WO2021018799A1 - Verfahren zur klassifizierung des risikos für die entwicklung einer hpv-persistenz - Google Patents

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WO2021018799A1
WO2021018799A1 PCT/EP2020/071046 EP2020071046W WO2021018799A1 WO 2021018799 A1 WO2021018799 A1 WO 2021018799A1 EP 2020071046 W EP2020071046 W EP 2020071046W WO 2021018799 A1 WO2021018799 A1 WO 2021018799A1
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biomarkers
living
risk
classification
genus
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PCT/EP2020/071046
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Matthias Willmann
Thomas Iftner
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Definitions

  • the present invention relates to a method ex vivo for classifying the risk of a living being with an infection of the cervix uteri with human papilloma viruses (HPV infection) and inconspicuous cytological findings for the development of a persistent HPV infection. It also relates to the use of at least two biomarkers to classify the risk of a living being with an HPV infection and inconspicuous histological findings for the development of a persistent HPV infection. Finally, the invention relates to a device for classifying the risk of a living being with an HPV infection and inconspicuous cytological findings for the development of a persistent HPV infection and possibly a cervical intraepithelial neoplasia (CIN).
  • CIN cervical intraepithelial neoplasia
  • the cervical carcinoma also called collum carcinoma or cervical cancer
  • cervical cancer is a malignant tumor of the cervix (cervix uteri). It is the fourth most common malignant tumor in women worldwide. Histologically, the majority of the cases are squamous cell carcinoma. The most common cause of cervical cancer is infection with high-risk types of the human papillomavirus (HR-HPV).
  • HR-HPV human papillomavirus
  • cervical cancer early care examinations are offered. In Germany, according to a new guideline of the Federal Joint Committee, this examination will in future include a FIPV test and a cytological examination of the cervical mucosa from 2020. Women who are FIPV-positive for HR-HPV and have cytological abnormalities will be further clarified. Women who are HPV-negative and cytologically normal will be called back for the next screening examination in 3 years.
  • the invention is therefore based on the object of providing a solution with which the disadvantages of the prior art can be avoided or at least reduced.
  • a method is to be provided with which the risk of developing a persistent HPV infection can be determined in a living being with an HPV infection and inconspicuous cytological findings via a one-off test.
  • This object is achieved by an ex vivo method for classifying the risk of a living being with an HPV infection of the cervix uteri and normal cytological findings for the development of a persistent HPV infection, which has the following steps:
  • Microbiome sample to obtain a frequency pattern
  • biomarkers are selected from Catenulispora (genus), Oleiphilus (genus), Chlamydiae (phylum), microorganisms with the metabolic pathway UDPNAGSYN-PWY, microorganisms with the metabolic pathway PWY-621, and Aureobasidium (Genus).
  • the inventors have recognized that the mucosal microbiome of the cervix uteri significantly influences the risk of HR-HPV persistence both through metabolic and immunological influences and that certain factors involved are suitable predictors for predicting HR-HPV disease. Persistence risks are.
  • Catenulispora refers to the genus (genus) of the suborder of
  • Catenulisporineae belonging to Actinomycetales are gram-positive bacteria that can be found in living organisms but also in soil or decomposing organic material. According to the invention, all bacteria belonging to the genus Catenulispora are suitable as biomarkers.
  • Oleiphilus denotes the genus (genus) of the so far little described family of Oleiphilaceae bacteria. According to the invention, all microbiome bacteria are suitable as biomarkers which belong to the genus Oleiphilus.
  • Chlamydiae denotes gram-negative bacteria of the strain (phylum), the members of which are characterized by an extraordinary diversity and which include both pathogens and symbionts. According to the invention, all microbiome bacteria are suitable as biomarkers which belong to the strain Chlamydiae.
  • Microorganisms with the metabolic pathway UDPNAGSYN-PWY which is also referred to as UDP-N-acetyl-D-glucosamine biosynthesis pathway, comprise a number of very different organisms, such as, for example. Escherichia coli K-12 substr. MG1655. According to the invention, all microbiome organisms are suitable as biomarkers that have this metabolic pathway.
  • Microorganisms with the metabolic pathway PWY-621 which is also referred to as sucrose degradation III, also include a number of the most varied of organisms, such as, for example, Methylomicrobium alcaliphilum 20Z or Saccharomyces cerevisiae. According to the invention, all microbiome organisms are suitable as biomarkers which have this metabolic pathway.
  • Aureobasidium refers to a genus of the family Dothioraceae, mostly yeast-like fungi, to which the molds also belong. According to the invention, all microbiome fungi that belong to the genus Aureobasidium are suitable as biomarkers. According to the invention, a “living being” comprises a human and animal living being, in particular a female sex, preferably a female human.
  • a “persistent HPV infection” is such
  • Unremarkable cytological finding means according to the invention that the cervix uteri shows no visible signs of a pathological change, which can be determined, for example, in the course of a histological examination of the cervical mucosa.
  • a “microbiome sample” is one of the to be examined
  • At least two biomarkers means 2 or 3 or 4 or 5 or 6 according to the invention
  • the "relative frequency" of a biomarker is the number of
  • biomarkers in the microbiome sample recorded via its DNA sequence, understood in relation to all the DNA sequences recorded in the microbiome sample.
  • a "frequency pattern" is a result of the relative
  • classification or “classification” the assignment of the living being to be examined to a group with a high risk of developing HPV persistence (high risk group) or a group with a low risk of developing HPV Persistence (low risk group) on the Understand the basis of the recognized frequency pattern.
  • the classification can be carried out using classification methods known to the person skilled in the art, which are also referred to as classifiers.
  • the method according to the invention now enables, for the first time, a stratification in HR-HPV-positive and cytologically normal patients with regard to the development of a persistent HPV infection with only one test.
  • the process can be carried out simply, quickly and inexpensively.
  • the pattern recognition takes place by means of a
  • Classification method preferably by means of machine classification.
  • Machine classification which is also referred to as automatic classification, is understood according to the invention to be a method that can be implemented as an algorithm and that carries out the risk classification of the living being on the basis of the recognized frequency pattern as a result of a machine learning process.
  • the algorithm builds a statistical model based on training data, i.e. a large number of frequency patterns of the high-risk type and a large number of frequency patterns of the low-risk type. In this way, previously unknown frequency patterns can be recognized, assessed and assigned to one of the two groups.
  • the machine classification is carried out by means of a k-nearest neighbor algorithm (KNN) and / or by means of a stochastic gradient descent algorithm (SGD).
  • KNN k-nearest neighbor algorithm
  • SGD stochastic gradient descent algorithm
  • ANN is a method for pattern recognition and classification based on a non-parametric method for estimating Probability density functions.
  • the class allocation is made taking into account the 'k' nearest neighbors.
  • the SGD is an iterative method for optimizing an objective function with suitable smoothness properties.
  • the HPV infection is one with a high-risk strain (HR-HPV infection).
  • the microbiome sample is a cervical and / or vaginal swab.
  • a suitable biological sample is provided which can be obtained in a minimally invasive manner using means of clinical routine.
  • step 2 the relative frequency of at least three, preferably at least four, more preferably at least five, and most preferably of all six biomarkers is determined.
  • This measure has the advantage that as the biomarkers to be determined increase, the accuracy of the classification is also increased.
  • the classification accuracy is lowest for two of the identified biomarkers and highest for six of the identified biomarkers.
  • the person skilled in the art will adapt the number of biomarkers to the accuracy required for the respective question. If, for example, only a rough assessment of the risk is to be determined, it is sufficient if the relative frequency abilities of a few, for example two or three biomarkers can be determined. If, on the other hand, the classification is to form the basis for therapeutic measures and, as a result, a high level of accuracy is required, the relative frequencies of many, for example five or six, biomarkers are determined.
  • step 4 at a After step 4 at a
  • Biomarkers are selected from Leisingera (Genus), Devosia (Genus), microorganisms with the metabolic pathway PWY-2941, Thermothelomyces (Genus), and Marssonia (Genus).
  • the method according to the invention is developed into a two-stage test. If it is determined in the first stage with steps (2) - (4) that there is an increased risk of developing a persistent HPV infection ("CL-HPV-P Classifier”), in the second stage with the steps ( 5) - (7) it can be determined whether there is an increased or a low risk of developing a CIN (“CL-CIN Classifier").
  • CL-HPV-P Classifier a persistent HPV infection
  • the second stage with the steps ( 5) - (7) it can be determined whether there is an increased or a low risk of developing a CIN
  • the inventors have been able to find five other biomarkers that one
  • Leisingera denotes a genus (genus) of the Rhodobacteraceae gram-negative and physiologically extremely diverse proteobacteria. According to the invention, all microbiome bacteria are suitable as further biomarkers that belong to the genus Leisingera.
  • Devosia denotes a genus (genus) gram-negative, flagellar
  • microbiome bacteria belonging to the genus Devosia are suitable as further biomarkers.
  • Microorganisms with the metabolic pathway PWY-2941 which is also referred to as the lysine biosynthesis II pathway, include a large number of species, such as, for example, members of Bacillus sp., Brevibacillus laterosporus, members of Paenibacillus sp. or Virgibacillus sp. According to the invention, all microbiome organisms are suitable as further biomarkers which have this metabolic pathway.
  • Thermothelomyces is a genus (genus) so far little characterized fungi that belong to the tribe of Ascomycetes.
  • a well-known representative is the Thermothelomy ces thermophila, formerly also known as Myceliophthora thermophila.
  • all microbiome fungi that belong to the genus Thermothelomyces are suitable as further biomarkers.
  • Marssonia is a genus (genus) of mushrooms belonging to the family Dermateaceae
  • microbiome bacteria that belong to the genus Marssonia are suitable as further biomarkers.
  • a group with a low risk of developing a CIN is classified as a Living beings are generally classified as having "medium risk”. This classification with regard to a fundamentally medium risk is based on the fact that, for this living being via steps (2) - (4) according to the invention, an increased risk for the development of a persistent HPV infection was determined.
  • the relative frequency of at least three, preferably at least four, and most preferably of all five further biomarkers is determined in step 5.
  • Another object of the present invention relates to the use of
  • biomarkers for the classification of the risk of a living being with an HPV infection of the cervix uteri and normal cytological findings for the development of a persistent HPV infection, whereby the biomarkers are selected from Catenulispora (genus), Oleiphilus (genus), Chlamydiae ( Phylum), microorganisms with the metabolic pathway UDPNAGSYN-PWY, microorganisms with the metabolic pathway PWY-621, and aureobasidium (genus).
  • a frequency pattern formed from the relative frequencies of the at least two biomarkers in a microbiome sample of the living being is used for classification.
  • Another object relates to an apparatus for classifying the risk of a
  • the device having the following: an input unit for entering data on the relative frequency of at least two biomarkers in a microbiome Specimen of living being; a processor that is configured to execute instructions to a
  • this optionally has a
  • Sequencing unit for generating the data on the relative frequency of the at least two biomarkers in the microbiome sample of the living being and, optionally, an output unit for displaying the classification of the living being to a user.
  • Microbiota dysbiosis is associated with HPV-induced cervical carcinogenesis.
  • Kwasniew ski W. Wolun-Cholewa M.
  • Kotarski J. Warchol W.
  • Kuzma D. Kwasniewska A., Gozdzicka-Jozefiak A.
  • neoplasia disease progression is associated with increased vaginal microbiome diversity.
  • Fig. 1 biomarker for differentiating an HR-HPV persistence from a Spontanhei treatment
  • FIG. 5 test method according to the invention in medical application
  • the inventors carried out a study to develop a diagnostic test for the risk stratification of HR-HPV-positive women with normal cytological findings.
  • HR-HPV high risk type
  • FIR-FIPV infection A total of 6 biomarkers were found which can differentiate statistically significantly between a transient and persistent FIR-FIPV infection (FIG. 1). It is the relative frequency of three bacterial taxa (2 genera: Catenulispora, Oleiphilus-, 1 phylum: Chlamydiae), the relative frequency of two metabolic pathways in the microbiome (UDPNAGSYN-PWY, PWY-621), and the relative frequency of the Aureobasidium mushroom genus.
  • Fig. 3 shows that all machine learning classification models have a very high ROC-AUC (at least 0.96). The ability to discriminate is therefore very high.
  • the invention encompasses all classification methods created, predominantly machine ones
  • a two-stage test is provided that can divide the target population into three risk groups (Figure 4).
  • the machine learning classification model is used, which shows the risk of HPV persistence ("CL-HPV-P Classifier"). Women who are negative here are classified as "low risk” and are not examined further.
  • FIG. 5 shows an application of the test method according to the invention in FIG.
  • the invention is based on the determination of relative frequencies more specifically
  • Biomarkers in a biological sample are preferably determined and quantified at the DNA level using sequencing devices.
  • the sequencing devices sequence the DNA of microorganisms in a sample usually.
  • sample 1 contains more species A and B than sample 2. However, this could be a wrong result.
  • sequencing the aim is to have approximately the same number of sequences for each sample, but this is usually not possible in practice. Often times one sample contains far fewer sequences than another. Then the total number of sequences from one species is lower, although just as much of it was in the sample. It is therefore normalized to the relative frequency.
  • Microbiome For species A in sample 2, 10/50 applies, i.e. also an occurrence of 20% in the microbiome. Despite the different absolute frequency (20 vs. 10 sequences), the relative frequency (20% vs. 20%) is identical. Species A occurs equally in both microbiomes.
  • a database and a software program are preferably used which realizes a comparison with the database and an annotation including counting of the sequences.
  • the following databases have proven themselves: no, RefSeq.
  • the following software is also preferably used: Kaiju.
  • Fig. 6 shows a schematic diagram of an embodiment for a
  • Device 10 for classifying the risk of a living being with an infection of the cervix uteri with human papillomavirus (HPV infection) and inconspicuous like cytological findings for the development of a persistent HPV infection and possibly a cervical intraepithelial neoplasia (CIN).
  • HPV infection human papillomavirus
  • CIN cervical intraepithelial neoplasia
  • the device 10 has an input unit 12 for
  • the device also has a processor 14 which is set up to execute instructions in order to carry out a method with the following steps: 1) Creation of a frequency pattern from the data on the relative frequency of the at least two biomarkers in the microbiome. Specimen of living being; 2) supply of the frequency pattern from step 2 of a pattern recognition; 3) Classification of the living being as a result of pattern recognition into (i) a high risk group, or (ii) a low risk group.
  • the processor 14 can be set up, for example, by storing suitable software or a suitable classification algorithm.
  • the device also has an output unit 16 for displaying the classification of the living being to a user and a sequencing unit 18 for generating the data on the relative frequency of the at least two biomarkers in the microbiome sample of the living being.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren ex vivo zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV- Infektion) und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-Infektion. Es betrifft ferner die Verwendung von zumindest zwei Biomarkern zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-Infektion und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-Infektion. Schließlich betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-Infektion und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-Infektion und ggf. einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) (Fig. 1).

Description

Verfahren zur Klassifizierung des Risikos für die Entwicklung einer HPV-Persistenz
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren ex vivo zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV- Infektion) und unauffälligem zytologischem Befund für die Entwicklung einer persistieren den HPV-lnfektion. Es betrifft ferner die Verwendung von zumindest zwei Biomarkern zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-lnfektion und unauffälligem histologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion. Schließlich betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-lnfektion und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion und ggf. einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN).
[0002] Das Zervixkarzinom, auch Kollumkarzinom oder Gebärmutterhalskrebs genannt, ist ein bösartiger Tumor des Gebärmutterhalses ( Cervix uteri). Es ist weltweit der vierthäufigste bösartige Tumor bei Frauen. Histologisch handelt es sich in der Mehrheit der Fälle um ein Plattenepithelkarzinom. Die häufigste Ursache für ein Zervixkarzinom ist eine Infektion mit Hochrisikotypen des humanen Papillomvirus (HR-HPV). [0003] In den meisten Ländern werden Frauen ab einem gewissen Lebensalter, meist dem 35. Lebensjahr, Zervixkarzinom-Frühsorgeuntersuchungen angeboten. In Deutschland umfasst diese Untersuchung nach einer neuen Richtlinie des Gemeinsamen Bundesaus schusses zukünftig ab dem Jahr 2020 einen FIPV-Test und eine zytologische Untersu chung der Zervixschleimhaut. Frauen, die FIPV-positiv für einen HR-HPV und zytologisch auffällig sind, werden weiter abgeklärt. Frauen, die HPV-negativ und zytologisch unauffäl lig sind, werden in 3 Jahren wieder zur nächsten Screening-Untersuchung einbestellt.
[0004] Hinsichtlich des weiteren Vorgehens bei Frauen, die HR-HPV-positiv aber zytologisch unauffällig sind, wird voraussichtlich nach 12 Monaten eine erneute entsprechende Testung durchgeführt.
[0005] Diese Strategie birgt allerdings Risiken für die Frau und für die Kosteneffizienz des
Screenings. In den meisten Fällen heilt die HR-HPV-lnfektion spontan ab, sodass keine erhöhte Gefahr besteht, dass sich ein Zervixkarzinom ausbildet. Diese Frauen müssen allerdings 12 Monate auf ein negatives Ergebnis warten, was eine erhöhte psychische Belastung darstellt.
[0006] Im Falle einer bereits vorliegenden persistenten Infektion bei der ersten HPV-Testung kann nicht bestimmt werden, wie lange schon eine persistente Infektion vorliegt oder ob es zu einer spontanen Abheilung kommen kann. Bei einer über 24 Monate andauernden Persistenz der HR-HPV-lnfektion besteht eine erhöhte Gefahr zur Entwicklung einer Krebsvorstufe, die sich unentdeckt zum Zervixkarzinom entwickeln kann.
[0007] Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Lösung bereitzustellen, mit denen die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden oder zumindest reduziert werden können. Insbesondre soll ein Verfahren bereitgestellt werden, mit dem bei einem Lebewe sen mit einer HPV-lnfektion und unauffälligem zytologischen Befund über einen einmali gen Test das Risiko für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion ermittelt werden kann. [0008] Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren ex vivo zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-lnfektion der Cervix uteri und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion gelöst, das folgenden Schritte aufweist:
1 ) Bereitstellung einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens;
2) Bestimmung der relativen Häufigkeit von zumindest zwei Biomarkern in der
Mikrobiom-Probe zum Erhalt eines Häufigkeitsmusters;
3) Zuführung des Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer Mustererkennung;
4) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der Mustererkennung in eine Hochrisikogruppe, oder eine Geringrisikogruppe, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus Catenulispora (Genus), Oleiphilus (Genus), Chlamydiae (Phylum), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg UDPNAGSYN-PWY, Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-621 , und Aureobasidium (Genus).
[0009] Die Erfinder haben erkannt, dass das Schleimhaut-Mikrobiom der Cervix uteri sowohl durch metabolische als auch immunologische Einflüsse das HR-HPV-Persistenz-Risiko signifikant beeinflusst und dass bestimmte daran beteiligte Faktoren geeignete Prä- diktoren zur Vorhersage eines HR-HPV-Persistenz-Risikos sind.
[0010] In einer von den Erfindern durchgeführten prospektiven Studie konnten sie feststellen, dass es signifikante Unterschiede im Zervix-Mikrobiom von Frauen gibt, bei welchen HR- HPV persistiert und solchen, bei denen HR-HPV spontan eliminiert wird. Die Erfinder konnten Biomarker von bakteriellen, funktionellen und fungalen Faktoren identifizieren, die eine Risikostratifizierung der Patienten ermöglichen. [0011] Catenulispora bezeichnet dabei die Gattung (Genus) der zur Subordnung der
Catenulisporineae gehörenden Actinomycetales. Hierbei handelt es sich um grampositive Bakterien, die sich in lebenden Organismen aber auch in Böden oder sich zersetzendem organischem Material finden lassen. Erfindungsgemäß sind sämtliche Bakterien als Biomarker geeignet, die der Gattung Catenulispora angehören.
[0012] Oleiphilus bezeichnet die Gattung (Genus) der zur bislang wenig beschriebenen Familie der Oleiphilaceae gehörenden Bakterien. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom- Bakterien als Biomarker geeignet, die der Gattung Oleiphilus angehören.
[0013] Chlamydiae bezeichnet gramnegative Bakterien des Stamms (Phylum), deren Mitglieder sich durch eine außergewöhnliche Vielfalt auszeichnen und welche sowohl Krankheitser reger als auch Symbionten umfassen. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom- Bakterien als Biomarker geeignet, die dem Stamm Chlamydiae angehören.
[0014] Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg UDPNAGSYN-PWY, der auch als UDP-N- Acetyl-D-Glucosamin-Biosynthesis-Weg bezeichnet wird, umfassen eine Reihe unter schiedlichster Organismen, wie bspw. Escherichia coli K-12 substr. MG1655. Erfindungs gemäß sind sämtliche Mikrobiom-Organismen als Biomarker geeignet, die diesen Stoff wechselweg aufweisen.
[0015] Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-621 , der auch als Saccharose- Degradation III bezeichnet wird, umfassen ebenfalls eine Reihe verschiedenster Orga nismen, wie z.B. Methylomicrobium alcaliphilum 20Z oder Saccharomyces cerevisiae. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Organismen als Biomarker geeignet, die diesen Stoffwechselweg aufweisen.
[0016] Aureobasidium bezeichnet eine Gattung der zur Familie Dothioraceae zählenden meist hefeähnlichen Pilzen, zu denen auch die Schimmelpilze gehören. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Pilze als Biomarker geeignet, die der Gattung Aureobasidium angehören. [0017] Erfindungsgemäß umfasst ein "Lebewesen" ein menschliches und tierisches Lebewesen, insbesondere weiblichen Geschlechts, vorzugsweise einen weiblichen Menschen.
[0018] Erfindungsgemäß wird unter einer "persistierenden HPV-lnfektion" eine solche
verstanden, die bei dem zu untersuchenden Lebewesen über einen Zeitraum von zumin dest 12, vorzugsweise zumindest 24 Monaten vorhanden ist. Dabei werden die Begriffe persistierend und persistent sowie persistierenden HPV-lnfektion und HPV-Persistenz synonym gebraucht.
[0019] "Unauffälliger zytologischer Befund" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Cervix uteri keine sichtbaren Anzeichen für eine pathologische Veränderung aufweist, was sich bspw. im Rahmen einer histologischen Untersuchung der Zervixschleimhaut feststellen lässt.
[0020] Erfindungsgemäß wird unter einer "Mikrobiom-Probe" eine solche des zu untersuchenden
Lebewesens verstanden, die potenziell Zellen von Mikroorganismen, vor allem Bakterien und Pilze, enthalten, wie bspw. ein humane Probe der Zervix- und/oder Vaginalschleim haut aus einem Abstrich.
[0021] "Zumindest zwei Biomarker" bedeutet erfindungsgemäß 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6
Biomarker.
[0022] Erfindungsgemäß wird unter "relativer Häufigkeit" eines Biomarkers die Anzahl des
spezifischen Biomarkers in der Mikrobiom-Probe, erfasst über seine DNA-Sequenz, im Verhältnis sämtlicher in der Mikrobiom-Probe erfasster DNA-Sequenzen verstanden.
[0023] Erfindungsgemäß wird unter einem "Häufigkeitsmuster" eine sich aus den relativen
Häufigkeiten der Biomarker zusammengesetzte Information verstanden.
[0024] Unter "Klassifizierung" oder auch "Klassifikation" wird erfindungsgemäß die Zuordnung des zu untersuchenden Lebewesens zu einer Gruppe mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer HPV-Persistenz (Hochrisikogruppe) oder einer Gruppe mit einem geringen Risiko für die Entwicklung einer HPV-Persistenz (Geringrisikogruppe) auf der Basis des erkannten Häufigkeitsmusters verstanden. Die Klassifizierung kann dabei mittels dem Fachmann bekannter Klassifikationsverfahren, die auch als Klassifikator (engl. Classifier) bezeichnet werden, erfolgen.
[0025] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. Das
erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nun erstmals eine Stratifizierung bei HR-HPV- positiven und zytologisch unauffälligen Patienten hinsichtlich der Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion mit nur einer Testung. Das Verfahren ist einfach, schnell und kostengünstig durchführbar.
[0026] Nach einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Mustererkennung mittels eines
Klassifikationsverfahrens, vorzugsweise mittels maschineller Klassifikation.
[0027] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Verfahren zum Einsatz kommt, das besonders zuverlässige Ergebnisse liefert. Unter "maschineller Klassifikation", die auch als automati sche Klassifikation bezeichnet wird, wird dabei erfindungsgemäß ein als Algorithmus implementierbares Verfahren verstanden, das die Risikoeinstufung des Lebewesens auf der Basis des erkannten Häufigkeitsmusters als Ergebnis eines maschinellen Lernvor gangs vornimmt. Dazu baut der Algorithmus ein statistisches Modell auf, das auf Trai ningsdaten, also einer Vielzahl von Häufigkeitsmustern des Hochrisikotyps und einer Vielzahl von Häufigkeitsmustern des Geringrisikotyps, beruht. So können auch bislang unbekannte Häufigkeitsmuster erkannt, beurteilt und einem der beiden Gruppen zugeord net werden.
[0028] Nach einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die maschinelle Klassifikation mittels eines k-nächste-Nachbarn-Algorithmus (KNN) und/oder mittels Stochastic-Gradient- Descent-Algorithmus (SGD).
[0029] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass Mustererkennungs- bzw. Klassifikationsverfahren zum Einsatz kommen, die nach Erkenntnissen der Erfinder besonders gute und zuverläs sige Ergebnisse liefern. Bei KNN handelt es sich um ein Verfahren zur Mustererkennung und Klassifikation basierend auf einer nichtparametrische Methode zur Schätzung von Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen. Dabei erfolgt die Klassenzuordnung unter Berück sichtigung der 'k' nächsten Nachbarn. Die SGD ist eine iterative Methode zur Optimierung einer Zielfunktion mit geeigneten Glätteigenschaften.
[0030] Nach einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der HPV-lnfektion eine solche mit einem Hochrisikostamm (HR-HPV-lnfektion).
[0031] Mit dieser Maßnahme erfolgt auf vorteilhafte Art und Weise eine Anpassung des
erfindungsgemäßen Verfahrens an die sich derzeit darstellenden Bedürfnisse im klini schen Alltag. So ist die häufigste Ursache für die Entwicklung eines Zervixkarzinom ist eine Infektion mit Hochrisikotypen des humanen Papillomvirus (HR-HPV). Deshalb besteht gerade bei einer Infektion einer Patientin mit einem HR-HPV und unauffälligem histologischem Befund der Wunsch nach einer zuverlässigen Prognose, ob die Entwick lung einer Persistenz wahrscheinlich oder eher unwahrscheinlich ist. Hier schafft die Erfindung Abhilfe.
[0032] Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei der Mikrobiom- Probe um einen Zervix- und/oder Vaginalabstrich.
[0033] Mit dieser Maßnahme wird eine geeignete biologische Probe bereitgestellt, die mit Mitteln der klinischen Routine minimalinvasiv gewonnen werden kann.
[0034] Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird in Schritt 2 die relative Häufigkeit von zumindest drei, vorzugsweise zumindest vier, weiter vorzugsweise zumindest fünf, und höchst vorzugsweise von allen sechs Biomarkern bestimmt.
[0035] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit Erhöhung der zu bestimmenden Biomarker auch die Genauigkeit der Klassifizierung erhöht wird. So ist die Klassifikationsgenauigkeit bei zwei der erkannten Biomarkern am geringsten und bei sechs der erkannten Biomar kern am höchsten. Der Fachmann wird die Anzahl der Biomarker daran anpassen, welche Genauigkeit für die jeweilige Fragestellung erforderlich ist. Soll bspw. lediglich eine grobe Einschätzung des Risikos ermittelt werden, so ist ausreichend, wenn die relative Häufig- keiten von wenigen, bspw. zwei oder drei Biomarkern bestimmt werden. Soll hingegen die Klassifikation die Basis für therapeutische Maßnahmen bilden und ist infolgedessen eine hohe Genauigkeit erforderlich, so werden die relativen Häufigkeiten von vielen, bspw. fünf oder sechs Biomarkern bestimmt.
[0036] Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden nach Schritt 4 bei einer
Klassifizierung in eine Hochrisikogruppe folgende weitere Schritte durchgeführt werden:
5) Bestimmung der relativen Häufigkeit von zumindest zwei weiteren Biomarkern in der Mikrobiom-Probe zum Erhalt eines weiteren Häufigkeitsmusters;
6) Zuführung des weiteren Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer weiteren Musterer kennung;
7) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der weiteren Mustererkennung in eine Gruppe mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer zervikalen in traepithelialen Neoplasie (CIN), oder eine Gruppe mit einem geringen Risiko für die Entwicklung einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN), wobei die weiteren Biomarker ausgewählt sind aus Leisingera (Genus), Devosia (Genus), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-2941 , Thermothelomyces (Genus), und Marssonia (Genus).
[0037] Mit dieser Maßnahme wird das erfindungsgemäße Verfahren zu einem zweistufigen Test weitergebildet. Wird in der ersten Stufe mit den Schritten (2) - (4) festgestellt, dass ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion vorliegt ("CL- HPV-P Classifier"), kann in der zweiten Stufe mit den Schritten (5) - (7) festgestellt werden, ob ein erhöhtes oder geringes Risiko für die Entwicklung einer CIN vorliegt ("CL- CIN Classifier"). [0038] Die Erfinder haben nämlich fünf weitere Biomarker auffinden können, die eine
Klassifikation eines Patienten mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung einer HPV- Persistenz in eine Gruppe mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung einer CIN und eine Gruppe mit geringem Risiko für die Entwicklung einer CIN erlaubt.
[0039] Leisingera bezeichnet eine Gattung (Genus) von zu den Rhodobacteraceae zählenden gram-negativen und physiologisch äußerst vielfältigen Proteobakterien. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Bakterien als weitere Biomarker geeignet, die der Gattung Leisingera angehören.
[0040] Devosia bezeichnet eine Gattung (Genus) gram-negativer, flagellentragender,
stäbchenförmiger Bakterien. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Bakterien als weitere Biomarker geeignet, die der Gattung Devosia angehören.
[0041] Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-2941 , der auch als Lysin-Biosynthese- Il-Weg bezeichnet wird, umfassen ein Vielzahl von Spezies, wie bspw. Angehörige von Bacillus sp., Brevibacillus laterosporus, Angehörige von Paenibacillus sp. oder Virgibacil- lus sp. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Organismen als weitere Biomarker geeignet, die diesen Stoffwechselweg aufweisen.
[0042] Thermothelomyces ist eine Gattung (Genus) bislang wenig charakterisierter Pilze, die zum Stamm der Ascomyceten gehören. Ein bekannter Vertreter ist der Thermothelomy ces thermophila, früher auch als Myceliophthora thermophila bezeichnet. Erfindungsge mäß sind sämtliche Mikrobiom-Pilze als weitere Biomarker geeignet, die der Gattung Thermothelomyces angehören.
[0043] Marssonia ist eine Gattung (Genus) von Pilzen, die zur Familie der Dermateaceae
gehören. Erfindungsgemäß sind sämtliche Mikrobiom-Bakterien als weitere Biomarker geeignet, die der Gattung Marssonia angehören.
[0044] Dabei kann ein Lebewesen, das als Ergebnis der weiteren Mustererkennung in die
Gruppe mit einem geringen Risiko für die Entwicklung einer CIN klassifiziert wird, als Lebewesen mit grundsätzlich "mittlerem Risiko" klassifiziert werden. Diese Klassifizierung hinsichtlich eines grundsätzlich mittleren Risikos basiert auf der Tatsache, dass für dieses Lebewesen über die erfindungsgemäßen Schritte (2) - (4) gleichwohl ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion bestimmt wurde.
[0045] Die Merkmale, Eigenschaften, Definitionen, die für die Schritte (2) - (4) des
erfindungsgemäßen Verfahrens gelten, gelten entsprechend für die Schritte (5) - (7) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
[0046] Insofern wird in einer Ausführungsform der Erfindung in Schritt 5 die relative Häufigkeit von zumindest drei, vorzugsweise zumindest vier, und höchst vorzugsweise von allen fünf weiteren Biomarkern bestimmt.
[0047] Mit dieser Maßnahme wird zunehmend die Klassifizierungsgenauigkeit erhöht.
[0048] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von
zumindest zwei Biomarkern zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer HPV-lnfektion der Cervix uteri und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus Catenuli- spora { Genus), Oleiphilus (Genus), Chlamydiae (Phylum), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg UDPNAGSYN-PWY, Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY- 621 , und Aureobasidium (Genus).
[0049] Dabei ist es bevorzugt, wenn zur Klassifizierung ein Häufigkeitsmuster gebildet aus den relativen Häufigkeiten der zumindest zwei Biomarker in einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens verwendet wird.
[0050] Die Eigenschaften, Vorteile, Merkmale und Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.
[0051 ] Ein weiterer Gegenstand betrifft eine Vorrichtung zur Klassifizierung des Risikos eines
Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV- Infektion) und unauffälligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistieren den HPV-lnfektion und ggf. einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN), wobei die Vorrichtung Folgendes aufweist: eine Eingabeeinheit zum Eingabe von Daten zur relativen Häufigkeit von zumin dest zwei Biomarkern in einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens; einen Prozessor, der zur Ausführung von Anweisungen eingerichtet ist, um ein
Verfahren mit folgenden Schritten durchführen:
1 ) Erstellung eines Häufigkeitsmusters aus den Daten zur relativen Häufigkeit der zumindest zwei Biomarker in der Mikrobiom-Probe des Lebewesens;
2) Zuführung des Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer Mustererkennung;
3) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der Mustererkennung in eine Hochrisikogruppe, oder eine Geringrisikogruppe.
[0052] Nach einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist diese optional eine
Sequenziereinheit zur Generierung der Daten zur relativen Häufigkeit der zumindest zwei Biomarkern in der Mikrobiom-Probe des Lebewesens sowie, optional, eine Ausgabeein heit zur Anzeige der Klassifizierung des Lebewesens an einen Nutzer auf.
[0053] Die Eigenschaften, Vorteile, Merkmale und Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung entsprechend.
[0054] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu
erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Beispiele
[0061] Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind dabei nicht einschränkend.
[0062] Es versteht sich außerdem, dass einzelne Merkmale, die in den Ausführungsbeispielen offenbart sind, nicht nur im Kontext der jeweiligen spezifischen Ausführungsform sondern in einer Allgemeingültigkeit offenbart sind und für sich genommenen einen eigenen Beitrag zur Erfindung liefern. Der Fachmann kann deshalb diese Merkmale frei mit anderen Merkmalen der Erfindung kombinieren.
[0063] Dabei wird Bezug auf die beiliegenden Figuren genommen, in denen folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 Biomarker zur Unterscheidung einer HR-HPV Persistenz von einer Spontanhei lung;
Fig. 2 Ergebnis der Ward-Cluster-Analyse;
Fig. 3 Maschine-Learning-Klassifikationsmodelle;
Fig. 4 Erfindungsgemäßes zweistufiges Testverfahren mit Risikoeinstufung;
Fig. 5 Erfindungsgemäßes Testverfahren in der medizinischen Anwendung;
Fig. 6 Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 1. Klinische Studie
[0064] Die Erfinder haben eine Studie zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zur Risiko- Stratifizierung von HR-HPV-positiven Frauen mit unauffälligem zytologischen Befund durchgeführt.
Material und Methoden
Studiendesign
Fall-Kontrollstudiendesign innerhalb einer prospektiven Beobachtungsstu die.
Studienteilnehmer
100 Frauen mit positiven Nachweis einer Infektion der Cervix uteri mit Flumanen Papillomviren eines Hochrisikotyps (HR-HPV). Diese wurden über mehrere Jahre wiederholt auf dem HR-HPV-Status hin untersucht.
Endpunkt
Risikoklassifizierung einer i) Persistenz der HR-HPV-lnfektion nach 24 Monaten, und ii) der Gefahr der Entwicklung einer histologischen Schleim hautveränderung (CIN bzw. CIN2+).
Untersuchte Exposition
Taxonomische und funktionelle Anordnung des Zervix-Mikrobioms bei der Eingangsuntersuchung. Methodik
Shotgun-Metagenomics auf einem HiSeq2500 mit einem 2x150bp paired end Vorgehen und einer Sequenziertiefe von 4 - 5 Gb pro Probe, bioinfor- matische Auswertung mit Trimmomatic/Kneaddata/Kaiju/Humann2, statisti sche Regressionsmodelle mit Stata V12, Machine Learning Klassifikati onsmodelle wurden mit Scikit Learn erstellt und getestet.
Ergebnisse
Ergebnisse zur HR-HPV-Persistenz
57 Frauen wiesen eine transiente Infektion aus, welche innerhalb von 24 Mo naten spontan ausheilte.
43 Frauen wiesen eine für mindestens 24 Monate bestehende persistierende FIR-FIPV-lnfektion auf.
Ergebnisse der Mikrobiom-Untersuchungen zur HR-HPV-Persistenz
Insgesamt wurden 6 Biomarker aufgefunden, welche zwischen einer transien ten und persistenten FIR-FIPV-lnfektion statistisch signifikant unterscheiden können (Fig. 1 ). Es handelt sich um die relative Häufigkeit von drei bakteriel len Taxa (2 Gattungen: Catenulispora, Oleiphilus-, 1 Phylum: Chlamydiae), die relative Häufigkeit von zwei Stoffwechselwegen im Mikrobiom (UDPNAGSYN- PWY, PWY-621 ), und die relativen Häufigkeit der Pilzgattung Aureobasidium.
Diese 6 Biomarker wurden einer Ward-Cluster-Analyse zugänglich gemacht, die zeigt, dass die Studienpopulation sich anhand dieser Marker in zwei gut zu unterscheidende Gruppen unterteilt (Fig. 2). Dabei kommt eine Gruppe vor mit einem 2.77fach erhöhtem Risiko einer HR-HPV-Persistenz (obere Gruppe, Ri sikoerhöhung basiert auf der Odds Ratio mit einem p = 0.03). Daraufhin wurden 6 verschiedene Machine-Learning-Klassifikationsmodelle entwickelt, um die Studienpopulation in beide Gruppen zu unterscheiden. Die se Population umfasste noch 90 Frauen, da 10 Frauen wegen eines CIN2+ Befundes ausgeschlossen worden sind, da für diese der Test nicht sinnvoll ist. Eine Testkohorte von 20% wurde aus dieser Population ausgeschlossen, um die entstehenden Machine-Learning-Klassifikationsmodelle unabhängig zu evaluieren. Das heißt, dass die finale Testung an Proben von Frauen durchge führt wurde, welche zuvor nicht für den Aufbau der Machine-Learning- Classifier verwendet wurden. Dies sichert die Generalisierbarkeit der Daten.
Fig. 3 zeigt, dass alle Machine-Learning-Klassifikationsmodelle eine sehr hohe ROC-AUC haben (mindestens 0.96). Das Diskriminationsvermögen ist daher sehr hoch.
2. Testanwenduna
[0065] Die Erfindung umfasst alle erstellten Klassifikationsverfahren, vorwiegend maschinelle
Klassifikationsmodelle. Dabei haben sich jedoch die KNN- und SGD-Modelle in der Praxis aufgrund der hohen Unterscheidungskraft besonders bewährt. Alle Modelle liegen als Pickle-Dateien vor.
[0066] Es wird ein zweistufiger Test bereitgestellt, der die Zielpopulation in drei Risikogruppen unterteilen kann (Fig. 4). Zunächst wird das Machine-Learning-Klassifikationsmodell eingesetzt, welches das Risiko einer HPV-Persistenz anzeigt ("CL-HPV-P Classifier"). Frauen, die hier negativ sind, werden als "low risk" eingestuft und werden nicht weiter untersucht.
[0067] Wer in diesem CL-HPV-P Modell zur Risikogruppe zählt, wird durch das zweite Machine- Learning-Klassifikationsmodel ("CL-CIN Classifier") weiter untersucht hinsichtlich einer möglichen Entwicklung hin zu CIN bzw. CIN2+ ("CL-CIN2+ Classifier"). Frauen, die in diesem CL-CIN-Test nicht zur Hochrisikogruppe zählen, werden als "medium risk" einge stuft. [0068] Wer zur Hochrisikogruppe zählt, wir als "high risk" eingestuft.
[0069] Fig. 5 zeigt eine Anwendung des erfindungsgemäßen Testverfahrens in der
medizinischen Praxis mit entsprechenden interventioneilen Konsequenzen. Danach werden Frauen ab einem Alter von 35 Jahren einem HPV-Test und einer zytologischen Untersuchung der Cervix uteri unterzogen. Sind beide Tests negativ, erfolgt eine Kontrolle nach 3 Jahren. Fallen beide Tests positiv aus, ergeben sich neben einem positiven HPV- Test zytologisch Hinweise auf Krebsvorstufen oder Krebs, erfolgt eine weitere Abklärung gemäß S3-Leitlinie. Das bedeutet, dass der Gebärmutterhals vom Arzt mit einer Lupe auf Krebsvorstufen untersucht wird und ggf. eine Gewebeprobe entnommen wird (Kolposko pie). Die Gewebeproben werden dann einer genaueren histologischen Untersuchung zugeführt werden. Bei positivem HPV-Test und negativem zytologischen Befund kommt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einsatz. Patientinnen mit "low risk" oder "medium risk" werden in ein bis drei Jahren erneut kontrolliert. Patientinnen mit "high risk" werden engmaschig (3-6 Monate) kontrolliert und ggf. zusätzlichen diagnostischen Tests unter worfen.
3. Relative Häufigkeiten
[0070] Die Erfindung beruht auf der Bestimmung von relativen Häufigkeiten spezifischer
Biomarker in einer biologischen Probe. Dabei werden die Biomarker vorzugsweise auf DNA-Ebene unter Verwendung von Sequenziergeräten ermittelt und quantifiziert.
[0071] Die Sequenziergeräte sequenzieren die DNA von Mikroorganismen einer Probe i.d.R.
nach einem zufälligen Ablauf. Dies bedeutet gleichwohl, dass die DNA von Organismen, die häufig in einer Probe Vorkommen, in der Regel auch häufiger sequenziert wird. Pro Sequenzierlauf werden meist mehrere Millionen kleine Sequenzen erzeugt. Diese werden mit einer Datenbank abgeglichen. Dann wird eine solche Sequenz annotiert. Es wird bewertet, worin ihr Ursprung liegt. Dieser ist in der Regel ein Gen (Annotation der Gen funktion oder Stoffwechselweg) und die Zugehörigkeit zu einer mikrobiellen Spezies (Taxonomie). Jetzt wird die Gesamtzahl der Sequenzen gezählt für jede Einheit, z.B. Spezies. [0072] Beispiel: In Probe 1 finden sich 20 Sequenzen von Spezies A und 10 Sequenzen von Spezies B. In Probe 2 finden sich 10 Sequenzen von Spezies A und 5 Sequenzen von Spezies B. Es lässt sich schlussfolgern, dass in beiden Proben mehr Spezies A vorkommt als Spezies B. In der vergleichenden Genomik werden nun vor allem Unterschiede zwischen den Proben untersucht. Jetzt könnte geschlussfolgert werden, dass in Probe 1 mehr Spezies A und B enthalten ist als in Probe 2. Das könnte aber ein falsches Ergebnis sein. Beim Sequenzieren wird zwar angestrebt, für jede Probe ungefähr gleich viele Sequenzen zu sequenzieren, was jedoch in der Praxis meist nicht gelingt. Oft enthält eine Probe viel weniger Sequenzen als eine andere. Dann ist die Gesamtzahl der Sequenzen von einer Spezies geringer, obwohl genau so viel von ihr in der Probe war. Daher wird auf die relative Häufigkeit normalisiert.
[0073] In dem obigen Beispiel wird angenommen, dass im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens in Probe 1 genau 100 Sequenzen produziert wurden und in Probe 2 genau 50. Dann gilt für Spezies A in Probe 1 genau 20/100, also ein Vorkommen von 20% im
Mikrobiom. Für Spezies A in Probe 2 gilt 10/50, also auch ein Vorkommen von 20% im Mikrobiom. Trotz der unterschiedlichen absoluten Häufigkeit (20 vs. 10 Sequenzen) ist die relative Häufigkeit (20% vs. 20%) identisch. In beiden Mikrobiomen kommt Spezies A gleich häufig vor.
[0074] Für das Bestimmen der relativen Häufigkeit setzt man vorzugsweise eine Datenbank und ein Softwareprogramm ein, welches einen Abgleich mit der Datenbank und eine Annotati on samt Zählung der Sequenzen realisiert. Erfindungsgemäß haben sich folgende Daten banken bewährt: nr, RefSeq. Ferner kommt vorzugsweise folgende Software zum Einsatz: Kaiju.
4. Klassifizierunqsvorrichtunq
[0075] Fig. 6 zeigt ein schematisches Diagramm eines Ausführungsbeispiels für eine
erfindungsgemäße Vorrichtung 10 zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV-lnfektion) und unauffälli- gern zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV-lnfektion und ggf. einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN).
[0076] In diesem Ausführungsbeispiel weist die Vorrichtung 10 eine Eingabeeinheit 12 zum
Eingabe von Daten zur relativen Häufigkeit von zumindest zwei Biomarkern in einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens auf.
[0077] Die Vorrichtung weist nach diesem Ausführungsbeispiel außerdem einen Prozessor 14 auf, der zur Ausführung von Anweisungen eingerichtet ist, um ein Verfahren mit folgenden Schritten durchführen: 1 ) Erstellung eines Häufigkeitsmusters aus den Daten zur relativen Häufigkeit der zumindest zwei Biomarkern in der Mikrobiom-Probe des Lebewesens; 2) Zuführung des Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer Mustererkennung; 3) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der Mustererkennung in (i) eine Hochrisikogruppe, oder (ii) eine Geringrisikogruppe. Diese Einrichtung des Prozessors 14 kann bspw. durch die Speicherung einer geeigneten Software bzw. eines geeigneten Klassifizierungsalgorith mus erfolgen.
[0078] Die Vorrichtung weist nach diesem Ausführungsbeispiel ferner eine Ausgabeeinheit 16 zur Anzeige der Klassifizierung des Lebewesens an einen Nutzer sowie eine Sequenzie reinheit 18 zur Generierung der Daten zur relativen Häufigkeit der zumindest zwei Bio markern in der Mikrobiom-Probe des Lebewesens auf.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren ex vivo zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV-lnfektion) und unauffäl ligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV- lnfektion, mit folgenden Schritten:
1 ) Bereitstellung einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens;
2) Bestimmung der relativen Häufigkeit von zumindest zwei Biomarkern in der Mikrobiom-Probe zum Erhalt eines Häufigkeitsmusters;
3) Zuführung des Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer Mustererkennung;
4) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der Mustererkennung in eine Hochrisikogruppe, oder eine Geringrisikogruppe, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus Catenulispora (Genus), Oleiphilus (Ge nus), Chlamydiae (Phylum), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg
UDPNAGSYN-PWY, Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-621 , und Aureobasidium (Genus).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Mustererkennung mittels eines Klassifikationsverfahrens, vorzugsweise mittels maschineller Klassifi kation erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die maschinelle Klassifikation mittels eines k-nächste-Nachbarn-Algorithmus (KNN) erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die maschinelle Klassifikation mittels Stochastic Gradient Descent (SGD) erfolgt.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die HPV-lnfektion eine solche mit einem Hochrisikostamm ist (HR-HPV-lnfektion).
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobiom-Probe ein Zervix- und/oder Vaginalabstrich ist.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 2 die relative Häufigkeit von zumindest drei, vorzugsweise zumindest vier, weiter vorzugsweise zumindest fünf, und höchst vorzugsweise von allen sechs Biomarkern bestimmt wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Schritte, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 4 bei einer Klassifizierung in eine Hochrisikogruppe folgende weitere Schritte durchgeführt werden:
5) Bestimmung der relativen Häufigkeit von zumindest zwei weiteren Biomar kern in der Mikrobiom-Probe zum Erhalt eines weiteren Häufigkeitsmusters;
6) Zuführung des weiteren Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer weiteren Mustererkennung;
7) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der weiteren Mustererken nung in eine Gruppe mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer zervi kalen intraepithelialen Neoplasie (CIN), oder eine Gruppe mit einem geringen Risiko für die Entwicklung einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN), wobei die weiteren Biomarker ausgewählt sind aus Leisingera (Genus), Devosia (Genus), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-2941 , Thermothelomyces (Genus), und Marssonia (Genus).
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 5 die relative Häufigkeit von zumindest drei, vorzugsweise zumindest vier, und höchst vorzugs weise von allen fünf weiteren Biomarkern bestimmt wird.
10. Verwendung von zumindest zwei Biomarkern zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV- Infektion) und unauffälligem histologischen Befund für die Entwicklung einer per sistierenden HPV-lnfektion, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus Catenulispo- ra (Genus), Oleiphilus (Genus), Chlamydiae (Phylum), Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg UDPNAGSYN-PWY, Mikroorganismen mit dem Stoffwechselweg PWY-621 , und Aureobasidium (Genus).
1 1. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Klassifizierung ein Häufigkeitsmuster gebildet aus den relativen Häufigkeiten der zumindest zwei Biomarker in einer Mikrobiom-Probe des Lebewesens verwendet wird.
12. Vorrichtung (10) zur Klassifizierung des Risikos eines Lebewesens mit einer
Infektion der Cervix uteri mit Humanen Papillomviren (HPV-lnfektion) und unauffäl ligem zytologischen Befund für die Entwicklung einer persistierenden HPV- lnfektion und ggf. einer zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN), wobei die Vor richtung Folgendes aufweist: eine Eingabeeinheit (12) zum Eingabe von Daten zur relativen Häufigkeit von zumindest zwei Biomarkern in einer Mikrobiom-Probe des Lebewe sens; einen Prozessor (14), der zur Ausführung von Anweisungen eingerichtet ist, um ein Verfahren mit folgenden Schritten durchführen:
1 ) Erstellung eines Häufigkeitsmusters aus den Daten zur relativen Häufigkeit der zumindest zwei Biomarker in der Mikrobiom-Probe des Lebewesens;
2) Zuführung des Häufigkeitsmusters aus Schritt 2 einer Mustererken nung;
3) Klassifizierung des Lebewesens als Ergebnis der Mustererkennung in eine Hochrisikogruppe, oder eine Geringrisikogruppe.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, die zusätzlich Folgendes aufweist: eine Ausgabeeinheit (16) zur Anzeige der Klassifizierung des Lebewesens an einen Nutzer.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, die zusätzlich Folgendes aufweist: eine Sequenziereinheit (18) zur Generierung der Daten zur relativen Häu figkeit der zumindest zwei Biomarkern in der Mikrobiom-Probe des Lebe- wesens.
PCT/EP2020/071046 2019-07-26 2020-07-24 Verfahren zur klassifizierung des risikos für die entwicklung einer hpv-persistenz WO2021018799A1 (de)

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R. M. BROTMAN ET AL: "Interplay Between the Temporal Dynamics of the Vaginal Microbiota and Human Papillomavirus Detection", THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, vol. 210, no. 11, 18 June 2014 (2014-06-18), US, pages 1723 - 1733, XP055522107, ISSN: 0022-1899, DOI: 10.1093/infdis/jiu330 *

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