phase component may be used, or two or more types may be used in combination.
  • waxes such as beeswax, carnauba wax, candelilla wax, jojoba oil, lanolin, whale wax; macadamia nut oil, olive oil, cottonseed oil, soybean oil, avocado oil, rice bran oil, rice oil.
  • olive oil, cottonseed oil, soybean oil avocado oil, rice bran oil, rice oil.
  • olive oil cottonseed oil
  • the amount of the oil phase component used may be appropriately adjusted within a range in which the O / W type emulsion can be formed well.
  • the concentration of the oil phase component in the O / W type emulsion is 0.5% by mass or more and 10% by mass. It can be less than or equal to%.
  • the ratio is within this range, an O / W type emulsion can be satisfactorily formed.
  • 1% by mass or more is more preferable, 2% by mass or more is further preferable, 8% by mass or less is more preferable, and 5% by mass or less is further preferable.
  • a buffer solution can be used in addition to water.
  • a buffer solution for example, a buffer solution having a pH of 4.5 or more and 9 or less can be used.
  • the type of buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include phosphate buffer solution, acetate buffer solution, citrate buffer solution, citrate phosphate buffer solution, borate buffer solution, tartrate buffer solution, and Tris buffer solution.
  • the amount of the aqueous phase component used may be appropriately adjusted within a range in which the O / W type emulsion can be formed well.
  • the volume of the aqueous phase component is twice or more that of the components other than the aqueous phase component constituting the O / W type emulsion.
  • the capacity can be 20 times or less.
  • the ratio is more preferably 5 times or more, and more preferably 10 times or less.
  • the O / W type emulsion can be prepared by a conventional method.
  • an oil phase solution is prepared by mixing components other than the aqueous phase component constituting the O / W type emulsion.
  • a part or all of the aqueous phase components are added and stirred to obtain an O / W type emulsion.
  • the mixture may be heated to a temperature below the boiling points of the oil phase component and the aqueous phase component.
  • the obtained emulsion may be diluted with the remaining aqueous phase component.
  • the mixing conditions of the fluorescent dye (I) and the O / W type emulsion are not particularly limited as long as the fluorescent dye (I) and the O / W type emulsion come into contact with each other.
  • the fluorescent dye (I) may be added and mixed with the O / W type emulsion, or the O / W type emulsion may be added and mixed with the fluorescent dye (I). If the location of the fluorescent dye (I) is not clear, add the O / W emulsion to a place where the presence of the fluorescent dye (I) is expected or suspected by dropping or spraying it. Just do it.
  • the light irradiated to the mixture is not particularly limited as long as it contains light having the maximum absorption wavelength of the fluorescent dye (II), but the peak wavelength of the irradiation light is included in the range of the maximum absorption wavelength ⁇ 20 nm of the fluorescent dye (II). It is more preferable that the fluorescent dye (II) is contained in the range of the maximum absorption wavelength of ⁇ 10 nm.
  • the light intensity of the device for irradiating the excitation light and the distance between the device and the irradiation position may be appropriately adjusted to the extent that the fluorescent dye (II) is sufficiently excited.
  • the fluorescent dye (II) is excited by irradiation with the excitation light, and the excitation energy is transferred to the nearby fluorescent dye (I) by Förster resonance energy transfer (FRET), and the fluorescent dye (I) emits light.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the intensity of light emission by FRET generally tends to be lower than that by direct excitation, but many fluorescent dyes (II) contained in the oil droplets of the O / W type emulsion have a large amount of light energy.
  • the fluorescent dye (I) is close to the oil droplets or is incorporated into the oil droplets due to the lipophilic compound that absorbs and excites the fluorescent dye (I) and causes a bioorthogonal reaction with the fluorescent dye (I). A large amount of light energy absorbed by the fluorescent dye (II) is efficiently transferred to the fluorescent dye (I), and the fluorescent dye (I) can effectively emit light.
  • the fluorescent dye can be efficiently emitted by light having a wavelength different from the original maximum absorption wavelength. Therefore, even in a case where the abundance of the fluorescent dye is small and detection is difficult, such as bioimaging, the fluorescence can be enhanced and the detection can be easily performed.
  • 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof is administered to a subject, and protoporphyrin IX (PpIX) biosynthesized from 5-aminolevulinic acid and accumulated in cancer tissue is irradiated with purple light having a wavelength of 405 nm and red light having a wavelength of 635 nm.
  • the cancer tissue is identified by detecting.
  • purple light is highly phototoxic and has low biopermeability, even if cancer is present, only cancer tissue existing on the surface of an organ or the like may be detected.
  • the method of the present invention it is possible to excite with light having a longer wavelength, which has low phototoxicity and high biopermeability, and the fluorescence can be enhanced, so that it exists on the surface of an organ or the like. It may be possible to effectively detect not only cancerous tissue but also relatively deep cancerous tissue.
  • Derivatives of 5-aminolevulinic acid include, for example, esters, acylates, and pharmaceutically acceptable salts.
  • the derivative may be a pharmaceutically acceptable salt of the ester, a pharmaceutically acceptable salt of the acylate, or an acylated ester.
  • Examples of the ester of 5-aminolevulinic acid include C 1-6 esters such as methyl ester, ethyl ester, isopropyl ester, n-propyl ester and t-butyl ester.
  • acyl group that modifies the amino group of 5-aminolevulinic acid examples include C 1-7 alkanoyl groups such as formyl, acetyl, n-propanoyl, n-butanoyl, and n-hexanoyl.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, nitrate, perchlorate, phosphate; oxalate, malon.
  • Latex Maleate, fumarate, lactate, malate, citrate, tartrate, benzoate, trifluoroacetate, acetate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluo Organic acid salts such as lomethane sulfonate; amino acid salts such as glutamate and asparagate; alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt; ammonium salts.
  • 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof is not particularly limited, but oral administration including sublingual administration or intravenous injection is preferable. Therefore, 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof is preferably powder, granule, tablet, capsule, syrup, injection or drip. Diagnostic agents containing 5-aminolevulinic acid or derivatives thereof may include other components as required, such as general pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, solvents, dispersion media, bulking agents, and excipients. Molding agents, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents and the like can be added.
  • the administration of 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof may be appropriately adjusted according to the body weight, sex, symptoms, etc. of the subject, and can be, for example, 0.1 mg or more and 1000 mg or less per 1 kg of the body weight of the subject.
  • the dose is preferably 10 mg or more, preferably 100 mg or less, and more preferably 50 mg or less.
  • the time from administration of 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof to detection may be appropriately adjusted, but can be, for example, 30 minutes or more and 8 hours or less.
  • the time is preferably 1 hour or more, more preferably 2 hours or more, preferably 6 hours or less, and more preferably 5 hours or less.
  • Protoporphyrin IX which is biosynthesized in vivo from 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof, has absorption wavelength peaks at 510 nm, 545 nm, 580 nm, and 630 nm in addition to the maximum absorption wavelength of 405 nm.
  • the fluorescent dye (II) a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the range of 405 ⁇ 20 nm is preferable, and a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength in the range of 405 nm ⁇ 10 nm is more preferable, and the maximum fluorescence Fluorescent dyes having a wavelength in the range of 510 nm, 545 nm, 580 nm or 630 nm ⁇ 20 nm are preferable, and fluorescent dyes contained in the range of 510 nm, 545 nm, 580 nm or 630 nm ⁇ 10 nm are more preferable.
  • An O / W emulsion containing a lipophilic compound having a functional group that causes a bioorthogonal reaction with PpIX and a fluorescent dye (II) in an oil droplet exposes an organ suspected of having cancer by surgery. After spraying on the surface, light including excitation light of fluorescent dye (II) is irradiated. Then, by detecting the fluorescence of PpIX, it becomes possible to identify the location of the cancer tissue.
  • the particle size and polydispersity index of the obtained emulsion were measured by a dynamic light scattering method. The results are shown in Table 1.
  • NE-1 the emulsion containing no CNO
  • NE-2 and NE-3 the emulsion containing 1.75 mg or 3.5 mg of CNO, respectively.
  • Test Example 1 Emission enhancement test of protoporphyrin IX (PpIX) DiO-containing nanoemulsions NE-1 to NE-3 prepared in Synthesis Example 3 were each diluted 10-fold with phosphate buffer (pH 7.2), and protoporphyrin was diluted.
  • the disodium salt of IX (PpIX) was added at 0 ⁇ M, 100 ⁇ M, 200 ⁇ M, 500 ⁇ M or 1000 ⁇ M, and the mixture was heated and stirred at 40 ° C. for 24 hours. After returning to room temperature, each solution was diluted 1000-fold with a medium containing 10% FBS, irradiated with excitation light of 473 nm, and the fluorescence spectrum was measured. The results are shown in FIGS.
  • the maximum absorption wavelength of DiO is 475 nm
  • the maximum fluorescence wavelength is 500 nm
  • the maximum absorption wavelength of PpIX is 410 nm
  • the maximum fluorescence wavelength is 635 nm
  • PpIX is slightly excited even with wavelengths of 510 nm, 545 nm, 580 nm and 630 nm.
  • it is not excited by light having a wavelength of 473 nm. Therefore, when NE-1 is irradiated with excitation light of 473 nm, fluorescence of 500 nm, which is considered to be derived from DiO, is observed, and fluorescence of 635 nm derived from PpIX is only slightly observed (FIG. 2).
  • FIG. 5 shows that in a solution containing both DiO and PpIX but not containing the CNO that binds them together, the fluorescence near 635 nm is due to direct excitation by excitation light near 405 nm.
  • the concentration of PpIX is 100 mM to 200 mM (corresponding to the concentration of 1/5 to 1/10 of DiO) with respect to NE-2 and NE-3 containing CNO. )
  • FRET indirect photoexcitation

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Abstract

本発明は、最大吸収波長以外のピーク波長の光を使っても蛍光色素の発光強度を増強できる方法と、当該方法を応用したがん組織の検出方法を提供することを目的とする。本発明に係る蛍光色素の発光強度の増強方法は、蛍光色素（Ｉ）と、少なくとも、蛍光色素（Ｉ）と生体直交型反応を起こす官能基を有する脂溶性化合物、および最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なり且つ最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれる蛍光色素（ＩＩ）を油滴中に含むＯ／Ｗ型エマルションとを混合する工程、および、上記蛍光色素（ＩＩ）の励起光を上記蛍光色素（Ｉ）と上記Ｏ／Ｗ型エマルションの混合物に照射する工程を含むことを特徴とする。

Description

蛍光色素の発光強度の増強方法
　本発明は、最大吸収波長以外のピーク波長の光を使っても蛍光色素の発光強度を増強できる方法に関するものである。
　蛍光色素は、高度にπ共役した構造を有する有機化合物であり、特定波長の光を吸収して励起すると、そのエネルギーは分子内での振動や回転運動などに費やされず、特定波長の光として放出する。蛍光色素は、このように吸収波長と発光波長が異なる他、レーザーに対する感受性や、光エネルギーと電気エネルギーを相互変換できる特性などから、光記録媒体用色素や光電変換色素などとして、銀塩写真、ディスプレイ、太陽電池など、様々な分野で応用が期待されている。また、高い視認性から、バイオ分野での蛍光標識色素としても利用されている。
　例えば特許文献１には、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその誘導体を体内に投与すると、がん組織にＡＬＡ類から誘導されるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）が蓄積し、光照射で蛍光を発するとの知見から開発された腫瘍診断剤が開示されており、特許文献２には、ＡＬＡ類を生体内に投与し、光照射で蛍光を発する血清や尿中のＰｐＩＸを測定する腫瘍診断剤が開示されており、特許文献３には、ＡＬＡ類を含む膀胱がん検出のための経口投与剤である増感剤が開示されている。
　蛍光色素は、上記の通り特定波長の光を吸収することにより励起して特定波長の蛍光を発するが、励起光の波長を変更することが望ましい場合がある。例えば、短波長の光はエネルギーが大きい。一方、長波長の光は害が小さく、且つ透過性が高いという利点がある。例えば上記のＰｐＩＸの最大吸収波長は紫色の４０５ｎｍであり、最大蛍光波長が６３５ｎｍの赤色光を発する。しかし短波長である紫色光の光毒性は強く、また生体透過性が低いために表面のがん組織しか検出することができない。
特許第２７３１０３２号公報 特開２００６－１２４３７２号公報 国際公開第２００９／１３０８９３号パンフレット
　上述したように、蛍光色素の励起光波長を変更することが望ましい場合がある。しかし、最大吸収波長以外のピーク波長の光を照射すると、蛍光強度が低下するのが一般的である。
　そこで本発明は、最大吸収波長以外のピーク波長の光を使っても蛍光色素の発光強度を増強できる方法と、当該方法を応用したがん組織の検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、微粒子を使って励起光エネルギーを集積し、その励起光エネルギーを、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して近傍の蛍光色素に移動させて励起することにより、蛍光色素の励起光波長とは異なるピーク波長を使っても蛍光色素の蛍光強度を増強できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　蛍光色素の発光強度を増強するための方法であって、
　蛍光色素（Ｉ）と、少なくとも、蛍光色素（Ｉ）と生体直交型反応を起こす官能基を有する脂溶性化合物、および最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なり且つ最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれる蛍光色素（ＩＩ）を油滴中に含むＯ／Ｗ型エマルションとを混合する工程、および、
　上記蛍光色素（ＩＩ）の励起光を上記蛍光色素（Ｉ）と上記Ｏ／Ｗ型エマルションの混合物に照射する工程を含むことを特徴とする方法。
　［２］　上記蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長より長波長側にある上記［１］に記載の方法。
　［３］　上記蛍光色素（Ｉ）が水溶性である上記［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　上記生体直交型反応が、エテニル基とニトリルオキシド基との反応、エチニル基とアジド基との反応、２－メトキシカルボニルトリフェニルホスフィンとアジド基との反応、シクロオクチニル基とテトラジニル基との反応、シクロオクテニル基とテトラジニル基との反応、メチルシクロペンテニル基とテトラジニル基との反応、およびチオール基とマレイミド基との反応から選択される上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］　上記蛍光色素（Ｉ）がプロトポルフィリンＩＸである上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］　がん組織を検出するための方法であって、
　５－アミノレブリン酸またはその誘導体を被検者に投与する工程、
　上記［５］に記載の方法により、がん組織の存在が疑われる箇所において上記プロトポルフィリンＩＸ由来の発光強度を増強する工程、および、
　上記プロトポルフィリンＩＸ由来の発光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
　本発明方法によれば、最大吸収波長と異なるピーク波長の光を使っても蛍光色素を発光させることができ且つ蛍光強度を増強することができる。よって本発明は、エネルギーがより高い短波長光や、安全性と透過性がより高い長波長光を使って蛍光色素を発光させることができる技術として非常に価値が高い。
図１は、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の吸収波長曲線と蛍光波長曲線である。図１中、吸収波長曲線は実線で示しており、蛍光波長曲線は点線で示している。 図２は、脂溶性ニトリルオキシド（ＣＮＯ）を含まないＯ／Ｗ型エマルションとプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）との混合物に４７３ｎｍの最大ピーク波長の励起光を照射した場合の蛍光スペクトルである。 図３は、油相成分とＣＮＯとの合計に対する割合が約９．１質量％であるＣＮＯを含むＯ／Ｗ型エマルションとＰｐＩＸとの混合物に４７３ｎｍの最大ピーク波長の励起光を照射した場合の蛍光スペクトルである。 図４は、油相成分とＣＮＯとの合計に対する割合が約１６．７質量％であるＣＮＯを含むＯ／Ｗ型エマルションとＰｐＩＸとの混合物に４７３ｎｍの最大ピーク波長の励起光を照射した場合の蛍光スペクトルである。 図５は、ＣＮＯを含まないＯ／Ｗ型エマルションとＰｐＩＸとの混合物の６３５ｎｍ付近の蛍光に関する励起スペクトルである。 図６は、油相成分とＣＮＯとの合計に対する割合が約９．１質量％であるＣＮＯを含むＯ／Ｗ型エマルションとＰｐＩＸとの混合物の６３５ｎｍ付近の蛍光に関する励起スペクトルである。 図７は、油相成分とＣＮＯとの合計に対する割合が約１６．７質量％であるＣＮＯを含むＯ／Ｗ型エマルションとＰｐＩＸとの混合物の６３５ｎｍ付近の蛍光に関する励起スペクトルである。
　以下、工程毎に本発明を説明するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
　１．混合工程
　本工程では、蛍光色素（Ｉ）と、少なくとも、蛍光色素（Ｉ）と生体直交型反応を起こす官能基を有する脂溶性化合物、および最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なり且つ最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれる蛍光色素（ＩＩ）を油滴中に含むＯ／Ｗ型エマルションとを混合する。
　蛍光色素（Ｉ）は、本発明において発光させる主要な蛍光色素であり、脂溶性化合物と生体直交型反応を起こす官能基を有する以外、特に制限されない。生体直交型反応は、ｉｎ　ｖｉｖｏやｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件下において、標的とする生体分子をその機能を損なわせることなく化学修飾でき、周囲環境に影響を受けない高化学選択的・高収率・高速の反応と定義されており、本発明では生体直交型反応を起こす官能基を利用する。
　生体直交型反応を起こす官能基の組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、エテニル基（ビニル基）とニトリルオキシド基との反応、エチニル基とアジド基との反応、２－メトキシカルボニルトリフェニルホスフィンとアジド基との反応、シクロオクチニル基とテトラジニル基との反応、シクロオクテニル基とテトラジニル基との反応、メチルシクロペンテニル基とテトラジニル基との反応、チオール基とマレイミド基との反応が挙げられる。例えば、エテニル基とニトリルオキシド基との反応では、１，３－双極子であるニトリルオキシド基とＣ－Ｃ二重結合との間で［３＋２］付加環化が起こり、複素環化合物が生成する。但し、エチニル基とアジド基との反応には、銅触媒を用いることが好ましい。それに対して、２－メトキシカルボニルトリフェニルホスフィンとアジド基との反応や、シクロオクテニル基とテトラジニル基との反応では、銅触媒は不要である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　蛍光色素（Ｉ）としては、当初から生体直交型反応を起こす官能基を有する蛍光色素を用いてもよいし、蛍光色素が生体直交型反応を起こす官能基を有さない場合には、蛍光色素に生体直交型反応を起こす官能基を導入してもよい。例えば、５－アミノレブリン酸またはその誘導体の投与により生合成され、がん組織に蓄積するプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）は、２つのエテニル基（ビニル基）を有する。
　蛍光色素（Ｉ）としては、水溶性のものであれば生体や生体サンプルに対して使用可能であり、油溶性であればＯ／Ｗ型エマルションとの混合で油滴中に取り込まれ、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がより効率的に起こる可能性がある。水溶性とは、粉末状態の対象物１ｇまたは１ｍＬを水に加え、２０±５℃で５分毎に３０秒間強く振り混ぜるとき、３０分間以内に溶解するのに必要な水の量が３０ｍＬ未満であることをいい、当該量としては１０ｍＬ未満が好ましい。油溶性とは、粉末状態の対象物１ｇまたは１ｍＬを水に加え、２０±５℃で５分毎に３０秒間強く振り混ぜるとき、３０分間以内に溶解するのに必要な水の量が１０００ｍＬ以上であることをいうものとする。
　蛍光色素（Ｉ）としては、例えば、上述のプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の他、エオシンやウラニン等、水溶性フルオレセイン系色素が挙げられる。
　蛍光色素（Ｉ）の使用量は、調整可能である場合、Ｏ／Ｗ型エマルション中における濃度で５０μＭ以上が好ましく、７５μＭ以上がより好ましく、１００μＭ以上がより更に好ましい。その上限は特に制限されないが、例えば５０００μＭ以下とすることができる。
　脂溶性化合物は、Ｏ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれ、且つ蛍光色素（Ｉ）と生体直交型反応を起こす官能基を有する。脂溶性化合物は、蛍光色素（Ｉ）が有する生体直交型反応を起こす官能基と、生体直交型反応を起こす官能基を有する。例えば、蛍光色素（Ｉ）がエテニル基（ビニル基）を有する場合、脂溶性化合物はニトリルオキシド基を有することが好ましい。
　脂溶性化合物としては、例えば、置換基として生体直交型反応を起こす官能基を有するベンゼン化合物が挙げられる。脂溶性化合物は、脂溶性の向上のため、長鎖炭化水素基や長鎖アルコキシ基、例えば、Ｃ12-24アルキル基やＣ12-24アルコキシ基を置換基として有していてもよい。
　脂溶性化合物の使用量は、Ｏ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれる蛍光色素（ＩＩ）と蛍光色素（Ｉ）との間でフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる程度、具体的には両者の距離が１０ｎｍ未満になるように、油滴と蛍光色素（Ｉ）とが接近することができれば、特に制限されない。例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する油相成分と脂溶性化合物との合計に対する脂溶性化合物の割合を１質量％以上、２５質量％以下とすることができる。当該割合が１質量％以上であれば、生体直交型反応により蛍光色素（Ｉ）をＯ／Ｗ型エマルションの油滴により確実に接近せしめることができる。当該割合が２５質量％以下であれば、油滴中の蛍光色素（ＩＩ）の相対割合が十分である。当該割合としては、２質量％以上がより好ましく、５質量％以上がより更に好ましく、また、２０質量％以下がより好ましく、１８質量％以下がより更に好ましい。
　蛍光色素（ＩＩ）は、Ｏ／Ｗ型エマルションの油滴中に含有される程度に脂溶性を示し、その最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なり、且つその最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれるものを用いる。
　よって蛍光色素（ＩＩ）としては、脂溶性のものを用いるか、或いは水溶性のものであってもそのカウンターアニオンまたはカウンターカチオンとして脂溶性の高いものを用いる。蛍光色素（ＩＩ）としては、例えば、ナフタレン系蛍光色素；アントラセン系蛍光色素；ピレン系蛍光色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７等のシアニン系蛍光色素；ローダミンＢ、ＴＭＲ等のローダミン系蛍光色素；ＢＯＤＩＰＹ系蛍光色素；Ｎｉｌｅ　Ｒｅｄ系蛍光色素；クロモン系蛍光色素が挙げられる。蛍光色素（ＩＩ）としては、電荷を有する蛍光色素であっても、そのアルキル基ができるだけ長鎖、例えばＣ12-24アルキル基のものを用いることが好ましい。脂溶性の高いカウンターアニオンとしては、例えば、テトラフェニルボレートやテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレートが挙げられる。脂溶性の高いカウンターアニオンと塩を形成する蛍光色素（ＩＩ）としては、例えば、ＤｉＩ、Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ　ＤｉＩ、Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ　ＤｉＯ、Ｄｉｏ、ＤｉＯＣ１４（３）、ＤｉＯＣ１６（３）、Ｎｅｕｒｏ－ＤｉＩ、Ｎｅｕｒｏ－Ｄｉｏ等のオキシカルボシアニン色素が挙げられる。
　本発明では、蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長とは異なるピーク波長の光により蛍光色素（Ｉ）を発光させるため、蛍光色素（Ｉ）に加えて、最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なる蛍光色素（ＩＩ）を用いる。例えば、蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長よりも低波長側にある場合、エネルギーの高い低波長光により蛍光色素（Ｉ）を間接的に励起して発光させ得る。一方、蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長よりも高波長側にある場合、より安全性が高く且つ透過性の高い高波長光により蛍光色素（Ｉ）を間接的に励起して発光させ得る。
　蛍光色素（ＩＩ）は、Ｏ／Ｗ型エマルションの油滴中に存在し、油滴近傍にある蛍光色素（Ｉ）との間でフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす。ＦＲＥＴとは、二つの蛍光分子がごく近接して存在する場合に一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へ、エネルギーが移行する現象をいう。より具体的には、一方の蛍光分子の蛍光ピークが他方の蛍光分子の励起ピークと重複する場合、一方の蛍光分子が励起光により励起されると、他方の蛍光分子に励起エネルギーが移動され、他方の蛍光分子が発光する。ＦＲＥＴによる蛍光強度は、ＦＲＥＴによらない直接励起による蛍光強度よりも一般的に低いが、本発明ではＯ／Ｗ型エマルションの油滴中に存在する蛍光色素（ＩＩ）により、直接励起に比べて多量の光エネルギーを捕集することができ、捕集された多量の光エネルギーが蛍光色素（ＩＩ）から蛍光色素（Ｉ）へ受け渡されるため、通常の直接励起よりも強い蛍光強度が得られる。よって、蛍光色素（ＩＩ）としては、その最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれるものを用い、蛍光色素（ＩＩ）の蛍光波長域に蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長が含まれている必要は必ずしもないが、蛍光色素（ＩＩ）の蛍光波長域に蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長以外の吸収ピーク波長が含まれていることが好ましい。
　例えば、図１として示すＰｐＩＸの吸収波長曲線（実線）と蛍光波長曲線（点線）の通り、ＰｐＩＸは、紫色光である４０５ｎｍの最大吸収波長と、赤色光である６３５ｎｍの最大蛍光波長を示し、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍおよび６３０ｎｍにも吸収波長ピークを有する。よって、蛍光色素（Ｉ）としてＰｐＩＸを用いる場合、蛍光色素（ＩＩ）として、その最大蛍光波長がＰｐＩＸの最大吸収波長と重複している蛍光色素（ＩＩ）を用いると、ＰｐＩＸの蛍光を極めて効率的に増強でき得る。しかしこの場合には、蛍光色素は一般的により短波長の光を吸収してより長波長の蛍光を発するものであるため、蛍光色素（ＩＩ）の励起にはその最大吸収波長が４０５ｎｍよりも短波長の光を使わざるを得ない。それに対して、最大蛍光波長がＰｐＩＸの吸収波長ピークである５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍおよび／または６３０ｎｍと重複する蛍光色素（ＩＩ）を用いれば、蛍光増強効果は比較的低下するかもしれないが、より安全な長波長光で蛍光強度を増強することができ得る。
　蛍光色素（ＩＩ）の使用量は、ＦＲＥＴにより蛍光色素（Ｉ）を十分に励起することができ、蛍光色素（Ｉ）の直接励起の場合よりも高強度で蛍光色素（Ｉ）を発光させ得ることができれば、特に制限されない。例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する油相成分と蛍光色素（ＩＩ）との合計に対する蛍光色素（ＩＩ）の割合を５質量％以上、４０質量％以下とすることができる。当該割合が５質量％以上であれば、蛍光色素（Ｉ）を十分に間接励起することができる。当該割合が４０質量％以下であれば、油滴中の脂溶性化合物の相対割合が十分である。当該割合としては、８質量％以上がより好ましく、１２質量％以上がより更に好ましく、また、３０質量％以下がより好ましく、２０質量％以下がより更に好ましい。
　Ｏ／Ｗ型エマルションには、油滴を安定化する等のため界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤のいずれも用いることができるが、非イオン界面活性剤が好ましい。非イオン界面活性剤としては、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、デカグリセリンエステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等を挙げることができる。
　界面活性剤の使用量は、Ｏ／Ｗ型エマルション中の油滴を安定化できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションにおける界面活性剤の濃度を１質量％以上、１０質量％以下とすることができる。当該割合が１質量％以上であれば、油滴をより確実に安定化することができる。当該割合が１０質量％以下であれば、油滴中の蛍光色素（ＩＩ）と脂溶性化合物の相対割合が十分である。当該割合としては、２質量％以上がより好ましく、３質量％以上がより更に好ましく、また、８質量％以下がより好ましく、６質量％以下がより更に好ましい。
　Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する油相の成分は特に制限されないが、生体に対する安全性が高いものが好ましい。油相成分としては、例えば、トリオレイン、トリリノレイン、トリパルミチン、トリステアリン、トリミリスチン、トリアラキドニン等のトリグリセリド；流動パラフィン、スクアレン、スクアラン、プリスタン等の炭化水素類；ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などの長鎖脂肪酸類；パルミチン酸エチルヘキシル、イソノナン酸イソノニル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸エチル、トリ（カプリル酸・カプリン酸）グリセリル、２－エチルヘキサン酸セチル、トリ２－エチルヘキサン酸グリセリル、セバシン酸ジイソプロピル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル等のエステル類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、アミノ変性シリコーン等のシリコーン油類；セタノール、オレイルアルコール等の高級アルコール類；バチルアルコール、キミルアルコール等のアルキルグリセリルエーテル類などが挙げられる。油相成分は、１種のみ用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。例えば、複数の油相成分の混合物としては、ミツロウ、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ラノリン、鯨ロウ等のロウ類；マカデミアナッツ油、オリーブ油、綿実油、大豆油、アボガド油、コメヌカ油、米油、コメ胚芽油、パーム核油、ヒマシ油、ローズヒップ油、月見草油、ツバキ油、馬油、グレープシード油、ヤシ油、メドウホーム油、シアバター、コーン油、サフラワー油、ゴマ油等の油脂類が挙げられる。
　油相成分の使用量は、Ｏ／Ｗ型エマルションを良好に形成できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションにおける油相成分の濃度を０．５質量％以上、１０質量％以下とすることができる。当該割合がこの範囲にあれば、Ｏ／Ｗ型エマルションを良好に形成できる。当該割合としては、１質量％以上がより好ましく、２質量％以上がより更に好ましく、また、８質量％以下がより好ましく、５質量％以下がより更に好ましい。
　Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する水相の成分としては、水の他、緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、例えば、ｐＨが４．５以上、９以下の緩衝液を用いることができる。緩衝液の種類は特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。
　水相成分の使用量は、Ｏ／Ｗ型エマルションを良好に形成できる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する水相成分以外の成分に対して２倍容量以上、２０倍容量以下とすることができる。当該割合がこの範囲にあれば、Ｏ／Ｗ型エマルションを良好に形成できる。当該割合としては、５倍容量以上がより好ましく、また、１０倍容量以下がより好ましい。
　Ｏ／Ｗ型エマルションは常法により作製することができる。例えば、Ｏ／Ｗ型エマルションを構成する水相成分以外の成分を混合し、油相溶液を作製する。次に、水相成分の一部または全部を添加し、攪拌することでＯ／Ｗ型エマルションが得られる。油相溶液の作製時や分散時には、混合物を油相成分および水相成分の沸点未満の温度で加熱してもよい。また、水相成分の一部で油滴を分散させた場合には、得られたエマルションを残りの水相成分で希釈してもよい。
　蛍光色素（Ｉ）とＯ／Ｗ型エマルションとの混合条件は、蛍光色素（Ｉ）とＯ／Ｗ型エマルションとが接触する限り特に制限されない。例えば、蛍光色素（Ｉ）をＯ／Ｗ型エマルションに添加混合してもよいし、Ｏ／Ｗ型エマルションを蛍光色素（Ｉ）に添加混合してもよい。また、蛍光色素（Ｉ）の所在が明確ではない場合には、蛍光色素（Ｉ）の存在が予想される場所や疑われる箇所に、Ｏ／Ｗ型エマルションを滴下または噴霧するなどして添加すればよい。
　２．発光工程
　本工程では、蛍光色素（Ｉ）とＯ／Ｗ型エマルションの混合物に、蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長の光を照射する。
　混合物に照射する光は、蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長の光を含むものであれば特に制限されないが、照射光のピーク波長が蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長±２０ｎｍの範囲に含まれていることが好ましく、蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長±１０ｎｍの範囲に含まれていることがより好ましい。
　励起光を照射するための機器の光強度や、機器と照射位置との距離は、蛍光色素（ＩＩ）が十分に励起される程度に適宜調整すればよい。励起光の照射により、蛍光色素（ＩＩ）が励起され、その励起エネルギーは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により近傍に存在する蛍光色素（Ｉ）へ受け渡され、蛍光色素（Ｉ）が発光する。その際、一般的にＦＲＥＴによる発光の強度は直接励起による発光に比べて低下する傾向があるが、Ｏ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれる多くの蛍光色素（ＩＩ）が多量の光エネルギーを吸収して励起し、また、蛍光色素（Ｉ）との間で生体直交型反応を起こす脂溶性化合物により蛍光色素（Ｉ）は油滴に近接しているか或いは油滴中に取り込まれるため、蛍光色素（ＩＩ）が吸収した多量の光エネルギーは効率的に蛍光色素（Ｉ）へ受け渡され、蛍光色素（Ｉ）は有効に発光することが可能になる。
　上述した通り、本発明方法によれば、蛍光色素を本来の最大吸収波長とは異なる波長の光によっても効率的に発光させることができる。それにより、例えばバイオイメージング等、蛍光色素の存在量が少なく検出が難しいような場合であっても、蛍光を増強することができ、容易に検出することが可能になり得る。
　例えば、５－アミノレブリン酸またはその誘導体を被験者に投与し、５－アミノレブリン酸から生合成されてがん組織に集積するプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）に波長４０５ｎｍの紫色光を照射して６３５ｎｍの赤色光を検出することによりがん組織を特定することが行われている。しかし、紫色光は光毒性が高く、また生体透過性が低いため、たとえがんが存在していても臓器などの表面に存在しているがん組織しか検出できないおそれがある。一方、上記本発明方法を利用すれば、光毒性が低く且つ生体透過性が高いより長波長の光で励起が可能になり、且つ蛍光を増強することができるため、臓器などの表面に存在するがん組織のみならず、比較的深部のがん組織も効果的に検出できる可能性がある。
　５－アミノレブリン酸の誘導体としては、例えば、エステル体、アシル化体、および薬学上許容される塩が挙げられる。当該誘導体は、エステル体の薬学上許容される塩、アシル化体の薬学上許容される塩、アシル化エステル体であってもよい。５－アミノレブリン酸のエステル体としては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｎ－プロピルエステル、ｔ－ブチルエステル等のＣ1-6エステルが挙げられる。５－アミノレブリン酸のアミノ基を修飾するアシル基としては、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ－プロパノイル、ｎ－ブタノイル、ｎ－ヘキサノイル等のＣ1-7アルカノイル基が挙げられる。薬学上許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩などの有機酸塩；グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩が挙げられる。
　５－アミノレブリン酸またはその誘導体の投与形態は特に制限されないが、舌下投与も含む経口投与や、静脈注射することが好ましい。よって、５－アミノレブリン酸またはその誘導体は、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤や点滴剤とすることが好ましい。５－アミノレブリン酸またはその誘導体を含む診断剤には、必要に応じて他の成分、例えば、薬学上許容される一般的な担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などを添加することができる。
　５－アミノレブリン酸またはその誘導体の投与は、被験者の体重、性別、症状などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、被験者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下とすることができる。当該投与量としては、１０ｍｇ以上が好ましく、また、１００ｍｇ以下が好ましく、５０ｍｇ以下がより好ましい。
　５－アミノレブリン酸またはその誘導体の投与から検出までの時間は、適宜調整すればよいが、例えば３０分以上、８時間以下とすることができる。当該時間としては、１時間以上が好ましく、２時間以上がより好ましく、また、６時間以下が好ましく、５時間以下がより好ましい。
　５－アミノレブリン酸またはその誘導体から生体内で生合成されるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）は、４０５ｎｍの最大吸収波長の他に、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍおよび６３０ｎｍにも吸収波長ピークを有する。よって、蛍光色素（ＩＩ）としては、最大蛍光波長が４０５±２０ｎｍの範囲に含まれている蛍光色素が好ましく、４０５ｎｍ±１０ｎｍの範囲に含まれていること蛍光色素がより好ましく、また、最大蛍光波長が５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍまたは６３０ｎｍ±２０ｎｍの範囲に含まれている蛍光色素が好ましく、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍまたは６３０ｎｍ±１０ｎｍの範囲に含まれている蛍光色素がより好ましい。
　ＰｐＩＸと生体直交型反応を起こす官能基を有する脂溶性化合物および蛍光色素（ＩＩ）を油滴中に含むＯ／Ｗ型エマルションは、例えば、手術によりがんの存在が疑われる臓器を露出させ、その表面に噴霧した後、蛍光色素（ＩＩ）の励起光を含む光を照射する。次いで、ＰｐＩＸの蛍光を検出することにより、がん組織の所在を特定することが可能になる。
　本願は、２０１９年８月３０日に出願された日本国特許出願第２０１９－１５８５００号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１９年８月３０日に出願された日本国特許出願第２０１９－１５８５００号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　合成例１：　脂溶性ニトリルオキシド（ＣＮＯ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　（１）化合物１の合成
　４－ヒドロキシ－２，６－ジメトキシベンズアルデヒド（５００ｍｇ，２．７４ｍｍｏｌ）、Ｋ2ＣＯ3（１．１４ｇ，８．２２ｍｍｏｌ，３ｅｑ）、および１－ヨードヘキサデカン（１．７３ｍＬ，５．４８ｍｍｏｌ，２ｅｑ）をナスフラスコに量り取り、更にアセトン（１３．７ｍＬ）を加えた。次いで、得られた反応液を６０℃で２３時間加熱還流し、放冷後に吸引濾過にて不溶物を除去した。濾液を減圧濃縮した後、酢酸エチルに溶解させ、水と飽和食塩水にて洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウムにて脱水した後、減圧濃縮して真空にて乾燥させ、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：Ｈｅｘａｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝２／１→１／１）にて精製することにより、白色粉末の化合物１を得た（収量：３１５ｍｇ，収率：２８％）。
　（２）化合物２の合成
　化合物１（２５０ｍｇ，６１５μｍｏｌ）とＮＨ2ＯＨ・ＨＣｌ（４７ｍｇ，６７６μｍｏｌ，１．１ｅｑ）をナスフラスコに量り取り、更にエタノール（４．５ｍＬ）を加えて氷冷した。別途、水（１．５ｍＬ）に水酸化ナトリウム（３７ｍｇ，９２２μｍｏｌ，１．５ｅｑ）を溶解し、得られた溶液を先のナスフラスコへ一滴ずつ加えた。得られた反応液を６０℃で１時間加熱攪拌し、放冷後に吸引濾過することにより白色粉末の化合物２を得た（収量：２５９ｍｇ，収率：ｑｕａｎｔ）。
　（３）化合物３の合成
　化合物２（２５０ｍｇ，５９３μｍｏｌ）とトリエチルアミン（１２３μＬ，８８９μｍｏｌ，１．５ｅｑ）をナスフラスコに量り取り、更にクロロホルム（６．８ｍＬ）を加えて氷冷した。次いで、Ｎ－クロロスクシンイミド（１１８ｍｇ，８８９μｍｏｌ，１．５ｅｑ）を加えて１時間撹拌した。反応溶に水を加えて反応を停止させた後、クロロホルムで抽出し、水で洗浄した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで脱水した後、減圧濃縮し真空にて乾燥させた。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン：酢酸エチル＝９／１）にて精製することにより、淡黄色粉末の化合物３を得た（収量：１５７ｍｇ，収率：６３％）。
　合成例２：　脂溶性シアニン色素ＤｉＯの合成
　脂溶性シアニン色素であるＤｉＯを、公知方法（Ｂｏｈｄａｎ　Ａｎｄｒｅｉｕｋら，ｓｍａｌｌ，ｖｏｌ．１３，ｉｓｓｕｅ３８，１７０１５８２（２０１７））にしたがって合成した。
　合成例３：　ＤｉＯ－ＣＮＯ含有ナノエマルションの作製
　サンプルチューブにトリグリセリド（「Ｌａｂｒａｆａｃ(R)　ＣＣ」，１７．５ｍｇ）、界面活性剤（「Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ(R)　ＥＬＰ」ＢＡＳＦ社製，ＰＥＧ－３５ヒマシ油，３２．５ｍｇ）、およびＤｉＯ（３．５ｍｇ）を量り取ったものを３セット用意した。次いで、８℃で１０分間加熱撹拌した後、ＣＮＯを加えないか、或いはＣＮＯをそれぞれ１．７５ｍｇまたは３．５ｍｇを入れて、５分加熱撹拌した。これに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２，２３０μＬ）を加え、５分間加熱撹拌した。得られたエマルションの粒径と多分散度指数を、動的光散乱法にて測定した。結果を表１に示す。以下、ＣＮＯを含まないエマルションをＮＥ－１といい、ＣＮＯをそれぞれ１．７５ｍｇまたは３．５ｍｇ含むエマルションをＮＥ－２およびＮＥ－３という。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　試験例１：　プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の発光増強試験
　合成例３で作製したＤｉＯ含有ナノエマルションＮＥ－１～ＮＥ－３それぞれをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍希釈し、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）の二ナトリウム塩を０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭまたは１０００μＭ加え、４０℃で２４時間加熱攪拌した。室温に戻した後、それぞれの溶液を、１０％ＦＢＳを含む培地で１０００倍希釈し、４７３ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。結果を図２～４に示す。
　通常、ＤｉＯの最大吸収波長は４７５ｎｍ、最大蛍光波長は５００ｎｍであり、ＰｐＩＸの最大吸収波長は４１０ｎｍ、最大蛍光波長は６３５ｎｍであり、ＰｐＩＸは５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍおよび６３０ｎｍの波長光でも若干励起されるが、４７３ｎｍの波長光では励起されない。よって、ＮＥ－１に４７３ｎｍの励起光を照射した場合には、ＤｉＯに由来すると考えられる５００ｎｍの蛍光が認められ、ＰｐＩＸに由来する６３５ｎｍの蛍光は僅かに認められるのみである（図２）。
　一方、ＣＮＯを含むＮＥ－２およびＮＥ－３の場合には、４７３ｎｍの励起光照射により、６３０ｎｍ付近に明確な発光ピークが確認された（図３および図４）。この発光ピークは、ＰｐＩＸを添加しない場合には認められないことから、ＰｐＩＸに由来するものであると考えられる。より詳しくは、エマルションの液滴中に含まれるＣＮＯのニトリルオキシド基がＰｐＩＸのビニル基と相互作用して油滴近傍にＰｐＩＸが存在しており、先ず４７３ｎｍの励起光によりＤｉＯが励起され、ＤｉＯの蛍光波長範囲と重複する吸収波長範囲を有するＰｐＩＸとの間でフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、ＰｐＩＸが発光したと考えられる。
　更に、これらＮＥ－１～ＮＥ－３の溶液について、６３５ｎｍ付近の蛍光に関する励起スペクトルを測定した。結果を図５～７に示す。
　図５には、ＤｉＯとＰｐＩＸの両方を含んでいても、両者を結び付けるＣＮＯを含まない溶液では、６３５ｎｍ付近の蛍光は４０５ｎｍ付近の励起光による直接励起によるものであることが示されている。
　一方、図６および図７に示される結果の通り、ＣＮＯを含むＮＥ－２とＮＥ－３に関して、特にＰｐＩＸの濃度が１００ｍＭ～２００ｍＭ（ＤｉＯの５分の１～１０分の１の濃度に相当）においては、４０５ｎｍ（ＰｐＩＸの主吸収帯）の直接励起よりも、４７３ｎｍによる間接的光励起（ＦＲＥＴ）の方が効率的にＰｐＩＸの発光が得られることが判明した。

Claims (6)

  1. 　蛍光色素の発光強度を増強するための方法であって、
    　蛍光色素（Ｉ）と、少なくとも、蛍光色素（Ｉ）と生体直交型反応を起こす官能基を有する脂溶性化合物、および最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長と異なり且つ最大蛍光波長が蛍光色素（Ｉ）の吸収波長域に含まれる蛍光色素（ＩＩ）を油滴中に含むＯ／Ｗ型エマルションとを混合する工程、および、
    　上記蛍光色素（ＩＩ）の励起光を上記蛍光色素（Ｉ）と上記Ｏ／Ｗ型エマルションの混合物に照射する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 　上記蛍光色素（ＩＩ）の最大吸収波長が蛍光色素（Ｉ）の最大吸収波長より長波長側にある請求項１に記載の方法。
  3. 　上記蛍光色素（Ｉ）が水溶性である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　上記生体直交型反応が、エテニル基とニトリルオキシド基との反応、エチニル基とアジド基との反応、２－メトキシカルボニルトリフェニルホスフィンとアジド基との反応、シクロオクチニル基とテトラジニル基との反応、シクロオクテニル基とテトラジニル基との反応、メチルシクロペンテニル基とテトラジニル基との反応、およびチオール基とマレイミド基との反応から選択される請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　上記蛍光色素（Ｉ）がプロトポルフィリンＩＸである請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　がん組織を検出するための方法であって、
    　５－アミノレブリン酸またはその誘導体を被検者に投与する工程、
    　請求項５に記載の方法により、がん組織の存在が疑われる箇所において上記プロトポルフィリンＩＸ由来の発光強度を増強する工程、および、
    　上記プロトポルフィリンＩＸ由来の発光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
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JPS60501443A (ja) * 1983-06-02 1985-09-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバ−シティ 長波長光によつて励起された腫瘍特定マ−カ−中の静脈注射ポルフィリンから発せられた赤外螢光を監視することによる癌組織の位置特定

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MASUDA, H. ET AL.: "Dual wavelength 5- aminolevulinic acid photodynamic therapy using a novel flexible light-emitting diode uni t", J. DERMATOL. SCI., vol. 93, no. 2, February 2019 (2019-02-01), pages 109 - 115, XP085629303, DOI: 10.1016/j.jdermsci.2018.12.006 *

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