WO2020157357A1 - Método para predecir o pronosticar el desarrollo de la artritis reumatoide - Google Patents

Método para predecir o pronosticar el desarrollo de la artritis reumatoide Download PDF

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WO2020157357A1
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chronic inflammatory
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times higher
autoimmune disease
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Inventor
Francisco José TINAHONES MADUEÑO
Antonio FERNÁNDEZ NEBRO
Natalia MENA VÁZQUEZ
Sara MANRIQUE ARIJA
Isabel MORENO INDIAS
Patricia RUIZ LIMÓN
Lidia SÁNCHEZ ALCOHOLADO
Carolina GUTIÉRREZ REPISO
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Universidad de Malaga
Servicio Andaluz de Salud
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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Universidad de Malaga
Servicio Andaluz de Salud
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is within the field of medicine, microbiology and nutrition, and specifically relates to a method for predicting or forecasting an individual's probability of suffering from diseases related to the immune system, and preferably with the development of arthritis. rheumatoid.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA is a systemic disease that always affects the joints, especially the hands and feet.
  • inflammation of the synovial membranes results in the development of bone erosions that impair the functionality of the joints and disable patients.
  • Up to 25% of RA patients will have bone erosion in the first months, but the three years after diagnosis, erosions will occur in up to 70% or more of the patients.
  • RA becomes an overwhelming challenge due to the physical, emotional, and financial burdens caused by the disease (Fischer, 2011).
  • the prognosis of the disease depends on the patient's comorbidities in the presentation and the presence of prognostic factors.
  • Patient factors associated with increased disability, mortality and lack of response to treatments include the presence of high titers of autoantibodies against rheumatoid factor (RF) or citrullinated cyclic peptide (PCC), smoking, high number of affected joints, phase reactants acute high, early appearance of joint erosions and initial disability (Fischer, 2011; Scott et al., 2010).
  • Table 2 shows other factors. Since the use of biological agents prevents erosive bone disease, it is important to administer them early in the course of the disease, during the so-called "window of opportunity", when inflammation is a prominent feature of the disease. AR.
  • Table 1 presents the ACR / EULAR 2010 (American College of Rheumatology / European League against Rheumatism) diagnostic criteria for RA.
  • the patients they are diagnosed with RA if they present at least four of the seven criteria for at least 6 weeks according to criteria of ACR 1987 (Arnett et al., 1988).
  • the new ACR / EULAR 2010 criteria for the diagnosis of rheumatoid arthritis have a higher sensitivity allowing an earlier diagnosis (Aletaha el al, 2010) than with the old ones of the 1987 ACR.
  • Rheumatoid arthritis can be difficult to diagnose in its early stages because the early signs and symptoms mimic those of many other diseases. There is no blood test or physical finding to confirm the diagnosis. During the Physical exam, the doctor checks the joints for swelling, redness, and warmth. You can also check your reflexes and muscle strength.
  • ESG erythrocyte sedimentation rate -
  • PCR C-reactive protein
  • X-rays to help track the progression of rheumatoid arthritis in the joints over time.
  • Tests such as ultrasound and MRI can aid in early diagnosis and monitoring of the disease.
  • DMARDs disease-modifying antirheumatic drugs
  • NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • Over-the-counter NSAIDs include ibuprofen and naproxen sodium. Stronger NSAIDs are available by prescription. Side effects may include ringing in the ears, stomach irritation, heart problems, and liver and kidney damage.
  • Corticosteroid medications such as prednisone, reduce inflammation and pain and slow joint damage. Side effects can include thinning bones, weight gain, and diabetes. Doctors often prescribe a corticosteroid to relieve acute symptoms, with the goal of gradually decreasing the medication.
  • FAMEs Disease modifying antirheumatic drugs
  • FAMEb biological FAME
  • FAMEsd conventional, also called traditional or classic (FAMEsc) and specifically directed to a target (FAMEsd).
  • FAMEsd The former do not have a specific target, their mechanism of action is very heterogeneous, acting at different levels of the immune system as immunosuppressants, immunomodulators or otherwise.
  • FAMEsd have as a mechanism of action the blocking of molecules that are responsible for intracellular signaling.
  • FAMEsc include methotrexate, leflunomide, hydroxychloroquine, and sulfasalazine.
  • DMARDs used in RA include abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, rituximab, and tocilizumab.
  • FAMEsd we find tofacitinib and baricitinib.
  • Bio DMARDs are usually more effective when combined with nonbiological DMARDs, such as methotrexate.
  • Surgery carries a risk of bleeding, infection, and pain.
  • taxonomic groups that make up the intestinal microbiota can be used for early diagnosis, and / or to predict or forecast the risk of an individual suffering from an autoimmune inflammatory disease, and more preferably a chronic systemic inflammatory disease. like RA.
  • Dorea formicigenerans abundance levels were significantly correlated with the degree of joint inflammatory activity measured by various activity indices, such as the Simplified Disease Activity Index (SDAI) or the Clinical Disease Activity Index (CDAI), as well as with the degree of deterioration of physical function mediated by the Health Assessment Questionnaire (HAQ).
  • SDAI Simplified Disease Activity Index
  • CDAI Clinical Disease Activity Index
  • HAQ Health Assessment Questionnaire
  • microorganisms can act as biomarkers for RA disease, which allow us to differentiate the severity or degree of activity of the disease, and be used in clinical practice in order to predict the prognosis of these patients and even improve diagnosis. of them, since currently the diagnostic methods are not enough to make an early detection of RA and avoid irreversible damage.
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data to predict or forecast the evolution of chronic inflammatory autoimmune disease, hereinafter the first method of the invention, comprising:
  • step (b) determine the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota in the sample isolated from step (a).
  • the chronic inflammatory disease is RA.
  • the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) can be carried out by any procedure known in the state of the art. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by PCR. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) further comprises pyrosequencing or mass sequencing techniques.
  • the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) comprises a Gradient Denaturing Gel Electrophoresis (DGGE).
  • DGGE Gradient Denaturing Gel Electrophoresis
  • the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by means of antibodies, preferably fluorescent ones. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by means of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • step (b) further comprises measuring the microbial activity of the taxonomic groups that make up the gut microbiota.
  • microbial activity is measured, but is not limited to, by radioisotopes, microelectrodes, and / or stable isotopes.
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, biological cells, tissues and / or fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample is feces or is derived from feces.
  • taxonomic group is understood to be the group of microorganisms classified in a certain taxonomic category. Normally a taxonomic group that classifies microorganisms includes one or more minor groups, subordinate to the largest. A taxonomic category constitutes a classification group. The taxonomic ranges or categories normally used in taxonomy are: Domain, Kingdom, Edge or Division, Class, Order, Family, Genus, Species.
  • chronic inflammatory autoimmune disease is understood as those diseases mediated by the immune system, including rheumatoid arthritis, Sjógren syndrome, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, autoimmune thyroiditis (Hashimoto and Graves), type 1 diabetes mellitus and inflammatory bowel disease.
  • a second aspect of the invention relates to a method for predicting or forecasting the risk of an individual suffering from a chronic inflammatory autoimmune disease, hereinafter the second method of the invention, comprising steps (a) and (b) of the first method of the invention, and further comprises:
  • step (c) classify the individual from step (a), in the group of individuals with a probability at least 2 times higher, preferably 2.5 times higher, and more preferably 3 times higher, of suffering from a chronic inflammatory disease, if it presents a percentage Collinsela, and more preferably Collinsela aerofaciens at least 2 times higher, preferably 2.5 times higher, and more preferably 3 times higher than the reference percentage.
  • the reference percentage being that of an individual (or the mean values of a group of individuals) who has not been diagnosed with a chronic inflammatory disease.
  • the biological sample isolated from the subject's intestine is a stool sample. More preferably, the chronic inflammatory disease is RA.
  • step (b) The determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) can be carried out by any procedure known in the state of the art.
  • nucleic acid identification techniques immunological techniques or techniques that measure microbial activity.
  • the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by means of nucleic acid identification techniques, and more preferably by PCR techniques. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) further comprises pyrosequencing or mass sequencing techniques. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) comprises a Gradient Denaturing Gel Electrophoresis (DGGE).
  • DGGE Gradient Denaturing Gel Electrophoresis
  • the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by immunological techniques, and more preferably by antibodies, preferably fluorescent ones. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the determination of the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota of step (b) is carried out by means of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • step (b) further comprises measuring the microbial activity of the taxonomic groups that make up the gut microbiota.
  • microbial activity is measured, but is not limited to, by radioisotopes, microelectrodes, and / or stable isotopes.
  • Steps (b) and / or (c), of the method described above can be fully or partially automated, for example, by means of a robotic sensor equipment for detecting the presence in step (b) or computerized classification in step (c).
  • Collinselaaerofaciens belongs to the genus Collinsela, family C oriobacteriaceae, order Coriobacteriales, class Coriobacteriia, PhylumAcf / noóacfer / a, group Terrabacteria, Superreino Bacteria.
  • the term "individual” as used in the description refers to animals, preferably mammals, and more preferably, humans.
  • the term “individual” in this report is synonymous with “patient”, and is not intended to be limiting in any respect, as it may be of any age, sex and physical condition.
  • a third aspect of the invention relates to a kit or device, hereafter the kit or device of the invention, comprising the elements necessary to identify the taxonomic groups that make up the intestinal microbiota in an isolated sample.
  • the kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of identifying taxonomic groups by characterizing the 16S region of the rRNA.
  • the kit or device of the invention comprises the primers for amplifying variable regions of the 16S rRNA gene.
  • Ion-adapters were included in the forward primer followed by a specific multiplex identifier.
  • the primers, probes or antibodies are modified or labeled, for example, but not limited to, by radioactive or immunological labeling.
  • the kit may contain oligonucleotides designed from a known 16S rRNA sequence of the microbiota microorganisms, and / or capable of hybridizing with the sequence of said genes for subsequent PCR amplification.
  • Primers preferably comprise the sequences SEQ ID NO: 1 (primer AERO-F) (5'- CTTTCAGCAGGGAAGAGTCAA-3 ') and SEQ ID NO: 2 (primer AERO-R) (5'- AGCCATGCACCACCTGT-ATGG-3'), according to Kageyama et al, 2000 (FEMS Microbiologyletters, 183: 43-47).
  • the PCR program was created as follows 95 ° C 10 min and 30 cycles of 95 ° C 30sec, 58 ° C 30sec, 20sec 72 ° C followed by 72 ° C for 7 minutes. After agarose gel electrophoresis, the PCR products were purified twice using AgencourtAM Puré Kit (BeckmanCoulter, Milano, Italy) and quantified using QubitTM dsDNA HS Assay Kit (ThermofisherScientific) and an equimolar mixture was obtained before the subsequent processing and sequencing on an Ion S5 platform according to the manufacturer's protocols (ThermoFisherScientific, MA, USA).
  • the kit or device of the invention further comprises the elements necessary to perform a massive sequencing.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides that have any of their atoms with a radioactive isotope, normally 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as for example with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized on a membrane.
  • a radioactive isotope normally 32 P or tritium
  • immunologically labeled nucleotides such as for example with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized on a membrane.
  • the kit of the invention can include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An RNA microarray is an array on a solid substrate (typically a glass slide or a thin-film silicon cell) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate.
  • Each spot contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, such as probes (or indicators).
  • the number of spots is not limited in any way, there is a preferred embodiment in which the microarray is customized for the methods of the invention.
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less. Therefore, another aspect of the invention relates to a microarray comprising oligonucleotides designed from a known sequence or mRNA of the genes, and / or capable of hybridizing with the sequences of the genes.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequentially elongating a single nucleotide growing chain using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by means of a selective nucleotide activation method, protected by a photo-labile reagent, by the selective incidence of light through a photo mask.
  • the mask photo can be physical or virtual.
  • the oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • the synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • Supports could be, but are not limited to, NC or nylon (charged) filters or membranes, silicon, or glass carriers for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes, or epoxy.
  • the probe is each of the samples on the chip.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention to predict or forecast the evolution of a chronic inflammatory autoimmune disease.
  • the chronic inflammatory disease is RA.
  • a fifth aspect of the invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, comprising bacteria of the genus Dorea. More preferably the composition of the invention comprises bacteria of the species Dorea formicigenerans.
  • the composition is a pharmaceutical composition. More preferably the composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier or carrier, a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the preparation of therapeutic compositions comprising microorganisms.
  • the composition further comprises another active ingredient.
  • active ingredient means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect on diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the making of the drug and are present in the drug in an intended modified form that provides the specific activity or effect.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical form, hereinafter the pharmaceutical form of the invention, comprising the composition of the invention.
  • pharmaceutical form is understood to be the mixture of one or more active ingredients with or without additives that have physical characteristics for their proper dosage, preservation, administration and bioavailability.
  • compositions and dosage forms of the invention are suitable for oral administration, in solid or liquid form.
  • Possible forms for oral administration are tablets, capsules, syrups or solutions and may contain conventional excipients known in the pharmaceutical field, such as aggregating agents (eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar , corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine), disintegrants (eg starch, polyvinylpyrrolidone or microcrystalline cellulose) or a pharmaceutically acceptable surfactant such as sodium lauryl sulfate.
  • Other dosage forms may be colloidal systems, which include nanoemulsions, nanocapsules, and polymeric nanoparticles.
  • compositions for oral administration can be prepared by conventional Pharmaceutical Galenic methods, such as mixing and dispersing.
  • the tablets can be coated following methods known in the pharmaceutical industry.
  • compositions and dosage forms can be adapted for parenteral administration, as sterile solutions, suspensions, or lyophilisates of the products of the invention, using the appropriate dose.
  • Suitable excipients can be used, such as pH buffering agents or surfactants.
  • compositions or pharmaceutical forms of the present invention can be prepared using conventional methods, such as those described in the Pharmacopoeias of different countries and in other reference texts.
  • administration of the compositions or pharmaceutical forms of the present invention can be carried out by any suitable method and the oral or topical routes. Oral administration is preferred for the convenience of the patients and for the chronic nature of the diseases to be treated.
  • the amount of a compound of the present invention administered will depend on the relative efficacy of the chosen compound, the severity of the disease to be treated and the weight of the patient. However, the compounds of this invention will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3 or 4 times a day, with a total dose between 0.1 and 1000 mg / Kg / day. It is important to bear in mind that it may be necessary to introduce variations in the dose, depending on the age and condition of the patient, as well as modifications in the route of administration.
  • compositions of the present invention can be used together with other drugs in combination therapies.
  • the other drugs may be part of the same composition or of a different composition, for administration at the same time or at different times.
  • Another aspect of the invention relates to the composition of the invention for use as a medicine.
  • medicine refers to any substance used for the prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • composition of the invention for predicting or forecasting the course of a chronic inflammatory autoimmune disease.
  • the chronic inflammatory disease is RA.
  • the composition comprises bacteria of the species Dorea formicigenerans.
  • the composition of the invention is a food composition such as a nutraceutical composition or a composition of the "medical food” type, hereinafter the food composition of the invention.
  • compositions are commonly called probiotics.
  • Probiotics are compositions with live added microorganisms that remain active in the intestine in sufficient quantity to alter the host's intestinal microbiota, both by implantation and by colonization. They can have beneficial effects when ingested in sufficient quantities. They can pass through the digestive system and recover alive in the stool, but they also adhere to the intestinal mucosa.
  • the World Health Organization defined probiotics as "Live microorganisms that, when supplied in adequate amounts, promote health benefits of the host organism"
  • the expression “adequate amounts” or also “therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of carrying out the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, it will be determined, among other causes, by the characteristics of the compounds and the patients themselves, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • the food composition of the invention comprises bacteria of the genus Dorea, and preferably Dorea formicigenerans, in an effective amount for the prevention, relief and / or treatment of a chronic inflammatory disease, and preferably for the prevention, relief and treatment of RA, in mammals, including a human.
  • Preferred food compositions are selected from the list consisting of: a drink, milk, yogurt, cheese, fermented milk, flavored milk drink, soy milk, pre-cooked cereals, bread, cakes, butter, margarine, sauces, frying oils , vegetable oils, corn oil, olive oil, soybean oil, palm oil, sunflower oil, cottonseed oil, condiments, salad dressings, fruit juices, syrups, desserts, glazes and fillings, soft frozen products, sweets, chewing gum and intermediate foods.
  • the food composition of the invention can be a nutritional or dietary supplement.
  • the nutritional or dietary supplement comprises a sterile composition containing the bacteria of the genus Dorea, and preferably Dorea formicigenerans, preferably provided with a gastric acid resistant coating, being a delayed release composition.
  • the food composition, including bacteria of the genus Dorea, and preferably Dorea formicigenerans and / or the nutritional or dietary supplement comprises appropriate "carriers" such as diluents, adjuvants, excipients, or vehicles with which the compound is administered. the invention.
  • Suitable suitable excipients include, but are not limited to starch, glucose, fructose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, calcium sulfate, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like.
  • Such nutritional supplements can be used to combat inflammatory problems, and help maintain a mammal's health, or a healthy lifestyle, preferably a human being.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the food composition of the invention to predict or forecast the evolution of a chronic inflammatory autoimmune disease.
  • Another aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions for causing a computer to carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be made up of said cable or another device or medium.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk. Lasted.
  • the programs could be supported on a transmittable carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may take the form of source code, object code, an intermediate source of code, and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer programs also encompass cloud applications based on this procedure.
  • Another aspect of the invention relates to a computer readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine, and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit degradation of the probe; or as junction points for detectable debris or shielding debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more derivatized, non-standard, modified base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -terc-butyl-benzyl-adenine, imidazole, substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5- carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylamino, 5-carboxymethylamino.
  • derivatized, non-standard, modified base moieties including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -terc-butyl-benzyl-adenine, imidazole, substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar residues including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • a biologically active variant or fragment is understood as those variants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. These effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the ratio of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences being compared. Sequence comparison methods are known in the art, and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereuxef al., NucleicAcidsResearch 12: 287 (1984) Genetics Computer GroupUniversity of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • the results of the invention showed a significant increase in Collinsela aerofaciens bacteria in RA patients compared to healthy donors.
  • an increase in the action of arginine deiminase was observed, which belonged approximately 90% to the AR genes of the Collinsela genus.
  • the importance of the enzyme arginine deiminase is that it catalyzes a reaction in which the arginine substrate will give rise to citrulline among other products.
  • the most specific autoantibodies are citrullinated cyclic anti-peptide antibodies (ACPAs) that are directed against citrullinated peptides and proteins.
  • ACPAs citrullinated cyclic anti-peptide antibodies
  • Collinsella aerofaciens has been associated with younger RA patients and high ACPA titers.
  • younger RA patients are associated with a higher frequency of positive ACPAs and a greater severity of the disease.
  • Collinsella aerofaciens is associated with tobacco, which is involved in the protein citrunilation process,

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Abstract

Método para predecir o pronosticar el desarrollo de la artritis reumatoide Método para predecir o pronosticar la probabilidad de un individuo de padecer enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, y preferiblemente con el desarrollo de artritis reumatoide, kit o dispositivo de diagnóstico y usos.

Description

MÉTODO PARA PREDECIR O PRONOSTICAR EL DESARROLLO DE LA
ARTRITIS REUMATOIDE
DESCRIPCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, la microbiología y la nutrición, y específicamente se refiere a un método para predecir o pronosticar la probabilidad de un individuo de padecer enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, y preferiblemente con el desarrollo de artritis reumatoide.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica de naturaleza autoinmune que causa daño articular, discapacidad y deterioro de la calidad de vida y una disminución de la esperanza de vida. La mayoría de las muertes suceden por causas cardiovasculares, pulmonares e infecciosas. Estos graves desenlaces se asocian con unos elevados costes sanitarios, sociales y personales. Además, provoca elevados costes para la sociedad y se asocia con una elevada mortalidad cardiovascular y pulmonar o por infecciones. La AR afecta a unas 240.000 personas en España y cada año se diagnostican 20.000 nuevos casos.
Aunque se desconoce la etiología precisa de la AR, el paradigma actual es que los individuos genéticamente predispuestos progresan por al menos 6 fases evolutivas, tanto preclínicas como clínicas, antes de que la AR esté plenamente establecida (1). Se piensa que esta transición es en parte fruto de interacciones entre factores genéticos y ambientales.
Se cree que primero se produce una pérdida de la tolerancia inmune local en lugares distantes a las articulaciones, que se propaga a otros sistemas. Los lugares donde más probablemente este proceso se inicia son las superficies mucosas donde se ubican la microbiota y una gran cantidad de células inmunitarias.
l La microbiota comensal y patógena, y sus metabolitos, podrían producir además cambios epigenéticos en sus comensales por muchos mecanismos poco conocidos. El presente proyecto trata de estudiar las relaciones entre microbiota intestinal y epigenética en el desarrollo de la AR. Sin embargo aún son necesarios más estudios y profundos sobre cómo la microbiota influye en la patogénesis y progresión de la AR.
La AR es una enfermedad sistémica que afecta siempre a las articulaciones, sobre todo de manos y pies. En las articulaciones, la inflamación de las membranas sinoviales da lugar al desarrollo de erosiones óseas que deterioran la funcionalidad de las articulaciones y discapacitan a los pacientes. Aproximadamente el 60-90% de los pacientes siguen un curso evolutivos destructivo con rápido deterioro físico. Hasta el 25% de los pacientes con AR tendrán erosión ósea en los primeros meses, pero los tres años posteriores al diagnóstico, presentan erosiones hasta el 70% o más de los pacientes. En los primeros 10 años posteriores al diagnóstico, cerca del 50% de los pacientes deberán dejar de trabajar, y la AR se convierte en un desafío abrumador debido a las cargas físicas, emocionales y financieras causadas por la enfermedad (Fischer, 2011).
El pronóstico de la enfermedad depende de las comorbilidades del paciente en la presentación y de la presencia de factores pronósticos. Los pacientes factores asociados a mayor discapacidad, mortalidad y falta de respuesta a los tratamientos incluyen la presencia de títulos altos de autoanticuerpos contra el factor reumatoide (RF) o péptido cíclico citrulinado (PCC), tabaquismo, número elevado de articulaciones afectadas, reactantes de fase aguda elevados, aparición precoz de erosiones articulares y discapacidad inicial (Fischer, 2011 ; Scott et al., 2010). En la tabla 2 se muestran otros factores Dado que el uso de agentes biológicos previene la enfermedad ósea erosiva, es importante administrarlos tempranamente en el curso de la enfermedad, durante la llamada "ventana de oportunidad", cuando la inflamación es una característica prominente de la AR.
A pesar de los muchos avances tanto en nuestra comprensión como en el tratamiento de la AR, sigue siendo en gran medida incurable y sus causas son aún desconocidas. La enfermedad puede llevar a mortalidad prematura, discapacidad y disminución de la calidad de vida (Brooks, 2006; CDC, 2015).
La Tabla 1 presenta los criterios diagnósticos de ACR/EULAR 2010 (American College of Rheumatology/ European League Against Rheumatism) para la AR. Los pacientes son diagnosticados con AR si presentan al menos cuatro de los siete criterios durante al menos 6 semanas según criterios de ACR 1987 (Arnett et al., 1988). Los nuevos criterios ACR /EULAR 2010 para el diagnóstico de artritis reumatoide presentan una mayor sensibilidad permitiendo un diagnóstico más precoz (Aletaha el al, 2010) que con los antiguos de la ACR de 1987.
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La artritis reumatoide puede ser difícil de diagnosticar en sus primeras etapas debido a que los primeros signos y síntomas imitan a los de muchas otras enfermedades. No hay un análisis de sangre o un hallazgo físico para confirmar el diagnóstico. Durante el examen físico, el médico revisa las articulaciones en busca de hinchazón, enrojecimiento y calor. También puede revisar sus reflejos y la fuerza muscular.
Análisis de sangre
Las personas con artritis reumatoide a menudo tienen una tasa elevada de la velocidad de sedimentación globular (VSG o ESR, del inglés erythrocyte sedimentation rate -) o proteína C reactiva (PCR), que puede indicar la presencia de un proceso inflamatorio en el cuerpo. Otros análisis de sangre comunes buscan anticuerpos contra el factor reumatoide y anticuerpos antipéptidoscíclicos citrulinados(ACPAs).
Pruebas de imagen
Radiografías para ayudar a rastrear la progresión de la artritis reumatoide en las articulaciones con el tiempo. Las pruebas como la ecografía y la RMN pueden ayudar al diagnóstico precoz y monitorización de la enfermedad.
Tratamiento
No hay cura para la artritis reumatoide. Pero los descubrimientos recientes indican que la remisión de los síntomas es más probable cuando el tratamiento comienza temprano con medicamentos fuertes conocidos como medicamentos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD, por sus siglas en inglés).
Medicamentos
Dependerán de la gravedad de sus síntomas y de cuánto tiempo haya tenido artritis reumatoide.
• AINEs. Los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) pueden aliviar el dolor y reducir la inflamación. Los AINE de venta libre incluyen ibuprofeno y naproxeno sódico. Los AINE más fuertes están disponibles con receta médica. Los efectos secundarios pueden incluir zumbidos en los oídos, irritación estomacal, problemas cardíacos y daño hepático y renal.
• Esteroides Los medicamentos corticosteroides, como la prednisona, reducen la inflamación y el dolor y retardan el daño articular. Los efectos secundarios pueden incluir adelgazamiento de los huesos, aumento de peso y diabetes. Los médicos a menudo recetan un corticosteroide para aliviar los síntomas agudos, con el objetivo de disminuir gradualmente la medicación.
• Fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME). Estos se clasifican de acuerdo con la manera de producirlos en sintéticos (FAMEs), cuya producción es mediante síntesis química tradicional y en FAME biológicos (FAMEb) que se producen empleando células vivas, de modo similar al de las vacunas. Los FAMEs, a su vez, se dividen en convencionales también llamados tradicionales o clásicos (FAMEsc) y dirigidos específicamente a una diana (FAMEsd). Los primeros no tienen una diana específica, su mecanismo de acción es muy heterogéneo, actuando en diferentes niveles del sistema inmune como inmunosupresores, inmunomoduladores o de otro tipo. Los FAMEsd tienen como mecanismo de acción el bloqueo de moléculas que se encargan de la señalización intracelular. Estos fármacos han demostrado ser eficaces en el control de la actividad de la enfermedad, la función física, calidad de vida y progresión radiológica de la enfermedad
• Entre los FAMEsc se incluyen metotrexato, leflunomida, hidroxicloroquina y sulfasalazina.
Los efectos secundarios varían, pero pueden incluir daño hepático, supresión de la médula ósea e infecciones pulmonares graves.
• Los FAMEb utilizados en la AR incluye abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, rituximab ytocilizumab. Entre los FAMEsd encontramos tofacitinib y baricitinib.
Estos medicamentos pueden atacar partes del sistema inmunológico que desencadenan una inflamación que causa daños en las articulaciones y los tejidos. Estos tipos de medicamentos también aumentan el riesgo de infecciones.
Los DMARDs biológicos suelen ser más efectivos cuando se combinan con un DMARDs no biológico, como el metotrexato.
Terapia física u ocupacional, mediante ejercicios para ayudar a mantener las articulaciones flexibles.
Cirugía
Si los medicamentos no previenen o retrasan el daño articular, se puede considerar una cirugía para reparar las articulaciones dañadas. También puede reducir el dolor y corregir deformidades.
La cirugía conlleva un riesgo de sangrado, infección y dolor.
En España, de acuerdo con Carbonell et al., 2008, la sospecha de artritis temprana se definió como cualquier paciente que se presente por primera vez en el último medio año con uno o más de los siguientes síntomas:
(i) más de una articulación inflamada; (ii) dolor en las articulaciones meta-carpofalíngeas o meta-tarsofalángicas; y
(iii) rigidez matutina actual en las manos durante más de 30 minutos.
En el momento actual no existen métodos de diagnóstico que detecten de manera temprana la enfermedad. La detección temprana puede evitar la enfermedad ósea erosiva, por lo que es necesario el desarrollo de métodos de detección temprana de la enfermedad.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. A) Beta diversidad. Según análisis de similitud (ANOSIM) los pacientes con AR (azul) tienden (P=0,07) a diferir con los sujetos sanos(rojo) de acuerdo a su microbiota. B) En cuanto a la biodiversidad (medida por el índice Simpson), los pacientes AR parecen mostrar una biodiversidad menor, aunque de manera no significativa (P>0.05). C) Atendiendo a la composición microbiana, se ha encontrado un dato interesante a nivel de especie: la especie Collinselaaerofaciens se encuentra significativamente (P=0,034) incrementada en los pacientes AR, mientras que Doreaformicigenerans se encuentra decrecida (P=0,041). D) Se ha calculado con las especies anteriores un índice de AR atendiendo al log(abundancia especies incrementadas AR)/log(abundancia especies disminuidas AR), encontrándose incrementado en los pacientes AR.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han identificado que grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal pueden emplearse para el diagnóstico temprano, y/o para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer una enfermedad inflamatoria autoinmune, y más preferiblemente una enfermedad inflamatoria sistémica crónica como la AR.
Los resultados de los ensayos realizado mostraron un aumento significativo de la bacteria Collinsela aerofaciens en pacientes AR respecto a donantes sanos. Además, se observó un aumento en la acción de la arginina deiminasa, que pertenecía aproximadamente en un 90% a los genes de AR del género Collinsela. La importancia de la enzima arginina deiminasa es que cataliza una reacción en la que el sustrato arginina dará lugar a citrulina entre otros productos. En la AR los autoanticuerpos más específicos son los anticuerpos antipéptidos cíclicos citrulinados (ACPAs) que se dirigen contra péptidos y proteínas citrulinados. Por tanto, la alteración de Collinselaaerofaciens podría influir significativamente, mediante mecanismos enzimáticos, en la perpetuación de la autoinmunidad de la enfermedad.
Asimismo, los resultados revelaron un descenso significativo de Dorea formicigenerans en pacientes AR respecto a donantes sanos. Los niveles de abundancia de Dorea formicigenerans se correlacionaron significativamente con el grado de actividad inflamatoria articular medida por diversos índices de actividad, como el índice simplificado de la actividad de la enfermedad (SDAI) o el índice clínico de actividad de la enfermedad (CDAI), así como con el grado de deterioro de la función física mediado por Health Assesment Questionnaire (HAQ).
Estos microorganismos pueden actuar como biomarcadores para la enfermedad de la AR, los cuales nos permitan diferenciar la gravedad o grado de actividad de la enfermedad, y ser utilizados en la práctica clínica con el fin de predecir el pronóstico de estos pacientes e incluso mejorar el diagnóstico de los mismos, ya que actualmente los métodos de diagnóstico no son suficientes para hacer una detección precoz de la AR y evitar daños irreversibles.
A largo plazo estos resultados podrían sugerir nuevas dianas terapéuticas para la AR que frenaran la actividad inflamatoria de esta patología y supongan una mejora coste- efectividad para el sistema de sanidad y la población en general.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la evolución de la enfermedad autoinmune inflamatoria crónica, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) obtener una muestra biológica de dicho individuo, y
b) determinar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en la muestra aislada del paso (a).
Más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria crónica es la AR.
La determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido en el estado del arte. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) además comprende técnicas de pirosecuenciación o secuenciación masiva.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) comprende una Electroforesis en Gel Desnaturalizante en Gradiente (DGGE).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante anticuerpos, preferiblemente fluorescentes. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el paso (b) además comprende la medición de la actividad microbiana de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal. Preferiblemente, la actividad microbiana se mide, aunque sin limitarnos, mediante radioisótopos, microelectrodos e/o isótopos estables.
Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada son heces fecales o procede de heces fecales.
En esta memoria se entiende por“grupo taxonómico” al grupo de microorganismos clasificados en una determinada categoría taxonómica. Normalmente un grupo taxonómico que clasifique a unos microorganismos abarca uno o varios grupos menores, subordinados al mayor. Una categoría taxonómica constituye un grupo de clasificación. Los rangos o categorías taxonómicas normalmente usados en taxonomía son: Dominio, Reino, Filo o División, Clase, Orden, Familia, Género, Especie. En esta memoria se entiende por“enfermedad autoinmune inflamatoria crónica” a aquellas enfermedades mediadas por el sistema inmune, incluyendo la artritis reumatoide, síndrome de Sjógren, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunes (Hashimoto y Graves), diabetes mellitus tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención, y además comprende:
c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, preferiblemente 2,5 veces mayor, y más preferiblemente 3 veces mayor, de padecer una enfermedad inflamatoria crónica, si presenta un porcentaje de Collinsela, y más preferiblemente Collinsela aerofaciens al menos 2 veces superior, preferiblemente 2,5 veces superior, y más preferiblemente 3 veces superior al porcentaje de referencia.
siendo el porcentaje de referencia el de un individuo (o los valores medios de un grupo de individuos) que no ha sido diagnosticado de una enfermedad inflamatoria crónica.
Preferiblemente, la muestra biológica aislada del intestino del individuo es una muestra de heces. Más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria crónica es la AR.
La determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido en el estado del arte.
Así, se puede realizar mediante técnicas de identificación de ácidos nucléicos, técnicas inmunológicas o técnicas que midan la actividad microbiana.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante técnicas de identificación de ácidos nucléicos, y más preferiblemente mediante técnicas de PCR. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) además comprende técnicas de pirosecuenciación o secuenciación masiva. En otra realización preferida de este aspecto de la invención la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) comprende una Electroforesis en Gel Desnaturalizante en Gradiente (DGGE).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante técnicas inmunológicas, y más preferiblemente mediante anticuerpos, preferiblemente fluorescentes. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el paso (b) además comprende la medición de la actividad microbiana de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal. Preferiblemente, la actividad microbiana se mide, aunque sin limitarnos, mediante radioisótopos, microelectrodos e/o isótopos estables.
Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).
Collinselaaerofaciens pertenece al género Collinsela, familia C oriobacteriaceae, orden Coriobacteriales, clase Coriobacteriia , PhylumAcf/noóacfer/a, grupo Terrabacteria, Superreino Bacteria.
El término“individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término“individuo” en esta memoria, es sinónimo de “paciente”, y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para identificar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en una muestra aislada. En una realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de identificar los grupos taxonómicos mediante la caracterización de la región 16S del ARNr.
En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende los cebadores para amplificar regiones variables del gen del ARNr 16S. Ion-adaptadores se incluyeron en el cebador directo seguido de un identificador específico Multiplex.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida del 16S ARNr de los microorganismos de la microbiota, y/o capaces de hibridar con la secuencia de dichos genes para posterior amplificación por PCR. Preferiblemente los cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO: 1 (cebador AERO-F) (5’- CTTTCAGCAGGGAAGAGTCAA-3’ ) y SEQ ID NO: 2 (cebador AERO-R) (5’- AGCCATGCACCACCTGT- ATGG-3’), de acuerdo a Kageyama et al, 2000 (FEMS Microbiologyletters, 183: 43-47).
En una realización particular el programa de PCR fue creado como sigue 95° C 10 min y 30 ciclos de 95°C 30seg, 58°C 30seg, 20 seg 72°C seguido por 72°C durante 7 minutos. Después de la electroforesis en gel de agarosa, los productos PCR fueron purificados dos veces utilizando Kit AgencourtAM Puré (BeckmanCoulter, Milano, Italia) y se cuantificó utilizando el kit Qubit TM dsDNA HS Assay Kit (ThermofisherScientific) y una mezcla equimolar se obtuvo antes de la su posterior procesamiento y secuenciación en una plataforma Ion S5 de acuerdo con los protocolos del fabricante (ThermoFisherScientific, MA, USA).
En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención además comprende los elementos necesarios para realizar una secuenciación masiva. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo foto lábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una foto máscara. La foto máscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para predecir o pronosticar la evolución de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica.
En una realización preferida, la enfermedad inflamatoria crónica es la AR. COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
Un quinto aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende bacterias del género Dorea. Más preferiblemente la composición de la invención comprende bacterias de la especie Dorea formicigenerans.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica. Más preferiblemente la composición además comprende un transportador o carrier farmacéuticamente aceptable, un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas que comprenden microorganismos.
En otra realización preferida de la invención, la composición además comprende otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende la composición de la invención.
En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.
En otra realización preferida de la presente invención, las composiciones y formas farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinilpirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio. Otras formas farmacéuticas pueden ser los sistemas coloidales, dentro de los cuales se incluyen nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas poliméricas.
Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.
Las composiciones y formas farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes.
Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia. La administración de las composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado y las vías oral o tópica. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar.
La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.
Las composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.
Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para predecir o pronosticar la evolución de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad inflamatoria crónica es la AR. En otra realización preferida la composición comprende bacterias de la especie Dorea formicigenerans. COMPOSICIÓN ALIMENTARIA
En otro aspecto de la invención, la composición de la invención es una composición alimentaria tal y como una composición nutracéutica o una composición del tipo “medical food’, de ahora en adelante composición alimentaria de la invención.
Estas composiciones se denominan habitualmente probióticos. Los probióticos son composiciones con microorganismos vivos adicionados que permanecen activos en el intestino en cantidad suficiente como para alterar la microbiota intestinal del huésped, tanto por implantación como por colonización. Pueden tener efectos beneficiosos cuando son ingeridos en cantidades suficientes. Pueden atravesar el aparato digestivo y recuperarse vivos en los excrementos, pero también se adhieren a la mucosa intestinal.
En el año 2002, la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió los probióticos como «Microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades adecuadas, promueven beneficios en la salud del organismo anfitrión»
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión“cantidades adecuadas” o también“cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos y de los pacientes, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
La composición alimentaria de la invención comprende las bacterias del género Dorea, y preferiblemente Dorea formicigenerans, en una cantidad eficaz para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica, y preferiblemente para la prevención, alivio y tratamiento de la AR, en mamíferos, incluyendo un ser humano. Las composiciones alimentarias preferidas se seleccionan de la lista que consiste en: una bebida, leche, yogur, queso, leche fermentada , bebida de leche aromatizada, leche de soja, cereales precocinados, pan, pasteles, mantequilla, margarina, salsas, aceites para freír, aceites vegetales, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, condimentos, aderezos para ensaladas, zumos de frutas, jarabes, postres, glaseados y rellenos, productos congelados blandos, dulces, chicles y alimentos intermedios. La composición alimentaria de la invención puede ser un suplemento nutricional o dietético. En otra realización preferida, el suplemento nutricional o dietético comprende una composición estéril que contiene las bacterias del género Dorea, y preferiblemente Dorea formicigenerans, preferentemente provisto de un revestimiento resistente a los ácidos gástricos, siendo una composición de liberación retardada. En otra realización preferida, la composición alimentaria, incluyendo las bacterias del género Dorea, y preferiblemente Dorea formicigenerans y/o el suplemento nutricional o dietético comprende "portadores" apropiados tales como diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehículos con los que se administra el compuesto de la invención. Excipientes apropiados adecuados incluyen, pero no se limitan a almidón, glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, sulfato de calcio, gel de sílice , estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. Tales suplementos nutricionales se pueden utilizar para combatir problemas inflamatorios, y ayudan a mantener la salud o un estilo de vida saludable al mamífero, preferiblemente un ser humano.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición alimentaria de la invención para predecir o pronosticar la evolución de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica
MEDIOS AUTOMATIZADOS DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina,1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), áster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-dia inopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos “secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereuxef al., NucleicAcidsResearch 12: 287 (1984) Genetics Computer GroupUniversity of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Los resultados de la invención mostraron un aumento significativo de la bacteria Collinsela aerofaciens en pacientes AR respecto a donantes sanos. Además, se observó un aumento en la acción de la arginina deiminasa, que pertenecía aproximadamente en un 90% a los genes de AR del género Collinsela. La importancia de la enzima arginina deiminasa es que cataliza una reacción en la que el sustrato arginina dará lugar a citrulina entre otros productos. En la AR los autoanticuerpos más específicos son los anticuerpos antipéptidos cíclicos citrulinados (ACPAs) que se dirigen contra péptidos y proteínas citrulinados. De hecho, Collinsella aerofaciens se ha asociado a pacientes AR más jóvenes y títulos altos de ACPAs. Asimismo, en la literatura se ha demostrado que los pacientes AR más jóvenes se asocian a una mayor frecuencia de ACPAs positivos y una mayor gravedad de la enfermedad. Además, Collinsella aerofaciens se asocia con el tabaco, el cual está involucrado en el proceso de citrunilación de proteínas,
Por tanto, la alteración de Collinsela aerofaciens podría influir significativamente, mediante mecanismos enzimáticos, en la perpetuación de la autoinmunidad de la enfermedad. Asimismo, los resultados de los ejemplos de la invención revelaron un descenso significativo de Dorea formicigenerans en pacientes AR respecto a donantes sanos, considerando dicha bacteria protectora frente a la enfermedad.

Claims

REIVINICACIONES
1.- Un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la evolución de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica, que comprende: a) obtener una muestra biológica de dicho individuo, y b) determinar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en la muestra aislada del paso (a).
2.- Un método para predecir o pronosticar la evolución de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica que comprende los pasos (a) y (b) según la reivindicación 1 , y además comprende: c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, preferiblemente 2,5 veces mayor, y más preferiblemente 3 veces mayor, de padecer una enfermedad inflamatoria crónica, si presenta un porcentaje de Collinsela, y más preferiblemente Collinsela aerofaciens al menos 2 veces superior, preferiblemente 2,5 veces superior, y más preferiblemente 3 veces superior al porcentaje de referencia.
3.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la enfermedad autoinmune inflamatoria crónica es la AR.
4 - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la muestra biológica aislada del intestino del individuo es una muestra de heces fecales o proviene de heces fecales.
5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal se realiza por una técnica de PCR, por una técnica inmunológica, o por una técnica que mida la actividad microbiana.
6.- Un kit o dispositivo de diagnóstico que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 ( AERO-F) (5’-CTTTCAGCAGGGAAGAGTCAA-3’ ) y SEQ ID NO: 2 (cebador AERO-R) (5’-AGCCATGCACCACCTGT- ATGG-3’).
7.- El uso del kit o el dispositivo según la reivindicación 6, para predecir o pronosticar la evolución de la enfermedad autoinmune inflamatoria crónica que enfermedad inflamatoria crónica autoinmune, preferiblemente AR.
8.- Una composición que comprende bacterias del género Dorea, más preferiblemente de la especie Dorea formicigenerans
9.- La composición según la reivindicación 8 para su uso como medicamento.
10.- La composición según la reivindicación 8 para su uso en la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica, preferiblemente AR.
11.- Una composición alimentaria tal y como una composición nutracéutica o una composición del tipo “medical food’ que comprende una composición según la reivindicación 8.
12.- El uso de una composición alimentaria según la reivindicación 11 para la prevención, alivio y/o tratamiento de una enfermedad inflamatoria crónica, y preferiblemente para la prevención, alivio y tratamiento de la AR.
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