WO2020226151A1 - Antitussive for pertussis and method for screening antitussive for pertussis - Google Patents
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Abstract
Provided are: an antitussive for pertussis that comprises a bradykinin B2 receptor antagonist or a transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) antagonist as an active ingredient; and a method for screening an antitussive for pertussis, said method comprising a step for selecting a substance that inhibits the activity of a bradykinin B2 receptor or TRPV1.
Description
本発明は、百日咳に対する鎮咳薬および百日咳に対する鎮咳薬のスクリーニング方法に関するものである。
The present invention relates to a method for screening an antitussive for whooping cough and an antitussive for whooping cough.
百日咳は百日咳菌（Bordetella pertussis）の気道感染によって起こる呼吸器感染症であり、連続性の咳嗽発作や咳嗽後の嘔吐、吸気性の笛声（whoop）などの特徴的な症状を呈する。百日咳は、主に発展途上国での乳幼児感染が最も問題視されているが、先進国においても乳幼児期に接種したワクチン効果の減弱した青年・成人層の感染やワクチン成分と抗原性の異なる抗原変異株の出現で患者数が増加しており、いわゆる再興感染症の一つに挙げられている。日本国内では、百日咳は2017年まで小児科定点把握疾患（全国約3,000ヶ所の小児科定点医療機関で集計）に分類され、年間1,500～6,500人が報告されていた。2018年からは、青年、成人層の患者数の増加などの影響を考慮し、全数把握疾患に指定されている。
Pertussis is a respiratory infection caused by respiratory tract infection of Bordetella pertussis, and exhibits characteristic symptoms such as continuous coughing attacks, vomiting after coughing, and inspiratory whistle (whoop). Pertussis is the most problematic for infant infections mainly in developing countries, but even in developed countries, infections in adolescents and adults with diminished vaccine efficacy during infancy and antigens with different antigenicity from vaccine components The number of patients is increasing with the advent of mutant strains, and it is listed as one of the so-called re-emerging infectious diseases. In Japan, whooping cough was classified as a pediatric fixed-point grasping disease (aggregated by about 3,000 pediatric fixed-point medical institutions nationwide) until 2017, and 1,500 to 6,500 people were reported annually. From 2018, it has been designated as a 100% grasp disease in consideration of the effects such as an increase in the number of adolescents and adults.
百日咳菌の潜伏期間は7～10日であり、発症から回復までに数週間を必要とする。百日咳の症状は病期により、カタル期（感冒症状、1～2週間）、痙咳期（発作性の咳、3～6週間）、回復期（6週間以降）に分けられる。特に、痙咳期に見られる百日咳特有の咳発作は、患者に多大な負荷を強い、ときに死因に直結する。しかし、その発症機構が現在まで不明であるために、臨床現場では対症療法を持って処置せざるを得ないのが現状である。通常、百日咳の治療には、感染菌の排除のためにエリスロマイシン、クラリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質が用いられるが、典型的な咳発作が認められる痙咳期以降では咳に対する改善効果は期待できない。一般的な去痰薬、鎮咳薬、鎮静薬なども百日咳には有効でないケースが多い。また、咳発作が重篤化した場合は、人工呼吸管理が必要となるため、入院加療が必要となる。
The incubation period of B. pertussis is 7 to 10 days, and it takes several weeks from the onset to recovery. The symptoms of whooping cough are divided into catarrhal stage (cold symptoms, 1 to 2 weeks), spastic cough (paroxysmal cough, 3 to 6 weeks), and convalescent stage (6 weeks or later) according to the stage. In particular, the coughing attacks peculiar to whooping cough, which are seen during the coughing period, place a heavy burden on the patient and are sometimes directly linked to the cause of death. However, since the onset mechanism is unknown until now, the current situation is that there is no choice but to treat with symptomatic treatment in clinical practice. Macrolide antibiotics such as erythromycin and clarithromycin are usually used to treat whooping cough to eliminate infectious bacteria, but after the coughing period when typical cough attacks are observed, the effect of improving cough is I can't expect it. In many cases, general expectorants, antitussives, and sedatives are not effective for whooping cough. In addition, if the cough attack becomes severe, artificial respiration management is required, so hospitalization is required.
これらの背景から、百日咳発症後の咳発作に有効な治療薬が望まれているが、最も効果の期待できる根治治療に繋がる研究は全く進んでいない。この原因として、百日咳菌がヒトのみを宿主とするために、百日咳の咳発作を再現する汎用性の高い動物モデルが確立できていない点が挙げられる。本課題を解決すべく、発明者らは、百日咳菌および菌体破砕液をマウスに経鼻投与し、百日咳の咳発作を再現するマウス百日咳モデルを作製した（特許文献１）。この動物モデルを用いることで、百日咳の治療法を探索するためのスクリーニングが可能となった。
From these backgrounds, effective therapeutic agents for cough attacks after the onset of whooping cough are desired, but research leading to the most effective curative treatment has not progressed at all. The reason for this is that since Bordetella pertussis uses only humans as a host, a highly versatile animal model that reproduces the coughing attack of pertussis has not been established. In order to solve this problem, the inventors nasally administered Bordetella pertussis and bacterial cell disruption solution to mice to prepare a mouse pertussis model that reproduces a whooping cough attack (Patent Document 1). Using this animal model, screening was made possible to search for a cure for whooping cough.
一般的な咳発作は、様々な環境要因や内在性化合物によって気道の求心性感覚神経が刺激されることで誘発される神経反射応答である。この咳反射は、神経繊維に分布する多種多様な刺激受容体およびメディエーターが複雑に関連しあって形成されている。例えば、炎症メディエーターの一種であるブラジキニンは、恒常発現型であるB2受容体を介して咳発作を誘発する（非特許文献１）。ブラジキニンによる咳発作に関しては、炎症誘導型のB1受容体が関与するとの報告もある（非特許文献２）。これらの受容体を介したブラジキニンによる咳発作は、イオンチャネルであるtransient receptor potential（TRP）V1の活性化により引き起こされることが報告されているが（非特許文献３）、近年の研究により、ブラジキニンにより活性化される他のTRPチャネル（TRPV4、TRPA1など）も咳発作に関与する可能性が指摘されている（非特許文献４）。
A common cough attack is a nerve reflex response induced by stimulation of the afferent sensory nerves of the airways by various environmental factors and endogenous compounds. This cough reflex is formed by a complex association of a wide variety of stimulus receptors and mediators distributed in nerve fibers. For example, bradykinin, a type of inflammatory mediator, induces a cough attack via the constitutively expressed B2 receptor (Non-Patent Document 1). It has also been reported that an inflammation-induced B1 receptor is involved in a cough attack caused by bradykinin (Non-Patent Document 2). It has been reported that coughing attacks caused by bradykinin via these receptors are caused by activation of the ion channel transient receptor potential (TRP) V1 (Non-Patent Document 3), but recent studies have shown that bradykinin It has been pointed out that other TRP channels activated by (TRPV4, TRPA1, etc.) may also be involved in cough attacks (Non-Patent Document 4).
また、プロスタグランジン（PG）類、特にPGE2は、EP受容体（EP1～4）を介してブラジキニンによるTRPの活性化を増強することで咳発作に関与していることが報告されている（非特許文献５）。この他の例として、一酸化窒素やアナンダミドがTRPチャネルの活性化を介して咳発作を引き起こすこと（非特許文献６、７）、サブスタンスPやニューロキニン（NK）A、Bに代表されるペプチド性神経伝達物質タキキニン類がNK受容体（NK1、NK2、NK3など）を介して咳発作を誘発することなどが報告されている（非特許文献８）。
In addition, prostaglandins (PGs), especially PGE2, have been reported to be involved in cough attacks by enhancing the activation of TRP by bradykinin via EP receptors (EP1-4) (). Non-Patent Document 5). Other examples include that nitric oxide and anandamide cause cough attacks through activation of TRP channels (Non-Patent Documents 6 and 7), peptides represented by substances P and neurokinins (NK) A and B. It has been reported that tachykinins, which are sex neurotransmitters, induce cough attacks via NK receptors (NK1, NK2, NK3, etc.) (Non-Patent Document 8).
このように、一般的な咳発作についても、そのメカニズムの全容はいまだ明らかとなっておらず、百日咳における咳発作が、上記の一般的な咳発作に関与する受容体やメディエーターを介して誘発されていることは報告されていない。
Thus, the mechanism of common cough attacks has not yet been clarified, and cough attacks in whooping cough are induced via the receptors and mediators involved in the above-mentioned general cough attacks. It has not been reported to be.
本発明は、百日咳における咳発作が関与する受容体を見出し、百日咳に対する鎮咳薬および百日咳に対する鎮咳薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
An object of the present invention is to find a receptor involved in a cough attack in whooping cough and to provide a screening method for an antitussive for whooping cough and an antitussive for whooping cough.
本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１（transient receptor potential vanilloid 1）アンタゴニストを有効成分とする百日咳に対する鎮咳薬。
［２］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバント、デルチバントまたはファシチバントである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［３］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバントである前記［２］に記載の鎮咳薬。
［４］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがブラジキニンＢ２受容体と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［５］ＴＲＰＶ１アンタゴニストがカプサゼピン、ヨードレシニフェラトキシン、ルテニウムレッドまたはα-スピナステロールである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［６］ＴＲＰＶ１アンタゴニストがＴＲＰＶ１と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［７］ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の活性化を阻害する物質を選択する工程を含む、百日咳に対する鎮咳薬のスクリーニング方法。
［８］ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１を発現する細胞と被験物質とを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の下流シグナルを測定する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質とブラジキニンを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する工程とを含む、前記［７］に記載のスクリーニング方法。 The present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
[1] An antitussive for whooping cough containing a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) antagonist as an active ingredient.
[2] The antitussive agent according to the above [1], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squidibant, deltibant or fasitibant.
[3] The antitussive drug according to the above [2], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squid.
[4] The antitussive agent according to the above [1], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to the bradykinin B2 receptor.
[5] The antitussive agent according to the above [1], wherein the TRPV1 antagonist is capsazepine, iodoresiniferatoxin, ruthenium red or α-spinasterol.
[6] The antitussive agent according to the above [1], wherein the TRPV1 antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to TRPV1.
[7] A method for screening an antitussive for whooping cough, which comprises a step of selecting a substance that inhibits activation of bradykinin B2 receptor or TRPV1.
[8] A step of contacting a cell expressing the bradykinin B2 receptor or TRPV1 with a test substance, a step of measuring a downstream signal of the bradykinin B2 receptor or TRPV1, and a step of measuring in the cells not in contact with the test substance. The screening method according to the above [7], which comprises a step of selecting a test substance that lowers the downstream signal as compared with the downstream signal.
[9] A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor with a test substance and bradykinin, a step of confirming the binding between the bradykinin B2 receptor and bradykinin, and a step of bradykinin measured in the cells not in contact with the test substance. The screening method according to the above [7], which comprises a step of selecting a test substance that inhibits the binding of bradykinin B2 receptor to bradykinin as compared with the binding of B2 receptor to bradykinin.
［１］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１（transient receptor potential vanilloid 1）アンタゴニストを有効成分とする百日咳に対する鎮咳薬。
［２］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバント、デルチバントまたはファシチバントである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［３］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバントである前記［２］に記載の鎮咳薬。
［４］ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがブラジキニンＢ２受容体と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［５］ＴＲＰＶ１アンタゴニストがカプサゼピン、ヨードレシニフェラトキシン、ルテニウムレッドまたはα-スピナステロールである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［６］ＴＲＰＶ１アンタゴニストがＴＲＰＶ１と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［１］に記載の鎮咳薬。
［７］ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の活性化を阻害する物質を選択する工程を含む、百日咳に対する鎮咳薬のスクリーニング方法。
［８］ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１を発現する細胞と被験物質とを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の下流シグナルを測定する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質とブラジキニンを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する工程とを含む、前記［７］に記載のスクリーニング方法。 The present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
[1] An antitussive for whooping cough containing a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) antagonist as an active ingredient.
[2] The antitussive agent according to the above [1], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squidibant, deltibant or fasitibant.
[3] The antitussive drug according to the above [2], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squid.
[4] The antitussive agent according to the above [1], wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to the bradykinin B2 receptor.
[5] The antitussive agent according to the above [1], wherein the TRPV1 antagonist is capsazepine, iodoresiniferatoxin, ruthenium red or α-spinasterol.
[6] The antitussive agent according to the above [1], wherein the TRPV1 antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to TRPV1.
[7] A method for screening an antitussive for whooping cough, which comprises a step of selecting a substance that inhibits activation of bradykinin B2 receptor or TRPV1.
[8] A step of contacting a cell expressing the bradykinin B2 receptor or TRPV1 with a test substance, a step of measuring a downstream signal of the bradykinin B2 receptor or TRPV1, and a step of measuring in the cells not in contact with the test substance. The screening method according to the above [7], which comprises a step of selecting a test substance that lowers the downstream signal as compared with the downstream signal.
[9] A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor with a test substance and bradykinin, a step of confirming the binding between the bradykinin B2 receptor and bradykinin, and a step of bradykinin measured in the cells not in contact with the test substance. The screening method according to the above [7], which comprises a step of selecting a test substance that inhibits the binding of bradykinin B2 receptor to bradykinin as compared with the binding of B2 receptor to bradykinin.
本発明により百日咳に対する鎮咳薬を提供することができる。有効成分として既に臨床使用されているブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストを用いることができるので、安全性の高い医薬を提供することができる。また、本発明のスクリーニング方法により、百日咳の鎮咳に有用な物質を取得することができ、新規な百日咳に対する鎮咳薬を提供することができる。
According to the present invention, an antitussive for whooping cough can be provided. Since a bradykinin B2 receptor antagonist that has already been clinically used can be used as the active ingredient, a highly safe drug can be provided. Further, by the screening method of the present invention, a substance useful for antitussive of whooping cough can be obtained, and a novel antitussive drug for whooping cough can be provided.
〔百日咳に対する鎮咳薬〕
本発明は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１（transient receptor potential vanilloid 1）アンタゴニストを有効成分とする百日咳に対する鎮咳薬を提供する。本発明の鎮咳薬の有効成分は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１アンタゴニストであれば特に限定されず、公知のブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１アンタゴニストから適宜選択することができる。ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストとしては、例えば、イカチバント（Icatibant）、デルチバント（Deltibant）、ファシチバント（Fasitibant）などが挙げられる。ＴＲＰＶ１アンタゴニストとしては、例えば、カプサゼピン（Capsazepine）、ヨードレシニフェラトキシン（Iodoresiniferatoxin）、ルテニウムレッド（Ruthenium red）、α-スピナステロール（α-Spinasterol）などが挙げられる。 [Antitussive for whooping cough]
The present invention provides an antitussive for whooping cough containing a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) antagonist as an active ingredient. The active ingredient of the antitussive agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a bradykinin B2 receptor antagonist or TRPV1 antagonist, and can be appropriately selected from known bradykinin B2 receptor antagonists or TRPV1 antagonists. Bradykinin B2 receptor antagonists include, for example, Icatibant, Deltibant, Fasitibant and the like. Examples of TRPV1 antagonists include Capsazepine, Iodoresiniferatoxin, Ruthenium red, α-Spinasterol and the like.
本発明は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１（transient receptor potential vanilloid 1）アンタゴニストを有効成分とする百日咳に対する鎮咳薬を提供する。本発明の鎮咳薬の有効成分は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１アンタゴニストであれば特に限定されず、公知のブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１アンタゴニストから適宜選択することができる。ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストとしては、例えば、イカチバント（Icatibant）、デルチバント（Deltibant）、ファシチバント（Fasitibant）などが挙げられる。ＴＲＰＶ１アンタゴニストとしては、例えば、カプサゼピン（Capsazepine）、ヨードレシニフェラトキシン（Iodoresiniferatoxin）、ルテニウムレッド（Ruthenium red）、α-スピナステロール（α-Spinasterol）などが挙げられる。 [Antitussive for whooping cough]
The present invention provides an antitussive for whooping cough containing a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) antagonist as an active ingredient. The active ingredient of the antitussive agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a bradykinin B2 receptor antagonist or TRPV1 antagonist, and can be appropriately selected from known bradykinin B2 receptor antagonists or TRPV1 antagonists. Bradykinin B2 receptor antagonists include, for example, Icatibant, Deltibant, Fasitibant and the like. Examples of TRPV1 antagonists include Capsazepine, Iodoresiniferatoxin, Ruthenium red, α-Spinasterol and the like.
イカチバントは、遺伝性血管性浮腫治療薬の有効成分として臨床使用されている。イカチバント酢酸塩を含む注射剤が日本において医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。本発明に使用するイカチバントはイカチバント酢酸塩であってもよい。イカチバント酢酸塩に関する情報は以下のとおりである。
一般名：イカチバント酢酸塩
化学名：D-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-(R)-4-hydroxy-L-prolylglycyl-3-(thiophen-2-yl)-L-alanyl-L-seryl-(R)-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-yl)carbonyl]-(2S,3aS,7aS)-[(hexahydroindolin-2-yl)carbonyl]-L-arginine triacetate
分子式：C59H89N19O13S・3C2H4O2
分子量：1,484.68
構造式： Ikatibant is clinically used as an active ingredient in a therapeutic agent for hereditary angioedema. An injection containing squidibant acetate has been approved as a medical drug in Japan and is listed in the NHI price list. The squid ibant used in the present invention may be squid ibant acetate. Information on squidibant acetate is as follows.
Generic name: Ikatibant acetate Chemical name: D-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl- (R) -4-hydroxy-L-prolylglycyl-3- (thiophen-2-yl) -L-alanyl-L-seryl- (R)-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-yl) carbonyl]-(2S, 3aS, 7aS)-[(hexahydroindolin-2-yl) carbonyl]-L-arginine triacetate
Molecular formula: C 59 H 89 N 19 O 13 S ・ 3C 2 H 4 O 2
Molecular weight: 1,484.68
Structural formula:
一般名：イカチバント酢酸塩
化学名：D-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-(R)-4-hydroxy-L-prolylglycyl-3-(thiophen-2-yl)-L-alanyl-L-seryl-(R)-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-yl)carbonyl]-(2S,3aS,7aS)-[(hexahydroindolin-2-yl)carbonyl]-L-arginine triacetate
分子式：C59H89N19O13S・3C2H4O2
分子量：1,484.68
構造式： Ikatibant is clinically used as an active ingredient in a therapeutic agent for hereditary angioedema. An injection containing squidibant acetate has been approved as a medical drug in Japan and is listed in the NHI price list. The squid ibant used in the present invention may be squid ibant acetate. Information on squidibant acetate is as follows.
Generic name: Ikatibant acetate Chemical name: D-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl- (R) -4-hydroxy-L-prolylglycyl-3- (thiophen-2-yl) -L-alanyl-L-seryl- (R)-[(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-yl) carbonyl]-(2S, 3aS, 7aS)-[(hexahydroindolin-2-yl) carbonyl]-L-arginine triacetate
Molecular formula: C 59 H 89 N 19 O 13 S ・ 3C 2 H 4 O 2
Molecular weight: 1,484.68
Structural formula:
デルチバント（KEGG DRUG エントリ: D03677、CAS登録番号：140661-97-8）は、組成式：C128H194N40O28S2、分子量：2805.2912である。
Delchibant (KEGG DRUG entry: D03677, CAS Registry Number: 140661-97-8) has a composition formula: C 128 H 194 N 40 O 28 S 2 , a molecular weight: 2805.2912.
ファシチバント（CAS登録番号：869939-83-3）は、分子式：C36H49Cl2N6O6S+、分子量：764.784、IUPAC Name：[(4S)-4-amino-5-[4-[4-[[2,4-dichloro-3-[(2,4-dimethylquinolin-8-yl)oxymethyl]phenyl]sulfonylamino]oxane-4-carbonyl]piperazin-1-yl]-5-oxopentyl]-trimethylazaniumである。
Phenylibant (CAS Registry Number: 869939-83-3) has a molecular formula: C 36 H 49 C l2 N 6 O 6 S + , a molecular weight: 764.784, IUPAC Name: [(4S) -4-amino-5- [4- [4-[[2,4-dichloro-3-[(2,4-dimethylquinolin-8-yl) oxymethyl] phenyl] sulfonylamino] oxane-4-carbonyl] piperazin-1-yl] -5-oxopentyl] -trimethylazanium Is.
カプサゼピンは、カプサイシンのアナログでありＴＲＰＶ１アンタゴニストとして知られている。カプサゼピンに関する情報は以下のとおりである。
一般名：カプサゼピン
CAS登録番号：138977-28-3
化学名：N-[2-(4-Chlorophenyl)ethyl]-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-benzazepine-2-carbothioamide
分子式：C19H21ClN2O2S
分子量：376.9
構造式： Capsazepine is an analog of capsaicin and is known as a TRPV1 antagonist. Information about capsazepine is as follows.
Generic name: Capsazepin
CAS Registry Number: 138977-28-3
Chemical name: N- [2- (4-Chlorophenyl) ethyl] -1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-benzazepine-2-carbothioamide
Molecular formula: C 19 H 21 ClN 2 O 2 S
Molecular weight: 376.9
Structural formula:
一般名：カプサゼピン
CAS登録番号：138977-28-3
化学名：N-[2-(4-Chlorophenyl)ethyl]-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-benzazepine-2-carbothioamide
分子式：C19H21ClN2O2S
分子量：376.9
構造式： Capsazepine is an analog of capsaicin and is known as a TRPV1 antagonist. Information about capsazepine is as follows.
Generic name: Capsazepin
CAS Registry Number: 138977-28-3
Chemical name: N- [2- (4-Chlorophenyl) ethyl] -1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-benzazepine-2-carbothioamide
Molecular formula: C 19 H 21 ClN 2 O 2 S
Molecular weight: 376.9
Structural formula:
ヨードレシニフェラトキシンは、CAS登録番号：535974-91-5、分子式：C37H39IO9、分子量：754.614、IUPAC Name：[(1R,2R,6R,10S,11R,13S,15R,17R)-13-benzyl-6-hydroxy-4,17-dimethyl-5-oxo-15-prop-1-en-2-yl-12,14,18-trioxapentacyclo[11.4.1.01,10.02,6.011,15]octadeca-3,8-dien-8-yl]methyl 2-(4-hydroxy-3-iodo-5-methoxyphenyl)acetateである。
Iodoresiniferatoxin has CAS registration number: 535974-91-5, molecular formula: C 37 H 39 IO 9 , molecular weight: 754.614, IUPAC Name: [(1R, 2R, 6R, 10S, 11R, 13S, 15R, 17R). ) -13-benzyl-6-hydroxy-4,17-dimethyl-5-oxo-15-prop-1-en-2-yl-12,14,18-trioxapentacyclo [11.4.1.01,10.02,6.011,15] octadeca-3,8-dien-8-yl] methyl 2- (4-hydroxy-3-iodo-5-methoxyphenyl) acetate.
ルテニウムレッドは、CAS登録番号：11103-72-3、分子式：Cl6H46N14O2Ru3、分子量：790.374である。
Ruthenium red has a CAS Registry Number: 11103-72-3, a molecular formula: Cl 6 H 46 N 14 O 2 Ru 3 , and a molecular weight: 790.374.
α－スピナステロールは、CAS登録番号：481-18-5、分子式：C29H48O、分子量：412.702、IUPAC Name：(3S,5S,9R,10S,13R,14R,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-olである。
α-Spinasterol has CAS Registry Number: 481-18-5, Molecular Formula: C 29 H 48 O, Molecular Weight: 412.702, IUPAC Name: (3S, 5S, 9R, 10S, 13R, 14R, 17R) -17-[ (E, 2R, 5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl] -10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,9,11,12,14,15 , 16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-3-ol.
ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストは、ブラジキニンＢ２受容体と特異的に結合する抗体またはペプチドであってもよい。抗体またはペプチドがブラジキニンＢ２受容体と結合することにより、本来のリガンドの結合を阻害することができる。同様に、ＴＲＰＶ１アンタゴニストは、ＴＲＰＶ１と特異的に結合する抗体またはペプチドであってもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。抗体およびペプチドは、いずれも公知の方法により製造することができる。
The bradykinin B2 receptor antagonist may be an antibody or peptide that specifically binds to the bradykinin B2 receptor. By binding the antibody or peptide to the bradykinin B2 receptor, the binding of the original ligand can be inhibited. Similarly, the TRPV1 antagonist may be an antibody or peptide that specifically binds to TRPV1. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. It may also be a complete antibody molecule or an antibody fragment capable of specifically binding to an antigen (eg, Fab, F (ab') 2, Fab', Fv, scFv, etc.). The antibody may be a human chimeric antibody or a humanized antibody. Both the antibody and the peptide can be produced by a known method.
本発明の鎮咳薬は、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１アンタゴニストを有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
The antitussive drug of the present invention contains a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 antagonist as an active ingredient and can be formulated according to conventional means. For example, formulations for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets, film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Examples include syrups, emulsions and suspensions. These formulations are manufactured by known methods and contain carriers, diluents or excipients commonly used in the formulation field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets. For example, injections, suppositories, etc. are used as preparations for parenteral administration, and the injections are intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, drip injection, intra-articular injection. Including dosage forms such as. Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the active ingredient in a sterile aqueous or oily solution usually used for injections. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, an isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents are used, and suitable solubilizing agents such as alcohol (for example, ethanol) and polyalcohol (for example) are used. , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50, etc.) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the active ingredient with a conventional suppository base.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。
The formulations thus obtained are safe and low toxicity, and therefore, for example, orally to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Alternatively, it can be administered parenterally. When the active ingredient is a peptide or antibody, as an injection or infusion formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, parenteral routes of administration, such as intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous or topical. It is preferable to administer to.
本発明の鎮咳薬には、有効成分を０．００１～５０質量％、好ましくは０．０１～１０質量％、更に好ましくは０．１～１質量％含有することができる。本発明の鎮咳薬の投与量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５～７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ～４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ～２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
The antitussive agent of the present invention can contain 0.001 to 50% by mass, preferably 0.01 to 10% by mass, and more preferably 0.1 to 1% by mass of the active ingredient. The dose of the antitussive drug of the present invention is appropriately set in consideration of the severity of the disease, the age, body weight, sex, medical history, type of active ingredient, and the like of the patient. When an average human having a body weight of about 65 to 70 kg is targeted, about 0.02 mg to 4000 mg per day is preferable, and about 0.1 mg to 200 mg is more preferable. The total daily dose may be a single dose or a divided dose.
〔スクリーニング方法〕
本発明は、百日咳に対する鎮咳薬またはその候補物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の活性化を阻害する物質を選択する工程を含むものであればよい。 [Screening method]
The present invention provides a method for screening an antitussive drug or a candidate substance thereof for whooping cough. The screening method of the present invention may include a step of selecting a substance that inhibits the activation of bradykinin B2 receptor or TRPV1.
本発明は、百日咳に対する鎮咳薬またはその候補物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の活性化を阻害する物質を選択する工程を含むものであればよい。 [Screening method]
The present invention provides a method for screening an antitussive drug or a candidate substance thereof for whooping cough. The screening method of the present invention may include a step of selecting a substance that inhibits the activation of bradykinin B2 receptor or TRPV1.
ブラジキニンＢ２受容体はＧタンパク質共役型受容体であり、三量体Ｇタンパク質のＧｉ／ｏ、Ｇｑ/１１およびＧｓが共役している。そのためブラジキニンＢ２受容体へのブラジキニンの結合により、Ｇｉ／ｏの下流ではホスホリパーゼＡ２の活性化を通じてプロスタグランジン（ＰＧＩ２やＰＧＥ２など）が生成される。Ｇｑ/１１を通じてはホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）が活性化され、ホスファチジルイノシトール２リン酸の分解によるジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸の生成、それに続いて細胞内カルシウム濃度の上昇とプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化が起こる（Choi and Hwang, Biomol. Ther. 26:255-267, 2018）。Ｇｓの下流ではアデニル酸サイクラーゼの活性化によりｃＡＭＰが生成される（Liebmann et al, Biochem. J. 313:109-118, 1996）。
The bradykinin B2 receptor is a G protein-coupled receptor, and the trimer G proteins Gi / o, Gq / 11 and Gs are conjugated. Therefore, the binding of bradykinin to the bradykinin B2 receptor produces prostaglandins (PGI2, PGE2, etc.) downstream of Gi / o through activation of phospholipase A2. Phospholipase Cβ (PLCβ) is activated through Gq / 11 to produce diacylglycerol and inositol triphosphate by degradation of phosphatidylinositol diphosphate, followed by an increase in intracellular calcium concentration and protein kinase C (PKC). Activation occurs (Choi and Hwang, Biomol. Ther. 26: 255-267, 2018). Downstream of Gs, cAMP is produced by activation of adenylate cyclase (Liebmann et al, Biochem. J. 313: 109-118, 1996).
ＴＰＲＶ１は陽イオンチャネルであり、カプサイシンなどのリガンドの結合、熱刺激、酸などの複数の痛み刺激により開口し、陽イオン（Ｎａ＋、Ｃａ２＋など）が細胞外から細胞内に流入することで脱分極が引き起こされる。その結果として生じた活動電位が信号として中枢へと伝えられ、咳嗽反射や疼痛などを惹起する。
TPRV1 is a cation channel that is opened by binding of ligands such as capsaicin, thermal stimulation, and multiple pain stimuli such as acid, and cations (Na + , Ca 2+, etc.) flow into the cell from the outside. Depolarization is caused. The resulting action potential is transmitted as a signal to the central nervous system, causing the cough reflex and pain.
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は特に限定されず、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等であってもよい。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これらの被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が好ましい。
The test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and is limited to nucleic acids, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, and mammals. The tissue extract, plasma, etc. may be used. The test substance may be a novel substance or a known substance. These test substances may form salts. As the salt of the test substance, a salt with a physiologically acceptable acid or base is preferable.
本発明のスクリーニング方法は、例えば以下の工程（１）～（３）を含むものであってもよい。
（１）ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１を発現する細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の下流シグナルを測定する工程、および
（３）被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する工程。 The screening method of the present invention may include, for example, the following steps (1) to (3).
(1) A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor or TRPV1 with a test substance,
(2) A step of measuring the downstream signal of bradykinin B2 receptor or TRPV1 and (3) a step of selecting a test substance that lowers the downstream signal as compared with the downstream signal measured in the cells not in contact with the test substance. ..
（１）ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１を発現する細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の下流シグナルを測定する工程、および
（３）被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する工程。 The screening method of the present invention may include, for example, the following steps (1) to (3).
(1) A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor or TRPV1 with a test substance,
(2) A step of measuring the downstream signal of bradykinin B2 receptor or TRPV1 and (3) a step of selecting a test substance that lowers the downstream signal as compared with the downstream signal measured in the cells not in contact with the test substance. ..
工程（１）において、ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞としては、脊髄後根神経節（ＤＲＧ：dorsal root ganglion）ニューロン、線維芽細胞、レチノイン酸により神経細胞に分化させたＰ１９細胞、神経芽細胞腫とグリオーマのハイブリッド細胞株ＮＧ１０８－１５、ブラジキニンＢ２受容体を強制発現させた株化細胞（例えば、HEK293、CHO等）などを使用することができる。ＴＲＰＶ１を発現する細胞としては、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、線維芽細胞、神経芽細胞腫とグリオーマのハイブリッド細胞株ＮＧ１０８－１５、ＴＲＰＶ１を強制発現させた株化細胞（例えば、HEK293、CHO等）などを使用することができる。
In step (1), the cells expressing the brazikinin B2 receptor include dorsal root ganglion (DRG) neurons, fibroblasts, P19 cells differentiated into neurons by retinoic acid, and neuroblasts. A hybrid cell line NG108-15 of tumor and glioma, a cell line in which bradikinin B2 receptor is forcibly expressed (for example, HEK293, CHO, etc.) can be used. The cells expressing TRPV1 include spinal posterior root ganglion (DRG) neurons, fibroblasts, neuroblastoma-glioma hybrid cell line NG108-15, and TRPV1 forced expression lined cells (eg, HEK293, CHO etc.) can be used.
工程（１）において、細胞と被験物質を接触させる方法は、例えば、細胞を培養するための培養液に被験物質を添加する方法などが挙げられる。なお、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
Examples of the method of bringing the cells into contact with the test substance in the step (1) include a method of adding the test substance to the culture medium for culturing the cells. It is preferable to provide a control group that does not come into contact with the test substance.
工程（２）において、ブラジキニンＢ２受容体の下流シグナルとしては、アラキドン酸、プロスタグランジン、イノシトールリン酸、ジアシルグリセロール、ｃＡＭＰなどが挙げられ、これらを測定することにより、ブラジキニンＢ２受容体の活性化を評価することができる。ＴＲＰＶ１の下流シグナルとしては、活動電位の発生、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇、神経ペプチド（例えば、ニューロキニンＡ、サブスタンスＰ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド等）の遊離抑制などが挙げられる。それゆえ、活動電位、細胞内Ｃａ２＋濃度、神経ペプチド濃度を測定することにより、ＴＲＰＶ１の活性化を評価することができる。上記評価項目の測定方法は、公知の測定方法から適宜選択することができる。
In step (2), examples of downstream signals of bradykinin B2 receptor include arachidonic acid, prostaglandin, inositol phosphate, diacylglycerol, cAMP, etc., and by measuring these, activation of bradykinin B2 receptor is performed. Can be evaluated. Examples of downstream signals of TRPV1 include the generation of action potentials, an increase in intracellular Ca 2+ concentration, and suppression of release of neuropeptides (for example, neurokinin A, substance P, calcitonin gene-related peptides, etc.). Therefore, the activation of TRPV1 can be evaluated by measuring the action potential, the intracellular Ca 2+ concentration, and the neuropeptide concentration. The measurement method of the above evaluation items can be appropriately selected from known measurement methods.
工程（３）では、被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する。被験物質が下流シグナルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞における下流シグナルと比較して９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
In step (3), a test substance that lowers the downstream signal as compared with the downstream signal measured in the cells that are not in contact with the test substance is selected. The degree to which the test substance reduces the downstream signal is not particularly limited, but for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% as compared with the downstream signal in cells not in contact with the test substance. Hereinafter, a test substance that reduces the amount to 40% or less and 30% or less may be selected.
本発明のスクリーニング方法は、例えば以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むものであってもよい。
（ａ）ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質とブラジキニンを接触させる工程、
（ｂ）ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する工程、および
（ｃ）被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する工程。 The screening method of the present invention may include, for example, the following steps (a) to (c).
(A) A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor with a test substance and bradykinin,
(B) The step of confirming the binding between bradykinin B2 receptor and bradykinin, and (c) the binding of bradykinin B2 receptor and bradykinin measured in the cells not in contact with the test substance, as compared with the binding of bradykinin B2 receptor. The step of selecting a test substance that inhibits the binding of the body to bradykinin.
（ａ）ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質とブラジキニンを接触させる工程、
（ｂ）ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する工程、および
（ｃ）被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する工程。 The screening method of the present invention may include, for example, the following steps (a) to (c).
(A) A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor with a test substance and bradykinin,
(B) The step of confirming the binding between bradykinin B2 receptor and bradykinin, and (c) the binding of bradykinin B2 receptor and bradykinin measured in the cells not in contact with the test substance, as compared with the binding of bradykinin B2 receptor. The step of selecting a test substance that inhibits the binding of the body to bradykinin.
工程（ａ）のブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞には、上記工程（１）のブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と同じ細胞を使用することができる。ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質を接触させる方法も、上記工程（１）と同じように行うことができる。
As the cell expressing the bradykinin B2 receptor in the step (a), the same cell as the cell expressing the bradykinin B2 receptor in the above step (1) can be used. The method of bringing the test substance into contact with the cells expressing the bradykinin B2 receptor can also be carried out in the same manner as in the above step (1).
工程（ｂ）において、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する方法は特に限定されず、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合レベルを確認できる公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法などを好適に用いることができる。
In the step (b), the method for confirming the binding between the bradykinin B2 receptor and bradykinin is not particularly limited, and a known method capable of confirming the binding level between the bradykinin B2 receptor and bradykinin can be appropriately selected and used. it can. For example, an ELISA method, a fluorescent polarization method, or the like can be preferably used.
工程（ｃ）では、被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する。被験物質がブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の両者の結合レベルと比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
In step (c), a test substance that inhibits the binding between bradykinin B2 receptor and bradykinin is selected as compared with the binding between bradykinin B2 receptor and bradykinin measured in the cells that are not in contact with the test substance. The degree to which the test substance lowers the binding level between the bradykinin B2 receptor and bradykinin is not particularly limited, but for example, 90% or less and 80% or less as compared with the binding level of both when the test substance is not in contact with the test substance. , 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less may be selected.
本発明のスクリーニング方法により選択された被験物質は、百日咳に対する鎮咳薬の有効成分として有用である。また、本発明のスクリーニング方法により選択された被験物質は、百日咳に対する鎮咳薬の有効成分の候補物質として有用であり、更なるスクリーニングを経て、百日咳に対する鎮咳薬の有効成分となる可能性を有する。
The test substance selected by the screening method of the present invention is useful as an active ingredient of an antitussive for whooping cough. In addition, the test substance selected by the screening method of the present invention is useful as a candidate substance for an active ingredient of an antitussive drug for whooping cough, and may become an active ingredient of an antitussive drug for whooping cough after further screening.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
〔実施例１：咳発作に関与する受容体のアンタゴニストによる百日咳発作抑制の検討〕
１－１ 実験材料および方法
（１）百日咳菌の菌体破砕液の調製
百日咳菌18323株を0.8%ハイポリペプトン、1%グリセロール、15%馬脱繊維血液を含むBorder-Gengou寒天培地（Becton Dickinson）に播種し、37℃で3日間培養した。複数のコロニーをStainer-Scholte液体培地（Stainer, J Gen Microbiol, 1970）に懸濁し、OD650=0.2となるように調整した後、37℃で12～14時間振とう培養した。菌液をBioruptor（Cosmo Bio）を用いて超音波破砕した後、遠心し（12,000×g、5分、4℃）、上清を0.22μmフィルター（Millex-GV；Merck Millipore）でろ過することにより菌体を完全に除去した。この溶液を百日咳菌の菌体破砕液とし、Micro BCA Protein Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いてタンパク質濃度を決定した後、マウスへの投与に使用するまで－80℃で保存した。 [Example 1: Examination of suppression of whooping cough attack by an antagonist of a receptor involved in cough attack]
1-1 Experimental materials and methods (1) Preparation of B. pertussis cell disruption solution Border-Gengou agar medium (Becton Dickinson) containing 0.8% high polypeptone, 1% glycerol, and 15% horse defibrosis blood of 18323 strains of B. pertussis. Was sown and cultured at 37 ° C for 3 days. Multiple colonies were suspended in Stainer-Scholte liquid medium (Stainer, J Gen Microbiol, 1970), adjusted to OD650 = 0.2, and then shake-cultured at 37 ° C. for 12 to 14 hours. By ultrasonically crushing the bacterial solution using Bioruptor (Cosmo Bio), centrifuging (12,000 × g, 5 minutes, 4 ° C), and filtering the supernatant with a 0.22 μm filter (Millex-GV; Merck Millipore). The cells were completely removed. This solution was used as a cell disruption solution of Bordetella pertussis, and the protein concentration was determined using the Micro BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific), and then stored at -80 ° C until it was used for administration to mice.
１－１ 実験材料および方法
（１）百日咳菌の菌体破砕液の調製
百日咳菌18323株を0.8%ハイポリペプトン、1%グリセロール、15%馬脱繊維血液を含むBorder-Gengou寒天培地（Becton Dickinson）に播種し、37℃で3日間培養した。複数のコロニーをStainer-Scholte液体培地（Stainer, J Gen Microbiol, 1970）に懸濁し、OD650=0.2となるように調整した後、37℃で12～14時間振とう培養した。菌液をBioruptor（Cosmo Bio）を用いて超音波破砕した後、遠心し（12,000×g、5分、4℃）、上清を0.22μmフィルター（Millex-GV；Merck Millipore）でろ過することにより菌体を完全に除去した。この溶液を百日咳菌の菌体破砕液とし、Micro BCA Protein Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いてタンパク質濃度を決定した後、マウスへの投与に使用するまで－80℃で保存した。 [Example 1: Examination of suppression of whooping cough attack by an antagonist of a receptor involved in cough attack]
1-1 Experimental materials and methods (1) Preparation of B. pertussis cell disruption solution Border-Gengou agar medium (Becton Dickinson) containing 0.8% high polypeptone, 1% glycerol, and 15% horse defibrosis blood of 18323 strains of B. pertussis. Was sown and cultured at 37 ° C for 3 days. Multiple colonies were suspended in Stainer-Scholte liquid medium (Stainer, J Gen Microbiol, 1970), adjusted to OD650 = 0.2, and then shake-cultured at 37 ° C. for 12 to 14 hours. By ultrasonically crushing the bacterial solution using Bioruptor (Cosmo Bio), centrifuging (12,000 × g, 5 minutes, 4 ° C), and filtering the supernatant with a 0.22 μm filter (Millex-GV; Merck Millipore). The cells were completely removed. This solution was used as a cell disruption solution of Bordetella pertussis, and the protein concentration was determined using the Micro BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific), and then stored at -80 ° C until it was used for administration to mice.
（２）アンタゴニスト
咳発作に関与する受容体のアンタゴニストとして、以下の9種類を使用した。
・ブラジキニンB1受容体アンタゴニスト：Des-Arg9-[Leu8]-Bradykinin（ペプチド研究所）
・ブラジキニンB2受容体アンタゴニスト：イカチバント（ペプチド研究所）
・TRPV1アンタゴニスト：カプサゼピン（富士フィルム和光純薬工業）
・TRPV4アンタゴニスト：HC-067047（シグマアルドリッチ）
・TRPA1アンタゴニスト：HC-030031（富士フィルム和光純薬工業）
・EP3アンタゴニスト：L-798106（シグマアルドリッチ）
・NK1受容体アンタゴニスト：スパンチド（ペプチド研究所）
・NK2受容体アンタゴニスト：GR159897（R&D Systems）
・NK3受容体アンタゴニスト：SB222200（シグマアルドリッチ）
各アンタゴニストは、濃度が200 nmol/mlとなるようにPBSを用いて用時調製した。 (2) Antagonists The following 9 types were used as antagonists of receptors involved in cough attacks.
-Bradykinin B1 receptor antagonist: Des-Arg9- [Leu8] -Bradykinin (Peptide Institute)
・ Bradykinin B2 receptor antagonist: Ikatibant (Peptide Institute)
・ TRPV1 antagonist: Capsazepine (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ TRPV4 antagonist: HC-067047 (Sigma-Aldrich)
・ TRPA1 antagonist: HC-030031 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ EP3 antagonist: L-798106 (Sigma-Aldrich)
・ NK1 receptor antagonist: Spunched (Peptide Institute)
・ NK2 receptor antagonist: GR159897 (R & D Systems)
・ NK3 receptor antagonist: SB222200 (Sigma-Aldrich)
Each antagonist was prepared at the time of use using PBS to a concentration of 200 nmol / ml.
咳発作に関与する受容体のアンタゴニストとして、以下の9種類を使用した。
・ブラジキニンB1受容体アンタゴニスト：Des-Arg9-[Leu8]-Bradykinin（ペプチド研究所）
・ブラジキニンB2受容体アンタゴニスト：イカチバント（ペプチド研究所）
・TRPV1アンタゴニスト：カプサゼピン（富士フィルム和光純薬工業）
・TRPV4アンタゴニスト：HC-067047（シグマアルドリッチ）
・TRPA1アンタゴニスト：HC-030031（富士フィルム和光純薬工業）
・EP3アンタゴニスト：L-798106（シグマアルドリッチ）
・NK1受容体アンタゴニスト：スパンチド（ペプチド研究所）
・NK2受容体アンタゴニスト：GR159897（R&D Systems）
・NK3受容体アンタゴニスト：SB222200（シグマアルドリッチ）
各アンタゴニストは、濃度が200 nmol/mlとなるようにPBSを用いて用時調製した。 (2) Antagonists The following 9 types were used as antagonists of receptors involved in cough attacks.
-Bradykinin B1 receptor antagonist: Des-Arg9- [Leu8] -Bradykinin (Peptide Institute)
・ Bradykinin B2 receptor antagonist: Ikatibant (Peptide Institute)
・ TRPV1 antagonist: Capsazepine (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ TRPV4 antagonist: HC-067047 (Sigma-Aldrich)
・ TRPA1 antagonist: HC-030031 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ EP3 antagonist: L-798106 (Sigma-Aldrich)
・ NK1 receptor antagonist: Spunched (Peptide Institute)
・ NK2 receptor antagonist: GR159897 (R & D Systems)
・ NK3 receptor antagonist: SB222200 (Sigma-Aldrich)
Each antagonist was prepared at the time of use using PBS to a concentration of 200 nmol / ml.
（３）実験スケジュール
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、アンタゴニスト溶液300μlを腹腔内投与した（5匹/群）。対照群（5匹/群）として、PBS 300μlを同様に投与した。アンタゴニストの投与直後に、PBSで1mg/ml（タンパク質濃度）に希釈した百日咳菌の菌体破砕液50μlをマウスの鼻腔内に投与した。アンタゴニストおよび百日咳菌の菌体破砕液の投与は、5日間連続して行った。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、Day4からDay14までのマウスの咳発作を以下の要領で測定した。すなわち、マウスを個別の観察用ケージに入れ、マイクロホン接続ビデオカメラを用いて、ケージ内のマウスの様子を1日1匹当たり5分間撮影した。撮影した動画をAdobe Premiere Pro Cs5.5（Adobe Systems）で再生し、咳音とマウスの動作、および表示される音声波形を併せて発咳を確認し、その回数を計測した。統計学的解析はPrism8（GraphPad Soft ware）を使用し、One-way ANOVAおよびTukey法により有意差検定を実施した。 (3) Experimental schedule 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and 300 μl of the antagonist solution was intraperitoneally administered (5 animals / group). As a control group (5 animals / group), 300 μl of PBS was similarly administered. Immediately after administration of the antagonist, 50 μl of B. pertussis cell disruption solution diluted to 1 mg / ml (protein concentration) with PBS was intranasally administered to mice. Administration of the antagonist and the cell disruption solution of Bordetella pertussis was carried out for 5 consecutive days. The first administration day was set to day 0 (Day 0), and cough attacks in mice fromDay 4 to Day 14 were measured as follows. That is, the mice were placed in individual observation cages, and the state of the mice in the cages was photographed for 5 minutes per mouse per day using a video camera connected to a microphone. The recorded video was played back on Adobe Premiere Pro Cs5.5 (Adobe Systems), and coughing was confirmed by combining the coughing sound, mouse movement, and displayed voice waveform, and the number of coughing was measured. For statistical analysis, Prism8 (GraphPad Software) was used, and a significant difference test was performed by the One-way ANOVA and Tukey methods.
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、アンタゴニスト溶液300μlを腹腔内投与した（5匹/群）。対照群（5匹/群）として、PBS 300μlを同様に投与した。アンタゴニストの投与直後に、PBSで1mg/ml（タンパク質濃度）に希釈した百日咳菌の菌体破砕液50μlをマウスの鼻腔内に投与した。アンタゴニストおよび百日咳菌の菌体破砕液の投与は、5日間連続して行った。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、Day4からDay14までのマウスの咳発作を以下の要領で測定した。すなわち、マウスを個別の観察用ケージに入れ、マイクロホン接続ビデオカメラを用いて、ケージ内のマウスの様子を1日1匹当たり5分間撮影した。撮影した動画をAdobe Premiere Pro Cs5.5（Adobe Systems）で再生し、咳音とマウスの動作、および表示される音声波形を併せて発咳を確認し、その回数を計測した。統計学的解析はPrism8（GraphPad Soft ware）を使用し、One-way ANOVAおよびTukey法により有意差検定を実施した。 (3) Experimental schedule 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and 300 μl of the antagonist solution was intraperitoneally administered (5 animals / group). As a control group (5 animals / group), 300 μl of PBS was similarly administered. Immediately after administration of the antagonist, 50 μl of B. pertussis cell disruption solution diluted to 1 mg / ml (protein concentration) with PBS was intranasally administered to mice. Administration of the antagonist and the cell disruption solution of Bordetella pertussis was carried out for 5 consecutive days. The first administration day was set to day 0 (Day 0), and cough attacks in mice from
１－２ 結果
結果を図１および図２に示した。図１は、Day4からDay14までの毎日の各群のマウスの咳発作回数の平均値を示した図である。図１から、Day7にはすべての群のマウスに咳発作が誘発され、Day10までにピークに達した後、Day14にかけて徐々に減少する傾向が見られた。アンタゴニスト投与群のうち、B2受容体アンタゴニスト（イカチバント）およびTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）を投与した群では、他の群と比較し、ピーク時の咳発作回数が少ない傾向を示した。 1-2 Results The results are shown in FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a diagram showing the average number of coughing attacks of mice in each group every day fromDay 4 to Day 14. From FIG. 1, cough attacks were induced in all groups of mice on Day 7, peaked by Day 10, and then tended to gradually decrease toward Day 14. Among the antagonist-administered groups, the group administered with the B2 receptor antagonist (squidibant) and the TRPV1 antagonist (capsazepine) tended to have fewer cough attacks at the peak than the other groups.
結果を図１および図２に示した。図１は、Day4からDay14までの毎日の各群のマウスの咳発作回数の平均値を示した図である。図１から、Day7にはすべての群のマウスに咳発作が誘発され、Day10までにピークに達した後、Day14にかけて徐々に減少する傾向が見られた。アンタゴニスト投与群のうち、B2受容体アンタゴニスト（イカチバント）およびTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）を投与した群では、他の群と比較し、ピーク時の咳発作回数が少ない傾向を示した。 1-2 Results The results are shown in FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a diagram showing the average number of coughing attacks of mice in each group every day from
図２は、Day6からDay14における45分間（5分×9日間）の咳発作の総数を示した図である。図１の結果と同様に、B2受容体アンタゴニスト（イカチバント）およびTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）を投与したマウスでは、対照群であるPBS投与マウス群より咳発作の総数が少ない傾向を示した（P=0.064）。一方、他の7種類のアンタゴニストではこの傾向は見られなかった（P>0.3）。以上の結果から、B2受容体アンタゴニストおよびTRPV1アンタゴニストは百日咳菌による咳発作を抑制できると考えられた。
FIG. 2 is a diagram showing the total number of cough attacks for 45 minutes (5 minutes x 9 days) from Day 6 to Day 14. Similar to the results shown in FIG. 1, mice treated with the B2 receptor antagonist (squidibant) and TRPV1 antagonist (capsazepine) tended to have fewer cough attacks than the control group of PBS-treated mice (P = 0.064). ). On the other hand, this tendency was not observed with the other 7 antagonists (P> 0.3). From the above results, it was considered that B2 receptor antagonist and TRPV1 antagonist can suppress coughing attacks caused by Bordetella pertussis.
〔実施例２：咳発作に関与する受容体のアンタゴニストによる百日咳発作抑制の検討〕
２－１ 実験材料および方法
（１）百日咳菌咳誘発因子の調製
百日咳菌の咳誘発因子である百日咳毒素（Pertussis toxin；PT）、Virulence-associated gene 8（Vag8）、Lipooligosaccharide（LOS）は以下のように調製した。
PTは、Stainer-Scholte液体培地で培養した百日咳菌18323株の培養上清より精製した（Skelton et al, J Clin Microbiol, 1990）。 [Example 2: Examination of suppression of whooping cough attack by an antagonist of a receptor involved in cough attack]
2-1 Experimental Materials and Methods (1) Preparation of B. Pertussis Cough Inducing Factors Pertussis toxin (PT), Virulence-associated gene 8 (Vag8), and Lipooligosaccharide (LOS), which are cough-inducing factors of B. pertussis, are as follows. Prepared as.
PT was purified from the culture supernatant of 18323 strains of B. pertussis cultured in Stainer-Scholte liquid medium (Skelton et al, J Clin Microbiol, 1990).
２－１ 実験材料および方法
（１）百日咳菌咳誘発因子の調製
百日咳菌の咳誘発因子である百日咳毒素（Pertussis toxin；PT）、Virulence-associated gene 8（Vag8）、Lipooligosaccharide（LOS）は以下のように調製した。
PTは、Stainer-Scholte液体培地で培養した百日咳菌18323株の培養上清より精製した（Skelton et al, J Clin Microbiol, 1990）。 [Example 2: Examination of suppression of whooping cough attack by an antagonist of a receptor involved in cough attack]
2-1 Experimental Materials and Methods (1) Preparation of B. Pertussis Cough Inducing Factors Pertussis toxin (PT), Virulence-associated gene 8 (Vag8), and Lipooligosaccharide (LOS), which are cough-inducing factors of B. pertussis, are as follows. Prepared as.
PT was purified from the culture supernatant of 18323 strains of B. pertussis cultured in Stainer-Scholte liquid medium (Skelton et al, J Clin Microbiol, 1990).
Vag8は、大腸菌に産生させ、精製したリコンビナントタンパク質を用いた。Vag8発現ベクターを作製するために、百日咳菌18323株のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット（CACAACAAGCTCGAGTTTCTGGGCGATGTC（配列番号1）およびAAGCTTGAATTCCTACCCGATCGAATGCAG（配列番号2））を用いたPCRによりVag8のパッセンジャー領域を増幅した。このPCR産物をpCold II-HAT（Suzuki et al, Microbiol Immunol, 2017）のXhoIおよびEcoRIサイトに挿入し、大腸菌BL21（DE3）株へ導入した。1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを添加し、15℃、24時間培養することでVag8の発現を誘導した後、菌を10 mMイミダゾール含有Buffer A（50 mM sodium phosphate、300 mM NaCl、pH8.0）中で超音波処理により溶菌した。遠心後の上清をニッケル樹脂（HIS-Select Nickel Affinity Gel；シグマアルドリッチ）に吸着させた後、300 mMイミダゾール含有Buffer Aを用いて、Vag8を抽出した。Vag8画分に含まれるイミダゾールは、PBSを用いた透析により除去した。PTおよびVag8のタンパク質濃度は、Micro BCA Protein Assay（Thermo Fisher Scientific）を用いて決定した。
Vag8 was produced by Escherichia coli and purified recombinant protein was used. To prepare a Vag8 expression vector, the passenger region of Vag8 was amplified by PCR using the genomic DNA of Bordetella pertussis 18323 strain as a template and primer sets (CACAACAAGCTCGAGTTTCTGGGCGATGTC (SEQ ID NO: 1) and AAGCTTGATCCTACCCGATCGAATGCAG (SEQ ID NO: 2)). This PCR product was inserted into the XhoI and EcoRI sites of pCold II-HAT (Suzuki et al, Microbiol Immunol, 2017) and introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain. After inducing the expression of Vag8 by adding 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside and culturing at 15 ° C for 24 hours, the bacteria were cultivated in Buffer A containing 10 mM imidazole (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 8. In 0), the bacteria were lysed by sonication. The supernatant after centrifugation was adsorbed on a nickel resin (HIS-Select Nickel Affinity Gel; Sigma-Aldrich), and then Vag8 was extracted using Buffer A containing 300 mM imidazole. The imidazole contained in the Vag8 fraction was removed by dialysis with PBS. The protein concentrations of PT and Vag8 were determined using MicroBCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific).
Lipooligosaccharide（LOS）は、ホットフェノール法を用いて、百日咳菌18323株より精製した（Minnick, Infect Immun, 1994）。LOSの精製は、SDS-PAGEおよび銀染色により確認した。LOSの力価（エンドトキシンユニット：EU）は、リムルスカラーKYテストワコー（富士フィルム和光純薬）を用いて決定した。
Lipooligosaccharide (LOS) was purified from 18323 strains of Bordetella pertussis using the hot phenol method (Minnick, Infect Immun, 1994). Purification of LOS was confirmed by SDS-PAGE and silver staining. The titer of LOS (endotoxin unit: EU) was determined using Limulus Color KY Test Wako (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
（２）アンタゴニスト
実施例１で使用したアンタゴニストのうち、HC-067047（TRPV4アンタゴニスト）とL-798106（EP3アンタゴニスト）を除く7種類のアンタゴニストを使用した。各アンタゴニストは、濃度が67 nmol/mlまたは200 nmol/mlとなるようにPBSを用いて用時調製した。 (2) Antagonists Among the antagonists used in Example 1, seven types of antagonists were used except HC-067047 (TRPV4 antagonist) and L-798106 (EP3 antagonist). Each antagonist was prepared at the time of use using PBS to a concentration of 67 nmol / ml or 200 nmol / ml.
実施例１で使用したアンタゴニストのうち、HC-067047（TRPV4アンタゴニスト）とL-798106（EP3アンタゴニスト）を除く7種類のアンタゴニストを使用した。各アンタゴニストは、濃度が67 nmol/mlまたは200 nmol/mlとなるようにPBSを用いて用時調製した。 (2) Antagonists Among the antagonists used in Example 1, seven types of antagonists were used except HC-067047 (TRPV4 antagonist) and L-798106 (EP3 antagonist). Each antagonist was prepared at the time of use using PBS to a concentration of 67 nmol / ml or 200 nmol / ml.
（３）咳発作回数の測定
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、アンタゴニスト溶液300μlを腹腔内投与した（5匹/群）。対照群（5匹/群）として、PBS 300μlを同様に投与した。腹腔内投与の直後に、PT（200 ng）、Vag8（500 ng）、LOS（4×104 EU）を含むPBS溶液50μlをマウスの鼻腔内に投与した。アンタゴニストおよび咳誘発因子の投与は、5日間連続して行った。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、Day4からDay14までのマウスの咳発作を以下の要領で測定した。マウスを個別の観察用ケージに入れ、マイクロホン接続ビデオカメラを用いて、ケージ内のマウスの様子を1日1匹当たり5分間撮影した。撮影した動画をAdobe Premiere Pro Cs5.5（Adobe Systems）で再生し、咳音とマウスの動作から咳発作の回数を計測した。結果は、Day 6からDay 14における45分間（5分×9日間）の咳発作の総数で表している。なお、統計学的解析はPrism8（GraphPad Soft ware）を使用し、One-way ANOVAおよびTukey法により有意差検定を実施した。 (3) Measurement of the number of cough attacks 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and 300 μl of an antagonist solution was intraperitoneally administered (5 animals / group). As a control group (5 animals / group), 300 μl of PBS was similarly administered. Immediately after intraperitoneal administration, 50 μl of PBS solution containing PT (200 ng), Vag8 (500 ng) and LOS (4 × 10 4 EU) was administered intranasally to mice. Administration of antagonists and cough-inducing factors was performed for 5 consecutive days. The first administration day was set to day 0 (Day 0), and cough attacks in mice fromDay 4 to Day 14 were measured as follows. Mice were placed in individual observation cages and a microphone-connected video camera was used to photograph the mice in the cage for 5 minutes per mouse per day. The recorded video was played back on Adobe Premiere Pro Cs5.5 (Adobe Systems), and the number of coughing attacks was measured from the coughing sound and mouse movement. The results are expressed as the total number of cough attacks for 45 minutes (5 minutes x 9 days) from Day 6 to Day 14. For statistical analysis, Prism8 (GraphPad Software) was used, and a significant difference test was performed by the One-way ANOVA and Tukey methods.
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、アンタゴニスト溶液300μlを腹腔内投与した（5匹/群）。対照群（5匹/群）として、PBS 300μlを同様に投与した。腹腔内投与の直後に、PT（200 ng）、Vag8（500 ng）、LOS（4×104 EU）を含むPBS溶液50μlをマウスの鼻腔内に投与した。アンタゴニストおよび咳誘発因子の投与は、5日間連続して行った。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、Day4からDay14までのマウスの咳発作を以下の要領で測定した。マウスを個別の観察用ケージに入れ、マイクロホン接続ビデオカメラを用いて、ケージ内のマウスの様子を1日1匹当たり5分間撮影した。撮影した動画をAdobe Premiere Pro Cs5.5（Adobe Systems）で再生し、咳音とマウスの動作から咳発作の回数を計測した。結果は、Day 6からDay 14における45分間（5分×9日間）の咳発作の総数で表している。なお、統計学的解析はPrism8（GraphPad Soft ware）を使用し、One-way ANOVAおよびTukey法により有意差検定を実施した。 (3) Measurement of the number of cough attacks 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and 300 μl of an antagonist solution was intraperitoneally administered (5 animals / group). As a control group (5 animals / group), 300 μl of PBS was similarly administered. Immediately after intraperitoneal administration, 50 μl of PBS solution containing PT (200 ng), Vag8 (500 ng) and LOS (4 × 10 4 EU) was administered intranasally to mice. Administration of antagonists and cough-inducing factors was performed for 5 consecutive days. The first administration day was set to day 0 (Day 0), and cough attacks in mice from
２－２ 結果
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示した。B2受容体アンタゴニスト（イカチバント）およびTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）を投与した群では、PBS投与群と比較して咳誘発因子によるマウス咳発作の総数が有意に減少した（P<0.01）。一方、B1受容体、TRPA1、NK1受容体、NK2受容体、NK3受容体の各アンタゴニストでは、咳発作の総数に変化は見られなかった。 2-2 Results The results are shown in FIGS. 3A and 3B. The total number of mouse cough attacks due to cough-inducing factors was significantly reduced in the B2 receptor antagonist (squidibant) and TRPV1 antagonist (capsazepine) -treated groups compared to the PBS-treated group (P <0.01). On the other hand, there was no change in the total number of cough attacks with the B1 receptor, TRPA1, NK1 receptor, NK2 receptor, and NK3 receptor antagonists.
結果を図３Ａおよび図３Ｂに示した。B2受容体アンタゴニスト（イカチバント）およびTRPV1アンタゴニスト（カプサゼピン）を投与した群では、PBS投与群と比較して咳誘発因子によるマウス咳発作の総数が有意に減少した（P<0.01）。一方、B1受容体、TRPA1、NK1受容体、NK2受容体、NK3受容体の各アンタゴニストでは、咳発作の総数に変化は見られなかった。 2-2 Results The results are shown in FIGS. 3A and 3B. The total number of mouse cough attacks due to cough-inducing factors was significantly reduced in the B2 receptor antagonist (squidibant) and TRPV1 antagonist (capsazepine) -treated groups compared to the PBS-treated group (P <0.01). On the other hand, there was no change in the total number of cough attacks with the B1 receptor, TRPA1, NK1 receptor, NK2 receptor, and NK3 receptor antagonists.
〔実施例３：百日咳菌咳誘発因子を投与したマウスにおける気管支肺胞洗浄液中のブラジキニン濃度の検討〕
３－１ 実験材料および方法
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、実施例２で調製した百日咳菌咳誘発因子PT（200 ng）、Vag8（500 ng）およびLOS（4×104 EU）を含むPBS溶液50μlを鼻腔内に投与した。咳誘発因子の投与回数により以下の3群を設けた（5匹/群）。各群にそれぞれ対照群（5匹/群）を設け、PBS 50μlを同様に投与した。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、1回投与群はDay1に、4日間連続投与群はDay4に、5日間連続投与群はDay10に、以下の要領で各マウスの気管支肺胞洗浄液を回収した。過剰量のペントバルビタールの腹腔内投与により安楽殺したマウスの気管にカテーテルを挿入してPBS 500μlを注入し、吸引した。再度、PBSの注入および吸引を行い、回収した液を遠心後（12,000×g、5分、4℃）、上清を回収して気管支肺胞洗浄液とした。気管支肺胞洗浄液中のブラジキニン濃度および総タンパク濃度は、Mouse Bradykinin ELISA Kit（MyBioSource）およびMicro BCA Protein Assayにより測定した。結果は、ブラジキニン量（pg/mg protein）として表している。なお、有意差検定にはTwo-way ANOVAおよびTukey法を用いた。 [Example 3: Examination of bradykinin concentration in bronchoalveolar lavage fluid in mice administered with Bordetella pertussis cough inducer]
3-1 Experimental materials and methods 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and the pertussis cough inducers PT (200 ng), Vag8 (500 ng) and LOS prepared in Example 2 were prepared. 50 μl of PBS solution containing (4 × 10 4 EU) was administered intranasally. The following 3 groups were set according to the number of administrations of the cough inducer (5 animals / group). Each group was provided with a control group (5 animals / group), and 50 μl of PBS was administered in the same manner. The first administration day is set to day 0 (Day 0), the single administration group is on Day 1, the 4-day continuous administration group is onDay 4, the 5-day continuous administration group is on Day 10, and the bronchial alveoli of each mouse are as follows. The cleaning solution was collected. A catheter was inserted into the trachea of mice euthanized by intraperitoneal administration of an excessive amount of pentobarbital, and 500 μl of PBS was injected and aspirated. PBS was injected and aspirated again, and the collected solution was centrifuged (12,000 × g, 5 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was collected to prepare a bronchoalveolar lavage fluid. Bradykinin concentration and total protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid were measured by Mouse Bradykinin ELISA Kit (MyBioSource) and Micro BCA Protein Assay. The results are expressed as bradykinin amount (pg / mg protein). The two-way ANOVA and Tukey methods were used for the significance test.
３－１ 実験材料および方法
7週齢のC57BL/6J雄マウス（日本クレア）をイソフルランで麻酔し、実施例２で調製した百日咳菌咳誘発因子PT（200 ng）、Vag8（500 ng）およびLOS（4×104 EU）を含むPBS溶液50μlを鼻腔内に投与した。咳誘発因子の投与回数により以下の3群を設けた（5匹/群）。各群にそれぞれ対照群（5匹/群）を設け、PBS 50μlを同様に投与した。1回目の投与日を0日目（Day0）とし、1回投与群はDay1に、4日間連続投与群はDay4に、5日間連続投与群はDay10に、以下の要領で各マウスの気管支肺胞洗浄液を回収した。過剰量のペントバルビタールの腹腔内投与により安楽殺したマウスの気管にカテーテルを挿入してPBS 500μlを注入し、吸引した。再度、PBSの注入および吸引を行い、回収した液を遠心後（12,000×g、5分、4℃）、上清を回収して気管支肺胞洗浄液とした。気管支肺胞洗浄液中のブラジキニン濃度および総タンパク濃度は、Mouse Bradykinin ELISA Kit（MyBioSource）およびMicro BCA Protein Assayにより測定した。結果は、ブラジキニン量（pg/mg protein）として表している。なお、有意差検定にはTwo-way ANOVAおよびTukey法を用いた。 [Example 3: Examination of bradykinin concentration in bronchoalveolar lavage fluid in mice administered with Bordetella pertussis cough inducer]
3-1 Experimental materials and methods 7-week-old C57BL / 6J male mice (Claire Japan) were anesthetized with isoflurane, and the pertussis cough inducers PT (200 ng), Vag8 (500 ng) and LOS prepared in Example 2 were prepared. 50 μl of PBS solution containing (4 × 10 4 EU) was administered intranasally. The following 3 groups were set according to the number of administrations of the cough inducer (5 animals / group). Each group was provided with a control group (5 animals / group), and 50 μl of PBS was administered in the same manner. The first administration day is set to day 0 (Day 0), the single administration group is on Day 1, the 4-day continuous administration group is on
３－２ 結果
結果を図４に示した。誘発因子4日間連続投与群は、対照群と比較してブラジキニン濃度の上昇が認められた（P<0.01）。 3-2 Results The results are shown in Fig. 4. An increase in bradykinin concentration was observed in the 4-day continuous administration group of the inducer compared with the control group (P <0.01).
結果を図４に示した。誘発因子4日間連続投与群は、対照群と比較してブラジキニン濃度の上昇が認められた（P<0.01）。 3-2 Results The results are shown in Fig. 4. An increase in bradykinin concentration was observed in the 4-day continuous administration group of the inducer compared with the control group (P <0.01).
〔実施例４：Kng1遺伝子欠損マウスを用いた百日咳発作の検討〕
４－１ 実験材料および方法
（１）Kng1遺伝子欠損マウスの作製
ブラジキニンの前駆体である高分子量キニノーゲンをコードするKng1遺伝子の全長を欠失したKng1-/-マウス（C57BL/6J）を、CRISPR/Cas9システムを用いた以下の方法で作出した（Mashiko et al, Sci Rep, 2013; Abbasi et al, J Cell Sci, 2018）。C57BL/6J間の交配により得られた受精卵にCas9タンパク質（Thermo Fisher Scientific）および2種類の合成crRNAとtracrRNA（シグマアルドリッチ）のアニーリング産物をエレクトロポレーションにより導入し、代理母マウスに移植することでKng1-/-マウスを作出した。各crRNAは、それぞれKng1遺伝子の5’および3’領域の配列（5’領域：GACCTCAGGAATCTAAATAG（配列番号3）、3’領域：ACAGAGGCACGGGTGCCACA（配列番号4））を標的とする。Kng1遺伝子の欠損は、プライマーセット（Kng1-check-S1：CAACTCAGGCCGTGTGTTTG（配列番号5）、Kng1-check-S2：GCAGAGCCATCCTGAGGAAA（配列番号6）、Kng1-check-AS：ACTCCCCAGCTGCTATCAGA（配列番号7））を用いたPCRおよびシークエンス解析により確認した。また、高分子量キニノーゲンの欠損は、抗Kng1抗体（シグマアルドリッチ）を用いたウエスタンブロットにより確認した。 [Example 4: Examination of whooping cough attack using Kng1 gene-deficient mice]
4-1 Experimental materials and methods (1) Preparation of Kng1 gene-deficient mouse Kng1-/-mouse (C57BL / 6J) lacking the full length of the Kng1 gene encoding high-molecular-weight kininogen, which is a precursor of bradykinin, was CRISPR / It was created by the following method using the Cas9 system (Mashiko et al, Sci Rep, 2013; Abbasi et al, J Cell Sci, 2018). Introducing Cas9 protein (Thermo Fisher Scientific) and annealing products of two synthetic crRNAs and tracrRNAs (Sigma-Aldrich) into fertilized eggs obtained by mating between C57BL / 6J by electroporation and transplanting them into surrogate mother mice. Created a Kng1-/-mouse. Each crRNA targets the sequences of the 5'and 3'regions of the Kng1 gene (5'region: GACCTCAGGAATCTAAATAG (SEQ ID NO: 3), 3'region: ACAGAGGCACGGGTGCCACA (SEQ ID NO: 4)). For deletion of the Kng1 gene, use a primer set (Kng1-check-S1: CAACTCAGGCCGTGTGTTTG (SEQ ID NO: 5), Kng1-check-S2: GCAGAGCCATCCTGAGGAAA (SEQ ID NO: 6), Kng1-check-AS: ACTCCCCAGCTGCTATCAGA (SEQ ID NO: 7)). It was confirmed by PCR and sequence analysis. The deficiency of high molecular weight kininogen was confirmed by Western blotting using an anti-Kng1 antibody (sigma-aldrich).
４－１ 実験材料および方法
（１）Kng1遺伝子欠損マウスの作製
ブラジキニンの前駆体である高分子量キニノーゲンをコードするKng1遺伝子の全長を欠失したKng1-/-マウス（C57BL/6J）を、CRISPR/Cas9システムを用いた以下の方法で作出した（Mashiko et al, Sci Rep, 2013; Abbasi et al, J Cell Sci, 2018）。C57BL/6J間の交配により得られた受精卵にCas9タンパク質（Thermo Fisher Scientific）および2種類の合成crRNAとtracrRNA（シグマアルドリッチ）のアニーリング産物をエレクトロポレーションにより導入し、代理母マウスに移植することでKng1-/-マウスを作出した。各crRNAは、それぞれKng1遺伝子の5’および3’領域の配列（5’領域：GACCTCAGGAATCTAAATAG（配列番号3）、3’領域：ACAGAGGCACGGGTGCCACA（配列番号4））を標的とする。Kng1遺伝子の欠損は、プライマーセット（Kng1-check-S1：CAACTCAGGCCGTGTGTTTG（配列番号5）、Kng1-check-S2：GCAGAGCCATCCTGAGGAAA（配列番号6）、Kng1-check-AS：ACTCCCCAGCTGCTATCAGA（配列番号7））を用いたPCRおよびシークエンス解析により確認した。また、高分子量キニノーゲンの欠損は、抗Kng1抗体（シグマアルドリッチ）を用いたウエスタンブロットにより確認した。 [Example 4: Examination of whooping cough attack using Kng1 gene-deficient mice]
4-1 Experimental materials and methods (1) Preparation of Kng1 gene-deficient mouse Kng1-/-mouse (C57BL / 6J) lacking the full length of the Kng1 gene encoding high-molecular-weight kininogen, which is a precursor of bradykinin, was CRISPR / It was created by the following method using the Cas9 system (Mashiko et al, Sci Rep, 2013; Abbasi et al, J Cell Sci, 2018). Introducing Cas9 protein (Thermo Fisher Scientific) and annealing products of two synthetic crRNAs and tracrRNAs (Sigma-Aldrich) into fertilized eggs obtained by mating between C57BL / 6J by electroporation and transplanting them into surrogate mother mice. Created a Kng1-/-mouse. Each crRNA targets the sequences of the 5'and 3'regions of the Kng1 gene (5'region: GACCTCAGGAATCTAAATAG (SEQ ID NO: 3), 3'region: ACAGAGGCACGGGTGCCACA (SEQ ID NO: 4)). For deletion of the Kng1 gene, use a primer set (Kng1-check-S1: CAACTCAGGCCGTGTGTTTG (SEQ ID NO: 5), Kng1-check-S2: GCAGAGCCATCCTGAGGAAA (SEQ ID NO: 6), Kng1-check-AS: ACTCCCCAGCTGCTATCAGA (SEQ ID NO: 7)). It was confirmed by PCR and sequence analysis. The deficiency of high molecular weight kininogen was confirmed by Western blotting using an anti-Kng1 antibody (sigma-aldrich).
（２）百日咳菌およびその菌体破砕液によるKng1-/-マウスの咳発作回数の測定
百日咳菌18323株をStainer-Scholte液体培地で培養し、OD650 = 0.03（1×108 CFU/ ml）となるように調整した。本菌液50μlをメデトミジン（0.3 mg/kg、共立製薬）、ミダゾラム（2 mg/kg、武田テバ）、ブトルファノール（5 mg/kg、Meiji Seikaファルマ）で麻酔した野生型およびKng1-/-マウス（6-8週齢、オス、5匹/群）の鼻腔内に投与した。上記実施例２（３）に記載の方法と同じ方法で、咳発作回数を測定した。咳発作解析用の撮影が終了した後（Day 14）、過剰量のペントバルビタールの腹腔内投与によりマウスを安楽殺させ、気管および肺を摘出した。それぞれの臓器をPBSに浸し、バイオマッシャーI（ニッピ）およびポリトロンPT1200E（Kinematica）を用いてホモジナイズした後、適宜希釈した溶液をBG培地に塗布、培養、CFUの計測を行い、各臓器における生菌数を算出した。
また、イソフルランにより麻酔した野生型およびKng1-/-マウス（6-8週齢、オス、5匹/群）にPBSで1 mg/mlに調整した百日咳菌の菌体破砕液50μlを5日間連続で鼻腔内に投与し、同様に咳発作の回数を測定した。 (2) Measurement of the number of coughing attacks in Kng1-/-mouse with Bordetella pertussis and its cell disruption solution 18323 strains of Bordetella pertussis were cultured in Stainer-Scholte liquid medium, and OD650 = 0.03 (1 × 10 8 CFU / ml). Adjusted to be. Wild-type and Kng1-/-mice anesthetized with 50 μl of this bacterial solution with medetomidine (0.3 mg / kg, Kyoritsu Pharmaceutical), midazolam (2 mg / kg, Takeda Teva), butorphanol (5 mg / kg, Meiji Seika Pharma). 6-8 weeks old, male, 5 animals / group) were administered intranasally. The number of cough attacks was measured by the same method as described in Example 2 (3) above. After the cough attack analysis imaging was completed (Day 14), mice were euthanized by intraperitoneal administration of an excessive amount of pentobarbital, and the trachea and lungs were removed. Each organ is immersed in PBS, homogenized using Biomasher I (Nippi) and Polytron PT1200E (Kinematica), and then an appropriately diluted solution is applied to BG medium, cultured, and CFU is measured to obtain viable bacteria in each organ. The number was calculated.
In addition, 50 μl of B. pertussis cell disruption solution adjusted to 1 mg / ml with PBS was applied to wild-type and Kng1-/-mice (6-8 weeks old, male, 5 animals / group) anesthetized with isoflurane for 5 consecutive days. Was administered intranasally, and the number of cough attacks was measured in the same manner.
百日咳菌18323株をStainer-Scholte液体培地で培養し、OD650 = 0.03（1×108 CFU/ ml）となるように調整した。本菌液50μlをメデトミジン（0.3 mg/kg、共立製薬）、ミダゾラム（2 mg/kg、武田テバ）、ブトルファノール（5 mg/kg、Meiji Seikaファルマ）で麻酔した野生型およびKng1-/-マウス（6-8週齢、オス、5匹/群）の鼻腔内に投与した。上記実施例２（３）に記載の方法と同じ方法で、咳発作回数を測定した。咳発作解析用の撮影が終了した後（Day 14）、過剰量のペントバルビタールの腹腔内投与によりマウスを安楽殺させ、気管および肺を摘出した。それぞれの臓器をPBSに浸し、バイオマッシャーI（ニッピ）およびポリトロンPT1200E（Kinematica）を用いてホモジナイズした後、適宜希釈した溶液をBG培地に塗布、培養、CFUの計測を行い、各臓器における生菌数を算出した。
また、イソフルランにより麻酔した野生型およびKng1-/-マウス（6-8週齢、オス、5匹/群）にPBSで1 mg/mlに調整した百日咳菌の菌体破砕液50μlを5日間連続で鼻腔内に投与し、同様に咳発作の回数を測定した。 (2) Measurement of the number of coughing attacks in Kng1-/-mouse with Bordetella pertussis and its cell disruption solution 18323 strains of Bordetella pertussis were cultured in Stainer-Scholte liquid medium, and OD650 = 0.03 (1 × 10 8 CFU / ml). Adjusted to be. Wild-type and Kng1-/-mice anesthetized with 50 μl of this bacterial solution with medetomidine (0.3 mg / kg, Kyoritsu Pharmaceutical), midazolam (2 mg / kg, Takeda Teva), butorphanol (5 mg / kg, Meiji Seika Pharma). 6-8 weeks old, male, 5 animals / group) were administered intranasally. The number of cough attacks was measured by the same method as described in Example 2 (3) above. After the cough attack analysis imaging was completed (Day 14), mice were euthanized by intraperitoneal administration of an excessive amount of pentobarbital, and the trachea and lungs were removed. Each organ is immersed in PBS, homogenized using Biomasher I (Nippi) and Polytron PT1200E (Kinematica), and then an appropriately diluted solution is applied to BG medium, cultured, and CFU is measured to obtain viable bacteria in each organ. The number was calculated.
In addition, 50 μl of B. pertussis cell disruption solution adjusted to 1 mg / ml with PBS was applied to wild-type and Kng1-/-mice (6-8 weeks old, male, 5 animals / group) anesthetized with isoflurane for 5 consecutive days. Was administered intranasally, and the number of cough attacks was measured in the same manner.
４－２ 結果
（１）咳発作回数
百日咳菌を投与したマウスの咳発作回数の結果を図５Ａに、百日咳菌の菌体破砕液を投与したマウスの咳発作回数の結果を図５Ｂに示した。どちらを投与した場合も、Kng1-/-マウスでは、野生型マウスと比較して、咳発作の総数が有意に減少していた。
（２）百日咳菌の生菌数
結果を図６に示した。気管内および肺内の百日咳菌の生菌数は、どちらの臓器でも野生型マウスとKng1-/-マウスの間に有意差は見られなかった。 4-2 Results (1) Number of coughing attacks Figure 5A shows the results of the number of coughing attacks in mice administered with Bordetella pertussis, and FIG. 5B shows the results of the number of coughing attacks in mice administered with B. pertussis cell disruption solution. .. Both doses significantly reduced the total number of cough attacks in Kng1-/-mice compared to wild-type mice.
(2) Viable count of Bordetella pertussis The results are shown in FIG. The viable numbers of B. pertussis in the trachea and lungs were not significantly different between wild-type and Kng1-/-mice in either organ.
（１）咳発作回数
百日咳菌を投与したマウスの咳発作回数の結果を図５Ａに、百日咳菌の菌体破砕液を投与したマウスの咳発作回数の結果を図５Ｂに示した。どちらを投与した場合も、Kng1-/-マウスでは、野生型マウスと比較して、咳発作の総数が有意に減少していた。
（２）百日咳菌の生菌数
結果を図６に示した。気管内および肺内の百日咳菌の生菌数は、どちらの臓器でも野生型マウスとKng1-/-マウスの間に有意差は見られなかった。 4-2 Results (1) Number of coughing attacks Figure 5A shows the results of the number of coughing attacks in mice administered with Bordetella pertussis, and FIG. 5B shows the results of the number of coughing attacks in mice administered with B. pertussis cell disruption solution. .. Both doses significantly reduced the total number of cough attacks in Kng1-/-mice compared to wild-type mice.
(2) Viable count of Bordetella pertussis The results are shown in FIG. The viable numbers of B. pertussis in the trachea and lungs were not significantly different between wild-type and Kng1-/-mice in either organ.
実施例１～４の結果から、百日咳菌は呼吸器におけるブラジキニン濃度を上昇させ、B2受容体およびTPRV1を介して咳発作を引き起こしていることが示された。したがって、B2受容体アンタゴニストおよびTPRV1アンタゴニストは百日咳に対する鎮咳薬の有効成分として有用であることが明らかとなった。
From the results of Examples 1 to 4, it was shown that Bordetella pertussis increased the concentration of bradykinin in the respiratory tract and caused a coughing attack via B2 receptor and TPRV1. Therefore, it was revealed that B2 receptor antagonists and TPRV1 antagonists are useful as active ingredients of antitussives for whooping cough.
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the technical means disclosed in the different embodiments may be appropriately combined. The obtained embodiments are also included in the technical scope of the present invention. In addition, all the academic and patent documents described in the present specification are incorporated herein by reference.
Claims (9)
- ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストまたはＴＲＰＶ１（transient receptor potential vanilloid 1）アンタゴニストを有効成分とする百日咳に対する鎮咳薬。 An antitussive for whooping cough containing a bradykinin B2 receptor antagonist or a TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) antagonist as an active ingredient.
- ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバント、デルチバントまたはファシチバントである請求項１に記載の鎮咳薬。 The antitussive agent according to claim 1, wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squidibant, deltibant or fasitibant.
- ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがイカチバントである請求項２に記載の鎮咳薬。 The antitussive drug according to claim 2, wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is squid.
- ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニストがブラジキニンＢ２受容体と特異的に結合する抗体またはペプチドである請求項１に記載の鎮咳薬。 The antitussive agent according to claim 1, wherein the bradykinin B2 receptor antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to the bradykinin B2 receptor.
- ＴＲＰＶ１アンタゴニストがカプサゼピン、ヨードレシニフェラトキシン、ルテニウムレッドまたはα-スピナステロールである請求項１に記載の鎮咳薬。 The antitussive agent according to claim 1, wherein the TRPV1 antagonist is capsazepine, iodoresiniferatoxin, ruthenium red or α-spinasterol.
- ＴＲＰＶ１アンタゴニストがＴＲＰＶ１と特異的に結合する抗体またはペプチドである請求項１に記載の鎮咳薬。 The antitussive agent according to claim 1, wherein the TRPV1 antagonist is an antibody or peptide that specifically binds to TRPV1.
- ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の活性化を阻害する物質を選択する工程を含む、百日咳に対する鎮咳薬のスクリーニング方法。 A method for screening an antitussive for whooping cough, which comprises the step of selecting a substance that inhibits the activation of bradykinin B2 receptor or TRPV1.
- ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１を発現する細胞と被験物質とを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体またはＴＲＰＶ１の下流シグナルを測定する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定した下流シグナルと比較して下流シグナルを低下させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項７に記載のスクリーニング方法。 A step of contacting a cell expressing the bradykinin B2 receptor or TRPV1 with a test substance, a step of measuring a downstream signal of the bradykinin B2 receptor or TRPV1, and a step of measuring a downstream signal in the cell not in contact with the test substance. The screening method according to claim 7, comprising the step of selecting a test substance that reduces the downstream signal in comparison.
- ブラジキニンＢ２受容体を発現する細胞と被験物質とブラジキニンを接触させる工程と、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を確認する工程と、被験物質と接触していない前記細胞において測定したブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合と比較して、ブラジキニンＢ２受容体とブラジキニンとの結合を阻害する被験物質を選択する工程とを含む、請求項７に記載のスクリーニング方法。 A step of contacting a cell expressing a bradykinin B2 receptor with a test substance and bradykinin, a step of confirming the binding between the bradykinin B2 receptor and bradykinin, and a step of confirming the binding of the bradykinin B2 receptor to the bradykinin B2 receptor measured in the cells not in contact with the test substance. The screening method according to claim 7, comprising the step of selecting a test substance that inhibits the binding of bradykinin B2 receptor to bradykinin as compared with the binding of bradykinin to bradykinin.
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