WO2020171293A1 - 혐기소화 공정 내 단백질 분해 산생성균의 선택 정량을 위한 dna 탐침자 - Google Patents

혐기소화 공정 내 단백질 분해 산생성균의 선택 정량을 위한 dna 탐침자 Download PDF

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Definitions

  • Biotechnology-applied gene library method, blot hybridization, and FISH (fluorescence in situ hybridization) method are used as meter reading methods for poorly cultured microorganisms such as acid-producing bacteria, but individual microorganisms (or Microorganism group) has a structural limitation that can only be used as a relative quantification expressed as a ratio to the total microorganism.
  • the probe for acid-producing bacteria belonging to genus Fastidiosipila may include a primer of SEQ ID NO: 1, a primer of SEQ ID NO: 3, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a fluorescent material.
  • the present invention is a primer pair consisting of nucleotide sequences capable of probing all acidic bacteria species belonging to genus Sedimentibacter represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15 and a base sequence represented by SEQ ID NO: 14 It provides a method of manufacturing a probe labeled with a fluorescent material consisting of.
  • Fas-R380 3'-GTCCCGTCTAAAGAAGTT-5' (SEQ ID NO: 3).
  • Pro-R437 3'-ACTTTATTCCCTTGCAAA-5' (SEQ ID NO: 6).
  • Clo-F221 5'-AGTGTTAATGGTTGAGAG-3' (SEQ ID NO: 7);
  • the nucleotide sequence of a probe labeled with a primer or a fluorescent substance includes the following sequence capable of specifically quantifying acid-producing bacteria belonging to genus Sedimentibacter .
  • the primer and probe sequence of the present invention is a forward primer selected from 1230 to 1236 bp on the 16S rRNA gene sequence, a reverse primer selected from 1406 to 1410 bp on the 16S rRNA gene sequence, and 1348 to 1358 bp on the 16S rRNA gene sequence. It is preferably a probe nucleotide sequence selected from the site.
  • Sed-T1353 5'-CACCATGGAAGTTGRTAATACCC-3' (SEQ ID NO: 14); And
  • nucleotide sequence is the information on the primer and probe set of the quantification kit of the present invention designed to specifically quantify the 16S rRNA gene of acidic bacteria species belonging to genus Tepidimicrobium , and the size of the amplification product is 430 bp.
  • SEQ ID NO: 5 is a probe base sequence of acid-producing bacteria belonging to genus Proteiniphilum .
  • SEQ ID NO: 11 is a nucleotide sequence for probe of acid-producing microorganisms belonging to genus Gelria .
  • SEQ ID NO: 17 is a nucleotide sequence for probe of acid-producing bacteria belonging to genus Tepidimicrobium .

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 이용해 바이오가스화 설비에서 발견되는 주요 단백질 가수분해 산생성균 군집을 선택적으로 정량 할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 탐침자에 관한 것이다.

Description

혐기소화 공정 내 단백질 분해 산생성균의 선택 정량을 위한 DNA 탐침자
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 이용해 바이오가스화 설비에서 발견되는 주요 단백질 분해 산생성균 군집을 선택적으로 정량 할 수 있는 탐침자에 관한 것이다.
혐기 소화는 유기물이 산소가 없는 혐기 상태에서 혐기 미생물에 의해 가수분해, 산발효, 메탄생성 과정 등을 거쳐 최종적으로 메탄과 이산화탄소를 주성분으로 하는 바이오가스로 전환되는 생화학적 과정을 의미하며, 혐기성 소화 또는 바이오가스화라고도 불린다.
산생성균은 비교적 넓은 pH 범위(4~8)에서 탄수화물, 단백질, 지방으로 구성된 유기물을 가수분해 효소를 이용하여 단량체로 가수분해 시킨 뒤, 이를 유기산으로 전환시키며, 메탄 생성균은 산생성과정 중 발생한 수소와 이산화탄소, 그리고 아세트산을 이용하여 바이오가스를 생산한다. 두 군집 간의 생화학적 평형상태는 전체 혐기소화 공정 효율에 직접적인 영향을 미친다.
따라서 혐기 소화 공정의 성공적인 운전 및 운전안정성 확보를 위해 유입원수의 단백질 농도 및 성상에 따른 소화조 내 단백질 분해 산생성균에 대한 정확한 정량정보 분석이 필수적이다. 또한, 이러한 정량정보는 공정 평가를 위해 활용될 수 있을 뿐 아니라 개별 산생성균의 군집의 생장역학 모델을 수립하는데 필수적인 요소로 작용한다.
그러나 환경기술에서 미생물 정량정보 분석을 위해 널리 사용되는 건조중량 방법은 미생물과 여타 유기물을 구별할 수 없다는 근본적인 문제가 있어, 효율적인 정량이 어렵다. 또한 콜로니 수 세기(colony count), MPN(most probable number)과 같은 전통적인 배양의존법은 배양과정에서 오는 부정확성을 피할 수 없어 복합 산생성균이 공존하는 소화조 샘플의 미생물 정량에 이용되는 데는 한계가 많은 실정이다. 생명공학기술을 응용한 유전자 라이브러리(gene library)법, 블롯 결합법(blot hybridization), FISH(fluorescence in situ hybridization)법 등은 산생성균과 같은 난배양성 미생물의 검침방법으로 이용되고 있으나 개별 미생물(또는 미생물 그룹)을 전체 미생물에 대한 비율로 표현하는 상대정량만을 할 수밖에 없는 구조적인 한계점을 내포하고 있다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 미생물 정량법은 (i) 대상 미생물에 대한 특이성이 높고, (ii) 민감도와 재현성이 높으며, (iii) 절대정량이 가능하고, (iv) 비교적 빠른 시간 내에 정량이 가능하다는 장점이 있어 환경미생물의 정량법으로 각광받고 있다. 실시간 중합효소연쇄반응의 수행을 위해서는 대상 미생물(군집)에 대해 특이적인 탐침자 세트가 확보되어야 한다.
한편, 단백질 분해 산생성균의 경우 계통분류학적인 분류에 따라 일부 목(order), 과(family) 및 속(genus)에 대한 탐침자 세트가 보고되어 있으나 대부분의 속 및 종(species)에 대하여는 특이적인 탐침자가 존재하지 않아 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 정량법이 부재한 실정이다.
더구나, 실규모 혐기소화조에선 외부환경 변화에서 오는 공정장애가 발생하기 쉬운 것으로 알려져 있으며, 특히 음식물류폐기물 및 가축분뇨와 같은 고농도 단백질을 함유한 유기성 폐기물의 혐기소화 공정에서는 시기별 유입 성상의 변동이 커, 이에 따라 소화조 내 산생성균에 의해 발생되는 유기산의 축적이 유발되며, 이에 따라 pH가 낮아져 미생물 활성에 저해를 준다. 경제적 손실을 최소화하기 위해서는 빠른 시간 내 공정장애를 진단하고 대처하는 것이 중요하지만, 기존의 물리화학적인 공정 모니터링 인자는 미생물의 생장을 반영하지 못하므로 공정 장애에 대한 신속하고 정확한 진단 및 대응방안을 찾기 어려운 문제가 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 혐기소화 공정, 특히, 음식물류폐기물 및 가축분뇨와 같은 고농도 단백질을 함유한 유기성 폐기물의 혐기소화 공정에서 산생성균을 선택적으로 정량 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 혐기소화 공정에서 산생성균을 선택적으로 정량 할 수 있는 새로운 탐침자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 혐기소화 공정에서 산생성균을 선택적으로 정량 할 수 있는 새로운 탐침자를 이용하여 공정을 운전하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은
고농도 유기성폐기물 (음식물류폐기물, 가축분뇨)을 처리하는 실규모 바이오가스화 설비 내에서 산생성균을 정량하기 위해서, genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, 및 genus Tepidimicrobium 로 이루어진 6개의 목적 군집 중 적어도 하나에 속하는 미생물을 qPCR로 정량하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 qPCR은 상기 6개의 목적 군집, 즉, genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, 및 genus Tepidimicrobium에 포함되는 각 미생물 종들에 특이적으로 qPCR이 일어날 수 있는 탐침자를 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탐침자는 정방향 및 역방향 프라이머(primer), 특이적 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 1의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열 번호 2의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 4의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머, 서열 번호 5의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 7의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열 번호 8의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Gelria에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 10의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머, 서열 번호 11의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 13의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머, 서열 번호 14의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 16의 프라이머, 서열번호 18의 프라이머, 서열 번호 17의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침할 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, 및 genus Tepidimicrobium에 포함되는 각 미생물 종들을 탐침할 수 있는 탐침자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 1의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열 번호 2의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 4의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머, 서열 번호 5의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 7의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열 번호 8의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Gelria에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 10의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머, 서열 번호 11의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 13의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머, 서열 번호 14의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자는 서열 번호 16의 프라이머, 서열번호 18의 프라이머, 서열 번호 17의 염기서열, 및 형광물질을 포함할 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 기재되는 genus Fastidiosipila에 속하는 산성성균 종(species)들을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재되는 genus Proteiniphilum을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 7 및 서열번호 9으로 기재되는 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산성성균 종(species)들을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 10 및 서열번호 12으로 기재되는 genus Gelria에 속하는 산성성균 종(species)들을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 13 및 서열번호 15으로 기재되는 genus Sedimentibacter에 속하는 산성성균 종(species)들을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 서열번호 16 및 서열번호 18으로 기재되는 genus Tepidimicrobium에 속하는 산성성균 종(species)들을 모두 탐침할 수 있는 염기서열들로 구성되는 프라이머 쌍 및 서열번호 17로 기재되는 염기서열로 구성되는, 형광물질로 표지된 프로브 제작 방법을 제공한다.
본 발명에 의해서 고농도 단백질 함유 유기성폐기물(음식물류폐기물, 가축분뇨)을 처리하는 실규모 바이오가스화 설비 내에서 산생성균을 정량 할 수 있는 방법이 제공되었다.
또한, 본 발명에 의해서 고농도 단백질 함유 유기성폐기물(음식물류폐기물, 가축분뇨)을 처리하는 실규모 바이오가스화 설비 내에서 산생성균을 정량 할 수 있는 탐침자들이 제공되었다.
본원 발명에 의해서 제공되는 방법과 탐침자를 이용하여 혐기소화조 내 공정 장애를 신속하게 진단하거나 주요 산생성균 군집의 증식속도를 모니터링 함으로써 공정효율을 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니며, 본 발명을 예시하기 위한 것임을 유의하여야 한다.
< 실시예 > 대상 박테리아 군집 선정, 프라이머 , 프로브 셋트의 설계, 제작 및 검증
본 발명자들은 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing) 기법 중 하나인 Ion Torrent PGM을 이용해 고농도 유기성폐기물 (음식물류폐기물, 가축분뇨)을 처리하는 전국 분산 위치 실규모 바이오가스화 소화조(88개 샘플)에서 높은 상대적 밀도(relative density)를 갖는 동시에 높은 상대적 빈도수(relative frequency)가 높은 산생성균 군집을 선별하였다. 그 결과 genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, genus Tepidimicrobium를 주요 산생성균 군집으로 선정하였다.
이후 본 발명자들은 상기 군집의 16S rRNA 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머와 형광물질이 표지된 프로브를 디자인하여 제작하였다.
박테리아의 16S rDNA의 염기서열에 대한 자료는 공인된 데이터베이스에서 확보하였다 (Ribosomal　Database Project　release 11; National Center for Biotechnology Information). 이들 염기서열에서 각 그룹에 특이적인 부분들을 선정하여 각각 순방향 및 역방향 프라이머, 그리고 프로브로 역할을 하도록 설계하였으며, 프로브는 정방향과 역방향 프라이머 사이에 배치되는 염기서열을 갖는 형광 탐침자로 5' 말단에는 빛을 발산하는 형광물질인 FAM(6-carboxyfluorescein)을 부착하였으며, 3' 말단에는 형광 억제 물질로서 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)를 사용하였다. 이를 통해 향후 qPCR 수행 시 이 형광물질의 지수적인 증가를 탐지함으로써 샘플 내 해당 산생성균 군집의 수를 정량 할 수 있다.
각 프라이머 및 프로브 셋트의 해당 산생성균 그룹에 대한 특이성은 상기 16S rRNA 유전자 데이터베이스에 있는 프로그램(PROBE MATCH)을 이용하여 컴퓨터 시뮬레이션을 통한 이론적 검증을 통해 각 셋트의 특이성을 검증하였다. 또한 실험적으로 특이성을 검증하기 위하여 5종의 정량대상 산생성균을 여러 균주수탁기관(ATCC, DSMZ, KCTC)으로부터 분양받아 각 균주의 16S rRNA 유전자를 추출하였다. 실시간 PCR은 증폭시 매 회(cycle)의 형광의 세기(fluorescence intensity)를 실시간으로 모니터링 할 수 있으므로, 증폭이 지수적으로 일어나는 PCR 반응의 초기에 정량이 가능하다. 실시간 PCR의 반응조건은 하기와 같다. 반응키트(LightCycler TaqMan Master Mix, Roche Diagnostics사 제품)의 각 모세관(capillary tube)에 2 ㎕ 시료 DNA, 각각 500 nM 순방향 및 역방향 프라이머, 100 nM 형광 프로브, 4 ㎕ 반응액(reaction mixture), 그리고 전체 부피가 20 ㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 모든 실시간 PCR 반응조건은 2단계(2-step)로서 중합효소 활성화(Taq polymerase activation)를 94℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 10초), 결합과 연장(annealing and extension, 60℃에서 30초)을 총 50회(cycle) 수행하였다. 모든 실시간 PCR을 수행할 때 시료 DNA 대신 멸균 증류수를 넣은 대조군 모세관을 포함시켰다.
본 실시예의 결과를 통해 해당 프라이머 및 프로브 셋트가 정량 하고자 하는 목적 그룹이 성공적으로 증폭되어 검출되었음을 확인할 수 있다.
본 발명에서, 프라이머 또는 형광 물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 8~54 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 163~185 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 374~392 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Fastidiosipila에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량 할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로, 최종 증폭산물의 크기는 350 bp이다.
Fas-F30: 5'-CGATTCTGAACGTTTAGT-3' (서열번호 1);
Fas-T170: 5'-TGAAAGATGGCCTCGCGC-3' (서열번호 2); 및
Fas-R380: 3'-GTCCCGTCTAAAGAAGTT-5' (서열번호 3).
본 발명에서, 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 112~168 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 420~454 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 217~272 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Proteiniphilum에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량 할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로, 최종 증폭산물의 크기는 271 bp이다.
Pro-F166: 5'-AATACCCTATAACACAGG-3' (서열번호 4);
Pro-T217: 5'-CGGTTGAAGATGGGCATG-3' (서열번호 5); 및
Pro-R437: 3'-ACTTTATTCCCTTGCAAA-5' (서열번호 6).
본 발명에서, 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 175~245 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 387~421 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 264~274 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량 할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로, 최종 증폭산물의 크기는 185 bp이다.
Clo-F221: 5'-AGTGTTAATGGTTGAGAG-3' (서열번호 7);
Clo-T264: 5'-TGCTGCCGTTTGAGGATG-3' (서열번호 8); 및
Clo-R406: 3'-GTAGACTATTCTCGACTG-5' (서열번호 9).
본 발명에서, 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Gelria에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 16~150 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 224~286 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 175~196 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Gelria에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량 할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로, 최종 증폭산물의 크기는 155 bp이다.
Ger-F69: 5'-CGAGGTAGAAGGGTATGG-3' (서열번호 10);
Ger-T182: 5'-AACCTGCCTCCAAGCCCG-3' (서열번호 11); 및
Ger-R224: 3'-CTGAGCTCATCCGGTATT-5' (서열번호 12).
본 발명에서, 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1230~1236 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1406~1410 bp 부위에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 1348~1358 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Sedimentibacter에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량 할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로, 최종 증폭산물의 크기는 176 bp이다.
Sed-F1230: 5'-ATAAACCGATCCCAGTTC-3' (서열번호 13);
Sed-T1353: 5'-CACCATGGAAGTTGRTAATACCC-3' (서열번호 14); 및
Sed-R1406: 3'-TTRATCCTACCTTMGGCG-5' (서열번호 15).
본 발명에 있어서, 프라이머 또는 형광물질로 표지된 프로브의 염기서열은 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균을 특이적으로 정량 가능한 하기의 서열을 포함한다. 본 발명의 프라이머 및 프로브 염기서열은 16S rRNA 유전자 서열 상에서 180~190 bp 부위에서 선택되는 정방향 프라이머 및 16S rRNA 유전자 서열 상에서 186 bp 에서 선택되는 역방향 프라이머, 16S rRNA 유전자 서열 상에서 225~231 bp 부위에서 선택되는 프로브 염기서열인 것이 바람직하다. 하기의 염기서열은 genus Tepidimicrobium에 속하는 산성성균 종(species)들의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 정량할 수 있도록 설계된 본 발명의 정량키트 프라이머 및 프로브 셋트 정보로 증폭산물의 크기는 430 bp이다.
Tep-F180: 5'-ACCCTATGACACTTAAGK-3' (서열번호 16);
Tep-T230: 5'-TRGRAGATGGCCTCGCGT-3' (서열번호 17); 및
Tep-R610: 3'-CAGTTTCAARTGCTTACW-5' (서열번호 18).
서열번호 2는 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.
서열번호 5는 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.
서열번호 8은 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.
서열번호 11은 genus Gelria에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.
서열번호 14는 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.
서열번호 17은 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균 미생물들의 탐침용 염기서열이다.

Claims (15)

  1. 고농도 유기성 폐기물를 처리하는 바이오가스화 설비의 산 생성균을 정량하는 방법에 있어서,
    genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, 및 genus Tepidimicrobium 로 이루어진 미생물 중 적어도 하나를 qPCR로 정량하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 qPCR은 genus Fastidiosipila, genus Proteiniphilum, genus Candidatus Cloacamonas, genus Gelria, genus Sedimentibacter, 또는 genus Tepidimicrobium에 특이적인 탐침자를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 탐침자는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머(primer), 특이적 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 1의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열 번호 2의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 4의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머, 서열 번호 5의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 7의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열 번호 8의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Gelria에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 10의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머, 서열 번호 11의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 13의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머, 서열 번호 14의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균 미생물들은 서열 번호 16의 프라이머, 서열번호 18의 프라이머, 서열 번호 17의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 탐침자로 탐침하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 서열 번호 1의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머, 서열 번호 2의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 genus Fastidiosipila에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
  11. 서열 번호 4의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머, 서열 번호 5의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 genus Proteiniphilum에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
  12. 서열 번호 7의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머, 서열 번호 8의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 genus Candidatus Cloacamonas에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
  13. 서열 번호 10의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머, 서열 번호 11의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 genus Gelria에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
  14. 서열 번호 13의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머, 서열 번호 14의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 genus Sedimentibacter에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
  15. 서열 번호 16의 프라이머, 서열번호 18의 프라이머, 서열 번호 17의 염기서열, 및 형광물질을 포함하는 상기 genus Tepidimicrobium에 속하는 산생성균 미생물용 탐침자.
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