WO2020161013A1 - Mikrofluidikeinrichtung und verfahren zum abtrennen von blutserum - Google Patents

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blood serum
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Tobias SCHUNCK
Michael Bassler
Peter Spang
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Definitions

  • the invention relates to a microfluidic device, more precisely a microfluidic blood serum generator, with a microfluidic structure for separating blood serum from a blood sample.
  • the invention also relates to a method for separating blood serum from a blood sample by means of such a blood serum generator.
  • a “microfluidic device” in the sense of this document is a generally flat component, typically in credit card format, in particular a microfluidic chip, whose base plate (also referred to as substrate) consists in particular of a polymer material, glass or silicon, in which the microfluidic structure for separating blood serum and any other fluid channels and / or other microstructures, such as micropumps, actuators, sensors, membranes, valves, stirring elements or the like, are incorporated in a manner known per se by injection molding processes, hot stamping processes or milling.
  • the microfluidic device sometimes referred to as “lab-on-a-chip”, can generally be used for chemical synthesis or analysis as well as for medical diagnostics in the laboratory or on site. It is characterized in particular by its miniaturization for the synthesis and / or analysis of very small amounts of liquid.
  • Microfluidic devices and microfluidic structures are used to handle sometimes very small amounts of liquid in the range from a few ml to the ml range.
  • the fluid lines in the microfluidic structures have lateral dimensions in the range of a few mm and below. Liquids are handled in such a microfluidic structure in the flow system, that is, by produce a pressure difference (positive and / or negative pressure) between a first connection and a second connection of the microfluidic device conveyed through the fluid lines.
  • control or operator devices are used, for example, which are connected to the microfluidic device or in which it is inserted. Manual actuation is also possible.
  • the known microfluidic device comprises a sample inlet which is connected to a microfluidic channel, a composite membrane with filter elements being arranged between the inlet and the microfluidic channel, which membrane is set up to receive the blood sample, to hold it in place, a blood coagulation process to set in motion and selectively hold back the coagulated blood components while the liquid blood serum is pulled out of the membrane and transported away through the microfluidic channel.
  • the invention is accordingly based on the object of providing a microfluidic blood serum generator and a method for separating blood serum from a blood sample, which enable the reliable processing of very small, “patient-friendly” amounts of blood in the range of a few 10 ml without increased expenditure on equipment.
  • the blood serum generator comprises a microfluidic structure for separating blood serum from a blood sample, the blood serum generator having a first connection and a second connection, between which the microfluidic structure is formed, the microfluidic structure having a supply channel communicating with the first connection, a coagulation area into which the feed channel opens and has a discharge channel communicating with the second connection and into which the coagulation area merges, the first connection being designed for introducing a blood sample under a first pressure and the second connection for applying a second pressure is formed, which is lower than the first pressure, the coagulation area by a single contiguous hollow Space is formed and a barrier for holding back a clotted blood sample is arranged in the transition from the coagulation area to the discharge channel.
  • the method according to the invention for separating blood serum from a blood sample comprises the steps: providing a microfluidic blood serum generator with a microfluidic structure of the type mentioned above, transporting a blood sample from the supply channel into the coagulation area, driven by a first pressure drop from the first Connection to the second connection, holding the blood sample in the coagulation area until it has clotted, and transporting the blood serum from the coagulation area into the discharge channel, driven by a second pressure drop from the first connection to the second connection, during the rest of the coagulated blood sample is retained in the coagulation area by means of the barrier, the second pressure drop and the barrier in the transition from the coagulation area to the discharge channel being dimensioned such that internal binding forces hold the rest of the coagulated blood sample together.
  • the invention is based on the knowledge that the remainder of the clotted blood sample, the so-called blood cake, has such strong internal binding forces or adhesive forces that it even when exposed to a pressure gradient within the microfluidic structure, which is sufficient to extract the serum from this structure and at the same time is held back by a barrier, neither breaks apart, nor intracellular components or blood cells are released (hemolysis), or dissolved erythrocytes are released which contaminate the blood serum.
  • This process management is referred to below as "clean extraction" for the purpose of linguistic simplification.
  • the membrane which has a large number of pores in which the blood is distributed and coagulated there, the inventors have recognized that it is therefore sufficient to design the coagulation area in the form of a single contiguous cavity.
  • the cavity of the coagulation area preferably does not exceed a volume of 50 ml, preferably 25 ml.
  • the serum yield in the method according to the invention is between 10% and 25%, based on the amount of whole blood. This enables the volume of the coagulation area to be minimized.
  • the volume of 50 ml or less ensures that a sufficient amount of serum can be made available for a subsequent analysis, with only a few drops of blood being required by a patient. With a volume of 25 ml or less, only one or two drops are sufficient for the analysis.
  • the barrier preferably comprises a cross-sectional constriction in relation to a main flow direction in the transition from the coagulation region to the discharge channel.
  • the exact geometric structure of the barrier is not important as long as the barrier is suitable for holding back the blood cake in the coagulation area. This can be achieved, for example, by means of that cross-sectional taper. It can be stepped or ramp-shaped in the main flow direction. The latter variant has the advantage that the flow within the coagulation area is more even, the cavity of the coagulation area can be reliably filled and there is no serum return. stands behind because there are no corners with poor flow in the area of the cross-sectional taper.
  • the invention is further developed in that the barrier comprises a lattice structure with no more than 10 passages for the blood serum.
  • Such a lattice structure is also suitable for holding back the blood cake with the proviso of a clean extraction.
  • the maximum number of 10 passes ensures that the structure can be carved out of the substrate material of the microfluidic chip as part of the microfluidic structure in the injection molding process, hot stamping process or by milling. This feature also serves to distinguish it from filter-based technology, in which the filter membrane is a separate element, the production of which causes additional costs.
  • the barrier has a minimum clear width of not less than 10 mm, preferably not less than 50 mm and not more than 200 mm, in relation to a direction perpendicular to the main flow direction in the transition from the coagulation area to the discharge channel preferably provides no more than 150 mm.
  • the fluidic channels in fluidic structures are essentially rectangular. With this geometry, the smaller of the wall clearances is understood as the minimum clear width.
  • the above dimensions regardless of whether with a cross-sectional taper or with the passages between the grids of a grid structure, have proven to be suitable for securely retaining the blood cake and at the same time providing sufficient flow cross-section for the withdrawal of the blood serum from the coagulation area.
  • the barrier comprises a flat channel section with a clear height of not less than 10 mm, preferably not less than 50 mm and not more than 200 mm, preferably not more than 150 mm.
  • the barrier preferably comprises a grid structure with a clear grid spacing of not less than 50 mm and not more than 350 mm, preferably not more than 300 mm.
  • the barrier can be formed individually or in combination by the lattice structure or the cross-sectional tapering, it being possible for the flat channel section to follow the cross-sectional tapering.
  • the grid structure is preferably located in the flat channel section.
  • a coagulation activator in particular a soluble or gel-like coagulation activator, is particularly preferably introduced into the coagulation area.
  • the coagulation activator is not decisive for the success of the extraction of blood serum according to the invention, but it accelerates the coagulation process of the fresh blood from a few minutes to 10 to 20 seconds. The advantage is therefore a considerable saving in time for the entire extraction process.
  • the coagulation activator preferably fills the coagulation area in the form of a porous structure.
  • the pores provide the volume for the fresh blood.
  • the most uniform possible distribution and the largest possible pore surface of the channel Clotting activators ensure that the clotting activator dissolves quickly in the blood and that the blood clots evenly and quickly.
  • the coagulation activator is provided in the coagulation area to accelerate the coagulation process before the blood serum generator according to the invention is used, particularly preferably in that the coagulation activator is introduced as a solution into the coagulation area of the microfluidic structure and then freeze-dried by cooling and evacuation in the open microfluidic structure becomes.
  • “open” means that the connections of the microfluidic structure are at least partially unoccupied in order to allow the water that escapes during freeze-drying to escape from the microfluidic structure.
  • Another variant provides, before the chip is covered, in which the microfluidic structure is incorporated, i.e. Before the microfluidic structure in the substrate is covered with a film, the coagulation activator is introduced and freeze-dried and then the chips are covered.
  • the coagulation activator ideally dissolves completely in the blood sample when the blood sample is transported into the coagulation area and / or when the blood sample is held in the coagulation area, so that - with the exception of solid constituents of blood - no more solid constituents are present in the coagulation area.
  • the coagulation activator therefore does not form a structural component of the blood serum generator and therefore, unlike a filter membrane, does not serve to hold back the blood cake, but rather is a component of it.
  • the volume ratio of coagulation activator and fresh blood within the coagulation range is preferably 1: 3 to 1: 5, particularly preferably 1: 4.
  • the method is advantageously developed in that the barrier comprises a flat channel section and the coagulation process is optically monitored in the flat section.
  • the flat channel section can in particular be one with the clearance height specified above.
  • Optical monitoring can take place regardless of whether a coagulation activator has been used or not. It can be used on the one hand to determine the coagulation factor and on the other hand to control the further process. For example, movements are detected using a speckle image.
  • the transport of the blood serum out of the coagulation area is thus advantageously initiated as soon as a standstill of the movements is ascertained in this way during the optical monitoring of the coagulation process. Then it is assumed that the blood particles actually no longer move, and the coagulation process is considered complete.
  • the method according to the invention is advantageously further developed in that the first pressure drop from the first connection to the second connection is less than 10 mbar, preferably less than 5 mbar.
  • the negative pressure should not be higher than 10 mbar, better still not higher than 5 mbar, as otherwise uncontrolled separation and / or breaking up of the blood drop may occur.
  • the second pressure drop from the first connection to the second connection is preferably less than 25 mbar, particularly preferably less than 15 mbar.
  • the blood serum can be drawn out of the blood cake even at these low pressure differences.
  • the pressure differences are so small that this takes place reliably as a process, i.e. without destroying the blood cake, in particular without hemolysis, as a clean extraction.
  • the first connection comprises a receiving bore for a capillary tube or is itself designed as a capillary tube.
  • a capillary tube is suitable for taking up a drop of blood, for example, from a patient's finger via capillary fluid until the capillary is completely filled. Furthermore, such a capillary tube has a defined volume in which the amount of blood is determined before it is introduced into the microfluidic structure. This volume is preferably measured to the dimensions of the microfluidic structure, so that the cross section of the coagulation area is completely filled. A preferred volume of such a capillary tube is 20 ml, which corresponds approximately to a drop of blood.
  • Such a capillary tube can then be inserted in a fluid-tight manner into the receiving bore of the first connection, so that the said pressure drop from the first connection to the second connection ensures that the capillary is emptied and the blood is drawn into the coagulation area via the supply channel.
  • a further advantageous embodiment of the method provides that the blood sample is held in the coagulation area by compensating for the first drop in pressure as soon as the blood sample has reached an intended position within the microfluidic structure.
  • the blood sample forms a coherent liquid plug with a front interface within the microfluidic structure, the arrival of the front interface at the intended position being detected by sensors.
  • the arrival of the front interface at the intended position is also preferably detected optically or capacitively.
  • the arrival of the front boundary surface at the intended position can also be detected by means of differential pressure measurement in the form of an increase in the pressure difference between the first connection and the second connection if a cross-sectional constriction is provided at the predefined position.
  • the intended position is therefore advantageously located in the area of the barrier at the transition between the coagulation area and the discharge channel and very particularly preferably the flat channel section of the barrier.
  • FIG. 1 shows a detail of a first embodiment of the microfluidic blood serum generator according to the invention in a top view
  • FIG. 2 shows the embodiment according to FIG. 1 in a sectional view from the side;
  • FIG. 3 shows a detail of a second embodiment of the microfluidic blood serum generator according to the invention in plan view;
  • FIG. 4 shows the embodiment according to FIG. 3 in the sectional view from the side
  • FIG. 5 an enlarged detail from FIG. 4.
  • Flow direction refers to the main flow direction prevailing in a component, which approximately follows the contour of the respective microfluidic structures.
  • Lateral refers to the direction perpendicular to the direction of flow and in the main plane of the blood serum generator.
  • FIGS. 1 and 2 a first embodiment of the microfluidic blood serum generator 10 according to the invention is shown in two views.
  • FIG. 1 shows the top view of the main plane of the flat, check card-shaped substrate of this microfluidic device.
  • FIG. 2 (“Section A-A”) shows a section through this substrate along the section line 11 and with the viewing direction in accordance with that with arrows “A”.
  • the blood serum generator 10 has a microfluidic structure 12, only the section of the microfluidic structure 12 relevant to the separation of blood serum from a blood sample being shown in the figures.
  • further microfluidic structure components can be located.
  • components such as B. micropumps, actuators, sensors, membranes, valves, stirring elements, mixers, reaction chambers and the like are located for processing and / or analyzing the sample.
  • a first and a second connection are located at at least two ends of the entire microfluidic structure in order to be able to generate a pressure gradient within the microfluidic structure. With one exception, these connections are not shown explicitly in the second exemplary embodiment.
  • the relevant microfluidic structure 12 comprises a feed channel 14 into which the fresh blood flows from a first connection (not shown) in the flow direction indicated by the arrow 16.
  • the feed channel 14 opens into a coagulation area 18 into which the blood flows and where it is held for the purpose of coagulation.
  • the coagulation area 18 is in turn divided into an inlet area 20, which laterally expands the fluid flow starting from the cross section of the feed channel 14, and downstream a deep area 22, the inlet area 20 being designed to be shallower than the deep area 22. The transition between them is abrupt Edge 24 formed.
  • the coagulation area 18 merges into a discharge channel 26, a barrier being located in the transition 28 from the coagulation area 18 to the discharge channel 26.
  • the barrier comprises an edge or stepped cross-sectional constriction 30 and an adjoining flat channel section 32 which at the same time constricts the fluid flow laterally to the width of the discharge channel 26.
  • the channel behind the last element of the barrier in the flow direction is referred to as discharge channel 26 ‘.
  • Fresh blood is transported in the form of a liquid plug, i.e. a coherent finite volume, driven by a first drop in pressure, from the first connection to the second connection from the supply channel 14 into the coagulation area 18, the inlet area 20 being filled first, by spreading the fluid plug of the blood laterally.
  • the blood then flows over the edge 24 into the deep region 22 until it is completely filled.
  • the transport is stopped when a front boundary surface of the liquid plug is sensed at a provided position in the area of the barrier, that is to say in the transition 28. This is preferably done in an area of the transition located as far downstream as possible in order to have to fill as little volume as possible with serum upstream of the discharge channel after coagulation.
  • a light barrier or a sensor could be set up, which optically or electrically detects the flat channel section 32.
  • the pressure drop from the first to the second connection is compensated for.
  • a negative pressure which is preferably applied to the second connection to generate the pressure drop, is switched off or the second connection is ventilated, so that the blood stops immediately.
  • FIG. 3 again shows a plan view of the main plane of the flat, check card-shaped substrate of the microfluidic device.
  • FIG. 4 (“Section BB”) shows a section through this substrate along the section line 11 'and with the direction of view according to FIG the arrows "B".
  • FIG. 5 (“Detail C”) shows an enlarged section from FIG. 4 on the circular marking with the same lettering in FIG.
  • the blood serum generator 10 ‘has a microfluidic structure 12‘, the figures again only showing the section of the microfluidic structure 12 ‘relevant to the separation of blood serum from a blood sample and an adjoining analysis channel 50..
  • further microfluidic structure components such as. B. micropumps, actuators, sensors, membranes, valves, stirring elements, mixers, reaction chambers and the like for preparing and / or analyzing the sample.
  • the relevant microfluidic structure 12 ‘comprises a feed channel 14‘, into which the fresh blood flows from a first connection 15 ‘in the direction of flow indicated by the arrow 16‘.
  • the first connection 15 ‘has a cylindrical bore laterally in the substrate of the blood serum generator 10, which is set up to receive a capillary tube 99‘ in a fluid-tight manner.
  • the feed channel 14 ' opens into a coagulation area 18' into which the blood flows and where it is held for the purpose of coagulation.
  • the coagulation area 18 ' is again divided into an inlet area 20', which laterally expands the fluid flow starting from the cross section of the supply channel 14 '.
  • the inlet area 20 ' is designed to be deep on the inlet side and tapers in a ramp-shaped manner downstream to the depth of a flat area 22' of the coagulation area 18 'that adjoins downstream.
  • the reason for this geometry is the lower-lying first connection 15 ', from which a transition into a surface channel must be created.
  • the coagulation area 18' is widened again laterally in relation to the inlet area 20 'in order to provide a sufficient volume for the blood sample and possibly a coagulation activator.
  • the coagulation area 18 'again merges into a discharge channel 26', the transition 28 'this time having a barrier which has a cross-sectional tapering in the form of a ramp 40', a flat channel section 42 ', which at the end of the fluid flow again laterally to the width of the Constricts discharge channel 26 ', and comprises a lattice structure 44' with a total of five passages for the blood serum.
  • discharge channel 26 The channel behind the last element of the barrier in the flow direction is referred to as discharge channel 26 ‘.
  • the discharge channel 26 ‘initially continues with the same depth as the flat channel section 42‘ of the barrier and then widens in the depth direction in the form of a ramp 46 ‘, while it further constricts the fluid flow laterally. This is a particularly advantageous feature because the discharge channel has a very small volume, so that the blood serum can be made available as directly as possible and without loss of further processing.
  • the discharge channel 26 finally opens downstream into the analysis channel 50‘, in which the serum obtained is transported onward via a pressure gradient created between an inlet side 51 ‘and an outlet side 52‘ of the analysis channel 50 ‘in the direction of the arrow 17‘.
  • the microfluid structure 12 ' is thereby decoupled from the further process sequence, and contamination of the analysis channel 50' with other blood components is prevented.
  • the inlet area 20' in which the liquid plug is located is first filled of the blood spreads laterally.
  • the blood then flows over the ramp of the inlet area 20 'into the flat area 22' until it is completely filled.
  • the transport is stopped again when a front boundary surface of the liquid plug is at a provided position in the area of the barrier, that is to say in the Transition 28, is detected by sensors. This is preferably done in an area of the transition located as far downstream as possible in order to have to fill as little volume as possible with serum upstream of the discharge channel after coagulation.
  • a light barrier could serve as described above.
  • the liquid plug is held in this position until the blood in the coagulation area 18 'has completely clotted.
  • the coagulation can be accelerated in that a coagulation activator was previously located in the coagulation area 18 'and particularly preferably in the flat area 22'.
  • the coagulation is preferably monitored optically again.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen mikrofluidischen Blutserumgenerator (10, 10'), der einen ersten Anschluss (15') und einen zweiten Anschluss aufweist, zwischen denen eine Mikrofluidikstruktur (12, 12') ausgebildet ist, wobei die Mikrofluidikstruktur (12, 12') einen mit dem ersten Anschluss (15') kommunizierenden Zuführkanal (14, 14'), einen Gerinnungsbereich, in den der Zuführkanal mündet, und einen mit dem zweiten Anschluss kommunizierenden Abführkanal (26, 26'), in den der Gerinnungsbereich (18, 18') übergeht, aufweist, wobei der erste Anschluss zum Einleiten einer Blutprobe unter einem ersten Druck ausgebildet ist und der zweite Anschluss zum Anlegen eines zweiten Druckes ausgebildet ist, der geringer als der erste Druck ist, wobei der Gerinnungsbereich durch einen einzigen zusammenhängenden Hohlraum gebildet wird und wobei im Übergang (28, 28') vom Gerinnungsbereich zum Abführkanal eine Barriere zum Zurückhalten einer geronnenen Blutprobe angeordnet ist. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe mittels eines solchen Blutserumgenerators.

Description

Mikrofluidikeinrichtung und Verfahren zum Abtrennen von Blutserum
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Mikrofluidikeinrichtung, genauer einen mikrofluidi- schen Blutserumgenerator, mit einer Mikrofluidikstruktur zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe mittels eines solchen Blutserum- generators.
Als„Mikrofluidikeinrichtung“ im Sinne dieser Schrift wird ein in der Regel flaches Bauelement, typischerweise im Scheckkartenformat, insbesondere ein mikroflu- idischer Chip, verstanden, dessen Grundplatte (auch Substrat bezeichnet) ins- besondere aus einem Polymermaterial, Glas oder Silizium besteht, in welches die Mikrofluidikstruktur zum Abtrennen von Blutserum sowie etwaige weitere Fluidkanäle und/oder andere Mikrostrukturen, wie etwa Mikropumpen, Aktoren, Sensoren, Membranen, Ventile, Rührelemente oder dergleichen in an sich bekannter Weise durch Spritzgussverfahren, Heißprägeverfahren oder Fräsen eingearbeitet sind. Die Mikrofluidikeinrichtung, gelegentlich auch als„Lab-on-a- Chip“ bezeichnet, kann allgemein zur chemischen Synthese oder Analyse ge- nauso wie zur medizinischen Diagnostik im Labor oder vor Ort eingesetzt wer- den. Sie zeichnet sich insbesondere aufgrund ihrer Miniaturisierung zur Synthe- se und/oder Analyse kleinster Flüssigkeitsmengen aus.
Mikrofluidikeinrichtungen und Mikrofluidikstrukturen dienen der Handhabung von teilweise sehr kleinen Flüssigkeitsmengen im Bereich weniger ml bis in den ml- Bereich. Die Fluidleitungen in den Mikrofluidikstrukturen weisen laterale Abmes- sungen im Bereich weniger mm und darunter auf. Flüssigkeiten werden in einer solchen Mikrofluidikstruktur im Durchflusssystem gehandhabt, d. h. durch Er- zeugen einer Druckdifferenz (Über- und/oder Unterdrück) zwischen einem ers- ten Anschluss und einem zweiten Anschluss der Mikrofluidikeinrichtung durch die Fluidleitungen gefördert. Hierfür kommen beispielse Steuer- oder Betreiber- geräte zum Einsatz, die an die Mikrofluidikeinrichtung angeschlossen werden bzw. in die diese eingelegt wird. Eine manuelle Betätgiung ist auch möglich.
Traditionell wird Blutserum aus einer Blutprobe in einem Labor extrahiert, indem die Blutprobe nach Gerinnung in einem Reaktionsgefäß zentrifugiert wird, so dass sich das Serum von den geronnenen, festen Bestandteilen des Blutes trennt. Inzwischen wurden auch Zentrifugationschips im mikrofluidischen Maß- stab zur Plasmagewinnung in mikrofluidischer Größenordnung entwickelt, siehe beispielsweise Marion Ritzi-Lehnert et al. “Development of chip-compatible sample preparation for diagnosis of infectious diseases”, Expert Review of Molecular Diagnostics 12:2, S. 189-206 (2012).
Eine andere Methode zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe macht von einem Filterverfahren Gebrauch. Hierzu wird beispielhaft auf die Schrift WO 2014/182844 A1 verwiesen. Die bekannte Mikrofluidikeinrichtung umfasst einen Probeneinlass, der mit einem Mikrofluidikkanal verbunden ist, wobei eine Verbundmembran mit Filterelementen zwischen dem Einlass und dem Mikroflu- idikkanal angeordnet ist, welche dazu eingerichtet ist, die Blutprobe aufzuneh- men, an Ort und Stelle zu halten, einen Blutgerinnungsprozess in Gang zu setzen und die geronnenen Blutbestandteile selektiv zurückzuhalten, während das flüssige Blutserum aus der Membran herausgezogen und durch den Mikro- fluidikkanal abtransportiert wird.
Während die Zentrifugation im mikrofluidischen Maßstab einen zusätzlichen apparativen Aufwand erfordert, sind die Verfahren der Bluttrennung mittels Filtermembran insoweit nachteilig, als solche Filter sehr geringe Porenquer- schnitte aufweisen, um Blutzellen oder auch Bakterien oder andere Partikel zurückhalten zu können. Dies birgt einerseits die Gefahr von Verstopfungen und verringert andererseits den Durchfluss. Um dies zu kompensieren, weisen die Membranen in der Regel eine große Filterfläche und somit zwangsläufig auch ein großes Membranvolumen auf, was es wiederum erforderlich macht größere Blutmengen im Bereich von mehreren 100 ml für eine Analyse bereitzustellen. Auch erfordert die prozesssichere Ausstattung derartiger mikrofluidischer Struk- turen mit Membranen zusätzliche Materialien und Montageschritte.
Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, einen mikrofluidischen Blutserumgenerator und ein Verfahren zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe bereitzustellen, welche die prozesssichere Verarbeitung sehr kleiner, „patientenfreundlicher“ Blutmengen im Bereich von wenigen 10 ml ohne erhöh- ten apparativen Aufwand ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen mikrofluidischernBlutserumgenerator mit den Merkmalen des Anspruches 1 sowie durch ein Verfahren mit den Merkma- len des Anspruches 11. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.
Der erfindungsgemäße Blutserumgenerator umfasst eine Mikrofluidikstruktur zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe, wobei der Blutserumgenera- tor einen ersten Anschluss und einen zweiten Anschluss aufweist, zwischen denen die Mikrofluidikstruktur ausgebildet ist, wobei die Mikrofluidikstruktur einen mit dem ersten Anschluss kommunizierenden Zuführkanal, einen Gerin- nungsbereich in den der Zuführkanal mündet, und einen mit dem zweiten An- schluss kommunizierenden Abführkanal, in den der Gerinnungsbereich über- geht, aufweist, wobei der erste Anschluss zum Einleiten einer Blutprobe unter einem ersten Druck ausgebildet ist und der zweite Anschluss zum Anlegen eines zweiten Druckes ausgebildet ist, der geringer als der erste Druck ist, wobei der Gerinnungsbereich durch einen einzigen zusammenhängenden Hohl- raum gebildet wird und wobei im Übergang von Gerinnungsbereich zum Abführ- kanal eine Barriere zum Zurückhalten einer geronnenen Blutprobe angeordnet ist. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe umfasst die Schritte: Bereitstellen eines mikrofluidischen Blutserum- generators mit einer Mikrofluidikstruktur der vorstehend genannten Art, Trans- portieren einer Blutprobe aus dem Zuführkanal in den Gerinnungsbereich, ange- trieben durch einen ersten Druckabfall von dem ersten Anschluss zu dem zwei- ten Anschluss, Halten der Blutprobe in dem Gerinnungsbereich, bis sie geron- nen ist, und Transportieren des Blutserums aus dem Gerinnungsbereich in den Abführkanal, angetrieben durch einen zweiten Druckabfall von dem ersten An- schluss zu dem zweiten Anschluss, während der Rest der geronnenen Blutpro- be in dem Gerinnungsbereich mittels der Barriere zurückgehalten wird, wobei der zweite Druckabfall und die Barriere im Übergang vom Gerinnungsbereich zum Abführkanal so bemessen sind, dass innere Bindungskräfte den Rest der geronnenen Blutprobe Zusammenhalten.
Die Erfindung basiert in Abgrenzung zu den filterbasierten Bluttrennungsverfah- ren auf der Erkenntnis, dass der Rest der geronnenen Blutprobe, der sogenann- te Blutkuchen, so starke innere Bindungskräfte oder Klebekräfte aufweist, dass dieser auch, wenn er innerhalb der Mikrofluidikstruktur einem Druckgefälle ausgesetzt ist, welches ausreicht das Serum aus diesem Gebilde zu extrahie- ren, und gleichzeitig von einer Barriere zurückgehalten wird, weder auseinan- derbricht noch intrazelluläre Bestandteile oder Blutkörperchen freigesetzt wer- den (Hämolyse) oder gelöste Erythrozyten herausgelöst werden, die das Blutse- rum verunreinigen. Diese Prozessführung wird nachfolgend zur sprachlichen Vereinfachung als„saubere Extraktion“ bezeichnet. Im Gegensatz zur Membran, welche eine Vielzahl von Poren aufweist, in denen sich das Blut verteilt und dort gerinnt, haben die Erfinder erkannt, dass es des- halb genügt, den Gerinnungsbereich in Form eines einzigen zusammenhängen- den Hohlraums auszubilden.
Bevorzugt überschreitet der Hohlraum des Gerinnungsbereichs ein Volumen von 50 mI, vorzugsweise 25 mI, nicht.
Ein wesentlicher positiver Effekt ist, dass das gesamte Volumen des Gerin- nungsbereichs effizient genutzt werden kann, so dass eine sehr hohe Ausbeute an Blutserum erzielt wird. Die Serumsausbeute beträgt bei dem erfindungsge- mäßen Verfahren zwischen 10 % und 25 %, bezogen auf die Menge des Voll- blutes. Dies ermöglicht das Volumen des Gerinnungsbereichs zu minimieren. Das Volumen von 50 mI oder weniger stellt sicher, das eine ausreichende Menge an Serum für eine nachfolgende Analyse bereitsgestellt werden kann, wobei nur sehr wenige Tropfen Blut von einem Patienten benötigt werden. Bei 25 mI oder weniger Volumen genügen sogar nur ein bis zwei Tropfen für die Analyse.
Weiterhin bevorzugt umfasst die Barriere bezogen auf eine Hauptströmungsrich- tung im Übergang von Gerinnungsbereich zum Abführkanal eine Querschnitts- verengung.
Auf die exakte geometrische Struktur der Barriere kommt es nicht an, so lange die Barriere geeignet ist, den Blutkuchen in dem Gerinnungsbereich zurückzu- halten. Dies kann beispielsweise mittels jener Querschnittsverjüngung erreicht werden. Sie kann stufenförmig oder rampenförmig in der Hauptströmungsrich- tung ausgebildet sein. Die letztere Variante hat den Vorteil, dass die Strömung innerhalb des Gerinnungsbereichs gleichmäßiger verläuft, der Hohlraum des Gerinnungsbereichs prozesssicher gefüllt werden kann und keine Serumsrück- stände Zurückbleiben, weil es keine schlecht durchströmten Ecken im Bereich der Querschnittsverjüngung gibt.
Alternativ zu der Querschnittsverengung oder zusätzlich ist die Erfindung dadurch weitergebildet, dass die Barriere eine Gitterstruktur mit nicht mehr als 10 Durchgängen für das Blutserum umfasst.
Auch eine solche Gitterstruktur ist zum Zurückhalten des Blutkuchens unter der Maßgabe einer sauberen Extraktion geeignet. Die Höchstzahl von 10 Durch- gängen stellt sicher, dass die Struktur als Bestandteil der Mikrofluidikstruktur im Spritzgussverfahren, Heißprägeverfahren oder durch Fräsen aus dem Sub- stratmaterial des mikrofluidischen Chips herausgearbeitet werden kann. Dieses Merkmal dient auch insoweit zur Abgrenzung gegenüber der filterbasierten Technologie, bei der die Filtermembran ein separates Element ist, dessen Her- stellung weitere Kosten verursacht.
Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, dass die Barriere in Bezug auf eine Richtung senkrecht zur Hauptströmungsrichtung im Übergang vom Gerin- nungsbereich zum Abführkanal eine minimale lichte Weite von nicht weniger als 10 mm, bevorzugt nicht weniger als 50 mm und nicht mehr als 200 mm, bevorzugt nicht mehr als 150 m m bereitstellt.
Herstellungsbedingt sind die Fluidikkanäle in Fluidikstrukturen und so auch der der Zuführkanal, der Gerinnungsbereich und der Abführkanal, im Wesentlichen rechteckig ausgebildet. Als minimale lichte Weite wird bei dieser Geometrie der kleinere der Wandabstände verstanden. Die obigen Abmessungen, egal ob bei einer Querschnittsverjüngung oder bei den Durchgängen zwischen den Gittern einer Gitterstruktur, haben sich als geeignet erwiesen, den Blutkuchen sicher zurückzuhalten und gleichzeitig ausreichend Strömungsquerschnitt für das Abziehen des Blutserums aus dem Gerinnungsbereich bereitzustellen. Besonders bevorzugt ist eine Ausgesalttung, bei der die Barriere einen flachen Kanalabschnitt mit einer lichten Höhe von nicht weniger als 10 mm, bevorzugt nicht weniger als 50 m m und nicht mehr als 200 m m, bevorzugt nicht mehr als 150 mm, umfasst.
Weiterhin bevorzugt umfasst die Barriere eine Gitterstruktur mit einem lichten Gitterabstand von nicht weniger als 50 mm und nicht mehr als 350 m m, bevor- zugt nicht mehr als 300 mm.
Die Barriere kann einzeln oder in Kombination von der Gitterstruktur oder der Querschnittsverjüngung gebildet werden, wobei der Querschnittsverjüngung der flache Kanalabschnitt folgen kann. In letzterem Fall befindet sich die Gitterstruk- tur vorzugsweise in dem flachen Kanalabschnitt.
Besonders bevorzugt ist in dem Gerinnungsbereich ein Gerinnungsaktivator, insbesondere ein löslicher oder gelförmiger Gerinnungsaktivator, eingebracht.
Der Gerinnungsaktivator ist zwar nicht maßgeblich für den Erfolg der erfin- dungsgemäßen Extraktion von Blutserum, jedoch beschleunigt er den Gerin- nungsprozess des frischen Blutes von wenigen Minuten auf 10 bis 20 Sekun- den. Der Vorteil liegt also in einem erheblichen Zeitgewinn für das gesamte Extraktionsverfahren. Der Gerinnungsaktivator füllt vorzugsweise den Gerinnungsbereich in Form einer porösen Struktur.
Die Poren stellen das Volumen für das frische Blut bereit. Eine möglichst gleichmäßige Verteilung und eine möglichst große Porenoberfläche des Gerin- nungsaktivators stellen sicher, dass sich der Gerinnungsaktivator schnell in dem Blut auflöst und das Blut gleichmäßig schnell gerinnt.
Verfahrenstechnisch wird der Gerinnungsaktivator in dem Gerinnungsbereich zum Beschleunigen des Gerinnungsvorgangs vor Benutzung des erfindungsge- mäßen Blutserumgenerators bereitgestellt und zwar besonders bevorzugt, in- dem der Gerinnungsaktivator als Lösung in den Gerinnungsbereich der Mikroflu- idikstruktur eingebracht und anschließend durch Abkühlen und Evakuieren in der offenen Mikrofluidikstruktur gefriergetrocknet wird. Mit„offen“ ist hier in einer Variante gemeint, dass die Anschlüsse der Mikrofluidikstruktur zumindest teil- weise nicht belegt sind, um das beim Gefriertrocknen entweichende Wasser aus der Mikrofluidikstruktur austreten zu lassen. Eine andere Variante sieht vor, vor der Deckelung des Chips, in welchen die Mikrofluidikstruktur eingearbeitet ist, d.h. bevor die Mikrofluidikstruktur in dem Substrat mit einer Folie abgedeckt wird, den Gerinnungsaktivator einzubringen und gefrierzutrocknen und an- schließend den Chips zu Deckeln.
Der Gerinnungsaktivator löst sich beim Transportieren der Blutprobe in den Gerinnungsbereich und/oder beim Halten der Blutprobe in dem Gerinnungsbe- reich in der Blutprobe idealerweise vollständig auf, so dass - feste Bestandteile Blutes ausgenommen -keine festen Bestandteile mehr in dem Gerinnungsbe- reich vorliegen. Der Gerinnungsaktivator bildet mithin keinen strukturellen Be- standteil des Blutserumgenerators und dient deshalb anders als eine Filter- membran nicht zum Zurückhalten des Blutkuchens, sondern ist vielmehr ein Bestandteil desselben.
Bevorzugt beträgt das Volumenverhältnis aus Gerinnungsaktivator und frischem Blut innerhalb des Gerinnungsbereichs 1 :3 bis 1 :5, besonders bevorzugt 1 :4. Das Verfahren ist dadurch vorteilhaft weitergebildet, dass die Barriere einen flachen Kanalabschnitt umfasst und der Gerinnungsvorgang im flachen Ab- schnitt optisch überwacht wird. Der flache Kanalabschnitt kann insbesondere ein solcher mit der oben angegebenen lichten Höhe sein.
Die optische Überwachung kann unabhängig davon erfolgen, ob ein Gerin- nungsaktivator eingesetzt wurde oder nicht. Sie kann einerseits zur Ermittlung des Gerinnungsfaktors genutzt werden und andererseits zur Steuerung des weiteren Prozesses. Beispielsweise werden Bewegungen mittels eines Speckle- Bildes detektiert. Insbesondere wird das Transportieren des Blutserums aus dem Gerinnungsbereichs also vorteilhafter Weise eingeleitet, sobald beim opti- schen Überwachen des Gerinnungsvorgangs auf diese Weise ein Stillstand der Bewegungen festgestellt wird. Dann nämlich geht man davon aus, dass sich die Blutteilchen tatsächlich nicht mehr bewegen, und der Gerinnungsvorgang gilt als abgeschlossen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhafterweise ferner dadurch weiter- gebildet, dass der erste Druckabfall vom ersten Anschluss zum zweiten An- schluss weniger als 10 mbar, vorzugsweise weniger als 5 mbar, beträgt. Der Unterdrück sollte nicht höher sein als 10 mbar, besser noch nicht höher als 5 mbar, da es andernfalls evtl schon zur unkontrollierten Separation und/oder zum Zerteilen des Blutstropfens kommen kann.
Bevorzugt beträgt der zweite Druckabfall vom ersten Anschluss zum zweiten Anschluss weniger als 25 mbar, besonders bevorzugt weniger als 15 mbar.
Es hat sich gezeigt, dass bereits bei diesen geringen Druckdifferenzen das Blutserum aus dem Blutkuchen herausgezogen werden kann. Zugleich sind die Druckdifferenzen so gering, dass dies prozesssicher, also ohne Zerstörung des Blutkuchens, insbesondere ohne eine Hämolyse, als saubere Extraktion erfolgt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Mikrofluidikstruktur sieht vor, dass der erste Anschluss eine Aufnahmebohrung für ein Kapillarrohr umfasst oder selbst als Kapillarrohr ausgebildet ist.
Ein Kapillarrohr ist dazu geeignet, einen Bluttropfen beispielsweise vom Finger eines Patienten über Kapillarkaft bis zur vollständigen Befüllung der Kapillare aufzunehmen. Ferner hat ein solches Kapillarrohr ein definiertes Volumen, in welchem die Blutmenge vor dem Einbringen in die Mikrofluidikstruktur festgelegt wird. Dieses Volumen ist vorzugsweise auf die Dimension der Mikrofluidikstruk- tur abgemessen, so dass der Querschnitt des Gerinnungsbereiches vollständig befüllt wird. Ein bevorzugtes Volumen eines solchen Kapillarrohrs beträgt 20 ml, was in etwa einem Tropfen Blut entspricht. Ein solches Kapillarrohr kann dann Fluiddicht in die Aufnahmebohrung des ersten Anschlusses eingesetzt werden, so dass der besagte Druckabfall vom ersten Anschluss zum zweiten Anschluss dafür sorgt, dass die Kapillare entleert und das Blut über den Zuführkanal in den Gerinnungsbereich eingezogen wird.
Besonders bevorzugt geschieht dies, indem an dem zweiten Anschluss ein Unterdrück angelegt wird. Dies ist prozesstechnisch die einfachste Lösung, sowohl den ersten als auch den zweiten Druckabfall zu erzeugen. Das freie Ende des in die Aufnahmebohrung eingesteckten Kapillarrohres bleibt dann einfach dem Umgebungsdruck ausgesetzt und muss nicht an eine Druckleitung angeschlossen werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, dass das Halten der Blutprobe in dem Gerinnungsbereich durch Ausgleichen des ersten Druckabfalls erfolgt, sobald die Blutprobe eine vorgesehene Position innerhalb der Mikrofluidikstruktur erreicht hat. Besonders bevorzugt bildet die Blutprobe innerhalb der Mikrofluidikstruktur einen zusammenhängenden Flüssigkeitsplug mit einer vorderen Grenzfläche, wobei ein Eintreffen der vorderen Grenzfläche an der vorgesehenen Position sensorisch erfasst wird.
Weiterhin bevorzugt wird das Eintreffen der vorderen Grenzfläche an der vorge- sehenen Position dabei optisch oder kapazitiv erfasst.
Alternativ kann das Eintreffen der vorderen Grenzfläche an der vorgesehenen Position auch mittels Differenzdruckmessung in Form eines Anstiegs der Druck- differenz zwischen dem ersten Anschluss und dem zweiten Anschluss erfasst werden, wenn an der vorgegebenen Position eine Querschnittsverengung vor- gesehen ist. Deshalb befindet sich die vorgesehene Position vorteilhafter Weise im Bereich der Barriere am Übergang zwischen dem Gerinnungsbereich und dem Abführ- kanal und ganz besonders bevorzugt dem flachen Kanalabschnitt der Barriere.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachfolgend anhand von Figurenzeichnungen erläutert. Es zeigen:
Figur 1 ausschnittsweise eine erste Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen mikrofluidischen Blutserumgenerators in der Draufsicht;
Figur 2 die Ausführungsform gemäß Figur 1 in der Schnittdarstellung von der Seite; Figur 3 ausschnittsweise eine zweite Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen mikrofluidischen Blutserumgenerators in der Draufsicht;
Figur 4 die Ausführungsform gemäß Figur 3 in der Schnittdarstellung von der Seite und
Figur 5 eine Ausschnittsvergrößerung aus Figur 4.
Zur Beschreibung der Geometrie der Mikrofluidikstrukturen wird nachfolgend vereinfachend von einem„Fluidstrom“ gesprochen, was sowohl den Strom des frischen Blutes oder des Serums oder etwaiger sonstiger Fluide in der Mikroflu- idikstruktur zusammenfasst. „Strömungsrichtung“ bezeichnet jeweils die in ei- nem Bauteil vorherrschende Hauptströmungsrichtung, welche näherungsweise der Kontur der jeweiligen Mikrofluidikstruturen folgt. „Lateral“ bezeichnet die Richtung senkrecht zur Strömungsrichtung und in der Hauptebene des Blutse- rumgenerators.
In den Figuren 1 und 2 ist eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Blutserumgenerators 10 in zwei Ansichten gezeigt. Figur 1 zeigt die Draufsicht auf die Hauptebene des flachen, checkkartenförmigen Sub- strats dieser Mikrofluidikeinrichtung. Figur 2 („Schnitt A-A“) zeigt einen Schnitt durch dieses Substrat entlang der Schnittlinie 11 und mit Blickrichtung gemäß der mit Pfeile„A“.
Der Blutserumgenerator 10 weist eine Mikrofluidikstruktur 12 auf, wobei in den Figuren nur der zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe relevante Ausschnitt der Mikrofluidikstruktur 12 gezeigt ist. In Strömungsrichtung, gekenn- zeichnet durch die Pfeile 16 und 17, vor und/oder hinter dem gezeigten Aus- schnitt der Mikrofluidikstruktur 12 können sich weitere Mikrofluidikstrukturkom- ponenten, wie z. B. Mikropumpen, Aktoren, Sensoren, Membranen, Ventile, Rührelemente, Mischer, Reaktionskammern und dergleichen zum Aufbereiten und/oder Analysieren der Probe befinden. An wenigstens zwei Enden der ge- samten Mikrofluidikstruktur befinden sich ein erster und ein zweiter Anschluss, um darüber ein Druckgefälle innerhalb der Mikrofluidikstruktur erzeugen zu können. Diese Anschlüsse sind mit einer Ausnahim zweiten Ausführungsbei- spiel nicht explizit dargestellt.
Die relevante Mikrofluidikstruktur 12 umfasst einen Zuführkanal 14, in den das frische Blut von einem ersten Anschluss (nicht gezeigt) in der durch den Pfeil 16 gekennzeichneten Strömungsrichtung einströmt. Der Zuführkanal 14 mündet in einen Gerinnungsbereich 18, in welchen das Blut einfließt, und wo es zwecks Gerinnung gehalten wird. Der Gerinnungsbereich 18 ist seinerseits eingeteilt in einen Einlaufbereich 20, der den Fluidtrom ausgehend von dem Querschnitt des Zuführkanals 14 lateral aufweitet, und stromabwärts einen tiefen Bereich 22, wobei der Einlaufbereich 20 flacher ausgestaltet ist als der tiefe Bereich 22. Der Übergang dazwischen ist sprungförmig als Kante 24 ausgebildet.
Der Gerinnungsbereich 18 geht in einen Abführkanal 26 über, wobei sich im Übergang 28 vom Gerinnungsbereich 18 zum Abführkanal 26 eine Barriere befindet. Die Barriere umfasst eine Kante oder stufenförmige Querschnittsver- jüngung 30 und einen sich daran anschließenden flachen Kanalabschnitt 32, der den Fluidstrom zugleich lateral auf die Weite des Abführkanals 26 einschnürt. Als Abführkanal 26‘ wird der Kanal hinter dem in Strömungsrichtung letzten Element der Barriere bezeichnet.
Frisches Blut wird im Form eines Flüssigkeitsplugs, also eines zusammenhän- genden endlichen Volumens, angetrieben durch einen ersten Druckabfall, vom ersten Anschluss zum zweiten Anschluss aus dem Zuführkanal 14 in den Gerin- nungsbereich 18 transportiert, wobei zunächst der Einlaufbereich 20 befüllt wird, indem sich der Flüssigkeitsplug des Blutes lateral ausbreitet. Anschließend fließt das Blut über die Kante 24 in den tiefen Bereich 22 ein, bis dieser vollständig befüllt ist. Der Transport wird dann gestoppt, wenn eine vordere Grenzfläche des Flüssigkeitsplugs an einer vorgesehenen Position im Bereich der Barriere, also im Übergang 28, sensorisch erfasst wird. Bevorzugt geschieht das in einem möglichst weit stromabwärts gelegenen Bereich des Übergangs, um nach der Gerinnung möglichst wenig Volumen vor dem Abführkanal mit Serum füllen zu müssen. Hierzu könnte beispielsweise eine Lichtschranke oder ein Sensor gemäß der DE 10 2014 214 026 A1 eingerichtet sein, welche den flachen Ka- nalabschnitt 32 optisch bzw. elektrisch erfasst. Sobald das dort eintreffende Blut bei der Nutzung der Lichtschranke als Sensor das Licht der Lichtschranke ab- sorbiert, wird der Druckabfall vom ersten zum zweiten Anschluss ausgeglichen. Anders gesagt wird ein Unterdrück, welcher vorzugweise zum Erzeugen des Druckabfalls an dem zweiten Anschluss angelegt wird, abgeschaltet bzw. der zweite Anschluss belüftet, so dass das Blut augenblicklich stoppt.
In dieser Position wird der Flüssigkeitsplug gehalten, bis das Blut in dem Gerin- nungsbereich 18 vollständig geronnen ist. Die Gerinnung kann dadurch be- schleunigt sein, dass sich zuvor in dem Gerinnungsbereich 18 und besonders bevorzugt in dem tiefen Bereich 22 ein Gerinnungsaktivator befand. Die Gerin- nung wird vorzugsweise optisch überwacht. Auch dies geschieht bevorzugt in dem flachen Kanalabschnitt 32 des Übergangs 28 oder alternativ dem flachen Einlaufbereich 20 des Gerinnungsbereichs 18. Eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Blutse- rumgenerators 10‘ wird anhand der Figuren 3 bis 5 erläutert. Figur 3 zeigt wie- der eine Draufsicht auf die Hauptebene des flachen, checkkartenförmigen Sub- strats der Mikrofluidikeinrichtung. Figur 4 („Schnitt B-B“) zeigt einen Schnitt durch dieses Substrat entlang der Schnittlinie 1 1' und mit Blickrichtung gemäß der Pfeile„B“. Figur 5 („Detail C“) zeigt einen vergrößerten Ausschnitt aus Figur 4 an der gleichlautend beschrifteten kreisförmigen Markierung in Figur 4.
Der Blutserumgenerator 10‘ weist eine Mikrofluidikstruktur 12‘ auf, wobei in den Figuren wieder nur der zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe rele- vante Ausschnitt der Mikrofluidikstruktur 12‘ sowie ein angrenzender Analyseka- nal 50‘ gezeigt ist. In Strömungsrichtung, gekennzeichnet durch die Pfeile 16‘ und 17‘, können sich abermals weitere Mikrofluidikstrukturkomponenten, wie z. B. Mikropumpen, Aktoren, Sensoren, Membranen, Ventile, Rührelemente, Mi- scher, Reaktionskammern und dergleichen zum Aufbereiten und/oder Analysie- ren der Probe befinden.
Die relevante Mikrofluidikstruktur 12‘ umfasst einen Zuführkanal 14‘, in den das frische Blut von einem ersten Anschluss 15‘ in der durch den Pfeil 16‘ gekenn- zeichneten Strömungsrichtung einströmt. Der erste Anschluss 15‘ weist einen zylindrische Bohrung seitlich in dem Substrat des Blutserumgenerators 10‘ auf, die eingerichtet ist, ein Kapillarrohr 99‘ fluiddicht aufzunehmen.
Der Zuführkanal 14‘ mündet in einen Gerinnungsbereich 18‘, in welchen das Blut einfließt, und wo es zwecks Gerinnung gehalten wird. Der Gerinnungsbe- reich 18‘ ist wieder eingeteilt in einen Einlaufbereich 20‘, der den Fluidtrom ausgehend von dem Querschnitt des Zuführkanals 14‘ lateral aufweitet. In Ab- grenzung zu der ersten Ausführungsform ist der Einlaufbereich 20‘ eingangssei- tig tief ausgestaltet und verjüngt sich stromabwärts rampenförmig bis auf die Tiefe eines sich stromabwärts anschließenden flachen Bereiches 22‘ des Gerin- nungsbereichs 18‘. Grund für diese Geometrie ist der tiefer liegende erste An- schluss 15‘, von dem aus ein Übergang in einen Oberlächenkanal geschaffen werden muss. Im flachen Bereich 22‘ ist der Gerinnungsbereich 18‘ nochmals gegenüber dem Einlaufbereich 20‘ lateral aufgeweitet, um ein ausreichendes Volumen für die Blutprobe und ggf. einen Gerinnungsaktivator bereitzustellen. Der Gerinnungsbereich 18‘ geht wieder in einen Abführkanal 26‘ über, wobei der Übergang 28‘ diesmal eine Barriere aufweist, die eine Querschnittsverjüngung in Form einer Rampe 40‘, einen flachen Kanalabschnitt 42‘, der den Fluidstrom am Ende wieder lateral auf die Weite des Abführkanals 26‘ einschnürt, und eine Gitterstruktur 44‘ mit insgesamt fünf Durchgängen für das Blutserum umfasst.
Als Abführkanal 26‘ wird der Kanal hinter dem in Strömungsrichtung letzten Element der Barriere bezeichnet. Der Abführkanal 26‘ setzt sich zunächst mit der gleichen Tiefe fort, wie der flache Kanalabschnitt 42‘ der Barriere und weitet sich anschließend in Tiefenrichtung in Form einer Rampe 46‘ auf, während er den Fluidstrom lateral weiter stark einschnürt. Dies ist ein besonders günstiges Merkmal, weil der Abführkanal ein sehr geringes Volumen aufweist, so dass das Blutserum möglichst direkt und ohne Verlust der weiteren Prozessierung zur Verfügung gestellt werden kann. Der Abführkanal 26‘ mündet stromabwärts schließlich in den Analysekanal 50‘, in dem das gewonnene Serum über ein Druckgefälle, angelegt zwischen einer Einlassseite 51‘ und einer Auslassseite 52‘ des Analysekanals 50‘ in Richtung des Pfeils 17‘, weitertransportiert wird. Die Mikrofluidstruktur 12‘ wird hierdurch vom weiteren Prozessablauf entkoppelt, eine Kontamination des Analysekanals 50‘ mit anderen Blutbestandteilen ver- hindert.
Frisches Blut wird auch hier im Form eines Flüssigkeitsplugs, angetrieben durch einen ersten Druckabfall, vom ersten Anschluss 15‘ zum zweiten Anschluss aus dem Zuführkanal 14‘ in den Gerinnungsbereich 18‘ transportiert, wobei zunächst der Einlaufbereich 20‘ befüllt wird, in dem sich der Flüssigkeitsplug des Blutes lateral ausbreitet. Anschließend fließt das Blut über die Rampe des Einlaufbe- reichs 20‘ in den flachen Bereich 22‘ ein, bis dieser vollständig befüllt ist. Der Transport wird wieder dann gestoppt, wenn eine vordere Grenzfläche des Flüs- sigkeitsplugs an einer vorgesehenen Position im Bereich der Barriere, also im Übergang 28, sensorisch erfasst wird. Bevorzugt geschieht das in einem mög- lichst weit stromabwärts gelegenen Bereich des Übergangs, um nach der Ge- rinnung möglichst wenig Volumen vor dem Abführkanal mit Serum füllen zu müssen. Hierzu könnte wie oben geschildert eine Lichtschranke dienen. Alterna- tiv kann das Eintreffen der vorderen Grenzfläche des Flüssigkeitsplugs an der Gitterstruktur 44‘ auch mittels Differenzdruckmessung in Form eines Anstiegs der Druckdifferenz zwischen dem ersten Anschluss und dem zweiten Anschluss erfasst werden, weil die Überwindung derselben aufgrund von Grenzflächenef- fekten zusätzliche Arbeit erfordert, die sich als Differenzdruckanstieg in dem System bemerkbar macht.
In dieser Position wird der Flüssigkeitsplug gehalten, bis das Blut in dem Gerin- nungsbereich 18‘ vollständig geronnen ist. Die Gerinnung kann dadurch be- schleunigt sein, dass sich zuvor in dem Gerinnungsbereich 18‘ und besonders bevorzugt in dem flachen Bereich 22‘ ein Gerinnungsaktivator befand. Die Ge- rinnung wird vorzugsweise wieder optisch überwacht.
Die Forschungsarbeiten, die zu diesen Ergebnissen geführt haben, wurden von der Europäischen Union gefördert.
Bezugszeichenliste
10, 10‘ Blutserumgenerator
1 1 , 1 1 ' Schnittlinie
12, 12‘ Mikrofluidistruktur
14, 14' Zuführkanal
15‘ erster Anschluss
16, 16‘ Strömungsrichtungspfeil
17, 17‘ Strömungsrichtungspfeil
18, 18‘ Gerinnungsbereich
20, 20‘ Einlaufbereich des Gerinnungsbereichs
22 tiefer Bereich des Gerinnungsbereichs
22‘ flacher Bereich des Gerinnungsbereichs
24 Kante
26, 26' Abführkanal
28, 28‘ Übergang
30 Kante oder stufenförmige Querschnittsverjüngung
32 flacher Kanalabschnitt
40‘ Querschnittsverjüngung in Form einer Rampe
42‘ flacher Kanalabschnitt
44‘ Gitterstruktur
46‘ Rampe des Abführkanals
50‘ Analysekanal
51 ' Einlassseite
52‘ Auslassseite
99‘ Kapillarrohr

Claims

Patentansprüche
1. Mikrofluidischer Blutserumgenerator (10, 10‘) mit einer Mikrofluidikstruktur (12, 12‘), wobei der Blutserumgenerator (10, 10‘) einen ersten Anschluss (15‘) und einen zweiten Anschluss aufweist, zwischen denen die Mikroflu- idikstruktur (12, 12‘) ausgebildet ist,
wobei die Mikrofluidikstruktur (12, 12‘) einen mit dem ersten Anschluss (15‘) kommunizierenden Zuführkanal (14, 14‘), einen Gerinnungsbereich, in den der Zuführkanal (14, 14‘) mündet, und einen mit dem zweiten An- Schluss kommunizierenden Abführkanal (26, 26‘), in den der Gerinnungs- bereich (18, 18‘) übergeht, aufweist,
wobei der erste Anschluss (15‘) zum Einleiten einer Blutprobe unter ei- nem ersten Druck ausgebildet ist und der zweite Anschluss zum Anlegen eines zweiten Druckes ausgebildet ist, der geringer als der erste Druck ist,
wobei der Gerinnungsbereich (18, 18‘) durch einen einzigen zusammen- hängenden Hohlraum gebildet wird und
wobei im Übergang (28, 28‘) vom Gerinnungsbereich (18, 18‘) zum Ab- führkanal (26, 26‘) eine Barriere zum Zurückhalten einer geronnenen Blutprobe angeordnet ist.
2. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeich- net,
dass der Hohlraum des Gerinnungsbereichs (18, 18‘) ein Volumen von 50 mI, vorzugsweise 25mI, nicht überschreitet.
3. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Barriere in einer Hauptströmungsrichtung im Übergang (28, 28‘) vom Gerinnungsbereich (18, 18‘) zum Abführkanal (26, 26‘) betrachtet ei- ne Querschnittsverengung umfasst.
4. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass die Barriere eine Gitterstruktur (44‘) mit nicht mehr als 10 Durch- gängen für das Blutserum umfasst.
5. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass die Barriere in einer Richtung senkrecht zu einer Hauptströmungs- richtung im Übergang (28, 28‘) vom Gerinnungsbereich (18, 18‘) zum Ab- führkanal (26, 26‘) eine minimale lichte Weite von nicht weniger als 10 m m, bevorzugt nicht weniger als 50 m m, und nicht mehr als 200 m m, bevorzugt nicht mehr als 150 m m, bereitstellt.
6. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass die Barriere einen flachen Kanalabschnitt mit einer lichte Höhe von nicht weniger als 10 m m, bevorzugt nicht weniger als 50 m m, und nicht mehr als 200 m m, bevorzugt nicht mehr als 150 m m, umfasst.
7. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass die Barriere eine Gitterstruktur (44‘) mit einem lichten Gitterabstand von nicht weniger als 50pm und nicht mehr als 350 m m, bevorzugt nicht mehr als 300mm, umfasst.
8. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass, in dem Gerinnungsbereich (18, 18‘) ein Gerinnungsaktivator einge- bracht ist.
9. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich- net,
dass der Gerinnungsaktivator den Gerinnungsbereich (18, 18‘) in Form einer porösen Struktur zumindest teilweise füllt.
10. Blutserumgenerator (10, 10‘) nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass, der erste Anschluss (15‘) eine Aufnahmebohrung für ein Kapillar- rohr umfasst oder als Kapilarrohr ausgebildet ist.
1 1. Verfahren zum Abtrennen von Blutserum aus einer Blutprobe umfassend die Schritte:
- Bereitstellen eines Blutserumgenerator (10, 10‘) mit einer Mikroflu- idikstruktur (12, 12‘) nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
- Transportieren einer Blutprobe aus dem Zuführkanal (14, 14‘) in den Gerinnungsbereich, angetrieben durch einen ersten Druckabfall von dem ersten Anschluss (15‘) zu dem zweiten Anschluss,
- Halten der Blutprobe in dem Gerinnungsbereich, bis sie geronnen ist, und
- Transportieren des Blutserums aus dem Gerinnungsbereich (18, 18‘) in den Abführkanal, angetrieben durch einen zweiten Druckabfall von dem ersten Anschluss (15‘) zu dem zweiten Anschluss, während der Rest der geronnenen Blutprobe in dem Gerinnungsbereich (18, 18‘) mittels der Barriere zurückgehalten wird, wobei der zweite Druckabfall und die Barriere im Übergang (28, 28‘) vom Gerinnungsbereich (18, 18‘) zum Abführkanal (26, 26‘) so bemessen sind, dass innere Bindungskräfte den Rest der geronnenen Blutprobe Zusam- menhalten.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , gekennzeichnet durch
- das Bereitstellen eines Gerinnungsaktivators in dem Gerinnungs- bereich (18, 18‘) zum Beschleunigen des Gerinnungsvorgangs.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
dass der Gerinnungsaktivator als Lösung in den Gerinnungsbereich (18, 18‘) eingebracht und anschließend in der offenen Mikrofluidikstruktur (12, 12‘) gefriergetrocknet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,
dass sich der Gerinnungsaktivator beim Transportieren der Blutprobe in den Gerinnungsbereich (18, 18‘) und/oder beim Halten der Blutprobe in dem Gerinnungsbereich (18, 18‘) in der Blutprobe auflöst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeich- net,
dass die Barriere einen flachen Kanalabschnitt umfasst und der Gerin- nungsvorgang im flachen Abschnitt optisch überwacht wird.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet,
dass der erste Druckabfall vom ersten Anschluss (15‘) zum zweiten An- schluss weniger als 10 mbar, vorzugsweise weniger als 5 mbar, beträgt.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet,
dass der zweite Druckabfall vom ersten Anschluss (15‘) zum zweiten An- schluss weniger als 25 mbar, vorzugsweise weniger als 15 mbar, beträgt.
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