WO2020218390A1 - 結合体、及び癌治療剤 - Google Patents

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西山　伸宏
貴大 野本
花奈 河本
宏泰 武元
誠 松井
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国立大学法人東京工業大学
Ｓｂｉファーマ株式会社
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a conjugate with deferoxamines and a cancer therapeutic agent.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-083250 filed in Japan on April 24, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Non-Patent Document 4-6 the half-life of the blood concentration of DFO is as short as 20 minutes or less, and in order to obtain a sufficient therapeutic effect, it is necessary to administer it by infusion for a long time (8 hours or more)
  • Non-Patent Document 7 since it does not have selective accumulation in tumors, side effects on the whole body are also a concern.
  • the former problem of early disappearance was improved by binding DFO to a polymer such as dextran or hydroxyethyl starch (HES) (Non-Patent Document 7), and DFO (HES-DFO) bound to HES was administered.
  • Prolongation of survival has been reported in leukemic rats (Non-Patent Document 8).
  • the tumor accumulation of HES-DFO has not been investigated, and no example has yet been reported in which polymer-modified DFO showed an antitumor effect on solid tumors.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and has excellent blood retention, tumor accumulation, and excellent antitumor effect.
  • the purpose is to provide a therapeutic agent.
  • the present invention has the following aspects.
  • Deferroxamines which are at least one compound selected from the group consisting of deferroxamine or ions or salts thereof, and derivatives thereof, and a biocompatible polymer are bound to each other, and the biocompatible polymer is formed.
  • a conjugate comprising a first biocompatible polymer chain and a second biocompatible polymer chain different from the first biocompatible polymer chain.
  • ⁇ 3> The conjugate according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the second biocompatible polymer chain is a polyamino acid.
  • A represents the first biocompatible polymer chain, and represents the first biocompatible polymer chain.
  • L represents a linker part and represents B represents the second biocompatible polymer chain, and includes a repeating structure represented by (b2) below, a repeating structure represented by (b1), and a repeating structure represented by (b2).
  • R 1 represents the amino acid side chain
  • R 2 is a combination of the amino acid side chain and the deferoxamines.
  • n represents the total number of (b1) and (b2), n is an integer of 1 to 1000, m is an integer of 1 to 1000 (where m ⁇ n), and n ⁇ m is 2 or more.
  • a plurality of R 1 may be the same or different, when m is 2 or more, plural R 2 may be the same or different from each other. ).
  • n 1 represents the total number of (b1-1) and (b2-1), n 1 is an integer of 1 to 1000, m 1 is an integer of 1 to 1000 (where m 1 ⁇ n 1 ). If n 1 -m 1 is 2 or more, plural R 11 may be the same or different from each other, when m 1 is 2 or more, plural R 12 may be the same or different .. ).
  • ⁇ 7> The conjugate according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the number average molecular weight is 2,000 to 200,000.
  • a cancer therapeutic agent containing the conjugate according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> as an active ingredient.
  • the present invention it is possible to provide a conjugate and a cancer therapeutic agent having excellent blood retention, further tumor accumulation, and exhibiting an excellent antitumor effect.
  • the conjugate of the embodiment deferroxamines and a biocompatible polymer are bound, and the biocompatible polymer is a first biocompatible polymer chain and the first biocompatible polymer. It contains a second biocompatible polymer chain that is different from the chain.
  • the conjugate of the embodiment has an iron chelating action derived from deferoxamines, and preferably has an iron (III) ion-specific chelating action.
  • deferroxamines and a polymer are bonded, and the polymer has a first polymer chain and a second polymer chain different from the first polymer chain.
  • the polymer may be a biocompatible polymer.
  • deferoxamines means at least one compound selected from the group consisting of deferoxamine or an ion or salt thereof, and derivatives thereof.
  • Deferoxamine is known as a compound represented by the following formula (I) (hereinafter referred to as "compound (I)".
  • compound (I) Deferoxamine is specific for iron (III) ion among many iron chelating agents. It has a chelating effect and is widely used as a therapeutic agent for iron excess.
  • Deferoxamine can be provided in the form of ions or salts.
  • the compound (I) may be a cation or the compound (I) may be an anion.
  • compound (I) is a cation, the compound (I) protons group represented by "-NH 2" is added in, - was the cation moiety represented by "NH 3 +" Things can be mentioned.
  • Examples of the ion of compound (I) include a compound represented by the following formula (I-1).
  • Examples of the salt of deferoxamine include pharmacologically acceptable salts, and deferoxamine mesylate represented by the following formula (I-2) is preferable.
  • Examples of the pharmacologically acceptable salt include a pharmacologically acceptable acid addition salt, metal salt, ammonium salt, organic amine addition salt and the like.
  • Examples of the acid addition salt include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate and other inorganic acid salts, formate, acetate, propionate and toluenesulfonic acid. Salt, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate, etc.
  • Organic acid addition salts can be exemplified.
  • the metal salt examples include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium and calcium salt, and metal salts such as aluminum and zinc.
  • the ammonium salt examples include alkylammonium salts such as ammonium salt and tetramethylammonium salt.
  • the organic amine salt examples include each salt such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and toluidine salt. In addition, these salts can also be used as a solution at the time of use.
  • deferoxamine derivative is not particularly limited as long as it has the above iron chelating action.
  • Derivatives of deferoxamine include deferoxamine or an ion or salt thereof in which one or more hydrogen atoms or groups are substituted with other groups (substituents). Further, deferoxamine or an ion or salt thereof may have a hydrogen atom added or removed.
  • substituents include a hydroxyl group, an amino group, a monovalent chain saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom and the like.
  • Examples of the monovalent chain saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group and the like.
  • Examples of the halogen atom include a fluorine atom and a chlorine atom.
  • the iron chelating action of deferoxamine is said to be exerted by the three hydroxamic acid structural portions represented in the following formula (I-3). Therefore, since it is difficult to affect the iron chelating action, for example, in the above compound (I), the group represented by "-NH 2 " at the terminal (in the above compound (I-1), the terminal is not affected. which one or more hydrogen atoms constituting the group) represented by "-NH 3 +" is substituted with the other group (the substituent) are preferable.
  • the biocompatible polymer means a polymer that does not exert or is unlikely to exert a significant adverse effect or adverse effect such as a strong inflammatory reaction or injury when administered to a living body.
  • the biocompatible polymer is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and for example, polyethylene glycol (PEG), acrylic resin (resin containing a structural unit derived from (meth) acrylic acid ester), poly. Examples thereof include amino acids, polynucleotides, polyacrylamides, polyethers, polyesters, polyurethanes, polysaccharides, copolymers thereof and the like.
  • the biocompatible polymer may partially have any group introduced during its synthesis. Examples of such a group include a part of a polymerization initiator and the like.
  • the biocompatible polymer according to the present embodiment includes a first biocompatible polymer chain and a second biocompatible polymer chain.
  • the first biocompatible polymer chain and the second biocompatible polymer chain are different from each other, and the biocompatible polymer of the present embodiment is the biocompatible polymer chain of the first biocompatible polymer chain. It can be provided as a block copolymer containing a block and a block of a second biocompatible polymer chain. Further, the biocompatible polymer according to the present embodiment may contain yet another polymer chain in addition to the first biocompatible polymer chain and the second biocompatible polymer chain.
  • the "block copolymer” is a polymer to which a plurality of types of blocks (partial constituents in which the same type of structural units are repeatedly bonded) are bonded.
  • the number of blocks constituting the block copolymer may be two or more.
  • the number average molecular weight (Mn) of the biocompatible polymer can be appropriately determined depending on the molecular weight of the conjugate of the present embodiment.
  • the number average molecular weight of the first biocompatible polymer chain calculated by 1 H NMR is preferably 700 to 100,000, more preferably 2,000 to 50,000, and further 7,000 to 30,000. preferable.
  • the number average molecular weight of the second biocompatible polymer chain calculated by 1 H NMR is preferably 700 to 100,000, more preferably 2,000 to 50,000, and further 7,000 to 30,000. preferable.
  • the number average molecular weight ratio of the first biocompatible polymer chain to the second biocompatible polymer chain is, for example, It may be 10: 1 to 1:10, and may be 10: 3 to 3:10.
  • the dispersity (Mw / Mn) of the biocompatible polymer is preferably 1.0 or more and less than 2.0, more preferably 1.0 to 1.5, still more preferably 1.0 to 1.3. 0 to 1.2 is particularly preferable. From the viewpoint that the conjugate of the embodiment can more effectively exhibit excellent tumor accumulation, the dispersity of the biocompatible polymer is preferably within the above range.
  • the value calculated from the ratio of the peak integral values based on the 1 H NMR spectrum can be adopted as the number average molecular weight of the polymer.
  • the number average molecular weight can be calculated by calculating the degree of polymerization of the monomer and adding the total molecular weight of the structure derived from the polymerized monomer to the molecular weight of the structure derived from the initiator.
  • the number average molecular weight of the conjugate which will be described later, a part of the value calculated from the ratio of the peak integral values based on the 1 H NMR spectrum can be adopted.
  • a calculation method for example, as shown in Examples described later, from the ratio of the peak integrated value of the structure derived from the initiator present at the end of the polymer chain and the peak integrated value of the structure derived from DFO of the calculation target portion, It can be calculated by calculating the number of DFO bonds and adding the total molecular weight of the bound DFO-derived structure to the number average molecular weight of the polymer chains.
  • the first biocompatible polymer chain or the second biocompatible polymer chain is preferably polyethylene glycol from the viewpoint of excellent biocompatibility and versatility.
  • the first biocompatible polymer chain or the second biocompatible polymer chain is preferably a polyamino acid from the viewpoint of excellent biocompatibility and a balance between biostability and biodegradability.
  • the first biocompatible polymer chain contained in the biocompatible polymer and the second biocompatible polymer chain for example, the first biocompatible polymer chain is polyethylene glycol (PEG). Therefore, a combination in which the second biocompatible polymer chain is a polyamino acid is preferable.
  • PEG polyethylene glycol
  • the biocompatible polymer is preferably biodegradable.
  • Biodegradability means a property that can be absorbed or decomposed in the living body.
  • the biodegradable biocompatible polymer is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and examples thereof include polyamino acids, polyesters, polynucleotides, and polysaccharides.
  • the biodegradable polymer means that at least a part of the biocompatible polymer is biodegradable. Therefore, block copolymers of polyamino acids, polyesters, polynucleotides, polysaccharides, etc. with PEG, acrylic resins (resins containing structural units derived from (meth) acrylic acid esters), polyacrylamides, polyethers, polyurethanes, etc. Also corresponds to a biodegradable biocompatible polymer.
  • biostability means that it can exist in vivo without being immediately absorbed or immediately degraded.
  • a biocompatible polymer has biodegradability and biostability, it means that it can exist in the living body until it is absorbed or decomposed in the living body.
  • the biocompatible polymer is biostable, which means that at least a part of the biocompatible polymer is biostable. Therefore, block copolymers of polyamino acids, polyesters, polynucleotides, polysaccharides, etc. with PEG, acrylic resins (resins containing structural units derived from (meth) acrylic acid esters), polyacrylamides, polyethers, polyurethanes, etc. Also corresponds to a biocompatible polymer with biostability.
  • the method for producing a biocompatible polymer containing the first biocompatible polymer chain and the second biocompatible polymer chain is not particularly limited.
  • a method in which a first biocompatible polymer chain is synthesized by a known polymerization reaction and then a monomer of the second biocompatible polymer chain is polymerized on the first biocompatible polymer chain. Can be manufactured.
  • the polymer chains obtained by the polymerization reaction may be in the state of precursors (for example, those having a protective group), respectively, and are ordinary ones selected by those skilled in the art for the precursors obtained by the polymerization reaction.
  • the treatment may be carried out to produce a first biocompatible polymer chain and a second biocompatible polymer chain.
  • the first biocompatible polymer chain or its precursor provided as a polymer in advance and the second biocompatible polymer chain or its precursor can be bonded by a known reaction. .. At that time, the two may be bonded by utilizing the bond between the reactive functional groups.
  • the same treatment can be performed in the same manner to produce a first biocompatible polymer chain and a second biocompatible polymer chain.
  • the conjugate of the present embodiment is a combination of deferoxamines and a biocompatible polymer.
  • the biocompatible polymer and the deferoxamines may be directly bound or may be bound via an arbitrary linker, and the effect of the present invention can be obtained.
  • the combination mode is not particularly limited.
  • the biocompatible polymer and the deferoxamines are preferably bound by a covalent bond in order to maintain the stability of the bond in the body.
  • the biocompatible polymer and the deferoxamines may be bonded by utilizing the bond between the reactive functional groups of each other.
  • the reactive functional group may be one originally possessed by the biocompatible polymer and / or deferoxamines, or may be modified or introduced.
  • the deferoxamines and biocompatible polymers may undergo structural changes necessary for their binding, respectively, as long as the effects of the present invention are obtained. Good.
  • only one deferoxamine may be bound to the biocompatible polymer, or two or more may be bound.
  • the number of deferoxamines in the conjugate of the present embodiment may be an integer of 1 or more, an integer of 1 to 1000, an integer of 3 to 100, and an integer of 5 to 50. You can. When the number is not less than the above lower limit value, the iron chelating action of deferoxamines is satisfactorily exhibited, and when the number is not more than the above upper limit value, the hydrophilicity of the conjugate is appropriately improved, which is preferable.
  • the deferoxamines can bind to any of the biocompatible polymers.
  • Deferoxamines may be attached to a first biocompatible polymer chain and / or a second biocompatible polymer chain.
  • deferoxamines may be attached to the functional groups of the first biocompatible polymer chain and / or the second biocompatible polymer chain.
  • the binding mode is not particularly limited, but for example, in the case of deferoxamine of the above compound (I), if it is a bond with a group (amino group) represented by "-NH 2 ", the binding mode of the deferoxamine It is less likely to affect iron chelating action and does not require modification or derivatization of deferoxamine.
  • deferoxamines include the amino group of the deferoxamines and the "group capable of binding to the amino group" of the first biocompatible polymer chain and / or the second biocompatible polymer chain. May be combined.
  • the group that can be bonded to the amino group include a carboxyl group, a hydroxyl group, an aldehyde group or a carbonyl group. These groups may be those contained in the side chains of the polymer chain.
  • a carboxyl group is preferable as a group capable of binding to an amino group from the viewpoint of bond stability with an amino group and ease of synthesis.
  • the first biocompatible polymer chain and / or the second biocompatible polymer chain may have a carboxyl group.
  • An amide bond is formed between the carboxyl group of the first biocompatible polymer chain and / or the second biocompatible polymer chain and the amino group of the deferroxamines to form the first biocompatible polymer chain.
  • / or a second biocompatible polymer chain can be bound to deferroxamines.
  • biocompatible polymer chain having a carboxyl group in the molecule examples include polyamino acids, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, carboxymethyl cellulose, hyaluronic acid and the like.
  • the carboxylic group may be a carboxyl group protected by a protecting group.
  • the carboxyl group is introduced by a known method using chloroacetic acid, succinic anhydride, chloroformic acid-p-nitrophenyl, or the like. be able to.
  • the biocompatible polymer is polyacrylamide, a carboxyl group protected by a carboxyl group or a protective group by a known production method such as free radical polymerization or living radical polymerization using acrylic acid or benzyl acrylate as a raw material. It is possible to produce a biocompatible polymer having the above.
  • a biocompatible polymer chain having a carboxyl group and deferroxamines having an amino group are used as a condensing agent such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide. Condensation reaction in the presence can be mentioned. Further, in the case of a biocompatible polymer chain having a carboxyl group protected by a protecting group, the protecting group is deprotected by a known reaction to obtain a biocompatible polymer chain having a carboxyl group, and then condensation is performed in the same manner. Can react.
  • the deferoxamines may be bound to only one of the first biocompatible polymer chain and the second biocompatible polymer chain.
  • deferoxamines can bind to a second biocompatible polymer chain.
  • the second biocompatible polymer chain may have a side chain, and deferoxamines may be bound to the side chain of the second biocompatible polymer chain.
  • conjugate of the present embodiment there is an example including a structure represented by the following general formula (1) or (1-1).
  • A represents the first biocompatible polymer chain
  • L represents a linker portion
  • B represents the second living body bound to the deferoxamines. Represents a compatible polymer chain.
  • the linker portion is preferably an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, preferably a linear alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, and is preferably a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms. It is more preferably an alkylene group.
  • Examples of the alkylene group include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, and a pentamethylene group.
  • the second biocompatible polymer chain to which the deferoxamines are bound is preferably a polyamino acid.
  • the B in the general formula (1) or (1-1) is preferably as follows.
  • B represents the second biocompatible polymer chain bound to the deferoxamines, and the second biocompatible polymer chain has a repeating structure represented by the following (b2) or is represented by (b1). It is preferable to include a repeating structure to be formed and a repeating structure represented by (b2).
  • R 1 represents the amino acid side chain
  • R 2 is a combination of the amino acid side chain and the deferoxamines.
  • n represents the total number of (b1) and (b2), n is an integer of 1 to 1000, m is an integer of 1 to 1000 (where m ⁇ n), and n ⁇ m is 2 or more.
  • a plurality of R 1 may be the same or different, when m is 2 or more, plural R 2 may be the same or different from each other. ).
  • the amino acid side chain is used in the usual sense in the art and refers to a structure other than the amino group and the carboxy group involved in the amide bond of the polypeptide.
  • glycine is a hydrogen atom and alanine is an amino acid. It is a methyl group, and if it is valine, it is an isopropyl group.
  • the sequences of (b1) and (b2) may be random.
  • m represents the total number of (b2) in the second biocompatible polymer chain
  • nm represents the total number of (b1) in the second biocompatible polymer chain.
  • nm may be 0 (ie, the second biocompatible polymer chain may have only (b2) bound to deferoxamines among (b1) and (b2). ).
  • the second biocompatible polymer chain may consist of the repeating structure represented by (b2), the repeating structure represented by (b1), and the repeating structure represented by (b2). ..
  • amino acid side chain of R 1 and the amino acid side chain of R 2 may be the same or different from each other.
  • n is an integer of 1 to 1000, may be an integer of 10 to 500, and may be an integer of 20 to 100.
  • the value of n is within the above range, the value of the molecular weight of the second biocompatible polymer chain is preferable, which is preferable.
  • m is an integer of 1 to 1000, may be an integer of 3 to 100, and may be an integer of 5 to 50.
  • the value of m is not less than the lower limit, the iron chelating action of deferoxamines is satisfactorily exhibited, and when the value of m is not more than the upper limit, the hydrophilicity of the conjugate is good, which is preferable.
  • the numerical range when n is larger than m is also illustrated here, n and m may be the same number.
  • the binding mode between the polyamino acid and the deferoxamines is not particularly limited, but the binding between the amino acid side chain of the polyamino acid and the deferoxamines is preferable.
  • Examples of the method of binding deferroxamines to the amino acid side chain of a polyamino acid include a method of forming an amide bond with an amino group of the side chain of lysine and a method of forming a disulfide bond with a thiol group of the side chain of cysteine.
  • deferoxamine of the above compound (I) if it is bonded to the group (amino group) represented by "-NH 2 ", it is difficult to affect the iron chelating action of deferoxamine, and Since it is not necessary to deferoxamine, a method of forming an amide bond between the carboxyl group of the aspartic acid side chain or the glutamate side chain and the amino group of the deferoxamines is preferable.
  • the second biocompatible polymer chain is a polyamino acid and contains aspartic acid and / or glutamic acid as a constituent unit, the following is preferable as B in the above general formula (1) or (1-1).
  • B represents the second biocompatible polymer chain bound to the deferoxamines, and the second biocompatible polymer chain has a repeating structure represented by the following (b2-1) or (b1-1). ) And the repeating structure represented by (b2-1) are preferably included.
  • R 11 represents the amino acid side chain
  • R 12 is a combination of the carboxyl group in the aspartic acid side chain represented by -CH 2- COOH or the glutamic acid side chain represented by -CH 2- CH 2- COOH and the deferoxamines.
  • n 1 represents the total number of (b1-1) and (b2-1)
  • n 1 is an integer of 1 to 1000
  • m 1 is an integer of 1 to 1000 (where m 1 ⁇ n 1 ). If n 1 -m 1 is 2 or more, plural R 11 may be the same or different from each other, when m 1 is 2 or more, plural R 12 may be the same or different .. ).
  • n 1 and m 1 are the same as the relationship of n and m above, and the numerical values and the like described as n and m can be applied to n 1 and m 1 .
  • the second biocompatible polymer chain comprises a repeating structure represented by (b2-1), a repeating structure represented by (b1-1), and a repeating structure represented by (b2-1). It may be a thing.
  • amino acid side chain of R 11 and the amino acid side chain of R 12 may be the same or different from each other.
  • the first biocompatible polymer chain is preferably polyethylene glycol.
  • the above general formula (1) Is preferably the structure represented by the following general formula (1-2).
  • l is an integer of 1 to 1500
  • B represents the second biocompatible polymer chain bound to the deferoxamines
  • the second biocompatible polymer chain is shown in Table (b2-1) below. It includes a repeating structure represented by (b1-1) and a repeating structure represented by (b2-1).
  • l is an integer of 1 to 1500, may be an integer of 10 to 1000, and may be an integer of 100 to 500.
  • the conjugate of the present embodiment preferably has a number average molecular weight (Mn) of 2,000 to 200,000, for example, 5,000 to 100,000, or 10,000 to 50,000. It may be 17,000 to 45,000, or 20,000 to 40,000.
  • Mn number average molecular weight
  • the number average molecular weight of the conjugate is in the above range, the retention of the conjugate in blood and the accumulation in tumor tissue can be appropriately improved, and the accumulation in normal tissues such as the liver can be prevented. As a result, deferoxamines can be efficiently delivered to the tumor tissue.
  • Tumor accumulation of conjugates is considered to be exerted by selective accumulation in tumors utilizing the enhanced vascular leakage of tumors, that is, enhanced permeability and retention effect (EPR effect), and selection within tumors. Achieve better antitumor effect by removing iron.
  • EPR effect enhanced permeability and retention effect
  • the conjugate may form a polymer micelle or may be in the form of a polymer vesicle.
  • the conjugate of the present embodiment is extremely excellent, having excellent blood retention, further having tumor accumulation, and exhibiting an excellent antitumor effect.
  • DFO has poor retention in blood, so it has been necessary to continuously administer it by infusion.
  • the conjugate of the present embodiment has excellent blood retention, it can be administered in a more spaced form and can be easily prescribed. Since the conjugate of the present embodiment has excellent tumor accumulation, it is possible to improve only the accumulation of the drug in the tumor tissue without inducing the accumulation of the drug in the normal tissue. As a result, according to the conjugate of the present embodiment, high drug efficacy and low side effects can be achieved.
  • the conjugate of the present embodiment has excellent blood retention and tumor accumulation because the biocompatible polymer has a first biocompatible polymer chain and the first biocompatible polymer. It is considered that this is due to the inclusion of a second biocompatible polymer chain different from the chain. Since the conjugate contains different types of polymer chains, when this is administered in vivo, it is conceivable that the chains will bind to and stabilize other molecules in the body so that the different types of chains do not coexist with each other. ..
  • the conjugate of the embodiment is considered to exhibit, for example, an improved affinity between the conjugate of the present embodiment and serum albumin, which is a cancer-accumulating protein, and exerts better tumor accumulation and antitumor effect. ..
  • ⁇ Cancer treatment agent ⁇ As one embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient. As one embodiment of the present invention, there is provided a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient.
  • the conjugate of the above embodiment has an iron chelating action, it is expected to have a therapeutic effect on various diseases by utilizing the iron chelating action.
  • target diseases expected to have a therapeutic effect include iron overload and iron-requiring cancers, such as solid cancers.
  • Human solid cancers include, for example, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, small cell cancer, non-small cell cancer, breast cancer, gastric cancer, cholecyst / bile duct cancer, lung cancer, etc.
  • Liver cancer hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, rectal cancer, ovarian cancer, villous epithelial cancer, uterine body cancer, cervical cancer, renal pelvis / urinary tract cancer, bladder cancer , Prostate cancer, penis cancer, testicular cancer, fetal cancer, Wilms cancer, skin cancer, malignant melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma, Ewing tumor, soft sarcoma and the like.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient may further contain another anticancer agent or the like. With such a configuration, a synergistic effect on cancer treatment can be expected.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient is 5-aminolevulinic acid or a derivative thereof, a salt or an ester (hereinafter, also simply referred to as "ALAs". Details of ALAs will be described later. It can be used for photodynamic diagnosis and / or treatment using.). Hereinafter, the principle of photodynamic diagnosis and / or treatment using 5-aminolevulinic acid will be described. As shown in FIG. 26, 5-aminolevulinic acid (5-ALA) is taken up by cells and then used in the heme biosynthetic pathway. Its metabolic intermediate, protoporphyrin IX, is known to selectively accumulate in cancer cells.
  • 5-aminolevulinic acid 5-ALA
  • protoporphyrin IX is known to selectively accumulate in cancer cells.
  • protoporphyrin IX is a photosensitizer, it can kill cancer cells by generating damaging active oxygen in the cancer cells by irradiating it with light of a specific wavelength (photodynamic therapy).
  • protoporphyrin IX by irradiating protoporphyrin IX with light of a specific wavelength (for example, 400-410 nm), red fluorescence is emitted, and cancer cells can be effectively visualized (photodynamic diagnosis).
  • a specific wavelength for example, 400-410 nm
  • cancer stem cells which are deeply involved in cancer recurrence, have a particularly high amount of iron uptake, so that the metabolism of protoporphyrin IX is enhanced. Since protoporphyrin IX does not accumulate in cancer stem cells, there is concern that the therapeutic effect may be reduced.
  • Non-Patent Document 9 by chelating iron ions in cancer cells using the cancer therapeutic agent of the embodiment, protoporphyrin IX accumulation is selectively enhanced in cancer cells, and photodynamic diagnosis and photodynamic diagnosis and / Or it is thought that the effect of treatment can be improved.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient may be provided alone as being used for photodynamic diagnosis and / or treatment, and may be a combination drug with the above ALAs. It may be provided in a dosage form such as a combination formulation.
  • One embodiment provides a method comprising administering the ALAs and the conjugate of the embodiment to a subject in need of treatment.
  • a method for treating cancer which comprises administering the ALAs and the conjugate of the embodiment to a subject in need of treatment.
  • a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient for administration to a subject to which the ALAs are administered As one embodiment, there is provided a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the ALAs as an active ingredient for administration to a subject to which the conjugate of the embodiment is administered.
  • the conjugate of the embodiment is provided for photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer.
  • the use of a conjugate of the embodiment for photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer is provided.
  • One embodiment provides the use of the ALAs and conjugates of the embodiments for photodynamic diagnosis and / or treatment of cancer.
  • a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient for use in photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer As one embodiment, there is provided a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the ALAs and the conjugate of the embodiment as an active ingredient for use in photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer.
  • a kit comprising the composition or a cancer therapeutic agent is provided.
  • a conjugate of the embodiment in the manufacture of a medicament for use in photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer.
  • the use of the ALAs and the conjugate of the embodiment in the manufacture of a medicament for use in photodynamic diagnosis and / or treatment for cancer is provided.
  • the above target is an example of a cancer patient.
  • the photodynamic diagnosis and / or treatment for the above-mentioned cancer includes irradiating the cells of the subject to which the conjugate of the ALAs and / or embodiments has been administered with light.
  • the cell is a concept that includes a tumor.
  • the wavelength of the light beam is known and may be any one capable of generating active oxygen in cancer cells.
  • ALA means 5-aminolevulinic acid.
  • ALA also called ⁇ -aminolevulinic acid, is a kind of amino acid.
  • R 21 represents a hydrogen atom or an acyl group
  • R 22 represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl group.
  • ALA corresponds to the case where R 21 and R 22 are hydrogen atoms.
  • ALAs may act as an active ingredient in the state of ALA of formula (II) or a derivative thereof in vivo, and can also be administered as a prodrug (precursor) decomposed by an enzyme in vivo.
  • acyl group in R 21 of (II) formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, hexanoyl, octanoyl, such as benzyl group linear or branched number from 1 to 8 carbon atoms in the Examples thereof include an alkanoyl group and an aloyl group having 7 to 14 carbon atoms such as a benzoyl, 1-naphthoyl and 2-naphthoyl groups.
  • the alkyl group in R 22 of the formula (II) includes a linear group such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, and octyl group. Examples thereof include branched alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms.
  • a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms may be mentioned.
  • Examples of the aryl group in R 22 of the formula (II) include an aryl group having 6 to 14 carbon atoms such as a phenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl group.
  • R 21 is formyl, acetyl, propionyl, compounds butyryl group.
  • preferred ALA derivatives include compounds in which the above R 22 is a methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl group or the like.
  • the combination of R 21 and R 22 is (formyl and methyl), (acetyl and methyl), (propionyl and methyl), (butyryl and methyl), (formyl and ethyl), (acetyl). And ethyl), (propionyl and ethyl), (butyryl and ethyl) combinations of compounds.
  • examples of the salt of ALA or a derivative thereof include a pharmacologically acceptable acid addition salt, metal salt, ammonium salt, organic amine addition salt and the like.
  • examples of the acid addition salt include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate and other inorganic acid salts, formate, acetate, propionate and toluenesulfonic acid.
  • Salt succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate, etc.
  • Organic acid addition salts can be exemplified.
  • the metal salt examples include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium and calcium salt, and metal salts such as aluminum and zinc.
  • the ammonium salt examples include alkylammonium salts such as ammonium salt and tetramethylammonium salt.
  • the organic amine salt examples include each salt such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and toluidine salt. In addition, these salts can also be used as a solution at the time of use.
  • ALA esters include, but are not limited to, methyl esters, ethyl esters, propyl esters, butyl esters, pentyl esters and the like.
  • ALA various esters such as ALA methyl ester, ALA ethyl ester, ALA propyl ester, ALA butyl ester, and ALA pentyl ester, and their hydrochlorides and phosphates. Esters and sulfates.
  • ALA hydrochloride and ALA phosphate can be exemplified as particularly suitable ones.
  • the above ALAs can be produced by known methods such as chemical synthesis, production by microorganisms, and production by enzymes. Further, the above ALAs may form a hydrate or a solvate, and ALAs may be used alone or in combination of two or more as appropriate.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient contains ascorbic acid or a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter, also simply referred to as "ascorbic acids". Details of ascorbic acids will be described later). It can be used for the vitamin C therapy used. The principle of vitamin C therapy using ascorbic acid will be described below. Intravenous injection of pharmacological concentrations of vitamin C (ascorbic acid) produces hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in the extracellular region of the tumor, which permeates the tumor cells and has an antitumor effect. (Vitamin C therapy) [Q. Chen, MG Espey, MC Krishna, JB Mitchell, CP Corpe, GR Buettner, E.
  • ascorbic acid is a concept including ascorbic acid or a derivative thereof or a salt thereof, and is also referred to as vitamin C. Further, although L-ascorbic acid naturally exists, either L-ascorbic acid or D-ascorbic acid obtained by chemical synthesis can be preferably used. Examples of the salt of ascorbic acid include the types of salts exemplified as the above-mentioned salts of ALAs.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient may be provided alone as being used for vitamin C therapy, or may be provided as a combination drug or a combination preparation with the ascorbic acids. It may be provided in a dosage form.
  • One embodiment provides a method comprising administering the ascorbic acids and the conjugate of the embodiment to a subject in need of treatment.
  • a method for treating cancer which comprises administering the ascorbic acids and the conjugate of the embodiment to a subject in need of treatment.
  • a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient for administration to a subject to which the ascorbic acids are administered or administered As one embodiment, there is provided a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the ascorbic acids as an active ingredient for administration to a subject to which the conjugate of the embodiment is administered.
  • the conjugate of the embodiment is provided for vitamin C therapy for cancer.
  • the ascorbic acids and the conjugate of the embodiment are provided for vitamin C therapy for cancer.
  • the use of the conjugate of the embodiment for vitamin C therapy for cancer is provided.
  • the use of the ascorbic acids and the conjugate of the embodiment for vitamin C therapy for cancer is provided.
  • a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient for use in vitamin C therapy for cancer As one embodiment, there is provided a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the ascorbic acid and the conjugate of the embodiment as an active ingredient for use in vitamin C therapy for cancer.
  • a pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient and a pharmaceutical composition or cancer containing the ascorbic acid as an active ingredient for use in vitamin C therapy for cancer.
  • a kit with a therapeutic agent and is provided.
  • One embodiment provides the use of a conjugate of the embodiment in the manufacture of a medicament for use in vitamin C therapy for cancer.
  • a conjugate of the embodiment in the manufacture of a medicament for use in vitamin C therapy for cancer.
  • the above target is an example of a cancer patient.
  • the above-mentioned vitamin C therapy comprises administering ascorbic acids to a subject, preferably intravenous injection.
  • the subject is a concept that includes a patient with a tumor.
  • the concentration of ascorbic acids in the tumor in vitamin C therapy is not particularly limited as long as it has an antitumor effect, and as an example, it may be 1 mM or more, 2 mM or more, or 3 mM or more.
  • the upper limit of the concentration of ascorbic acids in the tumor in vitamin C therapy is not particularly limited, but as an example, it may be 20 mM or less, 15 mM or less, or 10 mM or less. ..
  • the concentration of ascorbic acids in the tumor for example, it may be 1 mM or more and 20 mM or less, 2 mM or more and 15 mM or less, and 3 mM or more and 10 mM or less.
  • Administration of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent of the embodiment to a subject administration to a patient, for example, intranasal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., intranasal, transbronchial, intramuscular, etc. It can be performed transdermally or orally by a method known to those skilled in the art.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but those skilled in the art can appropriately select the dose.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition or the therapeutic agent for cancer of the embodiment may be appropriately determined according to the administration route, and is not limited, but is an injection, a drip, a tablet, a capsule, a fine granule, a powder, or a liquid. , Liquid agents dissolved in syrup and the like, patches, suppositories and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient is preferably an oral preparation, an injection preparation, or an infusion preparation.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the ALAs as an active ingredient is preferably an oral preparation, an injection preparation, or an intravenous drip preparation.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing ascorbic acid as an active ingredient is preferably an injection or a drip, and more preferably an injection or a drip for intravenous injection.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent can be added with other optional ingredients such as other medicinal ingredients, nutritional supplements, carriers, etc., if necessary.
  • optional ingredients conventional pharmaceutically acceptable carriers and binders such as crystalline cellulose, gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable and animal fats, fats and oils, gums, polyalkylene glycols, etc. , Stabilizers, solvents, dispersion media, bulking agents, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents and other compounding ingredients for preparation can be added. it can.
  • Examples of formulation in the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent of the embodiment include tablets, capsules, elixirs, and oral preparations used as microcapsules, which are optionally coated with sugar.
  • aseptic solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or those used parenterally in the form of injections of suspensions can be mentioned.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically sterile water, saline, vegetable oils, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavors, excipients, vehicles, preservatives. Examples thereof include those formulated by appropriately combining with an agent, a binder and the like and mixing in a unit dose form required for generally accepted pharmaceutical practice.
  • Additives that can be mixed with tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, traganth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling such as corn starch, gelatin and alginic acid. Agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavors such as peppermint, reddish oil or cherry are used.
  • the dispensing unit form is a capsule, the above-mentioned material can further contain a liquid carrier such as fat or oil.
  • Aseptic compositions for injection can be formulated according to routine formulation practices using vehicles such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannitol, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizers such as.
  • Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol and nonionic surfactants such as Polysorbate 80 (TM), HCO-50 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination as solubilizing agents. It may also be blended with buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, soothing agents such as procaine hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenol and antioxidants.
  • buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, soothing agents such as procaine hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenol and antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the dose of the conjugate to be administered by the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent is 0.1 mg to 1,000 mg in terms of DFO per 1 kg of the subject's body weight, depending on the subject's height, body weight, age, and symptoms. It can be administered in the range of preferably 0.1 mg to 200 mg, more preferably 0.5 mg to 50 mg, still more preferably 1 mg to 20 mg.
  • the dose of ALA to be administered by the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent depends on the subject's height, weight, age, and symptoms, in terms of ALA per kg of subject body weight (ie, in formula (II)).
  • R 21 and R 22 are hydrogen atoms
  • it is preferably administered in the range of 1 mg to 1,000 mg, preferably 5 mg to 100 mg, more preferably 10 mg to 30 mg, and further preferably 15 mg to 25 mg. it can.
  • the dose of ascorbic acid to be administered by the pharmaceutical composition or the therapeutic agent for cancer may be 5 mg or more in terms of ascorbic acid per 1 kg of the body weight of the subject, depending on the height, weight, age and symptoms of the subject. It may be 20 mg or more, for example, 5 mg to 1,000 mg, or 20 mg to 1,000 mg.
  • the dose of ascorbic acid may be 50 mg to 1,000 mg or 250 mg to 1000 mg per 1 kg of the body weight of the subject in terms of ascorbic acid. It may be 400 mg to 1,000 mg, or 500 mg to 800 mg.
  • the number of administrations and the frequency of administration when the ALAs or ascorbic acids and the conjugate of the embodiment are administered to a subject are the administration status (administration interval) of the ALAs or ascorbic acids used in combination and the conjugate. , The number of administrations, and the duration of administration), and those skilled in the art can appropriately determine the appropriate number of administrations and the frequency of administration.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient may be administered before, during, or after the administration of the ALAs or ascorbic acids.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient and the ALAs or ascorbic acids are each effective amount at the same time or at different times, continuously or at intervals with respect to the subject. It can be administered after an interval.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient and the ALAs or ascorbic acids may be administered to a tumor patient in the same administration cycle, or may be administered in different administration cycles. You may.
  • administration of the ALAs or ascorbic acids to a subject is started before administration of a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient is started. ..
  • the ALAs or ascorbic acids may be administered one or more times from one week before the start of administration of the pharmaceutical composition or the cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient to the day of administration. , May be administered daily.
  • the time point of administration of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient is not particularly limited, but the administration of the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient is not particularly limited. It is preferably within 1 week, more preferably within 3 days, and even more preferably within 1 day from the start of administration of the ALAs or ascorbic acids.
  • administration of the ALAs or ascorbic acids to a subject is started on the same day as administration of a pharmaceutical composition or a cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient.
  • the ALAs or ascorbic acids can be administered from the administration start date of the pharmaceutical composition or the cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient.
  • the ALAs or ascorbic acids and the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient are administered at the same time, they may be prepared and administered in a single preparation. It may be administered simultaneously by separate routes of administration.
  • administration of the ALAs or ascorbic acids to a subject is initiated after administration of a pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition or cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment as an active ingredient may be administered once or more from one week before the start of administration of the ALA or ascorbic acid to the day of administration. , May be administered daily.
  • the time when the administration of the ALAs or ascorbic acids is started is not particularly limited, but the administration of the ALAs or ascorbic acids is 1 from the time when the pharmaceutical composition or the cancer therapeutic agent containing the conjugate of the embodiment is contained as an active ingredient. Within a week is preferred, within 3 days is more preferred, and within 1 day is even more preferred.
  • PEG-PBLA n was synthesized by N-carboxyanhydride (NCA) polymerization using PEG 10k -NH 2 as an initiator and BLA-NCA as a monomer.
  • NCA N-carboxyanhydride
  • the carboxy group of the side chain was deprotected under basic conditions to obtain PEG-PAsp n .
  • PEG-PBLA 35 500 mg (0.0284 mmol) and PEG-PBLA 78 500 mg (0.0194 mmol) were weighed in a 50 mL eggplant flask, 5 mL of 0.1 M NaOH was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • 1 1 H-NMR spectra are shown in FIGS. 9 and 11, and GPC curves are shown in FIGS. 10 and 12.
  • calcein-AM is a cell membrane permeable compound that does not show fluorescence by itself, but is hydrolyzed by intracellular esterase to become calcein.
  • This calcein is a compound that exhibits strong yellow-green fluorescence and is retained inside the cell because it is membrane-impermeable.
  • calcein has an iron chelating ability, and its fluorescence disappears when it forms a complex with iron. Therefore, by measuring the fluorescence of calcein, the intracellular iron ion concentration can be indirectly measured.
  • PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 / Fe and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 / Fe also showed characteristic absorption peaks of DFO / Fe, and thus have excellent iron chelating ability. It was confirmed.
  • DLD-1 or CT26 cells were seeded on a 24-well plate at 5.0 ⁇ 10 4 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After diluting the above preparation solution 10-fold with RPMI, 500 ⁇ L was added to each well and incubated for 24 hours. After washing with 500 ⁇ L of D-PBS, 0.100 ⁇ M calcein-AM solution was added, and the cells were incubated in the dark for 30 min for DLD-1 cells and 15 min for CT26 cells. After washing twice with 500 ⁇ L of D-PBS, 150 ⁇ L Trypsin-EDTA solution was added, and the cells were incubated for 10 min for DLD-1 cells and 3 min for CT 26 cells.
  • FIG. 15A shows the measurement results of DLD-1 cells
  • FIG. 15B shows the measurement results of CT26 cells.
  • PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 increased the fluorescence intensity of calcein, indicating a decrease in intracellular iron ion concentration, PEG- It was confirmed that P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 also have iron chelating ability in the ecological environment.
  • ⁇ Propidium Iodide Dojindo Molecular Technologies Inc.
  • ⁇ Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies Inc.
  • CT26 cell mouse colon carcinoma cell line
  • DLD-1 cell human colon adenocarcinoma cell line
  • Cy5-PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 Cy5-NHS was attached to the amino group at the end of PEG-P [Asp (DFO) m ] n .
  • DLD-1 cells were seeded on a 35 mm 2 glass base dish at 5.0 ⁇ 10 4 cells / dish and pre-cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • iron chelating agent used in this example is localized in endosomes / lysosomes, it was suggested that it is taken up by cells by endocytosis.
  • DLD-1 or CT-26 cells were seeded in a 75 mm 2 flask at 5.0 ⁇ 10 6 cells / flask and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. 10 mL of the above prepared solution was added to each flask and incubated for 3 or 24 hours. After washing twice with 5 mL of D-PBS, 2.5 mL Trypsin-EDTA solution was added, and the cells were incubated for 10 min for DLD-1 cells and 5 min for CT-26 cells. After confirming that the cells had peeled off with an optical microscope, 2.5 mL of RPMI medium was added and suspended.
  • FIG. 17A shows the measurement results of DLD-1 cells
  • DLD-1 cells were seeded on a 6-well plate at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours.
  • the above preparation solution was diluted 10-fold with RPMI, 3 mL was added to each well, and the mixture was incubated for 72 hours.
  • 700 ⁇ L of Trypsin-EDTA solution was added and incubated for 10 min.
  • 700 ⁇ L of D-PBS containing 10% FBS was added and sufficiently suspended. The suspension was centrifuged at 1200 rpm for 3 min to remove the supernatant.
  • FIG. 18A is a graph showing the distribution of fluorescence acquired by FCM
  • DFO, PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 significantly suppressed the proliferation of DLD-1 cells.
  • CT26 subcutaneous tumor mouse model 100 ⁇ l of CT26 cell suspension (1.0 ⁇ 10 6 cells / ml) was subcutaneously injected into BALB / c mice.
  • the blood concentration of DFO 1 hour after administration was 0.25% dose / mL, showing rapid disappearance from the blood, while PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO). ) 26 ] 78 showed blood concentrations of 10% dose / mL and 8.6% dose / mL, respectively, 6 hours after administration. Furthermore, PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 accumulated in the tumor due to the EPR effect, and 3.9% dose / g and 4.1 at 6 hours after administration, respectively. The intratumoral concentration of% dose / g was shown.
  • DFO and PEG-P [Asp (DFO) m ] n were intravenously injected into mouse models of DLD-1 and CT26 subcutaneous tumors to evaluate their antitumor effects.
  • DLD-1 and CT26 subcutaneous tumor mouse models 100 ⁇ l of DLD-1 cell suspension (1.0 ⁇ 10 7 cells / ml) and CT26 cell suspension (1.0 ⁇ 10 6 cells / ml) were subcutaneously injected into BALB / c mice and BALB / c nude mice, respectively.
  • mice having a tumor size of 50 to 100 mm 3 were administered 100 ⁇ l of the above prepared solution intravenously (DFO 1.52 ⁇ mol / mouse).
  • the control group received the same amount of PBS as the treatment group by intravenous tail vein injection.
  • the administration schedule is shown below.
  • DLD-1 Subcutaneous tumor mouse model: Once daily 5 times a week, 15 times in total CT26
  • 22 and 23 are the measurement results of the DLD-1 subcutaneous tumor mouse model
  • FIGS. 24 and 25 are the measurement results of the CT26 subcutaneous tumor mouse model.
  • the result shows the value of mean ⁇ SD.
  • PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 have been shown to provide superior antitumor effects compared to DFO.
  • PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 and PEG-P [Asp (DFO) 26 ] 78 achieved tumor accumulation.
  • no weight loss was confirmed during the treatment period it is considered that no serious side effects occurred.
  • DLD-1 cells were seeded on a 35 mm 2 glass base dish at 3.0 ⁇ 10 5 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After removing the solution, 2 mL of the above prepared solution diluted 10-fold with RPMI was added to each dish and incubated for 24 hours. After washing with 2 mL of serum-free RPMI, 1 mL of serum-free RPMI containing 1 ⁇ M Ferro Orange was added, and the mixture was incubated in the dark for 30 min. After that, the fluorescence of Ferro Orange was observed by CLSM. The results obtained are shown in FIG. 27A.
  • DLD-1 cells were seeded on a 35 mm 2 glass base dish at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After removing the solution, 3 mL of the above prepared solution diluted 10-fold with RPMI was added to each well and incubated for 72 hours. Then, 330 ⁇ L of 10 mM BrdU / D-PBS solution was added, and the mixture was incubated for 1 hour. After removing the solution, 1 mL of 1.0 M HCl solution was added and incubated for 10 min.
  • DLD-1 cells were seeded on a 6-well plate at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After removing the solution, 3 mL of the above prepared solution diluted 10-fold with RPMI was added to each well and incubated for 72 h. Then, 330 ⁇ L of 10 mM BrdU / D-PBS solution was added, and the mixture was incubated for 1 hour. After washing with 3 mL of D-PBS, 700 ⁇ L of Trypsin-EDTA solution was added and incubated for 10 min.
  • the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 3 min to remove the supernatant.
  • 500 ⁇ L of 0.1 M sodium tetraborate buffer (pH 8.5) was added and incubated for 2 min.
  • the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 3 min to remove the supernatant.
  • After washing with 1 mL of 1% BSA / 0.5% Tween20 / D-PBS solution 95 ⁇ L of 1% BSA / 0.5% Tween20 / D-PBS solution was added.
  • 5 ⁇ L of FITC-anti-BrdU antibody was added and incubated for 1 hour.
  • DFO and PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 were shown to induce inhibition of DNA synthesis by significantly suppressing BrdU uptake, resulting in cell cycle arrest in S phase. it was thought.
  • DLD-1 cells were seeded on a 6-well plate at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well and pre-cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After removing the solution, 3 mL of the above prepared solution diluted 10-fold with RPMI was added to each well and incubated for 24 hours. After washing with 3 mL of D-PBS, 700 ⁇ L of Trypsin-EDTA solution was added and incubated for 10 min. After confirming that the cells had peeled off with an optical microscope, 700 ⁇ L of RPMI was added and the cells were sufficiently suspended. The suspension was centrifuged at 1200 rpm for 3 min to remove the supernatant.
  • FIG. 29A is a graph showing the distribution of fluorescence acquired by FCM, and FIG.
  • DFO and PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 markedly increased the proportion of apoptotic and necrotic cells.
  • CT26 subcutaneous tumor mouse model 100 ⁇ l of CT26 cell suspension (1.0 ⁇ 10 6 cells / ml) was subcutaneously injected into BALB / c mice.
  • PEG-P [Asp (DFO) 10 ] 35 was shown to provide superior protoporphyrin accumulation in tumors compared to Control and DFO.
  • FIG. 31 is a graph showing the effect of PEG-P [Asp (DFO) 36 ] 76 on vitamin C treatment in vitro.
  • the concentration in the graph shows the concentration equivalent to DFO in PEG-P [Asp (DFO) 36 ] 76 .
  • FIG. 32 is a graph showing the effect of PEG-P [Asp (DFO) 36 ] 76 on vitamin C treatment in vivo. Results are shown as mean ⁇ standard deviation.
  • PEG-P [Asp (DFO) 36 ] 76 showed a high therapeutic effect when used in combination with high-concentration vitamin C.
  • the effect of PEG-P [Asp (DFO) 36 ] 76 tends to be higher when the dose is 0.9 mg / mouse and when the dose is 0.9 mg / mouse and when the dose is 0.9 mg / mouse. It was shown to be.
  • the iron chelating agent and 5-aminolevulinic acid used in this example showed an improvement in the amount of protoporphyrin IX accumulated in the tumor. It has been shown that the iron chelating agent used in this example is suitable for use in photodynamic diagnosis and / or treatment with 5-aminolevulinic acid. Furthermore, the administration of the iron chelating agent and vitamin C used in this example exerts an excellent antitumor effect, and the iron chelating agent used in this example is suitable for use in vitamin C therapy. Shown.

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Abstract

デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物であるデフェロキサミン類と、生体適合性高分子と、が結合し、前記生体適合性高分子が、第１の生体適合性高分子鎖と、前記第１の生体適合性高分子鎖とは異なる第２の生体適合性高分子鎖とを含む、結合体。

Description

結合体、及び癌治療剤
　本発明は、デフェロキサミン類との結合体、及び癌治療剤に関する。
　本願は、２０１９年４月２４日に、日本に出願された特願２０１９－０８３２５０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　がん細胞は増殖するうえで必須である鉄の要求量が高く、鉄キレート剤をがん治療薬へと応用する鉄キレート療法は、がん治療への新たなアプローチとして注目を集めている。多数ある鉄キレート剤の中でも、鉄（III）イオンに対して特異的なキレート作用を示すデフェロキサミン（ＤＦＯ）は、鉄過剰症の治療薬として広く使用されていることから、これまでに最も盛んに研究され、種々のがん細胞株に対して、細胞周期停止を介した細胞増殖抑制効果を示すことが報告されている（非特許文献１－３）。また、臨床研究も進められており、一定の抗腫瘍効果が示されている（非特許文献４及び５）。
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　しかしながら、ＤＦＯの血中濃度半減期は２０分以下と極めて短く、十分な治療効果を得るには、点滴により長時間（８ｈ～）にわたって投与する必要がある（非特許文献４－６）。また、腫瘍への選択的な集積性を持たないため、全身への副作用も懸念される。
　前者の早期消失性の問題は、ＤＦＯをデキストランやヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）といった高分子に結合させることで改善され（非特許文献７）、ＨＥＳに結合させたＤＦＯ（ＨＥＳ－ＤＦＯ）を投与された白血病ラットでは生存期間の延長が報告されている（非特許文献８）。しかし、ＨＥＳ－ＤＦＯの腫瘍集積性は検討されておらず、高分子修飾されたＤＦＯが固形がんに対して抗腫瘍効果を示したという例は、いまだ報告されていない。
　本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、血中滞留性に優れ、更には腫瘍集積性を有し、優れた抗腫瘍効果を発揮する、結合体及び癌治療剤を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は以下の態様を有する。
＜１＞デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物であるデフェロキサミン類と、生体適合性高分子と、が結合し、前記生体適合性高分子が、第１の生体適合性高分子鎖と、前記第１の生体適合性高分子鎖とは異なる第２の生体適合性高分子鎖とを含む、結合体。
＜２＞前記デフェロキサミン類が、前記第２の生体適合性高分子鎖に結合した、前記＜１＞に記載の結合体。
＜３＞前記第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である、前記＜１＞又は＜２＞に記載の結合体。
＜４＞　前記第１の生体適合性高分子鎖がポリエチレングリコールである、前記＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の結合体。
＜５＞下記一般式（１）又は（１－１）で表される構造を含む、前記＜１＞～＜４＞のいずれか一つに記載の結合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式（１）～（１－１）中、
　Ａは、前記第１の生体適合性高分子鎖を表し、
　Ｌは、リンカー部を表し、
　Ｂは、前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、下記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含む。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式（ｂ１）～（ｂ２）中、
　Ｒ１は、アミノ酸側鎖を表し、
　Ｒ２は、アミノ酸側鎖と前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
　ｎは（ｂ１）及び（ｂ２）の合計数を表し、ｎは１～１０００の整数であり、ｍは１～１０００の整数であり（ただしｍ≦ｎ）、ｎ－ｍが２以上である場合、複数個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍが２以上である場合、複数個のＲ２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
＜６＞下記一般式（１－２）で表される構造を含む、前記＜５＞に記載の結合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式（１－２）中、
　Ｂは、前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、下記（ｂ２－１）表される繰り返し構造、又は（ｂ１－１）表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）表される繰り返し構造を含む。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式（ｂ１－１）～（ｂ２－１）中、
　Ｒ１１は、アミノ酸側鎖を表し、
　Ｒ１２は、－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるアスパラギン酸側鎖、又は－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるグルタミン酸側鎖におけるカルボキシル基と、前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
　ｎ１は（ｂ１－１）及び（ｂ２－１）の合計数を表し、ｎ１は１～１０００の整数であり、ｍ１は１～１０００の整数であり（ただしｍ１≦ｎ１）、ｎ１－ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
＜７＞数平均分子量が２，０００～２００，０００である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか一つに記載の結合体。
＜８＞前記＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の結合体を有効成分として含有する癌治療剤。
　本発明によれば、血中滞留性に優れ、更には腫瘍集積性を有し、優れた抗腫瘍効果を発揮する、結合体及び癌治療剤を提供できる。
実施例で作製したPEG-PBLA35の1H NMRスペクトルである。 PEG-PBLA35のGPCカーブである。 実施例で作製したPEG-PBLA78の1H NMRスペクトルである。 PEG-PBLA78のGPCカーブである。 実施例で作製したPEG-PAsp35の1H NMRスペクトルである。 PEG-PAsp35のGPCカーブである。 実施例で作製したPEG-PAsp78の1H NMRスペクトルである。 PEG-PAsp78のGPCカーブである。 実施例で作製したPEG-P[Asp(DFO)10]35の1H NMRスペクトルである。 PEG-P[Asp(DFO)10]35のGPCカーブである。 実施例で作製したPEG-P[Asp(DFO)26]78の1H NMRスペクトルである。 PEG-P[Asp(DFO)26]78のGPCカーブである。 Calcein-AM 法の原理を説明する概要図である。 DFO/Fe及びPEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)/FeのUV-Visスペクトルである。 フローサイトメトリーにより取得した、calcein 蛍光の蛍光強度を示すグラフである。 フローサイトメトリーにより取得した、calcein 蛍光の蛍光強度を示すグラフである。 Cy5-PEG-PAsp(DFO)を加えて２４時間インキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の様子を示す共焦点顕微鏡の観察画像である。 DFO 及び PEG-P[Asp(DFO)10]35の細胞取り込み量を示すグラフである。 DFO 及び PEG-P[Asp(DFO)10]35の細胞取り込み量を示すグラフである。 DFO及びPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。 DFO及びPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。 PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78) を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞において、細胞増殖が抑制されたことを示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルにおいて、DFOと PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)とでの、血中滞留性を比較した結果を示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルにおいて、DFOと PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)とでの、腫瘍集積性を比較した結果を示すグラフである。 DLD-1皮下腫瘍マウスモデルにおける、DFO又は PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)の投与による、腫瘍サイズの経時変化を示すグラフである。 DLD-1皮下腫瘍マウスモデルの、DFO又は PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)の投与による、体重の経時変化を示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルにおける、DFO又は PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)の投与による、腫瘍サイズの経時変化を示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルの、DFO又は PEG-P[Asp(DFO)m]n (n＝35, 78)の投与による、体重の経時変化を示すグラフである。 ５－アミノレブリン酸を用いた光線力学診断及び／又は治療の原理を説明する概要図である。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35、及びFerroOrangeを加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の様子を示す共焦点顕微鏡の観察画像である。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞質内自由鉄の量を解析した結果を示すグラフである。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35、及びFITC-抗BrdU 抗体を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の様子を示す共焦点顕微鏡の観察画像である。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞の、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞におけるアポトーシス誘導の状況を、ＦＣＭにより解析した結果を示すグラフである。 DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35を加えてインキュベーションした後のＤＬＤ－１細胞を、生細胞、アポトーシス初期細胞、又はアポトーシス後期・ネクローシス細胞に換算した結果を示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルにおける、DFO又はPEG-P[Asp(DFO)10]35の投与による、腫瘍中のプロトポルフィリンIX蓄積の経時変化を示すグラフである。 CT26細胞の培養液にビタミンC及びPEG-P[Asp(DFO)36]76を添加し、がん細胞の殺傷効果が確認されたことを示すグラフである。 CT26皮下腫瘍マウスモデルにおける、ビタミンＣ、又はビタミンＣ及びPEG-P[Asp(DFO)36]76の投与による、腫瘍サイズの経時変化を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態における、結合体及び癌治療剤を説明する。
≪結合体≫
　実施形態の結合体は、デフェロキサミン類と、生体適合性高分子と、が結合し、前記生体適合性高分子が、第１の生体適合性高分子鎖と、前記第１の生体適合性高分子鎖とは異なる第２の生体適合性高分子鎖とを含むものである。
　実施形態の結合体は、デフェロキサミン類に由来する鉄キレート作用を有するものであり、鉄（ＩＩＩ）イオンに対して特異的なキレート作用を有することが好ましい。
　実施形態の結合体は、デフェロキサミン類と、高分子と、が結合し、前記高分子が、第１の高分子鎖と、前記第１の高分子鎖とは異なる第２の高分子鎖とを含むものであってよく、前記高分子は生体適合性高分子であってよい。
＜デフェロキサミン類＞
　本明細書において「デフェロキサミン類」とは、デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を意味する。
　デフェロキサミンは、下記式（Ｉ）で表される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」という」として知られている。デフェロキサミンは、多数ある鉄キレート剤の中でも鉄（ＩＩＩ）イオンに対して特異的なキレート作用を示し、鉄過剰症の治療薬としても広く使用されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　デフェロキサミンは、イオン若しくは塩の形態で提供され得る。上記化合物（Ｉ）のデフェロキサミンのイオンとしては、化合物（Ｉ）がカチオンとなったものでもよく、化合物（Ｉ）がアニオンとなったものでもよい。
　化合物（Ｉ）がカチオンとなったものとしては、化合物（Ｉ）において「－ＮＨ２」で表される基にプロトンが付加して、「―ＮＨ３ ＋」で表されるカチオン部となったものが挙げられる。
　化合物（Ｉ）のイオンとしては、例えば下記式（Ｉ－１）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　デフェロキサミンの塩としては、例えば、薬理学的に許容される塩が挙げられ、下記式（Ｉ－２）で表されるデフェロキサミンメシル酸塩が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
　デフェロキサミンの誘導体としては、上記鉄キレート作用を有するものであれば特に制限されない。デフェロキサミンの誘導体としては、デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩において、１個以上の水素原子又は基が、それ以外の基（置換基）で置換されたものが挙げられる。また、デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩において、水素原子が付加または脱離されたものであってもよい。ここで置換基としては、水酸基、アミノ基、炭素数１～４の１価の鎖状飽和炭化水素基、ハロゲン原子等が挙げられる。炭素数１～４の１価の鎖状飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子等が挙げられる。
　デフェロキサミンの鉄キレート作用は、下記式（Ｉ－３）中に示す、３つのヒドロキサム酸構造部分により発揮されるとされる。したがって、鉄キレート作用に影響を及ぼし難いことから、例えば、上記の化合物（Ｉ）においては、末端の「－ＮＨ２」で表される基（上記の化合物（Ｉ－１）においては、末端の「－ＮＨ３ ＋」で表される基）を構成する水素原子の１個以上がそれ以外の基（前記置換基）で置換されたものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
＜生体適合性高分子＞
　本実施形態の結合体において、生体適合性高分子とは、生体に投与した場合に、強い炎症反応や傷害等の著しい有害作用や悪影響を、及ぼさない又は及ぼしにくいポリマーを意味する。
　生体適合性高分子としては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等が挙げられる。生体適合性ポリマーは、一部にその合成過程で導入された任意の基を有していてもよい。このような基としては、例えば重合開始剤の一部等が挙げられる。
　本実施形態に係る生体適合性高分子は、第１の生体適合性高分子鎖と、第２の生体適合性高分子鎖とを含む。なお、前記第１の生体適合性高分子鎖と第２の生体適合性高分子鎖とは異なるものであり、本実施形態の生体適合性高分子は、第１の生体適合性高分子鎖のブロックと第２の生体適合性高分子鎖のブロックを含むブロック共重合体として提供できる。また、本実施形態に係る生体適合性高分子は、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖の他に、さらに別の高分子鎖を含むことができる。
　本実施形態において、「ブロック共重合体」とは、複数種類のブロック（同種の構成単位が繰り返し結合した部分構成成分）が結合した高分子である。ブロック共重合体を構成するブロックは、２種類であってもよく、３種類以上であってもよい。
　生体適合性高分子の数平均分子量（Ｍｎ）は、本実施形態の結合体の分子量に応じても適宜定めることができるが、
　第１の生体適合性高分子鎖の１Ｈ ＮＭＲにより算出された数平均分子量は、７００～１００，０００が好ましく、２，０００～５０，０００がより好ましく、７，０００～３０，０００がさらに好ましい。
　第２の生体適合性高分子鎖の１Ｈ ＮＭＲにより算出された数平均分子量は、７００～１００，０００が好ましく、２，０００～５０，０００がより好ましく、７，０００～３０，０００がさらに好ましい。
　第１の生体適合性高分子鎖と第２の生体適合性高分子鎖との数平均分子量比（第１の生体適合性高分子鎖：第２の生体適合性高分子鎖）は、例えば、１０：１～１：１０であってよく、１０：３～３：１０であってよい。
　生体適合性高分子の分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．０以上２．０未満が好ましく、１．０～１．５がより好ましく、１．０～１．３がさらに好ましく、１．０～１．２が特に好ましい。実施形態の結合体が、優れた腫瘍集積性をより効果的に発揮可能との観点からは、生体適合性高分子の分散度が上記範囲内にあることが好ましい。
　本明細書において、高分子の数平均分子量は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルによるピーク積分値の比から算出した値を採用できる。算出方法としては、例えば後述の実施例で示すように、高分子鎖末端に存在する開始剤由来の構造のピーク積分値と、算出対象部分のモノマー由来の構造のピーク積分値との比から、モノマーの重合度を算出し、重合したモノマー由来の構造の合計分子量を開始剤由来の構造の分子量に加算することで数平均分子量を算出可能である。
　後述する結合体の数平均分子量についても、１Ｈ ＮＭＲスペクトルによるピーク積分値の比から算出した値を一部採用できる。算出方法としては、例えば後述の実施例で示すように、高分子鎖末端に存在する開始剤由来の構造のピーク積分値と、算出対象部分のＤＦＯ由来の構造のピーク積分値との比から、ＤＦＯの結合数を算出し、結合したＤＦＯ由来の構造の合計分子量を高分子鎖の数平均分子量に加算することで算出可能である。
　第１の生体適合性高分子鎖又は第２の生体適合性高分子鎖は、生体適合性及び汎用性に優れるとの観点から、ポリエチレングリコールであることが好ましい。
　第１の生体適合性高分子鎖又は第２の生体適合性高分子鎖は、生体適合性及び生体安定性と生体分解性とのバランスに優れるとの観点から、ポリアミノ酸であることが好ましい。
　生体適合性高分子が含む第１の生体適合性高分子鎖と、第２の生体適合性高分子鎖との組み合わせとしては、例えば、第１の生体適合性高分子鎖がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である組み合わせが好ましい。
　本実施形態の結合体において、生体適合性高分子は生体分解性であることが好ましい。
　生体分解性とは、生体内で吸収又は分解され得る性質を意味する。生体分解性である生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等が挙げられる。
　本明細書において、生体適合性高分子が生体分解性であるとは、生体適合性高分子の少なくとも一部が生体分解性であることを意味する。したがって、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等と、ＰＥＧ、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリウレタン等とのブロックコポリマー等も生体分解性の生体適合性高分子に該当する。
　生体分解性であるポリマーを用いることにより、結合体の生体内への蓄積を抑制することができ、副作用を低減させることができる。
　本明細書において、生体安定性とは、生体内で即時に吸収又は即時に分解されることなく、存在可能であることを意味する。生体適合性高分子が生体分解性且つ生体安定性を有する場合には、生体内で吸収又は分解されるまでの間、生体内で存在可能であることを意味する。
　本明細書において、生体適合性高分子が生体安定性であるとは、生体適合性高分子の少なくとも一部が生体安定性であることを意味する。したがって、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等と、ＰＥＧ、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリウレタン等とのブロックコポリマー等も生体安定性の生体適合性高分子に該当する。
　第１の生体適合性高分子鎖と第２の生体適合性高分子鎖とを含む生体適合性高分子の製造方法は、特に制限されない。例えば、第１の生体適合性高分子鎖を公知の重合反応により合成した後、第１の生体適合性高分子鎖に、第２の生体適合性高分子鎖の単量体を重合させる方法により製造することができる。重合反応によって得られた前記高分子鎖は、それぞれ前駆体（例えば保護基を有するもの）の状態であってもよく、重合反応によって得られた前駆体に対して当業者により選択された通常の処理を行い、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖を製造してもよい。
　或いは、予め重合体として提供された、第１の生体適合性高分子鎖又はその前駆体と、第２の生体適合性高分子鎖又はその前駆体とを、公知の反応によって結合させることができる。その際、反応性の官能基同士の結合を利用して、両者を結合させてもよい。前駆体を用いる場合には、同様に適宜処理を行い、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖を製造することができる。
＜結合体＞
　本実施形態の結合体は、デフェロキサミン類と、生体適合性高分子とが結合したものである。
　なお、生体適合性高分子とデフェロキサミン類との結合は、生体適合性高分子とデフェロキサミン類とが直接結合してもよく、任意のリンカーを介して結合してもよく、本発明の効果が得られる限り、その結合様式は特に制限されない。
　生体適合性高分子とデフェロキサミン類とは、体内での結合の安定性を保つため、共有結合により結合されていることが好ましい。
　例えば、生体適合性高分子とデフェロキサミン類との互いの反応性の官能基同士の結合を利用して結合させてもよい。反応性の官能基は、生体適合性高分子及び／又はデフェロキサミン類が元から有しているものでもよく、改変又は導入されたものであってもよい。
　生体適合性高分子とデフェロキサミン類との結合においては、デフェロキサミン類及び生体適合性高分子は、それぞれ、本発明の効果が得られる限り、それらが結合するのに必要な構造の変化を受けてもよい。
　実施形態の結合体において、デフェロキサミン類は、生体適合性高分子に１つのみ結合してもよく、２つ以上結合してもよい。
　本実施形態の結合体における、デフェロキサミン類の個数は、１以上の整数であればよく、１～１０００の整数であってよく、３～１００の整数であってよく、５～５０の整数であってよい。
　上記個数が上記下限値以上であることで、デフェロキサミン類の鉄キレート作用が良好に発揮され、上記個数が上記上限値以下であることで、結合体の親水性が適度に向上し好ましい。
　本実施形態の結合体において、デフェロキサミン類は、生体適合性高分子のうちのいずれの箇所とも結合可能である。デフェロキサミン類は、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖に結合してもよい。
　例えば、デフェロキサミン類は、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖の有する官能基と結合してもよい。
　当該結合様式は、特に限定されるものではないが、例えば、上記の化合物（Ｉ）のデフェロキサミンにおいては、「－ＮＨ２」で表される基（アミノ基）との結合であると、デフェロキサミンの鉄キレート作用に影響を及ぼし難く、またデフェロキサミンを改変したり誘導体化したりする必要が生じない。このことから、例えば、デフェロキサミン類は、デフェロキサミン類のアミノ基と、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖の有する“アミノ基と結合可能な基”とが結合してもよい。
　アミノ基と結合可能な基としては、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基又はカルボニル基が挙げられる。これらの基は、前記高分子鎖の側鎖が有するものであってよい。
　なかでも、アミノ基との結合安定性および合成容易性の観点からは、アミノ基と結合可能な基としては、カルボキシル基が好ましい。第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖はカルボキシル基を有するものであってよい。第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖のカルボキシル基と、デフェロキサミン類のアミノ基と、でアミド結合を形成させて、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖とデフェロキサミン類とを結合させることができる。
　分子内にカルボキシル基を有する生体適合性高分子鎖としては、ポリアミノ酸や、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸等が挙げられる。
　カルボシキル基は、保護基で保護されたカルボキシル基であってもよい。
　カルボキシル基又は保護基で保護されたカルボキシル基を有しない生体適合性高分子鎖の場合、クロロ酢酸、無水コハク酸、クロロギ酸－ｐ－ニトロフェニル等を用いた公知の方法によりカルボキシル基を導入することができる。
　例えば、生体適合性ポリマーがポリアクリルアミドである場合、アクリル酸又はアクリル酸ベンジルを原料として、フリーラジカル重合又はリビングラジカル重合等の公知の製造方法により、カルボキシル基、又は保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性高分子を製造することができる。
　カルボキシル基とアミノ基とでアミド結合を形成させる方法としては、例えば、カルボキシル基を有する生体適合性高分子鎖とアミノ基を有するデフェロキサミン類とを、Ｎ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤の存在下で縮合反応させることが挙げられる。また、保護基で保護されたカルボキシル基を有する生体適合性高分子鎖の場合、公知の反応で保護基を脱保護し、カルボキシル基を有する生体適合性高分子鎖を得た後、同様に縮合反応させることができる。
　また、デフェロキサミン類は、第１の生体適合性高分子鎖又は第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方のみに結合してもよい。例えば、デフェロキサミン類は、第２の生体適合性高分子鎖に結合することができる。例えば、第２の生体適合性高分子鎖が側鎖を有するものであり、デフェロキサミン類が、第２の生体適合性高分子鎖の側鎖と結合したものであってよい。
　本実施形態の結合体の一例として、下記一般式（１）又は（１－１）で表される構造を含むものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式（１）～（１－１）中、Ａは、前記第１の生体適合性高分子鎖を表し、Ｌはリンカー部を表し、Ｂは、前記デフェロキサミン類と結合した前記第２の生体適合性高分子鎖を表す。）
　前記リンカー部は、炭素原子数１～２０のアルキレン基であることが好ましく、炭素原子数１～２０の直鎖状のアルキレン基であることが好ましく、炭素原子数１～５の直鎖状のアルキレン基であることがより好ましい。該アルキレン基中の１個又は２個以上の－ＣＨ２－は、それぞれ独立して－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯＮＨ－によって置換されていてもよい。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等を例示できる。
　本実施形態の結合体において、デフェロキサミン類が結合した第２の生体適合性高分子鎖は、ポリアミノ酸であることが好ましい。
　第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である場合、上記一般式（１）又は（１－１）におけるＢとしては、以下が好ましい。
　Ｂは、前記デフェロキサミン類と結合した前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、第２の生体適合性高分子鎖は、下記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式（ｂ１）～（ｂ２）中、
　Ｒ１は、アミノ酸側鎖を表し、
　Ｒ２は、アミノ酸側鎖と前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
　ｎは（ｂ１）及び（ｂ２）の合計数を表し、ｎは１～１０００の整数であり、ｍは１～１０００の整数であり（ただしｍ≦ｎ）、ｎ－ｍが２以上である場合、複数個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍが２以上である場合、複数個のＲ２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
　アミノ酸側鎖とは、当分野における通常の意味で用いられ、ポリペプチドのアミド結合に関与するアミノ基とカルボキシ基以外の構造を指し、例えば、グリシンであれば水素原子であり、アラニンであればメチル基であり、バリンであればイソプロピル基である。
　第２の生体適合性高分子鎖が、（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含む場合、（ｂ１）と（ｂ２）の配列はランダムであってよい。ｍは第２の生体適合性高分子鎖における（ｂ２）の合計数を表し、ｎ－ｍは第２の生体適合性高分子鎖における（ｂ１）の合計数を表す。ｎ－ｍは０であってもよい（すなわち、第２の生体適合性高分子鎖は（ｂ１）及び（ｂ２）のうち、デフェロキサミン類と結合した（ｂ２）のみを有していてもよい。）。
　第２の生体適合性高分子鎖は、上記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造からなるものであってもよい。
　また、Ｒ１のアミノ酸側鎖とＲ２のアミノ酸側鎖とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
　式（ｂ１）～（ｂ２）中、ｎは１～１０００の整数であり、１０～５００の整数であってよく、２０～１００の整数であってよい。上記ｎの値が上記範囲内であることで、第２の生体適合性高分子鎖の分子量の値が好適なものとなり好ましい。
　式（ｂ１）～（ｂ２）中、ｍは１～１０００の整数であり、３～１００の整数であってよく、５～５０の整数であってよい。上記ｍの値が上記下限値以上であることで、デフェロキサミン類の鉄キレート作用が良好に発揮され、上記ｍの値が上記上限値以下であることで、結合体の親水性が良好となり好ましい。
　なお、ここでは、ｎがｍよりも大きい場合の数値範囲も例示しているが、ｎとｍとは同一の数であってもよい。
　ポリアミノ酸とデフェロキサミン類との結合様式は、特に限定されるものではないが、ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖とデフェロキサミン類との結合が好ましい。ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖にデフェロキサミン類を結合させる方法としては、リジンの側鎖のアミノ基とのアミド結合、システインの側鎖のチオール基とのジスルフィド結合を形成させる方法などが挙げられる。上述のとおり、例えば、上記の化合物（Ｉ）のデフェロキサミンにおいては、「－ＮＨ２」で表される基（アミノ基）との結合であると、デフェロキサミンの鉄キレート作用に影響を及ぼし難く、またデフェロキサミンを誘導体化する必要が生じないことから、アスパラギン酸側鎖又はグルタミン酸側鎖のカルボキシル基と、デフェロキサミン類のアミノ基とのアミド結合を形成させる方法が好ましい。
　第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸であり、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を構成単位として含む場合、上記一般式（１）又は（１－１）におけるＢとしては、以下が好ましい。
　Ｂは、前記デフェロキサミン類と結合した前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、第２の生体適合性高分子鎖は、下記（ｂ２－１）表される繰り返し構造、又は（ｂ１－１）表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）表される繰り返し構造を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式（ｂ１－１）～（ｂ２－１）中、
　Ｒ１１は、アミノ酸側鎖を表し、
　Ｒ１２は、－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるアスパラギン酸側鎖、又は－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるグルタミン酸側鎖におけるカルボキシル基と、前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
　ｎ１は（ｂ１－１）及び（ｂ２－１）の合計数を表し、ｎ１は１～１０００の整数であり、ｍ１は１～１０００の整数であり（ただしｍ１≦ｎ１）、ｎ１－ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
　第２の生体適合性高分子鎖が、（ｂ１－１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）で表される繰り返し構造を含む場合、（ｂ１－１）と（ｂ２－１）の配列はランダムであってよい。ｎ１及びｍ１は、上記ｎ及びｍの関係と同じであり、ｎ及びｍとして説明した数値等をｎ１及びｍ１にも適用できる。
　第２の生体適合性高分子鎖は、上記（ｂ２－１）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１－１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）で表される繰り返し構造からなるものであってもよい。
　また、Ｒ１１のアミノ酸側鎖とＲ１２のアミノ酸側鎖とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
　第１の生体適合性高分子鎖は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。
　第１の生体適合性高分子鎖が、ポリエチレングリコールであり、第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸であって、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を構成単位として含む場合、上記一般式（１）で表される構造としては、下記一般式（１－２）で表される構造が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式（１－２）中、
　ｌは１～１５００の整数であり、Ｂは、前記デフェロキサミン類と結合した前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、第２の生体適合性高分子鎖は、下記（ｂ２－１）表される繰り返し構造、又は（ｂ１－１）表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）表される繰り返し構造を含む。）
　式（１－２）中、ｌは１～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式（ｂ１－１）～（ｂ２－１）中、Ｒ１１、Ｒ１２、ｎ１、及びｍ１は前記と同一の意味を表す）。
　本実施形態の結合体は、数平均分子量（Ｍｎ）が２，０００～２００，０００であることが好ましく、例えば５，０００～１００，０００であってもよく、１０，０００～５０，０００であってもよく、１７，０００～４５，０００であってもよく、２０，０００～４０，０００であってもよい。
　結合体の数平均分子量が上記の範囲であることにより、結合体の血中滞留性、腫瘍組織への集積性を適度に向上させ、また、肝臓等の正常組織への集積を防止できる。この結果、デフェロキサミン類を効率よく腫瘍組織に送達することが可能になる。
　結合体の腫瘍集積性は、腫瘍の亢進した血管漏出性を利用した腫瘍への選択的な集積、すなわちｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果（ＥＰＲ効果）により発揮されるものと考えられ、腫瘍内での選択的な除鉄により、より優れた抗腫瘍効果を達成する。
　また、結合体は、高分子ミセルを形成していてもよく、高分子ベシクルの形態であってもよい。
　本実施形態の結合体は、血中滞留性に優れ、更には腫瘍集積性を有し、優れた抗腫瘍効果を発揮する、非常に優れたものである。
　従来、ＤＦＯは血中滞留性に乏しいため、点滴により連続投与する必要があった。一方で、本実施形態の結合体は、優れた血中滞留性を有するので、より間隔を空けた投与形態とでき、容易に処方可能である。
　本実施形態の結合体は、優れた腫瘍集積性を有するので、正常組織への薬物の集積を誘導することなく、腫瘍組織への薬物の集積のみを向上させることができる。この結果、本実施形態の結合体によれば、高い薬効と低い副作用を達成することができる。
　従来、ＤＦＯをデキストランやヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）といった高分子に結合させることが行われていたが、高分子修飾されたＤＦＯが固形がんに対して抗腫瘍効果を示したという例は、いまだ報告されていない。
　本実施形態の結合体が、優れた血中滞留性及び腫瘍集積性を有するのは、生体適合性高分子が、第１の生体適合性高分子鎖と、前記第１の生体適合性高分子鎖とは異なる第２の生体適合性高分子鎖とを含むことに起因するものと考えられる。結合体が異なる種類の高分子鎖を含むことで、これを生体内に投与すると、異なる種類の鎖同士が互いに混在しないよう、生体内の他の分子と結合し、安定化することが考えられる。実施形態の結合体は、例えば、本実施形態の結合体と、がん集積性タンパク質である血清アルブミン等との親和性が向上し、より優れた腫瘍集積性と抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。
≪癌治療剤≫
　本発明の一実施形態として、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
　本発明の一実施形態として、実施形態の結合体を有効成分として含有する癌治療剤を提供する。
　上記実施形態の結合体は、鉄キレート作用を有することから、鉄キレート作用を利用して、種々の疾患に対する治療効果が期待される。
　治療効果が期待される対象疾患としては、鉄過剰症の他、鉄要求性のがんを挙げることができ、例えば固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、さらに他の抗がん剤等を含んでいてもよい。かかる構成により、がん治療に対する相乗効果が期待できる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、５－アミノレブリン酸またはその誘導体、塩もしくはエステル（以下、単に「ＡＬＡ類」とも称する。ＡＬＡ類の詳細については後述する。）を用いた光線力学診断及び／又は治療に使用することができる。以下、５－アミノレブリン酸を用いた光線力学診断及び／又は治療の原理について説明する。
　図２６に示すように、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）は細胞に取りこまれた後、ヘム生合成経路に使われる。その代謝中間体であるプロトポルフィリンＩＸは、がん細胞選択的に蓄積することが知られている。プロトポルフィリンＩＸは光感受性物質であるため、特定波長の光を照射することにより、傷害を与える活性酸素を癌細胞内で発生させ、がん細胞を殺傷できる（光線力学治療）。また、プロトポルフィリンＩＸに特定波長（例えば400-410nm）の光を照射することにより赤色蛍光が発せられ、癌細胞を効果的に可視化できる（光線力学診断）。
　しかし、例えば、がんの再発にも深く関わるとされるがん幹細胞は、鉄の取り込み量が特に高いため、プロトポルフィリンＩＸの代謝が亢進している。がん幹細胞においては、プロトポルフィリンＩＸが蓄積しないため、治療効果の低減が懸念される。
　そこで、非特許文献９に示す通り、実施形態の癌治療剤を用いてがん細胞内の鉄イオンをキレートすることで、がん細胞選択的にプロトポルフィリンＩＸ蓄積性を高め、光線力学診断及び／又は治療の効果を向上させることができると考えられる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、光線力学診断及び／又は治療に使用されるものとして、単独で提供されてもよく、前記ＡＬＡ類との合剤や組み合わせ製剤等の剤型で提供されてもよい。
　一実施形態として、前記ＡＬＡ類と、実施形態の結合体とを、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
　一実施形態として、前記ＡＬＡ類と、実施形態の結合体とを、治療を必要とする対象に投与することを含む癌の治療方法を提供する。
　一実施形態として、前記ＡＬＡ類が投与されるまたは投与されている対象に投与するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、実施形態の結合体が投与されるまたは投与されている対象に投与するための、前記ＡＬＡ類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療のための、実施形態の結合体を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療のための、前記ＡＬＡ類及び実施形態の結合体を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療のための、実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療のための、前記ＡＬＡ類及び実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療に使用するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療に使用するための、前記ＡＬＡ類及び実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療に使用するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と、前記ＡＬＡ類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と、を備えたキットを提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療に使用するための医薬の製造における、実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対する光線力学診断及び／又は治療に使用するための医薬の製造における、前記ＡＬＡ類及び実施形態の結合体の使用を提供する。
　上記対象としては、癌患者を例示する。
　上記の癌に対する光線力学診断及び／又は治療は、前記ＡＬＡ類及び／又は実施形態の結合体が投与された対象の有する細胞に、光線を照射することを含む。前記細胞は、腫瘍を含む概念である。前記光線の波長は公知であり、癌細胞内で活性酸素を発生可能なものであればよい。
　本明細書において、ＡＬＡは、５－アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ－アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。
　ＡＬＡの誘導体としては、下記式（ＩＩ）で表される化合物を例示することができる。式（ＩＩ）において、Ｒ２１は、水素原子またはアシル基を表し、Ｒ２２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基またはアラルキル基を表す。なお、式（ＩＩ）において、ＡＬＡは、Ｒ２１およびＲ２２が水素原子の場合に相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ＡＬＡ類は、生体内で式（ＩＩ）のＡＬＡまたはその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することもできる。
　式（ＩＩ）のＲ２１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖または分岐状の炭素数１～８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１－ナフトイル、２－ナフトイル基等の炭素数７～１４のアロイル基を挙げることができる。
　式（ＩＩ）のＲ２２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖または分岐状の炭素数１～８のアルキル基を挙げることができる。
　式（ＩＩ）のＲ２２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１－シクロヘキセニル基等の飽和、または一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３～８のシクロアルキル基を挙げることができる。
　式（ＩＩ）のＲ２２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６～１４のアリール基を挙げることができる。
　式（ＩＩ）のＲ２２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７～１５のアラルキル基を挙げることができる。
　好ましいＡＬＡ誘導体としては、Ｒ２１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ２２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ２１とＲ２２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。
　ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡまたはその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
　ＡＬＡ類のエステルとしては、これに限定されるものではないが、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステル等を挙げることができる。
　以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、および、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。
　上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物または溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独でまたは２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。
　上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、アスコルビン酸若しくはその誘導体又はその塩（以下、単に「アスコルビン酸類」とも称する。アスコルビン酸類の詳細については後述する。）を用いたビタミンＣ療法に使用することができる。以下、アスコルビン酸を用いたビタミンＣ療法の原理について説明する。
　薬理学的濃度のビタミンＣ（アスコルビン酸）を静脈注射すると、腫瘍内の細胞外領域で過酸化水素（H2O2）を産生し、この過酸化水素が腫瘍細胞に浸透して抗腫瘍効果をもたらすことが知られている（ビタミンC療法） [Q. Chen, M. G. Espey, M. C. Krishna, J. B. Mitchell, C. P. Corpe, G. R. Buettner, E. Shacter, M. Levine, Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells: action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 13604-13609 (2005)., Q. Chen, M. G. Espey, A. Y. Sun, J. H. Lee, M. C. Krishna, E. Shacter, P. L. Choyke, C. Pooput, K. L. Kirk, G. R. Buettner, M. Levine, Ascorbate in pharmacologic concentrations selectively generates ascorbate radical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8749-8754 (2007)., Q. Chen, M. G. Espey, A. Y. Sun, C. Pooput, K. L. Kirk, M. C. Krishna, D. S. Khosh, J. Drisko, M. Levine, Pharmacologic doses of ascorbate act as a prooxidant and decrease growth of aggressive tumor xenografts in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 11105-11109 (2008).]。
　一方、最近の研究 [M. Mojic, J. Bogdanovic Pristov, D. Maksimovic-Ivanic, D. R. Jones, M. Stanic, S. Mijatovic, I. Spasojevic, Extracellular iron diminishes anticancer effects of vitamin C: an in vitro study. Sci. Rep. 4, 5955 (2014).]によると、腫瘍内細胞外領域の過剰な鉄イオンが、フェントン反応により過酸化水素をヒドロキシラジカルに変換すること、そのヒドロキシラジカルは細胞内浸透性が低いために殺細胞効果が低下してしまうことが報告されている。したがって腫瘍内の過剰な鉄イオンを不活性化することができれば、ビタミンCによる抗腫瘍効果を向上できるものと期待される。
　本明細書において、「アスコルビン酸類」とは、アスコルビン酸若しくはその誘導体又はその塩を含む概念であり、ビタミンＣともいう。また、天然に存在するのはＬ－アスコルビン酸であるが、Ｌ－アスコルビン酸、化学合成にて得られるＤ－アスコルビン酸のどちらでも好適に使用できる。
　アスコルビン酸の塩としては、上記のＡＬＡ類の塩として例示した種類の塩が挙げられる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、ビタミンＣ療法に使用されるものとして、単独で提供されてもよく、前記アスコルビン酸類との合剤や組み合わせ製剤等の剤型で提供されてもよい。
　一実施形態として、前記アスコルビン酸類と、実施形態の結合体とを、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
　一実施形態として、前記アスコルビン酸類と、実施形態の結合体とを、治療を必要とする対象に投与することを含む癌の治療方法を提供する。
　一実施形態として、前記アスコルビン酸類が投与されるまたは投与されている対象に投与するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、実施形態の結合体が投与されるまたは投与されている対象に投与するための、前記アスコルビン酸類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法のための、実施形態の結合体を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法のための、前記アスコルビン酸類及び実施形態の結合体を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法のための、実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法のための、前記アスコルビン酸類及び実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法に使用するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法に使用するための、前記アスコルビン酸類及び実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法に使用するための、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と、前記アスコルビン酸類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と、を備えたキットを提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法に使用するための医薬の製造における、実施形態の結合体の使用を提供する。
　一実施形態として、癌に対するビタミンＣ療法に使用するための医薬の製造における、前記アスコルビン酸類及び実施形態の結合体の使用を提供する。
　上記対象としては、癌患者を例示する。
　上記のビタミンＣ療法は、アスコルビン酸類を対象に投与することを含み、好ましくは静脈注射することを含む。前記対象は、腫瘍を有する患者を含む概念である。
　ビタミンＣ療法における、腫瘍内のアスコルビン酸類の濃度は、抗腫瘍効果を有する限り特に制限されず、一例として、１ｍＭ以上であってよく、２ｍＭ以上であってよく、３ｍＭ以上であってよい。ビタミンＣ療法における、腫瘍内のアスコルビン酸類の濃度の上限値としては、特に制限されるものではないが、一例として、２０ｍＭ以下であってよく、１５ｍＭ以下であってよく、１０ｍＭ以下であってよい。腫瘍内のアスコルビン酸類の濃度の上記数値範囲の一例としては、例えば、１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であってよく、２ｍＭ以上１５ｍＭ以下であってよく、３ｍＭ以上１０ｍＭ以下であってよい。
　実施形態の医薬組成物又は癌治療剤の対象への投与、患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　実施形態の医薬組成物又は癌治療剤の剤型は、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、貼付剤、座薬剤等を挙げることができる。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の剤型は、経口剤、注射剤又は点滴剤が好ましい。
　前記ＡＬＡ類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の剤型は、経口剤、注射剤又は点滴剤が好ましい。
　前記アスコルビン酸類を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の剤型は、注射剤又は点滴剤が好ましく、静脈注射のための注射剤又は点滴剤がより好ましい。
　医薬組成物又は癌治療剤は、必要に応じて他の薬効成分、栄養剤、担体等の他の任意成分を加えることができる。任意成分として、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性および動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコール等の、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
　実施形態の医薬組成物又は癌治療剤における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として使用される経口剤が挙げられる。
　または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
　錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　医薬組成物又は癌治療剤によって投与されるべき結合体の投与量は、対象の身長、体重、年齢、および症状に応じて、対象の体重１ｋｇあたり、ＤＦＯ換算で、０．１ｍｇ～１，０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～２００ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ～５０ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ～２０ｍｇの範囲で投与することができる。
　医薬組成物又は癌治療剤によって投与されるべきＡＬＡ類の投与量は、対象の身長、体重、年齢、および症状に応じて、対象の体重１ｋｇあたり、ＡＬＡ換算（すなわち、式（ＩＩ）において、Ｒ２１およびＲ２２が水素原子の場合の質量換算）で、好ましくは１ｍｇ～１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ～３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ～２５ｍｇの範囲で投与することができる。
　医薬組成物又は癌治療剤によって投与されるべきアスコルビン酸類の投与量は、対象の身長、体重、年齢、および症状に応じて、対象の体重１ｋｇあたり、アスコルビン酸換算で、５ｍｇ以上であってもよく、２０ｍｇ以上であってもよく、例えば、５ｍｇ～１，０００ｍｇであってもよく、２０ｍｇ～１，０００ｍｇであってもよい。より高濃度でのアスコルビン酸類の投与量を検討する場合には、アスコルビン酸類の投与量は、対象の体重１ｋｇあたり、アスコルビン酸換算で５０ｍｇ～１，０００ｍｇであってもよく、２５０ｍｇ～１０００ｍｇであってもよく、４００ｍｇ～１，０００ｍｇであってもよく、５００ｍｇ～８００ｍｇであってもよい。
　前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類と、実施形態の結合体とを、対象に投与する場合の投与回数および投与頻度は、併用される前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類と、結合体のそれぞれの投与状況（投与間隔、投与回数、および投与期間）に鑑み、当業者は適宜、適切な投与回数および投与頻度を決定することができる。本発明の一実施形態において、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の投与前、投与時、または投与後から投与されてよい。
　実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類とは、それぞれの有効量を、対象に対して同時または異時に、連続的にまたは間隔をあけて投与することができる。実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤と前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類とは、同じ投与サイクルで腫瘍患者に投与されてもよいし、それぞれ別の投与サイクルで投与されてもよい。
　本発明の一実施形態において、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の対象への投与は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与が開始される前に開始される。例えば、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与開始の１週間前から当日までの間に、一回以上投与してもよく、連日投与してもよい。実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与開始時点は特に制限されないが、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与は、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の投与開始時点から１週間以内が好ましく、３日以内がより好ましく、１日以内がさらに好ましい。
　本発明の別の実施形態において、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の対象への投与は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与と同日に開始される。例えば、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与開始日から投与することができる。前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類と、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤とを同時に投与する場合、それらを単一の製剤に調製して投与してもよいし、別個の投与経路で同時に投与してもよい。
　本発明のさらに別の実施形態において、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の対象への投与は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与後に開始される。例えば、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤は、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の投与開始の１週間前から当日までの間に、一回以上投与してもよく、連日投与してもよい。前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の投与開始時点は特に制限されないが、前記ＡＬＡ類又はアスコルビン酸類の投与は、実施形態の結合体を有効成分として含有する医薬組成物又は癌治療剤の投与開始時点から１週間以内が好ましく、３日以内がより好ましく、１日以内がさらに好ましい。
　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．PEG10k-Poly[Aspartic acid(Deferoxamine)m]nの合成
＜1.1. 概要＞
　実施例で製造した鉄キレート剤PEG10k-Poly[Aspartic acid(Deferoxamine)m]n (以下PEG-P[Asp(DFO)m]nと略す。) の合成法を記す。nはAspの重合度を表し、mはDFOの導入数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　開始剤をPEG10k-NH2、モノマーをBLA-NCAとするN-carboxyanhydride(NCA)重合によりPEG-PBLAnを合成した。塩基性条件下で側鎖のカルボキシ基を脱保護し、PEG-PAspnを得た。その後、Deferoxamineのアミノ基をPEG-PAspnのカルボキシ基に結合し、PEG-P[Asp(DFO)m]nを得た。
＜1.2. 試薬＞
　特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
・α-Methoxy-ω-amino-poly(ethylene glycol) (PEG-NH2) [Mw : 10K]：NOF Co., Inc.・Benzene：Nacalai Tesque Inc.
・β-benzyl L-aspartate N-carboxyanhydride (BLA-NCA)：Chuo Kaseihin Co., Inc.
・dichloromethane (DCM)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
　アルゴン雰囲気下で蒸留して使用した。(b.p. 40 ℃)
・N,N-dimethylformamide (DMF)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
　アルゴン雰囲気下で蒸留して使用した。(b.p. 135 ℃)
・hexane：Kanto Chemical CO.,Inc.
・ethyl acetate：Kanto Chemical CO.,Inc.
・5 mol/L HCl： Nacalai Tesque Inc.
・5 mol/L NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
・Dimethyl sulfoxide (DMSO)：Nacalai Tesque Inc.
・Deferoxamine mesylate (DFO)：Sigma Aldrich Co., llc.
・N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.・N,N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.・Sodium chloride (NaCl)：Nacalai Tesque Inc.
・Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO3)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
＜1.3. 測定機器＞
・NMR (Nuclear Magnetic Resonance)：BRUKER AVANCEIII400 (400 MHz, BRUKER BioSpin)
　スピニング：オフ
　積算回数：24回
　温度：25℃
・GPC (Gel Permeation Chromatography)：Jasco International Co., Ltd.
　カラム：TSK-gel superAW3000 (Tosoh Corporation), 
　　　　　Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)
　検出器：RI-2031
＜1.4. 合成手法＞
［PEG-PBLAnの合成］
　300 mL二口ナスフラスコにPEG-NH2 1.00 g (0.100 mmol)を量り取り、ベンゼン10.0 mLに溶解させた後、凍結乾燥した。アルゴン雰囲気下で100 mL二口ナスフラスコにBLA-NCAを1.20 g (4.81 mmol) (n＝35)および2.40 g (9.62 mmol) (n＝78)量り取った。PEG-NH2にDMFを1.36 mL、DCMを13.6 mL加えた。また、BLA-NCAにDMFを1.63 mL (n＝35)および3.26 mL (n＝78)、DCMを16.3 mL (n＝35)および32.6 mL (n＝78)加え、溶解させた。BLA-NCA溶液をPEG-NH2溶液に加え、アルゴン雰囲気下のもと室温で48時間攪拌した。反応溶液をそれぞれヘキサン、酢酸エチル混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル ＝ 3：2）600 mL (n＝35)および750 mL (n＝78)に滴下し、再沈殿により精製した。その後、減圧乾燥させ、白色固体PEG-PBLAnを収量1.71 g(n＝35)および 2.54 g (n＝78)、収率97 ％ (n＝35)および98 % (n＝78)で得た。1H-NMR スペクトルを図１および図３に、GPCカーブ（カラム：TSK-gel superAW3000, 溶離液：NMP (50 mM LiBr), 流速：0.30 mL/min, 測定温度：40 ℃にて取得）を図２および図４に示す。
・1H NMR spectrum of PEG-PBLA35
　1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 2.53-2.69, 2.76-2.92 (br, -CH2-C＝O-O-), 3.42-3.67 (br, -CH2- CH2-O-), 4.95-5.13 (br, -O-CH2-Ph), 7.20-7.39 (br, Ph).
・1H NMR spectrum of PEG-PBLA78
　1H NMR (400MHz, DMSO-d6)：帰属は上記1H NMR spectrum of PEG-PBLA35と同じ
［PEG-PBLAnの脱保護］
　50 mLナスフラスコにPEG-PBLA35 500 mg（0.0284 mmol）およびPEG-PBLA78 500 mg (0.0194 mmol)をそれぞれ量り取り、5 mLの0.1 M NaOHを加えて室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜 (MWCO＝6~8 kDa)に入れ、2 Lの0.01 M HCl、続いて2 Lの純水でそれぞれ2回ずつ透析した。溶液を凍結乾燥させ、白色固体PEG-PAspnを収量367 mg (n＝35)および331 mg(n＝78)、収率 92 % (n＝35)および90 % (n＝78)で得た。1H-NMR スペクトルを図５および図７に、GPCカーブ（カラム：Superdex 200 increase 10/300 GL, 溶離液：10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl (pH 7.4), 流速：0.75 mL/min, 測定温度：室温により取得）を図６および図８に示す。
・1H NMR spectrum of PEG-PAsp35
　1H NMR (400MHz, D2O)：δ 2.73-2.97 (br, -CH2-COOH), 3.62-3.82 (br, -CH2-CH2-O-).
・1H NMR spectrum of PEG-PAsp78
　1H NMR (400MHz, D2O)：帰属は上記1H NMR spectrum of PEG-PAsp35と同じ
［DFOのPEG-PAsp nへの結合］
　50 mLナスフラスコにPEG-Asp35 100 mg (7.14 μmol)およびPEG-Asp78 100 mg (5.26 μmol)をそれぞれ量り取り、DMSO 30 mLに溶解させた。そこに、DCC 256 mg (1.24 mmol) (n＝35)および 407 mg (1.91 mmol) (n＝78)、DMAP 30.3 mg (0. 248 mmol) (n＝35)および48.1 mg (0.394 mmol) (n＝78)、DFO 163 mg (0.248 mmol) (n＝35)および259 mg (0.394 mmol) (n＝78)を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を透析膜 (MWCO＝3.5 kD)に入れ、300 mLのacetoneで透析を3回行った後、2 Lの0.01 M NaOH、続いて2 Lの純水でそれぞれ2回ずつ透析した。得られた溶液を0.45 μmのフィルターで濾過した後に、凍結乾燥し、白色固体PEG-P[Asp(DFO)m]nを収量 120 mg (n＝35)および139 g (n＝78)、収率 87 % (n＝35)および80 % (n＝78)で得た。1H-NMR スペクトルを図９および図１１に、GPCカーブを図１０および図１２に示す。
・1H NMR spectrum of PEG-P[Asp(DFO)10]35
　1H NMR (400MHz, D2O, NaOD)：δ1.13-1.96 (br, -CH2-CH2-CH2-), 1.98-2.09 (br, -C＝O-CH3), 2.43-2.55 (br, -CH2-C＝O-NH-), 3.08-3.33 (br, -C＝O-NH-CH2-), 3.52-3.62 (br, -CH2-NOH-), 3.66-3.90 (br, -CH2-CH2-O-).
・1H NMR spectrum of PEG-P[Asp(DFO)26]78
　1H NMR (400MHz, D2O, NaOD)：帰属は上記1H NMR spectrum of PEG-P[Asp(DFO)10]35と同じ
＜1.5. 解析＞
［PEG-PBLAn］
　1H NMRスペクトルの開始剤由来のピーク[3.42-3.67 ppm (-CH2- CH2-O-)]とBLA-NCA由来のピーク[2.53-2.69, 2.76-2.92 ppm -CH2-C＝O-O-), 4.95-5.13 (, -O-CH2-Ph), 7.20-7.39 ppm (Ph)]の積分値の比からPBLAの重合度DP＝35(n＝35)およびDP＝77(n＝78)、数平均分子量Mn＝17,600 （PEG:PBLA＝10,000:7,600）(n＝35)およびMn＝25,800（PEG:PBLA＝10,000:15,800）(n＝78)と求まった。また、GPCカーブから、得られたポリマーの分子量分散度はMw/Mn＝1.12 (n＝35)およびMw/Mn＝1.11 (n＝78)と求まり、狭い分子量分布を持つことを確認した。
［PEG-PAspn］
　1H NMRスペクトルの開始剤由来のピーク[3.62-3.82 ppm (-CH2-CH2-O-)]とアスパラギン酸のβ水素のピーク(2.73-2.97 ppm)の積分値の比からAspの重合度DP＝35(n＝35)およびDP＝78 (n＝78)、数平均分子量Mn＝14,000 （PEG:PAsp＝10,000:4,000）(n＝35)およびMn＝19,000 （PEG:PBLA＝10,000:9,000）(n＝78)と求まった。また、GPCカーブから、得られたポリマーは単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した。
［PEG-P[Asp(DFO)m]n］
　1H NMRスペクトルの開始剤由来のピーク[3.66-3.90 ppm (-CH2-CH2-O-)]およびDFO由来のピーク[1.13-1.96 ppm (-CH2-CH2-CH2-), 1.98-2.09 ppm (-C＝O-CH3), 2.43-2.55 ppm (-CH2-C＝O-NH-), 3.08-3.33 ppm (-C＝O-NH-CH2-), 3.52-3.62 ppm (-CH2-NOH-)]の積分値の比からDFOの導入数は10 (n＝35) および26(n＝78)、数平均分子量はMn＝19,300 (n＝35) およびMn＝32,900 (n＝78)と求まった。また、GPCカーブから、得られたポリマーは単峰性の狭い分子量分布を持つことを確認した。
　また更に、上記の合成手法と同様にして、PEG-P[Asp(DFO)36]76(Mn = 45,000)を得た。
　1H NMR (400MHz, D2O, NaOD)で解析し、帰属は上記1H NMR spectrum of PEG-P[Asp(DFO)10]35と同じであることを確認した。
２．PEG-P[Asp(DFO)m]nの鉄キレート能の評価
＜2.1. 概要＞
　DFO/Fe(III)錯体は420 nm付近に特徴的な吸収ピークを持つ。そこで、PEG-P[Asp(DFO)m]nの鉄キレート能を吸光スペクトル測定により評価した。また、生体環境におけるPEG-P[Asp(DFO)m]nの鉄キレート能を、細胞内の鉄イオン量を間接的に定量する方法として確立されているcalcein-AM法により評価した。図１３にcalcein -AM法の原理を簡単に示す。
［calcein -AM法の原理］
　calcein -AMは細胞膜透過性の化合物で、それ自体は蛍光を示さないが、細胞内のエステラ－ゼにより加水分解を受けてcalceinとなる。このcalceinは、強い黄緑色の蛍光を示す化合物で、膜不透過性であるため細胞内に保持される。また、calceinは鉄キレート能を有し、鉄と錯体を形成すると蛍光が消失するため、calceinの蛍光を測定することにより、間接的に細胞内の鉄イオン濃度が測定できる。
＜2.2. 試薬＞
　特に記述のない試薬・溶媒は市販品をそのまま使用した。
・Deferoxamine mesylate (DFO)：Sigma Aldrich Co., llc.
・PEG-P[Asp(DFO)10]35 (Mn＝19,300)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78 (Mn＝32,900)
・FeCl3・6H2O：Wako Pure Chemical IndustriesCo., Ltd.
・D-PBS(-)：Wako Pure Chemical IndustriesCo., Ltd.
・Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)：Sigma Aldrich Co., llc.
・Fetal bovine serum (FBS)：BioseraInc.
・Trypsin-EDTA solution：Sigma life scienceCo., Ltd.
・Penicillin / streptomycin：Sigma life scienceCo., Ltd.
・Calcein-AM：Dojindo Molecular Technologies Inc.
・CT26細胞 (mouse colon carcinoma cell line)：American Type Culture Collection.・DLD-1細胞 (human colon adenocarcinoma cell line)：American Type Culture Collection.
＜2.3. 測定機器＞
・NanoDrop One：Thermo Fisher ScientificInc..
・Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
・LSM710：Carl Zeiss Co., Ltd. 
・Guava（登録商標） easyCyte Flow Cytometry (FCM)：Merck Millipore
＜2.4. 吸収スペクトル測定による評価＞
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78、FeCl3溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：0.625 mM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.0635 mM (DFO濃度＝0.625 mM)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.0245 mM (DFO濃度＝0.625 mM)
・FeCl3/D-PBS溶液：2.50 mM
　800 μLのDFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液およびPEG-P[Asp(DFO)26]78溶液にそれぞれ200 μLのFeCl3溶液を加えた。D-PBSで2倍希釈した後、十分に攪拌し、Nanodropにより吸収スペクトルを測定した。その結果を図１４に示す。
　PEG-P[Asp(DFO)10]35/FeおよびPEG-P[Asp(DFO)26]78/FeもDFO/Feの特徴的な吸収ピークを示したことから、優れた鉄キレート能を有することを確認した。
＜2.5. Calcein-AM法による評価＞
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：2.00 mM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.203 mM (DFO濃度＝2.00 mM)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.0714 mM (DFO濃度＝2.00 mM)
　24-wellプレートにDLD-1またはCT26細胞を 5.0 × 104 cell / well となるよう播種し、37 ℃, 5 % CO2下で24時間前培養した。上記の調製溶液をRPMIで10倍希釈したのちに、各ウェルに500 μLずつ加え、24時間インキュベートした。D-PBS 500 μLで洗浄後、0.100 μM calcein-AM溶液を加え、暗所でDLD-1細胞では30 min、CT26 細胞では 15 minインキュベートした。D-PBS 500 μLで2回洗浄後、150 μL Trypsin-EDTA溶液を加え、DLD-1細胞では10 min、CT 26 細胞では 3 minインキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、10 % FBSを含むD-PBSを300 μLを加え、十分に懸濁した。懸濁液をセルストレイナーによって濾過し、FCMによりcalcein蛍光を測定した。得られた結果を図１５に示す。図１５ＡがDLD-1細胞、図１５ＢがCT26細胞の測定結果である。結果は、mean ± S.D. (n＝3)の値を示し、統計的有意差は t-testにより評価した（*p<0.05, **p<0.01）。
　PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78によりcalceinの蛍光強度が高まったことから、細胞内の鉄イオン濃度が減少したことが示され、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78は生態環境においても鉄キレート能を有することを確認した。
３．培養細胞に対する評価
＜3.1. 概要＞
　蛍光色素(Cy5)でラベルしたPEG-P[Asp(DFO)m]n（Cy5-PEG-P[Asp(DFO)m]n）の細胞内分布を共焦点顕微鏡により観察した。次に、DFOとPEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞取り込み量を比較した。続いて、PEG-P[Asp(DFO)m]nのがん細胞増殖抑制メカニズムを調べるべく、細胞周期への影響を評価した。最後に、がん細胞増殖抑制作用をCCK-8 assayにより評価した。
＜3.2. 試薬及び細胞株＞
　特に記述のない試薬は市販品をそのまま使用した。
・PEG-P[Asp(DFO)10]35 (Mn＝19,300)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78 (Mn＝32,900)
・Cy5-NHS：Thermo Fisher Scientific Inc.
　10 mg/mL Cy5-NHS/DMSO として使用した。
・Dimethyl sulfoxide (DMSO)：Nacalai Tesque Inc.
・GaCl3：Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
・5 mol/L NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
・HNO3：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
・Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)：Sigma AldrichCo., llc.
・D-PBS(-)：Wako Pure Chemical IndustriesCo., Ltd.
・Fetal bovine serum (FBS)：BioseraInc.
・Trypsin-EDTA solution：Sigma life scienceCo., Ltd.
・Penicillin / streptomycin：Sigma life scienceCo., Ltd.
・LysoTracker（登録商標）red DND - 99：Thermo Fisher Scientific Inc.
・Hoechst 33342：Thermo Fisher Scientific Inc.
・RNase A：Macherey nagel Inc.
・Propidium Iodide：Dojindo Molecular Technologies Inc.
・Cell Counting Kit-8：Dojindo Molecular Technologies Inc.
・CT26細胞 (mouse colon carcinoma cell line)：American Type Culture Collection.・DLD-1細胞 (human colon adenocarcinoma cell line)：American Type Culture Collection.
＜3.3. 測定機器＞
・Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
・LSM710：Carl Zeiss Co., Ltd. 
・Guava（登録商標） easyCyte Flow Cytometry (FCM)：Merck Millipore
・Agilent 7900 ICP-MS：Agilent Technology Co., Ltd.
＜3.4. 共焦点顕微鏡によるPEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞内分布の観察＞
　蛍光色素(Cy5)をPEG-P[Asp(DFO)m]nに導入し、共焦点顕微鏡を用いてCy5-PEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞内分布を観察した。
［Cy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35の合成］
　PEG-P[Asp(DFO)m]nの末端のアミノ基にCy5-NHSを結合した。PEG-P[Asp(DFO)10]35 20.0 mg ( 0.99 μmol) を6 mLバイアルに量り取り、 2.00 mLの純水に溶解させた。次に、PEG-P[Asp(DFO)10]35に対して1等量のCy5-NHS（10.0 mg/mL Cy5-NHS/DMSO 溶液 107 μL）を0.200 mLの純水に溶解させた後、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液に加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO＝10 kD) に入れ、限外ろ過を5回行った。その後、PD-10 カラムを用いてさらに精製し、ポリマー溶液を凍結乾燥させ、青色固体Cy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35を18.0 mg得た。
［共焦点顕微鏡による観察］
　35 mm2 Glass base dishにDLD-1細胞を 5.0 × 104 cell / dishとなるよう播種し、37 ℃, 5 % CO2下で24時間前培養した。23.3 μM Cy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液(DFO濃度＝200 μM)をRPMIで10倍希釈したのちに、各ディッシュに1 mLずつ加え、24時間インキュベートした。D-PBS 1 mL で洗浄後、100 nM LysoTracker （登録商標）red DND-99/(D-PBS：RPMI＝1:9) 溶液1 mLを加え、30 min インキュベートした。D-PBS 1 mLで洗浄後、5.0 μg/mL Hoechst / D-PBS 溶液 1 mLを加え、5 min インキュベートした。D-PBS 1 mL で2回洗浄後、RPMI 2 mLを加え、CLSMで観察した。得られた結果を図１６に示す。
　本実施例で用いた鉄キレート剤はエンドソーム/リソソームに局在していることから、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれることが示唆された。
＜3.5. PEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞取り込み量の評価＞
　DFOとPEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞取り込み量を比較するべく、DFO/Ga(III)錯体およびPEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga(III)錯体を細胞に添加したのちに、細胞内のGa含有量をICP-MSにより測定した。
［DFO/Ga溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液の調製］
・DFO/Ga溶液
　2.22 mM DFO/D-PBS溶液 9 mLに19.9 mM GaCl3/D-PBS溶液を1 mL加え、一晩攪拌した。NaOHを用いて、pHを7.4に調整したのちに、フィルターで濾過した。最後にRPMI培地を90 mLを加えた（DFO濃度＝200 μM）。
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液
　0.226 mM PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液 (DFO濃度＝2.22 mM) 9 mLに19.9 mM GaCl3/D-PBS溶液を1 mL加え、一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO＝10 kD) に入れ、限外ろ過を5回行った。精製した溶液にD-PBS 10 mLを加え、フィルターで濾過した。最後にRPMI培地を90 mL加えた（DFO濃度＝200 μM）。
［細胞内Ga含有量の測定］
　75 mm2 フラスコにDLD-1またはCT-26細胞を 5.0 × 106 cell / flask となるよう播種し、37 ℃, 5 % CO2下で24時間前培養した。上記の調製溶液を各フラスコに10 mLずつ加え、3時間または24時間インキュベートした。D-PBS 5 mLで2回洗浄後、2.5 mL Trypsin-EDTA溶液を加え、DLD-1細胞では10 min、CT -26 細胞では 5 minインキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、RPMI培地を2.5 mL加え、懸濁した。1200 rpmで3 min遠心し、上清を除いた。RPMI培地を5 mL加え、十分に懸濁し、細胞数を計測した。再び同じ条件で遠心し、上清を除いた。その後、HNO3を200 μL加え、90℃で1 時間インキュベートした。純水で2 mLまでメスアップし、疎水性フィルターで濾過した後に、ICP-MSにより細胞のGa含有量を測定した。得られた結果を図１７に示す。図１７ＡがDLD-1細胞、図１７ＢがCT26細胞の測定結果である。結果は、mean ± S.D. (n＝3)の値であり、統計的有意差は t-testにより評価した（**p<0.01）。
　高分子であるPEG-P[Asp(DFO)10]35と低分子であるDFOの取り込み量に大きな差は見られなかった。PEG-P[Asp(DFO)10]35はエンドサイトーシスにより効率的に細胞内に取りこまれたことが示唆された。
＜3.6. PEG-P[Asp(DFO)m]nによる細胞周期停止＞
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nのがん細胞増殖抑制メカニズムを調べるべく、Propidium Iodide (PI)染色により細胞周期を解析した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：45.0 μM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：61.0 μM (DFO濃度＝600 μM)
　6-wellプレートにDLD-1細胞を2.0 × 105 cell / well となるよう播種し、37 ℃、 5 % CO2下で24時間前培養した。上記の調製溶液をRPMIで10倍希釈したのち、各ウェルに3 mLずつを加え、72時間インキュベートした。D-PBS 3 mLで洗浄後、700 μLのTrypsin-EDTA溶液を加え、10 minインキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、10 % FBSを含むD-PBSを700 μLを加え、十分に懸濁した。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。細胞ペレットにD-PBSを500 μL加え、懸濁した。懸濁液を4.5 mLの70 %エタノールに滴下し、-20℃の冷凍庫で一晩固定した。10.0 μg/mL Propidium Iodide, 100 μg/mL RNase を含むD-PBS 500 mLを加え、暗所で30 minインキュベートした。最後に懸濁液をセルストレイナーによって濾過し、FCMを用いてPropidium Iodideの蛍光を測定した。測定データはModFit LTにより解析した。得られた結果を図１８に示す。図１８ＡはＦＣＭにより取得された蛍光の分布を示すグラフであり、図１８Ｂはそれを細胞周期に換算した結果を示す。結果は、mean ± S.D. (n＝3)の値を示す。
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)10]35は、S期へ細胞周期停止を誘導した。
＜3.7. PEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞増殖抑制作用＞
　PEG-P[Asp(DFO)m]nのがん細胞増殖抑制作用をCCK-8 assayにより評価した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：3.00 mM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.305 mM (DFO濃度＝3.00 mM)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.118 mM (DFO濃度＝3.00 mM)
　96-wellプレートにDLD-1細胞を 1.0 × 103 cell / well となるよう播種し、37 ℃, 5 % CO2下で24時間前培養した。上記の調製溶液を各ウェルに10 μLずつ加え、72時間インキュベートした。CCK-8溶液を各ウェルに10 μLずつ加え、2時間インキュベートした後、450 nmの吸光度を測定した。得られた結果を図１９に示す。結果は、mean ± S.D. (n＝5)の値を示し、統計的有意差は t-testにより評価した（****p<0.0001）。
　DFO、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78は有意にDLD-1細胞の増殖を抑制した。
４．皮下腫瘍マウスモデルに対する効果（血中滞留性・腫瘍集積性・抗腫瘍効果）
＜4.1. 概要＞
　CT26（マウス大腸がん細胞）皮下腫瘍マウスモデルにおけるDFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nの体内動態を評価した。DLD-1（ヒト大腸がん細胞）およびCT26皮下腫瘍マウスモデルにおけるDFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nの抗腫瘍効果を評価した。
＜4.2. 試薬、細胞及び動物＞
・Deferoxamine mesylate (DFO)：Sigma Aldrich Co., llc.
・PEG-P[Asp(DFO)10]35 (Mn＝19,300)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78 (Mn＝32,900)
・D-PBS (-)：Nacalai Tesque Inc.
・GaCl3：Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
・5 mol/l NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
・HNO3：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
・CT-26細胞 (mouse colon carcinoma cell line)：American Type Culture Collection.・DLD-1細胞 (human colon adenocarcinoma cell line)：American Type Culture Collection.
・BALB/c nude mice：Charles River Japan Inc.
・BALB/c mice ： Charles River Japan Inc.
＜4.3. 機器・設備＞
・Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
・Agilent 7900 ICP-MS：Agilent Technology Co., Ltd.
＜4.4. DFOとPEG-PAsp(DFO)の体内動態＞
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nの血中滞留性および腫瘍集積性を評価するべく、DFO/Ga(III)錯体およびPEG-P[Asp(DFO)m]n/Ga(III)錯体をCT26皮下腫瘍マウスモデルに静脈注射し、一定時間経過後の血液および腫瘍のGa含有量をICP-MSにより測定した。
［DFO/Ga、PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga、PEG-P[Asp(DFO)26]78/Ga溶液の調製］
・DFO/Ga溶液
　16.9 mM DFO/D-PBS溶液 2.70 mLに26.8 mM GaCl3/D-PBS溶液を300 μL加え、一晩攪拌した。NaOHを用いて、pHを7.4に調整したのちに、フィルターで濾過した。（DFO濃度＝15.2 mM）
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液
　1.71 mM PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液 (DFO濃度＝16.9 mM) 2.70 mLに26.8 mM GaCl3/D-PBS溶液を300 μL加え、一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO＝10 kD) に入れ、限外ろ過を5回行った。精製した溶液にD-PBS 3 mlを加え、フィルターで濾過した。（DFO濃度＝15.2 mM）
・PEG-P[Asp(DFO)26]78/Ga溶液
　0.662 mM PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液 (DFO濃度＝16.9 mM) 2.70 mLに26.8 mM GaCl3/D-PBS溶液を300 μL加え、一晩攪拌した。反応溶液を限外濾過膜 (MWCO＝10 kD) に入れ、限外ろ過を5回行った。精製した溶液にD-PBS 3 mlを加え、フィルターで濾過した。（DFO濃度＝15.2 mM）
［CT26皮下腫瘍マウスモデルの作製］
　CT26細胞懸濁液(1.0×106 cells/ml)をBALB/cマウスに対して100 μl皮下注射した。
［体内動態の評価］
　腫瘍サイズがおよそ200 mm3に達したモデルマウスに対して、上記の調製溶液100 μlを尾静脈投与した(DFO 1.52 μmol/mouse)。試料投与から1, 3, 6, 24時間後に解剖し、血液及び各種臓器を10ｍLファルコンチューブに回収した。HNO3を1 mL加え、50℃で15 min、70℃で15min、90℃で1 時間それぞれインキュベートした。純水で10 mlまでメスアップし、疎水性フィルターで濾過した後に、ICP-MSにより血液、各種臓器のガリウム含有量を測定した。その結果を図２０及び図２１に示す。結果は、mean ± S.D. (n＝3)の値を示す。
　投与から1時間後におけるDFOの血中濃度は0.25 % dose/mLと血中からの速やかな消失を示した一方で、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78は投与から6時間後においてそれぞれ10 % dose/mL、8.6 % dose/mLの血中濃度を示した。さらに、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78はEPR効果により腫瘍に集積し、投与から6時間後の時点でそれぞれ3.9 % dose/g、4.1 % dose/gの腫瘍内濃度を示した。また、投与から24時間後においてもそれぞれ2.0 % dose/g、3.4 % dose/gの腫瘍内濃度を維持した。これらの結果から、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78はDFOの血中滞留性の向上に加えて、腫瘍集積性および滞留性の付与を達成したことが示された。
＜4.5. 抗腫瘍効果＞
　DLD-1およびCT26皮下腫瘍マウスモデルに対して、DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nを静脈注射し、抗腫瘍効果を評価した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：15.2 mM 
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：1.54 mM (DFO濃度＝15.2 mM)
・PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.596 mM (DFO濃度＝15.2 mM)
［DLD-1およびCT26皮下腫瘍マウスモデルの作製］
　DLD-1細胞懸濁液(1.0×107 cells/ml)、CT26細胞懸濁液(1.0×106 cells/ml)をそれぞれBALB/cマウス、BALB/c nudeマウスに100 μl皮下注射した。
［抗腫瘍効果の評価］
　腫瘍サイズが50~100 mm3に達したマウスに対して、上記の調製溶液100 μlを尾静脈投与した(DFO 1.52 μmol / mouse)。Control群はPBSを治療群と等量尾静脈注射した。投与スケジュールを以下に示す。
　DLD-1皮下腫瘍マウスモデル：1日1回週5回投与、全15回
　CT26皮下腫瘍マウスモデル：1日1回連日投与、全14回
　投与期間中は1～2日おきに腫瘍径及び体重を測定した。測定した腫瘍径は、楕円体積近似式 (ab2 × １/２、a：長辺、b：短辺)に代入し腫瘍体積とした。腫瘍サイズおよび体重の経時変化をそれぞれ図２２および図２４、図２３および図２５に示す。図２２および図２３がDLD-1皮下腫瘍マウスモデル、図２４および図２５がCT26皮下腫瘍マウスモデルの測定結果である。結果は、mean ± S.D.の値を示す。
　DLD-1およびCT26皮下腫瘍マウスモデルにおいて、PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78はDFOと比較して優れた抗腫瘍効果をもたらすことが示された。PEG-P[Asp(DFO)10]35およびPEG-P[Asp(DFO)26]78が、腫瘍集積性を達成したことによるものと考えられる。また、治療期間中に体重の減少は確認されなかったことから、重篤な副作用は発現しなかったと考えられる。
５．培養細胞に対する評価
＜5.1. 概要＞
　吸光スペクトル測定およびcalcein-AM法により、PEG-P[Asp(DFO)m]nが鉄キレート能を有することが確認され、その結果として、PEG-P[Asp(DFO)m]nで処理した細胞の細胞質内自由鉄が減少するかを調べるべく、細胞質内自由鉄をFerroOrangeにより検出した。また、PEG-P[Asp(DFO)m]nの細胞増殖抑制のメカニズムとしてS期への細胞周期停止が明らかとなり、それはDNA合成阻害によるものと考え、BrdU染色によりDNA合成阻害を評価した。さらに、PEG-P[Asp(DFO)m]nがアポトーシスを誘導するかを調べるために、アポトーシス細胞をPI、AnnexinV染色により検出した。
＜5.2. 試薬及び細胞株＞
　特に記述のない試薬は市販品をそのまま使用した。
・DFO：Sigma AldrichCo., llc.
・PEG-P[Asp(DFO)10]35 (Mn＝19,300)
・Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)：Sigma AldrichCo., llc.
・D-PBS(-)：Nacalai Tesque Inc.
・Fetal bovine serum (FBS)：BioseraInc.
・Trypsin-EDTA solution：Sigma life scienceCo., Ltd.
・Penicillin / streptomycin：Sigma life scienceCo., Ltd.
・FerroOrange：Goryo Chemical, Inc.
・BrdU：Sigma AldrichCo., llc.
・5 M HCl：Nacalai Tesque Inc.
・Sodium borate：Nacalai Tesque Inc.
・Paraformaldehyde (PFA)：Nacalai Tesque Inc.
・TritonX-100：Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
・Bovine serum albumin (BSA)：Nacalai Tesque Inc.
・FITC-抗BrdU 抗体：Thermo Fisher Scientific, Inc.
・Hoechst 33342：Thermo Fisher Scientific Inc.
・Tween20：Sigma life scienceCo., Ltd.
・Apoptosis Kit (Annexin V-FITC kit)：Medical ＆ Biological Laboratories Co., Ltd
・DLD-1細胞 (human colon adenocarcinoma cell line)：American Type Culture Collection
＜5.3. 測定機器＞
・Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
・LSM710：Carl Zeiss Co., Ltd. 
・Guava（登録商標） easyCyte Flow Cytometry (FCM)：Merck Millipore
・Spark（登録商標）： Tecan Japan Co., Ltd,
＜5.4. PEG-P[Asp(DFO)m]nの鉄キレート能の評価＞
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nが細胞質内の自由鉄を減少させるかを調べるべく、DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]n処理した細胞の細胞質内自由鉄をFerroOrangeにより検出した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：2.00 mM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：200 μM (DFO濃度＝2.00 mM)
［共焦点顕微鏡による観察］
　35 mm2 Glass base dishにDLD-1細胞を3.0 × 105 cell / wellとなるよう播種し、37 ℃、5 % CO2下で24時間前培養した。溶液を除いた後、RPMIで10倍希釈した上記の調製溶液を各ディッシュに2 mLずつを加え、24時間インキュベートした。無血清RPMI 2 mLで洗浄後、1 μM FerroOrangeを含む無血清RPMI 1 mLを加え、暗所で30 minインキュベートした。その後、FerroOrangeの蛍光をCLSMで観察した。得られた結果を図27Ａに示す。
［プレートリーダーによる測定］
　96-wellプレートにDLD-1細胞を1.0 × 104 cell / wellとなるよう播種し、37 ℃、5 % CO2下で24時間前培養した。溶液を除いた後、RPMIで10倍希釈した上記の調製溶液を各ウェルに100 μLずつ加え、24 hインキュベートした。無血清RPMI 100 μLで洗浄後、1 μM FerroOrangeを含む無血清RPMI 100 μLを加え、暗所で30 minインキュベートした。その後、プレートリーダーによりFerroOrangeの蛍光強度を測定した。得られた結果を図27Ｂに示す。結果はmean ± S.D. (n＝5)の値を示す。統計的有意差はTukey's multiple comparison testにより評価した（****p<0.0001）。
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)10]35は、細胞質内の自由鉄を顕著に減少させた。
＜5.5. PEG-P[Asp(DFO)m]nによるDNA合成阻害＞
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nのS期への細胞周期停止のメカニズムを調べるべく、BrdU染色によりDNA合成阻害を評価した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：450 μM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：60.0 μM (DFO濃度＝600 μM)
［共焦点顕微鏡による観察］
　35 mm2 Glass base dishにDLD-1細胞を1.0 × 105 cell / well となるよう播種し、37 ℃、5 % CO2下で24時間前培養した。溶液を除いた後、RPMIで10倍希釈した上記の調製溶液を各ウェルに3 mLずつを加え、72時間インキュベートした。その後、10 mM BrdU / D-PBS溶液を330 μL加え、1時間インキュベートした。溶液を除いた後、1.0 M HCl溶液を1 mL加え、10 minインキュベートした。溶液を除いた後、0.1 M 四ホウ酸ナトリウムバッファー (pH 8.5)を1 mL加え、30 minインキュベートした。D-PBS 2 mLで洗浄後、4 % PFA / D-PBS溶液を1 mL加えて10 minインキュベートした。溶液を除いた後、0.2 % TritonX-100 / D-PBS溶液を1 mL加えて5 minインキュベートした。D-PBS 2 mLで洗浄後、5 % BSA / D-PBS溶液を2 mL加えて1時間インキュベートした。溶液を除いた後、FITC-抗BrdU 抗体/ 1 % BSA溶液を加え暗所で30 minインキュベートした。D-PBS 2 mLで洗浄後、5.0 μg/mL Hoechst/ D-PBS 溶液 1 mLを加え、暗所で5 minインキュベートした。D-PBS 2 mLで洗浄後、CLSMで観察した。得られた結果を図28Ａに示す。
［フローサイトメーターによる測定］
　6-wellプレートにDLD-1細胞を2.0 × 105 cell / wellとなるよう播種し、37 ℃、5 % CO2下で24時間前培養した。溶液を除いた後、RPMIで10倍希釈した上記の調製溶液を、各ウェルに3 mLずつを加え、72 hインキュベートした。その後、10 mM BrdU / D-PBS溶液を330 μL加え、1時間インキュベートした。D-PBS 3 mLで洗浄後、700 μLのTrypsin-EDTA溶液を加え、10 minインキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、RPMIを700 μL加え、十分に懸濁した。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。細胞ペレットにD-PBSを500 μL加え、懸濁した。細胞数を計測し、各サンプルの細胞数を揃えた。懸濁液を4.5 mLの70 %エタノールに滴下し、-20℃の冷凍庫で一晩固定した。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。2.0 M HCl / 0.5 %TritonX-100溶液を500 μL加え、30 minインキュベートした。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。0.1 M 四ホウ酸ナトリウムバッファー (pH 8.5)を500 μL加え、2 minインキュベートした。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。1 % BSA / 0.5 % Tween20 / D-PBS溶液 1 mLで洗浄したのちに、1 % BSA / 0.5 % Tween20 / D-PBS溶液を95 μL加えた。FITC-抗BrdU 抗体を5 μL加え、1時間インキュベートした。1 % BSA / 0.5 % Tween20 / D-PBS溶液 1 mLで洗浄したのちに、1 % BSA / 0.5 % Tween20 / D-PBS溶液を 500 μLを加えた。最後に懸濁液をセルストレイナーによって濾過し、FCMを用いてBrdUの蛍光を測定した。得られた結果を図28Ｂに示す。
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)10]35は、BrdUの取り込みを顕著に抑制したことからDNA合成阻害を誘導したことが示され、その結果、細胞周期をS期へ停止させたものと考えられた。
＜5.6. PEG-P[Asp(DFO)m]nのアポトーシス誘導の評価＞
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)m]nがアポトーシスを誘導するかを調べるために、アポトーシス細胞をPI、AnnexinV染色により検出した。
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：1.00 mM
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：100 μM (DFO濃度＝1.00 mM)
　6-wellプレートにDLD-1細胞を1.0 × 105 cell / wellとなるよう播種し、37 ℃、5 % CO2下で24時間前培養した。溶液を除いた後、RPMIで10倍希釈した上記の調製溶液を各ウェルに3 mLずつ加え、24時間インキュベートした。D-PBS 3 mLで洗浄後、700 μLのTrypsin-EDTA溶液を加え、10 minインキュベートした。光学顕微鏡で細胞が剥れたのを確認した後、RPMIを700 μL加え、十分に懸濁した。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。RPMIを500 μL加え、細胞数を計測して、各サンプルの細胞数を揃えた。懸濁液を1200 rpm、 3 min遠心し、上清を除いた。Apoptosis Kit付属のbinding buffer 85 μLと、annexinV溶液 10 μL、PI溶液 5 μLを加え、暗所で15 minインキュベートした。Binding buffer 400 μLを加えたのちに、懸濁液をセルストレイナーによって濾過し、FCMを用いてPI、AnnexinVの蛍光を測定した。得られた結果を図29に示す。図29ＡはFCMにより取得された蛍光の分布を示すグラフであり、図29Ｂはそれを生細胞、アポトーシス初期細胞、アポトーシス後期・ネクローシス細胞に換算した結果を示す。結果はmean ± S.D. (n＝3)の値を示す。統計的有意差はTukey's multiple comparison testにより評価した（****p<0.0001）。
　DFOおよびPEG-P[Asp(DFO)10]35は、アポトーシス細胞およびネクローシス細胞の割合を顕著に増加させた。
６．皮下腫瘍モデルマウスの腫瘍中プロトポルフィリンIX蓄積性に対する効果
＜6.1. 概要＞
　CT26（マウス大腸がん細胞）皮下腫瘍マウスモデルに5-アミノレブリン酸塩酸塩とDFOまたはPEG-P[Asp(DFO)m]nを投与したときの腫瘍中プロトポルフィリンIX蓄積性を評価した。
＜6.2. 試薬、細胞および動物＞
・Deferoxamine mesylate（DFO）：Sigma Aldrich Co., llc.
・PEG-P[Asp(DFO)10]35 (Mn＝19,300)
・5-アミノレブリン酸塩酸塩：COSMO OIL Co., Ltd.
・D-PBS（-）：Nacalai Tesque Inc．
・PBS（-）：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd
・N,N-Dimethylformamide (DMF)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd
・Protoporphyrin IX：Frontier Scientific, Inc.
・CT-26細胞（mouse colon carcinoma cell line）：American Type Culture Collection．
・BALB/c mice：Charles River Japan Inc．
＜6.3. 機器・設備＞
・infinite M200 PRO：Tecan Group Ltd.
＜6.4. 腫瘍中プロトポルフィリンIX蓄積性の評価＞
［DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液の調製］
・DFO/D-PBS溶液：15.2 mM 
・PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：1.54 mM (DFO濃度＝15.2 mM)
[5-アミノレブリン酸塩酸塩溶液の調製]
　5-アミノレブリン酸塩酸塩を25 mg/mlとなるよう生理食塩水に溶解させた。
[CT26皮下腫瘍マウスモデルの作製]
　CT26細胞懸濁液（1.0×106 cells/ml）をBALB/cマウスに対して100 μl皮下注射した。
[腫瘍中プロトポルフィリンIXの評価]
　腫瘍サイズがおよそ200 mm3に達したモデルマウスに対して、DFOまたはPEG-P[Asp(DFO)10]35溶液100 μlを尾静脈注射した（DFO 1.52 μmol/mouse）。Control群はDFO投与群と同様に生理食塩水 100 μlを尾静脈注射した。その直後に5-アミノレブリン酸塩酸塩溶液100 μlを経口投与した (250 mg/kg body weight, ALA換算で195.6 mg/kg body weight)。5-アミノレブリン酸塩酸塩溶液投与から0、1、2、3、5時間後に解剖し、腫瘍を回収した。腫瘍重量の9倍量のPBS（-）を加え、ホモジナイズし、超音波破砕した。この破砕液300 μlとDMF 700 μlを混合して遠心分離した。遠心上清の蛍光強度 (励起波長 405 nm) を測定したところ、635 nmにピークを持つ蛍光スペクトルが得られた。プロトポルフィリンIX量は励起波長405 nm、蛍光波長630 nmの蛍光強度を用いて算出した。図30に腫瘍中プロトポルフィリンIXの測定結果を示す。結果は、mean ± S．D．（n=3）の値を示す。
　CT26皮下腫瘍マウスモデルにおいて、PEG-P[Asp(DFO)10]35はControlおよびDFOと比較して、優れた腫瘍中プロトポルフィリン蓄積性をもたらすことが示された。
７．ビタミンC療法に対する効果
＜7.1. 背景＞
　本実施例で用いた鉄キレート剤とビタミンCとを併用することにより、ビタミンＣ療法による治療効果が向上されるかを検討した。
＜7.2. in vitroの活性評価＞
［実験材料］
・PEG-P[Asp(DFO)36]76 (Mn = 45,000)
・L-Ascorbic acid sodium salt (和光純薬株式会社)
・FeCl3 （和光純薬株式会社）
・CT26細胞（ATCC）
・RPMI培地（Sigma-Aldrich）, 10%FBS + 1%ペニシリン・ストレプトマイシンを加えて細胞培養用培地として使用
・Cell Counting Kit-8（同仁化学）
［実験方法］
・CT26細胞を96ウェルプレートに5 x 103 cells/wellで24時間培養した。
・細胞を各濃度のPEG-P[Asp(DFO)36]76及び5 mMのL-ascorbic acid sodium saltと15 μMのFe3+を含有する培地中で2時間培養した。
・培地交換した後、24時間培養した。
・培地を除去した後、10%のCell Counting Kit-8を含有する100 μL培地を加えて1.5時間培養した。
・450 nmの吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
　得られた結果を図３１に示す。
　図３１は、In vitroにおけるPEG-P[Asp(DFO)36]76のビタミンC治療への影響を示すグラフである。グラフ中の濃度は、PEG-P[Asp(DFO)36]76中のDFO相当の濃度を示す。結果は平均値±標準偏差（n=9）で示されている。
［結果］
　ビタミンCの殺細胞効果はPEG-P[Asp(DFO)36]76を加えることにより癌細胞殺傷効果が大幅に向上した（図３１）。
＜7.3. in vivoの活性評価＞
［実験材料］
・PEG-P[Asp(DFO)36]76 (Mn = 45,000)
・L-Ascorbic acid sodium salt (和光純薬株式会社)
・CT26細胞（ATCC）
・RPMI培地（Sigma-Aldrich）, 10%FBS + 1%ペニシリン・ストレプトマイシンを加えて細胞培養用培地として使用
・BALB/cマウス（メス、日本SLCより購入）
［実験方法］
・CT26細胞をBALB/cマウスの皮下に3 x 105 cells/mouseで注射し皮下腫瘍モデルを作成した。
・腫瘍の大きさが50 mm3に達した時点でPEG-P[Asp(DFO)36]76を静脈注射した（PEG-P[Asp(DFO)36]76投与量： 0.9 mg/mouse＝45 mg/体重kgまたは1.8 mg/mouse＝90 mg/体重kg）。
・PEG-P[Asp(DFO)36]76の投与から6時間後に、純水に溶解したL-ascorbic acid sodium saltを10 mg/mouse＝500 mg/体重kgで静脈注射した。
・5日間連続で上記の注射を行い、腫瘍サイズの経時変化を調べた。
　得られた結果を図３２に示す。
　図３２は、In vivoにおけるPEG-P[Asp(DFO)36]76のビタミンC治療への影響を示すグラフである。結果は平均値±標準偏差で示されている。
［結果］
　PEG-P[Asp(DFO)36]76はと高濃度ビタミンCとを併用することにより、高い治療効果を示した。また、PEG-P[Asp(DFO)36]76投与量が0.9 mg/mouseの場合と1.8 mg/mouseの場合とでは、投与量が0.9 mg/mouseの場合のほうが、その効果が高い傾向にあることが示された。
8. まとめ
　以上、本実施例の内容をまとめると、本実施例では、ＤＦＯが鉄をキレートするうえで関与しない末端のアミノ基を、多価カルボン酸構造を有する生体適合性高分子に結合した鉄キレート剤送達システムを構築した。吸収スペクトル測定により、本実施例で用いた鉄キレート剤の側鎖のＤＦＯはフリーのＤＦＯと同等の鉄キレート能を有することを確認した。生体環境においても本実施例で用いた鉄キレート剤のキレート能は維持され、培養大腸がん細胞内の鉄イオンをキレートすること、培養結腸腺がん細胞質内での自由鉄の減少を確認した。また、同細胞において細胞周期への影響を調べたところ、本実施例で用いた鉄キレート剤の投与によるＤＮＡ合成阻害が認められ、本実施例で用いた鉄キレート剤は、細胞周期をＳ期で停止させ、細胞増殖アッセイより増殖抑制作用やアポトーシス誘導作用等を有することを確認した。
　皮下腫瘍マウスモデルに対してＤＦＯと本実施例で用いた鉄キレート剤を静脈注射して、血中滞留性を比較した結果、ＤＦＯは早期に血中から消失したが、本実施例で用いた鉄キレート剤は投与から６時間後においても極めて高い血中濃度を維持した。さらに、本実施例で用いた鉄キレート剤は腫瘍に集積し、時間経過に伴いその集積量は増加した。この皮下腫瘍モデルを用いて抗腫瘍効果を検討したところ、ＤＦＯと比較して有意な治療効果をもたらすことが示された。
　また、本実施例で用いた鉄キレート剤及び５－アミノレブリン酸の投与により、腫瘍中のプロトポルフィリンIXの蓄積量の向上が認められた。本実施例で用いた鉄キレート剤が、５－アミノレブリン酸を用いた光線力学診断及び／又は治療での使用に好適であることが示された。
　更には、本実施例で用いた鉄キレート剤及びビタミンＣの投与により、優れた抗腫瘍効果が発揮され、本実施例で用いた鉄キレート剤が、ビタミンＣ療法における使用に好適であることが示された。
　各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

Claims (8)

  1. 　デフェロキサミン又はそのイオン若しくは塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物であるデフェロキサミン類と、生体適合性高分子と、が結合し、
    　前記生体適合性高分子が、第１の生体適合性高分子鎖と、前記第１の生体適合性高分子鎖とは異なる第２の生体適合性高分子鎖とを含む、結合体。
  2. 　前記デフェロキサミン類が、前記第２の生体適合性高分子鎖に結合した、請求項１に記載の結合体。
  3. 　前記第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である、請求項１又は２に記載の結合体。
  4. 　前記第１の生体適合性高分子鎖がポリエチレングリコールである、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合体。
  5. 　下記一般式（１）又は（１－１）で表される構造を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）～（１－１）中、
    　Ａは、前記第１の生体適合性高分子鎖を表し、
    　Ｌは、リンカー部を表し、
    　Ｂは、前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、下記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含む。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（ｂ１）～（ｂ２）中、
    　Ｒ１は、アミノ酸側鎖を表し、
    　Ｒ２は、アミノ酸側鎖と前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
    　ｎは（ｂ１）及び（ｂ２）の合計数を表し、ｎは１～１０００の整数であり、ｍは１～１０００の整数であり（ただしｍ≦ｎ）、ｎ－ｍが２以上である場合、複数個のＲ１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍが２以上である場合、複数個のＲ２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
  6. 　下記一般式（１－２）で表される構造を含む、請求項５に記載の結合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（１－２）中、
    　Ｂは、前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、下記（ｂ２－１）表される繰り返し構造、又は（ｂ１－１）表される繰り返し構造及び（ｂ２－１）表される繰り返し構造を含む。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（ｂ１－１）～（ｂ２－１）中、
    　Ｒ１１は、アミノ酸側鎖を表し、
    　Ｒ１２は、－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるアスパラギン酸側鎖、又は－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯＨで表されるグルタミン酸側鎖におけるカルボキシル基と、前記デフェロキサミン類とが結合したものであり、
    　ｎ１は（ｂ１－１）及び（ｂ２－１）の合計数を表し、ｎ１は１～１０００の整数であり、ｍ１は１～１０００の整数であり（ただしｍ１≦ｎ１）、ｎ１－ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍ１が２以上である場合、複数個のＲ１２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。
  7. 　数平均分子量が２，０００～２００，０００である、請求項１～６のいずれか一項に記載の結合体。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の結合体を有効成分として含有する癌治療剤。
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