WO2020196453A1 - Ｉｌ－３３関連疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

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inhibitor
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俊憲 中山
仁 熊谷
潔 平原
政宏 木内
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Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for interleukin (IL) -33 related diseases. More specifically, the present invention relates to a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases, an IL-33 activation inhibitor, and a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases.
  • IL interleukin
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-057333 filed in Japan on March 25, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Allergic airway inflammation is a type of IL-33-related disease, and is a pathological condition represented by bronchial asthma in human diseases.
  • As therapeutic agents for bronchial asthma inhaled steroids, ⁇ 2 receptor stimulants, leukotriene receptor antagonists, theophylline preparations, oral steroids and the like have been used for a long time.
  • biologics such as omalizumab targeting immunoglobulin E (IgE) and mepolizumab targeting IL-5, which is one of the inflammatory cytokines, have also been used in patients with intractable asthma. On the other hand, it is clinically applied.
  • IgE immunoglobulin E
  • mepolizumab targeting IL-5 which is one of the inflammatory cytokines
  • Ubiquitin SpecialiPeptidase 7 is a kind of deubiquitinating enzyme, and it is known that Murine Double Minute 2 (MDM2), which is an E3 ubiquitin ligase of p53, is used as a substrate.
  • MDM2 Murine Double Minute 2
  • Patent Documents 1 to 12 and Non-Patent Documents 1 to 11 describe low molecular weight compounds that specifically inhibit the activity of USP7. Patent Documents 1 to 12 and Non-Patent Documents 1 to 11 are incorporated herein by reference in their entirety.
  • an object of the present invention is to provide a technique for effectively preventing or treating IL-33-related diseases such as allergic airway inflammation.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the test substance comprises the step of measuring the activity of the USP7 protein in the presence of the test substance, and the activity was reduced as compared with the activity of the USP7 protein in the absence of the test substance.
  • a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for an IL-33-related disease which indicates that the agent is a prophylactic or therapeutic agent for a -33-related disease.
  • Amount of the cleaved IL-33 protein comprising a step of incubating the Granzyme A protein and the IL-33 protein in the presence of the test substance and a step of quantifying the cleaved IL-33 protein. was reduced compared to the amount of the IL-33 protein cleaved in the absence of the test substance, indicating that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases.
  • 33 A method for screening a prophylactic or therapeutic agent for a related disease comprising a step of incubating the Granzyme A protein and the IL-33 protein in the presence of the test substance and a step of quantifying the cleaved IL-33 protein.
  • a step of culturing Th2 cells in the presence of the test substance and a step of measuring the expression level of the Granzyme A gene or protein by the Th2 cells are included, and the expression level is in the absence of the test substance. Screening of prophylactic or therapeutic agents for IL-33-related diseases, indicating that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases, as shown by a decrease in the expression level of the Granzyme A gene or protein in Method.
  • a step of culturing Th2 cells in the presence of the test substance and a step of measuring the expression level of the USP7 gene or protein by the Th2 cells are included, and the expression level is in the absence of the test substance.
  • the ubiquitinated histone H2A includes a step of culturing Th2 cells in the presence of a test substance and a step of measuring the amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus of the Th2 cells. An increase in the amount of the test substance compared to the amount of ubiquitinated histone H2A in the absence of the test substance indicates that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases, IL. -33 A method for screening a preventive or therapeutic agent for a related disease.
  • FIG. It is a schematic diagram which shows the experiment schedule of Experiment Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having analyzed the cell in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having measured the airflow blockage in Experimental Example 1.
  • A) to (d) are micrographs showing the results of hematoxylin / eosin staining of tissue sections of mouse lungs in Experimental Example 2.
  • (A) to (d) are micrographs showing the results of PAS staining of tissue sections of mouse lungs in Experimental Example 3.
  • It is a schematic diagram which shows the experiment schedule of Experiment Example 4. 6 is a volcano plot showing the results of RNA-seq in Experimental Example 4.
  • (A) and (b) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR in Experimental Example 4.
  • (A) is the result of measuring the expression level of the Usp7 gene
  • (b) is the result of measuring the expression level of the Gzma gene.
  • (A) is a graph showing the result of flow cytometry analysis in Experimental Example 5.
  • (B) is a graph summarizing the results of (a). It is a photograph which shows the result of Western blotting in Experimental Example 6.
  • human genes and human proteins are represented by uppercase alphabets.
  • the first letter is represented by an uppercase alphabet, and the subsequent letters are represented by a lowercase alphabet.
  • mouse protein shall be represented by an uppercase alphabet.
  • human genes, mouse genes, and genes of other species may be represented by the uppercase alphabet without strict distinction.
  • human proteins, mouse proteins, and other types of proteins may be represented by uppercase alphabets without strict distinction.
  • the present invention provides a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases, which comprises a USP7 inhibitor as an active ingredient.
  • Th2 cells allergy-related type 2 helper T cells
  • Granzyme A was shown to cleave IL-33, a cytokine that plays a central role in IL-33-related diseases. It is known that IL-33 becomes active IL-33 by cleavage, and the degree of inducing inflammation is about 30 times higher than that before cleavage.
  • IL-33-related diseases can be prevented or prevented by inhibiting any reaction in the reaction pathway of USP7 expression ⁇ increased expression of granzyme A ⁇ cleavage / activation of IL-33 by granzyme A ⁇ induction of inflammatory reaction. Can be treated.
  • Th2 cells are a subgroup of CD4-positive T cells (so-called helper T cells), and T cells (naive T cells) that have no history of contact with antigen proteins are stimulated by cytokines such as IL-4 and IL-13. It is a cell that has differentiated by receiving.
  • NCBI accession numbers of the cDNA sequence of the human USP7 gene are NM_0012864557.1, NM_001286458.1, NM_00132185.8.1, NM_003470.2. , NP_003461.2., NP_0012733386.1, NP_0012733387.1, XP_016879141.1, etc., the NCBI accession number of the cDNA sequence of the mouse USP7 gene is NM_001003918.2, etc. Is NP_001003918.2.
  • NCBI accession number of the cDNA sequence of the human granzyme A gene is NM_006144.3, etc.
  • the NCBI accession number of the amino acid sequence of the human granzyme A protein is NP_006135.1, etc.
  • the mouse granzyme A gene is NM_0103700.2 or the like
  • the NCBI accession number of the amino acid sequence of the mouse granzyme A protein is NP_034500.1 or the like.
  • NCBI accession numbers of the cDNA sequence of the human IL-33 gene are NM_001199640.1, NM_00119964.11, NM_001314044.1, NM_001314045.1, NM_001314046.1, etc.
  • the NCBI accession numbers of the sequences are XP_016870774.1, NP_0013007977.1, NP_254274.1., NP_001340731.1, NP_00130090976.1, NP_001186569.1, NP_001300775.1, NP_001186570.1.
  • NCBI accession numbers of the cDNA sequence of the mouse IL-33 gene are NM_001164724.1, NM_133775.2, etc.
  • NCBI accession numbers of the amino acid sequence of the mouse IL-33 protein are NP_001158196.1, NP_598536.2. And so on.
  • examples of IL-33-related diseases include allergic airway inflammation, eosinophilic sinusitis, and eosinophilic esophagitis.
  • asthma is mentioned as an allergic airway inflammation, and among them, eosinophilic asthma is mentioned.
  • asthma in which the number of eosinophils in peripheral blood is 150 cells / ⁇ L or more can be determined to be eosinophilic asthma.
  • the IL-33 related disease is eosinophilic asthma in which the number of eosinophils in the peripheral blood is 500 / ⁇ L or more.
  • eosinophilic sinusitis is a type of fibrotic disease in which multiple nasal polyps (nasal polyps) with marked eosinophilic infiltration are formed in both paranasal sinuses and nasal cavities, and its pathogenic mechanism is clear. Not made. Even if the nasal polyps of patients with eosinophilic sinusitis are removed by surgery, they are likely to recur, which has become a major clinical problem as intractable chronic sinusitis. Eosinophilic esophagitis is a disease in which eosinophils concentrate on the mucous membrane of the esophagus and cause chronic inflammation.
  • Patients with IL-33-related diseases for whom administration of a USP7 inhibitor is effective include patients with a higher concentration of IL-33 or eosinophil count in blood or bronchoalveolar lavage fluid than in healthy subjects.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment is, for example, an IL-33-related disease patient having 150 or more eosinophils in peripheral blood or 500 or more eosinophils in peripheral blood. It is effective for patients with IL-33 related diseases.
  • the USP7 inhibitor may constitute a kit for preventing or treating IL-33-related diseases together with a reagent for measuring the concentration of IL-33 in blood or bronchoalveolar lavage fluid.
  • a reagent for measuring the concentration of IL-33 include an anti-IL-33 antibody, an immunoplate on which an anti-IL-33 antibody is immobilized, and a flow strip on which an anti-IL-33 antibody is immobilized.
  • the USP7 inhibitor may constitute a kit for preventing or treating IL-33-related diseases together with a reagent for measuring the number of eosinophils in blood or bronchoalveolar lavage fluid.
  • a reagent for measuring the eosinophil count include hematoxylin / eosin stain, Giemsa stain, field stain, Wright's stain, and antibodies specific for eosinophil markers.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment targets inflammation in the respiratory tract, a local administration method such as inhalation administration is also a realistic option. Therefore, the prophylactic or therapeutic agent of the present embodiment can be easily administered and is unlikely to cause systemic side effects.
  • the USP7 inhibitor may be an inhibitory nucleic acid for the USP7 gene.
  • the inhibitory nucleic acid include small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (SHRNA) and the like.
  • siRNA small interfering RNA
  • SHRNA short hairpin RNA
  • An expression vector expressing these inhibitory nucleic acids in mammalian cells may be used as a USP7 inhibitor.
  • SiRNA is a 21-23 base pair low molecular weight double-stranded RNA used for gene silencing by RNA interference.
  • the siRNA introduced into the cell binds to RNA-induced silencing complex (RISC).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • This complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA. As a result, gene expression is suppressed in a sequence-specific manner.
  • sense strand and antisense strand oligonucleotides are synthesized by a DNA / RNA automatic synthesizer, respectively, and denatured in an appropriate annealing buffer at about 90 to 95 ° C. for about 1 minute, and then 30 to 70. It can be prepared by annealing at about ° C. for about 1 to 8 hours.
  • ShRNA is a hairpin-type RNA sequence used for gene silencing by RNA interference.
  • SiRNA or shRNA is introduced into a target cell (eg, Th2 cell) intended to suppress the expression of the USP7 gene by administering it to a patient in the form of an expression vector into which an expression construct encoding siRNA or shRNA is introduced, and a short chain is introduced. It may be expressed by the RNA polymerase III (polIII) -based U6 promoter or H1 promoter having high RNA expression efficiency.
  • a plasmid vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector and the like can be used.
  • RNA-induced silencing complex binds to and cleaves mRNA having a sequence complementary to siRNA.
  • the USP7 inhibitor may be a low molecular weight compound. More specifically, the following formulas (A1) to (A5), (B1) to (B2), (C1) to (C5), (D1) to (D6), (E1) to (E8), (F1) )-(F5), (G1)-(G4), (H1)-(H8), (I1)-(I14), compounds or derivatives thereof, or pharmacologically acceptable thereof. Examples include salts or solvates thereof.
  • the USP7 inhibitors are the following formulas (A1) to (A5), (B1) to (B2), (C1) to (C5), (D1) to (D6), (E1) to (E8), ( It may be a compound represented by any of F1) to (F5), (G1) to (G4), (H1) to (H8), and (I1) to (I14), or may be a compound represented by the following formula (A1).
  • the compounds represented by the above formulas (A1) to (A3) are the compounds described in the above non-patent documents 1 and the like, and the compounds represented by the above formulas (A4) to (A5) are the above non-patent documents. It is the compound described in No. 4 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (B1) to (B2) are the compounds described in the above non-patent documents 2 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (C1) to (C5) are the compounds described in the above non-patent documents 3 and the like.
  • the compound represented by the above formula (D1) is a compound described in the above non-patent documents 4, 7, and the like.
  • the compounds represented by the formulas (D2), (D5), and (D6) are the compounds described in Non-Patent Document 4 and the like.
  • the compound represented by the above formula (D3) is a compound described in the above non-patent documents 4, 8 and the like.
  • the compound represented by the above formula (D4) is the compound described in the above non-patent document 8 and the like.
  • the compound represented by the above formula (E1) is a compound described in the above non-patent documents 4, 9, 10 and the like.
  • the compound represented by the above formula (E2) is a compound described in the above non-patent documents 4, 5, 6, 10, and the like.
  • the compound represented by the above formula (E3) is a compound described in the above non-patent documents 4, 9 and the like.
  • the compounds represented by the formulas (E4) to (E8) are the compounds described in Non-Patent Document 4 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (F1) to (F5) are the compounds described in the above non-patent documents 4 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (G1) to (G4) are the compounds described in the above non-patent documents 4 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (H1) to (H8) are the compounds described in the above non-patent documents 4 and the like.
  • the compounds represented by the above formulas (I1) to (I14) are the compounds described in the above non-patent documents 10 and the like.
  • one or more hydrogen atoms have a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, a thiol group, a sulfo group, and 1 to 3 carbon atoms. Examples include compounds substituted with alkyl groups.
  • Examples of pharmacologically acceptable salts include salts with alkali metals, alkaline earth metals, ammonium, alkylammonium and the like, and salts with mineral acids or organic acids. More specifically, for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, aluminum salt, triethylammonium salt, acetate, propionate, butyrate, formate, trifluoroacetate, maleate, etc.
  • the solvate is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable solvate, and examples thereof include hydrates and organic solvates.
  • the USP7 inhibitor is a granzyme A expression inhibitor.
  • the USP7 inhibitor is the same as that described above, and may be an inhibitory nucleic acid for the USP7 gene or a low molecular weight compound that inhibits the activity of the USP7 protein.
  • USP7 inhibitor is an IL-33 activation inhibitor.
  • the Granzyme A inhibitor is an IL-33 activation inhibitor.
  • the granzyme A inhibitor may be an inhibitory nucleic acid for the granzyme A gene, a low molecular weight compound that inhibits the protease activity of the granzyme A protein, or an inhibitor of the protease activity of the granzyme A protein. It may be an anti-granzyme A antibody.
  • Such inhibitory antibodies for example, bind to the catalytic domain of Granzyme A and inhibit the cleavage of the substrate protein by Granzyme A.
  • the inhibitory antibody immunizes mice and the like with a fragment containing the catalytic domain of Granzyme A, and establishes a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the immunized antigen by a well-known hybridoma technique, and from among them, Granzyme It can be obtained by selecting a clone that produces a monoclonal antibody that inhibits the protease activity of A.
  • the catalytic domain of Granzyme A can be easily specified by those skilled in the art based on the above-mentioned sequence information of Granzyme A and the like.
  • the anti-granzyme A antibody may be an antibody fragment.
  • the anti-granzyme A antibody or fragment thereof is preferably humanized. Since the human antibody or a fragment thereof has low immunogenicity even when administered to humans, side effects such as anaphylactic shock can be suppressed.
  • human antibodies examples include chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • the chimeric antibody means an antibody in which the variable region is an antibody derived from a non-human animal and at least a part of the constant region is an antibody derived from a human.
  • the humanized antibody means an antibody in which only the complementarity determining regions of the heavy chain and the light chain are derived from non-human animals, and the constant region and the framework region are human-derived antibodies.
  • the fully human antibody means an antibody derived entirely from humans including the complementarity determining regions.
  • the present invention provides a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases containing a granzyme A inhibitor as an active ingredient.
  • Granzyme A inhibitors are useful because they can be expected to have therapeutic effects on the prevention or treatment of IL-33-related diseases when administered in blood.
  • the IL-33-related diseases are the same as those described above, and examples thereof include allergic airway inflammation, eosinophilic sinusitis, and eosinophilic esophagitis.
  • asthma is mentioned as an allergic airway inflammation, and among them, eosinophilic asthma is mentioned.
  • asthma in which the number of eosinophils in peripheral blood is 150 cells / ⁇ L or more can be determined to be eosinophilic asthma.
  • the IL-33 related disease is eosinophilic asthma in which the number of eosinophils in the peripheral blood is 500 / ⁇ L or more.
  • Patients with IL-33-related diseases for whom administration of a granzyme A inhibitor is effective include patients with a higher concentration of IL-33 or eosinophil count in blood or bronchoalveolar lavage fluid than in healthy subjects.
  • administration of the granzyme A inhibitor includes, for example, patients with IL-33-related diseases having 150 or more eosinophils in peripheral blood and 500 eosinophils in peripheral blood / ⁇ L. It is effective for the above IL-33 related disease patients.
  • the Granzyme A inhibitor may constitute a kit for preventing or treating IL-33-related diseases together with a reagent for measuring the concentration of IL-33 in blood or bronchoalveolar lavage fluid.
  • the reagents for measuring the concentration of IL-33 are the same as those described above.
  • the Granzyme A inhibitor may constitute a kit for preventing or treating IL-33-related diseases together with a reagent for measuring the number of eosinophils in blood or bronchoalveolar lavage fluid.
  • the reagent for measuring the number of eosinophils is the same as that described above.
  • the USP7 inhibitor or Granzyme A inhibitor described above is preferably formulated as a pharmaceutical composition mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be in a dosage form used orally or in a dosage form used parenterally.
  • Dosage forms used orally include, for example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like.
  • Dosage forms used parenterally include, for example, injections, inhalants, suppositories, patches and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, solvents such as sterilized water and physiological saline; binders such as gelatin, cornstarch, traganth gum and arabic rubber; excipients such as crystalline cellulose; swelling agents such as alginic acid and the like. Can be mentioned.
  • pharmaceutically acceptable carriers include lipids and the like. Examples of the lipid include cationic lipids.
  • the pharmaceutical composition may further contain additives.
  • additives such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, and saccharin; flavors such as peppermint and red mono oil; stabilizers of benzyl alcohol and phenol; buffers such as phosphate and sodium acetate.
  • the pharmaceutical composition can be formulated by appropriately combining the above carriers and additives and mixing them in a generally accepted unit dose form required for pharmaceutical practice.
  • Administration to patients is performed, for example, by intranasal, transbronchial, intramuscular, percutaneous, or oral methods known to those skilled in the art, in addition to intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and the like. sell.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the patient's symptoms, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the dose of the USP7 inhibitor or granzyme A inhibitor varies depending on the type of USP7 inhibitor or granzyme A inhibitor, the patient's symptoms, etc., but in the case of oral administration, it is generally used in adults (assuming a body weight of 60 kg). It is appropriate to administer about 0.1 to 500 mg, preferably about 1.0 to 250 mg, more preferably about 1.0 to 100 mg per day once a day or in several divided doses. Conceivable.
  • the dose When administered parenterally, the dose varies depending on the type of USP7 inhibitor or granzyme A inhibitor, patient symptoms, target organs, administration method, etc., but when systemic administration is performed, it is generally for adults. In (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 500 mg, preferably about 1.0 to 250 mg, more preferably about 1.0 to 100 mg per day is divided into once or several times a day. It is considered appropriate to administer. When topical administration is performed, in general, for adults (assuming a body weight of 60 kg), about 0.001 to 10 mg, preferably about 0.01 to 5 mg, and more preferably about 0.02 to 2 mg per day. It is considered appropriate to administer once a day or in several divided doses.
  • the screening method of the first embodiment includes the step of measuring the activity of the USP7 protein in the presence of the test substance, and the activity is reduced as compared with the activity of the USP7 protein in the absence of the test substance.
  • the screening method of the first embodiment may be performed at the test tube level using USP7 protein or at the cultured cell level using cells expressing USP7 protein.
  • Examples of the activity of the USP7 protein include an activity of deubiquitinating a self-ubiquitinated MDM2 protein, an activity of deubiquitinating a ubiquitinated p53 protein, and the like.
  • the degree of ubiquitination of the MDM2 protein and the degree of ubiquitination of the p53 protein can be measured by Western blotting or the like.
  • a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, or the like can be used as the test substance.
  • the USP7 expressing cells cells derived from humans and cells derived from non-human animals can be used. Examples of cells derived from non-human animals include Escherichia coli, yeast cells, insect cells, plant cells and the like.
  • the USP7 expressing cell may be a cell into which an expression vector of the USP7 gene has been introduced, or may be a cell expressing the USP7 gene such as Th2 cell.
  • the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases. Can be judged.
  • test substance whose activity of the USP7 protein was reduced as compared with the negative control as a candidate substance was administered to an IL-33-related disease model animal for evaluation, and as a result, IL-33 was evaluated.
  • a test substance whose preventive or therapeutic effect on related diseases may be selected as a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases.
  • a negative control a compound or the like that has been clarified in advance not to affect the activity of the USP7 protein can be used.
  • examples of the IL-33-related disease model animal include an allergic airway inflammation model described later in Examples.
  • the screening method of the second embodiment includes the step of incubating the Granzyme A protein and the IL-33 protein in the presence of the test substance, and the step of quantifying the cleaved IL-33 protein.
  • the decrease in the amount of IL-33 protein compared to the amount of cleaved IL-33 protein in the absence of the test substance is that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases.
  • This is a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases.
  • the screening method of the second embodiment is preferably performed at the test tube level using Granzyme A protein and IL-33 protein.
  • the IL-33 protein may have a tag such as a GST-tag or a His ⁇ 6 tag from the viewpoint of facilitating purification, for example.
  • the reaction temperature and reaction time of the Granzyme A protein and the IL-33 protein can be appropriately adjusted, and examples thereof include conditions such as 10 minutes to 24 hours at 25 to 40 ° C.
  • the same substance as in the first embodiment can be used as the test substance.
  • the quantification of the cleaved IL-33 protein can be measured by Western blotting or the like.
  • the intensity of the band of the IL-33 protein whose molecular weight is smaller than that before cleavage may be quantified.
  • the molecular weight of the untagged IL-33 protein before cleavage is about 30 kDa, and the molecular weight after cleavage with Granzyme A is about 17 to 20 kDa.
  • the test substance is IL-. It can be determined that it is a preventive or therapeutic agent for 33-related diseases.
  • test substance a test substance in which cleavage of IL-33 protein is suppressed
  • the candidate substance is selected as IL-.
  • a negative control a compound or the like that has been previously shown not to affect the IL-33 protein cleavage activity of Granzyme A protein can be used.
  • examples of the IL-33-related disease model animal include an allergic airway inflammation model described later in Examples.
  • the screening method of the third embodiment includes a step of culturing Th2 cells in the presence of a test substance and a step of measuring the expression level of the Granzyme A gene or protein by the Th2 cells, and the expression level is the said.
  • a decrease in the expression level of the Granzyme A gene or protein in the absence of the test substance indicates that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for the IL-33-related disease.
  • the screening method of the third embodiment is carried out at the cellular level.
  • Th2 cells include cells derived from mammals, and examples thereof include human cells and mouse cells. Th2 cells may be cells induced to differentiate from naive CD4-positive T cells.
  • the same substance as in the first embodiment can be used as the test substance.
  • Culturing Th2 cells in the presence of the test substance may mean adding the test substance to the Th2 cell medium and culturing, or introducing the test substance into the Th2 cells by lipofection, electroporation, or the like. And may be cultivated.
  • the expression level of the Granzyme A gene can be measured by, for example, RT-PCR, quantitative RT-PCR, DNA microarray, or the like.
  • the expression level of Granzyme A protein can be measured by, for example, ELISA, Western blotting or the like.
  • the test substance prevents IL-33-related diseases.
  • it can be determined that it is a therapeutic agent.
  • a test substance having a reduced expression level of the Granzyme A gene or protein by Th2 cells as compared with a negative control was selected as a candidate substance, and then the candidate substance was administered to an IL-33-related disease model animal for evaluation.
  • a test substance whose preventive or therapeutic effect on IL-33-related diseases may be selected as a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases.
  • a negative control a compound or the like that has been clarified in advance not to affect the expression level of the Granzyme A gene or protein by Th2 cells can be used.
  • examples of the IL-33-related disease model animal include an allergic airway inflammation model described later in Examples.
  • the screening method of the fourth embodiment includes a step of culturing Th2 cells in the presence of a test substance and a step of measuring the expression level of the USP7 gene or protein by the Th2 cells, and the expression level is the test.
  • a decrease in the expression level of the USP7 gene or protein in the absence of the substance indicates that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for the IL-33-related disease.
  • the screening method of the fourth embodiment is carried out at the cellular level.
  • the same Th2 cells as those in the third embodiment can be used.
  • the same substance as in the first embodiment can be used as the test substance.
  • Culturing Th2 cells in the presence of a test substance is the same as in the third embodiment, and the test substance may be added to the Th2 cell medium and cultured, or by lipofection, electroporation, or the like.
  • the test substance may be introduced into Th2 cells and cultured.
  • the expression level of the USP7 gene can be measured by, for example, RT-PCR, quantitative RT-PCR, DNA microarray, or the like.
  • the expression level of the USP7 protein can be measured by, for example, ELISA, Western blotting or the like.
  • the test substance prevents IL-33-related diseases or It can be determined that it is a therapeutic agent.
  • a test substance having a reduced expression level of the USP7 gene or protein by Th2 cells as compared with a negative control was selected as a candidate substance, and then the candidate substance was administered to an IL-33-related disease model animal for evaluation.
  • a test substance whose preventive or therapeutic effect on IL-33-related diseases may be selected as a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases.
  • a negative control a compound or the like that has been previously clarified not to affect the expression level of the USP7 gene or protein by Th2 cells can be used.
  • examples of the IL-33-related disease model animal include an allergic airway inflammation model described later in Examples.
  • the screening method of the fifth embodiment includes a step of culturing Th2 cells in the presence of a test substance and a step of measuring the amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus of the Th2 cells.
  • the increase in the amount of ubiquitinated histone H2A compared to the amount of ubiquitinated histone H2A in the absence of the test substance is that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases. It is a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related diseases, which indicates that there is.
  • the screening method of the fifth embodiment is carried out at the cellular level.
  • the same Th2 cells as those in the third embodiment can be used.
  • the same substance as in the first embodiment can be used as the test substance.
  • Culturing Th2 cells in the presence of a test substance is the same as in the third embodiment, and the test substance may be added to the Th2 cell medium and cultured, or by lipofection, electroporation, or the like.
  • the test substance may be introduced into Th2 cells and cultured.
  • the amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus can be measured, for example, by the chromatin immunoprecipitation (ChIP) method or the like.
  • ChIP chromatin immunoprecipitation
  • a ChIP-qPCR method a ChIP-on-chip method, a ChIP-Seq method, or the like can be used.
  • the amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus of Th2 cells was measured in the presence of the test substance and found to be increased compared to the amount of ubiquitinated histone H2A in the absence of the test substance. In some cases, it can be determined that the test substance is a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases.
  • test substance having an increased amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus of Th2 cells as compared with a negative control was selected as a candidate substance, and then the candidate substance was used as an IL-33-related disease model animal.
  • a test substance that has been administered and evaluated and whose preventive or therapeutic effect on IL-33-related disease has been confirmed may be selected as a prophylactic or therapeutic agent for IL-33-related disease.
  • a negative control a compound or the like that has been clarified in advance to not affect the amount of ubiquitinated histone H2A at the Granzyme A locus of Th2 cells can be used.
  • examples of the IL-33-related disease model animal include an allergic airway inflammation model described later in Examples.
  • the invention provides a method of preventing or treating an IL-33-related disease, comprising the step of administering an effective amount of a USP7 inhibitor to a patient in need of treatment.
  • Patients include patients whose IL-33 concentration or eosinophil count in blood or bronchoalveolar lavage fluid is higher than that of healthy subjects. More specifically, for example, a patient having 150 eosinophils / ⁇ L or more in peripheral blood, a patient having 500 eosinophils / ⁇ L or more in peripheral blood, and the like can be mentioned.
  • the treatment method of the present embodiment includes a step of measuring the concentration of IL-33 or the number of eosinophils in the blood or bronchoalveolar lavage fluid of a patient with an IL-33-related disease, and the concentration or favor of IL-33. It may be a method for preventing or treating IL-33-related diseases, which comprises a step of administering an effective amount of a USP7 inhibitor to the patient when the eosinophil count is higher than that of a healthy person. Measurement of IL-33 concentration or eosinophil count is performed in vitro using a sample (blood, bronchoalveolar lavage fluid) taken from a patient.
  • IL-33 related diseases eg, allergic airway inflammation (eg, eosinophil asthma), eosinophil sinusitis, eosinophil esophagitis
  • Eosinophil counts are measured, patients with higher peripheral blood eosinophil counts than healthy individuals (eg, 150 / ⁇ L or higher, 500 / ⁇ L or higher) are selected, and USP7 is given to the selected patients.
  • the present invention provides a method for suppressing IL-33 activation, which comprises the step of administering an effective amount of a granzyme A inhibitor to a patient in need of treatment.
  • Patients include patients whose IL-33 concentration or eosinophil count in blood or bronchoalveolar lavage fluid is higher than that of healthy subjects. More specifically, for example, a patient having 150 eosinophils / ⁇ L or more in peripheral blood, a patient having 500 eosinophils / ⁇ L or more in peripheral blood, and the like can be mentioned.
  • the treatment method of the present embodiment includes a step of measuring the concentration of IL-33 or the number of eosinophils in the blood or bronchoalveolar lavage fluid of a patient with an IL-33-related disease, and the concentration or favor of IL-33. It may be a method for preventing or treating IL-33-related diseases, which comprises a step of administering an effective amount of a granzyme A inhibitor to the patient when the eosinophil count is higher than that of a healthy person. Measurement of IL-33 concentration or eosinophil count is performed in vitro using a sample (blood, bronchoalveolar lavage fluid) taken from a patient.
  • IL-33 related diseases eg, allergic airway inflammation (eg, eosinophil asthma), eosinophil sinusitis, eosinophil esophagitis
  • Eosinophil counts are measured, patients with higher peripheral blood eosinophil counts than healthy individuals (eg, 150 / ⁇ L or higher, 500 / ⁇ L or higher) are selected, and Granzyme is given to the selected patients.
  • the present invention provides a USP7 inhibitor for the prevention or treatment of IL-33 related diseases.
  • the present invention provides a Granzyme A inhibitor for suppressing IL-33 activation.
  • the present invention provides the use of a USP7 inhibitor to produce a prophylactic or therapeutic agent for IL-33 related diseases.
  • the invention provides the use of a Granzyme A inhibitor to produce an IL-33 activation inhibitor.
  • the IL-33-related diseases include those similar to those described above.
  • examples of the USP7 inhibitor and the granzyme A inhibitor include the same as those described above.
  • mice The C57BL / 6 mouse was purchased from Claire Japan. Usp7 fl / fl mice were provided by Dr. Akihiko Koseki (RIKEN). Usp7 fl / fl mice were mated with Rosa: Cre-ERT mice (Taconic) and OTII-TCR- ⁇ Tg mice.
  • OTII-TCR- ⁇ Tg mice having a TCR specific for residues 323-339 of the ovalbumin (OVA) protein were purchased from Jackson Laboratories.
  • mice All mice were used at 6-10 weeks of age and maintained under specific pathogen-free (SPF) conditions. All experimental protocols using mice were carried out with the approval of the Chiba University Animal Committee. In addition, all animals were bred according to the guidelines of Chiba University.
  • SPF pathogen-free
  • the antibodies used for staining the cytoplasm and cell surface were as follows. Brilliant Violet (BV) 421-labeled anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody (Clone XMG1.2, BioLegend), Phycoerythrin (PE) -labeled anti-Granzyme A antibody (3G8.5, BioLegend)
  • naive CD4-positive T cells When inducing Th2 cells to differentiate, naive CD4-positive T cells are used as IL-2 (25 U / mL), IL-4 (100 U / mL), anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody, anti-CD28 monoclonal antibody and anti-TCR ⁇ monoclonal. Cultured in the presence of antibody.
  • Th cells were stimulated and intracellular staining of cytokines was performed. Specifically, cultured Th cells were stimulated with ionomycin (500 nM), phorbol 12-millistate 13-acetate (50 ng / mL) and monensin (2 ⁇ M, Sigma) for 4 hours. Subsequently, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes in a permeation treatment solution containing 0.5% Triton X (50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.02% sodium azide, pH 7.5). , Treated on ice for 10 minutes.
  • Triton X 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.02% sodium azide, pH 7.5
  • Quantitative RT-PCR analysis Total RNA extraction and cDNA synthesis were performed by a conventional method. Quantitative RT-PCR was performed by a threshold cycle comparison method using StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Primers and TaqMan probes were purchased from Roche. The expression of the target gene was standardized for the expression of the Hprt gene.
  • RNA-Seqing RNA-Seqing
  • RNA-Seq RNA-Seqing
  • the FPKM fragment per kilobase of exon per million reads mapped
  • Bronchial alveolar lavage fluid (BALF) was collected 24 hours after the last OVA administration.
  • the cells in BALF were centrifuged on a slide glass using Cytospin 4 (Thermo Fisher Scientific) and stained with Diff-Quik Stein kit (Sysmex). 200 leukocytes were measured per slide using a microscope.
  • Airway hyperresponsiveness Twenty-four hours after the last OVA administration, airway hyperresponsiveness was investigated by measuring airflow obstruction induced by metacholine (Sigma) using a computer-controlled small animal ventilator (SCIREQ).
  • SCIREQ computer-controlled small animal ventilator
  • H & E hematoxylin-eosin
  • PAS periodic acid-Schiff
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an experiment schedule.
  • WT mice thymus-derived naive CD4 + T cells
  • WT mice thymus-derived naive CD4 + T cells
  • Cells and antigen-presenting cells derived from C57BL / 6 mice were prepared.
  • OTII Tg mice have a T cell receptor (TCR) for ovalbumin (OVA).
  • TCR T cell receptor
  • OVA ovalbumin
  • Th2 cells were transplanted into C57BL / 6 mice by tail vein injection at 1 ⁇ 10 6 cells / mouse.
  • OVA or phosphate buffered saline (PBS) was administered intranasally on days 1, 3 and 4 after cell transplantation.
  • OVA was administered at 100 ⁇ g / mouse.
  • Each mouse was analyzed 5 days after Th2 cell transplantation.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
  • WALF bronchoalveolar lavage fluid
  • WT PBS indicates that the result is a mouse in which Th2 cells derived from WT mice are transplanted and treated with PBS
  • KO PBS is obtained by transplanting Th2 cells derived from KO mice and PBS.
  • WT OVA indicates that it is the result of a mouse that has been transplanted with Th2 cells derived from WT mouse and has been administered OVA
  • “KO OVA” is derived from KO mouse.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring airflow obstruction by inducing airway contraction by administering mesacholine.
  • WT PBS indicates that the result is a mouse in which Th2 cells derived from WT mice are transplanted and treated with PBS
  • KO PBS is obtained by transplanting Th2 cells derived from KO mice and PBS.
  • WT OVA indicates that it is the result of a mouse that has been transplanted with Th2 cells derived from WT mouse and has been administered OVA
  • “KO OVA” is derived from KO mouse. This is the result of mice transplanted with Th2 cells and administered OVA.
  • WT indicates the result of a mouse transplanted with Th2 cells derived from Usp7 +/+ Cre-ERT2 + OTII Tg mouse (WT mouse), and "KO” is , Upp7 fl / fl Cre-ERT2 + OTII Tg mouse-derived Th2 cells were transplanted, and "PBS in.” Is the result of mice nasally administered PBS. "OVA i.n.” indicates that it is the result of mice that received OVA nasally.
  • the scale bar is 1000 ⁇ m.
  • FIGS. 4A and 4B the lungs of the PBS-administered group were in an almost normal state.
  • FIG. 4C infiltration of a large amount of inflammatory cells was observed in the lungs of the WT group to which OVA was administered.
  • FIG. 4 (c) the region where infiltration of inflammatory cells was observed is indicated by an arrow.
  • FIG. 4 (d) infiltration of inflammatory cells was observed in the lungs of the KO group to which OVA was administered, but allergic airway inflammation was remarkable as compared with FIG. 4 (c). It showed an improved condition.
  • WT indicates the result of a mouse transplanted with Th2 cells derived from Usp7 +/+ Cre-ERT2 + OTII Tg mouse (WT mouse), and "KO” is , Upp7 fl / fl Cre-ERT2 + OTII Tg mouse-derived Th2 cells were transplanted, and "PBS in.” Is the result of mice nasally administered PBS. "OVA i.n.” indicates that it is the result of mice that received OVA nasally.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (c) the lungs of the PBS-administered group were in an almost normal state.
  • FIG. 5 (b) a large amount of mucus was produced in the lungs of the WT group to which the OVA was administered.
  • FIG. 5 (b) the region where mucus production is observed is indicated by an arrow.
  • FIG. 5D almost no mucus production was observed in the lungs of the KO group to which the OVA was administered, indicating a state in which allergic airway inflammation was significantly improved.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an experiment schedule. First, Usp7 + / + Cre-ERT2 + OTII Tg mice (WT mice) of thymus-derived na ⁇ ve CD4-positive T cells, and, Usp7 fl / fl Cre-ERT2 + OTII Tg na ⁇ ve CD4 from thymus of mice (KO mice) Positive T cells were prepared.
  • these cells were cultured under Th2 conditions for 5 days.
  • the first 24 hours were treated with 4-hydroxytamoxifen (4-OHT).
  • stimulation was performed with an anti-TCR ⁇ antibody (clone H57-597), and each cell was recovered 4 hours after stimulation, and RNA-Seq analysis was performed.
  • FIG. 7 is a volcano plot showing the results of RNA-seq.
  • the vertical axis shows the p-value, and the horizontal axis shows the ratio of the expression level of each gene in the WT mouse and the KO mouse.
  • the upper part of the graph shows that the difference in expression level between WT mice and KO mice is large.
  • the circled plot shows genes whose expression levels are significantly lower in KO mice as compared to WT mice.
  • FIGS. 8 (a) and 8 (b) are graphs showing the results of confirming the results of RNA-Seq by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 8A is the result of measuring the expression level of the Usp7 gene
  • FIG. 8B is the result of measuring the expression level of the Gzma gene.
  • WT indicates that it is the result of cells derived from Usp7 +/+ Cre-ERT2 + OTII Tg mouse (WT mouse)
  • “KO” indicates Usp7 fl / f Cre.
  • the Il13 gene which encodes IL-13, which is a Th2 cytokine, was also detected as an important gene.
  • FIG. 9A is a graph showing the results of flow cytometry analysis.
  • the vertical axis represents the amount of granzyme A produced, and the horizontal axis represents the amount of interferon (IFN) - ⁇ produced.
  • FIG. 9B is a graph of the results of FIG. 9A.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of Western blotting.
  • full-length IL-33 indicates the position of the band of the total length IL-33
  • cleaved IL-33 indicates the position of the band of the cut IL-33.
  • GzmA indicates granzyme A
  • AEBSF indicates a serine protease inhibitor 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonylfluoride hydrochloride
  • E-64 indicates a cysteine protease.
  • GzmB indicates granzyme B
  • OVA indicates obalbumin
  • Pa Indicates papain
  • Asp Indicates Aspergillus cells
  • HDM indicates an inhibitor.
  • Granzyme A was used at a concentration of 100-2500 mM.
  • Granzyme B was used at a concentration of 100-2500 mM.
  • OVA was used at a concentration of 5 mg / mL.
  • Papain was used at a concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • Alpergillus cells were used at a concentration of 3.2 ⁇ g / mL.
  • indoor dust mites were used at a concentration of 400 ⁇ g / mL.
  • AEBSF was used at a concentration of 5 mM.
  • E-64 was used at a concentration of 50 ⁇ M.

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Abstract

Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　７（ＵＳＰ７）阻害剤を有効成分とする、インターロイキン（ＩＬ）－３３関連疾患の予防又は治療剤。

Description

ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤
　本発明は、インターロイキン（ＩＬ）－３３関連疾患の予防又は治療剤に関する。より具体的には、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤、ＩＬ－３３活性化抑制剤、及び、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。本願は、２０１９年３月２５日に、日本に出願された特願２０１９－０５７３３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　アレルギー性気道炎症はＩＬ－３３関連疾患の一種であり、ヒト疾患では気管支喘息に代表される病態である。気管支喘息の治療剤として、吸入ステロイド薬、β２受容体刺激薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬、テオフィリン製剤、経口ステロイド薬等が古くから用いられてきた。
　また、近年では、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を標的としたオマリズマブや、炎症性サイトカインの１つであるＩＬ－５を標的としたメポリズマブ等の生物学的製剤（注射製剤）も難治性喘息患者に対して臨床応用されている。
　これらの従来の気管支喘息治療法では、治療効果が不十分である難治性の患者が一定数存在し、その患者数の割合は最大で約１０％との報告もある。最重症の気管支喘息は、現代においても死に至る可能性のある病であり、難治性患者に対する治療技術の開発が非常に重要である。
　ところで、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　７（ＵＳＰ７）は脱ユビキチン化酵素の一種であり、ｐ５３のＥ３ユビキチンリガーゼであるＭｕｒｉｎｅ　Ｄｏｕｂｌｅ　Ｍｉｎｕｔｅ　２（ＭＤＭ２）を基質とすることが知られている。特許文献１～１２及び非特許文献１～１１には、ＵＳＰ７の活性を特異的に阻害する低分子化合物が記載されている。特許文献１～１２及び非特許文献１～１１は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許出願公開第２０１６／２７２５８８号明細書 米国特許出願公開第２０１６／１８５７８５号明細書 米国特許出願公開第２０１８／３３９９９１号明細書 米国特許出願公開第２０１８／１６２８３５号明細書 米国特許出願公開第２０１８／３４６４８０号明細書 米国特許出願公開第２０１６／２２９８７２号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０８８５２０号明細書 米国特許出願公開第２０１４／３７１２４７号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２３５２１号明細書 米国特許出願公開第２００９／１８１９７２号明細書 米国特許出願公開第２００９／２１５７８６号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０７７８０６号明細書
Kategaya L, et al, USP7 small-molecule inhibitors interfere with ubiquitin binding., Nature, 550 (7677), 534-538, 2017 Turnbull A. P., et al., Molecular basis of USP7 inhibition by selective small-molecule inhibitors., Nature, 550 (7677), 481-486, 2017 Gavory G., et al., Discovery and characterization of highly potent and selective allosteric USP7 inhibitors., Nat Chem Biol., 14 (2), 118-125, 2018 Wu J., et al., Chemical Approaches to Intervening in Ubiquitin Specific Protease 7 (USP7) Function for Oncology and Immune Oncology Therapies., J Med Chem., 61 (2), 422-443, 2018 Tian X.,et al., Characterization of selective ubiquitin and ubiquitin-like protease inhibitors using a fluorescence-based multiplex assay format., Assay Drug Dev Technol., 9 (2), 165-173, 2011 Altun M., et al., Activity-based chemical proteomics accelerates inhibitor development for deubiquitylating enzymes., Chem Biol., 18 (11), 1401-1412, 2011 Colland F., et al., Small-molecule inhibitor of USP7/HAUSP ubiquitin protease stabilizes and activates p53 in cells., Mol Cancer Ther., 8 (8), 2286-2295, 2009 Reverdy C., et al., Discovery of specific inhibitors of human USP7/HAUSP deubiquitinating enzyme., Chem Biol., 19 (4), 467-477, 2012 Weinstock J., et al., Selective Dual Inhibitors of the Cancer-Related Deubiquitylating Proteases USP7 and USP47., ACS Med Chem Lett., 3 (10), 789-792, 2012 Chen C., et al., Synthesis and biological evaluation of thiazole derivatives as novel USP7 inhibitors., Bioorg Med Chem Lett., 27 (4), 845-849, 2017 Kemp M., Chapter Three - Recent Advances in the Discovery of Deubiquitinating Enzyme Inhibitors., Progress in Medicinal Chemistry, 55, 149-192, 2016
　このような背景のもと、本発明は、アレルギー性気道炎症をはじめとするＩＬ－３３関連疾患を効果的に予防又は治療する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ＵＳＰ７阻害剤を有効成分とする、インターロイキン（ＩＬ）－３３関連疾患の予防又は治療剤。
［２］前記ＩＬ－３３関連疾患が、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎である、［１］に記載の予防又は治療剤。
［３］前記アレルギー性気道炎症が、好酸球性喘息である、［２］に記載の予防又は治療剤。
［４］前記ＵＳＰ７阻害剤が、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸である、［１］～［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［５］グランザイムＡ発現抑制剤である、［１］～［４］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［６］ＩＬ－３３活性化抑制剤である、［１］～［５］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［７］グランザイムＡ阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤。
［８］グランザイムＡ阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３活性化抑制剤。
［９］被験物質の存在下でＵＳＰ７タンパク質の活性を測定する工程を含み、前記活性が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７タンパク質の活性と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
［１０］被験物質の存在下でグランザイムＡタンパク質及びＩＬ－３３タンパク質をインキュベートする工程と、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質を定量する工程と、を含み、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量が前記被験物質の非存在下における切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量と比較して減少したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
［１１］被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
［１２］被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量を測定する工程と、を含み、前記ユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量が、前記被験物質の非存在下におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量と比較して増加したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
　本発明によれば、ＩＬ－３３関連疾患を効果的に予防又は治療する技術を提供することができる。
実験例１の実験スケジュールを示す模式図である。 実験例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞を解析した結果を示すグラフである。 実験例１において、気流閉塞を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例２において、マウスの肺の組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色した結果を示す顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例３において、マウスの肺の組織切片をＰＡＳ染色した結果を示す顕微鏡写真である。 実験例４の実験スケジュールを示す模式図である。 実験例４におけるＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示すボルカノプロットである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例４における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。（ａ）はＵｓｐ７遺伝子の発現量を測定した結果であり、（ｂ）はＧｚｍａ遺伝子の発現量を測定した結果である。 （ａ）は、実験例５におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果をまとめたグラフである。 実験例６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
　本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。
［ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤］
　１実施形態において、本発明は、ＵＳＰ７阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは、アレルギーに関連する２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）がＵＳＰ７タンパク質の制御下でグランザイムＡを産生することを明らかにした。さらに、グランザイムＡは、ＩＬ－３３関連疾患における中心的な役割を担うサイトカインであるＩＬ－３３を切断することを明らかにした。ＩＬ－３３は切断されることにより活性型ＩＬ－３３になり、切断前と比較して炎症を誘導する程度が約３０倍にもなることが知られている。
　したがって、ＵＳＰ７の発現→グランザイムＡの発現上昇→グランザイムＡによるＩＬ－３３の切断・活性化→炎症反応の誘導の反応経路に
おけるいずれかの反応を阻害することにより、ＩＬ－３３関連疾患を予防又は治療することができる。
　Ｔｈ２細胞とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（いわゆるヘルパーＴ細胞）の亜群であり、抗原タンパク質との接触経歴を持たないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）がＩＬ－４やＩＬ－１３等のサイトカインの刺激を受けることにより分化した細胞である。
　ヒトＵＳＰ７遺伝子のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１２８６４５７．１、ＮＭ＿００１２８６４５８．１、ＮＭ＿００１３２１８５８．１、ＮＭ＿００３４７０．２等であり、ヒトＵＳＰ７タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１３０８７８７．１、ＸＰ＿０１６８７９１４２．１、ＮＰ＿００３４６１．２、ＮＰ＿００１２７３３８６．１、ＮＰ＿００１２７３３８７．１、ＸＰ＿０１６８７９１４１．１等であり、マウスＵＳＰ７遺伝子のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１００３９１８．２等であり、マウスＵＳＰ７タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１００３９１８．２等である。
　また、ヒトグランザイムＡ遺伝子（ＧＺＭＡ遺伝子）のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００６１４４．３等であり、ヒトグランザイムＡタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００６１３５．１等であり、マウスグランザイムＡ遺伝子（Ｇｚｍａ遺伝子）のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０１０３７０．２等であり、マウスグランザイムＡタンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０３４５００．１等である。
　また、ヒトＩＬ－３３遺伝子（ＩＬ３３遺伝子）のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１１９９６４０．１、ＮＭ＿００１１９９６４１．１、ＮＭ＿００１３１４０４４．１、ＮＭ＿００１３１４０４５．１、ＮＭ＿００１３１４０４６．１等であり、ヒトＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＸＰ＿０１６８７０７７４．１、ＮＰ＿００１３００９７７．１、ＮＰ＿２５４２７４．１、ＮＰ＿００１３４０７３１．１、ＮＰ＿００１３００９７６．１、ＮＰ＿００１１８６５６９．１、ＮＰ＿００１３００９７５．１、ＮＰ＿００１１８６５７０．１、ＮＰ＿００１３００９７３．１、ＮＰ＿００１３００９７４．１等であり、マウスＩＬ－３３遺伝子（Ｉｌ３３遺伝子）のｃＤＮＡ配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１１６４７２４．１、ＮＭ＿１３３７７５．２等であり、マウスＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１１５８１９６．１、ＮＰ＿５９８５３６．２等である。
　本実施形態の予防又は治療剤において、ＩＬ－３３関連疾患としては、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎、好酸球性食道炎等が挙げられる。また、アレルギー性気道炎症としては喘息が挙げられ、中でも、好酸球性喘息が挙げられる。例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上である喘息を、好酸球性喘息であると判断することができる。一態様において、ＩＬ－３３関連疾患は、末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上である好酸球性喘息である。
　また、好酸球性副鼻腔炎は、両側副鼻腔及び鼻腔に著明な好酸球浸潤を伴う多発性の鼻茸（鼻ポリープ）ができる線維化疾患の一種であり、その病態形成機構は明らかにされていない。好酸球性副鼻腔炎患者の鼻茸を手術で除去しても再発しやすく、難治性の慢性副鼻腔炎として臨床上大きな問題となっている。また、好酸球性食道炎とは、好酸球が、食道の粘膜に集中し慢性的に炎症を起こす疾患である。
　ＵＳＰ７阻害剤の投与が有効なＩＬ－３３関連疾患患者としては、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い患者が挙げられる。本実施形態の予防又は治療剤は、例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上であるＩＬ－３３関連疾患患者や、末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上であるＩＬ－３３関連疾患患者に有効である。
　ＵＳＰ７阻害剤は、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度を測定する試薬と共にＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療用キットを構成していてもよい。ＩＬ－３３の濃度を測定する試薬としては、抗ＩＬ－３３抗体、抗ＩＬ－３３抗体が固定化されたイムノプレート、抗ＩＬ－３３抗体が固定化されたフローストリップ等が挙げられる。
　ＵＳＰ７阻害剤は、血液中又は気管支肺胞洗浄液中の好酸球数を測定する試薬と共にＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療用キットを構成していてもよい。好酸球数を測定する試薬としては、ヘマトキシリン・エオシン染色液、ギムザ染色液、フィールド染色液、ライト染色液、好酸球マーカーに特異的な抗体等が挙げられる。
　本実施形態の予防又は治療剤は、気道における炎症をターゲットとしているため、吸入投与等の局所的な投与方法も現実的な選択肢である。したがって、本実施形態の予防又は治療剤は、簡便に投与することができ、全身性の副作用を起こす可能性も低い。
　本実施形態において、ＵＳＰ７阻害剤は、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸であってもよい。阻害性核酸としては、ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等が挙げられる。これらの阻害性核酸を哺乳動物細胞（例えば、Ｔｈ２細胞）において発現する発現ベクターをＵＳＰ７阻害剤として用いてもよい。
　ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０～９５℃程度で約１分程度変性させた後、３０～７０℃程度で１～８時間程度アニーリングさせることにより調製することができる。
　ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする発現コンストラクトを導入した発現ベクターの形態で患者へ投与することにより、ＵＳＰ７遺伝子の発現抑制を意図する対象細胞（例、Ｔｈ２細胞）に導入し、短鎖ＲＮＡの発現効率が高いＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）系のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよい。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を利用することができる。
　あるいは、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
　ＵＳＰ７阻害剤は低分子化合物であってもよい。より具体的には、下記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物又はその誘導体若しくはそれらの薬理学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物が挙げられる。
　すなわち、ＵＳＰ７阻害剤は、下記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物であってもよいし、下記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物の誘導体であってもよいし、下記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物又はその誘導体の薬理学的に許容される塩であってもよいし、上記の化合物、誘導体、塩の溶媒和物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記式（Ａ１）～（Ａ３）で表される化合物は、上記非特許文献１等に記載された化合物であり、上記式（Ａ４）～（Ａ５）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記式（Ｂ１）～（Ｂ２）で表される化合物は、上記非特許文献２等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記式（Ｃ１）～（Ｃ５）で表される化合物は、上記非特許文献３等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記式（Ｄ１）で表される化合物は、上記非特許文献４、７等に記載された化合物である。上記式（Ｄ２）、（Ｄ５）、（Ｄ６）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。上記式（Ｄ３）で表される化合物は、上記非特許文献４、８等に記載された化合物である。上記式（Ｄ４）で表される化合物は、上記非特許文献８等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（Ｅ１）で表される化合物は、上記非特許文献４、９、１０等に記載された化合物である。上記式（Ｅ２）で表される化合物は、上記非特許文献４、５、６、１０等に記載された化合物である。上記式（Ｅ３）で表される化合物は、上記非特許文献４、９等に記載された化合物である。上記式（Ｅ４）～（Ｅ８）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（Ｆ１）～（Ｆ５）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記式（Ｇ１）～（Ｇ４）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記式（Ｈ１）～（Ｈ８）で表される化合物は、上記非特許文献４等に記載された化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式（Ｉ１）～（Ｉ１４）で表される化合物は、上記非特許文献１０等に記載された化合物である。
　上記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物の誘導体としては、例えば上記式（Ａ１）～（Ａ５）、（Ｂ１）～（Ｂ２）、（Ｃ１）～（Ｃ５）、（Ｄ１）～（Ｄ６）、（Ｅ１）～（Ｅ８）、（Ｆ１）～（Ｆ５）、（Ｇ１）～（Ｇ４）、（Ｈ１）～（Ｈ８）、（Ｉ１）～（Ｉ１４）のいずれかで表される化合物において、１又は複数の水素原子がハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、チオール基、スルホ基、炭素数１～３のアルキル基で置換された化合物が挙げられる。
　また、薬理学的に許容される塩としては、アルカリ金属類、アルカリ土類金属類、アンモニウム、アルキルアンモニウム等との塩、鉱酸又は有機酸との塩が挙げられる。より具体的には、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アルミニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ぎ酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、ラクトビオン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アジピン酸塩、システインとの塩、Ｎ－アセチルシステインとの塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ピクリン酸塩、チオシアン酸塩、ウンデカン酸塩、アクリル酸ポリマーとの塩、カルボキシビニルポリマーとの塩等が挙げられる。
　また、溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
　実施例において後述するように、Ｔｈ２細胞のＵＳＰ７遺伝子を欠損させると、グランザイムＡの発現が有意に抑制される。したがって、ＵＳＰ７阻害剤はグランザイムＡ発現抑制剤であるということができる。ここで、ＵＳＰ７阻害剤は、上述したものと同様であり、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸であってもよいし、ＵＳＰ７タンパク質の活性を阻害する低分子化合物であってもよい。
　また、ＵＳＰ７を阻害すると、グランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現が抑制され、その結果ＩＬ－３３タンパク質の活性化が抑制される。したがって、ＵＳＰ７阻害剤はＩＬ－３３活性化抑制剤であるということができる。
　また、実施例において後述するように、グランザイムＡはＩＬ－３３タンパク質を切断し活性化する。したがって、グランザイムＡ阻害剤は、ＩＬ－３３活性化抑制剤であるということができる。ここで、グランザイムＡ阻害剤は、グランザイムＡ遺伝子に対する阻害性核酸であってもよいし、グランザイムＡタンパク質のプロテアーゼ活性を阻害する低分子化合物であってもよいし、グランザイムＡタンパク質のプロテアーゼ活性を阻害する抗グランザイムＡ抗体であってもよい。そのような阻害抗体は、例えば、グランザイムＡの触媒ドメインに結合し、グランザイムＡによる基質タンパク質の切断を阻害する。前記阻害抗体は、グランザイムＡの触媒ドメインを含む断片によりマウス等を免疫し、周知のハイブリドーマ技術により、免疫した抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立し、その中から、グランザイムＡのプロテアーゼ活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより取得することができる。グランザイムＡの触媒ドメインは、上述のグランザイムＡの配列情報等に基づき、当業者であれば容易に特定することができる。また、抗グランザイムＡ抗体は抗体断片であってもよい。抗グランザイムＡ抗体又はその断片は、ヒト型化されていることが好ましい。ヒト型抗体又はその断片は、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。
　ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。
　したがって、１実施形態において、本発明は、グランザイムＡ阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤を提供する。グランザイムＡ阻害剤は、血中投与でＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療の薬効が期待でき、有用である。
　ここで、ＩＬ－３３関連疾患は上述したものと同様であり、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎等が挙げられる。また、アレルギー性気道炎症としては喘息が挙げられ、中でも、好酸球性喘息が挙げられる。例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上である喘息を、好酸球性喘息であると判断することができる。一態様において、ＩＬ－３３関連疾患は、末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上である好酸球性喘息である。
　グランザイムＡ阻害剤の投与が有効なＩＬ－３３関連疾患患者としては、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い患者が挙げられる。具体的には、グランザイムＡ阻害剤の投与は、例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上であるＩＬ－３３関連疾患患者や、末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上であるＩＬ－３３関連疾患患者に有効である。
　グランザイムＡ阻害剤は、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度を測定する試薬と共にＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療用キットを構成していてもよい。ＩＬ－３３の濃度を測定する試薬については、上述したものと同様である。
　グランザイムＡ阻害剤は、血液中又は気管支肺胞洗浄液中の好酸球数を測定する試薬と共にＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療用キットを構成していてもよい。好酸球数を測定する試薬については、上述したものと同様である。
　上述したＵＳＰ７阻害剤又はグランザイムＡ阻害剤は、薬学的に許容される担体と混合された医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。また、核酸が有効成分である場合には、薬学的に許容される担体として脂質等が挙げられる。脂質としてはカチオン性脂質が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
　ＵＳＰ７阻害剤又はグランザイムＡ阻害剤の投与量は、ＵＳＰ７阻害剤又はグランザイムＡ阻害剤の種類、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１～５００ｍｇ、好ましくは約１．０～２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
　非経口的に投与する場合、その投与量は、ＵＳＰ７阻害剤又はグランザイムＡ阻害剤の種類、患者の症状、対象臓器、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１～５００ｍｇ、好ましくは約１．０～２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．００１～１０ｍｇ、好ましくは約０．０１～５ｍｇ、より好ましくは約０．０２～２ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
［ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
　第１実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下でＵＳＰ７タンパク質の活性を測定する工程を含み、前記活性が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７タンパク質の活性と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
　第１実施形態のスクリーニング方法は、ＵＳＰ７タンパク質を用いて試験管レベルで行ってもよいし、ＵＳＰ７タンパク質を発現する細胞を用いて培養細胞レベルで行ってもよい。
　ＵＳＰ７タンパク質の活性としては、例えば、自己ユビキチン化したＭＤＭ２タンパク質を脱ユビキチン化する活性、ユビキチン化させたｐ５３タンパク質を脱ユビキチン化する活性等が挙げられる。ＭＤＭ２タンパク質のユビキチン化の程度、ｐ５３タンパク質のユビキチン化の程度は、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
　第１実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ等を用いることができる。
　また、ＵＳＰ７発現細胞としては、ヒト由来の細胞、非ヒト動物由来の細胞を用いることができる。非ヒト動物由来の細胞としては、例えば、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。ＵＳＰ７発現細胞は、ＵＳＰ７遺伝子の発現ベクターを導入した細胞であってもよいし、例えばＴｈ２細胞等のＵＳＰ７遺伝子を発現する細胞であってもよい。
　被験物質の存在下でＵＳＰ７タンパク質の活性を測定した結果、被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７タンパク質の活性と比較して低下した場合に、被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であると判断することができる。
　また、陰性対照と比較してＵＳＰ７タンパク質の活性を低下させた被験物質を候補物質として選択した後、当該候補物質をＩＬ－３３関連疾患モデル動物に投与して評価し、その結果、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療効果が確認された被験物質を、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤として選択してもよい。ここで、陰性対照としては、予めＵＳＰ７タンパク質の活性に影響を与えないことが明らかとなっている化合物等を用いることができる。また、ＩＬ－３３関連疾患モデル動物としては、例えば、実施例において後述するアレルギー性気道炎症モデルが挙げられる。
（第２実施形態）
　第２実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下でグランザイムＡタンパク質及びＩＬ－３３タンパク質をインキュベートする工程と、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質を定量する工程と、を含み、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量が前記被験物質の非存在下における切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量と比較して減少したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
　第２実施形態のスクリーニング方法は、グランザイムＡタンパク質及びＩＬ－３３タンパク質を用いて試験管レベルで行うことが好ましい。ＩＬ－３３タンパク質は、例えば精製を容易にする観点から、ＧＳＴ－タグ、Ｈｉｓ×６タグ等のタグを有していてもよい。また、グランザイムＡタンパク質及びＩＬ－３３タンパク質の反応温度、反応時間は適宜調整することができ、例えば２５～４０℃で１０分～２４時間等の条件が挙げられる。
　第２実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、第１実施形態と同様のものを用いることができる。また、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の定量は、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
　切断されたＩＬ－３３タンパク質としては、例えば、切断前と比較して分子量が小さくなったＩＬ－３３タンパク質のバンドの強度を定量すればよい。なお、タグのないＩＬ－３３タンパク質の切断前の分子量は３０ｋＤａ程度であり、グランザイムＡによる切断後の分子量は１７～２０ｋＤａ程度である。
　被験物質の存在下で切断されたＩＬ－３３タンパク質を定量した結果、被験物質の非存在下における、切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量と比較して減少した場合に、被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であると判断することができる。
　また、陰性対照と比較して切断されたＩＬ－３３タンパク質の量を減少させた被験物質（ＩＬ－３３タンパク質の切断を抑制した被験物質）を候補物質として選択した後、当該候補物質をＩＬ－３３関連疾患モデル動物に投与して評価し、その結果、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療効果が確認された被験物質を、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤として選択してもよい。ここで、陰性対照としては、予めグランザイムＡタンパク質のＩＬ－３３タンパク質切断活性に影響を与えないことが明らかとなっている化合物等を用いることができる。また、ＩＬ－３３関連疾患モデル動物としては、例えば、実施例において後述するアレルギー性気道炎症モデルが挙げられる。
（第３実施形態）
　第３実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
　第３実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで実施するものである。Ｔｈ２細胞としては、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、例えばヒト細胞、マウス細胞等が挙げられる。Ｔｈ２細胞はナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から分化誘導した細胞であってもよい。
　第３実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、第１実施形態と同様のものを用いることができる。被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養するとは、Ｔｈ２細胞の培地に被験物質を添加して培養することであってもよいし、リポフェクション、エレクトロポレーション等によりＴｈ２細胞の内部に被験物質を導入し、培養することであってもよい。
　グランザイムＡ遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等、ＤＮＡマイクロアレイ等により測定することができる。また、グランザイムＡタンパク質の発現量は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
　被験物質の存在下でＴｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量を測定した結果、被験物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であると判断することができる。
　また、陰性対照と比較してＴｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量を低下させた被験物質を候補物質として選択した後、当該候補物質をＩＬ－３３関連疾患モデル動物に投与して評価し、その結果、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療効果が確認された被験物質を、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤として選択してもよい。ここで、陰性対照としては、予めＴｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量に影響を与えないことが明らかとなっている化合物等を用いることができる。また、ＩＬ－３３関連疾患モデル動物としては、例えば、実施例において後述するアレルギー性気道炎症モデルが挙げられる。
（第４実施形態）
　第４実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
　第４実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで実施するものである。Ｔｈ２細胞としては、第３実施形態と同様のものを用いることができる。第４実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、第１実施形態と同様のものを用いることができる。
　被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養するとは、第３実施形態と同様であり、Ｔｈ２細胞の培地に被験物質を添加して培養することであってもよいし、リポフェクション、エレクトロポレーション等によりＴｈ２細胞の内部に被験物質を導入し、培養することであってもよい。
　ＵＳＰ７遺伝子の発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等、ＤＮＡマイクロアレイ等により測定することができる。また、ＵＳＰ７タンパク質の発現量は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
　被験物質の存在下でＴｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定した結果、被験物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であると判断することができる。
　また、陰性対照と比較してＴｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量を低下させた被験物質を候補物質として選択した後、当該候補物質をＩＬ－３３関連疾患モデル動物に投与して評価し、その結果、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療効果が確認された被験物質を、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤として選択してもよい。ここで、陰性対照としては、予めＴｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量に影響を与えないことが明らかとなっている化合物等を用いることができる。また、ＩＬ－３３関連疾患モデル動物としては、例えば、実施例において後述するアレルギー性気道炎症モデルが挙げられる。
（第５実施形態）
　第５実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、前記Ｔｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量を測定する工程と、を含み、前記ユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量が、前記被験物質の非存在下におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量と比較して増加したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法である。
　第５実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで実施するものである。Ｔｈ２細胞としては、第３実施形態と同様のものを用いることができる。第５実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、第１実施形態と同様のものを用いることができる。
　被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養するとは、第３実施形態と同様であり、Ｔｈ２細胞の培地に被験物質を添加して培養することであってもよいし、リポフェクション、エレクトロポレーション等によりＴｈ２細胞の内部に被験物質を導入し、培養することであってもよい。
　グランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量の測定は、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）法等により行うことができる。ＣｈＩＰ法としては、ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ法、ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ法、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ法等を利用することができる。
　被験物質の存在下で、Ｔｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量を測定した結果、被験物質の非存在下における、ユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量と比較して増加した場合に、被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であると判断することができる。
　また、陰性対照と比較してＴｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量を増加させた被験物質を候補物質として選択した後、当該候補物質をＩＬ－３３関連疾患モデル動物に投与して評価し、その結果、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療効果が確認された被験物質を、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤として選択してもよい。ここで、陰性対照としては、予めＴｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量に影響を与えないことが明らかとなっている化合物等を用いることができる。また、ＩＬ－３３関連疾患モデル動物としては、例えば、実施例において後述するアレルギー性気道炎症モデルが挙げられる。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＵＳＰ７阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療方法を提供する。
　患者としては、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い患者が挙げられる。より具体的には、例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上である患者、あるいは末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上である患者等が挙げられる。
　したがって、本実施形態の治療方法は、ＩＬ－３３関連疾患患者の血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数を測定する工程と、前記ＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い場合に、前記患者にＵＳＰ７阻害剤の有効量を投与する工程を含む、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療方法であってもよい。ＩＬ－３３の濃度又は好酸球数の測定は、患者から採取した試料（血液、気管支肺胞洗浄液）を用いてインビトロで行われる。例えば、ＩＬ－３３関連疾患（例、アレルギー性気道炎症（例、好酸球性喘息）、好酸球性副鼻腔炎、好酸球性食道炎）患者集団について、各患者の末梢血中の好酸球数を測定し、末梢血中の好酸球数が健常人よりも高い（例、１５０個／μＬ以上、５００個／μＬ以上）患者を選択し、選択された患者に対してＵＳＰ７阻害剤の有効量を投与する。
　１実施形態において、本発明は、グランザイムＡ阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、ＩＬ－３３活性化抑制方法を提供する。
　患者としては、血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い患者が挙げられる。より具体的には、例えば、末梢血中の好酸球が１５０個／μＬ以上である患者、あるいは末梢血中の好酸球が５００個／μＬ以上である患者等が挙げられる。
　したがって、本実施形態の治療方法は、ＩＬ－３３関連疾患患者の血液中又は気管支肺胞洗浄液中のＩＬ－３３の濃度又は好酸球数を測定する工程と、前記ＩＬ－３３の濃度又は好酸球数が健常人よりも高い場合に、前記患者にグランザイムＡ阻害剤の有効量を投与する工程を含む、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療方法であってもよい。ＩＬ－３３の濃度又は好酸球数の測定は、患者から採取した試料（血液、気管支肺胞洗浄液）を用いてインビトロで行われる。例えば、ＩＬ－３３関連疾患（例、アレルギー性気道炎症（例、好酸球性喘息）、好酸球性副鼻腔炎、好酸球性食道炎）患者集団について、各患者の末梢血中の好酸球数を測定し、末梢血中の好酸球数が健常人よりも高い（例、１５０個／μＬ以上、５００個／μＬ以上）患者を選択し、選択された患者に対してグランザイムＡ阻害剤の有効量を投与する。
　１実施形態において、本発明は、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療のためのＵＳＰ７阻害剤を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＩＬ－３３活性化抑制のためのグランザイムＡ阻害剤を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＩＬ－３３関連疾患の予防剤又は治療剤を製造するためのＵＳＰ７阻害剤の使用を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ＩＬ－３３活性化抑制剤を製造するためのグランザイムＡ阻害剤の使用を提供する。
　これらの実施形態において、ＩＬ－３３関連疾患としては上述したものと同様のものが挙げられる。また、ＵＳＰ７阻害剤、グランザイムＡ阻害剤としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
［材料及び方法］
（マウス）
　Ｃ５７ＢＬ／６マウスはクレアジャパン社より購入した。Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌマウスは古関明彦博士（理化学研究所）より分与された。Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌマウスはＲｏｓａ：Ｃｒｅ－ＥＲＴマウス（タコニック社）、ＯＴＩＩ－ＴＣＲ－αβＴｇマウスと交配した。
　オボアルブミン（ＯＶＡ）タンパク質の３２３－３３９残基に特異的なＴＣＲを有するＯＴＩＩ－ＴＣＲ－αβＴｇマウスはジャクソンラボラトリーズ社より購入した。
　全てのマウスは６～１０週齢で使用し、特定病原菌フリー（ＳＰＦ）条件下で維持した。マウスを用いる全ての実験プロトコールは千葉大学動物委員会により承認を得たうえで実施した。また、全ての動物の飼育は千葉大学の指針にしたがって行った。
（抗体）
　細胞質内及び細胞表面の染色に用いた抗体は次の通りであった。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）４２１標識抗ＩＦＮ－γモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ１．２、バイオレジェンド社）、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗グランザイムＡ抗体（３Ｇ８．５、バイオレジェンド社）
（インビトロＴｈ細胞分化培養）
　Ｕｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋マウス（ＷＴマウス）又はＵｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋マウス（ｃＫＯマウス）の胸腺由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４４ｌｏＣＤ６２Ｌｈｉ）を、マグネティックセルソーター（商品名「ａｕｔｏＭＡＣＳ」、ミルテニーバイオテック社）を用いて精製した。
　Ｔｈ２細胞を分化誘導する場合には、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＩＬ－２（２５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１００Ｕ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ－γモノクローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体及び抗ＴＣＲβモノクローナル抗体の存在下で培養した。
（免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー解析）
　Ｔｈ細胞を刺激しサイトカインの細胞内染色を行った。具体的には、培養したＴｈ細胞を、イオノマイシン（５００ｎＭ）、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（５０ｎｇ／ｍＬ）及びモネンシン（２μＭ、シグマ社）で４時間刺激した。続いて、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を室温で１０分間固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘを含む透過処理液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．５）中、氷上で１０分間処理した。続いて、細胞を３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１５分間ブロッキングした。続いて、適切な抗体で３０分以上染色した後、フローサイトメーター（商品名「ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ」又は商品名「ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ」、いずれもＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。データ解析はＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて行った。
（定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析）
　全ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成は定法により行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてスレッシュホールドサイクル比較法により行った。プライマー及びＴａｑＭａｎプローブはロシュ社より購入した。標的遺伝子の発現はＨｐｒｔ遺伝子の発現に対して標準化した。
（ＲＮＡ－シーケンシング）
　ＲＮＡ－シーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）は次のようにして行った。全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて抽出した。ｃＤＮＡライブラリ調製では、ＴｒｕＳｅｑ　ＲＮＡ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　ｖ２（イルミナ社）を使用説明書にしたがって使用した。
　ライブラリ断片のシーケンシングはＨｉＳＥｑｕａｔｉｏｎ　１５００　Ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ社）を用いて行った。データ解析では、リード配列（５０ｂｐ）を、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．８）及びＴｏｐＨａｔ（バージョン１．３．２）ソフトウエアを用いてｍｍ１０マウス参照ゲノム（カリフォルニア大学、２０１１年１２月）にアラインメントした。
　各遺伝子のＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ）は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．０．２）ソフトウエアを用いて計算した。
（Ｔｈ２細胞の移植により誘導された気道炎症モデル）
　ＷＴマウス又はＵｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＶＡ特異的ＯＴＩＩ　ＴＣＲマウス由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を、Ｔｈ２条件で培養した。最初の２４時間は４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）処理した。６日後、培養した細胞を尾静脈投与によりＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０４個／マウスで移植した。細胞移植後、１、３、４日目にオブアルブミン（ＯＶＡ）を鼻腔内投与した。細胞移植後５日目にマウスを安楽死させ解析した。
（気管支肺胞洗浄液の採取）
　最後のＯＶＡ投与から２４時間後に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取した。ＢＡＬＦ中の細胞はＣｙｔｏｓｐｉｎ４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてスライドガラス上に遠心し、Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｉｎ　ｋｉｔ（シスメックス社）を用いて染色した。顕微鏡を用いてスライド１枚当たり２００個の白血球を計測した。
（気道過敏反応）
　最後のＯＶＡ投与から２４時間後に、コンピューター制御された小動物ベンチレーター（ＳＣＩＲＥＱ）を用いて、メタコリン（シグマ社）により誘導された気流閉塞を測定することにより、気道過敏反応を検討した。
（肺の組織学的解析）
　肺組織の病理学的変化は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び過ヨウ素酸－シッフ（ＰＡＳ）染色によって評価した。
（統計学的解析）
　データはＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン６）を用いて解析した。２グループの比較はｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ　ｔｅｓｔにより計算した。３グループ以上の比較はｔｗｏ－ｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）と共にテューキーの多重比較検定又はシダックの多重比較検定により行った。０．０５以下のｐ値を有意であると判断した。
［実験例１］
（Ｔｈ２特異的なＵｓｐ７遺伝子の欠損はアレルギー性気道炎症における好酸球の浸潤の減少及び気道過敏反応の改善につながった）
　図１は実験スケジュールを示す模式図である。まず、Ｕｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）の胸腺由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞、Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＫＯマウス）の胸腺由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞、及び、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の抗原提示細胞を準備した。ＯＴＩＩ　Ｔｇマウスはオブアルブミン（ＯＶＡ）に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。
　続いて、これらの細胞をインビトロで６日間共培養した。図１中、「４－ＯＨＴ」は４－ヒドロキシタモキシフェンを示し、「Ｌｏｈ１５」はオブアルブミンの第３２３～３３９番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ、配列番号１）を示す。４－ＯＨＴは１００ｎＭで添加し、Ｌｏｈ１５は３００ｎＭで添加した。
　続いて、６日目に、Ｔｈ２細胞を尾静脈注射によりＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０６個／マウスで移植した。細胞移植後、１、３、４日目にＯＶＡ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を鼻腔内投与により投与した。ＯＶＡは１００μｇ／マウスで投与した。Ｔｈ２細胞の移植後５日目に各マウスを解析した。
　図２は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞を解析した結果を示すグラフである。図２中、「ＷＴ　ＰＢＳ」は、ＷＴマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ　ＰＢＳ」は、ＫＯマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの結果であることを示し、「ＷＴ　ＯＶＡ」は、ＷＴマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＯＶＡを投与したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ　ＯＶＡ」は、ＫＯマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＯＶＡを投与したマウスの結果であることを示し、「Ｅｏｓｉ．」は好酸球を示し、「Ｎｅｕｔ．」は好中球を示し、「Ｌｙｍｐ．」はリンパ球を示し、「Ｍａｃ．」はマクロファージを示し、「Ｔｏｔａｌ」は全白血球を意味する。
　その結果、ＫＯ　ＯＶＡ群において、好酸球及び全白血球の数が有意に減少したことが明らかとなった。
　また、図３はメサコリンを投与して気道の収縮を誘導し、気流閉塞を測定した結果を示すグラフである。図３中、「ＷＴ　ＰＢＳ」は、ＷＴマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ　ＰＢＳ」は、ＫＯマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＰＢＳを投与したマウスの結果であることを示し、「ＷＴ　ＯＶＡ」は、ＷＴマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＯＶＡを投与したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ　ＯＶＡ」は、ＫＯマウス由来のＴｈ２細胞を移植し、ＯＶＡを投与したマウスの結果であることを示す。
　その結果、ＫＯ　ＯＶＡ群において、気道過敏反応が有意に改善したことが明らかとなった。
　以上の結果から、Ｔｈ２特異的にＵｓｐ７を欠損させると、アレルギー性気道炎症における好酸球の浸潤が有意に減少し、また、気道過敏反応が有意に改善したことが明らかとなった。
［実験例２］
（Ｔｈ２特異的なＵｓｐ７遺伝子の欠損はアレルギー性気道炎症における炎症性細胞の浸潤の減少につながった）
　実験例１でＴｈ２細胞を移植した各群のマウスの肺の組織学的解析を行った。図４（ａ）～（ｄ）はマウスの肺の組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色した結果を示す顕微鏡写真である。図４（ａ）～（ｄ）中、「ＷＴ」はＵｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）由来のＴｈ２細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ」は、Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ＰＢＳ　ｉ．ｎ．」はＰＢＳを経鼻腔的に投与したマウスの結果であることを示し、「ＯＶＡ　ｉ．ｎ．」は、ＯＶＡを経鼻腔的に投与したマウスの結果であることを示す。スケールバーは１０００μｍである。
　その結果、図４（ａ）、（ｂ）に示すように、ＰＢＳ投与群の肺はほぼ正常な状態であった。これに対し、図４（ｃ）に示すように、ＯＶＡを投与したＷＴ群の肺では、大量の炎症性細胞の浸潤が認められた。図４（ｃ）中、炎症性細胞の浸潤が認められた領域を矢印で示す。また、図４（ｄ）に示すように、ＯＶＡを投与したＫＯ群の肺では、炎症性細胞の浸潤が認められたものの、図４（ｃ）と比較して、アレルギー性気道炎症が顕著に改善された状態を示した。
［実験例３］
（Ｔｈ２特異的なＵｓｐ７遺伝子の欠損はアレルギー性気道炎症における粘液産生の減少につながった）
　実験例１でＴｈ２細胞を移植した各群のマウスの肺の組織学的解析を行った。図５（ａ）～（ｄ）はマウスの肺の組織切片をＰＡＳ染色した結果を示す顕微鏡写真である。図５（ａ）～（ｄ）中、「ＷＴ」はＵｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）由来のＴｈ２細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ＫＯ」は、Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞を移植したマウスの結果であることを示し、「ＰＢＳ　ｉ．ｎ．」はＰＢＳを経鼻腔的に投与したマウスの結果であることを示し、「ＯＶＡ　ｉ．ｎ．」は、ＯＶＡを経鼻腔的に投与したマウスの結果であることを示す。スケールバーは１００μｍである。
　その結果、図５（ａ）、（ｃ）に示すように、ＰＢＳ投与群の肺はほぼ正常な状態であった。これに対し、図５（ｂ）に示すように、ＯＶＡを投与したＷＴ群の肺では、大量の粘液の産生が認められた。図５（ｂ）中、粘液の産生が認められる領域を矢印で示す。また、図５（ｄ）に示すように、ＯＶＡを投与したＫＯ群の肺ではほとんど粘液の産生が認められず、アレルギー性気道炎症が顕著に改善された状態を示した。
　以上、実験例１～３の結果から、Ｔｈ２細胞特異的なＵｓｐ７遺伝子の欠損は、ＯＶＡに暴露した場合のアレルギー性気道炎症の病態の改善につながることが明らかとなった。
［実験例４］
（Ｕｓｐ７遺伝子の欠損は、Ｔｈ２細胞におけるＧｚｍａ遺伝子及びＩｌ１３遺伝子の発現の減少につながった）
　ＲＮＡ－シーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によりＵｓｐ７遺伝子の欠損の影響を解析した。図６は実験スケジュールを示す模式図である。まず、Ｕｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）の胸腺由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞、及び、Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＫＯマウス）の胸腺由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製した。
　続いて、これらの細胞をＴｈ２条件で５日間培養した。最初の２４時間は４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）処理した。その後、抗ＴＣＲβ抗体（クローンＨ５７－５９７）で刺激を行い、刺激の４時間後に各細胞を回収し、ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行った。
　図７はＲＮＡ－ｓｅｑの結果を示すボルカノプロットである。縦軸はｐ値を示し、横軸はＷＴマウス及びＫＯマウスにおける各遺伝子の発現量の比を示す。グラフの上部ほどＷＴマウスとＫＯマウスで発現量の差が大きいことを示す。図７中、丸で囲んだプロットは、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで発現量が顕著に低い遺伝子を示す。
　これらの遺伝子のうち、グランザイムＡをコードするＧｚｍａ遺伝子の発現量が、ＷＴマウスと比較してＫＯマウスで顕著に減少したことが明らかとなった。
　図８（ａ）及び（ｂ）は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡ－Ｓｅｑの結果を確認した結果を示すグラフである。図８（ａ）はＵｓｐ７遺伝子の発現量を測定した結果であり、図８（ｂ）はＧｚｍａ遺伝子の発現量を測定した結果である。図８（ａ）及び（ｂ）中、「ＷＴ」はＵｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）由来の細胞の結果であることを示し、「ＫＯ」はＵｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＫＯマウス）由来の細胞の結果であることを示す。
　その結果、Ｇｚｍａ遺伝子の発現量はＷＴマウスと比較してＫＯマウスで確かに減少していることが確認された。
　Ｇｚｍａ遺伝子に加えて、Ｔｈ２サイトカインの一種であるＩＬ－１３をコードするＩｌ１３遺伝子も、重要な遺伝子として検出された。
［実験例５］
（Ｕｓｐ７遺伝子の欠損は、インビトロにおいて、グランザイムＡの産生の減少につながった）
　続いて、実験例４と同様にして、Ｕｓｐ７＋／＋Ｃｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＷＴマウス）由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞、及び、Ｕｓｐ７ｆｌ／ｆｌＣｒｅ－ＥＲＴ２＋ＯＴＩＩ　Ｔｇマウス（ＫＯマウス）由来のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ２条件で培養し、得られたＴｈ２細胞におけるグランザイムＡタンパク質の産生量をフローサイトメトリーにより解析した。
　図９（ａ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図９（ａ）中、縦軸はグランザイムＡの産生量を示し、横軸はインターフェロン（ＩＦＮ）－γの産生量を示す。図９（ｂ）は、図９（ａ）の結果をグラフにしたものである。
　その結果、ＫＯマウス由来のＴｈ２細胞では、ＷＴマウス由来のＴｈ２細胞と比較して、グランザイムＡ陽性細胞の割合が有意に減少したことが明らかとなった。
［実験例６］
（グランザイムＡはＩＬ－３３を切断し成熟型ＩＬ－３３を生成する）
　ヒトＩＬ－３３を、濃度を変えたグランザイムＡと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及び抗ヒトＩＬ－３３抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、ヒトＩＬ－３３の切断を検出した。
　また、比較のために、グランザイムＡにプロテアーゼインヒビターを混合したサンプルも用意した。また、比較のために、グランザイムＡの代わりにグランザイムＢ、オブアルブミン、パパイン、アスペルギルス属菌体、室内塵ダニ（Ｈｏｕｓｅ　ｄｕｓｔ　ｍｉｔｅ、ＨＤＭ）を反応させたサンプルも用意した。
　図１０はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１０中、「ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ＩＬ－３３」は全長のＩＬ－３３のバンドの位置を示し、「ｃｌｅａｖｅｄ　ＩＬ－３３」は切断されたＩＬ－３３のバンドの位置を示す。
　また、図１０中、「ＧｚｍＡ」はグランザイムＡを示し、「ＡＥＢＳＦ」はセリンプロテアーゼ阻害剤である４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を示し、「Ｅ－６４」はシステインプロテアーゼ阻害剤を示し、「ＧｚｍＢ」はグランザイムＢを示し、「ＯＶＡ」はオブアルブミンを示し、「Ｐａ．」はパパインを示し、「Ａｓｐ．」はアスペルギルス属菌体を示し、「Ｈ．Ｄ．Ｍ．」は室内塵ダニを示す。
　グランザイムＡは１００～２５００ｍＭの濃度で使用した。また、グランザイムＢは１００～２５００ｍＭの濃度で使用した。また、ＯＶＡは５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、パパインは１０μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、アルペルギルス属菌体は３．２μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、室内塵ダニは４００μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、ＡＥＢＳＦは５ｍＭの濃度で使用した。また、Ｅ－６４は５０μＭの濃度で使用した。
　その結果、グランザイムＡをヒトＩＬ－３３に添加した場合に、切断されたＩＬ－３３がグランザイムＡの濃度依存的に増加したことが明らかとなった。更に、グランザイムＡにセリンプロテアーゼ阻害剤を添加すると、切断されたＩＬ－３３のバンドが消失することが明らかとなった。この結果は、グランザイムＡがヒトＩＬ－３３を切断することを示す。
　以上実験例４～６の結果から、グランザイムＡがアレルギー性気道炎症の病態に関わっていることが明らかとなった。また、グランザイムＡはＩＬ－３３を切断することが明らかとなった。
　本発明によれば、ＩＬ－３３関連疾患を効果的に予防又は治療する技術を提供することができる。

Claims (25)

  1. 　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　７（ＵＳＰ７）阻害剤を有効成分とする、インターロイキン（ＩＬ）－３３関連疾患の予防又は治療剤。
  2. 　前記ＩＬ－３３関連疾患が、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
  3. 　前記アレルギー性気道炎症が、好酸球性喘息である、請求項２に記載の予防又は治療剤。
  4. 　前記ＵＳＰ７阻害剤が、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
  5. 　グランザイムＡ発現抑制剤である、請求項１～４のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
  6. 　ＩＬ－３３活性化抑制剤である、請求項１～５のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
  7. 　グランザイムＡ阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤。
  8. 　グランザイムＡ阻害剤を有効成分とする、ＩＬ－３３活性化抑制剤。
  9. 　被験物質の存在下でＵＳＰ７タンパク質の活性を測定する工程を含み、
    　前記活性が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７タンパク質の活性と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  10. 　被験物質の存在下でグランザイムＡタンパク質及びＩＬ－３３タンパク質をインキュベートする工程と、
    　切断された前記ＩＬ－３３タンパク質を定量する工程と、を含み、
    　切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量が前記被験物質の非存在下における切断された前記ＩＬ－３３タンパク質の量と比較して減少したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  11. 　被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、
    　前記Ｔｈ２細胞によるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、
    　前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるグランザイムＡ遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  12. 　被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、
    　前記Ｔｈ２細胞によるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、
    　前記発現量が、前記被験物質の非存在下におけるＵＳＰ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して低下したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  13. 　被験物質の存在下でＴｈ２細胞を培養する工程と、
    　前記Ｔｈ２細胞のグランザイムＡ遺伝子座におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量を測定する工程と、を含み、
    　前記ユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量が、前記被験物質の非存在下におけるユビキチン化されたヒストンＨ２Ａの量と比較して増加したことが、前記被験物質がＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤であることを示す、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  14. 　ＵＳＰ７阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療方法。
  15. 　前記ＩＬ－３３関連疾患が、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎である、請求項１４に記載の予防又は治療方法。
  16. 　前記アレルギー性気道炎症が、好酸球性喘息である、請求項１５に記載の予防又は治療方法。
  17. 　前記ＵＳＰ７阻害剤が、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の予防又は治療方法。
  18. 　ＩＬ－３３関連疾患の予防又は治療のためのＵＳＰ７阻害剤。
  19. 　前記ＩＬ－３３関連疾患が、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎である、請求項１８記載のＵＳＰ７阻害剤。
  20. 　前記アレルギー性気道炎症が、好酸球性喘息である、請求項１９記載のＵＳＰ７阻害剤。
  21. 　ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のＵＳＰ７阻害剤。
  22. 　ＩＬ－３３関連疾患の予防剤又は治療剤を製造するためのＵＳＰ７阻害剤の使用。
  23. 　前記ＩＬ－３３関連疾患が、アレルギー性気道炎症、好酸球性副鼻腔炎又は好酸球性食道炎である、請求項２２記載の使用。
  24. 　前記アレルギー性気道炎症が、好酸球性喘息である、請求項２３記載の使用。
  25. 　前記ＵＳＰ７阻害剤が、ＵＳＰ７遺伝子に対する阻害性核酸である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の使用。
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Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTUN, M. ET AL.: "Activity-Based Chemical Proteomics Accelerates Inhibitors Development for Deubiquitylating Enzymes", CHEM BIOL, vol. 18, 2011, pages 1401 - 12, XP055217598, ISSN: 1074-5521, DOI: 10.1016/j.chembiol.2011.08.018 *
CHEN, C. ET AL.: "Synthesis and biological evaluation of thiazole derivatives as novel USP 7 inhibitors", BIOORG MED CHEM LETT, vol. 27, 2017, pages 845 - 9, XP029906433, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/j.bmcl.2017.01.018 *
COLLAND, F. ET AL.: "Small-molecule inhibitor of USP 7/HAUSP ubiquitin protease stabilizes and activates p53 in cells", MOL CANCER THER, vol. 8, no. 8, 2009, pages 2286 - 95, XP002629465, ISSN: 1535-7163, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-09-0097 *
GAVORY, G. ET AL.: "Discovery and characterization of highly potent and selective allosteric USP 7 inhibitors", NAT CHEM BIOL, vol. 14, 2018, pages 118 - 25, XP055453500, ISSN: 1552-4450, DOI: 10.1038/nchembio.2528 *
HOLGADO, A. ET AL.: "IL -33trap is a novel IL -33-neutralizing biologic that inhibits allergic airway inflammation", J ALLERGY CLIN IMMUNOL, vol. 144, 13 March 2019 (2019-03-13), pages 204 - 15, XP085726350, ISSN: 0091-6749, DOI: 10.1016/j.jaci.2019.02.028 *
KATEGAYA, L. ET AL.: "USP 7 small-molecule inhibitors interfere with ubiquitin binding", NATURE, vol. 550, 2017, pages 534 - 8, XP055744653, ISSN: 0028-0836 *
KEMP, M. ET AL.: "Recent Advances in the Discovery of Deubiquitinating Enzyme Inhibitors", PROG MED CHEM, vol. 55, 2016, pages 149 - 92, XP055333853, ISSN: 0079-6468, DOI: 10.1016/bs.pmch.2015.10.002 *
KUMAGAI, HITOSHI,: ""A deubiquitinating enzyme, USP7 regulates allergic airway inflammation", CHIBA MEDICAL JOURNAL, vol. 95, 10 June 2019 (2019-06-10), pages 93 - 6, ISSN: 0303-5476 *
REVERDY, C. ET AL.: "Discovery of Specific Inhibitors of Human USP 7/ HAUSP deubiquitinating Enzyme", CHEM BIOL, vol. 19, 2012, pages 467 - 77, XP055268933, ISSN: 1074-5521, DOI: 10.1016/j.chembiol.2012.02.007 *
SU , D. ET AL.: "Ubiquitin-specific protease 7 sustains DNA damage response and promotes cervical carcinogenesis", J CLIN INVEST, vol. 128, no. 10, 2018, pages 4280 - 96, XP055744651, ISSN: 0021-9738 *
TIAN, X. ET AL.: "Characterizaition of Selective Ubiquitin and Ubiquitin-Like Protease Inhibitors Using a Fluorescence-Based Multiplex Assay Format", ASSAY DRUG DEV TECHNOL, vol. 9, no. 2, 2011, pages 165 - 73, XP055744664, ISSN: 1540-658X *
TURNBULL, A.P. ET AL.: "Molecular basis of USP 7 inhibition by selective small-molecule inhibitors", NATURE, vol. 550, 2017, pages 481 - 6, XP055453666, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/nature24451 *
WEINSTOCK, J. ET AL.: "Selective Dual Inhibitors of the Cancer-Related Deubiquitylating Protease USP 7 and USP 47", ACS MED CHEM LETT, vol. 3, 2012, pages 789 - 92, XP009186731, ISSN: 1948-5875, DOI: 10.1021/ml200276j *
WU, J. ET AL.: "Chemical Approaches to Intervening in Ubiquitin Specific Protease 7 ( USP 7) Function for Oncology and Immune Oncology Therapies", J MED CHEM, vol. 61, 2018, pages 422 - 43, XP055744660, ISSN: 0022-2623 *

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