WO2020111527A1 - 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents

오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 스크리닝 방법 Download PDF

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protein
collagen
screening
composition
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이수영
심현보
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Ewha Womans University
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Ewha Womans University
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present application discloses a screening method using the composition.
  • Oscar Ostoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR
  • Ig immunoglobulin
  • Oscar receptors have two Ig domains that recognize ligands, but lack cytoplasmic tail domains that mediate intracellular signaling. These receptors mediate signaling by binding to another receptor with an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM).
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • osteoclasts The differentiation of osteoclasts is regulated through the interaction of osteoclasts with osteoblasts. During this process, osteoblasts secrete collagen outside the cell, and secreted collagen has been reported to function as an Oscar ligand. Recently, the molecular mechanism of recognizing and binding collagen by the Oscar receptor has been interpreted as a structure by X-ray diffraction analysis. In addition, from the result that inflammatory cytokine secretion is promoted by the combination of Oscar and collagen in monocytes cells, the possibility that Oscar protein contributes to rheumatoid arthritis has been suggested.
  • the present application discloses a screening method using the composition.
  • Oscar (Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) protein or fragment thereof; And it provides a composition for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor comprising a fusion protein bound to the Fc domain of an immunoglobulin.
  • a second aspect of the present application provides a kit for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor, comprising the composition for screening the Oscar protein-collagen interaction inhibitor.
  • a third aspect of the present application provides a method for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor, comprising contacting a candidate substance with the composition for screening the Oscar protein-collagen interaction inhibitor.
  • Oscar protein-collagen interaction inhibitor screening composition using the fusion protein in which the Fc domain of the Osteo-associated Ig-like receptor (OSCAR) protein and the immunoglobulin are combined
  • the composition The screening kit using the composition and the screening method using the composition may screen an Oscar protein-collagen interaction inhibitor having an activity of inhibiting the binding of the Oscar protein-collagen.
  • 1 is a graph confirming that the Oscar fusion protein prepared in one embodiment of the present application can bind to collagen.
  • Figure 2 in one embodiment of the present application, is a graph confirming the Oscar fusion protein-collagen binding inhibitory activity of the anti-Oscar antibody.
  • the term “combination(s)” included in the expression of the marki form means one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of the components described in the expression of the marki form, It means to include one or more selected from the group consisting of the above components.
  • Oscar (Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) protein or fragment thereof; And it provides a composition for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor comprising a fusion protein bound to the Fc domain of an immunoglobulin.
  • Osteoclast-associated Ig-like receptor (OSCAR) protein is a cell surface receptor having two immunoglobulin (Ig) domains belonging to a leukocyte receptor complex, an Oscar protein. Is capable of binding collagen, and it is known that the binding may cause disease.
  • the Oscar protein or a fragment thereof may be derived from human or mouse. Genetic information, such as the amino acid sequence of the human or mouse-derived Oscar protein, the nucleotide sequence encoding the same, can be obtained from a known database, such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). There are, but are not limited to this.
  • the fragment of the Oscar protein may include an ectodomain (ectodomain).
  • ectodomain refers to a domain existing in the extracellular space of a membrane protein, and the ectodomain of an Oscar protein may include a site that recognizes collagen, but is not limited thereto. It is not.
  • the fragment of the Oscar protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Fc domain of immunoglobulin refers to heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain, excluding heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL1) of immunoglobulins. It means the constant region 3 (CH3) portion, and also includes a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the Fc domain of the immunoglobulin may be derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, or a combination thereof or a hybrid thereof, or may be derived from IgG or IgM that is most abundant in human blood. have.
  • the Fc domain of the immunoglobulin may be the Fc domain of human immunoglobulin gamma 1 (human IgG1), but is not limited thereto.
  • the fusion protein includes an Oscar protein or a fragment thereof; And a protein artificially synthesized to bind the immunoglobulin Fc domain.
  • the human or mouse-derived Oscar protein ectodomain and the human immunoglobulin gamma 1 Fc domain may be bound, which may be directly linked to each other. , It may also be linked through a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as it shows the activity of the fusion protein, but specifically, glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, asparagine, aspartic acid, Amino acids such as cysteine, glutamine, glutamic acid, lysine, and arginic acid can be used to connect them in consideration of ease of genetic manipulation.
  • a fusion protein in which the Fc domain of human-derived Oscar protein ectodomain and human immunoglobulin gamma 1 is combined can be used interchangeably with the name hOSCAR-Fc, and mouse-derived Oscar protein ectodomain and human immunoglobulin gamma 1
  • the fusion protein to which the Fc domain is bound can be used interchangeably with the name mOSCAR-Fc.
  • the fusion protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Proteins according to one embodiment of the present application as long as they have the same or corresponding biological activity as each protein, as well as the sequence number described, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92 with the amino acid sequence % Or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher homology, or a polynucleotide encoding the protein It may include.
  • amino acid sequence having a biological activity equal to or corresponding to the protein of SEQ ID NO: substantially as a sequence having homology to the sequence, some of the sequences have deletion, modification, substitution, or added amino acid sequences. It is obvious that it is included in the category.
  • homology refers to the degree to which a given amino acid sequence or polynucleotide sequence is consistent and may be expressed as a percentage.
  • a homologous sequence thereof having the same or similar activity to a given amino acid sequence or polynucleotide sequence is indicated as "% homology”.
  • standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, specifically hybridization using BLAST 2.0 or under defined stringent conditions
  • Appropriate hybridization conditions which can be identified by comparing sequences by experiment, are within the scope of the art, and methods well known to those skilled in the art (e.g., J.
  • collagen used throughout the present specification is a kind of protein, which is a main component of connective tissue, and mainly distributed in bones and skin, but distributed throughout the body, such as joints, membranes of each organ, and hair, A total of 28 types of collagen are known, and any type of collagen is not limited as long as it can cross-link with the Oscar protein.
  • Opcar protein-collagen interaction inhibitor used throughout this specification refers to all substances having an effect of inhibiting the interaction between Oscar protein and collagen, and specifically, Oscar protein- by binding to the collagen recognition site of Oscar protein- It may be to inhibit collagen binding, but is not limited thereto.
  • the Oscar protein-collagen interaction inhibitor is an anti-Oscar antibody, anti-Oscar antibody fragment, protein, oligopeptide, small organic molecule, polysaccharide, polynucleotide, that inhibits Oscar protein-collagen binding, It may be a compound or a combination thereof, and the inhibitor may include natural materials as well as synthetic materials, but is not limited thereto.
  • the Oscar protein-collagen interaction inhibitor may be an anti-Oscar antibody or fragment thereof.
  • antibody used throughout this specification is an immunoglobulin selected from the group consisting of IgA, IgE, IgM, IgD, IgY, IgNAR, heavy chain antibody and IgG, and can specifically bind to a target antigen.
  • the antibody consists of two light chains and two heavy chains, and each chain consists of a variable domain in which the amino acid sequence is variable and a constant domain having a constant sequence. .
  • a region to which an antigen binds is located at the end of the three-dimensional structure of the variable region, and this region is formed by gathering complementarity determining regions, each of which is present in three light and heavy chains.
  • the complementarity determining region is a particularly high part of the amino acid sequence among the variable regions, and specific antibodies against various antigens can be found by the high variability.
  • the scope of the present application includes not only complete antibody forms, but also antigen-binding fragments of the antibody molecules.
  • the F(ab')2 antibody is produced by cysteine residues in the hinge region of Fab' forming disulfide bonds.
  • Fv variable fragment refers to the smallest antibody fragment that has only the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • dsFv double disulfide Fv
  • scFv single-chain Fv
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., limited digestion of the entire antibody with papain to obtain Fab, and digestion with pepsin to obtain F(ab')2 fragment), preferably It can be produced through genetic recombination technology.
  • the sdAb and the nanobody are single variable domain antibody fragments, for example, among heavy chain antibodies comprising a single variable domain (VH) and two constant domains (CH2 and CH3) that occur naturally.
  • the domain may include an antibody fragment produced through protein hydrolysis or genetic recombination technology, and a single domain antibody fragment produced by artificially modifying an antibody light or heavy chain variable domain, but is not limited thereto.
  • antigen recognition portion refers to any fragment of an antibody of the invention that retains the antigen-binding activity of the antibody, and is compatible with “antigen binding fragments” and “binding fragments of peptides” and the like. Is used as
  • An anti-Oscara antibody or fragment thereof may be one that binds to a region of the Oscar protein, and specifically, inhibits the Oscar protein-collagen binding by binding to a site to which collagen binds in the Oscar protein.
  • it is not limited thereto.
  • a second aspect of the present application provides a kit for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor, comprising the composition for screening an Oscar protein-collagen inhibitor according to the first aspect of the present application.
  • the content overlapping with the first aspect also applies to the composition for screening of the second aspect.
  • the Oscar protein-collagen interaction inhibitor screening kit can detect the Oscar fusion protein-collagen binding level by detecting the Oscar fusion protein bound to collagen.
  • Kits herein may include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods.
  • the kit for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor is a secondary antibody labeled with a substrate, a suitable buffer solution, a chromogenic enzyme, or a fluorescent substance for immunological detection of an Oscar fusion protein bound to collagen, and Chromogenic substrates, and the like.
  • a substrate a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with polystyrene resin, and a slide glass made of glass, etc.
  • the colorase is peroxidase
  • alkaline force Alkaline phosphatase can be used
  • fluorescent materials such as FITC and RITC
  • the chromogenic substrate solution is ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur) Phonic acid)) or OPD (O-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine), but is not limited thereto.
  • the kit may be an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kit, but is not limited thereto.
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • a third aspect of the present application provides a method for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor, comprising contacting a candidate material with a composition for screening an Oscar protein-collagen inhibitor according to the first aspect of the present application. Content overlapping with the first and second sides also applies to the screening method of the third side.
  • the term "candidate” used throughout this specification refers to any substance that is expected to have the effect of inhibiting the binding of the Oscar protein to collagen, specifically, the Oscar protein-collagen by binding to the collagen recognition site of the Oscar protein. It may be to inhibit the binding, but is not limited thereto.
  • the candidate substance is a molecule such as an anti-Oscar antibody, an anti-Oscar antibody fragment, a protein, an oligopeptide, a small organic molecule, a polysaccharide, a polynucleotide, a compound, or a combination thereof, which is expected to inhibit the binding of Oscar protein to collagen It may be, the candidate material may include not only natural materials, but also synthetic materials, but is not limited thereto.
  • the candidate material may be an anti-Oscar antibody or fragment thereof.
  • the contacting may be contacting the candidate material with a fusion protein comprising an Oscar protein or a fragment thereof derived from each of humans and mice, respectively.
  • the candidate material may alternately contact a human-derived Oscar fusion protein and a mouse-derived Oscar fusion protein, but is not limited thereto.
  • a candidate material capable of binding to both human and mouse-derived Oscar fusion proteins may be screened, and the candidate material may have an inhibitory activity of inhibiting Oscar protein-collagen binding in both human and mouse. , It can be used not only as a therapeutic agent for humans, but also in animal experiments using mice.
  • measuring the binding level between collagen and a composition for screening an Oscar protein-collagen interaction inhibitor in contact with a candidate substance may be to further include selecting a candidate substance having a reduced binding level compared to the control sample.
  • the Oscar protein-collagen interaction inhibitor candidate was contacted with hOSCAR-Fc or mOSCAR-Fc, and then the collagen-coated ELISA plate was used to measure the binding level of Oscar fusion protein-collagen.
  • the measurement result is compared with the binding level of the control sample (hOSCAR-Fc or mOSCAR-Fc without contacting the candidate material), and a candidate substance having a lower binding level than the control sample can be selected as an Oscar protein-collagen interaction inhibitor. .
  • the candidate material may be an anti-Oscar antibody or fragment thereof.
  • the ectodomain (human derived: SEQ ID NO: 1, mouse derived: SEQ ID NO: 2) of the human and mouse-derived Oscar proteins is the Fc domain of human immunoglobulin gamma 1 (human IgG1). Fused to.
  • the human Oscar fusion protein and mouse Oscar fusion protein prepared above were named hOSCAR-Fc (SEQ ID NO: 3) and mOSCAR-Fc (SEQ ID NO: 4), respectively.
  • collagen (Bornstein and Traub type I from rat tail) powder was dissolved in a 0.1 M concentration of acetic acid aqueous solution at a concentration of 1 mg/mL, and then 2 ⁇ g/mL in PBS (phosphate buffered saline). Diluted to a concentration, 25 ⁇ L per well was added to the ELISA plate (Costar cat. no. 3690), and collagen was coated at room temperature for 1 hour. Thereafter, the collagen solution was removed from the plate, and again, 180 ⁇ L of blocking solution (3% [w/v] dried skim milk powder in PBS-0.05% Tween-20) was added to each well, and each well was placed at room temperature for 1 hour.
  • PBS phosphate buffered saline
  • hOSCAR-Fc was diluted to 0.5 ⁇ g/mL concentration in the blocking solution, and 25 ⁇ L was added to each well for 1 hour at room temperature between collagen and the human Oscar fusion protein prepared in Example 1. Binding was induced.
  • the ELISA plate was washed three times with a washing solution (PBS-0.05% Twee-20, then PBST), and goat anti-human IgG-HRP. (horseradish peroxidase) (Santa Cruz Biotechnology, sc-2453) was diluted 1:3,000 in a blocking solution and 25 ⁇ L was added to each well. The plate was left at room temperature for 1 hour to induce the binding of Oscar to goat anti-human IgG-horseradish peroxidase, and then the plate was washed 3 times with a washing solution.
  • a washing solution PBS-0.05% Twee-20, then PBST
  • goat anti-human IgG-HRP goat anti-human IgG-HRP.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • the following experiment was performed to measure the binding inhibitory activity of Oscar fusion protein-collagen of a candidate anti-Oscar antibody using the Oscar fusion protein of Example 1 (hOSCAR-Fc and mOSCAR-Fc).
  • the ELISA plate was coated with collagen in the same manner as in Example 2 and blocked with a blocking solution. Thereafter, the Oscar fusion protein (hOSCAR-Fc or mOSCAR-Fc) and anti-Oscar IgG antibodies (Ab1 to Ab5) were mixed in a blocking solution and placed for 1.5 hours to allow binding between the Oscar protein and the antibody. At this time, hOSCAR-Fc was added to a concentration of 0.1 to 0.5 ⁇ g/mL after mixing, 1 ⁇ g/mL for mOSCAR-Fc, and 2 to 4 ⁇ g/mL for anti-Oscar antibodies.
  • the Oscar fusion protein hOSCAR-Fc or mOSCAR-Fc
  • Anti-Oscar IgG antibodies Ab1 to Ab5
  • hOSCAR-Fc was added to a concentration of 0.1 to 0.5 ⁇ g/mL after mixing, 1 ⁇ g/mL for mOSCAR-Fc, and 2 to 4 ⁇ g/
  • a mixed solution of the Oscar fusion protein and the antibody was added to each well of the collagen-coated ELISA plate so that the Oscar protein and collagen were bound for 1 hour at room temperature. Thereafter, the ELISA plate was washed 3 times with a washing solution, diluted with goat anti-human IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, sc-2453) at a blocking solution of 1:3,000, added to each well 25 ⁇ L, and then 1 hour. While incubating at room temperature to induce the fusion of the Oscar fusion protein and goat anti-human IgG-HRP, and then washed the plate three times with a washing solution.
  • goat anti-human IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology, sc-2453
  • TMB 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • an antibody capable of effectively inhibiting the binding of human and mouse Oscar proteins to collagen among candidate Oscar protein-collagen interaction inhibitors can be selected.

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Abstract

본원은, 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질과 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 이용한 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 스크리닝용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 스크리닝 방법
본원은, 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질과 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 이용한 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 스크리닝용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR)는 백혈구(leukocyte) 수용체 복합체에 속하는 2개의 면역글로블린(immunoglobulin; Ig) 도메인을 가지는 세포 표면 수용체이다. 처음 발견 시, 파골세포 특이적 발현을 통해 파골세포의 분화를 조절하는 기능이 보고되었다(J Exp Med. 2002, 21;195(2):201-9.). 오스카 수용체는 리간드를 인식하는 두 개의 Ig 도메인을 가지나, 세포 내 신호전달을 매개하는 세포질내 꼬리 영역 (cytoplasmic tail domain)이 결여되어 있다. 이러한 수용체들은 ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)을 가지는 또 다른 수용체와 결합하여 신호전달을 매개한다. 오스카와 결합하여 세포 내로 신호전달을 매개하는 수용체로는 FcRγ가 확인되었다.
파골세포의 분화는 파골세포와 조골세포의 상호작용을 통해서 조절된다. 이 과정 중에 조골세포는 세포 외부에 콜라겐을 분비하고, 분비된 콜라겐이 오스카의 리간드로 기능함이 보고된 바 있다. 최근, 오스카 수용체에 의해서 콜라젠을 인지하여 결합하는 분자 기전이 X-선 회절분석에 의한 구조로 해석되었다. 또한, 단핵구(monocytes) 세포에서 오스카와 콜라겐의 결합에 의해서 염증성 사이토카인 분비가 촉진된다는 결과로부터 오스카 단백질이 류마티스성 관절염에 기여할 가능성이 제시된 바 있다.
현재까지, 오스카 단백질에 의해 유발되는 직접적인 질병으로 보고된 것은 없다. 또한, 오스카와 콜라겐의 결합을 저해하는 방법이나 오스카 단백질-오스카 결합을 저해하는 물질의 탐색시스템이 알려진 바도 없다. 콜라겐과 오스카의 상호 결합을 저해하는 활성을 가지는 물질 (항체, 저분자화합물 등)은 오스카의 기능(활성)을 억제할 것으로 기대할 수 있다. 따라서, 이러한 물질은 콜라겐-오스카 결합에 의해 유발되는 질병의 억제물질로 활용 가능성이 있다.
본원은, 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질과 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 이용한 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 스크리닝용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본원 제 2 측면은, 상기 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트를 제공한다.
본원 제 3 측면은, 후보물질을 상기 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 구현예들에 따르면, 본원의 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질과 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 이용한 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 스크리닝용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 스크리닝 방법을 통해 오스카 단백질-콜라겐 결합을 저해하는 활성이 있는 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제를 스크리닝 할 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에서 제조된 오스카 융합단백질이 콜라겐과 결합할 수 있음을 확인하는 그래프이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 있어서, 항-오스카 항체의 오스카 융합단백질-콜라겐 결합 저해 활성을 확인하는 그래프이다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질"은 백혈구(leukocyte) 수용체 복합체에 속하는 2개의 면역글로블린 (immunoglobulin; Ig) 도메인을 가지는 세포 표면 수용체로서, 오스카 단백질은 콜라겐과 결합할 수 있으며, 상기 결합에 의해 질병이 유발될 수 있다고 알려져 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 오스카 단백질 또는 이의 단편은 인간 또는 마우스로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 인간 또는 마우스 유래 오스카 단백질의 아미노산 서열, 이를 암호화하는 염기서열 등의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 오스카 단백질의 단편은 엑토도메인 (ectodomain)을 포함하는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "엑토도메인(ectodomain)"은 막 단백질의 세포외 공간에 존재하는 도메인을 의미하는 것으로서, 오스카 단백질의 엑토도메인은 콜라겐을 인식하는 부위를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 오스카 단백질의 단편은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "면역글로불린의 Fc 도메인"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역이거나, 구체적으로 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 인간 면역글로불린 감마 1(human IgG1)의 Fc 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따른 융합단백질은, 오스카 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질로서, 구체적으로 인간 또는 마우스 유래 오스카 단백질 엑토도메인과 인간 면역글로불린 감마 1의 Fc 도메인이 결합된 것일 수 있고, 이는 각각에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 링커는 융합단백질의 활성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 유전자 조작의 용이성을 고려하여 연결시킬 수 있다.
본원 명세서 전체에서 인간 유래 오스카 단백질 엑토도메인과 인간 면역글로불린 감마 1의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질은 hOSCAR-Fc이라는 명칭과 혼용하여 사용될 수 있고, 마우스 유래 오스카 단백질 엑토도메인과 인간 면역글로불린 감마 1의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질은 mOSCAR-Fc이라는 명칭과 혼용하여 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 단백질들은 각각의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있고, 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "콜라겐(collagen)"은 단백질의 일종으로서 결합 조직의 주성분이며, 뼈와 피부에 주로 있지만, 관절, 각 장기의 막, 머리카락 등 우리 몸 전체에 분포되어 있는 성분으로서, 총 28종류의 콜라겐이 알려져 있으며, 오스카 단백질과 상호결합 할 수 있다면, 어떠한 종류의 콜라겐이라도 제한되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제"는 오스카 단백질과 콜라겐의 상호작용을 저해하는 효과를 가지는 모든 물질을 의미하며, 구체적으로 오스카 단백질의 콜라겐 인식 부위에 결합하여 오스카 단백질-콜라겐 결합을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제는 오스카 단백질-콜라겐 결합을 저해하는 항-오스카 항체, 항-오스카 항체 단편, 단백질, 올리고펩타이드, 소형 유기분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드, 화합물 또는 이들의 조합일 수 있으며, 상기 저해제는 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제는 항-오스카 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "항체"는 IgA, IgE, IgM, IgD, IgY, IgNAR, heavy chain antibody 및 IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로, 목표 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항체는 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain) 각각 2개씩 모여 이루어지며, 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변영역(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 고정영역(constant domain)으로 이루어져 있다. 상기 항체는 가변영역의 3차원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며, 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성결정부위 (complementarity determining region)들이 모여서 형성된다. 상기 상보성결정부위는 가변영역 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며, 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다. 본원의 범위에는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 항체의 임의의 일부분을 의미하는 것으로서, scFv, dsFv, Fab, Fab', F(ab')2, sdAb 및 나노바디(nanobody) 등 및 이들의 조합이 항체 단편에 해당될 수 있으며, 상기 항체 단편은 항원인식 부위를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 또한, 상기 sdAb 및 나노바디는 단일 가변 도메인 항체단편으로, 예를 들어 자연적으로 발생하는 단일 가변 도메인(VH)과 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함하는 중쇄(heavy chain) 항체 중 그 가변 도메인을 단백질 가수분해 혹은 유전자 재조합 기술을 통하여 제작한 항체단편 및 항체 경쇄 혹은 중쇄 가변 도메인을 인공적으로 변형하여 제작한 단일 도메인 항체단편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "항원인식 부분"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로서, "항원 결합 단편" 및 "펩타이드의 결합 단편" 등과 호환적으로 사용된다.
본원의 일 구현예에 따른 항-오스카 항체 또는 이의 단편은, 오스카 단백질의 일부 영역에 결합하는 것일 수 있고, 구체적으로 오스카 단백질에서 콜라겐이 결합하는 부위에 결합하여 오스카 단백질-콜라겐 결합을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트를 제공한다. 제1측면과 중복되는 내용은 제2측면의 스크리닝용 조성물에도 공히 적용된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트는 콜라겐에 결합한 오스카 융합단백질을 검출함으로써, 오스카 융합단백질-콜라겐 결합 수준을 확인할 수 있다. 본원의 키트에는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트는 콜라겐에 결합한 오스카 융합단백질의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 3 측면은, 후보물질을 본원의 제 1 측면에 따른 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝 방법을 제공한다. 제1측면 및 제2측면과 중복되는 내용은 제3측면의 스크리닝 방법에도 공히 적용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "후보물질"은 오스카 단백질과 콜라겐의 결합을 저해하는 효과를 가질 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미하며, 구체적으로 오스카 단백질의 콜라겐 인식 부위에 결합하여 오스카 단백질-콜라겐 결합을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 후보물질은, 오스카 단백질과 콜라겐의 결합을 저해할 것으로 예상되는 항-오스카 항체, 항-오스카 항체 단편, 단백질, 올리고펩타이드, 소형 유기분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드, 화합물 등의 분자 또는 이들의 조합일 수 있으며, 상기 후보물질은 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 후보물질은 항-오스카 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 접촉은 후보물질을 인간 및 마우스 각각에서 유래된 오스카 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질과 각각 접촉시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 후보물질은 인간 유래 오스카 융합단백질과 마우스 유래 오스카 융합단백질을 교대로 접촉시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 인간 및 마우스 유래 오스카 융합단백질에 모두 결합할 수 있는 후보물질을 스크리닝 할 수 있고, 상기 후보물질은 인간 및 마우스 모두에서 오스카 단백질-콜라겐 결합 억제 저하 활성을 가질 수 있어, 인간을 대상으로 하는 치료제로 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 마우스를 이용한 동물 실험에서도 이용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 후보물질을 접촉시킨 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물과 콜라겐 간의 결합 수준을 측정하는 것; 및 상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 후보물질을 선별하는 것을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 후보물질을 hOSCAR-Fc 또는 mOSCAR-Fc와 접촉시킨 후, 콜라겐 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하여 오스카 융합단백질-콜라겐의 결합 수준을 측정하였고, 상기 측정 결과를 대조군 시료(후보물질을 접촉시키지 않은 hOSCAR-Fc 또는 mOSCAR-Fc)의 결합 수준과 비교하여, 대조군 시료보다 결합 수준이 감소한 후보물질을 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제로 선별할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 후보물질은 항-오스카 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원은 이에 제한되지 않을 수 있다.
[실시예]
실시예 1. 오스카 융합단백질 제조
오스카 융합단백질을 제조하기 위해, 인간 및 마우스에서 유래된 오스카 단백질의 엑토도메인(ectodomain)(인간 유래: 서열번호 1, 마우스 유래: 서열번호 2)을 인간 면역글로불린 감마 1 (human IgG1)의 Fc 도메인에 융합하였다.
상기에서 제조된 인간 오스카 융합단백질 및 마우스 오스카 융합단백질을 각각 hOSCAR-Fc(서열번호 3) 및 mOSCAR-Fc(서열번호 4)로 명명하였다.
실시예 2. 오스카 융합단백질과 콜라겐의 결합 확인
ELISA 기법을 이용하여 상기에서 제작된 오스카 융합단백질이 콜라겐과 상호 결합할 수 있는 지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, ELISA 플레이트에 콜라겐을 코팅하기 위해, 콜라겐(Bornstein and Traub type I from rat tail) 분말을 0.1M 농도의 아세트산 수용액에 1mg/mL 농도로 용해시킨 후, PBS (phosphate buffered saline)에 2μg/mL 농도로 희석하여 ELISA 플레이트(Costar cat. no. 3690)에 각 웰(well)당 25μL씩 가하고 1시간동안 상온에 두어 콜라겐을 코팅하였다. 그 후, 콜라겐 용액을 플레이트에서 제거하고 다시 각 웰 당 180μL씩의 블로킹 용액(3% [w/v] dried skim milk powder in PBS-0.05% Tween-20)을 가하고 1시간동안 상온에 두어 각 웰의 내부 표면을 블로킹하였다. 그 후, 블로킹 용액을 제거하고, hOSCAR-Fc를 블로킹 용액에 0.5μg/mL 농도로 희석하여 각 웰에 25μL씩 가함으로서 상온에서 1시간동안 콜라겐과 실시예 1에서 제조한 인간 오스카 융합단백질 사이의 결합을 유도하였다.
다음으로, 오스카 융합단백질과 콜라겐 사이의 결합 수준을 측정하기 위해 먼저, 상기의 ELISA 플레이트를 세척용액(PBS-0.05% Twee-20, 이후 PBST)으로 3회 세척하고, 염소 항-인간 IgG-HRP(horseradish peroxidase) (Santa Cruz Biotechnology, sc-2453)를 1:3,000으로 블로킹 용액에 희석하여 각 웰에 25 μL씩 가하였다. 플레이트를 1시간동안 상온에 두어 오스카와 goat anti-human IgG-horseradish peroxidase와의 결합을 유도하고, 이후 세척용액으로 플레이트를 3회 세척하였다. 그 후, 3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 25μL씩 각 웰에 가하고, 수 분 후 파란색으로의 색 변화가 뚜렷이 나타나면 각 웰에 25μL 씩의 1 M 농도의 황산 수용액을 가하여 효소반응을 정지시켰다. 각 웰의 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 오스카 단백질과 콜라겐 사이의 결합 수준을 측정하였다(도 1).
그 결과, 콜라겐 코팅된 ELISA 플레이트에 hOSCAR-Fc를 가하였을 때 (+hOSCAR-Fc) 콜라겐에 결합된 hOSCAR-Fc이 항-인간 IgG-HRP와 반응하여 흡광도가 측정되지만, hOSCAR-Fc가 없을 때는(-hOSCAR-Fc) 반응하지 않아 흡광도가 측정되지 않는 것을 확인하였는 바, 실시예 1에서 제작한 오스카 융합단백질은 콜라겐과 결합하는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 항-오스카 항체에 의한 오스카 융합단백질-콜라겐 결합 저해 확인
실시예 1의 오스카 융합단백질(hOSCAR-Fc 및 mOSCAR-Fc)을 이용하여 후보 항-오스카 항체의 오스카 융합단백질-콜라겐의 결합 저해 활성을 측정하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 실시예 2에서와 동일한 방식으로 ELISA 플레이트를 콜라겐으로 코팅하고 블로킹 용액으로 블로킹하였다. 그 후, 오스카 융합단백질(hOSCAR-Fc 또는 mOSCAR-Fc)과 항-오스카 IgG 항체(Ab1 내지 Ab5)를 블로킹 용액에 혼합하고 1.5시간 동안 두어 오스카 단백질과 항체 사이의 결합이 일어날 수 있도록 하였다. 이 때, hOSCAR-Fc는 혼합 후 농도가 0.1~0.5μg/mL, mOSCAR-Fc는 1μg/mL, 항-오스카 항체는 2~4μg/mL이 되도록 가하였다.
다음으로, 오스카 융합단백질과 항체의 혼합용액을 콜라겐이 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 가하여 상온에서 1시간동안 오스카 단백질과 콜라겐이 결합하도록 하였다. 그 후, ELISA 플레이트를 세척용액으로 3회 세척하고, 염소 항-인간 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, sc-2453)를 1:3,000으로 블로킹 용액에 희석하여 각 웰에 25μL씩 가한 후, 1시간동안 상온에 두어 오스카 융합단백질과 염소 항-인간 IgG-HRP 결합을 유도하고, 이후 세척용액으로 플레이트를 3회 세척하였다. 마지막으로 3,3‘, 5,5’-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액을 25μL씩 각 웰에 가하고, 수 분 후 파란색으로의 색 변화가 뚜렷이 나타나면 각 웰에 25μL씩의 1M 농도의 황산 수용액을 가하여 효소반응을 정지시켰다. 각 웰의 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 오스카 융합단백질-항체 혼합용액에서 일어나는 오스카 단백질과 콜라겐 사이의 결합 수준을 측정하였다(도 2).
그 결과, hOSCAR-Fc 또는 mOSCAR-Fc와 항-오스카 항체(Ab1 내지 Ab5)를 혼합한 후 콜라겐 코팅된 ELISA 플레이트에 가했을 때, 항-인간 IgG-HRP에 의해 검출되는 오스카 융합단백질-콜라겐 결합 신호가 항-오스카 항체를 가하지 않았을 때(no Ab)와 비교하여, 일부 항-오스카항체에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, hOSCAR-Fc 또는 mOSCAR-Fc을 이용하면, 후보 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 중 인간 및 마우스 오스카 단백질과 콜라겐의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 항체를 선별할 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 오스카(Osteoclast-associated Ig-like receptor, OSCAR) 단백질 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 도메인이 결합된 융합단백질을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 오스카 단백질의 단편은 엑토도메인(ectodomain)을 포함하는 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 오스카 단백질의 단편은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 오스카 단백질 또는 이의 단편은 인간 또는 마우스로부터 유래된 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제는 오스카 단백질과 콜라겐의 상호작용을 저해하는 효과를 갖는 항-오스카 항체, 항-오스카 항체 단편, 단백질, 올리고펩타이드, 소형 유기분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드, 화합물 또는 이들의 조합인 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트인 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 키트.
  9. 후보물질을 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 접촉은 후보물질을 인간 및 마우스 각각에서 유래된 오스카 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질과 각각 접촉시키는 것인, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    후보물질을 접촉시킨 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝용 조성물과 콜라겐 간의 결합 수준을 측정하는 것; 및
    상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 후보물질을 선별하는 것을 추가로 포함하는, 오스카 단백질-콜라겐 상호작용 저해제 스크리닝 방법.
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