WO2020217865A1 - Ａｄａｍｔｓ４のａｐｐ切断活性制御物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Ａｄａｍｔｓ４のａｐｐ切断活性制御物質のスクリーニング方法 Download PDF

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    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an APP cleavage activity controlling substance of ADAMTS4.
  • AD Alzheimer's disease
  • AD is the main cause of dementia and is a neurodegenerative disease that accounts for more than half of all dementia.
  • the number of dementia patients is estimated to be about 50 million worldwide in 2017, and is expected to reach about 82 million in 2030. It is estimated that the number of dementia patients in Japan will reach 7 million by 2025.
  • amyloid ⁇ (A ⁇ ) is deeply involved in the onset of Alzheimer's disease.
  • Amyloid precursor protein (APP) which is a transmembrane protein consisting of 770 residues of amino acids, is cleaved by various proteases to produce A ⁇ of various molecular species (see FIG. 1).
  • a ⁇ 1-40 having 40 amino acid residues and A ⁇ 1-42 having 42 amino acid residues are present, and A ⁇ 1-42 has strong cohesiveness.
  • senile plaques appear in the brain due to aggregation of A ⁇ with fibrosis, which is considered to be the earliest pathological change.
  • a ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 are produced from APP by cleavage by ⁇ -secretase that cleaves the N-terminal and cleavage by ⁇ -secretase that cleaves the C-terminal. It is also known that ⁇ -secretase that cleaves the N-terminal of leucine at position 17 of A ⁇ also exists, and ⁇ -secretase is involved in the production of sAPP ⁇ .
  • Non-Patent Documents 1, 2, and 3 In addition to A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42, it has been reported that various A ⁇ molecular species (that is, A ⁇ -related peptides) are produced from APP, and there are multiple types of A ⁇ -related peptides in human plasma. It has been shown (Non-Patent Documents 1, 2, and 3).
  • APP669-711 (also called A ⁇ (-3-40)) was reported to be effective as a component of blood biomarkers for estimating the state of amyloid accumulation in the brain (non-patent). Documents 4 and 5). Since the C-terminal of APP669-711 is the same as the C-terminal of A ⁇ 1-40, it is considered that the site was cleaved by ⁇ -secretase. What kind of protease cleaved the N-terminal of APP669-711? Is not clear.
  • Non-Patent Document 6 discloses that when sAPP ⁇ is produced by cleaving APP by ⁇ -secretase, the amount of A ⁇ (that is, A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42) produced decreases.
  • An approach has been reported that utilizes this mechanism to suppress amyloid accumulation in the brain by regulating ⁇ -secretase activity, which is useful for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • WO 2015/111430 discloses a method for measuring an APP-cleaving peptide.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-20980 discloses a method for mass spectrometry of a polypeptide.
  • Kaneko N Yamamoto R, Sato TA, Tanaka K .: Identification and quantification of amyloid beta-related peptides in human plasma using matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry.ProcJpnAcadS 2014; 90 (3): 104-17.
  • Kaneko N Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K.: Novel plasma biomarker Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014; 90 (9): 353-64.
  • a substance that strongly controls (strongly promotes) the N-terminal cleavage activity of APP669 it is considered that it can also be used to suppress the production amount of A ⁇ (A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42). That is, a control substance for the activity of the N-terminal cleaving enzyme of APP669 may be a drug candidate, and in order to develop it, a method for screening the control substance is required.
  • an object of the present invention is to identify the N-terminal cleaving enzyme of APP669. Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance that controls the N-terminal cleavage activity of APP669.
  • a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 is one of the enzymes that cleave the N-terminal of APP669. Furthermore, suppression of the production of APP669-x (peptide with N-terminal APP669) increases A ⁇ (A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42), and the APP fragment with N-terminal APP669 is cleaved by ⁇ -secretase (BACE1). I also confirmed that I would not receive it. From these findings, the present invention was reached.
  • a first aspect of the present invention is a method for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669.
  • a step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and It is a screening method including.
  • a second aspect of the present invention is a method for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669.
  • a step of allowing ADAMTS4 to act on an APP fragment containing a full-length APP or a sequence around the APP669 position in the presence of a candidate substance and
  • a step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and It is a screening method including.
  • a third aspect of the present invention is an N-terminal cleavage agent for APP669 containing ADAMTS4.
  • the present invention is based on the novel finding that ADAMTS4 cleaves the N-terminal site of amino acid 669 of amyloid precursor protein (APP) to produce APP669-x peptide, which comprises ADAMTS4.
  • An N-terminal cleavage agent for APP669 is provided.
  • a method for screening a substance that controls the N-terminal cleavage activity of APP669 using the amount of APP669-x peptide as an index is provided.
  • a method for screening a substance that controls the N-terminal cleavage activity of APP669 by ADAMTS4 using the amount of APP669-x peptide as an index is provided.
  • the amount of amyloid ⁇ (A ⁇ ) produced from the same APP varies according to the change in the amount of APP669-x peptide produced. Therefore, molecular-targeted drugs and gene therapies focusing on ADAMTS4 It is a useful method for screening effective substances.
  • amyloid ⁇ (A ⁇ ) is deeply involved in the development of Alzheimer's disease, and therefore, according to the screening method of the present invention, it is based on controlling the N-terminal cleavage activity of APP669. It enables screening that is useful for the development of preventive and therapeutic agents.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a production pathway of A ⁇ peptide by degradation of amyloid precursor protein (APP).
  • FIG. 2 shows the sequence of the modified ADAMTS4 gene region in A549-ADAMTS4KO cells. The upper row shows the base sequence (SEQ ID NO: 12) for the original genome, and the lower row shows the base sequence for the genome (3 alleles) after gene editing: 16 bp-deficient sequence (SEQ ID NO: 13), 29 bp from the top. A missing sequence (SEQ ID NO: 14) and a 20 bp missing sequence (SEQ ID NO: 15) are shown.
  • SEQ ID NO: 12 the base sequence for the original genome
  • SEQ ID NO: 13 16 bp-deficient sequence
  • SEQ ID NO: 14 16 bp-deficient sequence
  • SEQ ID NO: 15 are shown.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when GM6001 (25 ⁇ M) or DMSO was added as a control to A549-ADAMTS4KO cells and A549-wt cells, respectively, in Example 1.
  • the vertical axis is the average value of the normalized intensity.
  • FIG. 4 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 1.
  • FIG. 7 shows the production of APP669-711 in the culture supernatant when ADAMTS4 plasmid vector and empty pcDNA3.1 hygro + vector were co-transfected into APP table HEK at a ratio of 1:10 and 10: 1 in Example 2. It is a graph showing the amount, and cells without transfection of vector (mock) and cells with transfection of empty pcDNA3.1 hygro + vector only (empty) were defined as controls. The vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 8 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 2.
  • FIG. 9 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 2.
  • FIG. 10 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when EGFP, ADAMTS4, and inactive ADAMTS4_E362A were co-transfected into HEK cells together with human APP in Example 3.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 12 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 3.
  • FIG. 13 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 3.
  • FIG. 14 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 3.
  • FIG. 15 is a graph showing the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 or 10 ⁇ M INCB3619 was allowed to act on BE (2) -C cells in Example 4.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 16 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced for BE (2) -C cells in Example 4.
  • FIG. 17 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced for BE (2) -C cells in Example 4.
  • FIG. 18 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced for BE (2) -C cells in Example 4.
  • FIG. 19 is a graph showing the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 or 10 ⁇ M INCB3619 was allowed to act on A549 cells in Example 4.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 20 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 4.
  • FIG. 21 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 4.
  • FIG. 22 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 4.
  • FIG. 23 is a graph showing the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 was allowed to act on APPtable HEK cells in Example 4.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 24 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 4.
  • FIG. 25 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 4.
  • FIG. 26 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 4.
  • FIG. 27 shows the amount of APP669-711 produced in the culture supernatant when the vector of MT-MMP1, 2, 3, 4, 5, or 6 was transfected with respect to APP table HEK cells in Example 5. It is a graph.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 28 is a graph relating to the amount of APP669-709 produced in Example 5.
  • FIG. 29 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-40 produced in Example 5.
  • FIG. 30 is a graph relating to the amount of A ⁇ 1-38 produced in Example 5.
  • FIG. 31 shows A ⁇ -related peptides (APP669-709, APP669-711, A ⁇ 1-38, A ⁇ 1) in the culture supernatant when Full-length APP, c102, or c99 was transfected into HEK cells in Example 6. It is a graph which shows the production amount of -40).
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • ADAMTS4 The ADAMTS (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) family is a subfamily of ADAM and is an extracellular protease family found in mammals and the like. There are currently 19 members in ADAMTS. ADAMTS is classified into several subgroups centering on the substrate to be cleaved, and ADAMTS 1,4,5,8,9,15, and 20 are grouped as aggrecanase / Proteoglycanase. ing.
  • ADAMTS4 As described above, ADAMTS4 is known, and the ADAMTS4 gene sequence is registered as NP_005090.3. Two SNPs are present in the ADAMTS4 gene (rs423367, rs41270041), and the encoded protein causes their respective amino acid substitutions (Q626R, P720A).
  • ADAMTS4 is one of the enzymes that cleave the N-terminal of APP669. That is, ADAMTS4 cleaves the N-terminal site of amino acid 669 of amyloid precursor protein (APP) to produce APP669-x peptide.
  • APP amyloid precursor protein
  • the full length APP consists of 770 residues of amino acids, so x means an integer up to 770 that is greater than 669.
  • an N-terminal cutting agent for APP669 containing ADAMTS4 is provided. Further, in relation to the screening method described below, a method of using ADAMTS4 as an N-terminal cleavage agent of APP669 in an in vitro system, and a method of using ADAMTS4 as an N-terminal cleavage agent of APP669 of ADAMTS4 in an in vitro system. Use is provided.
  • the screening method is A method for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669. The process of allowing the candidate substance to act on the cultured cells, The step of measuring the A ⁇ -related peptide produced from the cultured cells and A step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and including.
  • the A ⁇ -related peptide includes various molecular species, and among them, the peptide cleaved at the N-terminal of APP669 can be represented as APP669-x. Since the full length APP consists of 770 residues of amino acids, x means an integer up to 770 that is greater than 669.
  • the A ⁇ -related peptide also includes a peptide cleaved on the N-terminal side of the 669th position of APP. Depending on the candidate substance, it may be cleaved at various sites of APP.
  • APP672-709 (A ⁇ 1-38) (SEQ ID NO: 1): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG APP672-711 (A ⁇ 1-40) (SEQ ID NO: 2): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV APP669-709 (A ⁇ (-3-38)) (SEQ ID NO: 3): VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG APP669-711 (A ⁇ (-3-40)) (SEQ ID NO: 4): VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV APP672-713 (A ⁇ 1-42) (SEQ ID NO: 5): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
  • APP672-709 and A ⁇ 1-38 represent the same peptide.
  • APP672-711 and A ⁇ 1-40 represent the same peptide
  • APP669-709 and A ⁇ (-3-38) represent the same peptide
  • APP669-711 and A ⁇ (-3-40) represent the same peptide.
  • And APP672-713 and A ⁇ 1-42 represent the same peptide.
  • a candidate substance for controlling the N-terminal cleavage activity of APP669 is allowed to act on cultured cells. This step can be carried out by a usual culture method.
  • the A ⁇ -related peptide produced from the cultured cells is measured.
  • This measurement step can be performed on the culture supernatant sample by a known method.
  • the A ⁇ -related peptide to be measured (A ⁇ -related peptide other than APP669-x and / or APP669-x) is measured.
  • the concentration and / or amount of A ⁇ -related peptide is basically measured, but other units used by those skilled in the art according to the concentration and / or amount, for example, the detected ionic strength in mass spectrometry may be used. ..
  • the measurement of A ⁇ -related peptide may be performed by a test based on biomolecule-specific affinity.
  • Testing based on biomolecule-specific affinity is a method well known to those of skill in the art and is not particularly limited, but immunoassays are preferred. Specifically, Western blot, radioimmunoassay, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (including sandwich immunomethod, competitive method, and direct adsorption method), immunoprecipitation method, precipitation reaction, immunodiffusion method, immunoaggregation measurement, Immunoassays including competing and non-competitive assay systems, such as complement fixation test analysis, immunoradiomimunoassay, fluorescent immunoassay, protein A immunoassay, etc. are included. In the immunoassay, an antibody that binds to an A ⁇ -related peptide in a biological sample is detected.
  • Measurement of A ⁇ -related peptide is performed on an immunoglobulin having an antigen-binding site that can recognize a peptide derived from amyloid precursor protein (APP), or an immunoglobulin fragment containing an antigen-binding site that can recognize a peptide derived from amyloid precursor protein (APP). It may be carried out using the antibody-immobilized carrier prepared using. Peptides in a sample can be detected by a mass spectrometer by an immunoprecipitation method using the antibody-immobilized carrier (Immunoprecipitation-Mass Spectrometry; IP-MS).
  • IP-MS immunoprecipitation-Mass Spectrometry
  • immunoprecipitation may be continuously performed, and then the peptide in the sample may be detected by a mass spectrometer (cIP-MS).
  • cIP-MS mass spectrometer
  • the mass spectrometry method used in this case is preferably a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometry method, an electrospray ionization (ESI) mass spectrometry method, or the like.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption Ionization-Flight Time
  • MALDI-IT Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Ion Trap
  • MALDI-IT-TOF Matrix Assisted Laser Desorption
  • MALDI-IT-TOF Matrix Assisted Laser Desorption
  • MALDI-FTICR matrix-assisted laser desorption ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance
  • ESI-QqQ electrospray ionization-triple quadrupole
  • ESI-Qq-TOF electrospray ionization-tandem quadrupole-flight time
  • ESI-FTICR electrospray ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance
  • the matrix and the matrix solvent can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA
  • 2,5-dihydroxybenzoic acid 2,5-DHB
  • sinapic acid 3-aminoquinoline (3-AQ) and the like are used. Can be done.
  • the matrix solvent for example, it can be selected from the group consisting of acetonitrile (ACN), trifluoroacetic acid (TFA), methanol, ethanol and water. More specifically, ACN-TFA aqueous solution, ACN aqueous solution, methanol-TFA aqueous solution, methanol aqueous solution, ethanol-TFA aqueous solution, ethanol solution and the like can be used.
  • a matrix additive (comatrix) may be used in combination.
  • the matrix additive can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a phosphonic acid group-containing compound can be used as the matrix additive.
  • phosphonic acid Phosphonic acid
  • methylphosphonic acid Metalphosphonic acid
  • phenylphosphonic acid Phenylphosphonic acid
  • 1-naphthylmethylphosphonic acid 1-Naphthylmethylphosphonic acid
  • MDPNA Methylenediphosphonic acid
  • Ethylenediphosphonic acid Ethylene-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid (Ethane-1-). Hydroxy-1,1-diphosphonic acid), Nitrilotriphosphonic acid, Ethylenediaminetetraphosphonic acid and the like.
  • a compound having 2 or more, preferably 2 to 4 phosphonic acid groups in one molecule is preferable.
  • the N-terminal cleavage activity of APP669 is evaluated from the measured amount of A ⁇ -related peptide produced. This evaluation step can be performed, for example, as follows.
  • the A ⁇ -related peptide is APP669-x
  • the amount of APP669-x of the control cells on which the candidate substance is not allowed to act as a reference level When the amount of APP669-x in the cells on which the candidate substance was acted was higher than the reference level, it was judged that the N-terminal cleavage activity of APP669 was increased, and the amount of APP669-x in the cells on which the candidate substance was acted was increased. When it is lower than the reference level, it is judged that the N-terminal cleavage activity of APP669 has decreased.
  • APP669-709 only one kind of APP669-x, for example, APP669-709 may be evaluated.
  • a plurality of species such as APP669-709, APP669-711, and APP669-713 may be evaluated.
  • the cleavage activity on the N-terminal side of APP669 is focused on, so it is possible to comprehensively evaluate these multiple species (individual comparison, comparison as a total amount). Conceivable.
  • the A ⁇ -related peptide is an A ⁇ -related peptide other than APP669-x and APP669-x
  • the step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 Using the amount of APP669-x and the amount of A ⁇ -related peptides other than APP669-x of the control cells on which the candidate substance is not acted as reference levels, When the amount of APP669-x in the cell on which the candidate substance is allowed to act is higher than the reference level and the amount of A ⁇ -related peptide other than APP669-x is equal to or lower than the reference level, the APP669 It was judged that the N-terminal cleavage activity was increased, and the amount of APP669-x in the cells on which the candidate substance was allowed to act was lower than the reference level, and the amount of A ⁇ -related peptides other than APP669-x was equivalent to the reference level. Alternatively, when it is higher than the reference level,
  • the APP669 cleavage activity can be specifically evaluated by referring to A ⁇ 1-y (a peptide having the N-terminal at the A ⁇ 1 position).
  • the candidate substance for the control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669 may be selected from low molecular weight compounds, peptides, proteins, nucleic acids and the like. A wide variety of substances are screened.
  • low molecular weight compound a low molecular weight compound capable of binding to the target polypeptide can be considered.
  • low molecular weight compounds that bind to certain proteins such as those used in drug discovery.
  • low molecular weight compounds that inhibit ADAMTS4 include GM6001 and Calcium pentasan polysulfate.
  • peptide a peptide consisting of 2 to 50 amino acid residues can be considered.
  • soybean peptides that have been reported to suppress the expression of ADAMTS4 are exemplified.
  • a protein consisting of 50 amino acid residues or more can be considered.
  • examples thereof include IL-1 cytokines and TNF- ⁇ , which are reported to promote the expression of ADAMTS4, and TIMP-3, which inhibits ADAMTS4 activity.
  • nucleic acid when ADAMTS4 is targeted, nucleic acids (vector, CRISPR-Cas9 system, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, aptamer) that increase or decrease the gene expression of ADAMTS4 can be considered. Nucleic acids (vectors, CRISPR-Cas9 system, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotides, aptamers) that increase or decrease gene expression can be considered even when an enzyme other than ADAMTS4 is targeted.
  • the screening method A method for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669.
  • a step of allowing ADAMTS4 to act on an APP fragment containing a full-length APP or a sequence around the APP669 position in the presence of a candidate substance and The step of measuring APP669-x produced from the APP fragment containing the full-length APP or the sequence around the APP669 position, and A step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and including.
  • ADAMTS4 is one of the enzymes that cleave the N-terminal of APP669, it is also possible to screen a control substance for APP669 cleaving activity in vitro according to the above steps.
  • the step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 can be performed, for example, as follows.
  • the step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 for example, Using the amount of APP669-x in the control system in which the candidate substance does not exist as a reference level, When the amount of APP669-x in the system in which the candidate substance was present was higher than the reference level, it was judged that the N-terminal cleavage activity of APP669 was increased, and APP669-x in the system in which the candidate substance was present was determined. When the amount is lower than the reference level, it is judged that the N-terminal cleavage activity of APP669 is reduced.
  • the amount of A ⁇ -related peptides other than APP669-x may be measured and evaluated.
  • the measuring method and the candidate substance are the same as described above.
  • kits A kit for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669, which comprises ADAMTS4, a full-length APP or an APP fragment containing a sequence around the APP669 position, and other components described above.
  • An APP fragment containing a sequence around the APP669 position is an amino acid sequence of 4 amino acids around the APP669 position [that is, APP665 (E), 666 (I), 667 (S), 668 (E), 669 (V), An APP fragment containing 670 (K), 671 (M), 672 (D), and 673 (A)], the N-terminal side and / or the C-terminal side may be longer. It is considered that the sequence around the APP669 position recognized by ADAMTS4 may be included.
  • Neutral surfactants are represented by the following abbreviations. n-Decyl- ⁇ -D-maltoside (DM) n-Dodecyl- ⁇ -D-maltoside (DDM) n-Nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside (NTM)
  • Example 1 Evaluation by ADAMTS4 knockout of A549 cells and GM6001 action
  • Effect of CRISPR / Cas9 clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated proteins
  • ADAMTS4 knockout using guide RNA gRNA
  • A549 cells are human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells.
  • the gRNA was designed using the CRISPR Search (https://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/find_crisprs).
  • a vector was created by inserting one by one.
  • a plurality of monoclonal cells were analyzed, and it was estimated that the ADAMTS4 gene region of A549 cells had 3 alleles. Then, as shown in FIG. 2, monoclonal cells lacking the gene region of the ADAMTS4 gene at 16 bp, 29 bp, and 20 bp were obtained. Since neither is a multiple of 3, it is presumed that normal ADAMTS4 protein expression does not occur. Therefore, it was considered that these cells were A549 cells (A549-ADAMTS4 KO cells) in which endogenous ADAMTS4 was knocked out (KO).
  • FIG. 2 shows the sequence of the modified ADAMTS4 gene region in A549-ADAMTS4KO cells.
  • the upper row is the base sequence for the original genome: GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCACGGTGCGGGGCTAAAGCGCTACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA (SEQ ID NO: 12) is shown.
  • the lower row shows the base sequence of the genome (3 alleles) after gene editing: From above, 16bp missing sequence: GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCACGCTACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA (SEQ ID NO: 13), 29bp missing sequence: GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGTAGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA (SEQ ID NO: 14), and 20bp-deficient sequence: GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCAACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA (SEQ ID NO: 15) Is shown.
  • GM6001 (25 ⁇ M), which is a metalloprotease inhibitor, or dimethyl sulfoxide (DMSO) as a control was added to each of the A549-ADAMTS4KO cells and A549-wild type (wt) cells, and the cells were incubated for 96 hours. The culture supernatant was then collected and stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • IP-MS immunoprecipitation
  • MS mass spectrometry
  • the cryopreserved culture supernatant is thawed and the reaction solution containing the internal standard peptide [800 mM GlcNAc, 0.2% (w / v) NTM, 0.2% (w / v) DDM, 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl. buffer (pH 7.4)] 250 ⁇ L and culture supernatant 250 ⁇ L were mixed.
  • the mixture was mixed with antibody-immobilized beads and subjected to an antigen-antibody reaction at 4 ° C. for 1 hour. 22 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-38 and 100 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-15 were used as internal standard peptides.
  • the antibody-immobilized beads were washed with the first wash buffer [first wash buffer (0.1% DDM, 0.1% NTM, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl). Wash once with 100 ⁇ L and wash once with 50 ⁇ L of 50 mM ammonium acetate buffer]. Then, the A ⁇ -related peptide captured in the antibody-immobilized beads was eluted with a glycine buffer containing DDM (50 mM Glycine buffer containing 0.1% DDM, pH 2.8).
  • a Tris buffer solution containing DDM (800 mM GlcNAc, 0.2% (w / v) DDM, 300 mM NaCl, 300 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)] was added to neutralize the pH (pH 7. It was returned to 4). Then, once again, the neutral eluate was contacted with the antibody-immobilized beads for 1 hour at 4 ° C. to react the A ⁇ -related peptide with the antigen-antibody reaction, and washed with the second washing buffer [second washing buffer (0.
  • ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid was used as a matrix for Linear TOF.
  • the matrix solution was prepared by dissolving 1 mg of CHCA in 1 mL of 70% (v / v) acetonitrile. 0.4% (w / v) methanediphosphonic acid (MDPNA) was used as the matrix additive. Equal amounts of 1 mg / mL CHCA solution and 0.4% (w / v) MDPNA were mixed to obtain a matrix / matrix additive solution [0.5 mg / mL CHCA / 0.2% (w / v) MDPNA]. ..
  • Mass spectrum data was acquired by Linear TOF in positive ion mode using AXIMA Performance (Shimadzu / KRATOS, Manchester, UK).
  • the m / z value of Linear TOF is indicated by the average mass of the peak.
  • the m / z value was calibrated using human angiotensin II, human ACTH fragment 18-39, bovine insulin oxidized beta-chain, and bovine insulin as external standards.
  • the signal intensity of each A ⁇ -related peptide was standardized using an internal standard peptide. Then, the average value of the normalized intensity of the four mass spectra obtained from one sample was obtained and evaluated as the amount of A ⁇ -related peptide produced.
  • S / N ⁇ 3 the number of data that does not reach the lower limit of detection
  • FIG. 3 to 6 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when GM6001 (25 ⁇ M) or DMSO was added as a control to A549-ADAMTS4KO cells and A549-wt cells, respectively.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 3 is a graph relating to APP669-711 production
  • FIG. 4 is a graph relating to APP669-709 production
  • FIG. 5 is a graph relating to A ⁇ 1-40 production
  • FIG. 6 is a graph relating to A ⁇ 1-38 production. It is a graph about the quantity.
  • APP669-711 A ⁇ (-3-40)
  • APP669- in both A549-ADAMTS4KO cells and A549-wt cells were compared with the control DMSO.
  • the production of 709 A ⁇ (-3-38)
  • ADAMTS4 is a metalloprotease and is known to be inhibited by GM6001. From this, it is considered that GM6001 inhibited the ADAMTS4 activity and reduced the production amounts of APP669-711 (A ⁇ (-3-40)) and APP669-709 (A ⁇ (-3-38)).
  • Table 1 shows the amino acid sequences of A ⁇ 1-38, A ⁇ 1-40, APP669-709 (A ⁇ (-3-38)), and APP669-711 (A ⁇ (-3-40)).
  • Example 2 Evaluation of APP table HEK cells by ADAMTS4 transfection
  • Non-Patent Document 7 a vector in which the cDNA of human APP (695 amino acid isoform) was inserted into cDNA 3.1 for expression of mammalian cells was used (Non-Patent Document 7), and was used in Human Embryonic Kidney cells 293 (HEK cells).
  • An APP table HEK in which human APP was stably expressed was prepared.
  • a cDNA library was prepared from all mRNAs of human neuroblastoma-derived BE2 (C) cells (purchased from ATCC), and the human ADAMTS4 gene was cloned by PCR.
  • the sequence that overlaps the original vector is shown in uppercase, and the ADAMTS4 sequence is shown in lowercase.
  • the first letter acc in lowercase letters is not the array of ADAMTS4 itself, but contains the Kozak sequence (acc) for improving the translation efficiency of ADAMTS4.
  • a human ADAMTS4 cDNA was inserted into a pcDNA3.1 hygro + vector in which the neomycin / kanamycin resistance gene of pcDNA3.1 was replaced with a hygromycin resistance gene by HiFi Assembly to create an ADAMTS4 plasmid vector.
  • the obtained cDNA sequence is shown as SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence encoded by the cDNA sequence is shown as SEQ ID NO: 19.
  • This cDNA was 100% consistent with the ADAMTS4 gene sequence NP_0050900.3 registered in the database.
  • There are two SNPs in the ADAMTS4 gene (rs423367, rs41270041), which cause amino acid substitutions (Q626R, P720A), respectively.
  • This vector and empty pcDNA3.1 hygro + vector were co-transfected at a ratio of 1:10 and 10: 1.
  • cells that did not transfect the vector (mock) and cells that transfected only the empty pcDNA3.1 hygro + vector (empty) were also prepared. After 6 hours, the medium was replaced with new DMEM medium, and after 48 hours, the culture supernatant was collected. The culture supernatant was measured by the same IP-MS as in Example 1. However, the IP antibody used was an anti-A ⁇ antibody clone 4G8 (BioLegend), and the internal standard peptide used was only 22 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-38.
  • FIGS. 7 to 10 show the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when ADAMTS4 plasmid vector and empty pcDNA3.1 hygro + vector were co-transfected into APP table HEK at a ratio of 1:10 and 10: 1.
  • cells without vector transfection (mock) and cells with empty pcDNA3.1 hygro + vector transfection (empty) were defined as controls.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 7 is a graph relating to the production amount of APP669-711
  • FIG. 8 is a graph relating to the production amount of APP669-709
  • FIG. 9 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-40
  • FIG. 10 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-38. It is a graph about the quantity.
  • APP669-711 A ⁇ (-3-40)
  • APP669-709 A ⁇ (A ⁇ (A ⁇ )) in cells overexpressing ADAMTS4 by co-transfection of ADAMTS4 plasmid vector and empty pcDNA3.1 hygro + vector at a ratio of 10: 1.
  • the production amount of -3-38)) tended to increase slightly (Figs. 7 and 8).
  • APP669-711 A ⁇ (-3-40) and N-terminal side are different, C-terminal side is the same A ⁇ 1-40
  • APP669-709 (A ⁇ (-3-38)) and N-terminal side are different, C-terminal side.
  • ADAMTS4_E362A is an inactive mutant in which glutamic acid (E) at amino acid sequence 362, which is the active center of ADAMTS4, is replaced with alanine (A). Therefore, ADAMTS4_E362A vector was created by the PCR method.
  • EGFP vector an empty vector in which EGFP was inserted into the pcDNA3.1 hygro + vector, ADAMTS4 vector, or ADAMTS4_E362A vector was co-transfected into HEK cells.
  • EGFP vector was used as a control.
  • a mock with no transfection was also used as a control. After incubating for 96 hours, the culture supernatant was collected and measured by the same IP-MS as in Example 1.
  • FIGS. 11-14 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when EGFP, ADAMTS4, and inactive ADAMTS4_E362A were co-transfected into HEK cells together with human APP.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 11 is a graph relating to the production amount of APP669-711
  • FIG. 12 is a graph relating to the production amount of APP669-709
  • FIG. 13 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-40
  • FIG. 14 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-38. It is a graph about the quantity.
  • ADAMTS4 plasmid vector was transfected and ADAMTS4 was overexpressed
  • EGFP was observed.
  • the production amounts of APP669-711 (A ⁇ (-3-40)) and APP669-709 (A ⁇ (-3-38)) equivalent to those of the overexpressed control cells were shown.
  • ADAMTS4 is one of the APP669-cleaving (N-terminal side) enzymes. Further, in Example 3, since the influence of the activity or inactivity of ADAMTS4 is reflected in the production amount of APP669-x, the Cleavage activity of APP669 containing ADAMTS4 is measured by measuring the production amount of APP669-x. Changes can also be captured, and it is considered that it can be used for screening of substances that control the APP669 cleavage activity.
  • Example 4 Evaluation of a compound that controls APP669 cleavage activity
  • a metalloprotease inhibitor 25 ⁇ M GM6001 (Cosmo Bio) or 10 ⁇ M INCB3619 (Non-Patent Document 8) was allowed to act on human neuroblastoma BE (2) -C and human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell A549.
  • DMSO was added as a control and incubated for 96 hours. Then, the culture supernatant was collected and measured by the same IP-MS as in Example 1. However, 20 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-38 and 100 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-15 were used as internal standard peptides.
  • FIGS. 15-18 The results for BE (2) -C cells are shown in FIGS. 15-18.
  • FIGS. 15 to 18 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 or 10 ⁇ M INCB3619 was allowed to act on BE (2) -C cells.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 15 is a graph relating to APP669-711 production
  • FIG. 16 is a graph relating to APP669-709 production
  • FIG. 17 is a graph relating to A ⁇ 1-40 production
  • FIG. 18 is a graph relating to A ⁇ 1-38 production. It is a graph about the quantity.
  • FIGS. 19-22 The results for A549 cells are shown in FIGS. 19-22.
  • 19 to 22 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 or 10 ⁇ M INCB3619 was allowed to act on A549 cells.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 19 is a graph relating to the production amount of APP669-711
  • FIG. 20 is a graph relating to the production amount of APP669-709
  • FIG. 21 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-40
  • FIG. 22 is a graph relating to the production amount of A ⁇ 1-38. It is a graph about the quantity.
  • FIGS. 23 to 26 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when 25 ⁇ M GM6001 was allowed to act on APP table HEK cells.
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • FIG. 23 is a graph relating to APP669-711 production
  • FIG. 24 is a graph relating to APP669-709 production
  • FIG. 25 is a graph relating to A ⁇ 1-40 production
  • FIG. 26 is a graph relating to A ⁇ 1-38 production. It is a graph about the quantity.
  • Example 5 Evaluation of APP table HEK cells by MT-MMP transfection
  • the expression vector in which the FLAG-tagged human MT-MMP1, MT-MMP2, MT-MMP3, MT-MMP4, MT-MMP5, or MT-MMP6 is inserted into the mammalian cell expression vector pCEP4 was invited by Motoharu Seiki. It was donated by a professor (Kanazawa University).
  • FIGS. 27 to 30 are graphs showing the amount of A ⁇ -related peptide produced in the culture supernatant when a vector of MT-MMP1, 2, 3, 4, 5, or 6 was transfected into APP table HEK cells. ..
  • the vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • 27 is a graph relating to APP669-711 production
  • FIG. 28 is a graph relating to APP669-709 production
  • FIG. 29 is a graph relating to A ⁇ 1-40 production
  • FIG. 30 is a graph relating to A ⁇ 1-38 production. It is a graph about the quantity.
  • Example 6 Evaluation of ⁇ -site cleavage by APP, c102, c99 transfection
  • BACE1 ⁇ -secretase
  • C102 is a protein whose N-terminal is APP669 and whose C-terminal is the C-terminal of APP, and is a protein on the C-terminal side after cleavage of APP669.
  • c99 is a protein on the C-terminal side after ⁇ -site cleavage ( ⁇ -CTF, referring to FIG. 1).
  • Non-Patent Document 10 As a vector for expressing c99 inserted into the membrane, a cDNA encoding SPA4CT (Non-Patent Document 10) to which 2 amino acids (DA) are added following the signal sequence of APP is inserted into the mammalian cell expression vector pcDNA4. was used (Non-Patent Document 11).
  • a vector expressing c102 in which 3 amino acids (VKM) were added before the c99 sequence to this vector was prepared by the PCR method. Full length APP, c102, or c99 was transfected into HEK cells. As a control, untransfected HEK cells (no) were also evaluated. After 96 hours, the culture supernatant was collected and measured by the same IP-MS as in Example 1. However, 20 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-38 and 100 pM stable isotope-labeled A ⁇ 1-15 were used as internal standard peptides.
  • FIG. 31 shows the production of A ⁇ -related peptides (APP669-709, APP669-711, A ⁇ 1-38, A ⁇ 1-40) in the culture supernatant when Full-length APP, c102, or c99 was transfected into HEK cells. It is a graph showing the quantity. The vertical axis is the average value of Normalized intensity.
  • the results of control (no), full length APP transfection, c102 transfection, and c99 transfection are shown in order from the left side.
  • the amount of APP669-709 produced is too small for control (no), c99 and does not appear in the bar graph.
  • the production amount of APP669-711 is too small for the control (no) and c99 and does not appear in the bar graph.
  • c102 is not subjected to ⁇ -site cleavage. That is, if the APP669 cleavage activity can be promoted, it is possible to suppress the production of A ⁇ 1-x including A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42. ing.
  • a method for screening a control substance for the N-terminal cleavage activity of APP669. The process of allowing the candidate substance to act on the cultured cells, The step of measuring the A ⁇ -related peptide produced from the cultured cells and A step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and Screening methods, including.
  • the candidate substance is selected from the group consisting of low molecular weight compounds, peptides, proteins and nucleic acids.
  • the candidate substance is selected from the group consisting of low molecular weight compounds, peptides, proteins and nucleic acids designed for ADAMTS4.
  • a step of allowing ADAMTS4 to act on an APP fragment containing a full-length APP or a sequence around the APP669 position in the presence of a candidate substance and The step of measuring APP669-x produced from the APP fragment containing the full-length APP or the sequence around the APP669 position, and A step of evaluating the N-terminal cleavage activity of APP669 and Screening methods, including.

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Abstract

ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、候補物質を培養細胞に作用させる工程と、前記培養細胞から産生されるＡβ関連ペプチドを測定する工程と、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程とを含む、スクリーニング方法。前記候補物質が、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる。ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断酵素。

Description

ＡＤＡＭＴＳ４のＡＰＰ切断活性制御物質のスクリーニング方法
　本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４のＡＰＰ切断活性制御物質のスクリーニング方法に関する。
　アルツハイマー病（Alzheimer's disease；ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の半数以上を占める神経変性疾患である。認知症患者数は２０１７年で世界中に約５０００万人いると推計され、２０３０年には約８２００万人になると見込まれている。日本国内でも認知症患者数は２０２５年には７００万人に達すると推定されている。
　アルツハイマー病の発症にはアミロイドβ（Ａβ）が深く関わっていると考えられている。膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が各種プロテアーゼによる切断を受けることによって、様々な分子種のＡβが産生される（図１参照）。主要なＡβとしてはアミノ酸４０残基のＡβ１－４０とアミノ酸４２残基のＡβ１－４２が存在し、Ａβ１－４２は凝集性が強い。アルツハイマー病では、Ａβの線維化を伴う凝集により脳内に老人斑が出現し、それが最も早期の病理学的変化と考えられている。
　Ａβ１－４０及びＡβ１－４２は、ＡＰＰから、Ｎ末端を切断するβ－セクレターゼによる切断、及びＣ末端を切断するγ－セクレターゼによる切断によって生成される。また、Ａβの１７位のロイシンのＮ末端を切断するα－セクレターゼも存在することが知られており、α－セクレターゼはｓＡＰＰαの産生に関与している。
　Ａβ１－４０及びＡβ１－４２以外にもＡＰＰからは様々なＡβ分子種（すなわち、Ａβ関連ペプチド）が産生されることが報告されており、ヒト血漿中にも複数種類のＡβ関連ペプチドが存在することが示されている（非特許文献１，２，３）。
　それらＡβ関連ペプチドの中で、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０）とも呼ばれる）は、脳内アミロイド蓄積状態を推定する血液バイオマーカーの構成因子として有効であることが報告された（非特許文献４，５）。ＡＰＰ６６９－７１１のＣ末端は、Ａβ１－４０のＣ末端と同じであるため、γ－セクレターゼによる切断を受けた部位と考えられるが、ＡＰＰ６６９－７１１のＮ末端がどのようなプロテアーゼにより切断されたのかは明らかとなっていない。
　α－セクレターゼがＡＰＰを切断することによりｓＡＰＰαが産生されると、Ａβ（すなわち、Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）の産生量が減少することが確認されている。その機構を利用し、α－セクレターゼ活性を調節することで脳内のアミロイド蓄積を抑制し、神経変性疾患の治療に役立てるというアプローチが報告されている（非特許文献６）。
　一方、脳の機能に重要な分泌タンパク質であるリーリンの発現低下や分解亢進がアルツハイマー病等の疾患の一因となることが知られており、リーリンの分解酵素A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 3（ＡＤＡＭＴＳ－３）を同定し、その活性制御に基づいたアルツハイマー病等の疾患の有効な予防や治療手段の開発につなげるアプローチも報告されている（ＷＯ　２０１４／０２７６６８，日本国特許第５８３８４８１号）。
　ＷＯ　２０１５／１１１４３０（米国公開ＵＳ　２０１６／０３３４４２０）には、ＡＰＰ切断型ペプチドの測定方法が開示されている。
　特開２０１７－２０９８０号公報（米国公開ＵＳ　２０１７／００１６９１０）には、ポリペプチドの質量分析方法が開示されている。
ＷＯ　２０１４／０２７６６８ 日本国特許第５８３８４８１号公報 ＷＯ　２０１５／１１１４３０ 米国公開ＵＳ　２０１６／０３３４４２０ 特開２０１７－２０９８０号公報 米国公開ＵＳ　２０１７／００１６９１０
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　α－セクレターゼについての上述した知見を踏まえれば、ＡＰＰ６６９のＮ末端を切断する酵素（以下、本明細書において単にＡＰＰ６６９切断酵素と呼ぶこともある）の活性を制御することが、Ａβ（すなわち、Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）の産生抑制に基づくアルツハイマー病の予防や治療手段として重要となると考えられる。このような技術的課題はこれまで知られていない。
　現時点でＡＰＰ６６９－ｘ産生に関わるＡＰＰ６６９のＮ末端切断酵素が明らかとなっていないため、まず、そのような酵素を同定することが求められる。
　そして、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を強く制御する（強く促進する）物質が見つかれば、Ａβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）の産生量の抑制にも利用できると考えられる。つまり、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断酵素活性の制御物質が薬剤候補になる可能性があり、それを開発するためには、制御物質をスクリーニングする方法が必要となってくる。
　そこで、本発明の目的は、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断酵素を同定することにある。また、本発明の目的は、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を制御する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4（ＡＤＡＭＴＳ４）がＡＰＰ６６９のＮ末端を切断する酵素の一つであることを突き止めた。さらには、ＡＰＰ６６９－ｘ（Ｎ末端がＡＰＰ６６９であるペプチド）の産生を抑制するとＡβ（Ａβ１－４０及びＡβ１－４２）が増えること、Ｎ末端がＡＰＰ６６９のＡＰＰ断片はβ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）による切断を受けないことも確認した。これらの知見から、本発明に到達した。
　本発明の第１の態様は、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　候補物質を培養細胞に作用させる工程と、
　前記培養細胞から産生されるＡβ関連ペプチドを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む、スクリーニング方法である。
　本発明の第２の態様は、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　In vitroの系で、候補物質存在下のもとＡＤＡＭＴＳ４を全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片に作用させる工程と、
　前記全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片から産生されるＡＰＰ６６９－ｘを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む、スクリーニング方法である。
　本発明の第３の態様は、ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤である。
　本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４が、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid precursor protein;ＡＰＰ）の６６９番目のアミノ酸のＮ末端部位を切断してＡＰＰ６６９－ｘペプチドを産生するという新規な知見に基づいており、ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤が提供される。
　本発明によれば、ＡＰＰ６６９－ｘペプチド量を指標として、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を制御する物質をスクリーニングする方法が提供される。
　本発明によれば、ＡＰＰ６６９－ｘペプチド量を指標として、ＡＤＡＭＴＳ４によるＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を制御する物質をスクリーニングする方法が提供される。
　本発明のスクリーニング方法によれば、ＡＰＰ６６９－ｘペプチドの産生量の変化に応じて、同じＡＰＰから産生されるアミロイドβ（Ａβ）の量も変動するため、ＡＤＡＭＴＳ４に着目した分子標的薬や遺伝子治療に有効な物質のスクリーニングに有用な手法となる。
　アルツハイマー病の発症にはアミロイドβ（Ａβ）が深く関わっていると考えられており、そのため、本発明のスクリーニング方法によれば、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を制御することに基づいて、アルツハイマー病の予防薬や治療薬開発に有用なスクリーニングが可能となる。
図１は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の分解による、Ａβペプチドの生成経路を模式的に示す図である。 図２は、Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞において、改変されたＡＤＡＭＴＳ４遺伝子領域の配列を示す。上段は、元ゲノムについての塩基配列（配列番号１２）を示しており、下段は、遺伝子編集後のゲノム（３アレル）についての塩基配列：上から、１６ｂｐ欠損した配列（配列番号１３）、２９ｂｐ欠損した配列（配列番号１４）、２０ｂｐ欠損した配列（配列番号１５）を示している。 図３は、実施例１において、Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞とＡ５４９－ｗｔ細胞それぞれに、ＧＭ６００１（２５μＭ）、又は、コントロールとしてＤＭＳＯを添加したときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフであり、縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図４は、実施例１において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図５は、実施例１において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図６は、実施例１において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図７は、実施例２において、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫにＡＤＡＭＴＳ４ plasmid vectorとempty pcDNA3.1 hygro+ vectorとを１：１０および１０：１の割合でco-transfectionしたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフであり、vectorをtransfectionしていない細胞（mock）とempty pcDNA3.1 hygro+ vectorのみをtransfectionした細胞（empty）をコンロトールとした。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図８は、実施例２において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図９は、実施例２において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図１０は、実施例２において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図１１は、実施例３において、ＨＥＫ細胞へヒトＡＰＰと共にＥＧＦＰ、ＡＤＡＭＴＳ４、および不活性型ＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２Ａをco-transfectionしたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図１２は、実施例３において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図１３は、実施例３において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図１４は、実施例３において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図１５は、実施例４において、ＢＥ（２）－Ｃ細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１、又は１０μＭ ＩＮＣＢ３６１９を作用させたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図１６は、実施例４において、ＢＥ（２）－Ｃ細胞についてのＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図１７は、実施例４において、ＢＥ（２）－Ｃ細胞についてのＡβ１－４０産生量に関するグラフである。 図１８は、実施例４において、ＢＥ（２）－Ｃ細胞についてのＡβ１－３８産生量に関するグラフである。 図１９は、実施例４において、Ａ５４９細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１、又は１０μＭ ＩＮＣＢ３６１９を作用させたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図２０は、実施例４において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図２１は、実施例４において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図２２は、実施例４において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図２３は、実施例４において、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１を作用させたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図２４は、実施例４において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図２５は、実施例４において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図２６は、実施例４において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図２７は、実施例５において、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞に対して、ＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，４，５，又は６のvectorをtransfectionしたときの培養上清中のＡＰＰ６６９－７１１産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。 図２８は、実施例５において、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフである。 図２９は、実施例５において、Ａβ１－４０産生量に関するグラフである。 図３０は、実施例５において、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。 図３１は、実施例６において、ＨＥＫ細胞に対して、Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＡＰＰ、ｃ１０２、又はｃ９９をtransfectionしたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド（ＡＰＰ６６９－７０９、ＡＰＰ６６９－７１１、Ａβ１－３８、Ａβ１－４０）の産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。
［ＡＤＡＭＴＳ４］
　ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ，A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs）ファミリーは、ＡＤＡＭのサブファミリーであり、哺乳動物等に見いだされる細胞外プロテアーゼファミリーである。ＡＤＡＭＴＳには現在１９のメンバーが存在している。ＡＤＡＭＴＳは切断する基質を中心にいくつかのサブグループに分類されており、ＡＤＡＭＴＳ１，４，５，８，９，１５，及び２０が、アグリカナーゼ／プロテオグリカナーゼ（Aggrecanase／Proteoglycanase）と呼ばれる一群とされている。
　上記のように、ＡＤＡＭＴＳ４は公知であって、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子配列は、ＮＰ＿００５０９０．３として登録されている。なお、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子には２つのＳＮＰが存在しており（ｒｓ４２３３３６７、ｒｓ４１２７００４１）、コードされるタンパク質には、それぞれのアミノ酸置換（Ｑ６２６Ｒ、Ｐ７２０Ａ）を生じる。
　本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ４が、ＡＰＰ６６９のＮ末端を切断する酵素の一つであることを突き止めた。すなわち、ＡＤＡＭＴＳ４が、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid precursor protein;ＡＰＰ）の６６９番目のアミノ酸のＮ末端部位を切断してＡＰＰ６６９－ｘペプチドを産生する。ここで、全長ＡＰＰは７７０残基のアミノ酸から成るので、ｘは、６６９よりも大きい７７０までの整数を意味する。
　このことにより、本発明により、ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤が提供される。また、以下に説明するスクリーニング方法との関連において、in vitroの系において、ＡＤＡＭＴＳ４をＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤として使用する方法、及び、in vitroの系における、ＡＤＡＭＴＳ４のＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤としての使用が提供される。
［ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質のスクリーニング方法］
　本発明の実施形態において、スクリーニング方法は、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　候補物質を培養細胞に作用させる工程と、
　前記培養細胞から産生されるＡβ関連ペプチドを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む。
　前記Ａβ関連ペプチドには、種々の分子種が含まれ、それらのうち、ＡＰＰ６６９のＮ末端で切断されたペプチドとしては、ＡＰＰ６６９－ｘとして表すことができる。全長ＡＰＰは７７０残基のアミノ酸から成るので、ｘは、６６９よりも大きい７７０までの整数を意味する。
　また、前記Ａβ関連ペプチドには、ＡＰＰの６６９番目よりもＮ末端側で切断されたペプチドも含まれる。候補物質によっては、ＡＰＰの種々の部位で切断されることが考えられる。
　また、前記Ａβ関連ペプチドとして、限定されることなく、次のペプチドを例示することができる。ＡＰＰ６６３－７１１，ＡＰＰ６６４－７１１，ＡＰＰ６６６－７０９，ＡＰＰ６６６－７１１，ＡＰＰ６６９－７０９（配列番号３），ＡＰＰ６６９－７１０，ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号４），ＡＰＰ６６９－７１３，ＡＰＰ６７１－７１１，ＡＰＰ６７２－７０９（配列番号１），ＡＰＰ６７２－７１１（配列番号２），ＡＰＰ６７２－７１３（配列番号５），ＡＰＰ６７４－７１１。
ＡＰＰ６７２－７０９（Ａβ１－３８）（配列番号１）：
　 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６７２－７１１（Ａβ１－４０）（配列番号２）：
　 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））（配列番号３）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））（配列番号４）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２－７１３（Ａβ１－４２）（配列番号５）：
　 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
　上記のように、ＡＰＰ６７２－７０９とＡβ１－３８とは同じペプチドを表す。同様に、ＡＰＰ６７２－７１１とＡβ１－４０とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６６９－７０９とＡβ（－３－３８）とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６６９－７１１とＡβ（－３－４０）とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６７２－７１３とＡβ１－４２とは同じペプチドを表す。
　すなわち、前記Ａβ関連ペプチドをＡβ１－ｙという表記を行う場合には、ｙ＝ｘ－６７１となる。
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質の候補物質を培養細胞に作用させる。この工程は、通常の培養法により行うことができる。
　次に、前記培養細胞から産生されたＡβ関連ペプチドを測定する。この測定工程は、公知の方法により、培養上清試料について行うことができる。測定対象とする前記Ａβ関連ペプチド（ＡＰＰ６６９－ｘ、及び／又は、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド）について測定する。
　測定工程において、基本的にはＡβ関連ペプチド濃度及び／又は量を測定するが、当業者が濃度及び／又は量に準じて用いる他の単位、例えば、質量分析における検出イオン強度であってもよい。
　Ａβ関連ペプチドの測定は、生体分子特異的親和性に基づく検査によって行ってもよい。生体分子特異的親和性に基づく検査は、当業者によく知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）（サンドイッチイムノ法、競合法、及び直接吸着法を含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、生体由来試料中のＡβ関連ペプチドに結合する抗体を検出する。
　Ａβ関連ペプチドの測定を、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ免疫グロブリン、またはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を含む免疫グロブリン断片を用いて作製された抗体固定化担体を用いて行ってもよい。前記抗体固定化担体を用いた免疫沈降法により質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行うことができる（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry； ＩＰ－ＭＳ）。
　また、本発明において、連続的に免疫沈降（Consecutive Immunoprecipitation；ｃＩＰ）を行い、その後、質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行ってもよい（ｃＩＰ－ＭＳ）。２回連続でアフィニティ精製を行うことにより、１回のアフィニティ精製だけでは排除しきれなかった夾雑物質を、２回目のアフィニティ精製によりさらに減少させることができる。このため、夾雑物質によるＡβ関連ペプチドのイオン化抑制を防ぐことができ、試料中の微量なＡβ関連ペプチドでも質量分析で高感度に計測することが可能となる。
　本発明においては、この場合に用いられる質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法などによる質量分析法であることが好ましい。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＱｑＱ（エレクトロスプレーイオン化－三連四重極）型質量分析装置、ＥＳＩ－Ｑｑ－ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化－タンデム四重極－飛行時間）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ（エレクトロスプレーイオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等を用いることができる。
　また、ＭＡＬＤＩ質量分析において、マトリックス、及びマトリックス溶媒は、当業者が適宜決定することができる。
　マトリックスとしては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５-ジヒドロキシ安息香酸（２，５－ＤＨＢ）、シナピン酸、３－アミノキノリン（３－ＡＱ）等を用いることができる。
　マトリックス溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール、エタノール及び水からなる群から選択して用いることができる。より具体的には、ＡＣＮ－ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、メタノール－ＴＦＡ水溶液、メタノール水溶液、エタノール－ＴＦＡ水溶液、エタノール溶液などを用いることができる。
　ＭＡＬＤＩ質量分析において、マトリックス添加剤（コマトリックス）が併用されてもよい。マトリックス添加剤は、当業者が適宜選択することができる。例えば、マトリックス添加剤として、ホスホン酸基含有化合物を用いることができる。具体的には、ホスホン酸基を１個含む化合物として、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニルホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、及び1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）等が挙げられる。また、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid；ＭＤＰＮＡ）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、及びエチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）等が挙げられる。上記のホスホン酸基含有化合物の中でも、１分子中に２以上、好ましくは２～４個のホスホン酸基を有する化合物が好ましい。
　測定されたＡβ関連ペプチドの産生量から、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する。この評価工程は、例えば、次のようにして行うことができる。
　前記Ａβ関連ペプチドが、ＡＰＰ６６９－ｘである場合、例えば、
　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する。
　この場合において、ただ１種のＡＰＰ６６９－ｘ、例えば、ＡＰＰ６６９－７０９について評価を行ってもよい。あるいは、ＡＰＰ６６９－７０９、ＡＰＰ６６９－７１１、ＡＰＰ６６９－７１３などの複数種について評価を行ってもよい。複数種についての評価を行う場合には、ＡＰＰ６６９のＮ末端側の切断活性に着目しているのであるから、これら複数種について総合的（個々の比較、合計量としての比較）に評価することが考えられる。
　前記Ａβ関連ペプチドが、ＡＰＰ６６９－ｘ、及び、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドである場合、例えば、
　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量及びＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量の各量を基準レベルとして、
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも低い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも高い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する。
　前記ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドがＡβ１－ｙ（ここで、ｙ＝ｘ－６７１）であると、ＡＰＰ６６９のＮ末端側の切断活性に加えて、ＡＰＰ６６９－ｘの産生と、Ａβ１－ｙとの産生との関連性について調べられ、より多くの知見が得られるであろう。Ａβ１－ｙ（Ｎ末端がＡβ１位であるペプチド）を参照することで、ＡＰＰ６６９切断活性を特異的に評価できる。
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質の候補物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸などから選ばれてよい。はば広く種々の物質をスクリーニングする。
　低分子化合物としては、標的ポリペプチドに結合可能な低分子化合物が考えられる。例えば、創薬で使われているような、あるタンパク質に結合する低分子化合物が挙げられる。ＡＤＡＭＴＳ４を阻害する低分子化合物であれば、ＧＭ６００１やCalcium pentosan polysulfate等が挙げられる。
　ペプチドとしては、２～５０アミノ酸残基からなるペプチドが考えられる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の発現を抑制すると報告されている大豆ペプチド等が例示される。
　タンパク質としては、５０アミノ酸残基以上からなるタンパク質が考えられる。例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の発現を促進すると報告されているIL-1 cytokinesやＴＮＦ－α、ＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害するＴＩＭＰ－３等が挙げられる。
　核酸としては、ＡＤＡＭＴＳ４をターゲットとした場合、ＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現を増加、又は減少させる核酸（ベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）が考えられる。ＡＤＡＭＴＳ４以外の酵素をターゲットとした場合においても、その遺伝子発現を増加、又は減少させる核酸（ベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）が考えられる。
　本発明の別の実施形態において、スクリーニング方法は、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　In vitroの系で、候補物質存在下のもとＡＤＡＭＴＳ４を全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片に作用させる工程と、
　前記全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片から産生されるＡＰＰ６６９－ｘを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む。
　ＡＤＡＭＴＳ４がＡＰＰ６６９のＮ末端を切断する酵素の一つであるという新規な知見から、in vitroにおいて、上記の工程に従って、ＡＰＰ６６９切断活性の制御物質をスクリーニングすることも可能である。
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の評価工程は、例えば、次のようにして行うことができる。
　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、例えば、
　前記候補物質を存在させていないコントロール系でのＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する。
　また、ＡＰＰ６６９－ｘの量の他に、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドの量についても測定して、評価を行ってもよい。測定方法や、候補物質については、上述したのと同様である。
［スクリーニング用キット］
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングするためのキットであって、ＡＤＡＭＴＳ４、全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片、その他の上述した各成分を含むキット。
　ＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片とは、ＡＰＰ６６９位前後の４アミノ酸ずつのアミノ酸配列［すなわち、ＡＰＰ６６５（Ｅ），６６６（Ｉ），６６７（Ｓ），６６８（Ｅ），６６９（Ｖ），６７０（Ｋ），６７１（Ｍ），６７２（Ｄ），及び６７３（Ａ）］を含むＡＰＰ断片のことで、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側は、それよりも長くてもよい。ＡＤＡＭＴＳ４が認識するＡＰＰ６６９位前後の配列が含まれていればよいと考えられる。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。
　中性界面活性剤は、以下の略称で表す。
n-Decyl-β-D-maltoside（ＤＭ）
n-Dodecyl-β-D-maltoside（ＤＤＭ）
n-Nonyl-β-D-thiomaltoside（ＮＴＭ）
［実施例１：Ａ５４９細胞のＡＤＡＭＴＳ４ノックアウト、及びＧＭ６００１作用による評価］
　Ａ５４９細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（clustered regularly interspaced short palindromic repeats／CRISPR associated proteins）及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いたＡＤＡＭＴＳ４ノックアウト、及び、メタロプロテアーゼ阻害剤であるＧＭ６００１の処理によるＡＰＰ６６９－ｘ産生への影響を評価した。Ａ５４９細胞は、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞である。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ Ｓｅａｒｃｈ（https://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/find_crisprs）を用いて設計した。
　ＳｐＣａｓ９ ｎｉｃｋａｓｅ及びｇＲＮＡを発現するベクターｐｘ３３５（Addgene＃42335）とレトロウイルス由来のベクターｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ Ｕ６ ＢｂｓＩ（Dundee大学Dario Alessi教授より供与されたもの）にＡＤＡＭＴＳ４を標的とするペアとなるｇＲＮＡをコードするｃＤＮＡを片方ずつ挿入したベクターを作出した。
　ｐｘ３３５に挿入したｃＤＮＡ配列
5’-GCGCTACCTGCTAACAGTGA-3'（配列番号６）
3'-CGCGATGGACGATTGTCACT-5'（すなわち、5’-TCACTGTTAGCAGGTAGCGC-3'：配列番号７）
　ｐＢａｂｅ Ｐｕｒｏ Ｕ６ ＢｂｓＩに挿入したｃＤＮＡ配列
5'-CATTCCACGGTGCGGGGCTA-3'（配列番号８）
3'-GTAAGGTGCCACGCCCCGAT-5'（すなわち、5’-TAGCCCCGCACCGTGGAATG-3'：配列番号９）
　これらのベクターをトランスフェクションし、Puromycinでセレクションを行い、モノクローン化した。各モノクローナル細胞からゲノムを抽出し、ｇＲＮＡの標的となる遺伝子領域を含むゲノム断片をＰＣＲで増幅し、サンガーシーケンシングを行った。ゲノム断片を増幅するために使用したプライマーは以下の通りである。
5’-AGTCAGGAATCCCGTGGGG-3’（配列番号１０）
3’-CCTGGGACTGGTGAAACTGTGT-5’（すなわち、5’-TGTGTCAAAGTGGTCAGGGTCC-3'：配列番号１１）
　複数のモノクローナル細胞を解析し、Ａ５４９細胞のＡＤＡＭＴＳ４遺伝子領域は３アレル存在すると推測された。そして、図２のように、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の遺伝子領域を１６ｂｐ、２９ｂｐ、２０ｂｐ欠損したモノクローナル細胞を得た。いずれも３の倍数ではないことから、正常なＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現が生じないと推測される。そこで、この細胞が内因性ＡＤＡＭＴＳ４をノックアウト（ＫＯ）されたＡ５４９細胞（Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞）であると考えられた。
　図２は、Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞において、改変されたＡＤＡＭＴＳ４遺伝子領域の配列を示す。
　上段は、元ゲノムについての塩基配列：
GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCACGGTGCGGGGCTAAAGCGCTACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA（配列番号１２）を示している。
　下段は、遺伝子編集後のゲノム（３アレル）についての塩基配列：
上から、
１６ｂｐ欠損した配列：
GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCACGCTACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA（配列番号１３），
２９ｂｐ欠損した配列：
GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGTAGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA（配列番号１４），及び
２０ｂｐ欠損した配列：
GGTGGTGGCAGATGACAAGATGGCCGCATTCCAACCTGCTAACAGTGATGGCAGCAGCAGCCAAGGCCTTCAAGCA（配列番号１５）
を示している。
　このＡ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞とＡ５４９－野生型（ｗｔ）細胞それぞれに、メタロプロテアーゼ阻害剤であるＧＭ６００１（２５μＭ）、又は、コントロールとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、９６時間インキュベートした。その後、培養上清を回収し、測定まで－８０℃で保存した。
　培養上清中のＡβ関連ペプチドを免疫沈降（Immunoprecipitation；ＩＰ）と質量分析（Mass spectrometry；ＭＳ）を組み合わせたＩＰ－ＭＳを用いて測定した。ＩＰでは抗Ａβ抗体クローン6E10（BioLegend）をDynabeads Epoxy（Thermo Fisher Scientific）に共有結合させた抗体固定化ビーズを使用した。
　凍結保存した培養上清を融解し、内部標準ペプチドを含む反応液［８００ｍＭ GlcNAc、０．２％（ｗ／ｖ） ＮＴＭ、０．２％（ｗ／ｖ） ＤＤＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）］２５０μＬと培養上清２５０μＬを混合した。混合液を抗体固定化ビーズと混ぜて、１時間、４℃で抗原抗体反応させた。内部標準ペプチドとして、２２ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－３８と１００ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－１５を使用した。
　抗原抗体反応後、抗体固定化ビーズを第一洗浄緩衝液で洗浄した［第一洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、０．１％ ＮＴＭ、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで１回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄］。その後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドをＤＤＭを含むグリシン緩衝液（０．１％ ＤＤＭを含有する５０ ｍＭ Glycine buffer，ｐＨ２．８）で溶出した。得られた溶出液にＤＤＭを含むトリス緩衝液［８００ｍＭ GlcNAc、０．２％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭTris-HCl buffer（ｐＨ７．４）］を加えてｐＨを中性（ｐＨ７．４）に戻した。その後、もう一度、中性の溶出液を抗体固定化ビーズと１時間、４℃で接触させて、Ａβ関連ペプチドを抗原抗体反応させ、第二洗浄緩衝液で洗浄［第二洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、１５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで２回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄］後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドを溶出液（５ｍＭ ＨＣｌ, ０．１ｍＭ Methionine, ７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で溶出した。このようにして、２段階ＩＰ操作によるＡβ関連ペプチドを含む各溶出液を得た。
　Ｌｉｎｅａｒ ＴＯＦ用のマトリックスとして、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）を用いた。マトリックス溶液は、ＣＨＣＡ １ｍｇを７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１ｍＬで溶解することによって調製した。マトリックス添加剤として、０．４％（ｗ／ｖ） methanediphosphonic acid（ＭＤＰＮＡ）を用いた。１ｍｇ／ｍＬ ＣＨＣＡ溶液と０．４％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡを等量混合し、マトリックス／マトリックス添加剤溶液［０．５ｍｇ／ｍＬ ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡ］を得た。
　予め、マトリックス／マトリックス添加剤溶液の０．５μＬをμFocus MALDI plateTM 900 μm (Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)の各ｗｅｌｌ上へ滴下し、乾燥させた。
　上記μFocus MALDI plateTM 900 μmの４ｗｅｌｌ上へ、ＩＰ後の各溶出液を滴下して乾燥させた。
　マススペクトルデータはＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ(Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK)を用いて、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ ＴＯＦで取得した。Ｌｉｎｅａｒ ＴＯＦのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準として、human angiotensin IIとhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。
　マススペクトルにおいて、各Ａβ関連ペプチドのシグナル強度に対して、内部標準ペプチドを用いて標準化した。その後、１サンプルから得られる４つのマススペクトルの標準化強度（Normalized intensity）の平均値を求め、それをＡβ関連ペプチド産生量として評価した。検出下限に達しない（Ｓ／Ｎ＜３）データ数が２つ以上存在した場合は、検出不可とした。
　結果を図３～６に示す。図３～６は、Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞とＡ５４９－ｗｔ細胞それぞれに、ＧＭ６００１（２５μＭ）、又は、コントロールとしてＤＭＳＯを添加したときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフであり、縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図３は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図４は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図５は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図６は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞のＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））の産生量は、Ａ５４９－ｗｔ細胞と比べると半分以下に低下していた（図３及び４）。一方、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０）とＮ末端側が異なり、Ｃ末端側は同じＡβ１－４０、及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））とＮ末端側が異なり、Ｃ末端側は同じＡβ１－３８の産生量は、逆にＡ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞ではＡ５４９－ｗｔ細胞と比べると若干増加する傾向にあった（図５及び６）。ＡＤＡＭＴＳ４のノックアウトによりＡＰＰ６６９をＮ末端とするペプチドの産生量が低下した結果は、ＡＤＡＭＴＳ４がＡＰＰ６６９のＮ末端の切断に関与していることを示している。
　さらに、メタロプロテアーゼ阻害剤であるＧＭ６００１を作用させると、Ａ５４９－ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞とＡ５４９－ｗｔ細胞のいずれにおいても、コントロールのＤＭＳＯに比べてＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））の産生量は半分程度に減少し、Ａβ１－４０とＡβ１－３８の産生量は僅かに増加する傾向にあった（図３～６）。ＡＤＡＭＴＳ４はメタロプロテアーゼであり、ＧＭ６００１により阻害されることが知られている。このことから、ＧＭ６００１によりＡＤＡＭＴＳ４活性が阻害されて、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））の産生量が減少したと考えられる。
　これらは、ＡＤＡＭＴＳ４がＡＰＰ６６９切断（Ｎ末端側）に関与していることを示す結果であるとともに、本手法を用いてＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及び／又はＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））の低下を捉えることにより、ＡＰＰ６６９切断活性の減少を評価できることを示している。ただし、ＡＰＰ６６９のＮ末端を切断する酵素はＡＤＡＭＴＳ４以外にも存在すると考えられる。その理由は、ＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞でもＡＰＰ６６９－ｘが完全に消失しなかったこと、そしてＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞にＧＭ６００１を作用させるとＡＰＰ６６９－ｘが減少したからであり、未知のメタロプロテアーゼがＡＤＡＭＴＳ４ ＫＯ細胞におけるＡＰＰ６６９－ｘ産生に関わっていることを示す結果でもある。
　表１に、Ａβ１－３８、Ａβ１－４０、ＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））、及びＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））のアミノ酸配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２：ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞のＡＤＡＭＴＳ４ transfectionによる評価］
　ＡＤＡＭＴＳ４過剰発現によるＡＰＰ６６９－ｘ産生への影響を評価した。
　ヒトＡＰＰを発現するベクターとして哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１にヒトＡＰＰ（６９５アミノ酸アイソフォーム）のｃＤＮＡが挿入されたものを用い（非特許文献７）、Human Embryonic Kidney cells 293（ＨＥＫ細胞）にヒトＡＰＰを安定発現させたＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫを作製した。また、ヒト神経芽細胞腫由来細胞ＢＥ２（Ｃ）細胞（ATCCより購入）の全ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作出し、ＰＣＲによりヒトＡＤＡＭＴＳ４遺伝子のクローニングを行った。
　クローニングに用いたプライマー
5'-GGAGACCCAAGCTGGaccatgtcccagacaggctcgc-3'（配列番号１６）
3'-ggacccgcccgtcctttattCGCAAATTTGAATTCGAACCA-5' （すなわち、5’-ACCAAGCTTAAGTTTA
AACGCttatttcctgcccgcccagg-3'：配列番号１７）
　上記のプライマーの配列において、元ベクターにＡＤＡＭＴＳ４の配列をインサートする際に、元ベクターとオーバーラップさせた配列を大文字で表記し、ＡＤＡＭＴＳ４の配列を小文字として表記している。なお、小文字の最初の文字accは、ＡＤＡＭＴＳ４自体の配列ではないが、ＡＤＡＭＴＳ４の翻訳効率を上げるためのコザック配列（acc）を入れている。
　ｐｃＤＮＡ３．１のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置き換えたｐｃＤＮＡ３．１ hygro+ vectorにヒトＡＤＡＭＴＳ４のｃＤＮＡをHiFi Assembly により挿入しＡＤＡＭＴＳ４ plasmid vectorを作出した。得られたｃＤＮＡ配列を配列番号１８として示し、それにコードされているアミノ酸配列を配列番号１９として示す。このｃＤＮＡはデータベースに登録されているＡＤＡＭＴＳ４遺伝子配列ＮＰ＿００５０９０．３と１００％一致した。なお、ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子には２つのＳＮＰが存在しており（ｒｓ４２３３３６７、ｒｓ４１２７００４１）、それぞれアミノ酸置換（Ｑ６２６Ｒ、Ｐ７２０Ａ）を生じる。
　このvectorとempty pcDNA3.1 hygro+ vectorを１：１０および１０：１の割合でco-transfectionした。コントロールとして、vectorをtransfectionしていない細胞（mock）とempty pcDNA3.1 hygro+ vectorのみをtransfectionした細胞（empty）も用意した。６時間後、新しいＤＭＥＭ培地に換え、４８時間後に培養上清を回収した。その培養上清を実施例１と同様のＩＰ－ＭＳで測定した。ただし、ＩＰの抗体は抗Ａβ抗体クローン4G8（Bio Legend）を用い、内部標準ペプチドは２２ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－３８のみを使用した。
　結果を図７～１０に示す。図７～１０は、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫにＡＤＡＭＴＳ４ plasmid vector とempty pcDNA3.1 hygro+ vectorとを１：１０および１０：１の割合でco-transfectionしたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフであり、vectorをtransfectionしていない細胞（mock）とempty pcDNA3.1 hygro+ vectorのみをtransfectionした細胞（empty）をコンロトールとした。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図７は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図８は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図９は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図１０は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　ＡＤＡＭＴＳ４ plasmid vector とempty pcDNA3.1 hygro+ vectorを１０：１の割合でco-transfectionして、ＡＤＡＭＴＳ４を過剰発現させた細胞ではＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））の産生量が若干増加する傾向が見られた（図７及び８）。一方、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０）とＮ末端側が異なり、Ｃ末端側は同じＡβ１－４０、及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））とＮ末端側が異なり、Ｃ末端側は同じＡβ１－３８の産生量は増加せず、若干低下する傾向があった（図９及び１０）。ＡＤＡＭＴＳ４の過剰発現によりＡＰＰ６６９をＮ末端とするペプチドが増加したことは、ＡＤＡＭＴＳ４がＡＰＰ６６９切断（Ｎ末端側）に関与していることを支持する結果となっている。
［実施例３：不活性型ＡＤＡＭＴＳ４（Ｅ３６２Ａ）の評価］
　ＡＤＡＭＴＳ４と不活性型ＡＤＡＭＴＳ４（Ｅ３６２Ａ）の過剰発現によるＡＰＰ６６９－ｘ産生への影響を比較した。
　ＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２ＡはＡＤＡＭＴＳ４の活性中心であるアミノ酸配列３６２番目のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に置換した、不活性型の変異体である。そこでＰＣＲ法によりＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２Ａ vectorを作出した。
　Ｅ３６２Ａ変異体作出に用いたプライマー
5'-cactgctgctcatgcgctgggtcatgtct-3'（配列番号２０）
3'-gtgacgacgagtacgcgacccagtacaga-5'（すなわち、5’-agacatgacccagcgcatgagcagcagtg-3'：配列番号２１）
　ヒトＡＰＰ vectorと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ hygro+ vectorにＥＧＦＰを挿入した空ベクター（ＥＧＦＰ vector）、ＡＤＡＭＴＳ４ vector、またはＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２Ａ vectorをＨＥＫ細胞へco-transfectionした。ＥＧＦＰ vectorはコントロールとして用いた。何もtransfectionしていないmockもコントロールとして用いた。９６時間インキュベートした後、培養上清を回収し、実施例１と同様のＩＰ－ＭＳで測定した。
　結果を図１１～１４に示す。図１１～１４は、ＨＥＫ細胞へヒトＡＰＰと共にＥＧＦＰ、ＡＤＡＭＴＳ４、および不活性型ＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２Ａをco-transfectionしたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図１１は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図１２は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図１３は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図１４は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　ＡＤＡＭＴＳ４ plasmid vectorをtransfectionして、ＡＤＡＭＴＳ４を過剰発現させた細胞では実施例２と同様に、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量が増加する傾向が見られた（図１１及び１２）。一方、Ａβ１－４０、及びＡβ１－３８の産生量には変化がなかった。不活性型のＡＤＡＭＴＳ４＿Ｅ３６２Ａを過剰発現させた細胞では、ＥＧＦＰを過剰発現させたコントロール細胞と同等のＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量を示した。
　この結果や、実施例１，２の結果を総合すると、ＡＤＡＭＴＳ４がＡＰＰ６６９切断（Ｎ末端側）酵素の一つであると考えられる。また、本実施例３ではＡＤＡＭＴＳ４の活性、又は不活性の影響がＡＰＰ６６９－ｘの産生量にも反映していることから、ＡＰＰ６６９－ｘの産生量を測定することによりＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９切断活性の変化も捉えることができ、ＡＰＰ６６９切断活性の制御物質のスクリーニングに利用可能と考えられる。
［実施例４：ＡＰＰ６６９切断活性を制御する化合物の評価］
　メタロプロテアーゼ阻害剤によるＡＰＰ６６９－ｘ産生への影響を評価した。
　ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）－Ｃ、及び、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９へ、メタロプロテアーゼ阻害剤２５μＭ ＧＭ６００１（コスモ・バイオ）、又は１０μＭ ＩＮＣＢ３６１９（非特許文献８）を作用させ、又は、コントロールとしてＤＭＳＯを添加し、９６時間インキュベートした。その後、培養上清を回収し、実施例１と同様のＩＰ－ＭＳで測定した。ただし、内部標準ペプチドは２０ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－３８と１００ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－１５を使用した。
　ＢＥ（２）－Ｃ細胞についての結果を図１５～１８に示す。図１５～１８は、ＢＥ（２）－Ｃ細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１、又は１０μＭ ＩＮＣＢ３６１９を作用させたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図１５は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図１６は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図１７は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図１８は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　Ａ５４９細胞についての結果を図１９～２２に示す。図１９～２２は、Ａ５４９細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１、又は１０μＭ ＩＮＣＢ３６１９を作用させたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図１９は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図２０は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図２１は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図２２は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　ＢＥ（２）－Ｃ細胞及びＡ５４９細胞いずれの場合においても、ＧＭ６００１の作用によりＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量が減少したが、Ａβ１－４０及びＡβ１－３８の産生量は減少しなかった。これらのことから、ＧＭ６００１がＡＰＰ６６９切断活性（Ｎ末端側）を低下させることが分かる。一方、ＩＮＣＢ３６１９による影響を確認すると、ＢＥ（２）－Ｃ細胞のＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量は若干減少したが、Ａ５４９細胞では変化がなかった。これらのことから、ＩＮＣＢ３６１９はＡＰＰ６６９切断活性（Ｎ末端側）を低下させる効果は低いことが分かる。このようにして、化合物ごとのＡＰＰ６６９切断活性への影響を評価することができる。
　また、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞についても、上記操作と同様に、２５μＭ ＧＭ６００１を作用させ、ＩＰ－ＭＳで測定した。
　ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞についての結果を図２３～２６に示す。図２３～２６は、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞へ２５μＭ ＧＭ６００１を作用させたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図２３は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図２４は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図２５は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図２６は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞の場合においても、ＧＭ６００１の作用によりＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量が減少したが、Ａβ１－４０及びＡβ１－３８の産生量は減少しなかった。
［実施例５：ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞のＭＴ－ＭＭＰ transfectionによる評価］
　メタロプロテアーゼであるＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，４，５，又は６によるＡＰＰ６６９－ｘ産生への影響を評価した。
　哺乳類細胞発現用ベクターｐＣＥＰ４に、ＦＬＡＧタグを付加したヒトＭＴ－ＭＭＰ１、ＭＴ－ＭＭＰ２、ＭＴ－ＭＭＰ３、ＭＴ－ＭＭＰ４、ＭＴ－ＭＭＰ５、又はＭＴ－ＭＭＰ６が挿入された発現ベクターは、清木元治招聘特任教授（金沢大学）よりご供与いただいた。
　ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞に対して、ＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，４，５，又は６のvectorをtransfectionして９６時間後に、培養上清を回収し、実施例１と同様のＩＰＭＳで測定した。コントロールとして、vectorをtransfectionしていない細胞（mock）を用いた。
　結果を図２７～３０に示す。図２７～３０は、ＡＰＰ ｓｔａｂｌｅ ＨＥＫ細胞に対して、ＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，４，５，又は６のvectorをtransfectionしたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。図２７は、ＡＰＰ６６９－７１１産生量に関するグラフであり、図２８は、ＡＰＰ６６９－７０９産生量に関するグラフであり、図２９は、Ａβ１－４０産生量に関するグラフであり、図３０は、Ａβ１－３８産生量に関するグラフである。
　ＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，５，又は６をtransfectionした細胞では、ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の両方の産生量が減少していた。一方、これらとＮ末端側が異なり、Ｃ末端側は同じＡβ１－４０とＡβ１－３８の産生量も同様に減少していた。ＭＴ－ＭＭＰ２や３はＡβを分解するという報告がある（非特許文献９）。したがって、ＭＴ－ＭＭＰ１，２，３，５，又は６が、ＡＰＰ６６９－ｘのみならずＡβ１－ｘをも分解して、これらＡβ関連ペプチド産生量が減少した結果と考えられる。このように、ＡＰＰ６６９位以外での切断があった場合は、Ａβ１－ｘも同様の変動が確認される。したがって、Ａβ１－ｘの変化も参照することが、ＡＰＰ６６９切断活性が変動しているのか、その他の切断が変動しているのかの判別に有効である。
［実施例６：ＡＰＰ，ｃ１０２，ｃ９９ transfectionによるβサイト切断評価］
　ＡＰＰ６６９切断後のｃ１０２にβ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）によるβサイト切断が生じるかどうかを評価した。
　ｃ１０２とは、Ｎ末端がＡＰＰ６６９で、Ｃ末端がＡＰＰのＣ末端であるタンパク質であり、ＡＰＰ６６９切断後のＣ末端側のタンパク質である。ｃ９９とはβサイト切断後のＣ末端側のタンパク質（図１を参照すると、β－ＣＴＦ）である。
　膜に挿入されたｃ９９を発現させるベクターとしては、ＡＰＰのシグナル配列に続いて２アミノ酸（ＤＡ）が付与されたＳＰＡ４ＣＴをコードするｃＤＮＡ（非特許文献１０）が哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ４に挿入されたものを用いた（非特許文献１１）。このベクターに対してｃ９９配列の前に３アミノ酸（ＶＫＭ）付加したｃ１０２を発現するベクターは、ＰＣＲ法により作出した。Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈであるＡＰＰ、ｃ１０２、又はｃ９９をＨＥＫ細胞にtransfectionした。コントロールとして、transfectionしていないＨＥＫ細胞（no）も評価した。９６時間後に培養上清を回収し、実施例１と同様のＩＰ－ＭＳで測定した。ただし、内部標準ペプチドは２０ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－３８と１００ｐＭ安定同位体標識Ａβ１－１５を使用した。
　結果を図３１に示す。図３１は、ＨＥＫ細胞に対して、Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＡＰＰ、ｃ１０２、又はｃ９９をtransfectionしたときの培養上清中のＡβ関連ペプチド（ＡＰＰ６６９－７０９、ＡＰＰ６６９－７１１、Ａβ１－３８、Ａβ１－４０）の産生量を表すグラフである。縦軸は標準化強度（Normalized intensity）の平均値である。各Ａβ関連ペプチドにおいて、左側から順に、コントロール（no）、Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈのＡＰＰのtransfection、ｃ１０２のtransfection、ｃ９９のtransfectionの結果を示している。ＡＰＰ６６９－７０９の産生量は、コントロール（no）、ｃ９９では少なすぎて棒グラフに表れていない。また、ＡＰＰ６６９－７１１の産生量は、コントロール（no）、ｃ９９では少なすぎて棒グラフに表れていない。
　ｃ１０２過剰発現ではＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））及びＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８）の産生量が最も多く、ｃ９９過剰発現ではＡβ１－４０及びＡβ１－３８の産生量が最も多かった。Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＡＰＰ過剰発現ではコントロール細胞と比べて、いずれのＡβ関連ペプチドも増加していた。これは過剰発現させたＦｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＡＰＰから、ＡＰＰ６６９－７１１、ＡＰＰ６６９－７０９、Ａβ１－４０、Ａβ１－３８などが生成されていることを示す。しかし、ｃ１０２過剰発現では、コントロール細胞と比べてＡβ１－４０やＡβ１－３８は増加していなかった。つまり、ＡＰＰ６６９切断（Ｎ末端側）後のｃ１０２に対してはβサイト切断を受けないことを示している。つまり、ＡＰＰ６６９切断活性を促進させることができれば、Ａβ１－４０やＡβ１－４２を含むＡβ１－ｘの産生を抑制する可能性を示している。
（１）
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　候補物質を培養細胞に作用させる工程と、
　前記培養細胞から産生されるＡβ関連ペプチドを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
（２）
　前記Ａβ関連ペプチドがＡＰＰ６６９－ｘである、上記（１）に記載の方法。
（３）
　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、上記（２）に記載の方法。
（４）
　前記Ａβ関連ペプチドが、ＡＰＰ６６９－ｘ、及び、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドである、上記（１）に記載の方法。
（５）
　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量及びＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量の各量を基準レベルとして、
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも低い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも高い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、上記（４）に記載の方法。
（６）
　前記ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドがＡβ１－ｙ（ここで、ｙ＝ｘ－６７１）である、上記（４）又は（５）に記載の方法。
（７）
　前記候補物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
　前記候補物質が、ＡＤＡＭＴＳ４をターゲットに設計された低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
　In vitroの系で、候補物質存在下のもとＡＤＡＭＴＳ４を全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片に作用させる工程と、
　前記全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片から産生されるＡＰＰ６６９－ｘを測定する工程と、
　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
（１０）
　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
　前記候補物質を存在させていないコントロール系でのＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、上記（９）に記載の方法。
（１１）
　前記候補物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、上記（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）
　ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤。
（１３）
　In vitroの系において、ＡＤＡＭＴＳ４をＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤として使用する方法。
（１４）
　In vitroの系における、ＡＤＡＭＴＳ４のＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤としての使用。

Claims (12)

  1. 　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
    　候補物質を培養細胞に作用させる工程と、
    　前記培養細胞から産生されるＡβ関連ペプチドを測定する工程と、
    　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
    を含む、スクリーニング方法。
  2. 　前記Ａβ関連ペプチドがＡＰＰ６６９－ｘである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
    　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
    　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
    　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記Ａβ関連ペプチドが、ＡＰＰ６６９－ｘ、及び、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
    　前記候補物質を作用させていないコントロール細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量及びＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量の各量を基準レベルとして、
    　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも低い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
    　前記候補物質を作用させた細胞のＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低く、且つ、ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチド量が前記基準レベルと同等もしくは前記基準レベルよりも高い場合に、ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記ＡＰＰ６６９－ｘ以外のＡβ関連ペプチドがＡβ１－ｙ（ここで、ｙ＝ｘ－６７１）である、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　前記候補物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記候補物質が、ＡＤＡＭＴＳ４をターゲットに設計された低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性の制御物質をスクリーニングする方法であって、
    　In vitroの系で、候補物質存在下のもとＡＤＡＭＴＳ４を全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片に作用させる工程と、
    　前記全長ＡＰＰ又はＡＰＰ６６９位前後の配列を含むＡＰＰ断片から産生されるＡＰＰ６６９－ｘを測定する工程と、
    　ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程と、
    を含む、スクリーニング方法。
  10. 　前記ＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性を評価する工程において、
    　前記候補物質を存在させていないコントロール系でのＡＰＰ６６９－ｘ量を基準レベルとして、
    　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも高い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が増加したと判断し、及び
    　前記候補物質を存在させた系でのＡＰＰ６６９－ｘ量が前記基準レベルよりも低い場合にＡＰＰ６６９のＮ末端切断活性が低下したと判断する、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記候補物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質及び核酸からなる群から選ばれる、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　ＡＤＡＭＴＳ４を含むＡＰＰ６６９のＮ末端切断剤。
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