WO2020165481A1 - Microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, módulo y kit para microscopio, método y programa de ordenador para la reconstrucción computacional del frente de onda - Google Patents

Microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, módulo y kit para microscopio, método y programa de ordenador para la reconstrucción computacional del frente de onda Download PDF

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WO2020165481A1 PCT/ES2020/070101 ES2020070101W WO2020165481A1 WO 2020165481 A1 WO2020165481 A1 WO 2020165481A1 ES 2020070101 W ES2020070101 W ES 2020070101W WO 2020165481 A1 WO2020165481 A1 WO 2020165481A1
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microscope
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wavefront
space
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Manuel MARTÍNEZ CORRAL
Genaro Saavedra Tortosa
Emilio SÁNCHEZ ORTIGA
Peter TÖRÖK
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Universitat De València
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    • G—PHYSICS
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    • G02B30/10—Optical systems or apparatus for producing three-dimensional [3D] effects, e.g. stereoscopic images using integral imaging methods

Definitions

  • Microscope for quantitative wavefront measurements module and kit for microscope, method and computer program for reconstruction
  • the present invention concerns, in a first aspect, a microscope for quantitative wavefront measurements, which comprises an ordered two-dimensional arrangement of lenses designed in such a way as to allow the measurement of smooth and non-smooth variations of the front of waves from biological samples, or obtaining high-resolution 3D images, including microscopic samples.
  • a second aspect of the present invention concerns a method for the computational reconstruction of the wavefront, adapted to perform the functions for which the computational entity of the microscope is configured.
  • the present invention concerns a computer program for the computational reconstruction of the wavefront, which includes program instructions that, when executed in a processor, implement the method of the second aspect.
  • the present invention concerns a computer program product that comprises a tangible medium on which the computer program of the third aspect is stored.
  • a fifth aspect of the present invention concerns a microscope module, to be coupled to a camera port of a microscope in order to construct the microscope of the first aspect of the present invention.
  • a sixth aspect of the present invention concerns a kit for a microscope, which comprises the module of the fifth aspect and an illumination module that can be coupled to an illumination port of a microscope.
  • the computational reconstruction of the wavefront is a problem of special interest in optical microscopy since it provides information on the light field emitted by 3D samples, that is, quantitative measurements of the wavefront.
  • this type of reconstruction is provided by two types of microscopes: 1) Microscopes based on interference detection! wavefront using a holographic process. This type of system has the disadvantage of its low stability and of obtaining only monocular information.
  • Microscopes with a structure similar to wavefront sensors based on the Hartmann-Shack (H-S) principle that is, those that include the characteristics defined in the preamble of claim 1 of the present invention. Such is the case of those described in the following patents: US9726875B2, US9658443B2,
  • the size of the diffraction spot When illuminating a microlens with a locally flat wave, the light is focused on the sensor (located in the image focal plane of the microlens) in the form of a diffraction spot.
  • the position of this spot with respect to the center of the microlens can be related to the angle of inclination of the locally flat wave.
  • the diameter of the spot, 0 d ⁇ , for a given lighting wavelength, l is related to the diameter, d, and the focal length of each microlens, /, by the following formula:
  • said spot in order to effectively sample the diffraction spot in order to calculate its centroid and, with it, its relative displacement, said spot must occupy at least 4 pixels according to the Nyquist criterion.
  • a size of 4 pixels is the optimal value since this value allows the spot to be effectively sampled with the sensor and, in turn, allows optimizing the number of wavefront angles determined by the stop shift,
  • This diameter directly determines the spatial resolution of the system. Furthermore, this size limits the number of pixels in which the wavefront is sampled for a given sensor size.
  • the number of microlenses, and therefore the number of pixels of the reconstruction varies between 20x20 and 100x100 (corresponding to pixelated sensors whose total size is in the range between 3.0 x 3.0 mm and, in extreme cases , 15.0 x 15.0 mm). 2) Angular resolution.
  • the maximum angle that can be sampled is related to the maximum displacement of the spot within its region. Since the microlenses create optical barriers, said displacement corresponds to half the size of microlenses,
  • the present invention concerns, in a first aspect, a microscope for quantitative wavefront measurements, comprising, in a manner known per se:
  • a microscope objective configured and arranged to receive and focus light scattered by the sample when illuminated with said illumination means
  • an image sensor formed by a plurality of photodetector elements, which is located in a capture space on the focal plane of the two-dimensional arrangement array of lenses to receive said light scattered by the sample after passing through said microscope objective and said ordered two-dimensional arrangement of lenses, and acquire spatial information and angular information of the object wavefront associated with said light from said sample, remaining facing each various lens of said photodetector elements;
  • At least one computational entity operatively connected to said image sensor and which is configured and arranged to perform a computational reconstruction of said object wavefront from said spatial and angular information.
  • the spacing r m between the centers of each two contiguous lenses of the ordered two-dimensional arrangement of lenses is greater than 500 pm and its relative aperture is less than 10.
  • the spacing between the centers of each two contiguous lenses of the ordered two-dimensional array of lenses has a value that is between 900 pm and 1100 pm, and their relative aperture has a value that is between 5 and 7 .
  • the spacing between the centers of each two contiguous lenses of said ordered two-dimensional array of lenses has a value between 990 pm and 1010 pm, preferably 1000 pm, and their relative aperture has a value that is between 5, 8 and 6.2, preferably 6.
  • the microscope proposed by the first aspect of the invention due to the few components it includes and their arrangement, is very compact and allows the measurement of the wavefront in 3D microscopic samples. Its implementation requires minimal variation on the configuration of a conventional microscope. Therefore, it is easy to implement on conventional microscopes. Like Hartmann-Shack technology, this new microscope is based on the use of a matrix or ordered two-dimensional arrangement of lenses. However, the characteristics of lens arrays are very different.
  • the microscope proposed by the first aspect of the present invention uses lens arrays of large spacing (preferably at or around 1000 pm) and small relative aperture (preferably at or around f # « 6).
  • the microscope of the present invention allows obtaining results that are unattainable with the Hartmann-Shack technology, such as the measurement of smooth and non-smooth variations of the wavefront from biological samples, or obtaining 3D images with higher resolution than that provided by the microscope itself.
  • the light illumination means are configured to illuminate the sample with partially or totally coherent light, and, for a preferred embodiment, with a beam of light with a width such that, in the absence of a sample or for a transparent sample, the object wavefront will be completely flat and the acquisition in the capture space will be exclusively the light field given by a central lens of said ordered two-dimensional arrangement of lenses.
  • the computational entity is configured to perform the following double sampling in two reciprocal spaces:
  • a first sampling, or angular sampling in the space in which the ordered two-dimensional arrangement of lenses is found to obtain the angular information of the object wavefront, determining it, the computational entity, and with it its content of spatial frequencies, in a function of the position or positions in the capture space in which the image sensor receives and acquires said light emitted by the sample after passing through the microscope objective and the ordered two-dimensional arrangement of lenses;
  • each photodetector element, or pixel, of the image sensor meets the following constraint: where Dt is the pixel size, l the wavelength of the illumination beam with which the illumination means illuminate said sample, / m the focal length of the lenses of said ordered two-dimensional array of lenses, and r m the spacing between the centers of every two contiguous lenses of said lenses.
  • the computational entity is configured to, in order to perform the aforementioned computational reconstruction, interpret the aforementioned reconstruction space as a synthetic capture system in which an ordered two-dimensional arrangement of lenses is placed. spacing between the centers of every two contiguous lenses Ax / M, so that for each spatial sampling position l, the object wavefront o (x) is sampled locally, so that the intensity of the light received at each photodetector element or pixel I m , represents a measure of the angular composition of the object wavefront.
  • the computational entity is configured to, according to an embodiment, in order to carry out the aforementioned computational reconstruction, consider that in each subregion of the transposed space, that is, the reconstruction, a local sampling is carried out in plane waves of the front of object wave, where each pixel of a subregion of the transposed space corresponds to a direction of propagation of the plane waves that make up the object wavefront in said area.
  • the computational entity is also configured, according to an implementation of said embodiment, to determine, for a subregion given by the superscript /, the complex amplitude of the object wavefront according to the following expression: where / ⁇ knewis the intensity of the pixel corresponding to position m, n within subregion 1 and k mn is the direction vector of the plane wave that corresponds to the pixel located at position m, n.
  • the computational entity is configured to transfer the information contained by each pixel to a plane wave base in which each position of the pixel represents a propagation direction of the object wavefront, and, advantageously, to carry out the aforementioned computational reconstruction by adding, for each subregion of the transposed space, the contribution of the different angular components expressed in the plane wave base, to provide a grayscale image, where the resulting gray level represents a quantitative measure of the object wavefront.
  • the computational entity is operatively connected to an incoherent extensive light source and to the image sensor to control both, and is configured to perform a pre-calibration process (that is, before proceeding with measurements quantitative data of a sample), for the characterization and parameterization of the capture space, according to the following sequence:
  • a circle detection image processing algorithm to provide the following parameters: relative position and size of the lenses of the ordered two-dimensional array of lenses and number of pixels contained within the sub-regions delimited by each lens of the ordered two-dimensional array Of lenses.
  • the computational entity is configured to perform the aforementioned parameterization of the capture space, determining and granting the angular dimensions to the capture space by means of the parameters obtained during the calibration process, and depending on the pixel size of the sensor image, which is known to the computational entity.
  • the present invention also concerns, in a second aspect, a method for the computational reconstruction of the wavefront, which comprises performing the functions for which the computational entity of the microscope of the first aspect of the invention is configured, for any of its examples of realization. That is, all the functional characteristics described above after the expression "the computational entity is configured to" describe steps of the method of the second aspect of the present invention for corresponding embodiments.
  • the present invention concerns a computer program for the computational reconstruction of the wavefront, which includes program instructions that, when executed in a processor, implement the method of the second aspect.
  • the present invention concerns a computer program product that comprises a tangible medium on which the computer program of the third aspect is stored.
  • the microscope of the present invention due to the conditions thereof, the nature and effects of which will be described below, allows obtaining the results unattainable with the Hartmann-Shack technology indicated above.
  • the number of pixels of the reconstruction of the wavefront of the microscope of the present invention can be significantly higher than that of an HS since it is not linked to the size of the lenses (in this case the size of the lenses of the ordered two-dimensional arrangement is preferably of the order of mm, which is why they will be called mililents).
  • the number of pixels of the wavefront reconstruction is obtained by dividing the number of sensor pixels by the number of millilents. If, for example, for an exemplary embodiment, the microscope of the present invention consisted of 5 millilents in a transverse direction (for example the horizontal or x direction) and a 2,500 pixel sensor in said direction, the final reconstruction would have 500 pixels in that direction.
  • the spatial resolution is given by the transposition ratio.
  • N is the number of millilents in the corresponding sampling direction
  • r m is the size of the millilents
  • f oh (mm) 200 / M mic .
  • the microscope of the present invention makes it possible to measure, for the locally flat waves that make up the wave front, inclinations between 15 and 30 times greater than an HS.
  • the present invention represents a compact and low cost solution for the measurement of the scattered wavefront by microscopic samples. It represents a much more stable and simple system than those based on interference detection! while significantly improving spatial resolution compared to systems based on Hartmann-Shack detectors.
  • such a module which includes at least the ordered two-dimensional arrangement of lenses and the image sensor of the microscope of the first aspect of the present invention, as well as a support thereof and a tube.
  • optical-mechanical coupling device adapted to be coupled (optically and mechanically) to a camera port of a microscope.
  • a sixth aspect of the present invention concerns a microscope kit comprising the microscope module of the fifth aspect and an illumination module comprising the illumination means of the microscope of the first aspect of the present invention adapted to be coupled to a port of illumination of a microscope.
  • the present invention has potential application in various fields of science and technology. On the one hand, it represents a direct application in any field that requires quantitative information from microscopic samples in a non-invasive way, that is, without requiring a dye to observe the different structures that make up the sample. Therefore, its use in histology is of special interest. In the same way, it is possible to apply the present invention in metrology and in the study of MEMS systems (microelectromechanical systems), especially, the behavior of said systems as a function of the temperature given to the stability of the proposed measurement system with respect to it. .
  • MEMS systems microelectromechanical systems
  • Figure 1 shows a diagram of the microscope proposed by the first aspect of the present invention, for an embodiment.
  • Figure 2 shows the arrangement of the array or ordered two-dimensional arrangement of lenses of the microscope proposed by the first aspect of the invention, superimposed on the pupil of the objective thereof.
  • Figure 3 is a schematic illustration of the transposition relationship between the capture space and the reconstruction space, carried out by the computational entity of the microscope of the first aspect of the present invention, for an embodiment of the same and of the method of the second aspect of the invention.
  • Figure 4 shows a series of exemplary images of a proof-of-concept experiment using the microscope of the first aspect of the invention for the computational reconstruction of a sample made up of cotton fibers.
  • Figure 5 is a schematic representation of the capture, transposition and reconstruction carried out with the microscope of the first aspect of the present invention and according to the method of the second aspect of the invention, for an embodiment.
  • Figure 6 shows a flow chart with the operational steps to be followed by means of the microscope and method proposed by the present invention, for an embodiment.
  • Figure 7 schematically illustrates the microscope kit proposed by the sixth aspect of the present invention with two couplings, one to the camera port, for the module of the fifth aspect of the invention, and the other to the illumination port, for the media. lighting of a kit lighting module, of a conventional microscope.
  • the microscope proposed by the first aspect of the present invention comprises:
  • - lighting means formed by a light source 1, partially or totally coherent, to illuminate a sample T (illustrated schematically in Figure 5);
  • microscope objective 2 configured and arranged to receive and focus light scattered by the sample T when illuminated with the illumination means 1;
  • photodetector elements and
  • At least one computational entity (not illustrated) operatively connected to the image sensor 4 and which is configured and arranged to perform a computational reconstruction of the object wavefront from the spatial and angular information.
  • the spacing r m between the centers of each two contiguous lenses of the ordered two-dimensional array of lenses 3 is preferably at or around 1000 pm, and their relative aperture has a value of o around 6.
  • Figure 2 illustrates the arrangement of the array or ordered two-dimensional arrangement of lenses 3 of the microscope proposed by the first aspect of the invention, superimposed on the objective pupil thereof.
  • Each millilent is characterized by the position of its center with respect to the origin of coordinates.
  • the ideal configuration of the microscope fulfills the following conditions (other configurations can be used as long as the due alterations produced in the complex amplitude of the field when passing through the components of the microscope are taken into account):
  • the position of the matrix of millilents 3 corresponds to the position of the aperture diaphragm of the microscope objective 2 or to that of any intermediate image thereof.
  • the geometry in which the lenses are arranged in the matrix 3 determines the fill factor at the aperture diaphragm.
  • the two most common geometries in which the millilents are arranged are in a square matrix (the centers of the millilents are located at the nodes of a two-dimensional square network) or in a hexagonal network. However, any other geometry is also valid as long as the positions of the nodes of the network are known.
  • Light source 1 provides a uniform and collimated beam (or at least low divergence) on the microscopic sample T.
  • the width of beam B (see Figure 5) is such that, in the absence of sample, the image recorded by the sensor presents a uniform field in the area corresponding to the image plane of the central millilent and total absence of light in the rest, without there being any overlap between the areas corresponding to different millilents.
  • the pixelated sensor 4 is located on the image focal plane of the millilent matrix 3.
  • the information captured by the microscope proposed by the first aspect of the present invention represents a double sampling process in two reciprocal spaces, thus containing spatial and angular information simultaneously.
  • Dt is the size of the pixel
  • l the wavelength of the illumination beam with which the illumination means 1 illuminate the sample T
  • / m the focal length of the millilents
  • r m the spacing between the centers or nodes of each two contiguous millilents of the matrix 3.
  • / represents the / -th pixel of the sensor
  • the function h () represents the 2D impulse response of the microscope objective (typically an Airy disk) and m ( ⁇ ) that of the millilent matrix (typically a matrix of Airy discs, in the case of mililents with a circular aperture). These impulse responses are determined by wave diffraction and are functionally proportional to the Fourier transform of the corresponding aperture.
  • the function o () represents the amplitude distribution of the wavefront to be measured
  • M - the lateral magnification of the microscope, f or b the focal length of the microscope objective, and L the number of pixels in the sensor.
  • the rect () function is a binary function that is worth 1 inside a rectangle and 0 outside it
  • S () the Dirac delta function is a binary function that is worth 1 inside a rectangle and 0 outside it.
  • This expression shows the existence in the microscope and method of the present invention, of a double sampling of the complex distribution of amplitudes of the object, or (), limited in resolution by diffraction like any optical system free of aberrations.
  • a new reconstruction software is proposed, to be implemented by the computational entity and by the method of the second aspect of the invention, the first task of which is to detect the positions of the images provided by the matrix of millilents 3 in the plane of the image sensor 4. These positions define different regions of the frequency content that make up the spectrum of the object.
  • the mililent spacing defines the periodicity of the frequency sampling.
  • the pixelated sensor performs a second sampling but now on the spatial content. Since this sampling and the previous one are carried out in reciprocal spaces, it is possible to carry out a transposition, duly scaled, of any of them to place both information in the same space.
  • Said transposition can be understood as follows: - The sensor samples the spatial information with periodicity Dt. However, said sampling is carried out on a field previously sampled by the matrix of millilents 3 in its reciprocal space, with a periodicity r m .
  • the product spatial resolution x bandwidth also known in the scientific literature as space-bandwidth product (SBP) determines the amount of information captured by an optical system.
  • the matrix of millilents 3 is the limiting element, therefore the SBP is given by N r m , where N is the total number of millilents that fit within the pupil of the objective and that therefore provide images on the sensor Image 4.
  • the reconstruction space Er (whose transposed space is the capture space) which is located virtually on the object or capture space Ec (see Figures 3 and 5).
  • This consists of UN regions, whose position is given by the periodicity of the new spatial sampling. Within each region, a total of N angles are sampled with a precision that depends on the periodicity of the angular sampling in the reconstruction space Er, as illustrated in Figure 3, where the transposition relationship between the capture space is illustrated. Ec and the reconstruction space Er.
  • Said space can be interpreted as a synthetic capture system in which microlenses with Ax / M spacing are placed directly on the plane in which the sample is located.
  • the object wavefront o (x) is sampled locally, so that the intensity of each pixel I, m represents a measure of the angular composition of the object wavefront.
  • the object wavefront is interpreted as a superposition of plane waves, the sum of the local measurements for each spatial sampling region /, duly scaled with the intensity and the corresponding angular component, represents a sampled version of said wavefront:
  • the precision in the measurement of the angular components of the wavefront depends on the size and number of millilents in the capture space.
  • each Sr subregion of the transposed or reconstruction space Er performs local sampling in plane waves of the object wavefront.
  • Each pixel of a subregion Sr of the transposed space Er corresponds to a direction of propagation of the plane waves that make up the object wavefront in said area.
  • the complex amplitude of the object wavefront is given by: where i m ' n is the intensity of the pixel corresponding to position m, n within the Sr subregion and k m is the direction vector of the plane wave that corresponds to the pixel located at position m, n.
  • each Sr subregion will have only one component, given by element k 00 .
  • Said element corresponds to a plane wave traveling in the direction of the optical axis. In this way, from all Sr subregions, a totally flat wavefront would be composed, which is the one corresponding to sample T.
  • Figure 6 shows a flow chart showing the steps of the method proposed by the second aspect of the present invention, or in other words, the functions for which the computational entity of the microscope of the first aspect of the invention is configured , for an example of embodiment, which are described below in correspondence with the legends included in each block.
  • CALIBRATION Calibration is a necessary process in the characterization and parameterization of the capture space Eq. For the same assembly, this process will need to be carried out only once. To do this, the object space is illuminated with an incoherent large source, so that all the lenses in matrix 3 are illuminated. Once this is done, the image obtained is saved and a circle detection image processing algorithm is applied. This algorithm provides all the necessary parameters: relative position and size of the lenses, as well as the number of pixels contained within the subregions delimited by each lens.
  • TRANSPOSITION TO THE RECONSTRUCTION SPACE A transposition is applied to the capture space E), using the data of the parameterization. With them, an Er reconstruction space is obtained formed by a series of Sr subregions in which each pixel represents an angular direction of propagation of the wavefront.
  • MEASUREMENT OF THE ANGULAR COMPONENTS FOR EACH SUBREGION The information contained by each pixel is transferred to a plane wave base in which each position of the pixel represents a propagation direction of the wave front.
  • WAVE FRONT RECONSTRUCTION For each subregion, the contribution of the different angular components expressed in a plane wave base is added. The resulting gray level represents a quantitative measure of the wavefront.
  • Figure 7 schematically illustrates the microscope kit proposed by the sixth aspect of the present invention, which includes the module of the fifth aspect coupled to the camera port of a commercial microscope that includes a respective ocular ocular, objective Ob , tube lens Z and flip-up mirror R, as well as an illumination module including illumination means coupled to the illumination port of the microscope.
  • the kit adaptable to a commercial microscope consists of two parts indicated in the scheme of Figure 7 by a broken line:
  • Lighting module It is required to adapt a lighting means, generally a laser and a set of lenses that produce the lighting described in this document to the lighting port.
  • the lens matrix 3, the sensor 4 and an auxiliary lens 2 are adapted to the port of the microscope camera in such a way that the field collected by sensor 4 has the characteristics defined in the invention.
  • the main advantage of the microscope proposed by the present invention is that because the physical capture is carried out in the transposed space, the resolution of the synthetic microlenses of the Er reconstruction space is not limited by diffraction but by the spacing between the camera pixels or image sensor 4. This fact allows to provide a quantitative measurement of phases with an unprecedented lateral resolution.

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Abstract

La presente invención concierne a un microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, que comprende: medios para iluminar una muestra (T); un objetivo (2); una disposición bidimensional ordenada de lentes (3) con un espaciado p μ superior a 500 pm y una apertura relativa inferior a 10; un sensor de imagen (4) situado en un espacio de captura (Ec) para recibir la luz dispersada por la muestra (T), y adquirir información espacial e información angular del frente de onda objeto asociado a la misma; y una entidad computacional para realizar una reconstrucción computacional del frente de onda objeto a partir de las informaciones espacial y angular. Otros aspectos de la invención conciernen a un método, un programa de ordenador y un producto que lo incluye, adaptados para realizar las funciones de la entidad computacional del microscopio, así como a un módulo y un kit para microscopio.

Description

Microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, módulo y kit para microscopio, método y programa de ordenador para la reconstrucción
computacional del frente de onda
Sector de la técnica La presente invención concierne, en un primer aspecto, a un microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, que comprende una disposición bidimensional ordenada de lentes diseñada de manera tal que permite la medición de variaciones suaves y no suaves del frente de ondas procedente de muestras biológicas, o la obtención de imágenes 3D de gran resolución, incluyendo la de muestras microscópicas. Un segundo aspecto de la presente invención concierne a un método para la reconstrucción computacional del frente de onda, adaptado para realizar las funciones para las cuales la entidad computacional del microscopio está configurada.
En un tercer aspecto, la presente invención concierne a un programa de ordenador para la reconstrucción computacional del frente de onda, que incluye instrucciones de programa que cuando se ejecutan en un procesador implementan el método del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención concierne a un producto de programa de ordenador que comprende un medio tangible en el que se encuentra almacenado el programa de ordenador del tercer aspecto. Un quinto aspecto de la presente invención concierne a un módulo para microscopio, para acoplarse a un puerto de cámara de un microscopio con el fin de construir el microscopio del primer aspecto de la presente invención.
Un sexto aspecto de la presente invención concierne a un kit para microscopio, que comprende al módulo del quinto aspecto y a un módulo de iluminación acoplable a un puerto de iluminación de un microscopio.
Estado de la técnica anterior
La reconstrucción computacional del frente de ondas es un problema de especial interés en microscopía óptica ya que proporciona información del campo luminoso emitido por muestras 3D, es decir medidas cuantitativas del frente de ondas. En la actualidad este tipo de reconstrucción es proporcionado por dos tipos de microscopios: 1) Microscopios basados en la detección interferencia! del frente de ondas mediante un proceso holográfico. Este tipo de sistemas presenta la desventaja de su baja estabilidad y de obtener únicamente información monocular.
2) Microscopios de estructura similar a los sensores de frente de onda basados en el principio de Hartmann-Shack (H-S). Es decir, aquellos que incluyen las características definidas en el preámbulo de la reivindicación 1 de la presente invención. Tal es el caso de los descritos en las siguientes patentes: US9726875B2, US9658443B2,
US9679360B2 y US997691 1 B2.
En tales patentes se proponen distintas técnicas enfocadas en obtener una resolución espacial que sea, en US9726875B2, al menos aceptable para obtener una buena aproximación de los campos de luz reales, que sea, en US9658443B2, incrementada pero limitada por el límite de difracción, que sea, en US9679360B2, mejorada al obtener una imagen compuesta que combine una imagen de intensidad espacial con una de campo de luz, o que sea, en US9976911 B2, buena pero sin afectar negativamente a la resolución angular, es decir que se cumpla un compromiso entre resolución espacial y angular.
Si bien cada una de las propuestas hechas en tales patentes consigue en cierto grado mejorar la resolución espacial de los microscopios propuestos en las mismas, tal mejora es claramente mejorable, ya que la mejora en resolución espacial conseguida tiene las limitaciones de los sistemas basados en sensores de Hartmann-Shack, los cuales están limitados en resolución por el número de microlentes (independientemente de la resolución espacial del sensor pixelado). Debido a ello, para optimizar un sensor H-S se debe emplear el mayor número de microlentes posible, cuyo tamaño, consecuentemente, se debe reducir al mínimo. Sin embargo, existen dos limitaciones principales en dicho proceso:
1) El tamaño del spot de difracción: Al iluminar una microlente con una onda localmente plana, sobre el sensor (situado en el plano focal imagen de la microlente) se focaliza la luz en forma de un spot de difracción. La posición de este spot con respecto al centro de la microlente se puede relacionar con el ángulo de inclinación de la onda localmente plana. El diámetro del spot, 0d¿ , para una determinada longitud de onda de iluminación, l, está relacionado con el diámetro, d, y la focal de cada microlente, /, mediante la siguiente fórmula: donde
Figure imgf000005_0001
Por otro lado, para poder muestrear de forma efectiva el spot de difracción a fin de calcular su centroide y, con ello, el desplazamiento relativo del mismo, dicho spot debe ocupar al menos 4 pixeles según el criterio de Nyquist. En este caso, un tamaño de 4 pixeles es el valor óptimo ya que dicho valor permite muestrear el spot de forma efectiva con el sensor y, a su vez, permite optimizar el número de ángulos de frente de onda determinado por el desplazamiento del stop,
Figure imgf000005_0002
Se puede ver la limitación que esto supone al introducir valores típicos en la Ec. (3). Para el caso de un sensor con un tamaño de pixel de Dc = 6 mth, una longitud de onda de l = 0.5 mth, y tomando un valor típico de tamaño de microlente, d = 100 mth, la focal que optimizaría el sensor, de acuerdo con la Ec. (3), es / = 2.5 mm. Por lo tanto, las microlentes deben situarse en este caso a 2.5 mm del sensor. Si se redujese el tamaño de las microlentes, dicho valor se reduciría en la misma proporción, pero esto es posible desde un punto de vista práctico, ya que dicho valor de distancia focal se encuentra muy cercano al límite práctico tanto de fabricación como de alineamiento
A partir de estos cálculos es fácil entender por qué típicamente se emplea un valor de d = 150 mm como diámetro de las microlentes y distancia focal de aproximadamente / = 6 mm en los modelos comerciales. Dicho diámetro determina directamente la resolución espacial del sistema. Además, dicho tamaño limita el número de pixeles en los cuales se muestrea el frente de onda para un determinado tamaño de sensor. Típicamente, en los H-S comerciales el número de microlentes, y por tanto el número de pixeles de la reconstrucción varía entre 20x20 y 100x100 (que corresponden a sensores pixelados cuyo tamaño total está comprendido en el rango entre 3.0 x 3.0 mm y, en casos extremos, 15.0 x 15.0 mm). 2) Resolución angular.
Para cada onda localmente plana, el ángulo máximo que se puede muestrear está relacionado con el máximo desplazamiento del spot dentro de su región. Dado que las microlentes crean barreras ópticas, dicho desplazamiento se corresponde con la mitad del tamaño de las microlentes,
Figure imgf000006_0001
Por tanto, si se usaran microlentes de d = 150 mhi y f = 6 mm, el ángulo máximo mesurable del frente de onda incidente sería 0max = 0.7 ° . Es por ello que, normalmente, los sensores H-S se emplean para medir variaciones suaves del frente de onda y su uso para medir la luz dispersada en muestras biológicas es ciertamente limitado.
El razonamiento anterior demuestra por qué en el mejor de los casos los H-S comerciales no miden inclinaciones de las ondas localmente planas superiores a 0max = 1.0 °
Por otra parte, los mecanismos propuestos en las patentes mencionadas anteriormente basados en el principio de Hartmann-Shack tienen cierta complejidad, por lo que también sería interesante proponer mecanismos alternativos más simples.
Aparece, por tanto, necesario ofrecer una alternativa al estado de la técnica que cubra las lagunas hallada en el mismo, mediante la provisión de un microscopio que, como las patentes arriba citadas, sea estructuralmente similar a los basados en el principio de Hartmann-Shack pero que ofrezca unos resultados en cuanto a resolución espacial mucho mejores que los proporcionados por los microscopios del estado de la técnica basados en tal principio, así como una simplificación del mismo, y que, asimismo, ofrezca una mayor estabilidad y robustez que los basados en procedimientos interferenciales, e información no únicamente monocular. Explicación de la invención
Con tal fin, la presente invención concierne, en un primer aspecto, a un microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, que comprende, de manera en sí conocida:
- medios de iluminación para iluminar una muestra;
- un objetivo de microscopio configurado y dispuesto para recibir y enfocar luz dispersada por la muestra al ser iluminada con dichos medios de iluminación;
- una disposición bidimensional ordenada de lentes situada en el diafragma de apertura de dicho objetivo de microscopio o en la ubicación de una imagen intermedia del mismo;
- un sensor de imagen formado por una pluralidad de elementos fotodetectores, que está situado en un espacio de captura sobre el plano focal de la disposición bidimensional ordenada de lentes para recibir dicha luz dispersada por la muestra tras atravesar dicho objetivo de microscopio y dicha disposición bidimensional ordenada de lentes, y adquirir información espacial e información angular del frente de onda objeto asociado a dicha luz proveniente de dicha muestra, quedando enfrentados a cada lente varios de dichos elementos fotodetectores; y
- al menos una entidad computacional conectada operativamente con dicho sensor de imagen y que está configurada y dispuesta para realizar una reconstrucción computacional de dicho frente de onda objeto a partir de dichas informaciones espacial y angular.
A diferencia de los microscopios conocidos en el estado de la técnica, en el propuesto por el primer aspecto de la presente invención el espaciado rm entre los centros de cada dos lentes contiguas de la disposición bidimensional ordenada de lentes es superior a 500 pm y su apertura relativa es inferior a 10.
De acuerdo a un ejemplo de realización, el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de la disposición bidimensional ordenada de lentes tiene un valor que está entre 900 pm y 1100 pm, y su apertura relativa tiene un valor que está entre 5 y 7.
Para un ejemplo de realización preferido, el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes tiene un valor entre 990 pm y 1010 pm, preferentemente 1000 pm, y su apertura relativa tiene un valor que está entre 5,8 y 6,2, preferentemente 6.
El microscopio propuesto por el primer aspecto de la invención, por los pocos componentes que incluye y la disposición de los mismos, resulta muy compacto y permite la medición del frente de onda en muestras microscópicas 3D. Su implementación requiere una variación mínima sobre la configuración de un microscopio convencional. Por tanto, es fácil de implementar sobre microscopios convencionales. Al igual que la tecnología Hartmann-Shack este nuevo microscopio está basado en la utilización de una matriz o disposición bidimensional ordenada de lentes. Sin embargo las características de las matrices de lentes son muy distintas. Mientras que los dispositivos de Hartmann- Shack utilizan microlentes de espaciado pequeño (en torno a las 100 pm) y apertura relativa (o“f-number” en inglés) grande (en torno a f# « 25), tal y como se ha indicado arriba, el microscopio propuesto por el primer aspecto de la presente invención utiliza matrices de lentes de espaciado grande (preferentemente de o en torno a 1000 pm) y apertura relativa pequeña (preferentemente de o alrededor de f# « 6). El microscopio de la presente invención permite obtener resultados inalcanzables con la tecnología Hartmann-Shack, como la medición de variaciones suaves y no suaves del frente de ondas procedente de muestras biológicas, o la obtención imágenes 3D con mayor resolución que la proporcionada por el propio microscopio huésped en que se puede implementar el propuesto por el primer aspecto de la presente invención, para un ejemplo de realización gracias a las condiciones específicas de espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de la disposición bidimensional ordenada de lentes, y su apertura relativa, que difieren significativamente de las condiciones habituales utilizadas en el estado de la técnica.
Diferentes tipos de geometría para la disposición bidimensional ordenada de lentes son válidos y están cubiertos por el microscopio del primer aspecto de la presente invención, aunque preferentemente ésta sigue una geometría de red hexagonal o una geometría de matriz cuadrada.
Ventajosamente, los medios de iluminación luz están configurados para iluminar la muestra con luz parcial o totalmente coherente, y, para un ejemplo de realización preferido, con una haz de luz con un ancho tal que, en ausencia de muestra o para una muestra transparente, el frente de onda objeto será completamente plano y la adquisición en el espacio de captura será exclusivamente el campo de luz dado por una lente central de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes.
De acuerdo a un ejemplo de realización, que se beneficia de la particular disposición bidimensional ordenada de lentes, en especial de su espaciado rm y su apertura relativa, la entidad computacional (o entidades computacionales) está configurada para realizar el siguiente doble muestreo en dos espacios recíprocos:
- un primer muestreo, o muestreo angular, en el espacio en el que se encuentra la disposición bidimensional ordenada de lentes para obtener la información angular del frente de onda objeto, determinándola, la entidad computacional, y con ella su contenido de frecuencias espaciales, en función de la posición o posiciones en el espacio de captura en que el sensor de imagen recibe y adquiere dicha luz emitida por la muestra tras atravesar el objetivo de microscopio y la disposición bidimensional ordenada de lentes; y
- un segundo muestreo, o muestreo espacial, en el espacio de captura para obtener la información espacial a partir de la intensidad recibida por cada elemento fotodetector, o píxel, del sensor de imagen.
En general, cada elemento fotodetector, o píxel, del sensor de imagen cumple la siguiente restricción: donde Dt es el tamaño del píxel, l la longitud de onda del haz de iluminación con el que los medios de iluminación iluminan dicha muestra, /m la distancia focal de las lentes de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes y rm el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de dichas lentes.
Según un ejemplo de realización, la entidad computacional está configurada para realizar una transposición de uno de los dos espacios recíprocos para situar a ambas informaciones, la espacial y la angular, en el mismo espacio, o espacio de reconstrucción, situado virtualmente sobre el espacio objeto, donde dicho espacio de reconstrucción consta de UN regiones, donde L es el número de elemento fotodetectores, o píxeles, del sensor de imagen y N es el número de lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes, de manera que se realiza un único muestreo local de ondas planas del frente de onda objeto que incluye al mencionado muestreo espacial con una periodo de Ax/M donde M = - f^/ y Ab es la distancia focal del objetivo de microscopio, y al citado muestreo angular con un periodo de p^/L·.
Para una implementación de dicho ejemplo de realización, la entidad computacional está configurada para, con el fin de realizar la citada reconstrucción computacional, interpretar el mencionado espacio de reconstrucción como un sistema de captura sintético en el cual se coloca una disposición bidimensional ordenada de lentes de espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas Ax/M, de manera que para cada posición de muestreo espacial l, el frente de onda objeto o(x) se muestrea localmente, de forma que la intensidad de la luz recibida en cada elemento fotodetector o píxel I¡m, representa una medida de la composición angular del frente de onda objeto.
La entidad computacional está configurada para, de acuerdo a un ejemplo de realización, con el fin de realizar la mencionada reconstrucción computacional, considerar que en cada subregión del espacio traspuesto, es decir el reconstrucción, se realiza un muestreo local en ondas planas del frente de onda objeto, donde cada píxel de una subregión del espacio traspuesto se corresponde con una dirección de propagación de las ondas planas que componen el frente de onda objeto en dicha zona. Asimismo, la entidad computacional también está configurada, de acuerdo a una implementación de dicho ejemplo de realización, para determinar, para una subregión dada por el superíndice /, la amplitud compleja del frente de onda objeto según la siguiente expresión: donde /^„es la intensidad del píxel correspondiente a la posición m,n dentro de la subregión 1 y kmn el vector de dirección de la onda plana que se corresponde con el píxel situado en la posición m,n.
De acuerdo a un ejemplo de realización, la entidad computacional está configurada para transferir la información contenida por cada píxel a una base de ondas planas en la que cada posición del píxel representa una dirección de propagación del frente de onda objeto, y, ventajosamente, para llevar a cabo la mencionada reconstrucción computacional sumando, para cada subregión del espacio traspuesto, la contribución de las distintas componentes angulares expresadas en la base de ondas planas, para proporcionar una imagen de escala de grises, donde el nivel de gris resultante representa una medida cuantitativa del frente de onda objeto.
Para un ejemplo de realización, la entidad computacional está conectada operativamente con una fuente de luz extensa incoherente y con el sensor de imagen para controlarlos a ambos, y está configurada para realizar un proceso de calibrado previo (es decir antes de proceder a realizar las medidas cuantitativas de una muestra), para la caracterización y parametrización del espacio de captura, según la siguiente secuencia:
- controlando a la fuente extensa incoherente para iluminar el espacio objeto de forma que todas las lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes queden iluminadas,
- controlando al sensor de imagen para adquirir, bajo dicha iluminación extensa incoherente, una imagen de la muestra, y
- aplicando un algoritmo de procesado de imagen de detección de círculos para proporcionar los siguientes parámetros: posición relativa y tamaño de las lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes y número de píxeles contenido dentro de las subregiones delimitadas por cada lente de la disposición bidimensional ordenada de lentes.
Según un ejemplo de realización, la entidad computacional está configurada para realizar la citada parametrización del espacio de captura, determinando y otorgando las dimensiones angulares al espacio de captura mediante los parámetros obtenidos durante el proceso de calibrado, y en función del tamaño de píxel del sensor de imagen, el cual es conocido por la entidad computacional. La presente invención también concierne, en un segundo aspecto, a un método para la reconstrucción computacional del frente de onda, que comprende realizar las funciones para las cuales la entidad computacional del microscopio del primer aspecto de la invención está configurada, para cualquiera de sus ejemplos de realización. Es decir, que todas las características funcionales descritas anteriormente tras las expresión“la entidad computacional está configurada para” describen etapas del método del segundo aspecto de la presente invención para correspondientes ejemplos de realización.
En un tercer aspecto, la presente invención concierne a un programa de ordenador para la reconstrucción computacional del frente de onda, que incluye instrucciones de programa que cuando se ejecutan en un procesador implementan el método del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención concierne a un producto de programa de ordenador que comprende un medio tangible en el que se encuentra almacenado el programa de ordenador del tercer aspecto.
El microscopio de la presente invención, debido a las condiciones del mismo, cuya naturaleza y efectos se describirás a continuación, permite obtener los resultados inalcanzables con la tecnología Hartmann-Shack indicados arriba.
Por un lado, el número de píxeles de la reconstrucción del frente de ondas del microscopio de la presente invención puede ser significativamente mayor al de un H-S ya que no está ligado al tamaño de las lentes (en este caso el tamaño de las lentes de la disposición bidimensional ordenada es preferentemente del orden del mm, razón por la que se denominarán mililentes). En el microscopio de la presente invención, el número de píxeles de la reconstrucción del frente de onda se obtiene de dividir el número de píxeles del sensor entre el número de mililentes. Si, por ejemplo, para un ejemplo de realización, el microscopio de la presente invención constase de 5 mililentes en una dirección transversal (por ejemplo la horizontal o dirección x) y un sensor de 2.500 píxeles en dicha dirección, la reconstrucción final tendría 500 píxeles en dicha dirección. Si se quisiese tener un sensor H-S con el mismo número píxeles, para un tamaño típico de sensor de unos 6.0 x 6.0 mm, sería necesario tener microlentes de d = 12 mm. Como se explicó en el apartado anterior, dicho tamaño se encuentra muy lejos del límite práctico.
Hay que tener en cuenta que en el microscopio de la presente invención la resolución espacial viene dada por la relación de transposición. Para el caso de un microscopio de aumento moderado, por ejemplo Mmic = 10 (los microscopios científicos operan con aumentos de hasta Mmic = 100), la resolución espacial del sistema si se considera un tamaño de píxel de Dc = 6 mth sería de 0,6 mth. Es decir, dicho sistema mejora la resolución espacial en 3 órdenes de magnitud con respecto a un sensor H-S típico (cuya resolución, recordemos la determina el tamaño de las microlentes, y por tanto es del orden de 100 a 150 mhί).
Por otro lado, el máximo ángulo de las ondas planas muestreable por el microscopio de la presente invención viene dado por
Figure imgf000012_0001
donde N es el número de mililentes en la correspondiente dirección de muestreo, rm es el tamaño de las mililentes, y foh(mm ) = 200 /Mmic. Considerando valores típicos, por ejemplo rm = 1 mm, fob = 12 mm y N = 5, el ángulo máximo que se podría muestrear sería de 6max = 15°. Por tanto, el microscopio de la presente invención permite medir, para las ondas localmente planas que componen el frente de ondas, inclinaciones entre 15 y 30 veces mayores que un H-S.
La presente invención representa una solución compacta y de bajo coste para la medición del frente de onda dispersado por muestras microscópicas. Representa un sistema mucho más estable y sencillo que aquellos basados en la detección interferencia! al tiempo que mejora notablemente la resolución espacial con respecto a sistemas basados en detectores Hartmann-Shack.
Debido a que requiere la incorporación de pocos elementos ópticos con respecto a un microscopio convencional, su desarrollo en forma de módulo adaptable a un microscopio comercial es relativamente sencillo.
Se propone, por tanto, en un quinto aspecto, tal módulo, el cual incluye al menos la disposición bidimensional ordenada de lentes y el sensor de imagen del microscopio del primer aspecto de la presente invención, así como un soporte de los mismos y un tubo de acople óptico-mecánico adaptado para acoplarse (óptica y mecánicamente) a un puerto de cámara de un microscopio.
Un sexto aspecto de la presente invención concierne a un kit para microscopio que comprende el módulo para microscopio del quinto aspecto y un módulo de iluminación que comprende a los medios de iluminación del microscopio del primer aspecto de la presente invención adaptados para acoplarse a un puerto de iluminación de un microscopio. La presente invención tiene una aplicación potencial en diversos campos de la ciencia y la tecnología. Por un lado, representa una aplicación directa en cualquier campo que requiera información cuantitativa de muestras microscópicas de forma no invasiva, es decir, sin requerir un tinte para observar las distintas estructuras que componen la muestra. Por ello, es de especial interés su uso en histología. Del mismo modo, es posible aplicar la presente invención en metrología y en el estudio de sistemas MEMS (sistemas microelectromecánicos), en especial, el comportamiento de dichos sistemas en función de la temperatura dada a la estabilidad del sistema de medida propuesto con respecto a ésta.
Breve descripción de los dibujos
Las anteriores y otras ventajas y características se comprenderán más plenamente a partir de la siguiente descripción detallada de unos ejemplos de realización con referencia a los dibujos adjuntos, que deben tomarse a título ilustrativo y no limitativo, en los que:
La Figura 1 muestra un esquema del microscopio propuesto por el primer aspecto de la presente invención, para un ejemplo de realización.
La Figura 2 muestra la disposición de la matriz o disposición bidimensional ordenada de lentes del microscopio propuesto por el primer aspecto de la invención, superpuesta sobre la pupila del objetivo del mismo.
La Figura 3 es una Ilustración esquemática de la relación de trasposición entre el espacio de captura y el espacio de reconstrucción, llevada a cabo por la entidad computacional del microscopio del primer aspecto de la presente invención, para un ejemplo de realización del mismo y del método del segundo aspecto de la invención.
La Figura 4 muestra una serie de imágenes a modo de ejemplo de un experimento de prueba de concepto de utilización del microscopio del primer aspecto de la invención para la reconstrucción computacional de una muestra formada por unas fibras de algodón.
La Figura 5 es una representación esquemática de la captura, transposición y reconstrucción llevadas a cabo con el microscopio del primer aspecto de la presente invención y según el método del segundo aspecto de la invención, para un ejemplo de realización.
La Figura 6 muestra un diagrama de flujo con las etapas operativas a seguir mediante el microscopio y método propuestos por la presente invención, para un ejemplo de realización. La Figura 7 ilustra de manera esquemática al kit para microscopio propuesto por el sexto aspecto de la presente invención con dos acoples, uno al puerto de cámara, para el módulo del quinto aspecto de la invención, y otro al puerto de iluminación, para los medios de iluminación de un módulo de iluminación del kit, de un microscopio convencional.
Descripción detallada de unos ejemplos de realización
Según se ilustra en la Figura 1 de manera esquemática, para su realización más básica, el microscopio propuesto por el primer aspecto de la presente invención comprende:
- medios de iluminación formados por una fuente de luz 1 , parcial o totalmente coherente, para iluminar una muestra T (ilustrada de manera esquemática en la Figura 5);
- un objetivo de microscopio 2 configurado y dispuesto para recibir y enfocar luz dispersada por la muestra T al ser iluminada con los medios de iluminación 1 ;
- una disposición bidimensional ordenada de lentes 3 situada en el diafragma de apertura del objetivo de microscopio 2 o en la ubicación de una imagen intermedia del mismo;
- un sensor de imagen 4, o sensor pixelado, formado por una pluralidad de elementos fotodetectores o píxeles, que está situado en un espacio de captura sobre el plano focal de la disposición bidimensional ordenada de lentes o matriz de lentes 3 para recibir la luz dispersada por la muestra T tras atravesar el objetivo de microscopio 2 y la disposición bidimensional ordenada de lentes 3, y adquirir información espacial e información angular del frente de onda objeto asociado a la luz proveniente de la muestra T, quedando enfrentados a cada lente varios de los elementos fotodetectores; y
- al menos una entidad computacional (no ilustrada) conectada operativamente con el sensor de imagen 4 y que está configurada y dispuesta para realizar una reconstrucción computacional del frente de onda objeto a partir de las informaciones espacial y angular.
Tal y como se ha indicado en un apartado anterior, el espaciado rm entre los centros de cada dos lentes contiguas de la disposición bidimensional ordenada de lentes 3 es preferentemente de o en torno a 1000 pm, y su apertura relativa tiene un valor de o alrededor de 6.
En la Figura 2 se ilustra la disposición de la matriz o disposición bidimensional ordenada de lentes 3 del microscopio propuesto por el primer aspecto de la invención, superpuesta sobre la pupila del objetivo del mismo. Cada mililente está caracterizada por la posición de su centro con respecto al origen de coordenadas. La configuración ideal del microscopio cumple las siguientes condiciones (otras configuraciones pueden ser empleadas siempre que se tengan en cuenta las debidas alteraciones producidas en la amplitud compleja del campo al atravesar los componentes del microscopio):
1) La posición de la matriz de mililentes 3 se corresponde con la posición del diafragma de apertura del objetivo de microscopio 2 o bien con la de cualquier imagen intermedia del mismo.
2) La geometría en la cual se disponen las lentes en la matriz 3 determina el factor de llenado en el diafragma de apertura. La dos geometrías más comunes en que se disponen las mililentes son en matriz cuadrada (los centros de las mililentes se sitúan en los nodos de una red cuadrada bidimensional) o en red hexagonal. Sin embargo, cualquier otra geometría es también válida siempre que las posiciones de los nodos de la red sean conocidas.
3) La fuente de luz 1 proporciona un haz uniforme y colimado (o al menos de baja divergencia) sobre la muestra microscópica T. El ancho del haz B (ver Figura 5) es tal que, en ausencia de muestra, la imagen registrada por el sensor presenta un campo uniforme en la zona correspondiente al plano imagen de la mililente central y ausencia total de luz en el resto, sin que exista solapamiento entre las áreas correspondientes a distintas mililentes.
4) El sensor pixelado 4 se sitúa sobre el plano focal imagen de la matriz de mililentes 3.
Bajo estas condiciones, la información capturada por el microscopio propuesto por el primer aspecto de la presente invención representa un proceso de doble muestreo en dos espacios recíprocos, conteniendo así información espacial y angular de forma simultánea. La existencia de una relación de transformación de Fourier entre la información espacial y la angular, da lugar a la siguiente restricción sobre el tamaño del píxel:
Figure imgf000015_0001
donde Dt es el tamaño del píxel, l la longitud de onda del haz de iluminación con el que los medios de iluminación 1 iluminan la muestra T, /m la distancia focal de las mililentes y rm el espaciado entre los centros o nodos de cada dos mililentes contiguas de la matriz 3. La distribución de intensidades del campo detectado por el sensor se puede expresar matemáticamente como:
Figure imgf000016_0001
En esta ecuación, / representa el píxel / -ésimo del sensor, la función h( ) representa la respuesta impulsional 2D del objetivo de microscopio (típicamente un disco de Airy) y m(· ) la de la matriz de mililentes (típicamente una matriz de discos de Airy, en el caso de mililentes con abertura circular). Estas respuestas impulsionales están determinadas por la difracción de ondas y funcionalmente son proporcionales a la transformada de Fourier de la apertura correspondiente. Además, la función o( ) representa la distribución de amplitudes del frente de ondas a medir, M = -
Figure imgf000016_0002
el aumento lateral del microscopio, fob la distancia focal del objetivo de microscopio, y L el número de píxeles del sensor. Por último la función rect( ) es una función binaria que vale 1 en el interior de un rectángulo y 0 fuera del mismo, y S( ) la función delta de Dirac.
Esta expresión pone de manifiesto la existencia en el microscopio y método de la presente invención, de un doble muestreo de la distribución compleja de amplitudes del objeto, o( ), limitada en resolución por la difracción como cualquier sistema óptico libre de aberraciones.
En combinación con la particular configuración y disposición de los componentes del microscopio del primer aspecto de la presente invención, y con base a los mismos, se propone un nuevo software de reconstrucción, a implementar por la entidad computacional y por el método del segundo aspecto de la invención, cuya primera tarea consiste en detectar las posiciones de las imágenes proporcionadas por la matriz de mililentes 3 en el plano del sensor de imagen 4. Estas posiciones definen distintas regiones del contenido frecuencial que compone el espectro del objeto. El espaciado entre mililentes define la periodicidad del muestreo de frecuencial.
Por otro lado, el sensor pixelado realiza un segundo muestreo pero ahora sobre el contenido espacial. Dado que este muestreo y el anterior se realizan en espacios recíprocos, es posible realizar una trasposición, debidamente escalada, de cualquiera de ellos para situar ambas informaciones en el mismo espacio. Dicha trasposición puede entenderse de la siguiente forma: - El sensor muestrea con periodicidad Dt la información espacial. Sin embargo, dicho muestreo se realiza sobre un campo previamente muestreado por la matriz de mililentes 3 en su espacio recíproco, con una periodicidad rm. El producto resolución espacial x ancho de banda (también conocido en la literatura científica como space-bandwidth product (SBP)) determina la cantidad de información capturada por un sistema óptico. En la presente invención, la matriz de mililentes 3 es el elemento limitante, por tanto el SBP viene dado por N rm, siendo N el número total de mililentes que caben dentro de la pupila del objetivo y que por tanto proporcionan imágenes sobre el sensor de imagen 4.
- La transposición de la información espacio-angular capturada con el microscopio propuesto da lugar a una nueva expresión de esta información en la que se produce un intercambio de periodicidad de los muéstreos, de forma que la nueva matriz pixelada representa un muestreo local de ondas planas del frente de onda dispersado por el objeto. Ahora el periodo del muestreo espacial es Ax/M y el del muestreo angular es p^/L··
De esta forma, se define el que se denominará espacio de reconstrucción Er (cuyo espacio traspuesto es el de captura) el cual se sitúa virtualmente sobre el espacio objeto o de captura Ec (ver Figuras 3 y 5). Éste consta de UN regiones, cuya posición viene dada por la periodicidad del nuevo muestreo espacial. Dentro de cada región, se muestrea un total de N ángulos con una precisión que depende de la periodicidad del muestreo angular en el espacio de reconstrucción Er, según se ilustra en la Figura 3, donde se ilustra la relación de trasposición entre el espacio de captura Ec y el espacio de reconstrucción Er.
Dicho espacio puede interpretarse como un sistema de captura sintético en el cual se colocan unas microlentes de espaciado Ax/M directamente sobre el plano en el cual se encuentra la muestra. Con esto, para cada posición de muestreo espacial, /, el frente de onda objeto o(x) se muestrea localmente, de forma que la intensidad de cada píxel I¡m representa una medida de la composición angular del frente de onda objeto. Si se interpreta el frente de ondas objeto como una superposición de ondas planas, la suma de las medidas locales para cada región de muestreo espacial /, debidamente escaladas con la intensidad y la componente angular correspondiente, representa una versión muestreada de dicho frente de onda:
Figure imgf000017_0001
Para un objetivo de microscopio dado, la precisión en la medida de las componentes angulares del frente de onda depende del tamaño y número de mililentes en el espacio de captura.
A continuación se explica más detalladamente, con referencia a la Figura 5, el proceso de captura, transposición y reconstrucción llevado a cabo con el microscopio del primer aspecto de la presente invención y según el método del segundo aspecto de la invención, para un ejemplo de realización, para un haz de iluminación B con el que se ilumina una muestra T tras la cual se encuentran dispuestas, en el espacio de captura Ec, la matriz de lentes 3 y el sensor de imagen 4, ilustrándose esquemáticamente una representación del espacio de reproducción Er.
Es posible considerar que cada subregión Sr del espacio traspuesto o de reconstrucción Er realiza un muestreo local en ondas planas del frente de onda objeto. Cada píxel de una subregión Sr del espacio traspuesto Er se corresponde con una dirección de propagación de las ondas planas que componen el frente de onda objeto en dicha zona. Se puede considerar que para una subregión dada Sr, denotada por el superíndice /, la amplitud compleja del frente de onda objeto viene dada por:
Figure imgf000018_0001
siendo im‘n la intensidad del píxel correspondiente a la posición m,n dentro de la subregión Sr y km el vector de dirección de la onda plana que se corresponde con el píxel situado en la posición m,n.
Por ejemplo, al iluminar una muestra T completamente transparente, tal como muestra la figura, el frente de onda será completamente plano y el registro en el espacio de captura Ec será exclusivamente el campo dado por la mili lente central. Al realizar la transposición, cada subregión Sr tendrá únicamente una componente, dada por el elemento k00 . Dicho elemento corresponde a una onda plana viajando en la dirección del eje óptico. De esta forma, a partir de todas las subregiones Sr, se compondría un frente de onda totalmente plano, que es el correspondiente a la muestra T. Dichos elementos se relacionan físicamente con ondas planas a través de los parámetros del sistema de la siguiente forma:
Figure imgf000018_0002
En la Figura 4 se muestra un resultado preliminar como ejemplo del funcionamiento del microscopio y método de la presente invención. Dicho resultado se obtuvo con un microscopio de baja resolución y no optimizado y con una muestra de fibras de algodón, sin embargo, permite mostrar la potencialidad del concepto presentado en esta invención. En el panel de la izquierda de dicha figura se muestra la captura obtenida mediante un microscopio como el que propone la invención. Tras realizar la transposición se obtiene una matriz que representa el espacio de reconstrucción Er (panel central de la Figura 4). Por último, a partir del procesado de las contribuciones locales al frente de onda dada por los píxeles de las subregiones, se obtiene el frente de onda objeto (Figura 4 panel de la derecha).
En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo que muestra las etapas del método propuesto por el segundo aspecto de la presente invención, o dicho de otro modo, las funciones para las cuales la entidad computacional del microscopio del primer aspecto de la invención está configurada, para un ejemplo de realización, las cuales se describen a continuación en correspondencia con las leyendas incluidas en cada bloque.
CAPTURA: Captura obtenida por el sensor pixelado 4.
CALIBRADO: El calibrado es un proceso necesario en la caracterización y parametrización del espacio de captura Ec. Para un mismo montaje, este proceso será necesario realizarlo una única vez. Para ello, el espacio objeto se ilumina con una fuente extensa incoherente, de forma que todas las lentes de la matriz 3 queden iluminadas. Hecho esto, se guarda la imagen obtenida y se aplica un algoritmo de procesado de imagen de detección de círculos. Dicho algoritmo proporciona todos los parámetros necesarios: posición relativa y tamaño de las lentes así como el número de píxeles contenido dentro de las subregiones delimitadas por cada lente.
PARAMETRIZACIÓN DEL ESPACIO DE CAPTURA: Mediante los parámetros obtenidos durante el calibrado, y conocido el tamaño de píxel del sensor 4, se le otorgan las debidas dimensiones angulares al espacio de captura Ec.
TRASPOSICIÓN AL ESPACIO DE RECONSTRUCCIÓN: Se aplica una transposición al espacio de captura E), empleando los datos de la parametrización. Con ellos, se obtiene un espacio de reconstrucción Er formado por una serie de subregiones Sr en las que cada píxel representa una dirección angular de propagación del frente de onda.
MEDIDA DE LAS COMPONENTES ANGULARES PARA CADA SUBREGIÓN: La información contenida por cada píxel se transfiere a una base de ondas planas en la que cada posición del píxel representa una dirección de propagación del frente de ondas. RECONSTRUCCIÓN DEL FRENTE DE ONDAS: Para cada subregión, se suma la contribución de las distintas componentes angulares expresadas en una base de ondas planas. El nivel de gris resultante representa una medida cuantitativa del frente de ondas.
Finalmente, en la Figura 7 se ilustra de manera esquemática al kit para microscopio propuesto por el sexto aspecto de la presente invención, que incluye al módulo del quinto aspecto acoplado al puerto de cámara de un microscopio comercial que incluye unos respectivos ocular Oc, objetivo Ob, lente de tubo Z y espejo abatible R, así como a un módulo de iluminación que incluye a unos medios de iluminación acoplados al puerto de iluminación del microscopio.
El kit adaptable a un microscopio comercial consta de dos partes señaladas en el esquema de la Figura 7 mediante línea discontinua:
P1) Módulo de iluminación: Se requiere adaptar unos medios de iluminación, en general un láser y un conjunto de lentes que produzcan la iluminación descrita en el presente documento al puerto de iluminación.
P2) Módulo del quinto aspecto de la invención, o módulo de colección: La matriz de lentes 3, el sensor 4 y una lente auxiliar 2 (o un conjunto de ellas) se adaptan al puerto de la cámara del microscopio de tal forma que el campo recogido por el sensor 4 tenga las características definidas en la invención.
La principal ventaja del microscopio propuesto por la presente invención radica en que debido a que la captura física se realiza en el espacio traspuesto, la resolución de las microlentes sintéticas del espacio de reconstrucción Er no está limitada por la difracción si no por el espaciado entre los píxeles de la cámara o sensor de imagen 4. Este hecho permite proporcionar una medida cuantitativa de fases con una resolución lateral sin precedentes.
Un experto en la materia podría introducir cambios y modificaciones en los ejemplos de realización descritos sin salirse del alcance de la invención según está definido en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Microscopio para medidas cuantitativas del frente de onda, que comprende:
- medios de iluminación (1) para iluminar una muestra (T);
- un objetivo de microscopio (2) configurado y dispuesto para recibir y enfocar luz dispersada por la muestra (T) al ser iluminada con dichos medios de iluminación (1);
- una disposición bidimensional ordenada de lentes (3) situada en el diafragma de apertura de dicho objetivo de microscopio (2) o en la ubicación de una imagen intermedia del mismo;
- un sensor de imagen (4) formado por una pluralidad de elementos fotodetectores, que está situado en un espacio de captura (Ec) sobre el plano focal de la disposición bidimensional ordenada de lentes (3) para recibir dicha luz dispersada por la muestra (T) tras atravesar dicho objetivo de microscopio (2) y dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3), y adquirir información espacial e información angular del frente de onda objeto asociado a dicha luz proveniente de dicha muestra (T), quedando enfrentados a cada lente varios de dichos elementos fotodetectores; y
- al menos una entidad computacional conectada operativamente con dicho sensor de imagen (4) y que está configurada y dispuesta para realizar una reconstrucción computacional de dicho frente de onda objeto a partir de dichas informaciones espacial y angular; estando el microscopio caracterizado porque el espaciado rm entre los centros de cada dos lentes contiguas de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) es superior a 500 pm y porque su apertura relativa es inferior a 10.
2.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) tiene un valor que está entre 900 pm y 1100 pm, y su apertura relativa tiene un valor que está entre 5 y 7.
3.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) tiene un valor entre 990 pm y 1010 pm, preferentemente 1000 pm, y su apertura relativa tiene un valor que está entre 5,8 y 6,2, preferentemente 6.
4.- Microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos medios de iluminación luz están configurados para iluminar dicha muestra (T) con luz parcial o totalmente coherente.
5.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dichos medios de iluminación luz están configurados para iluminar dicha muestra (T) con una haz de luz (B) con un ancho tal que, en ausencia de muestra o para una muestra (T) transparente, el frente de onda objeto será completamente plano y la adquisición en el espacio de captura (Ec) será exclusivamente el campo de luz dado por una lente central de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3).
6.- Microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha entidad computacional, que es al menos una, está configurada para realizar el siguiente doble muestreo en dos espacios recíprocos:
- un primer muestreo, o muestreo angular, en el espacio en el que se encuentra la disposición bidimensional ordenada de lentes (3) para obtener la información angular del frente de onda objeto, determinándola, la entidad computacional, y con ella su contenido de frecuencias espaciales, en función de la posición o posiciones en el espacio de captura (Ec) en que el sensor de imagen (4) recibe y adquiere dicha luz emitida por la muestra (T) tras atravesar el objetivo de microscopio (2) y la disposición bidimensional ordenada de lentes (3); y
- un segundo muestreo, o muestreo espacial, en el espacio de captura (Ec) para obtener la información espacial a partir de la intensidad recibida por cada elemento fotodetector, o píxel, del sensor de imagen (4).
7.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el tamaño de cada elemento fotodetector, o píxel, de dicho sensor de imagen (4) cumple la siguiente restricción:
Figure imgf000022_0001
donde Dt es el tamaño del píxel, l la longitud de onda del haz de iluminación con el que los medios de iluminación (1) iluminan dicha muestra (T), /m la distancia focal de las lentes de dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) y rm el espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas de dichas lentes.
8.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha entidad computacional, que es al menos una, está configurada para realizar una transposición de uno de dichos dos espacios recíprocos para situar a ambas informaciones, la espacial y la angular, en el mismo espacio, o espacio de reconstrucción (Er), situado virtualmente sobre el espacio objeto, donde dicho espacio de reconstrucción (Er) consta de UN regiones, donde L es el número de elemento fotodetectores, o píxeles, del sensor de imagen (4) y N es el número de lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes (3), de manera que se realiza un único muestreo local de ondas planas del frente de onda objeto que incluye a dicho muestreo espacial con una periodo de Ax/M donde M = -fv/f0 ¡ y/Sb es la distancia focal del objetivo de microscopio (2), y a dicho muestreo angular con un periodo de /¾/¾>.
9.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para, con el fin de realizar dicha reconstrucción computacional, interpretar dicho espacio de reconstrucción (Er) como un sistema de captura sintético en el cual se coloca una disposición bidimensional ordenada de lentes de espaciado entre los centros de cada dos lentes contiguas Ax/M, de manera que para cada posición de muestreo espacial l, el frente de onda objeto o(x) se muestrea localmente, de forma que la intensidad de la luz recibida en cada elemento fotodetector o píxel hm, representa una medida de la composición angular del frente de onda objeto.
10.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para, con el fin de realizar dicha reconstrucción computacional, considerar que en cada subregión del espacio de reconstrucción (Er) se realiza un muestreo local en ondas planas del frente de onda objeto, donde cada píxel de una subregión del espacio de reconstrucción (Er) se corresponde con una dirección de propagación de las ondas planas que componen el frente de onda objeto en dicha zona.
1 1.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para determinar, para una subregión dada por el superíndice /, la amplitud compleja del frente de onda objeto según la siguiente expresión:
Figure imgf000023_0001
donde Im l n e s la intensidad del píxel correspondiente a la posición m,n dentro de la subregión 1 y kmn el vector de dirección de la onda plana que se corresponde con el píxel situado en la posición m,n.
12.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 , en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para transferir la información contenida por cada píxel a una base de ondas planas en la que cada posición del píxel representa una dirección de propagación del frente de onda objeto.
13.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para llevar a cabo dicha reconstrucción computacional sumando, para cada subregión del espacio de reconstrucción (Er), la contribución de las distintas componentes angulares expresadas en dicha base de ondas planas, para proporcionar una imagen de escala de grises, donde el nivel de gris resultante representa una medida cuantitativa del frente de onda objeto.
14.- Microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está conectada operativamente con una fuente de luz extensa incoherente y con dicho sensor de imagen (4) para controlarlos a ambos, y está configurada para realizar un proceso de calibrado previo, para la caracterización y parametrización del espacio de captura (Ec), controlando a dicha fuente extensa incoherente para iluminar el espacio objeto de forma que todas las lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes (3) queden iluminadas, controlando a dicho sensor de imagen (4) para adquirir, bajo dicha iluminación extensa incoherente, una imagen de la muestra, y aplicando un algoritmo de procesado de imagen de detección de círculos para proporcionar todos los siguientes parámetros: posición relativa y tamaño de las lentes de la disposición bidimensional ordenada de lentes (3) y número de píxeles contenido dentro de las subregiones delimitadas por cada lente de la disposición bidimensional ordenada de lentes (3).
15.- Microscopio de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la entidad computacional, que es al menos una, está configurada para realizar dicha parametrización del espacio de captura (Ec), determinando y otorgando las dimensiones angulares al espacio de captura (Ec) mediante los parámetros obtenidos durante el proceso de calibrado, y en función del tamaño de píxel del sensor de imagen (4).
16.- Microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) sigue una geometría de red hexagonal.
17.- Microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha disposición bidimensional ordenada de lentes (3) sigue una geometría de matriz cuadrada.
18.- Método para la reconstrucción computacional del frente de onda, que comprende realizar las funciones para las cuales la entidad computacional del microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 está configurada.
19.- Programa de ordenador para la reconstrucción computacional del frente de onda, que incluye instrucciones de programa que cuando se ejecutan en un procesador implementan el método de la reivindicación 18.
20.- Módulo para microscopio, que comprende al menos la disposición bidimensional ordenada de lentes (3) y el sensor de imagen (4) del microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, así como un soporte de los mismos y un tubo de acople óptico-mecánico adaptado para acoplarse a un puerto de cámara de un microscopio.
21.- Kit para microscopio, que comprende:
- el módulo para microscopio de la reivindicación 20; y
- un módulo de iluminación que comprende a los medios de iluminación (1) del microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 adaptados para acoplarse a un puerto de iluminación de un microscopio.
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