WO2021019418A1 - Biocathode enzymatique, son procede de fabrication ainsi que biopile a combustible et biocapteur comportant cette biocathode enzymatique - Google Patents

Biocathode enzymatique, son procede de fabrication ainsi que biopile a combustible et biocapteur comportant cette biocathode enzymatique Download PDF

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WO2021019418A1
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biocathode
agent
cofactor
glucose
enzymatic
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PCT/IB2020/057059
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Abdelkader Zebda
Philippe Cinquin
Donald Martin
Thomas SORANZO
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Université Grenoble Alpes
Institut National De La Santé Et De La Recherche Medicale - Inserm
Grenoble Inp (Institut National Polytechnique)
Cnrs - Centre National De La Recherche Scientifique
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    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to an enzymatic biocathode, its manufacturing process as well as a biofuel cell comprising it for its application to energy conversion and a biosensor comprising it for its application to detection.
  • a fuel cell is an electric cell which, unlike storage cells, can be supplied with fuel continuously so that the output of electrical power is sustained indefinitely (CONNIHAN MA, (1981) Dictionary of Energy, Routledge and Kegan Paul). They convert the chemical energy of fuel into electrical energy through the electrochemical reactions of fuel and an oxidant.
  • a fuel cell consists of two electrodes - an electron emitting anode and an electron receiving cathode - separated by an electrolyte allowing the passage of ions. At the anode and cathode respectively, oxidation of the fuel (anode) and reduction of the oxidant (cathode) take place. The oxidation and reduction reactions at the electrodes require the use of metallic or molecular catalysts.
  • EBFC Enzymatic Biofuel Cell
  • EBFCs are subclass of fuel cells, relying on purified redox enzymes to perform electrocatalytic reactions (see Figure 1 of the accompanying drawing).
  • EBFCs cannot compete with conventional fuel cells which are capable of delivering power densities of up to W / cm 2 1000 times greater than the powers delivered by biofuel cells.
  • enzymatic compared to metal catalysts, the attractiveness of enzymes is based on their high specificity towards their respective substrates and their ability to achieve high catalytic yields under mild conditions (20-40 ° C in a reasonable pH range of 5 -8 or even at neutral pH). Therefore, such electrochemical generators are envisioned to operate in complex media such as physiological fluids or plants.
  • glucose In the case of enzymatic fuel cells, the most widely studied fuel is glucose, but other important fuels such as ethanol, lactate or glycerol are also new fuels for collecting energy from the biomass.
  • the oxidant is often dioxygen or hydrogen peroxide, as these two substrates have a higher reduction potential. This is because the voltage of a fuel cell is the difference between the reduction potential of the oxidant and the oxidation potential of the fuel. Thus, to function, a fuel cell must use an oxidant having a reduction potential greater than the oxidation potential of the fuel. For this reason, the number of oxidants used is very limited, as few substrates have a high reduction potential. In addition, in the case of implantable biofuel, the only oxidant available in a living body is oxygen.
  • the available oxygen is limited by its low concentration due to its low solubility in water: 0.2 mM and only 0.05 mM in a living body (Challenges for successful implantation of biofuel cells, A. Zebda, JP Alcaraz, P. Vadgama, S. Shleev, P. Cinquin, DK Martin, Bioelectrochemistry, pages 57-72 (2018).
  • the low concentration of oxygen often causes the biocathode to be the limiting electrode in biofuel cells.
  • Implantable, and even non-implantable, biofuel cells therefore exhibit limited performance by the low level of dioxygen concentration in physiological fluid (0.05 mM) or in water (0.2 mM). Indeed, the oxygen concentration is 100 times lower than the glucose level in the body (5 mM), which presents a major problem because this low oxygen concentration limits the performance in terms of the electrical power delivered.
  • Shleev et al S. Shleev, Quo Vadis, Implanted Fuel Cell ChemPlusChem 2017, 82, 522-539 have shown that, in the case of implantable glucose biofuel cells, the low oxygen concentration limits the current density delivered by the 40 ⁇ A / cm2 glucose biofuel cell.
  • a cathode having a high surface area For example, to power a medical device consuming 1 mW, a glucose biofuel battery operating at 300 mV must have a biocathode having a surface area of about 400 cm2, which is, from a medical point of view, a serious constraint on the space available in the body for implantation of the glucose biofuel cell. For this reason, it is known, in the case of implantable glucose biofuel, that the low oxygen concentration linked to its low solubility in water (0.2 mM) causes the biocathode to be the limiting electrode in the battery. biofuel.
  • the object of the present invention is to resolve the drawbacks which have just been exposed for biofuel cells and biosensors and to this end proposes a novel enzymatic biocathode architecture capable of using glucose or an aldehyde as oxidant (see FIG. 2) with a relatively high voltage glucose reduction catalysis.
  • the enzymatic biocathode according to the invention is capable of converting the chemical energy of glucose or an aldehyde into electrical energy by means of enzymatic reduction of glucose or aldehyde.
  • this biocathode uses glucose or an aldehyde as an oxidant, which allows the construction of an implantable glucose biofuel cell that works 100% with glucose without the need for oxygen.
  • glucose as an oxidant in an implantable glucose biofuel significantly improves the performance of the biofuel cell. Additionally, the implantable glucose biofuel cell can be used as an energy source to produce oxygen in-vivo.
  • the biocathode according to the invention can also be used to design a biofuel cell operating under anaerobic conditions (for example: underwater, mines, special conditions).
  • the fuel cell will use glucose or other biomass compound as an oxidant at the biocathode and also as a reducer at the bioanode.
  • the biocathode according to the invention offers the possibility of measuring a glucose level at a very low potential by measuring a glucose reduction current, which prevents oxidative interference due to interfering molecules.
  • the biocathode operates in a reduction mode at a potential far away from the oxidation potential of interfering molecules present in a physiological fluid which increases the sensitivity and lifespan of the biosensor (see Figure 4).
  • the present invention therefore firstly relates to an enzymatic biomass biocathode based on monosaccharide, ketone or aldehyde, characterized in that it comprises:
  • the conductive particles can advantageously be chosen from particles of carbon nanotubes, graphene, graphite, carbon black or mesoporous carbon, in particular multi-walled carbon nanotubes (MWCNT - Multiwalled carbon nanotubes).
  • MWCNT - Multiwalled carbon nanotubes multi-walled carbon nanotubes
  • Aldose reductase is advantageously associated with its nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) cofactor, in which case the biocathode may comprise at least one agent for regenerating said NADPH cofactor by catalyzing its reduction at the surface of the biocathode, said regenerating agent allowing a electro-regeneration or photoregeneration, in this case being photosensitive.
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the regeneration agent can be an agent for electro-regeneration of the NADPH cofactor at the surface of the biocathode, said electro-regeneration agent being at least one redox polymer chosen in particular from benzylpropylviologene, a polysiloxane viologen polymer, polyaniline or polypyrrole.
  • the regeneration agent may be a photosensitive agent for regenerating the NADPH cofactor at the surface of the biocathode, said photosensitive agent being at least one photosensitive redox polymer in particular chosen from polymers of methylene green, of methylene blue, of neutral red. , polyaniline and polypyrrole.
  • the photosensitive agent can also be at least one non-polymeric photosensitive compound chosen in particular from chlorophyll, acridine, (pentamethylcyclopentadienyl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III) and proflavin.
  • Audit non-polymeric photosensitive compound can advantageously be associated with at least one electron donor chosen in particular from vitamin C, ferrocene, 8-hydroxyquinoline-5-sulfonic acid hydrate and a quinone, said electron donor being capable, once oxidized by said photosensitive compound, of reducing to the surface of the biocathode.
  • the photosensitive agent can also be at least one photosynthetic protein chosen in particular from ferrodoxin and ferrodoxin-NADP-reductase.
  • reagents and reaction products may or may be encapsulated in a protective envelope capable of passing reagents and reaction products, but not allowing (a), (b) or (c) to pass.
  • the aldose reductase and its cofactor may be enclosed in said or said redox polymers, which play the role of protective envelope, and may be placed under the form of a layer deposited on the conductive particles.
  • the protective shell can be chitosan, Nafion, polypyrrole, polyacrylic acid.
  • the invention also relates to a process for manufacturing a biocathode as defined above, characterized in that:
  • an encapsulation step which can then be carried out to encapsulate (a), (b) or (c).
  • step (B) in the case where the agent for regenerating the cofactor is a redox polymer, the latter can be deposited on the conductive particles by electropolymerization or electrodeposition or other electrochemical method such as cyclic voltammetry or chronoamperometry or chronopotentiometry, in the case where, with aldose reductase, its NADPH cofactor is associated, where appropriate with one or more proteins, the redox polymer can also be deposited by chemical polymerization processes, in the presence of 'an oxidizing element, such as iron chloride.
  • a subject of the present invention is also a biofuel cell comprising an anode or bioanode and a biocathode as defined above, or manufactured by the process as defined above.
  • the fuel can be selected from hydrogen and a biomass compound such as glucose, ethanol, glycerol, cholesterol, an aldehyde.
  • a biomass compound such as glucose, ethanol, glycerol, cholesterol, an aldehyde.
  • the anode can be a bioanode, using as a catalyst for the oxidation reaction at least one of enzymes, abiotic compounds, microbes and molecular catalysts.
  • the biofuel cell according to the invention can be implantable in a human or animal body, for example by the subcutaneous route or in the tissues to supply an electrical implantable medical device, and if necessary rechargeable externally with glucose, the monosaccharide, ketone or aldehyde through an external injection of a solution of glucose, monosaccharide, ketone or aldehyde.
  • It can in particular be implanted in the intestine in order to be used to consume glucose, ethanol, glycerol, cholesterol, a monosaccharide, a ketone, an aldehyde, or to quantify them, or to produce electrical power.
  • It can include a cathode using glucose as oxidant and an anode using glucose as reducing agent, without the use of oxygen.
  • the biofuel cell may include an anode based on a conductive material such as platinum, gold, graphite, to produce oxygen in vivo, this by connecting the biocathode and the anode to an electrical generator, such as a lithium battery or battery.
  • an electrical generator such as a lithium battery or battery.
  • the present invention finally relates to a glucose, monosaccharide, ketone or aldehyde biosensor comprising an anode consisting of a platinum wire and a biocathode as defined above or manufactured by a process as defined above, for in vivo (implantable biosensor) and in vitro applications, means for measuring the value of the reduction current of glucose, monosaccharide, ketone or aldehyde being provided for estimating the level of glucose, monosaccharide, ketone or aldehyde.
  • the glucose reduction current is measured at a low potential away from the interfering oxidation potential (potential less than 0V with respect to ECS) and, in this case, the biocathode response is insensitive to the presence of interfering compounds, such as ascorbic acid or dopamine.
  • Example 1 Manufacture of a biocathode with electro regeneration of the cofactor at the surface of the electrode
  • Carbon particle ink is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by weight of Tween80 and 5-10 mg / mL of carbon particles.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • the biocathode obtained is shown schematically in Figure 5.
  • Example 2 Manufacture of a biocathode with electro-regeneration of the cofactor using a redox mediator
  • Carbon particle ink (5-10 mg / mL) is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by weight of Tween80.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • a 2% by weight solution of chitosan containing aldose reductase (100 ⁇ M), its NADPH cofactor (1 mM) and a redox mediator pentamethylcyclopentadienyl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III) (25 ⁇ M) is deposited on the carbon sheet, and then allowed to dry for 6 hours.
  • the biocathode obtained is shown schematically in Figure 6.
  • Example 3 Manufacture of a biocathode with electro-regeneration of the cofactor using a redox polymer
  • Carbon particle ink (5-10 mg / mL) is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by weight of Tween80.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • a 2% by weight solution of chitosan containing aldose reductase (100 ⁇ M), its NADPH cofactor (1 mM) is deposited on the methylene green layer, and then allowed to dry for 6 hours.
  • the biocathode obtained is shown schematically in Figure 7.
  • Example 4 Manufacture of a biocathode with photoregeneration of the cofactor using a photosensitive molecule
  • a carbon particle ink is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by weight of Tween80.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • the biocathode obtained is shown schematically in Figure 8.
  • Example 5 Manufacture of a biocathode with photoregeneration of the cofactor using a photosensitive polymer
  • a carbon particle ink is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by weight of Tween80.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • the biocathode obtained is shown schematically in Figure 9.
  • Example 6 Manufacture of a 100% glucose biofuel cell
  • a carbon particle ink is prepared in an aqueous solution containing 0.5% by volume of Tween80.
  • This ink is deposited on a carbon sheet.
  • a 100% glucose biofuel cell is then manufactured using the bioanode produced above and a biocathode according to Example 3.
  • This biocathode oxidizes glucose to glucolactone at the bioanode using the enzyme glucose oxidase and its naphthoquinone mediates and reduces glucose to sorbitol at the biocathode.
  • the biopile obtained is shown schematically in Figure 10.
  • the current produced by the biopile passes through a resistance R.
  • Example 7 Manufacture of a 100% glucose biofuel cell
  • a 100% glucose biofuel cell is manufactured using the bioanode produced in Example 6 and a biocathode according to Example 2.
  • This biocathode oxidizes glucose to gluconic acid at the bioanode using the enzyme glucose oxidase. and its mediator naphthoquinone and reduces glucose to sorbitol at the biocathode.
  • the biopile obtained is shown schematically in Figure 11.
  • the current produced by the biopile passes through a voltmeter V.
  • Figures 12 and 13 show schematically the reactions occurring, respectively, at the anode and the biocathode.
  • glucose is oxidized to gluconic acid by the action of glucose oxidase (GOx).
  • the glucose oxidase mediator in the example shown naphthoquinone (naphtho), is oxidized at the surface of the anode from its reduced form Naphto re to its oxidized form Naphto ox .
  • glucose is reduced to sorbitol by the action of aldose reductase and its cofactor NADPH.
  • the NADPH cofactor is regenerated from its NADP form to its NADPH form using the redox mediator pentamethylcyclopentadienyl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III), noted RhMed, in Figure 13, RhMedred representing the reducing agent and RhMedox l ' oxidant of the oxidation-reduction couple.
  • the redox mediator is reduced at the cathode surface from its RhMedox form to its RhMedred form.
  • the curve in Figure 14 indicates the characteristics of the biofuel obtained.
  • the voltage of the open circuit biocell is 120 mV and it is capable of producing a power density of 3 ⁇ W / cm 2 for a glucose concentration of 20 mM.
  • Example 8 Manufacture of a glucose biosensor
  • a glucose biosensor is fabricated using a biocathode according to Example 3 and a conventional counter electrode such as a gold or platinum counter electrode.
  • the biosensor obtained is shown schematically in Figure 15.
  • the current produced by the biopile passes through a voltmeter V.

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Abstract

L'invention porte sur une biocathode enzymatique à biomasse à base de glucose, de monosaccharide, de cétone ou d'aldéhyde caractérisée par le fait qu'elle comporte : - un support conducteur collecteur; - disposées sur ledit support conducteur collecteur et étant liées avec lui, des particules conductrices; - une aldose réductase disposée sur lesdites particules conductrices, étant liée avec elles par adsorption et étant accessible en surface au réactif glucose, monosaccharide, cétone ou aldéhyde destiné à être réduit lors du fonctionnement de la biocathode.

Description

BIOCATHODE ENZYMATIQUE, SON PROGEDE DE FABRICATION AINSI QUE BIOPILE A COMBUSTIBLE ET BIOCAPTEUR COMPORTANT CETTE BIOCATHODE ENZYMATIQUE
La présente invention concerne une biocathode enzymatique, son procédé de fabrication ainsi qu’une biopile à combustible la comportant pour son application à la conversion d’énergie et un biocapteur la comportant pour son application à la détection.
Une pile à combustible est une pile électrique qui, contrairement aux piles de stockage, peut être alimentée en un combustible de manière continue de telle sorte que la sortie de puissance électrique est entretenue indéfiniment (CONNIHAN M.A., (1981) Dictionary of Energy, Routledge and Kegan Paul). Elles convertissent l’énergie chimique de combustible en énergie électrique par les réactions électrochimiques de combustible et d’un oxydant. Une pile à combustible est constituée par deux électrodes - une anode émettrice d’électrons et une cathode réceptrice d’électrons - , séparées par un électrolyte permettant le passage des ions. A l’anode et à la cathode respectivement, se réalisent une oxydation du combustible (anode) et une réduction de l’oxydant (cathode). Les réactions d’oxydation et de réduction aux électrodes nécessitent l’utilisation de catalyseurs métalliques ou moléculaires.
Une pile à biocombustible enzymatique (Enzymatic Biofuel Cell - EBFC) est une sous-classe des piles à combustible, reposant sur des enzymes redox purifiées pour effectuer des réactions électrocatalytiques (voir Figure 1 du dessin annexé). Lorsque l’on prend en considération la sortie de puissance, les EBFC ne peuvent pas rivaliser avec les piles à combustible classiques qui sont capables de délivrer des densités de puissance allant jusqu’au W/cm2 1000 fois supérieures aux puissances délivrées par les biopiles enzymatiques. Cependant, par comparaison avec les catalyseurs métalliques, l’attractivité des enzymes repose sur leur spécificité élevée envers leurs substrats respectifs et leur capacité à obtenir des rendements catalytiques élevés dans des conditions douces (20-40 °C dans une plage de pH raisonnable de 5-8 ou même à un pH neutre). Par conséquent, de tels générateurs électrochimiques sont envisagés pour fonctionner dans des milieux complexes tels que des fluides physiologiques ou des végétaux.
Dans le cas de piles à combustible enzymatiques, le combustible le plus largement étudié est le glucose, mais d’autres combustibles importants tels que l’éthanol, le lactate ou le glycérol sont également de nouveaux combustibles pour collecter de l’énergie à partir de la biomasse.
L’oxydant est souvent le dioxygène ou le peroxyde d’hydrogène, car ces deux substrats ont un potentiel de réduction plus élevé. En effet, la tension d’une pile à combustible est la différence entre le potentiel de réduction de l’oxydant et le potentiel d’oxydation du combustible. Ainsi, pour fonctionner, une pile à combustible doit utiliser un oxydant ayant un potentiel de réduction supérieur au potentiel d’oxydation du combustible. Pour cette raison, le nombre d’oxydants utilisés est très limité, car peu de substrats ont un potentiel de réduction élevé. De plus, dans le cas de biocombustible implantable, le seul oxydant disponible dans un corps vivant est l’oxygène. En outre, le dioxygène disponible est limité par sa faible concentration en raison de sa faible solubilité dans l’eau : 0,2 mM et seulement 0,05 mM dans un corps vivant (Challenges for successful implantation of biofuel cells, A. Zebda, J-P Alcaraz, P. Vadgama, S. Shleev, P. Cinquin, D.K. Martin, Bioelectrochemistry, pages 57-72 (2018).
La faible concentration en dioxygène amène souvent la biocathode à être l’électrode limitante dans les biopiles.
Les piles à biocombustible implantables, et même non implantables, présentent donc une performance limitée par le faible taux de concentration en dioxygène dans un fluide physiologique (0,05 mM) ou dans l’eau (0,2 mM). En effet, la concentration en dioxygène est 100 fois plus faible que le taux de glucose dans le corps (5 mM), ce qui présente un problème majeur car cette faible concentration en dioxygène limite la performance en termes de puissance électrique délivrée. Shleev et al (S. Shleev, Quo Vadis, Implanted Fuel Cell ChemPlusChem 2017, 82, 522-539) ont démontré que, dans le cas de piles à biocombustible glucose implantables, la faible concentration en dioxygène limite la densité de courant délivrée par la pile à biocombustible glucose à 40 µA/cm². Ainsi, l’augmentation de la performance de la pile à biocombustible glucose implantable nécessite l’utilisation d’une cathode ayant une aire de surface élevée. Par exemple, pour alimenter un dispositif médical consommant 1 mW, une pile à biocombustible glucose fonctionnant à 300 mV doit avoir une biocathode ayant une aire de surface d’environ 400 cm², ce qui est, d’un point de vue médical, une sérieuse contrainte envers l’espace disponible dans le corps pour l’implantation de la pile à biocombustible glucose. Pour cette raison, il est connu, dans le cas de biocombustible glucose implantable, que la faible concentration en oxygène liée à sa faible solubilité dans l’eau (0,2 mM) amène la biocathode à être l’électrode limitante dans la pile à biocombustible.
Les biocapteurs de glucose existants sont basés sur la mesure de courant d’oxydation de glucose souvent à un potentiel positif. Ces biocapteurs de glucose souffrent du courant d’oxydation de molécules interférentes présentes dans un fluide physiologique, ce qui diminue la sensibilité des biocapteurs (voir Figure 3 du dessin annexé).
La présente invention a pour but de résoudre les inconvénients qui viennent d’être exposés pour les biopiles et les biocapteurs et propose à cet effet une nouvelle architecture de biocathode enzymatique capable d’utiliser le glucose ou un aldéhyde comme oxydant (voir Figure 2) avec une catalyse de réduction du glucose à une tension relativement élevée.
Ainsi, la biocathode enzymatique selon l’invention est capable de convertir l’énergie chimique du glucose ou d’un aldéhyde en énergie électrique par l’intermédiaire d’une réduction enzymatique de glucose ou de l’aldéhyde. En effet, cette biocathode utilise le glucose ou un aldéhyde comme oxydant, ce qui permet la construction d’une pile à biocombustible glucose implantable fonctionnant à 100 % avec le glucose sans besoin de dioxygène.
L’utilisation de glucose comme oxydant dans un biocombustible glucose implantable permet d’augmenter considérablement les performances de la pile à biocombustible. De plus, la pile à biocombustible glucose implantable peut être utilisée comme source d’énergie pour produire du dioxygène in-vivo.
La biocathode selon l’invention peut également être utilisée pour concevoir une pile à biocombustible fonctionnant dans des conditions anaérobies (par exemple : sous l’eau, mines, conditions spéciales). Dans ce cas, la pile à combustible utilisera le glucose ou autre composé de biomasse comme oxydant à la biocathode et aussi comme réducteur à la bioanode.
De plus, la biocathode selon l’invention offre la possibilité de mesurer un taux de glucose à un potentiel très faible par la mesure d’un courant de réduction de glucose, ce qui empêche l’interférence d’oxydation liée à des molécules interférentes. La biocathode fonctionne dans un mode de réduction à un potentiel éloigné du potentiel d’oxydation de molécules interférentes présentes dans un fluide physiologique ce qui permet d’augmenter la sensibilité et la durée de vie du biocapteur (voir Figure 4).
La présente invention a donc d’abord pour objet une biocathode enzymatique à biomasse à base de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde caractérisée par le fait qu’elle comporte :
  • un support conducteur collecteur ;
  • disposées sur ledit support conducteur collecteur et étant liées avec lui, des particules conductrices ;
  • une aldose réductase disposée sur lesdites particules conductrices, étant liée avec elles par adsorption et étant accessible en surface au réactif monosaccharide, cétone ou aldéhyde destiné à être réduit lors du fonctionnement de la biocathode.
Le support conducteur collecteur peut avantageusement être choisi parmi :
  • les feuilles continues de carbone, de graphène ou de graphite ;
  • les feuilles continues d’un métal, tel que l’or ;
  • les feuilles continues d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) ; et
  • les tissus non tissés de fibres de carbone.
Les particules conductrices peuvent avantageusement être choisies parmi les particules de nanotubes de carbone, de graphène, de graphite, de noir de carbone ou de carbone mésoporeux, en particulier de nanotubes de carbone multiparois (MWCNT – Multiwalled carbon nanotubes).
A l’aldose réductase est avantageusement associé son cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), auquel cas la biocathode peut comporter au moins un agent de régénération dudit cofacteur NADPH en catalysant sa réduction à la surface de la biocathode, ledit agent de régénération permettant une électrorégénération ou une photorégénération, étant dans ce cas photosensible.
L’agent de régénération peut être un agent d’électrorégénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent d’électrorégénération étant au moins un polymère redox notamment choisi parmi le benzylpropylviologène, un polymère polysiloxane viologène, la polyaniline ou le polypyrrole.
L’agent de régénération peut être un agent photosensible de régénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent photosensible étant au moins un polymère photosensible redox notamment choisi parmi les polymères de vert de méthylène, de bleu de méthylène, de rouge neutre, la polyaniline et le polypyrrole.
L’agent photosensible peut également être au moins un composé photosensible non polymère choisi notamment parmi la chlorophylle, l’acridine, le (pentaméthylcyclopentadiényl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III) et la proflavine.
Audit composé photosensible non polymère peut avantageusement être associé au moins un donneur d’électrons choisi notamment parmi la vitamine C, le ferrocène, l’hydrate de l’acide 8-hydroxyquinoléine-5-sulfonique et une quinone, ledit donneur d’électrons étant capable, une fois oxydé par ledit composé photosensible, de se réduire à la surface de la biocathode.
L’agent photosensible peut également être au moins une protéine de photosynthèse choisie notamment parmi la ferrodoxine et la ferrodoxine-NADP-réductase.
Dans un mode de réalisation particulier :
  1. l’aldose réductase ; ou
  2. l’aldose réductase et son cofacteur NADPH ; ou
  3. l’aldose réductase et son cofacteur NADPH et au moins un agent de régénération dudit cofacteur, et le cas échéant au moins un donneur d’électrons dans le cas où l’agent de régénération est un agent photosensible de régénération et est un composé photosensible non polymère,
peut ou peuvent être encapsulés dans une enveloppe protectrice capable de laisser passer les réactifs et produits de réaction, mais ne laissant pas passer (a), (b) ou (c).
Dans le cas où le ou les agents de régénération est ou sont au moins un polymère redox, l’aldose réductase et son cofacteur peuvent être renfermés dans ledit ou lesdits polymères redox, lesquels jouent le rôle d’enveloppe protectrice, et peuvent être disposés sous la forme d’une couche déposée sur les particules conductrices.
L’enveloppe protectrice peuvent être en chitosane, Nafion, polypyrrole, acide polyacrylique.
L’invention porte également sur un procédé de fabrication d’une biocathode telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait que :
  1. sur un support conducteur collecteur, on fixe des particules conductrices par pulvérisation ou impression d’une encre ou d’une pâte à base de ces particules dispersées dans de l’eau et un tensio-actif ou un polymère ou un gel, puis séchage de ladite encre ou de ladite pâte ; et ensuite
  2. on dépose sur lesdites particules conductrices :
  1. une aldose réductase, ou
  2. une aldose réductase et son cofacteur NADPH, ou
  3. une aldose réductase, son cofacteur NADPH et un agent de régénération du cofacteur,
au moins l’un parmi (a), (b) et (c) pouvant être déposés à l’état encapsulé dans une enveloppe apte à laisser passer les réactifs et produits de réaction mais ne laissant pas passer respectivement (a), (b) ou (c), ou
une étape d’encapsulation pouvant être ensuite effectuée pour encapsuler (a), (b) ou (c).
A l’étape (B), dans le cas où l’agent de régénération du cofacteur est un polymère redox, on peut déposer ce dernier sur les particules conductrices par électropolymérisation ou électrodéposition ou autre méthode électrochimique telle que la voltamétrie cyclique ou chronoampérométrie ou chronopotentiométrie, dans le cas où, à l’aldose réductase, est associé son cofacteur NADPH, le cas échéant avec une ou des protéines, le polymère redox pouvant aussi être déposé par des procédés de polymérisation chimique, en présence d’un élément oxydant, comme le chlorure de fer.
La présente invention a aussi pour objet une biopile à combustible comportant une anode ou bioanode et une biocathode telle que définie ci-dessus, ou fabriquée par le procédé tel que défini ci-dessus.
Le combustible peut être choisi parmi l’hydrogène et un composé de biomasse tel que le glucose, l’éthanol, le glycérol, le cholestérol, un aldéhyde.
L’anode peut être une bioanode, utilisant, comme catalyseur de la réaction d’oxydation, au moins l’un parmi les enzymes, les composés abiotiques, les microbes et les catalyseurs moléculaires.
La biopile à combustible selon l’invention peut être implantable dans un corps humain ou animal, par exemple par voie sous-cutanée ou dans les tissus pour alimenter un dispositif médical implantable électrique, et le cas échéant rechargeable de manière externe avec le glucose, le monosaccharide, la cétone ou l’aldéhyde par l’intermédiaire d’une injection externe d’une solution de glucose, de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde.
Elle peut notamment être implantable dans l’intestin afin d’être utilisée pour consommer le glucose, l’éthanol, le glycérol, le cholestérol, un monosaccharide, une cétone, un aldéhyde, ou les quantifier, ou pour produire de la puissance électrique.
Elle peut comporter une cathode utilisant le glucose comme oxydant et une anode utilisant le glucose comme réducteur, sans utilisation de dioxygène.
La biopile peut comporter une anode à base d’un matériau conducteur tel que le platine, l’or, le graphite, pour produire du dioxygène in vivo, ceci en connectant la biocathode et l’anode à un générateur électrique, tel qu’une batterie ou une pile de lithium.
Elle peut être apte à fonctionner dans des conditions anaérobies, mines, mer, espace.
La présente invention porte enfin sur un biocapteur de glucose, de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde comportant une anode constituée par un fil de platine et une biocathode telle que définie ci-dessus ou fabriquée par un procédé tel que défini ci-dessus, pour des applications in vivo (biocapteur implantable) et in vitro, des moyens de mesure de la valeur du courant de réduction du glucose, du monosaccharide, de la cétone ou de l’aldéhyde étant prévus pour l’estimation du taux de glucose, du monosaccharide, de la cétone ou de l’aldéhyde.
Le courant de réduction de glucose est mesuré à un faible potentiel éloigné du potentiel d’oxydation interférant (potentiel inférieur à 0V par rapport à ECS) et, dans ce cas, la réponse de biocathode est insensible à la présence de composés interférents, tels que l’acide ascorbique ou la dopamine.
Pour mieux illustrer l’objet de la présente invention, on va en décrire ci-après, à titre indicatif et non limitatif, plusieurs modes de réalisation avec référence au dessin annexé.
Sur ce dessin :
  • [Fig. 1] est une représentation schématique du fonctionnement d’une pile à biocombustible enzymatique ;
  • [Fig. 2] est une représentation schématique du fonctionnement d’une biopile avec une biocathode selon l’invention ;
  • [Fig. 3] est une représentation schématique de l’oxydation de molécules interférentes pour des biocapteurs de glucose existants ;
  • [Fig. 4] est une représentation schématique de la réduction de biocapteur de glucose avec une biocathode selon l’invention sans réduction de molécules interférentes ;
  • [Fig. 5] est une représentation schématique d’une biocathode selon un premier mode de réalisation avec électro-régénération du cofacteur enzymatique ;
  • [Fig. 6] est une représentation schématique d’une biocathode selon un autre mode de réalisation avec électro-régénération du cofacteur enzymatique ;
  • [Fig. 7] est une représentation schématique d’une biocathode selon un autre mode de réalisation avec électro-régénération du cofacteur enzymatique ;
  • [Fig. 8] est une représentation schématique d’une biocathode selon un autre mode de réalisation avec photo-régénération du cofacteur enzymatique ;
  • [Fig. 9] est une représentation schématique d’une biocathode selon un autre mode de réalisation avec photo-régénération du cofacteur enzymatique ;
  • [Fig. 10] est une représentation schématique d’une biopile à glucose avec une biocathode selon une première variante ;
  • [Fig. 11] est une représentation schématique d’une biopile à glucose avec une biocathode selon une seconde variante ;
  • [Fig. 12] est une représentation schématique des réactions se déroulant à l’anode lors du fonctionnement de la biopile représentée à la Figure 11 ;
  • [Fig. 13] est une représentation schématique des réactions se déroulant à la biocathode lors du fonctionnement de la biopile représentée à la Figure 11 ;
  • [Fig. 14] est une courbe de puissance en fonction de la tension pour la biopile représentée à la Figure 11 à une concentration de glucose de 20 mM dans un tampon phosphate à pH 7 ;
  • [Fig. 15] est une représentation schématique d’un biocapteur de glucose avec une biocathode selon la présente invention ; et
  • [Fig. 16] est une courbe d’intensité de courant mesurée avec le biocapteur de la Figure 15 en fonction de la concentration en glucose.
Dans les figures, la légende ci-dessous est utilisée :
Figure pctxmlib-appb-I000001
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple 1 : Fabrication d’une biocathode avec électro régénération du cofacteur à la surface de l’électrode
Une encre de particules de carbone est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en poids de Tween80 et 5 à 10 mg/mL de particules de carbone.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Après séchage sous vide pendant deux heures, une couche de poly(bleu de méthylène) est déposée sur la couche de carbone par électropolymérisation.
Après rinçage à l’eau, on dépose une solution à 1 % en poids de Nafion contenant l’aldose réductase (100 µM), son cofacteur NADPH (1 mM), et on laisse sécher à température ambiante pendant une heure.
La biocathode obtenue est représentée schématiquement à la Figure 5.
Exemple 2 : Fabrication d’une biocathode avec électro régénération du cofacteur à l’aide d’un médiateur redox
Une encre de particules de carbone (de 5 à 10 mg/mL) est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en poids de Tween80.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Une solution à 2 % en poids de chitosane contenant l’aldose réductase (100 µM), son cofacteur NADPH (1 mM) et un médiateur redox pentaméthylcyclopentadiényl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III)(25 µM) est déposée sur la feuille de carbone, et on laisse ensuite sécher pendant 6 heures.
La biocathode obtenue est représentée schématiquement à la Figure 6.
Exemple 3 : Fabrication d’une biocathode avec électro-régénération du cofacteur à l’aide d’un polymère redox
Une encre de particules de carbone (de 5 à 10 mg/mL)est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en poids de Tween80.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Après séchage sous vide pendant deux heures, une couche de vert de méthylène est électrodéposée sur la couche de carbone par voltamétrie cyclique.
Une solution à 2 % en poids de chitosane contenant de l’aldose réductase (100 µM), son cofacteur NADPH (1 mM) est déposée sur la couche de vert de méthylène, et on laisse ensuite sécher pendant 6 heures.
La biocathode obtenue est représentée schématiquement à la Figure 7.
Exemple 4 : Fabrication d’une biocathode avec photorégénération du cofacteur à l’aide de molécule photosensible
Une encre de particules de carbone est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en poids de Tween80.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Après séchage sous vide pendant deux heures, on dépose une solution à 1 % en volume de Nafion contenant l’aldose réductase (100 µM), son cofacteur NADPH (1 mM), la protéine ferrodoxine-NADP (100 µM), la chlorophylle (100 µM) et la vitamine C.
La biocathode obtenue est représentée schématiquement à la Figure 8.
Exemple 5 : Fabrication d’une biocathode avec photorégénération du cofacteur à l’aide d’un polymère photosensible
Une encre de particules de carbone est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en poids de Tween80.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Après séchage sous vide pendant deux heures, on dépose sur cette feuille de carbone une solution à 1 % en volume de Nafion contenant de l’aldose réductase (100 µM), son cofacteur NADPH (1 mM), et on laisse ensuite sécher pendant une heure.
La biocathode obtenue est représentée schématiquement à la Figure 9.
Exemple 6 : Fabrication d’une biopile à 100 % glucose
Fabrication d’une bioanode
Une encre de particules de carbone est préparée dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en volume de Tween80.
Cette encre est déposée sur une feuille de carbone.
Après séchage sous vide pendant deux heures, on dépose une solution à 2 % en poids de chitosane contenant de la glucose oxydase (100 µM), son médiateur naphtoquinone (… mM), et on laisse tout sécher à l’air à la température ambiante pendant six heures.
Fabrication de la biopile
Une biopile à 100 % glucose est ensuite fabriquée à l’aide de la bioanode fabriquée ci-dessus et d’une biocathode selon l’Exemple 3. Cette biopile oxyde le glucose en glucolactone à la bioanode grâce à l’enzyme glucose oxydase et son médiateur naphtoquinone et réduit le glucose en sorbitol à la biocathode.
La biopile obtenue est représentée schématiquement à la Figure 10. Sur le schéma représenté, le courant produit par la biopile passe par une résistance R.
Exemple 7 : Fabrication d’une biopile à 100 % glucose
Fabrication de la biopile
Une biopile à 100 % glucose est fabriquée à l’aide de la bioanode fabriquée à l’Exemple 6 et d’une biocathode selon l’Exemple 2. Cette biopile oxyde le glucose en acide gluconique à la bioanode grâce à l’enzyme glucose oxydase et son médiateur naphtoquinone et réduit le glucose en sorbitol à la biocathode.
La biopile obtenue est représentée schématiquement à la Figure 11. Sur le schéma représenté, le courant produit par la biopile passe par un voltmètre V.
Les Figures 12 et 13 représentent schématiquement les réactions se produisant, respectivement, à l’anode et à la biocathode.
A l’anode, le glucose est oxydé en acide gluconique par l’action de la glucose oxydase (GOx).
Le médiateur de la glucose oxydase, dans l’exemple représenté la naphtoquinone (Naphto), est oxydé à la surface de l’anode de sa forme réduite Naphtore en sa forme oxydée Naphtoox.
En procédant ainsi, le transfert d’électrons du glucose vers la bioanode peut se faire.
A la biocathode, le glucose est réduit en sorbitol par l’action de l’aldose réductase et de son cofacteur NADPH.
Le cofacteur NADPH est régénéré de sa forme NADP en sa forme NADPH à l’aide du médiateur redox pentaméthylcyclopentadiényl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III), noté RhMed, sur la Figure 13, RhMedred représentant le réducteur et RhMedox l’oxydant du couple d’oxydo-réduction.
Le médiateur redox est réduit à la surface de la cathode de sa forme RhMedox en sa forme RhMedred.
En procédant de cette manière, les électrons sont transférés de la biocathode vers le glucose afin que celui-ci puisse être réduit en sorbitol.
La courbe de la Figure 14 indique les caractéristiques de la biopile obtenue. Le voltage de la biopile à circuit ouvert est de 120 mV et elle est capable de produire une densité de puissance de 3 µW/cm2 pour une concentration de glucose de 20 mM.
Exemple 8 : Fabrication d’un biocapteur à glucose
Un biocapteur à glucose est fabriqué à l’aide d’une biocathode selon l’Exemple 3 et d’une contre-électrode classique comme une contre-électrode en or ou en platine.
Le biocapteur obtenu est représenté schématiquement à la Figure 15. Sur le schéma représenté, le courant produit par la biopile passe par un voltmètre V.
A partir de ce biocapteur, on peut obtenir une courbe d’étalonnage à tension nulle de l’intensité mesurée à l’aide du biocapteur en fonction de la concentration en glucose. Cette courbe est représentée à la Figure 16.

Claims (23)

  1. – Biocathode enzymatique à biomasse à base de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde caractérisée par le fait qu’elle comporte :
    • un support conducteur collecteur ;
    • disposées sur ledit support conducteur collecteur et étant liées avec lui, des particules conductrices ;
    • une aldose réductase disposée sur lesdites particules conductrices, étant liée avec elles par adsorption et étant accessible en surface au réactif monosaccharide, cétone ou aldéhyde destiné à être réduit lors du fonctionnement de la biocathode.
  2. – Biocathode enzymatique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le support conducteur collecteur est choisi parmi :
    • les feuilles continues de carbone, de graphène ou de graphite ;
    • les feuilles continues d’un métal, tel que l’or ;
    • les feuilles continues d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) ; et
    • les tissus non tissés de fibres de carbone.
  3. – Biocathode enzymatique selon l’une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que les particules conductrices sont choisies parmi les particules de nanotubes de carbone, de graphène, de graphite, de noir de carbone ou de carbone mésoporeux, en particulier de nanotubes de carbone multiparois (MWCNT – Multiwalled carbon nanotubes).
  4. – Biocathode enzymatique selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait qu’à l’aldose réductase est associé son cofacteur nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), auquel cas la biocathode peut comporter au moins un agent de régénération dudit cofacteur NADPH en catalysant sa réduction à la surface de la biocathode, ledit agent de régénération permettant une électrorégénération ou une photorégénération, étant dans ce cas photosensible.
  5. - Biocathode enzymatique selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l’agent de régénération est un agent d’électrorégénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent d’électrorégénération étant au moins un polymère redox notamment choisi parmi le benzylpropylviologène, un polymère polysiloxane viologène, la polyaniline ou le polypyrrole.
  6. – Biocathode enzymatique selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l’agent de régénération est un agent photosensible de régénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent photosensible étant au moins un polymère photosensible redox notamment choisi parmi les polymères de vert de méthylène, de bleu de méthylène, de rouge neutre, la polyaniline et le polypyrrole.
  7. - Biocathode enzymatique selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l’agent de régénération est un agent photosensible de régénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent photosensible étant au moins un composé photosensible non polymère choisi notamment parmi la chlorophylle, l’acridine, le (pentaméthylcyclopentadiényl-2,2V-bipyridine aqua) rhodium (III) et la proflavine.
  8. - Biocathode enzymatique selon la revendication 7, caractérisée par le fait qu’audit composé photosensible non polymère est associé au moins un donneur d’électrons choisi notamment parmi la vitamine C, le ferrocène, l’hydrate de l’acide 8-hydroxyquinoléine-5-sulfonique et une quinone, ledit donneur d’électrons étant capable, une fois oxydé par ledit composé photosensible, de se réduire à la surface de la biocathode.
  9. - Biocathode enzymatique selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l’agent de régénération est un agent photosensible de régénération du cofacteur NADPH à la surface de la biocathode, ledit agent photosensible étant au moins une protéine de photosynthèse choisie notamment parmi la ferrodoxine et la ferrodoxine-NADP-réductase.
  10. – Biocathode enzymatique selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisée par le fait que :
    1. l’aldose réductase ; ou
    2. l’aldose réductase et son cofacteur NADPH ; ou
    3. l’aldose réductase et son cofacteur NADPH et au moins un agent de régénération dudit cofacteur, et le cas échéant au moins un donneur d’électrons dans le cas où l’agent de régénération est un agent photosensible de régénération et est un composé photosensible non polymère,
    est ou sont encapsulés dans une enveloppe protectrice capable de laisser passer les réactifs et produits de réaction, mais ne laissant pas passer (a), (b) ou (c).
  11. - Biocathode enzymatique selon la revendication 10, caractérisée par le fait que le ou les agents de régénération est ou sont au moins un polymère redox, l’aldose réductase et son cofacteur étant renfermés dans ledit ou lesdits polymères redox, lesquels jouent le rôle d’enveloppe protectrice, et peuvent être disposés sous la forme d’une couche déposée sur les particules conductrices.
  12. - Biocathode enzymatique selon la revendication 11, caractérisée par le fait que l’enveloppe protectrice est en chitosane, Nafion, polypyrrole, acide polyacrylique.
  13. – Procédé de fabrication d’une biocathode telle que définie à l’une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que :
    1. sur un support conducteur collecteur, on fixe des particules conductrices par pulvérisation ou impression d’une encre ou d’une pâte à base de ces particules dispersées dans de l’eau et un tensio-actif ou un polymère ou un gel, puis séchage de ladite encre ou de ladite pâte ; et ensuite
    2. on dépose sur lesdites particules conductrices :
    1. une aldose réductase, ou
    2. une aldose réductase et son cofacteur NADPH, ou
    3. une aldose réductase, son cofacteur NADPH et un agent de régénération du cofacteur,
    au moins l’un parmi (a), (b) et (c) pouvant être déposés à l’état encapsulé dans une enveloppe apte à laisser passer les réactifs et produits de réaction mais ne laissant pas passer respectivement (a), (b) ou (c), ou
    une étape d’encapsulation pouvant être ensuite effectuée pour encapsuler (a), (b) ou (c).
  14. – Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu’à l’étape (B), dans le cas où l’agent de régénération du cofacteur est un polymère redox, on dépose ce dernier sur les particules conductrices par électropolymérisation ou électrodéposition ou autre méthode électrochimique telle que la voltamétrie cyclique ou chronoampérométrie ou chronopotentiométrie, dans le cas où, à l’aldose réductase, est associé son cofacteur NADPH, le cas échéant avec une ou des protéines, le polymère redox pouvant aussi être déposé par des procédés de polymérisation chimique, en présence d’un élément oxydant, comme le chlorure de fer.
  15. – Biopile à combustible comportant une anode ou bioanode et une biocathode telle que définie à l’une des revendications 1 à 12, ou fabriquée par le procédé tel que défini à l’une des revendications 13 et 14.
  16. – Biopile selon la revendication 15, caractérisée par le fait que le combustible est choisi parmi l’hydrogène et un composé de biomasse tel que le glucose, l’éthanol, le glycérol, le cholestérol, un aldéhyde.
  17. - Biopile selon l’une des revendications 15 et 16, caractérisée par le fait que l’anode est une bioanode, utilisant, comme catalyseur de la réaction d’oxydation, au moins l’un parmi les enzymes, les composés abiotiques, les microbes et les catalyseurs moléculaires.
  18. – Biopile selon la revendication 17, caractérisée par le fait qu’elle est implantable dans un corps humain ou animal, par exemple par voie sous-cutanée ou dans les tissus pour alimenter un dispositif médical implantable électrique, et le cas échéant rechargeable de manière externe avec le glucose, le monosaccharide, la cétone ou l’aldéhyde par l’intermédiaire d’une injection externe d’une solution de glucose, de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde.
  19. – Biopile selon la revendication 18, caractérisée par le fait qu’elle est implantable dans l’intestin afin d’être utilisée pour consommer le glucose, l’éthanol, le glycérol, le cholestérol, un monosaccharide, une cétone, un aldéhyde, ou les quantifier, ou pour produire de la puissance électrique.
  20. - Biopile selon l’une des revendications 15 à 19, caractérisée par le fait qu’elle comporte une cathode utilisant le glucose comme oxydant et une anode utilisant le glucose comme réducteur, sans utilisation de dioxygène.
  21. - Biopile selon la revendication 18, caractérisée par le fait qu’elle comporte une anode à base d’un matériau conducteur tel que le platine, l’or, le graphite, pour produire du dioxygène in vivo, ceci en connectant la biocathode et l’anode à un générateur électrique, tel qu’une batterie ou une pile de lithium.
  22. - Biopile selon l’une des revendications 15 à 17, caractérisée par le fait qu’elle est apte à fonctionner dans des conditions anaérobies, mines, mer, espace.
  23. – Biocapteur de glucose, de monosaccharide, de cétone ou d’aldéhyde comportant une anode constituée par un fil de platine et une biocathode telle que définie à l’une des revendications 1 à 12 ou fabriquée par un procédé tel que défini à l’une des revendications 13 et 14, pour des applications in vivo (biocapteur implantable) et in vitro, des moyens de mesure de la valeur du courant de réduction du glucose, du monosaccharide, de la cétone ou de l’aldéhyde étant prévus pour l’estimation du taux de glucose, du monosaccharide, de la cétone ou de l’aldéhyde.
PCT/IB2020/057059 2019-08-01 2020-07-27 Biocathode enzymatique, son procede de fabrication ainsi que biopile a combustible et biocapteur comportant cette biocathode enzymatique WO2021019418A1 (fr)

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S. SHLEEVQUO VADIS, IMPLANTED FUEL CELL CHEMPLUSCHEM, vol. 82, 2017, pages 522 - 539

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