WO2020122090A1

WO2020122090A1 - 解毒剤

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Publication number: WO2020122090A1
Application number: PCT/JP2019/048382
Authority: WO
Inventors: 古性　均; 敬太郎吉本; 幸二和久井; 徹吉冨; 雅都宮川
Original assignee: Nissan Chemical Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Nissan Chemical Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-06-18
Anticipated expiration: 2021-06-11
Also published as: JP2022044843A

Abstract

本発明は、一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに、前記核酸アプタマーの配列に相補的ではない核酸配列（トーホールド配列）が、ステム部分の二本鎖のいずれかの末端に結合している、トーホールド配列付加核酸アプタマー、又は前記一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに相補的な核酸配列を有する核酸に、前記トーホールドに相補的な核酸配列を有する核酸が、前記の末端とは異なる末端に結合している、解毒剤に関する。

Description

解毒剤

　本発明は、トーホールド結合核酸アプタマー及びその解毒剤に関する。

　トロンビンは、多機能セリンプロテアーゼであり、止血ネットワークに重要な酵素である。血小板の活性化やフィブリノーゲンのタンパク質分解によるフィブリン形成の誘導を介して血液を凝固させる役割を担っている。トロンビンの酵素活性の阻害は、基質の認識および結合に関与するアニオン結合エキソサイトＩやＩＩをブロックすることによって引き起こされる。エキソサイトＩは、フィブリノーゲン、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子などが結合する。

　フィブリノーゲンは、血漿中に高濃度（２～４ｍｇ／ｍＬ、６～１２μＭ）で存在するタンパク質であり、トロンビンによってフィブリンに転化し、止血を行う役割を担っている。

　血液凝固は複数の因子からなる連鎖反応で、ある凝固因子が活性化されると、活性化された凝固因子がまた別の凝固因子を活性化する。同反応の開始は、内因系と外因系に大別され、共に共通系の第Ｘ因子を活性化する。活性化された第Ｘａ因子は第Ｖａ因子と共にプロトロンビンを分解・活性化してトロンビンを生成する。最終的に、トロンビンがフィブリノーゲンをフィブリンに変え、血餅をつくることにより、血液が凝固するという仕組みになっている。

　血栓塞栓症は罹患率および死亡率の高い疾患であるため、同疾病の治療可能な抗凝固剤の開発は重要である。既存の薬剤であるヘパリンは副作用が問題視されており、近年、ヘパリンに代わる新たな抗凝固剤が急速に開発されている（非特許文献１）。タンパク質や低分子化合物を骨格とした抗凝固剤が多く開発され、臨床において効果を発揮している。しかし、強力な抗凝固薬は出血リスクという副作用と隣り合わせであり、薬効を特異的に中和することができるような薬剤が求められている。

　核酸アプタマーは、様々な分子（金属イオン、小分子、タンパク質、細胞など）を特異的に認識するための分子として機能する一本鎖の機能的オリゴヌクレオチドである。また、核酸アプタマーは抗体に比べ、動物を利用せずにスクリーニングが可能であること、安価かつ容易に人工合成・修飾が可能であること、熱安定性が高く保存に優れていること、免疫原性が低いことなどの利点がある（非特許文献２、３）。さらに、抗体や小分子は、副作用が生じたときに投与する解毒剤の開発が困難であるが、アプタマーは相補鎖や小分子の添加によって比較的容易に制御できる。

　従来知られている代表的なトロンビン核酸アプタマーを以下に示す。

　ＴＢＡ１５（別名ＨＤ１：５’―ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ―３’）は、１５マーのトロンビンアプタマーであり、２つのＴＴループとＴＧＴモチーフを挟んでグアニン四重鎖構造を有している（非特許文献４）。ＴＢＡ１５は、トロンビンのエキソサイトＩに結合して不活性化させることが分かっており、冠動脈バイパス手術中の抗凝固剤（ＡＲＣ１８３）として臨床試験が行われた。しかし、ＴＢＡ１５の投与は抗凝固活性をもたらしたが、望ましい抗凝固活性を得るために必要な薬物量が適切ではなかったことから、臨床試験はフェーズＩ終了後に中止された（非特許文献５）。

　ＮＵ１７２（５’―ＣＧＣＣＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧ―３’）は、エキソサイトＩに結合する２６マーのトロンビンアプタマーである（非特許文献６）。　同アプタマーは、抗凝固剤の開発を目的とし、ＴＢＡ１５に代わるアプタマーとして開発された。ＮＵ１７２はＴＢＡ１５と同様に、血液凝固を阻害することが分かっており、冠動脈バイパス手術中の抗凝固剤（ＡＲＣ２１７２）として臨床試験が行われ、現在はフェーズＩＩの試験中である（非特許文献７）。

　ＴＢＡ２９（別名ＨＤ２２：５’―ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ―３’）は、２９マーのトロンビンアプタマーであり、二重鎖とグアニン四重鎖が混合した構造を有している（非特許文献８）。エキソサイトＩＩに結合して凝固反応阻害に関わるが、エキソサイトIのように直接フィブリノーゲンの代謝に関わるドメインではないため阻害効果は比較的緩やかである。

　核酸アプタマーは、相補鎖を加えることによって、解毒をコントロールすることができる。しかしながら、抗凝固薬のような技術分野においては、より迅速かつ確実な解毒手段が望まれている。

Kong、 Y.; Chen、 H.; Wang、Y. Q.; Meng、 L.; Wei、 J. F. Direct thrombin inhibitors: Patents 2002-2012 (Review); D.A. Spandidos、 2014; Vol. 9. Banerjee、 J.; Nilsen-Hamilton、 M. J. Mol. Med. 2013、 91 (12)、 1333. Lee、 J. O.; So、 H. M.; Jeon、 E. K.; Chang、 H.; Won、 K.; Kim、 Y. H. Anal. Bioanal. Chem. 2008、 390(4)、 1023. Bock、 L. C.; Griffin、 L. C.; Latham、 J. a; Vermaas、 E. H.; Toole、 J. J. Nature 1992、 355 (6360)、 564. Schwienhorst、 A. Cellular and Molecular Life Sciences. 2006、 pp 2773-2791. Waters、 E.; Richardson、 J.; Schaub、 R.; Kurz、 J. Effect of NU172 and bivalirudin on ecarin clotting time in human plasma and whole blood-Posters; 2009; Vol. 7. Zhou、 J.; Rossi、 J. Nat. Rev. Drug Discov. 2016、 16(3)、 181. Tasset、 D. M.; Kubik、 M. F.; Steiner、 W. J. Mol. Biol. 1997、 272 (5)、 688.

　本発明は、解毒容易な核酸アプタマー及びこの核酸アプタマーの解毒剤を提供する。

　上記課題を解決するための手段は、下記のとおりである：
　［１］一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに、前記核酸アプタマーの配列に相補的ではない核酸配列（トーホールド配列）が、ステム部分の二本鎖のいずれかの末端に連結している、トーホールド配列付加核酸アプタマー。
　［２］　［１］に記載の一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに相補的な核酸配列を有する核酸に、［１］に記載のトーホールド配列に相補的な核酸配列を有する核酸が、［１］に記載の末端とは異なる末端に結合している、解毒剤。
　［３］トーホールド配列の長さが、５～１５塩基である、［１］に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー、
　［４］トーホールド配列に相補的な核酸配列を有する核酸の長さが、５～１５塩基である、［２］に記載の解毒剤、
　［５］トーホールド配列が、ＡＣＴＧＣである、［１］に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー、
　［６］トーホールド配列に相補的な核酸配列が、ＧＣＡＧＴである、［２］に記載の解毒剤、
　［７］　［１］、［３］及び［５］のいずれかに記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー又は［２］、［４］及び［６］のいずれかに記載の解毒剤を含む、医薬組成物、
　［８］　［１］、［３］及び［５］のいずれかに記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー及び［２］、［４］及び［６］のいずれかに記載の解毒剤を含む、治療用キット。

　本発明において核酸アプタマーとは、核酸分子であって、所定の標的分子に対する親和性が高く、特異的に結合し得る分子のことをいう。このような性質を有する核酸分子を核酸アプタマーといい、特に断らない限り、塩基配列、分子の大きさ、分子の立体構造などによって限定されるものではない。好ましくは、核酸アプタマーは、一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡである。

　本発明のトーホールド配列付加核酸アプタマーは、一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに、前記核酸アプタマーに相補的ではない核酸配列を有する（トーホールド配列）が、ステム部分の二本鎖のいずれかの末端（５’末端又は３’末端）に結合している。トーホールド配列の長さは、５～２０塩基であり、好ましくは、５～１０塩基であり、より好ましくは、５塩基である。より具体的には、トーホールド配列は、ＡＣＴＧＣである。

　本発明の解毒剤は、本発明の核酸アプタマーの、一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに相補的な核酸配列に、本発明の核酸アプタマーのトーホールド配列に相補的な核酸配列が、本発明の核酸アプタマーとは異なる末端（３’末端又は５’末端）に結合している、解毒剤である。

　本発明の解毒剤の、トーホールド配列に相補的な核酸配列の長さは、５～１５塩基であり、好ましくは、５塩基である。より具体的には、トーホールド配列に相補的な核酸配列は、ＧＣＡＧＴである。

　本発明の核酸アプタマーの解毒剤は、核酸アプタマーを解毒する能力が維持されている限り、これらの配列において１～数個、例えば、１、２または３個の塩基が置換、欠失、挿入等されてよい。また、解毒対象がトロンビンに結合するアプタマーである場合、トロンビンのエキソサイトＩ又はＩＩ結合能が維持される限り、５’側および／または３’側に任意の長さの任意の配列が付加されてよい。

　本発明の核酸アプタマー及び／又は解毒剤は、さらに修飾されたものであってもよい。例えば、核酸アプタマーの安定性を増加させるために、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート、ＰＥＧ修飾、環状化することも可能である。また、蛍光物質等で標識されたものでもよい。

　本発明の核酸アプタマー及び／又は解毒剤は、その治療上有効量及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物又は治療用キットとして製剤化することができる。製薬上許容される担体としては、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール）、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、結晶セルロース、炭酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース）及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。治療用キットは、さらに取扱説明書を含むことができる。

　本発明の医薬組成物又は治療用キットは、経口的又は非経口的に投与することができ、適当な医薬製剤として用いることができる。経口投与用の適当な医薬製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤等の固体製剤、あるいは溶液製剤、懸濁製剤又は乳化製剤等が挙げられる。非経口投与用の適当な医薬製剤としては、坐剤、注射用蒸留水、生理食塩水又はブドウ糖水溶液等を用いた注射剤又は点滴製剤、あるいは吸入剤等を挙げることができる。

　本発明の医薬組成物又は治療用キットの投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によって変動させることができるが、１日当り０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇであり、これを１回或いは２回～４回に分けて投与することができる。

　本発明のトーホールド配列付加アプタマーを含有する医薬組成物又は治療用キットは、トロンビンに結合するアプタマーである場合、血液凝固に関連する疾患、たとえば、慢性動脈閉塞症や先天性アンチトロンビンＩＩＩ欠乏症などに使用することが期待できる。また、冠動脈バイパス手術時や血液体外循環時に使用することができる。さらに、周術期もさることながら、バイパスやステント、人工弁の術後に必要な抗血栓核酸アプタマー製剤の過剰摂取や腎不全、薬剤相互作用ならびに脱水などによる血中濃度上昇によって引き起こされる出血傾向を是正する第一選択薬もしくは補助薬剤になりうる。
　本発明の解毒剤を含有する医薬組成物又は治療用キットは、トーホールド配列付加アプタマーの解毒に使用することができる。

　血管の中で、血栓といわれる血液の固まりが引き起こす症状を広義の血栓症（以下、単に「血栓症」と記載した場合は、広義の血栓症をいう）と呼び、血栓が原因になって起こる病態は狭義の血栓症と塞栓症に分けられる。狭義の血栓症は血栓が形成個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによる症状で、塞栓症は血栓が形成個所から剥がれて血流によって移動し、他の個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによって起こる病態のことを指す。このような血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。

　本発明の１価又は２価の核酸アプタマーは、トロンビンに結合し、血液凝固を阻害することができるとともに、本発明の解毒剤は、本発明の核酸アプタマーを迅速に解毒することが可能である。

図１は、解毒オリゴヌクレオチドの添加による可逆的抗凝固活性である。破線：フィブリノーゲンをインヒビターの非存在下に０秒でトロンビンに加えた。実線：解毒剤（Ｍ０８ｓ－１の相補的オリゴヌクレオチド）をフィブリノーゲン、トロンビン及びＭ０８ｓ－１の混合物に２００秒で加えた。点線：フィブリノーゲンをＭ０８ｓ－１の存在下に０秒でトロンビンに加えた。最終濃度：［フィブリノーゲン］＝０．４ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝５０ｎＭ、［アプタマー］＝５００ｎＭ、［解毒剤］＝２．５μＭ図２は、アプタマーに対する相補配列を有する正常又はトーホールド介在鎖交換による解毒の模式図である。ここで、トーホールド配列は灰色部分である。Toehold-M08s-1は、Ｍ０８ｓ－１に、トーホールド配列を付加した核酸アプタマーであり、Complementary strand to M08s-1はM08s-1に相補的な配列を有する核酸であり、Complementary strand to M08s-1 and the toehold siteはトーホールド配列付加Ｍ０８ｓ－１に相補的な配列を有する核酸である。図３は、トーホールドＭ０８ｓ－１アプタマー及び解毒オリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｄｏｔｅ－１～４）の配列である。下線部は，トーホールド配列部位（アプタマー）とトーホールド相補配列部位（解毒剤）を示す．図４は、解毒剤なしに対する相対凝固時間を示す。図５は、解毒剤なしに対する相対ΔＡｍを示す。図６は、最適トーホールド配列の検討に用いたトーホールドＭ０８ｓ－１アプタマー及び解毒オリゴヌクレオチドの配列である。下線部は，トーホールド配列部位（アプタマー）とトーホールド相補配列部位（解毒剤）を示す。図７は、様々なトーホールド配列を付加したアプタマーに解毒オリゴヌクレオチドの添加時の可逆的抗凝固活性の比較である。左から、インヒビターとしてＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃ－Ｔｏｅｈｏｌｄ－Ｍ０８ｓ－１－１０ｎｔ、Ａ／Ｔ－Ｔｏｅｈｏｌｄ－Ｍ０８ｓ－１－１０ｎt、Ｇ／Ｃ－Ｔｏｅｈｏｌｄ－Ｍ０８ｓ－１－１０ｎｔを用いた結果を示している。破線：フィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。点線：トーホールド相補配列を含まない解毒剤（Ａｎｔｉｄｏｔｅ－０ｎｔ）とフィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。実線：トーホールド相補配列を含む解毒剤（Ａ/Ｔ/Ｇ/ＣまたはＡ/ＴまたはＧ/Ｃ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ－５ｎｔ）とフィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。最終濃度：［フィブリノーゲン］＝０．４ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝５０ｎＭ、［アプタマー］＝５００ｎＭ、［解毒剤］＝５００ｎＭ図８は、解毒剤なしに対する相対凝固時間を示す．図９は，解毒剤なしに対する相対ΔＡｍを示す．図１０は，短い５塩基のＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃトーホールド配列を付加したアプタマー（Ａ/Ｔ/Ｇ/Ｃ－Ｔｏｅｈｏｌｄ－Ｍ０８ｓ－１－５ｎｔ）に解毒オリゴヌクレオチドの添加時の可逆的抗凝固活性である。破線：フィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。点線：トーホールド相補配列を含まない解毒剤（Ａｎｔｉｄｏｔｅ－０ｎｔ）とフィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。実線：トーホールド相補配列を含む解毒剤（Ａ/Ｔ/Ｇ/Ｃ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ－５ｎｔ）とフィブリノーゲンをインヒビターの存在下に０秒でトロンビンに加えた。最終濃度：［フィブリノーゲン］＝０．４ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝５０ｎＭ、［アプタマー］＝５００ｎＭ、［解毒剤］＝５００ｎＭ図１１は，解毒剤なしに対する相対凝固時間と相対ΔＡｍを示す．図１２は、Ｍ０８とＨＤ２２を連結して二価化したアプタマーの抗凝固活性である。図１３は、短縮化されたＭ０８－Ｔ１５－ＨＤ２２に対する解毒剤である。

　トーホールド鎖置換の解毒有効性
　直接の抗凝固薬は、患者の罹患率及び死亡率を増加させる顕著な出血のような急性の合併症を引き起こす。したがって、回復剤の有効性は、副作用を抑えるために重要である。他の種類の抗凝固剤と比べて、アプタマー薬は、リバースの相補鎖を加えることによって解毒をコントロールすることができることが大きな利点である。Ｍ０８ｓ－１（ａｇｇｔｃａｇａｔｇａｔｇｇｇｇａｔｇｇｇｇｇｇｔｔｇｇａｇｇａａｔｇｇａｔｇａｃｃｔ）についてこれを立証するために、このアプタマーに対する全相補鎖配列の解毒効果を検討した。トロンビンとＭ０８ｓ－１及びフィブリノーゲンとからなる凝固混合物を解毒剤で処理し、散乱によってモニターした（図１）。

　過剰量の解毒剤にもかかわらず、緩やかな散乱の増加が見られ、約２００秒で凝固曲線の最大勾配に達した（ΔＡｍ）。この結果は、強固なアプタマー／トロンビン複合体とアプタマーの安定な二重鎖との間の平衡に由来する動的バリアーが原因であると考えられる。解毒剤の抑制効率を増加させるためにトーホールド介在鎖交換をこの解毒システムに導入した。「トーホールド（ｔｏｅｈｏｌｄ）」と呼ばれる短いぶら下がり末端は、鎖交換を劇的に増加させることが知られており、アプタマーの機能を急速に解毒するために有効であると仮定した。この仮定を検証するために、追加の１５塩基のオーバーハングセクションを有するＭ０８ｓ－１（トーホールドＭ０８ｓ－１）といくつかの長さの解毒剤を示した（図２及び３）。Ａｎｔｉｄｏｔｅ－１は、アプタマードメインのみを有する相補配列である。Ａｎｔｉｄｏｔｅ－２～４は、アプタマー及びトーホールド配列ドメインの両方を有する相補配列である。驚くべきことに、最低及び最高の有効性を有する解毒剤は、それぞれ、Ａｎｔｉｄｏｔｅ－１及びＡｎｔｉｄｏｔｅ－３であった。Ａｎｔｉｄｏｔｅ－１及びＡｎｔｉｄｏｔｅ－３の処理によって、凝固時間は、それぞれ、３２～７９％、及び７９～９１％だけ減少したが、ΔＡｍは、それぞれ、約１．３～３．１倍、及び５．４～１１倍増加した（図４、５）。これらの結果から、トーホールド活性化鎖置換は、アプタマーの解毒効力を強く増加することが明らかとなった。

　最適トーホールド配列の検討
　より短くかつ活性の優れたトーホールド配列の同定により、生産コスト，投与量，元のアプタマーの活性への影響の最小化が期待できる。図３に示したポリＡトーホールド配列アプタマーを用いた結果では、１０塩基のトーホールド相補配列を含む解毒剤が最も優れた中和効率を示した。ここでは、Ａ／Ｔ／Ｇ／ＣまたはＡ／ＴまたはＧ／Ｃからなる１０塩基のトーホールド配列を付加したアプタマーを用いて検討をおこない、ポリＡを上回る中和促進作用を有するトーホールド配列の検討をおこなった。仮説では、熱力学的に安定な二本鎖を形成するＧ／Ｃトーホールド配列が、最も効率が良いと推測された。しかしながら、結果としてＧ／Ｃトーホールドアプタマーでは、解毒剤の濃度依存的な中和反応の促進が観測されるのみで、トーホールド相補配列の有無とは無関係であった（図７，８，９）。これは、アプタマーの配列内にグアニンが多いため，トーホールド配列や解毒剤のトーホールド相補配列が、目的外のアプタマー配列部位（あるいはその相補配列部位）と相互作用し、トーホールド配列が機能していなかった可能性がある。Ａ／Ｔトーホールドアプタマーでは、ポリＡトーホールド配列の時と同様に、１０塩基のトーホールド相補配列を含む解毒剤の効果が最も高く、５塩基という短いトーホールド相補配列では中和反応の促進が観測されなかった（図７，８，９）。一方，Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃトーホールド配列では、５塩基という短いトーホールド相補配列にも関わらず、アプタマーと等量（０．５μＭ）の解毒剤の添加で７６％の凝固時間の短縮と、１３倍のΔＡｍの増加が観測された。これは、Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ配列が、ポリＡまたはＡ／Ｔ配列よりも二本鎖形成時の安定性が高く、かつＧ／Ｃ配列の時のような目的配列以外との相互作用が少なかったためであると考えられる。

　最も活性が高かったＡ/Ｔ/Ｇ/Ｃトーホールド配列を５塩基にまで短縮したアプタマーを用いて（Ａ/Ｔ/Ｇ/Ｃ－Ｔｏｅｈｏｌｄ－Ｍ０８ｓ－１－５ｎｔ, 図６）同様の中和反応実験をおこなった。結果として、アプタマーと等量（０．５μＭ）の解毒剤の添加で８３％の凝固時間の短縮と、１２倍のΔＡｍの増加が観測された（図１０，１１）。本研究で得られた知見や短いＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃトーホールド配列は、他のアプタマーへの適用も可能であると考えられ、他の分子種（低分子，抗体）の薬剤にはない「迅速な解毒」という特長を核酸アプタマー薬剤に与えるとこできる。

　獲得したアプタマー群の中から優れた抗凝固活性を有するアプタマーを選抜あるいは設計することを試みた。これまでに異なる部位を認識するＨＤ１とＨＤ２２を連結して二価化することで，親和性と抗凝固活性を向上することが報告されている（ＨＤ１－Ｔ１６－ＨＤ２２とＨＤ１－Ａ１５－ＨＤ２２）。そこで、トロンビンの異なる部位に結合するＭ０８とＨＤ２２を連結して二価化した。またＭ０８とＨＤ２２の間には、チミンが連続したリンカーを導入し、リンカー長の最適化を行ったところ、１５個のチミンが連続したリンカーを導入したＭ０８－Ｔ１５－ＨＤ２２が、ＨＤ１－Ａ１５－ＨＤ２２に比べて５倍の抗凝固活性を示した（図１２）。

　図１２で最も抗凝固活性が高かったＭ０８－Ｔ１５－ＨＤ２２に対する解毒剤の開発を行った。はじめに、Ｍ０８の相補鎖配列［Ｍ０８］ｃとＨＤ２２の相補鎖配列［ＨＤ２２］ｃを比較したところ、［Ｍ０８］ｃのほうが解毒剤として高い活性を示した。次に、リンカーに対する相補鎖配列をトーホールド配列として導入した。トーホールド配列長を５，１０，１５ｍｅｒとした中和剤を［Ｍ０８－Ｔ５］ｃ、［Ｍ０８－Ｔ１０］ｃ、［Ｍ０８－Ｔ１５］ｃとし、添加したところ、トーホールド配列が最も長い［Ｍ０８－Ｔ１５］ｃが高い解毒効果を示した。さらに、中和剤の効果を高めるため、Ｍ０８の相補鎖配列がステムループ構造を形成することに着目し、配列の短縮を行った。［Ｍ０８ｓ－Ｔ１５］ｃの結果が示すように、短縮化により、全長の相補鎖配列［Ｍ０８－Ｔ１５－ＨＤ２２］ｃよりも活性が高い解毒剤の開発に成功した（図１３）。

　図１２及び図１３に示されたＤＮＡの塩基配列を示す。

　本発明のトーホールド配列付加核酸アプタマーは、本発明の解毒剤により、迅速に解毒されることができる。

Claims

　一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに、前記核酸アプタマーの配列に相補的ではない核酸配列（トーホールド配列）が、ステム部分の二本鎖のいずれかの末端に結合している、トーホールド配列付加核酸アプタマー。
　請求項１に記載の一本鎖のループ部分及び二本鎖のステム部分からなる核酸アプタマーに相補的な核酸配列を有する核酸に、請求項１に記載のトーホールド配列に相補的な核酸配列を有する核酸が、請求項１に記載の末端とは異なる末端に結合している、解毒剤。
　トーホールド配列の長さが、５～１５塩基である、請求項１に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー。
　トーホールド配列に相補的な核酸の長さが、５～１５塩基である、請求項２に記載の解毒剤。
　トーホールド配列が、ＡＣＴＧＣである、請求項１に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー。
　トーホールド配列に相補的な核酸配列が、ＧＣＡＧＴである、請求項２に記載の解毒剤。
　請求項１、３及び５のいずれか一項に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー又は請求項２、４及び６のいずれか一項に記載の解毒剤を含む、医薬組成物。
　請求項１、３及び５のいずれか一項に記載のトーホールド配列付加核酸アプタマー及び請求項２、４及び６のいずれか一項に記載の解毒剤を組み合わせて含む、治療用キット。