WO2020256060A1 - バンコマイシンの骨形成阻害作用を緩和した感染症治療剤 - Google Patents

バンコマイシンの骨形成阻害作用を緩和した感染症治療剤 Download PDF

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WO2020256060A1
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vancomycin
vitamin
active vitamin
derivative
therapeutic agent
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PCT/JP2020/023936
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健太郎 辻
聡一郎 木村
一博 舘田
高橋　寛
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学校法人東邦大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to vancomycin and an infectious disease therapeutic agent containing active vitamin D or an active vitamin D derivative.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • vancomycin powder has been used after spinal surgery to solve the problem of side effects caused by systemic administration.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 3
  • an external powder preparation of vancomycin is also known (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 4 In vitro experiments have reported that vancomycin inhibits bone formation.
  • Vitamin D, active vitamin D and active vitamin D derivatives are known to exhibit osteogenic effects in osteoblasts, and active vitamin D3 derivatives such as calcitriol are clinically used as therapeutic agents for osteoporosis.
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 6
  • a method that does not cause bone formation inhibition while maintaining a high concentration of vancomycin is desired.
  • the present invention [1] An infectious disease therapeutic agent containing vancomycin and an active vitamin D or an active vitamin D derivative. [2] The infectious disease therapeutic agent according to [1], wherein the dosage form is a powder preparation. [3] The infectious disease therapeutic agent according to [1] or [2], which contains 3 g or more of vancomycin. [4] The infectious disease therapeutic agent according to any one of [1] to [3], which comprises 4 ng or more of active vitamin D or active vitamin D derivative. [5] The infectious disease therapeutic agent according to any one of [1] to [4], which comprises 3 to 6 g of vancomycin. [6] The infectious disease therapeutic agent according to any one of [1] to [4], which comprises 10 g or more of vancomycin.
  • the infectious disease therapeutic agent according to any one of [1] to [6], wherein the active vitamin D derivative is calcitriol.
  • a therapeutic agent for infectious diseases which comprises 10 g or more of vancomycin and 4 ng or more of calcitriol, eldecalcitol, alfacalcidol or phalacalcitriol.
  • the present invention relates to the infectious disease therapeutic agent according to [8], wherein the dosage form is a powder preparation.
  • the present invention also [10] A method for treating an infectious disease, which comprises directly applying or spraying vancomycin and a powder preparation containing active vitamin D or an active vitamin D derivative onto an affected area.
  • a surgical method comprising directly applying or spraying vancomycin and a powder preparation containing active vitamin D or an active vitamin D derivative to an affected area in order to prevent infection during surgery.
  • the method for operating an infectious disease according to [11] which comprises using 4 ng to 417 ng of active vitamin D or an active vitamin D derivative.
  • the present invention provides an infectious disease therapeutic agent that has no risk of infection during surgery and has no side effects on bone formation.
  • FIG. 1 shows that when osteoblasts were cultured [Day 1 (Fig. 1A), Day 3 (Fig. 1B), Day 7 (Fig. 1C)], vancomycin, vitamin D3 and vancomycin + vitamin D3 were added to the bone. This is the result showing the effect on the number of blast cells.
  • FIG. 2 shows the effect of the addition of vancomycin, vitamin D3 and vancomycin + vitamin D3 on the morphology of osteoblasts when the osteoblasts were cultured (day 1, day 3, day 7). is there. Vancomycin was tested at four different concentrations of 2500 ⁇ g / ml, 5000 ⁇ g / ml, 7500 ⁇ g / ml, and 10000 ⁇ g / ml.
  • FIG. 1 shows that when osteoblasts were cultured [Day 1 (Fig. 1A), Day 3 (Fig. 1B), Day 7 (Fig. 1C)], vancomycin, vitamin D3 and vancomycin + vitamin D3 were added to the bone. This is the result showing the effect on the
  • FIG. 3 is a stained photograph showing the effect of addition of vancomycin and vancomycin + vitamin D3 on the ALP distribution of osteoblasts when osteoblasts were cultured (day 1, day 3, day 7). is there.
  • Alkaline phosphatase (ALP) was observed with the naked eye (FIG. 3A) and under a microscope (FIG. 3B).
  • FIG. 4 the effect of addition of vancomycin and vancomycin + vitamin D3 on the alkaline phosphatase (ALP) activity of osteoblasts was measured on the 7th day of culturing the osteoblasts.
  • FIG. 5 is a photograph of Arizarin Red S staining for confirming the effect of addition of vancomycin and vancomycin + vitamin D3 on cell calcification on the 28th day of osteoblast culture.
  • FIG. 5A shows the case where the osteoblasts were cultured for 7 days, and the three concentrations of vitamin D 0.01 nM, 1 nM, and 100 nM and the three concentrations of vitamin D 0.01 nM, 1 nM, and 100 nM were added together with vancomycin 7500 ⁇ g / ml. , Vitamin D concentration and the effect of the combination of vancomycin and vitamin D concentration.
  • FIG. 7 shows the effect of the addition of vancomycin, vitamin D3 and vancomycin + vitamin D3 on the morphology of osteoblasts when the osteoblasts were cultured (day 7). Vancomycin was tested at a concentration of 7500 ⁇ g / ml, and vitamin D was tested at 0.01 nM, 1 nM, and 100 nM.
  • Vancomycin in the present invention means an aminoglycoside antibiotic whose general name is vancomycin hydrochloride.
  • the vancomycin used in the present invention may be obtained by any production method, but it is preferable that the vancomycin meets the specifications and purity as a drug or drug substance.
  • the active vitamin D or active vitamin D derivative in the present invention may be any compound that is a structural analog of vitamin D3 (cholecalciferol) and has an osteogenic effect, but is specific. Examples thereof include calcidol (25 hydroxylated active vitamin D3) known as active vitamin D3, calcitriol (1,25 hydroxylated active vitamin D3), eldecalcitol, alfacalcidol, falecalcitriol and the like.
  • the active vitamin D or the active vitamin D derivative can be used alone or in combination of one or more of these.
  • vancomycin and the active vitamin D or the active vitamin D derivative are contained in the preparation in which at least one of the vancomycin and the active vitamin D or the active vitamin D derivative is mixed. Show that.
  • the ratio thereof is the active vitamin D or the active vitamin D with respect to 3 g to 10 g of vancomycin.
  • the blending ratio of the active vitamin D derivative is 4 ng to 417 ng.
  • the composition of the present invention preferably contains 4 ng to 417 ng of active vitamin D or active vitamin D derivative with respect to 10 g. Is preferably blended in an amount of 4 ng to 8 ng.
  • the numerical range of the vancomycin and the active vitamin D or the active vitamin D derivative is based on the dose used at one time of use, and the therapeutic agent for infectious diseases of the present invention is produced in large quantities for multiple use. Also, if the blending ratio of vancomycin and at least one of active vitamin D or active vitamin D derivative is within the same range as the mixing ratio specified above, it is included in the present invention.
  • the preparation composition in the therapeutic agent for infectious diseases which comprises vancomycin of the present invention and an active vitamin D or an active vitamin D derivative, can be uniformly applied or sprayed in a solid state when used in surgery. It is necessary, preferably in powder form.
  • the powder is preferably a dry powder. Drying means adjusting the water content of the composition so that the particles are easily dispersed. In some embodiments, this water content is less than about 10% by weight, less than about 7% by weight, less than about 5% by weight, or less than about 3% by weight. .. Further, the powder means a composition composed of finely dispersed solid particles.
  • the formulation composition in the therapeutic agent for infectious diseases which comprises the vancomycin of the present invention and an active vitamin D or an active vitamin D derivative, is one embodiment of vitamin D or active vitamin D in a powder of vancomycin. It may be produced by blending the derivative as a solid, mixing and stirring, but since the blending composition ratio is higher in vancomycin, a large amount of dry powder of vancomycin is used, and active vitamin D is used. Alternatively, it may be prepared by a method of uniformly mixing the active vitamin D derivative.
  • the formulation composition may further contain one or more additives.
  • a suitable additive is a hydrophobic amino acid.
  • hydrophobic amino acids include, but are not limited to, tryptophan, tyrosine, leucine, isoleucine and phenylalanine.
  • Hydrophobic amino acids improve the physical stability and / or dispersibility of the composition and stabilize vancomycin and formulations of active vitamin D or active vitamin D derivatives.
  • composition containing vancomycin of the present invention and active vitamin D or active vitamin D derivative may further contain a bulking agent such as a carbohydrate bulking agent or a medium-chain fatty acid triglyceride.
  • Carbohydrate bulkers include, but are not limited to, lactose, mannitol, trehalose, raffinose, and maltodextrin.
  • the amount of active vitamin D or active vitamin D derivative to be blended is smaller than that of vancomycin, a bulking agent is added to active vitamin D or active vitamin D derivative for the purpose of uniform blending. You may add it after increasing the amount. Since the therapeutic agent for infectious diseases of the present invention is used as an external preparation during surgery, the carbohydrate enhancer must be safe in the body and soluble in water or body fluid.
  • the above additives may be contained in an amount of about 50% by weight or less of the composition, 30% by weight or less of the composition, or 10% by weight or less. Since the therapeutic agent for infectious diseases of the present invention is used as an external preparation during surgery, it is preferable that the amount of the additive is small. Further, the composition of the present invention may contain at least one of a pH adjusting agent such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride and potassium chloride, a buffering agent or a tonicity adjusting agent. In addition, a pharmaceutically acceptable auxiliary substance or auxiliary agent can be included as an external preparation used during surgery.
  • the therapeutic agent for infectious diseases in the present invention may be any therapeutic agent for which vancomycin is effective, and its indications and indications are synonymous with vancomycin indications, and the indications are sensitive to vancomycin.
  • indications such as sepsis, infectious endocarditis, secondary infections such as trauma / burn and surgical wound, myelitis, arthritis, pneumonia, pulmonary abscess, purulent chest, peritonitis, purulent meningitis
  • MRCNS vancomycin-sensitive methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus
  • MRCNS vancomycin-sensitive methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus
  • the indication is vancomycin-sensitive penicillin-resistant pneumoniae (PRSP), septicemia, pneumonia, purulent meningitis, etc.
  • PRSP vancomycin-sensitive penicillin-resistant pneumoniae
  • septicemia septicemia
  • pneumonia purulent meningitis
  • a preferred use in the present invention is the prevention and treatment of secondary infections such as surgical wounds.
  • the vancomycin of the present invention and an infectious disease therapeutic agent containing active vitamin D or an active vitamin D derivative are prepared by, for example, weighing a vancomycin raw material and an active vitamin D or an active vitamin D derivative and mixing them with a mixer. Can be manufactured by If the particle size of the vancomycin raw material is large, it may be crushed with a crusher and then mixed with a mixer, if necessary.
  • the formulation composition of the present invention can also provide a dry powder composition suitable for application or spraying on an affected area during surgery.
  • vancomycin and active vitamin D or active vitamin D derivatives can be prepared by the spray-drying method.
  • an aqueous solution of vancomycin and active vitamin D or an active vitamin D derivative can be prepared, and a spray dryer can be used by a conventional method to obtain a homogeneous granule.
  • a fine dry powder having particles having a diameter of 1 to 5 ⁇ m can also be produced.
  • Formulation Example 1 10 g of vancomycin hydrochloride and 4.167 ng of calcitriol are blended to produce a therapeutic agent for infectious diseases containing vancomycin and calcitriol to be used during surgery.
  • Preparation example 2 100 g of vancomycin hydrochloride and 41.67 ng of calcitriol are blended to produce an infectious disease therapeutic agent (for 10 times of surgery) containing vancomycin and calcitriol to be used at the time of surgery.
  • the vancomycin of the present invention and an infectious disease therapeutic agent containing active vitamin D or an active vitamin D derivative are used to prevent secondary infection by MRSA or the like at the time of spinal surgery closure.
  • an infectious disease therapeutic agent containing active vitamin D or an active vitamin D derivative is used to prevent secondary infection by MRSA or the like at the time of spinal surgery closure.
  • 3 g to 10 g of vancomycin preferably 3 g to 6 g using a pre-made preparation
  • 4 ng to 417 ng of active vitamin D or an active vitamin D derivative and 10 g or more of vancomycin.
  • 10 g of vancomycin and active vitamin D or active vitamin D derivative are used in an amount of 4 ng to 417 ng, preferably 4 ng to 8 ng, as a therapeutic agent for external infectious diseases corresponding to one operation.
  • active vitamin D or an active vitamin D derivative can be used to suppress the bone formation inhibitory action of vancomycin. Further, even when the amount of vancomycin is less than that, active vitamin D or active vitamin D derivative can be used for the purpose of promoting healing after surgery.
  • the method of using the vancomycin of the present invention and the infectious disease therapeutic agent containing the active vitamin D or the active active vitamin D derivative is to use about 3 to 10 g of the infectious disease therapeutic agent of the present invention during the operation of spinal surgery fusion. Preferably about 10 g is applied or sprayed onto the operated area and then the wound is sutured.
  • infectious disease therapeutic agent of the present invention By using the infectious disease therapeutic agent of the present invention, postoperative infection due to MRSA or the like is prevented, wound healing is smoothly performed without inhibiting bone formation, and the postoperative condition of the patient progresses satisfactorily.
  • Example 1 Confirmation of cytoprotective effect by adding vitamin D3 in osteoblast culture medium of various concentrations ofnadomycin (1) Culture of test osteoblasts Osteoblast MC3T3-E1cell (purchased from National Research and Development Corporation Physical and Chemical Research Institute) is cell proliferation. Since the rate, cell differentiation, and calcification are similar to human osteoblasts, the cells were selected as cells to be used in the evaluation test.
  • MC3T3-E1 cells are in ⁇ -MEM medium (purchased from Nacalai Tesque) containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% antibiotic (100 U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin) at 37 ° C., 5 It was cultured in an environment of% CO 2 . Incubate until 70% confluent (about 3 days), wash with PBS, then use trypsin-EDTA (0.05% trypsin, EDTA-4Na, purchased from Thermofisher Science) at 37 ° C. The cells were peeled off in an environment of 5% CO 2 , and subculture was performed.
  • (2) Preparation of vancomycin When 2 g of vancomycin was sprayed into the wound, the drainage volume was about 1500 ⁇ g / ml. Therefore, the vancomycin concentration was converted from the drainage volume of the drain.
  • the vancomycin used in this experiment was purchased from Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd., and the concentrations in each test were set to 2500 ⁇ g / ml, 5000 ⁇ g / ml, and 7500 ⁇ g / ml, respectively.
  • Vitamin D3 (calcitriol) Vitamin D3 was purchased from Caiman Chemical Co., Ltd.
  • concentration the number of cells and the cell morphology were examined at three concentrations of 0.01 nM, 1 nM, and 100 nM, respectively, in a preliminary test, but since cytotoxicity occurred at 100 nM, the test was decided at a concentration of 0.01 nM.
  • the final concentration of vancomycin was 2500 ⁇ g / ml, 5000 ⁇ g / ml, and 7500 ⁇ g / ml, and the concentration of vitamin D3 was 0.01 nM as described above. Then, after incubating for 24 hours, the culture solution was removed, and the vancomycin alone group contained 2500 ⁇ g / ml of vancomycin, 5000 ⁇ g / ml of vancomycin or 7500 ⁇ g / ml of vancomycin in the ⁇ -MEM culture solution containing 5% FBS, and vancomycin and vitamin D3.
  • vancomycin 2500 ⁇ g / ml + vitamin D3 0.01 nM, vancomycin 5000 ⁇ g / ml + vitamin D3 0.01 nM or vancomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 0.01 nM were added to a 5% FBS-containing ⁇ -MEM culture solution and cultured. .. The number of cells in each group was observed on the 1st, 3rd, and 7th days of culture.
  • FIG. 1 shows changes in the number of cells on the first day (Fig. 1A), the third day (Fig. 1B), and the seventh day (Fig. 1B) of each sample to which vancomycin and vitamin D3 were added.
  • the vancomycin concentrations of 2500 ⁇ g / ml, 5000 ⁇ g / ml, and 7500 ⁇ g / ml were added to vancomycin on the 1st, 3rd, and 7th days.
  • the number of osteoblasts in the group to which was added in combination with vancomycin was higher than that in the group to which vancomycin was added alone.
  • the number of osteoblasts decreased significantly from the control, but in the test results on the 7th day of culture, the number of cells was remarkably recovered by the combined use of vitamin D3.
  • FIG. 2 shows a photograph showing the state of morphological change of osteoblasts.
  • Alkaline phosphatase staining (ALP staining) and alkaline phosphatase activity (ALP activity) were performed to assess osteoblast maturation. In addition, alizarin red S staining was also performed.
  • the ALP staining kit was purchased from Cosmo Bio Co., Ltd., and the ALP activity kit was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and used.
  • (1) ALP-stained MC3T3-E1 cells were seeded on a plate using a 24-well plate so as to have 1 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the vancomycin alone group contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS
  • the combined group of vancomycin and vitamin D3 contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS.
  • ml + vitamin D3 0.01 nM was added.
  • the cells were further cultured for 24 hours, and ⁇ -MEM containing 5% FBS was added to the control group and the vancomycin alone administration group.
  • vitamin D3 0.01 nM was administered.
  • ALP staining was performed. After removing the culture medium, the cells were washed 3 times with 1 ml of PBS per well. Next, 250 ⁇ l / well of fixative (10% neutral buffered formalin) was added and fixed at room temperature for 20 minutes. The fixative was removed and washed 3 times with 2 / ml distilled water per well. To one chromogenic substrate, 5 ml of substrate buffer was added and dissolved, and 200 ⁇ l / well was added. Humidified at 37 ° C. for 20 minutes. Since the area with ALP activity was dyed blue, the inside of the well was washed with distilled water to stop the reaction when the color was sufficiently developed. The result is shown in FIG.
  • FIG. 3 it was found that the blue-stained portion, which was significantly reduced by the addition of vancomycin, was recovered in the vitamin D3-added group, and the decrease in cell differentiation ability was suppressed.
  • ALP-active MC3T3-E1 cell was seeded on a plate using a 96-well plate so as to have 10 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the vancomycin alone group contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS
  • the combined group of vancomycin and vitamin D3 contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS.
  • ml + vitamin D3 0.01 nM was added.
  • ⁇ -MEM containing 5% FBS was administered to the control group and the vancomycin alone administration group.
  • vitamin D3 0.01 nM was administered.
  • ALP activity was measured after 7 days. For ALP activity, 100 ⁇ l of substrate buffer and 20 ⁇ l of sample were added per well, and the mixture was stirred with a plate mixer for 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 80 ⁇ l / well of the reaction terminator was added. After stirring with a plate mixer for 1 minute, the absorbance at 405 nM was measured with a microplate reader.
  • MC3T3-E1 cells were seeded on the plates using a 12-well plate at 2.0 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the vancomycin alone group contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS
  • the combined group of vancomycin and vitamin D3 contained vancomycin 7500 ⁇ g / ml in the ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS.
  • ml + vitamin D3 0.01 nM was added. After culturing for 24 hours after the addition, ⁇ -MEM containing 5% FBS was added to the control group and the vancomycin alone administration group. In the vancomycin + vitamin D3 combination group, vitamin D3 0.01 nM was administered.
  • the staining method was carried out with reference to past experiments.
  • the culture medium was changed once every 3 days.
  • the cells were first washed 3 times with 1 ml of PBS for 5 minutes. Next, it was fixed at room temperature with a 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution (Fuji Film Wako Jun Co., Ltd.) for 20 minutes. Washed with distilled water 3 times for 10 minutes. Using 2% alizarin red S dissolved in distilled water, it was stained at room temperature for 10 minutes. Finally, the cells were washed with 1 ml of PBS and observed with the naked eye and under a microscope.
  • Example 3 MC3T3-E1 cells prepared in the same manner as in Example 1 (1) were seeded on a plate using a 24-well plate so as to have 1 ⁇ 10 4 cells per well. Using a culture solution of ⁇ -MEM containing 5% FBS and 1% antibiotic, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 3 days.
  • vancomycin final concentration 7500 ⁇ g / ml
  • ⁇ -MEM culture medium containing 5% FBS as a control was added, and this was added to Example 1 (3).
  • Vitamin D final concentration, 0.01 nM, 1 nM, 100 nM
  • test group control, mortomycin 7500 ⁇ g / ml alone group, vitamin D3 0.01 nM alone group, vitamin D3 1 nM alone group, vitamin D3 100 nM alone group, declarationomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 0.01n group, declarationomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin Eight test groups were prepared for the D3 1 nM group and the vancomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 100 nM group.
  • vancomycin alone group contained 5% FBS ⁇ -MEM culture solution containing 7500 ⁇ g / ml of vancomycin, and the combination group of vancomycin and vitamin D3 contained 5% FBS ⁇ .
  • vancomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 0.01 nM, vancomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 1 nM or vancomycin 7500 ⁇ g / ml + vitamin D3 100 nM were added to the MEM culture solution and cultured. On the 7th day of culture, the number of cells and the morphology of cells in each group were observed.
  • FIG. 6 shows the change in the number of cells on the 7th day of culture in each test group.
  • vitamin D3 increased the number of cells from the control at 0.01 nM and 1 nM, but showed a decreasing tendency at 100 nM administration.
  • vitamin D3 prevented the decrease in cell number due to vancomycin administration in the 0.01 nM administration group, 1 nM administration group, and 100 nM administration group, but the vitamin D3 1 nM administration group had the highest recovery. showed that.
  • Osteoblasts showed morphological changes at 100 nM when vitamin D3 alone was used, but the cell morphology changed in the presence of vancomycin 7500 ⁇ g / ml was suppressed by vitamin D3 0.01 nM administration and vitamin D1 1 nM administration. ..
  • an infectious disease therapeutic agent for preventing postoperative infectious diseases is provided.
  • VCM Vancomycin
  • VD3 Vitamin D3 day1: 1st day of culture day2: 2nd day of culture day3: 3rd day of culture
  • VCM7500 Vancomycin 7500 ⁇ g / ml
  • VD 0.01 Vitamin D3 0.01nM
  • VD1 Vitamin D3 1nM
  • VD100 Vitamin D3 100nM All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

バンコマイシンパウダーを用いた脊椎手術閉創時には、ＭＲＳＡによる二次感染予防のために、高濃度のバンコマイシンを感染予防のために直接、骨に散布するが、骨形成阻害が生じる可能性がある。その一方で骨形成阻害を考慮してバンコマイシンの濃度を下げてしまうと、十分な感染予防にはならない。高濃度のバンコマイシン濃度を維持しながら骨形成阻害が生じない医薬品の提供が望まれている。　バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有することを特徴とする感染症治療剤を提供する。

Description

バンコマイシンの骨形成阻害作用を緩和した感染症治療剤
　本発明はバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは、活性型ビタミンＤ誘導体を含有した感染症治療剤に関する。
　脊椎手術後の感染を防ぐために、予防抗菌薬の投与は有用である。一般的には、黄色ぶどう球菌による感染を予防するためにセファゾリンを使用する。しかし、難治性の手術部位感染では、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）やコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）の発生が多く、その予防抗菌薬としてはバンコマイシンが使用されている。しかし、一般的に使われているバンコマイシンの全身投与では、腎障害やアナフィラキシー等の副作用が発生することが報告がされている(非特許文献１)。全身投与により副作用が生じる問題を解決するために、近年バンコマイシンパウダーの使用が脊椎手術後に行われている。バンコマイシンパウダーを創内に局所投与することによって高濃度のバンコマイシンを投与することができ、感染予防につながること、また全身投与での副作用を防ぐことができると報告されている(非特許文献２、非特許文献３)。また、バンコマイシンの外用パウダー製剤も知られている（特許文献１）。
　しかし、バンコマイシンパウダー治療は、高濃度の抗菌剤を直接骨に散布することから骨形成阻害が生じる可能性がある。実際にインビトロの実験では、バンコマイシンが骨形成を阻害するとの報告がされている(非特許文献４)。
　ビタミンＤ、活性型ビタミンＤおよび活性型ビタミンＤ誘導体は骨芽細胞において骨形成作用を示すことが知られており、カルシトリオール等の活性型ビタミンＤ３誘導体は骨粗鬆治療剤として臨床で用いられている（非特許文献５、非特許文献６）。
米国特許９５７２７７４号明細書
クリストファー　ジェイ　ペイン（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｊ　Ｐａｙｎｅ）他７名、ジャーナル　オブ　アンティミクロバイアル　ケモセラピー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、２０１１年、第６６巻、２６２４－２６２７頁 ルセル　ジー　ストーム（Ｒｕｓｓｅｌｌ　Ｇ　Ｓｔｒｏｍ）他３名、スピン（Ｓｐｉｎｅ）、２０１３年、第３８巻、第１２号、９９１－９９４頁 フレッド　エイ　スウィート（Ｆｒｅｄ　Ａ　Ｓｗｅｅｔ）他２名、スピン（Ｓｐｉｎｅ）、２０１１年、第３６巻、第２４号、２０８４－２０８８頁 クラウディア　エーデル（Ｃｌａｕｄｉａ　Ｅｄｅｒ）他６名、ヨーロピアン　スピン　ジャーナル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｓｐｉｎｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ）、２０１６年、第２５巻、１０２１－１０２８頁 内田　悠志、歯科学報、２０１４年、１１４巻、第３号、９５頁 竹内靖博、メディシナル（ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ）、２０１２年、８月号、第２巻、８７－８８頁
　バンコマイシンパウダーを用いた脊椎手術閉創時は、高濃度のバンコマイシンを感染予防のために直接、骨に散布することから骨形成阻害が生じる可能性がある。その一方で骨形成阻害を考慮してバンコマイシンの濃度を下げてしまうと、十分な感染予防にはならない。
　高濃度のバンコマイシン濃度を維持しながら骨形成阻害が生じない方法が望まれている。
　本発明は、
〔１〕バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有することを特徴とする感染症治療剤、
〔２〕剤型がパウダー製剤であることを特徴とする〔１〕記載の感染症治療剤、
〔３〕バンコマイシンを３ｇ以上含むことを特徴とする〔１〕または〔２〕記載の感染症治療剤、
〔４〕活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ以上含むことを特徴とする〔１〕から〔３〕いずれかひとつに記載の感染症治療剤、
〔５〕バンコマイシンを３～６ｇ含むことを特徴とする〔１〕から〔４〕のいずれかひとつに記載の感染症治療剤、
〔６〕バンコマイシンを１０ｇ以上含むことを特徴とする〔１〕から〔４〕のいずれかひとつに記載の感染症治療剤、
〔７〕活性型ビタミンＤ誘導体が、カルシトリオールであることを特徴とする〔１〕から〔６〕いずれかひとつに記載の感染症治療剤、
〔８〕バンコマイシンを１０ｇ以上およびカルシトリオール、エルデカルシトール、アルファカルシドールまたはファレカルシトリオールを４ｎｇ以上配合することを特徴とする感染症治療剤、
〔９〕剤型がパウダー製剤であることを特徴とする〔８〕記載の感染症治療剤に関する。
本発明はまた、
〔１０〕バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有するパウダー製剤を、患部に直接塗布または噴霧することを特徴とする感染症の治療方法、
〔１１〕手術中の感染を予防するために、バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有するパウダー製剤を、患部に直接塗布または噴霧することを特徴とする手術方法、
〔１２〕バンコマイシン３ｇ～１０ｇおよび活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ～４１７ｎｇ投与することを特徴とする〔１０〕記載の感染症の予防および治療方法、および
〔１３〕バンコマイシン３ｇ～１０ｇおよび活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ～４１７ｎｇ使用することを特徴とする〔１１〕記載の感染症の手術方法に関する。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-113407号の開示内容を包含する。
　本発明により、手術中に感染の恐れが無く、かつ骨形成に副作用の無い感染症治療剤が提供される。
図１は、骨芽細胞を培養〔１日目（図１Ａ）、３日目（図１Ｂ）、７日目（図１Ｃ）〕した場合にバンコマイシン、ビタミンＤ３およびバンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が骨芽細胞数に与える影響を示した結果である。 図２は、骨芽細胞を培養（１日目、３日目、７日目）した場合にバンコマイシン、ビタミンＤ３およびバンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が骨芽細胞の形態に与える影響を示した結果である。なお、バンコマイシンは２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、７５００μｇ／ｍｌ、１００００μｇ／ｍｌの４種類の濃度で試験した。 図３は、骨芽細胞を培養（１日目、３日目、７日目）した場合にバンコマイシン、およびバンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が骨芽細胞のＡＬＰ分布に与える影響を示した染色写真である。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）は肉眼（図３Ａ）および顕微鏡下（図３Ｂ）で観察した。 図４、骨芽細胞を培養７日目にバンコマイシン、およびバンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性へ与える影響を測定したものである。 図５は、骨芽細胞培養２８日目に、バンコマイシン、バンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が細胞の石灰化に与える影響を確認するためのアリザリンレッドＳ染色の写真である。骨芽細胞の石灰化は肉眼（図５Ａ）および顕微鏡下（図５Ｂ）で観察した。 図６は、骨芽細胞を７日間培養した場合に、ビタミンＤ０．０１ｎＭ、１ｎＭ、１００ｎＭの３種濃度およびバンコマイシン７５００μｇ／ｍｌとともにビタミンＤ０．０１ｎＭ、１ｎＭ、１００ｎＭの３種濃度を加えた場合に、ビタミンＤの濃度およびバンコマイシンとビタミンＤ各濃度の組み合わせが与える影響を示した結果である。 図７は、骨芽細胞を培養（７日目）した場合にバンコマイシン、ビタミンＤ３およびバンコマイシン＋ビタミンＤ３の添加が骨芽細胞の形態に与える影響を示した結果である。なお、バンコマイシンは７５００μｇ／ｍｌの濃度で、ビタミンＤは、０．０１ｎＭ、１ｎＭ、１００ｎＭで試験した。
　本発明におけるバンコマイシンとは、医薬品一般名称をバンコマイシン・塩酸塩とするアミノグリコシド系抗生物質を意味する。本発明に用いるバンコマイシンはどのような製法で得られたものであっても良いが、医薬品または医薬原薬としての規格と純度を満たすことが好ましい。
　本発明における活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体とは、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）の構造類似体であって、骨形成作用を持つ化合物であればどのようなものでも良いが、具体的には、活性型ビタミンＤ３として知れるカルシドール（２５水酸化活性型ビタミンＤ３）、カルシトリオール（１、２５水酸化活性型ビタミンＤ３）、エルデカルシトール、アルファカルシドール、ファレカルシトリオール等が挙げられる。本発明において、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体はこれらの中から単独または一つ以上組み合わせて用いることができる。
　本発明において、バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有するとは、前記バンコマイシンと前記活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の少なくとも１種が、製剤の中に混合されていることを示す。
　前記バンコマイシンと活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の少なくとも１種とが、本発明の製剤の中に混合されている場合にその割合は、バンコマイシン３ｇ～１０ｇに対して、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体４ｎｇ～４１７ｎｇの配合割合である。本発明はバンコマイシンを１０ｇ以上使用する際に、バンコマイシンによる骨形成阻害の抑制効果が生じるので、本発明の組成物は１０ｇに対して活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ～４１７ｎｇ、好ましくは４ｎｇ～８ｎｇ配合することが好ましい。なお、前記バンコマイシンおよび活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の数値範囲は1回の使用時に用いる用量を基準としており、本発明の感染症治療剤を複数回使用するために大量に製造しておく場合も、バンコマイシンと活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の少なくとも１種との配合割合が前記に規定した混合割合と同じ範囲内であれば、本発明に含まれる。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有することを特徴とする感染症治療剤における製剤組成物は、固形状で手術に使用する際に均一に塗布または噴霧できることが必要で、好ましくはパウダー状のものが良い。パウダーとしては乾燥粉末であることが好ましい。乾燥とは、粒子が容易に分散するように、組成物の含水量を調節することを意味する。いくつかの実施形態では、この含水量は、約１０重量％未満の水分量、約７重量％未満の水分量、約５重量％未満の水分量、または約３重量％未満の水分量である。また、粉末とは微細分散固体粒子からなる組成物を意味する。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有することを特徴とする感染症治療剤における製剤組成物は、一つの態様としてバンコマイシンの粉体にビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を固形物として配合し、混合、撹拌して製造したものであっても良いが、配合組成比としてバンコマイシンの方が多いため、配合量が多いバンコマイシンの乾燥粉末を用いこれに活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を均一に混合させる方法で調製させても良い。
　本発明においては、バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体に加えて、製剤組成物にさらに１つまたは複数の添加剤を含んでいてもよい。適切な添加剤の一例には、疎水性アミノ酸が挙げられる。そのような疎水性アミノ酸としては、例えばトリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。疎水性アミノ酸は、組成物の物理的安定性および／または分散性を改善し、バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の配合物を安定化させる。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有する組成物は、更に炭水化物増量剤や中鎖脂肪酸トリグリセリド等の増量剤を含んでいても良い。炭水化物増量剤としては、ラクトース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびマルトデキストリンが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明においては、バンコマイシンに比べて活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の配合量が少ないため、均一な配合を目的とするために活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体に増量剤を加えて増量してから配合しても良い。なお、本発明の感染症治療剤は手術時に外用剤として用いるため、炭水化物増量剤は体内でも安全で、かつ水または体液に溶解するものでなくてはならない。
　上記の添加剤は、組成物の約５０重量％以下、組成物の３０重量％以下、または１０重量％以下の量で含まれてもよい。本発明の感染症治療剤は手術時に外用剤として使用するため、添加剤の量は少ない方が好ましい。更に本発明の組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのｐＨ調整剤、緩衝剤または張度調整剤の少なくとも１種を含んでいても良い。また、手術時に用いる外用剤として薬学的に許容される補助物質または補助剤を含むことができる。
　本発明における感染症治療剤とはバンコマイシンが効能を有する治療剤であればどのようなものでも良く、その適応菌種および適応症はバンコマイシンの適応症と同義であり、適応菌種がバンコマイシンに感性のＭＲＳＡの場合は、敗血症、感染性心内膜炎、外傷・熱傷及び手術創等の二次感染、骨髄炎、関節炎、肺炎、肺膿瘍、膿胸、腹膜炎、化膿性髄膜炎等の適応症の予防および治療が、バンコマイシンに感性のメチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲＣＮＳ）が適応菌種の場合は、敗血症、感染性心内膜炎、外傷・熱傷及び手術創等の二次感染、骨髄炎、関節炎、腹膜炎、化膿性髄膜炎等の適応症の予防および治療が、適応菌種がバンコマイシンに感性のペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ）の場合は、敗血症、肺炎、化膿性髄膜炎等の適応症の予防および治療が可能となるが、本発明における好ましい用途は手術創等の二次感染の予防および治療である。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有する感染症治療剤は、例えばバンコマイシン原料と活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を秤量の上、ミキサーにて混合することにより製造することができる。バンコマイシン原料の粒子径等が大きい場合は、必要により粉砕機で粉砕後、ミキサーで混合しても良い。
　本発明の製剤組成物は、外科手術中患部に塗布や噴霧するのに適した乾燥粉末組成物を提供することもできる。この場合、バンコマイシンおよび活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を、スプレードライ法により調製することができる。具体的にスプレードライ法は、バンコマイシンおよび活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体の水溶液を作成し、スプレードライヤーを常法により用いて均質の造粒物を得ることができる。上記方法を用いることにより直径１～５μｍの粒子を有する微細な乾燥粉末を製造することもできる。
　製剤例１
　バンコマイシン塩酸塩１０ｇとカルシトリオール４．１６７ｎｇを配合し、手術時に用いるバンコマイシンおよびカルシトリオールを含む感染症治療剤を製造する。
製剤例２
　バンコマイシン塩酸塩１００ｇとカルシトリオール４１．６７ｎｇを配合し、手術時に用いるバンコマイシンおよびカルシトリオールを含む感染症治療剤（手術１０回用）を製造する。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有する感染症治療剤は、脊椎手術閉創時にＭＲＳＡ等による二次感染を予防するために使用される。具体的には予め製造された製剤を用いて、バンコマイシン３ｇ～１０ｇ、好ましくは３ｇ～６ｇの使用が必要な場合は、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ～４１７ｎｇ、バンコマイシンを１０ｇ以上使用する場合は、バンコマイシン１０ｇと活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ～４１７ｎｇ、好ましくは４ｎｇ～８ｎｇ、一回の手術に対応した外用感染症治療剤として使用する。バンコマイシンの骨形成阻害作用は１０ｇ以上で出現するため、バンコマイシン１０ｇを使用する場合は、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体がバンコマイシンの骨形成阻害作用を抑止するために使用できる。また、バンコマイシン量がそれ未満の場合も手術後の治癒促進効果を目的として活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を使用することができる。
　本発明のバンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型活性型ビタミンＤ誘導体を含有する感染症治療剤の使用方法は、脊椎手術固定術の手術中に本発明の感染症治療剤約３～１０ｇ、好ましくは約１０ｇを手術した患部に塗布または噴霧し、その後傷口を縫合する。
　かかる本発明の感染症治療剤の使用により、ＭＲＳＡ等による術後感染を防ぐとともに、骨形成が阻害されることなく、創傷治癒が円滑に行われ患者の術後の容態が良好に経過する。
　以下に本発明の実施例を記載する。なお、以下の全ての実施例には活性型ビタミンＤとしてカルシトリオールを用いた。以下の実施例（図面の説明も含む）に記載するカルシトリオールはビタミンＤ３と記載する。
〔実施例１〕
　バンコマイシン各種濃度の骨芽細胞培養液におけるビタミンＤ３添加による細胞保護効果の確認
（１）試験用骨芽細胞の培養
　骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌ（国立研究開発法人理化学研究所より購入）は、細胞増殖率、細胞分化、石灰化がヒト骨芽細胞と類似しているため同細胞を評価試験に用いる細胞として選択した。
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と１％抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン+１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含んだα－ＭＥＭ 培地（ナカライテスク社より購入）で３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養した。７０％コンフルエントの状態になるまで培養を行い（約３日間）、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ（０.０５％ トリプシン、ＥＤＴＡ－４Ｎａ、サーモフィッシャーサイエンス社から購入）を使って３７℃、５％ＣＯ２の環境下で細胞を剥がし、継代培養を行った。
（２）バンコマイシンの調製
　バンコマイシンを創内に２ｇ散布した時、約１５００μｇ／ｍｌのドレーン排液量となることから、ドレーンの排液量からバンコマイシン濃度を換算した。
　この実験で使用したバンコマイシンは、塩野義製薬（株）から購入し、各試験の濃度は各２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、７５００μｇ／ｍｌに設定した。
　ちなみに臨床での創内散布の報告は、０．５ｇから６ｇまで報告されているので、上記の比の計算から２５００μｇ／ｍｌから７５００μｇ／ｍｌが適正であると計算した。
（３）ビタミンＤ３ (カルシトリオール) の調製
　ビタミンＤ３は、カイマンケミカル社から購入した。
濃度は、予備試験で各０.０１ｎＭ、１ｎＭ、１００ｎＭの３種濃度で細胞数と細胞形態を検討したが、１００ｎＭで細胞毒性が生じたため０.０１ｎＭの濃度で試験を行うこととした。
（４）バンコマイシン単独群とバンコマイシン+ビタミンＤ３併用群との細胞数と細胞形態の比較
　（１）で調整したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌを、２４ウェルプレートを用いて１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌｓになるようにプレートに播種した。５％ＦＢＳと１％抗生剤を含んだα－ＭＥＭの培養液を用いて、約３日間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。７０％コンフルエント後に、バンコマイシンおよび／またはビタミンＤ３を同時に投与した。バンコマイシンの終濃度は、２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、７５００μｇ／ｍｌの３種類の濃度を用い、ビタミンＤ３の濃度は前記のように０.０１ｎＭになるよう添加した。その後、２４時間インキュベートした後、培養液を取り除き、バンコマイシン単独群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン２５００μｇ／ｍｌ、バンコマイシン５０００μｇ／ｍｌまたはバンコマイシン７５００μｇ／ｍｌを、バンコマイシンとビタミンＤ３の併用群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン２５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ、バンコマイシン５０００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭまたはバンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを添加し、培養した。培養１日目、３日目、７日目に各群における細胞数を観察した。
　図１にバンコマイシンおよびそれにビタミンＤ３を加えた各サンプルの１日目（図１Ａ）、３日目（図１Ｂ）、７日目（図１Ｂ）における細胞数の変化を示した。
　図１によればビタミンＤ３をバンコマイシンに加えて添加した群に関しては、２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、７５００μｇ／ｍｌの各バンコマイシン濃度とも１日目、３日目、７日目においてバンコマイシンにビタミンＤ３を併用して添加した群はバンコマイシン単独添加群よりも骨芽細胞数は増加していた。とりわけ７５００μｇ／ｍｌのバンコマイシン単独添加群では著しく骨芽細胞数はコントロールより減少するが、培養７日目の試験結果ではビタミンＤ３併用により細胞数が顕著に回復していた。
　次に、フラスコを用いて、１フラスコあたり１×１０４ｃｅｌｌになるように骨芽細胞をフラスコに播種した。前記のウェルにおける試験と同様に何も加えないコントロール群、ビタミンＤ３単独投与群、バンコマイシン単独添加群 (バンコマイシン各２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、７５００μｇ／ｍｌ、１００００μｇ／ｍｌ)、バンコマイシン＋ビタミンＤ３併用添加群(バンコマイシン２５００μｇ／ｍｌ+ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ, バンコマイシン ５０００μｇ／ｍｌ+ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ, バンコマイシン ７５００μｇ／ｍｌ+ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ、バンコマイシン１００００μｇ／ｍｌ+ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ)に関して、培養を行い、１日目、３日目、７日目に細胞増殖・形態の変化について観察した。
　図２に骨芽細胞の形態変化の状態を示す写真を示した。
　図２によればビタミンＤ３を添加すると、骨芽細胞を７日間培養すると骨芽細胞は増殖し、高濃度バンコマイシンの細胞障害性は緩和された。
〔実施例２〕
バンコマイシン含有骨芽細胞培養におけるビタミンＤの効果の確認
　最もビタミンＤ３併用により効果が認められた濃度（バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ）について、分化・成熟に必要なアルカリフォスファターゼの活性について染色法を用いて肉眼的観察および顕微鏡下での観察を行い、活性能力を数値化、また、石灰化を評価するために染色を行なった。
　アルカリフォスファターゼの染色（ＡＬＰ染色）とアルカリフォスファターゼ活性（ＡＬＰ活性）は、骨芽細胞成熟を評価するために実行した。また、併せてアリザリンレッドＳ染色も行った。
　ＡＬＰ染色キットはコスモバイオ（株）から、ＡＬＰ活性キットは和光純薬工業（株）から購入して使用した。
（１）ＡＬＰ染色
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌは、２４ウェルプレートを用いて１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌｓになるようにプレートに播種した。プレコンフになったところでバンコマイシン単独群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌを、バンコマイシンとビタミンＤ３の併用群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを添加した。添加後更に２４時間培養を行い、コントロール群とバンコマイシン単独投与群には、５％ＦＢＳ入りα－ＭＥＭを添加した。バンコマイシン＋ビタミンＤ３併用群では、ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを投与した。７日後にＡＬＰ染色を行った。培養液を除去後、１ウェルあたりＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄した。次に、固定液（１０%中性緩衝ホルマリン液）を２５０μｌ／ウェル加え、室温で２０分間固定した。固定液を除去し、１ウェルあたり蒸留水２／ｍｌで３回洗浄した。発色基質１本に対して基質緩衝液５ｍｌを加え溶解し、これを２００μｌ／ウェル加えた。３７℃、２０分間加湿した。ＡＬＰ活性がある場所は青く染色されるため、十分に発色したら、蒸留水でウェル内を洗浄し、反応を止めた。
その結果を図３に示した。
　図３によれば、バンコマイシン添加で著しく低下した青い染色部分がビタミンＤ３添加群では、回復しており、細胞分化能力の減少が抑制されていることが判明した。
（２）ＡＬＰ活性
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌは、９６ウェルプレートを用いて１ウェルあたり１０×１０４ｃｅｌｌｓになるようにプレートに播種した。プレコンフになったところでバンコマイシン単独群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌを、バンコマイシンとビタミンＤ３の併用群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを添加した。添加後２４時間培養した段階で、コントロール群とバンコマイシン単独投与群には５％ＦＢＳ入りα－ＭＥＭを投与した。バンコマイシン＋ビタミンＤ３併用群では、ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを投与した。７日後にＡＬＰ活性を測定した。ＡＬＰ活性は１ウェルあたり基質緩衝液を１００μｌと検体を２０μｌ加え、プレートミキサーで１分間攪拌後、３７℃、１５分間インキュベートした。反応停止液を８０μｌ／ウェル加えた。プレートミキサーで１分間攪拌後、４０５ｎＭの吸光度をマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
　その結果を図４に示した。
　図４によればビタミンＤ３添加により、バンコマイシン添加で減少したＡＬＰ活性が増加した。
（３）アリザリンレッド染色
　アリザリンレッド染色は、骨芽細胞の石灰化を評価するために行った。石灰化染色キットは、シグマアルドリッチ社から購入し、使用した。
　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌを、１２ウェルプレートを用いて１ウェルあたり２．０×１０４ｃｅｌｌｓになるようにプレートに播種した。プレコンフになったところでバンコマイシン単独群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌを、バンコマイシンとビタミンＤ３の併用群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを添加した。添加後も２４時間培養を行った後、コントロール群とバンコマイシン単独投与群には、５％ＦＢＳ入りα－ＭＥＭを添加した。バンコマイシン＋ビタミンＤ３併用群では、ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭを投与した。２１日培養した後に、染色方法は過去の実験を参考に行った。３日に一回、培養液は交換した。３週間培養後、はじめに５分間ＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄した。次に、室温にて４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液(富士フィルム　和光純製株式会社)で２０分間固定を行った。１０分間３回蒸留水で洗浄した。蒸留水に溶かした２％アリザリンレッドＳを使用し、１０分間室温で染色した。最後にＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、肉眼的観察および顕微鏡下での観察を行った。
　結果を図５に示した。骨芽細胞の石灰化は、ＶＣＭ単独群では、染色がほとんど見られなかったのに対し、活性型ビタミンＤ３を追加すると石灰化を示す染色は回復した。石灰化は骨芽細胞の成熟過程で見られる現象であることからも、ビタミンＤ３の添加によりバンコマイシンによる細胞障害性が回復していることが判明した。
〔実施例３〕
　実施例１（１）記載の方法と同様の方法で調整したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｌを、２４ウェルプレートを用いて１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌｓになるようにプレートに播種した。５％ＦＢＳと１％抗生剤を含んだα－ＭＥＭの培養液を用いて、約３日間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。７０％コンフルエント後に、実施例１の（２）の記載で調整したバンコマイシン（終濃度７５００μｇ／ｍｌ）またはコントロールとしての５％ＦＢＳ入りα―ＭＥＭ培養液を加え、これに実施例１の（３）に記載の方法で調整した上記３種類の濃度のビタミンＤ(終濃度、０．０１ｎＭ，１ｎＭ、１００ｎＭ)を同時に添加した。
　従って、試験区としてコントロール、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ単独群、ビタミンＤ３　０．０１ｎＭ単独群、ビタミンＤ３　１ｎＭ単独群、ビタミンＤ３　１００ｎＭ単独群、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３　０．０１ｎ群、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３　１ｎＭ群およびバンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３　１００ｎＭ群の８区の試験区を作成した。
　薬剤添加後、２４時間インキュベートした後、培養液を取り除き、バンコマイシン単独群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌを、バンコマイシンとビタミンＤ３の併用群は５％ＦＢＳ含有α－ＭＥＭ培養液中に、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ ０.０１ｎＭ、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ １ｎＭまたはバンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ＋ビタミンＤ３ １００ｎＭを添加し、培養した。培養７日目に各群における細胞数および細胞の形態を観察した。
　図６に各試験区における培養７日目の細胞数の変化を示した。
　図６によれば、ビタミンＤ３は、０．０１ｎＭ、１ｎＭにおいてコントロールより細胞数を増加させたが、１００ｎＭ投与では減少傾向が見られた。バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ投与による細胞数の減少に関しては、ビタミンＤ３は０．０１ｎＭ投与群、１ｎＭ投与群、１００ｎＭ投与群においてバンコマイシン投与による細胞数の減少を防いだが、ビタミンＤ３　１ｎＭ投与群が最も高い回復を示した。
　各試験区における細胞形態の変化の結果を図７に示した。骨芽細胞は、ビタミンＤ３単独の場合は１００ｎＭで形態変化が見られたが、バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ存在下で変化した細胞の形態をビタミンＤ３　０．０１ｎＭ投与、ビタミンＤ１　1ｎＭ投与は抑止していた。
　本発明により、術後感染症予防のための感染症治療剤が提供される。
ＶＣＭ：バンコマイシン
ＶＤ３：ビタミンＤ３
ｄａｙ１：培養１日目
ｄａｙ２：培養２日目
ｄａｙ３：培養３日目
ＶＣＭ７５００：バンコマイシン７５００μｇ／ｍｌ
ＶＤ　０．０１：ビタミンＤ３　０．０１ｎＭ
ＶＤ１　　　　：ビタミンＤ３　１ｎＭ
ＶＤ１００　　：ビタミンＤ３　１００ｎＭ
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. バンコマイシンおよび、活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を含有することを特徴とする感染症治療剤。
  2. 剤型がパウダー製剤であることを特徴とする請求項１記載の感染症治療剤。
  3. バンコマイシンを３ｇ以上含むことを特徴とする請求項１または２記載の感染症治療剤。
  4. 活性型ビタミンＤまたは活性型ビタミンＤ誘導体を４ｎｇ以上含むことを特徴とする請求項１から３いずれか１項に記載の感染症治療剤。
  5. バンコマイシンを３～６ｇ含むことを特徴とする請求項１から４いずれか１項に記載の感染症治療剤。
  6. バンコマイシンを１０ｇ以上含むことを特徴とする請求項１から４いずれか１項に記載の感染症治療剤。
  7. 活性型ビタミンＤ誘導体が、カルシトリオールであることを特徴とする請求項１から６いずれか１項に記載の感染症治療剤。
  8. バンコマイシンを１０ｇ以上およびカルシトリオール、エルデカルシトール、アルファカルシドールまたはファレカルシトリオールを４ｎｇ以上配合することを特徴とする感染症治療剤。
  9. 剤型がパウダー製剤であることを特徴とする請求項８記載の感染症治療剤。
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