WO2020105628A1 - 標的核酸の検出方法および標的核酸検出用パッケージ - Google Patents

標的核酸の検出方法および標的核酸検出用パッケージ

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • ncRNAs small non-coding RNAs
  • miRNAs micro RNAs
  • Hybridization may be used to detect ncRNA.
  • the ncRNA is hybridized to a capture probe having a sequence complementary to its nucleic acid sequence. Hybridization of nucleic acids can be analyzed by electrochemical approaches or fluorescence methods.
  • FIG. 3A is a schematic cross-sectional view of the target nucleic acid detection package
  • FIG. 3B is a schematic plan view of the target nucleic acid detection package with the lid removed.
  • FIG. 5A is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of the first embodiment.
  • FIG. 5B is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Comparative Example 1.
  • FIG. 5A is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of the first embodiment
  • FIG. 5B is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Comparative Example 1.
  • FIG. 8B is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Comparative Example 6 and Comparative Example 7.
  • FIG. 9A is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Example 8.
  • FIG. 9B is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Example 9.
  • FIG. 9C is a histogram showing the electrode number distribution with respect to the current value ratio I / I 0 of Comparative Example 8.
  • the housing 410 is in the shape of a bottomed frame having an opening.
  • the opening of the housing 410 is covered with a cover portion 420 made of a rubber member such as silicone rubber.
  • the lid portion 420 can be pierced with an injection means holding a test sample such as a syringe described below, and the test sample can be injected onto the bioprobe chip 30 with the injection means pierced. ..
  • the housing 410 and the lid portion 420 are fixed to each other by an adhesive material or the like, and have a structure in which gas does not leak from between the housing 410 and the lid portion 420, and the inside of the housing 410 and the lid portion 420 is kept airtight.
  • a container is formed.
  • the liquid discharge line 460 communicates with the internal space 422.
  • the liquid discharge line 460 is provided with an opening / closing valve 462, and the amount of the liquid flowing through the liquid discharge line 460 can be adjusted by the opening degree of the opening / closing valve 462.
  • the internal space 422 is kept airtight by closing all of the open / close valve 432, the open / close valve 442, the open / close valve 452, and the open / close valve 462.
  • the obtained target nucleic acid detection package 400 can be carried in the air.
  • a syringe 500 in which a test sample solution is held in a syringe 510 is prepared, and an injection needle 520 is covered.
  • the test sample solution is injected into the syringe 510 into the internal space 422, and the working electrode of the bioprobe tip 30 is dipped in the test sample solution.
  • the hybridization step and the detection of the target nucleic acid can be performed in a replacement gas atmosphere in which the air is replaced with a gas that does not substantially contain superoxide.
  • Example 4 A PNA having a nucleic acid sequence that is non-complementary to the nucleic acid sequence of the miRNA of SEQ ID NO: 9 (TCACATCATGTCTGATAAGCTA- (AEEA) -Cys: SEQ ID NO: 5) was used, except that the same value as that of Example 1 was used. A histogram of the number of working electrodes with respect to the value of the ratio I / I 0 (in steps of 0.1) was created (see FIG. 7A).
  • Example 6 A PNA having a nucleic acid sequence that is non-complementary to the nucleic acid sequence of the miRNA of SEQ ID NO: 9 (TCGCCCCTCTCAACCCAGCTTT- (AEEA) -Cys: SEQ ID NO: 7) was used in the same procedure as in Example 1 except that a current value was used. A histogram of the number of working electrodes with respect to the value of the ratio I / I 0 (in steps of 0.1) was created (see FIG. 8A).
  • Example 7 A PNA having a nucleic acid sequence that is non-complementary to the nucleic acid sequence of the miRNA of SEQ ID NO: 9 (CCCCTCCCAGCCCTCCCTGCCA- (AEEA) -Cys: SEQ ID NO: 8) was used, and the current value was the same as in Example 1. A histogram of the number of working electrodes with respect to the value of the ratio I / I 0 (in steps of 0.1) was created (see FIG. 8A).

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Abstract

本発明のある態様は、被検サンプル中の標的核酸の検出方法であって、置換ガスの雰囲気下で、前記標的核酸と相補性を有する捕捉プローブを導体に結合させる工程と、前記置換ガスの雰囲気下で前記被検サンプルを前記捕捉プローブに接触させ、前記捕捉プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程と、を備える。

Description

標的核酸の検出方法および標的核酸検出用パッケージ
　本発明は、標的核酸の検出方法および標的核酸検出用パッケージに関する。
　近年、２０塩基程度のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む低分子ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのｎｃＲＮＡレベルが疾患と相関する場合には、疾患マーカーとしての利用が可能である。ｎｃＲＮＡの検出には、ハイブリダイゼーションが用いられることがある。ｎｃＲＮＡは、その核酸配列と相補的な配列を有する捕捉プローブにハイブリダイズされる。核酸のハイブリダイゼーションは、電気化学的アプローチや蛍光法によって分析可能である。
　非特許文献１には、核酸のハイブリダイゼーション度合を電気化学的アプローチによって定量的に分析する方法の一例が記載されている。
Gene sensors based on peptide nucleic acid (PNA) probes: Relationship between sensor sensitivity and probe/target duplex stability. Analyst, 2005, 130, 1478-82.
　本発明者は、核酸のハイブリダイゼーションについて鋭意検討したところ、ｎｃＲＮＡに、その核酸配列と非相補的な配列を有する捕捉プローブがハイブリダイズするかのように見える現象が生じる場合があり、ｎｃＲＮＡの検出精度の低下を招くことがあることを見出した。従来技術では、ｎｃＲＮＡに、その核酸配列と非相補的な配列を有する捕捉プローブがハイブリダイズするかのように見えることへの対策が取られておらず、ｎｃＲＮＡの検出精度の向上に改善の余地があるといえる。
　本発明によれば、被検サンプル中の標的核酸の検出方法であって、置換ガスの雰囲気下で、前記標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブを導体に結合させる工程と、前記置換ガスの雰囲気下で前記被検サンプルを前記捕捉プローブに接触させ、前記捕捉プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程と、を備える標的核酸の検出方法が提供される。
　また、本発明によれば、内部が気密に保たれる容器と、前記容器の内部に設置され、標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブを含むバイオプローブチップと、を備え、前記内部がスーパーオキシドを実質的に含まない置換ガスで満たされている標的核酸検出用パッケージが提供される。
　本発明によれば、捕捉プローブによる標的核酸の検出精度を高める技術を提供することができる。
標的核酸の検出方法を示す工程図である。 置換ガス雰囲気を実現するためのグローブボックスシステムの概略図である。 図３（ａ）は、標的核酸検出用パッケージの概略断面図であり、図３（ｂ）は、蓋部を外した状態での標的核酸検出用パッケージの概略平面図である。 被検サンプルの注入の方法を示す概略図である。 図５（ａ）は、実施例１の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図５（ｂ）は、比較例１の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。 図６（ａ）は、実施例２、実施例３の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図６（ｂ）は、比較例２、比較例３の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。 図７（ａ）は、実施例４、実施例５の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図７（ｂ）は、比較例４、比較例５の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。 図８（ａ）は、実施例６、実施例７の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図８（ｂ）は、比較例６、比較例７の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。 図９（ａ）は、実施例８の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図９（ｂ）は、実施例９の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。図９（ｃ）は、比較例８の電流値比Ｉ／Ｉ０に対する電極数分布を表すヒストグラムである。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書中、数値範囲の説明における「ａ～ｂ」との表記は、特に断らない限り、ａ以上ｂ以下であることを表す。
　本発明者は、ｎｃＲＮＡに、その核酸配列と非相補的な配列を有する捕捉プローブがハイブリダイズするかのように見える（以下、「擬似的にハイブリダイゼーションする」という場合がある）現象の原因について検討を進めたところ、捕捉プローブおよびチオール種が置かれるガス雰囲気中にスーパーオキシド（酸素が１電子還元されたフリーラジカル（Ｏ２ ・－）であり、正式にはスーパーオキシドアニオンラジカル））が存在すると、ｎｃＲＮＡと非相補的な関係にある捕捉プローブとが擬似的にハイブリダイゼーションするという知見を得た。以下、この知見に基づいて完成した発明について説明する。
（実施形態１）
　実施形態１は、被検サンプル中の標的核酸の検出方法であって、実質的にスーパーオキシドを含まない置換ガスの雰囲気下で、前記標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブを導体に結合させる工程と、前記置換ガスの雰囲気下で前記被検サンプルを含有する液体組成物を前記捕捉プローブに接触させ、前記捕捉プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程と、を備える。以下、実施形態１に係る標的核酸の検出方法の詳細について説明する。
　図１（ａ）～図１（ｄ）は、標的核酸の検出方法を示す工程図である。まず、図１（ａ）に示すように、バイオチッププローブ用の多層基板１０を用意する。多層基板１０は、基板１２、導体１４およびレジスト層１６を備える。
　基板１２は、たとえば、エポキシ樹脂などの樹脂やガラスで構成される。導体１４としては、金、白金、などの金属材料を用いることができ、この中でも、金が好適に用いられる。導体１４は、たとえば、スパッタ法などにより金を基板１２上に堆積した後、エッチング法により所定パターンになるように形成される。レジスト層１６は、導体１４の所定領域が露出するように導体１４を被覆する。レジスト層１６は、たとえば、周知のレジスト材料で導体１４全体を被覆した後、フォトリソグラフィ法により所定領域に開口を形成することで得られる。レジスト層１６に設けられた開口の径は、たとえば、３０μｍ～３００μｍである。導体１４の露出部は作用電極として用いられる。
　なお、基板１２上に、図示しない対向電極および参照電極が設けられる場合と、基板１２外に対向電極および参照電極を設ける場合、或いはそれらの組み合わせのいずれかを採用することができる。基板１２上に対向電極および参照電極を設ける場合には、レジスト層１６には、対向電極および参照電極用の開口が形成される。参照電極の表面は、通常、銀塩化銀で被覆される。
　次に、図１（ｂ）に示すように、標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブ２０として、導体１４の露出部にＰＮＡ（人工核酸、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）を結合させる。具体的には、ＰＮＡの末端にチオールリンカーを設けた分子構造とし、末端にチオールリンカーが結合したＰＮＡが分散されたエタノールなどの有機溶媒中に、導体１４の露出部を３０分浸した後、エタノールなどの有機溶媒や超純水で洗浄することにより、導体１４とチオールリンカー中の硫黄が結合し、導体１４の露出部が捕捉プローブ２０で修飾されたバイオプローブチップ３０が得られる。
　なお、基板１２上に複数の導体１４を設け、各導体１４の露出部に、共通の標的核酸に対応した配列の捕捉プローブ２０を結合させてもよい。また、基板１２上に複数の導体１４設け、異なる標的核酸に対応した配列の捕捉プローブ２０を選択的に修飾してもよい。
　次に、図１（ｃ）に示すように、導体１４の露出部のうち、捕捉プローブ２０が修飾されていない領域に、チオール種２２を結合させることが好ましい。チオール種２２として、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基、リン酸基、またはアミノ基を含むアルカンチオールが用いられ、たとえば、メルカプトエタノール、６－ヒドロキシ－１－ヘキサンチオール（ＨＨＴ）、８－ヒドロキシ－１－オクタンチオール、１１－ヒドロキシ－１－ウンデカンチオール等が挙げられる。チオール種２２による被覆方法は、捕捉プローブ２０による修飾と同様に、エタノールなどの有機溶媒中にチオール種２２を分散させた溶液中に導体１４の露出部を浸した後、エタノールなどの有機溶媒や超純水で洗浄する方法が挙げられる。捕捉プローブ２０が修飾されていない領域をチオール種２２で被覆することにより、導体１４の表面に標的核酸が非特異的に吸着することが抑制される。また、捕捉プローブ２０自体が導体１４の表面に吸着することが抑制されるため、捕捉プローブ２０の二次構造の安定化を図ることができる。以上の工程により、バイオプローブチップ３０が作製される。
　次に、図１（ｄ）に示すように、導体１４の露出部に被検サンプル４０を滴下する。被検サンプル４０には多種のｍｉＲＮＡが分布不明な状態で含まれている。捕捉対象の配列を持つｍｉＲＮＡ（標的核酸）のみが捕捉プローブ２０とハイブリダイゼーションして二重らせんを形成し、導体１４の露出部に残留する。ｍｉＲＮＡは、骨格基に負電荷を持っているため、導体１４を負に帯電させる。
（標的核酸の検出）
　作用電極、対向電極および参照電極をポテンショスタットに接続し、作用電極と参照電極との間の電位がポテンショスタットにより調整される。ポテンショスタットから与えられた走査電位に応じて作用電極の表面で酸化還元反応が行われ、酸化還元電流が発生する。作用電極が複数形成されている場合には、個々の作用電極に対して、計測した酸化還元電流を元に解析を行う。それにより、作用電極毎に対応する配列を持つ標的核酸が、被検サンプル中にどの程度の量で存在していたか算出することができる。
　具体的には、標的核酸の検出に酸化還元マーカと呼ばれる化合物を用いる。標的核酸がハイブリダイゼーションしていない作用電極では、酸化還元マーカが電位に応じて移動する。移動した酸化還元マーカは導体１４の露出部で酸化還元反応を行い、酸化還元電流を発生させる。酸化還元マーカは、特に限定されないが、たとえば、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－を用いることができる。
　酸化還元反応を利用したハイブリダイゼーションの電気化学的な検出方法は特に限定されず、周知のサイクリックボルタンメトリ（ＣＶ）や微分パルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）を適用することができる。
　本実施形態では、図１（ｂ）で示した捕捉プローブ２０による修飾工程、図１（ｃ）で示したチオール種２２の結合工程、図１（ｄ）で示したハイブリダイゼーション工程および標的核酸の検出を、実質的にスーパーオキシドを含まないガスで空気を置換した置換ガス雰囲気下で実施する。置換ガス雰囲気下では、後述するガスの割合は８０体積％以上が好ましく、９０体積％以上がより好ましく、９５体積％以上がさらに好ましく、１００体積％が最も好ましい。
　空気の置換に用いられるガスとしては、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンなどの希ガスや窒素などの不活性ガスが挙げられる。ただし、窒素を用いる場合には、スーパーオキシドを含有しない酸素を混合させる。
　置換ガスを窒素のみとした場合、ハイブリダイゼーション前に、捕捉プローブ中の核酸塩基が有する水素に窒素分子が結びつき、ハイブリダイゼーション時に核酸塩基同士（たとえば、ＰＮＡとｍｉＲＮＡ）の水素結合を阻害する場合がある。酸素の電気陰性度（オールレッド・ロコウ）は３．５０であり、窒素の電気陰性度３．０７より大きい。このため酸素を上記濃度で含む環境では、ハイブリダイゼーション前に捕捉プローブ中の核酸塩基が有する水素と酸素が結合し、窒素が結合することが抑制される。酸素は、水に対する溶解度が高いため、被検サンプルの溶液中で核酸塩基から容易に離脱し、ハイブリダイゼーションを阻害せずに済む。
　窒素と酸素の混合ガスにおいて、酸素濃度の下限は５体積％以上が好ましく、１０体積％以上がより好ましく、２０体積％以上がさらに好ましい。また、窒素と酸素の混合ガスにおいて、酸素濃度の上限は５５体積％以下が好ましく、５０体積％以下がより好ましく、４５体積％以下がさらに好ましい。窒素と酸素の混合ガス中の酸素濃度を５体積％以上とすることにより、窒素によるハイブリダイゼーションの阻害を抑制することができる。窒素と酸素の混合ガス中の酸素濃度を５５体積％以下とすることにより、引火リスクを下げるとともに、紫外線等により混合ガス中の酸素が１電子還元されスーパーオキシドが発生する確率を抑えることができる。
　図２は、置換ガス雰囲気を実現するためのグローブボックスシステム１００の概略図である。グローブボックスシステム１００は、グローブボックス１１０、ガス流入系２００およびガス排出系３００を備える。
　グローブボックス１１０は、上述した捕捉プローブの修飾および標的核酸のハイブリダイゼーション検出に必要な作業を行うための作業室１２０を有する。グローブボックス１１０には、開閉可能な前面扉１３０が設けられており、作業準備時に前面扉１３０を開けることで必要な備品を作業室１２０に載置することができる。グローブボックス１１０には、前面扉１３０の下方に作業室１２０内で作業を行うための作業用グローブ１４０が設けられている。
　ガス流入系２００は、ガス流入ライン２１０、開閉弁２２０および置換ガスボンベ２３０を有する。
　ガス流入ライン２１０の一方は、作業室１２０と連通しており、ガス流入ライン２１０の他方に置換ガスボンベ２３０が接続されている。ガス流入ライン２１０を通して作業室１２０に置換ガスボンベ２３０に貯蔵された置換ガスを流入させることができる。ガス流入ライン２１０には、開閉弁２２０が設けられており、開閉弁２２０の弁開度により、作業室１２０に流入させる置換ガスの量を調節することができる。
　ガス排出系３００は、ガス排出ライン３１０および陽圧安全弁３２０を有する。
　ガス排出ライン３１０の一方は、作業室１２０と連通しており、ガス排出ライン３１０の他方に陽圧安全弁３２０が設置されている。作業室１２０内の圧力が所定の陽圧（たとえば、外気圧に対して０．１ｋＰａ正圧）を超えると、陽圧安全弁３２０が開き、作業室１２０内の圧力が高くなりすぎることが抑制される。陽圧安全弁３２０が閉じた状態では作業室１２０内の圧力は陽圧に保たれる。
　なお、置換ガスとして窒素と酸素の混合ガスのような複数種のガスを用いる場合には、置換ガスボンベ２３０に混合ガスを貯蔵してもよいが、ガス毎に専用のガスボンベを用意し、ガス流入ライン２１０に接続してもよい。
　以上説明した標的核酸の検出方法によれば、スーパーオキシドにより、標的核酸に当該標的核酸と非相補的な核酸配列を有する捕捉プローブが擬似的にハイブリダイズすることが抑制される。これにより、標的核酸の検出精度を高めることができる。
　また、置換ガスとして窒素と酸素の混合ガスを用いることにより、置換ガスを窒素単独としたときに生じるハイブリダイゼーションが阻害される現象を抑制することができ、標的核酸の検出精度を高めることができる。
　なお、置換ガスの一部に酸素を用いる場合には、太陽光が遮断された遮光室内にグローブボックス１１０を設置し、室内の照明に蛍光灯を用いずＬＥＤを使用し、紫外線の影響を極力排除した環境下とすることが好ましい。これによれば、グローブボックス１１０に供給された酸素からスーパーオキシドが生成することを抑制し、グローブボックス１１００内に置換ガスとして酸素が導入された後も、グローブボックス１１０内を実質的にスーパーオキシドが存在しない雰囲気とすることができる。
（実施形態２）
　実施形態２に係る標的核酸の検出方法は、置換ガス雰囲気を実現するための手段が異なることを除いて、実施形態１の標的核酸の検出方法と同様である。
　本実施形態では、置換ガス雰囲気を実現するために、図３で示す標的核酸検出用パッケージ４００が用いられる。標的核酸検出用パッケージ４００は、内部が気密に保たれる容器と、当該内部に設置され、標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブで修飾されたバイオプローブチップとを備える。当該内部は実質的にスーパーオキシドを含まない置換ガスで満たされている。標的核酸検出用パッケージ４００の詳細について以下に説明する。
　標的核酸検出用パッケージ４００は、バイオプローブチップ３０、ハウジング４１０、蓋部４２０、気体流入ライン４３０、気体排出ライン４４０、液体流入ライン４５０および液体排出ライン４６０を有する。
　ハウジング４１０は開口を有する有底枠体状である。ハウジング４１０の開口にシリコーンゴムなどのゴム部材で構成された蓋部４２０によって蓋がされている。蓋部４２０は後述する注射器などの被検サンプルを保持した注入手段を突き刺すことができ、上記注入手段を突き刺した状態で、バイオプローブチップ３０上に上記被検サンプルを注入できるように構成される。ハウジング４１０と蓋部４２０とは接着材などにより固定され、ハウジング４１０と蓋部４２０との間からガスが漏れない構造となっており、ハウジング４１０と蓋部４２０とで内部が気密に保たれる容器が形成される。
　気体流入ライン４３０の一方は、ハウジング４１０と蓋部４２０とによって形成される内部空間４２２と連通している。気体流入ライン４３０の他方は、必要に応じて、上述した置換ガスを貯蔵する置換ガスボンベが接続される。気体流入ライン４３０には開閉弁４３２が設けられており、開閉弁４３２の開度により気体流入ライン４３０を流れるガスの量を調節することができる。
　気体排出ライン４４０の一方は、内部空間４２２と連通している。気体排出ライン４４０には開閉弁４４２が設けられており、開閉弁４４２の開度により気体排出ライン４４０を流れるガスの量を調節することができる。
　液体流入ライン４５０の一方は、内部空間４２２と連通している。液体流入ライン４５０には開閉弁４５２が設けられている。液体流入ライン４５０の他方は、必要に応じて、後述するコントロール測定用溶液や洗浄液などの液体が保持される容器と接続され、開閉弁４５２の開度により、コントロール測定用溶液や洗浄液などの液体の流通量を調節することができる。
　液体排出ライン４６０の一方は、内部空間４２２と連通している。液体排出ライン４６０には開閉弁４６２が設けられており、開閉弁４６２の開度により液体排出ライン４６０を流れる液体の量を調節することができる。
　開閉弁４３２、開閉弁４４２、開閉弁４５２および開閉弁４６２をいずれも閉じることにより、内部空間４２２が気密状態に保たれる。
　ハウジング４１０の底部に、実施形態１で説明したバイオプローブチップ３０が設置されている。バイオプローブチップ３０が備える導体に接続された配線（図示せず）が標的核酸検出用パッケージ４００の外部に導出される。
（標的核酸検出用パッケージの製造方法）
　蓋部４２０が外されたハウジング４１０の底部に、捕捉プローブおよびチオール種を修飾した後のバイオプローブチップ３０を載置する。なお、バイオプローブチップ３０への捕捉プローブおよびチオール種修飾からハウジング４１０底部へのバイオプローブチップ３０の載置までの一連の作業は、図２に示したようなグローブボックス１１０内で行うことでスーパーオキシドの吸着を防ぐことができる。蓋部４２０によりハウジング４１０に蓋をした後、ハウジング４１０をグローブボックス１１０外に取り出す。気体流入ライン４３０の他方に置換ガスを貯蔵する置換ガスボンベを接続した状態で、開閉弁４５２および開閉弁４６２を閉じ、開閉弁４３２および開閉弁４４２を開き、気体流入ライン４３０を介して置換ガスで内部空間４２２内の空気を置換した後、開閉弁４３２および開閉弁４４２を閉じ、内部空間４２２を置換ガスで満たし、実質的にスーパーオキシドを含有しないガス雰囲気とする。以上により、実質的にスーパーオキシドを含有しないガス雰囲気が保たれる標的核酸検出用パッケージ４００が得られる。
（標的核酸検出用パッケージの使用方法）
　得られた標的核酸検出用パッケージ４００は、空気中を持ち運ぶことができる。標的核酸検出用パッケージ４００使用時に、図４に示すように、被検サンプルの注入手段の一例として、シリンジ５１０内に被検サンプル溶液が保持された注射器５００を用意し、注射針５２０を蓋部４２０に突き刺した後、プランジャ５３０を押し込むことにより、シリンジ５１０内に被検サンプル溶液を内部空間４２２に注入し、バイオプローブチップ３０の作用電極を当該被検サンプル溶液に浸す。これにより、実質的にスーパーオキシドを含まないガスで空気を置換した置換ガス雰囲気下でハイブリダイゼーション工程および標的核酸の検出を実施することができる。
　本実施形態の標的核酸検出用パッケージ４００によれば、ハイブリダイゼーションおよび標的核酸の電気化学的検出時に、据え置き型のグローブボックスを必要としない。このため、空気の置換に用いる置換ガスの量を低減することができる。また、標的核酸検出用パッケージ４００は、持ち運びが容易であり、ユーザの好みの場所で容易に標的核酸の検出を行うことができる。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
　上述の各実施形態では、電気化学的な手法により標的核酸を検出しているが、捕捉プローブを蛍光物質や酵素などで標識することにより、標的核酸とハイブリダイゼーションした捕捉プローブを蛍光顕微鏡で検出する手法に適用することができる。実施形態２の標的核酸検出用パッケージ４００を使用する場合には、蓋部４２０自体を透明材料としたり、蓋部４２０にバイオプローブチップ３０観察用の透明窓を形成してもよい。
　実施形態２では、注入手段として、脱着可能な注射器５００を用いているが、注射器やスポイトなどの注入手段を蓋部４２０に固定した構造としてもよい。また、気体排出ライン４４０、液体排出ライン４６０に代えて、気体排出ライン４４０と液体排出ライン４６０を共通化した排出ラインを設けてもよい。
　以下、本発明を実施例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　同一作用電極において、ハイブリダイゼーション前のボルタモグラムの初期電流値Ｉ０（ハイブリダイゼーション前の酸化波ボルタモグラムは、ポテンシャルＥｐ０においてピーク電流値として初期電流値Ｉ０をとる。）およびハイブリダイゼーション後の酸化波ボルタモグラムのポテンシャルＥｐ０における電流値Ｉを測定すると、電流値Ｉは、初期電流値Ｉ０よりも減少する。このため、初期電流値Ｉ０に対する電流値Ｉの比（電流値比Ｉ／Ｉ０）を、核酸のハイブリダイゼーション度合を定量的に分析するための指標として機能させることができる。上記の知見に基づいた実験を実施した。実験の詳細については以下に説明する。
（実施例１）
（１）電極の調製
　（４×４電極）×８ブロックの作用電極（金電極、計１２８電極）が形成されたバイオプローブチップ用の多層基板を用意した。各金電極を酸素プラズマ装置で１０ｍＡ、２分間プラズマ照射を行い、各金電極の表面を洗浄した。グローブボックス内の空気を置換ガス（窒素：酸素＝７９：２１体積％）で置換した実質的にスーパーオキシドを含まない雰囲気下で、洗浄した作用電極の各ブロック毎に、０．０５％ＴＦＡに溶解した５０μＭのＰＮＡ（ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号１、（ＡＥＥＡ）はスペーサ部分であり、当該ＡＥＥＡは、2-(2-(aminomethoxy)ethoxy)acetylの略語である）を１０μＬ塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、超純水で洗浄し、１ｍＭのＨＨＴ２００μＬを全ての金電極上に塗布し、２５℃で３０分間静置した。その後、ＰＮＡおよびＨＨＴが結合した金電極を超純水で洗浄した。以下、金電極にＰＮＡを結合させる処理および金電極にＨＨＴを結合させる処理を「前処理」と呼ぶ。
（２）コントロールの電気化学測定
　グローブボックス内の空気を置換ガス（窒素：酸素＝７９：２１体積％）で置換した雰囲気下で、配列番号１のＰＮＡが結合した作用電極を用いて、サイクリックボルタンメトリー法での酸化電流におけるピーク電流値により初期電流値Ｉ０を算出した。初期電流値Ｉ０の測定は、バイオプローブチップ上に全電極をカバーするようにウェル形成したシリコンゴムをはりつけ、このウェル内に、１０００ｕＬのコントロール測定用溶液（リン酸２．５ｍＭ、ＮａＣｌＯ４５ｍＭ、酸化還元マーカー１ｍＭ）を満たしたのち、作用電極、参照電極および対向電極をソケットを介してポテンショスタットに接続して行った。
　なお、実施形態２で説明したような標的核酸検出用パッケージ４００を用いる場合には、図４に示すような被検サンプルの注入の前に初期電流値Ｉ０の測定を実施する。この初期電流値Ｉ０の測定は、上述したコントロール測定用溶液を液体流入ライン４５０を介して内部空間４２２に流入させ、作用電極、参照電極、対向電極をソケットを介してポテンショスタットに接続して行う。測定後は開閉弁４６２を開くことで測定溶液を排出したのち、開閉弁４６２を閉じる。測定溶液の排出時に気体流入ライン４３０を介して上述の置換ガスを内部空間４２２に流通させることが好ましい。なお、標的核酸検出用パッケージ４００の内部空間４２２内に導入される置換ガスを保持する容器として、大容量のボンベを用いてよいが、カートリッジ型の可搬タイプの容器を用いることが好適である。当該可搬タイプの容器は、標的核酸検出用パッケージ４００の製造業者やガス製造業者から提供されたものを、標的核酸検出用パッケージ４００を使用するユーザが気体流入ライン４３０に接続することにより使用される。
　続いて、開閉弁４５２および開閉弁４６２を開いた状態で、エタノールなどの洗浄液を内部空間４２２に流入させ、バイオプローブチップを洗浄する。このとき、開閉弁４３２が開けられた気体流入ライン４３０を介して上述の置換ガスを内部空間４２２に流通させ、内部空間４２２を置換ガス雰囲気下に保つ。洗浄完了後、開閉弁４５２を閉じ、洗浄液を排出する。洗浄液排出後、気体流入ライン４３０を介して内部空間４２２に置換ガスを流し続けた後、開閉弁４３２および開閉弁４６２を閉じる。
（３）ハイブリダイゼーションおよび電気化学測定
　置換ガス（窒素：酸素＝７９：２１体積％）雰囲気下で、上記（１）で得られた捕捉プローブを修飾した金電極上に、標的核酸となるｍｉＲＮＡ（３’－ＵＵＡＡＵＧＣＵＡＡＵＣＧＵＧＡＵＡＧＧＧＧＵ－５’：配列番号９）の濃度が８０μＭとなるように調整されたハイブリダイゼーション溶液１０μＬを各ブロック毎に滴下し、４０℃で４０分ハイブリダイゼーションを行った。なお、配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と配列番号１のＰＮＡの核酸配列とは非相補的な関係にある。２５℃エタノール１０ｍＬで二分間の洗浄および２５℃の超純水２００ｍＬ中で２分間電極を洗浄し、上記（２）コントロールの電気化学測定と同様な測定を実施し、Ｉ０と同電位となる電流値Ｉを測定した。以下、（２）コントロールの電気化学測定および（３）ハイブリダイゼーションおよび電気化学測定を「ハイブリダイゼーション分析」と呼ぶ。
（４）電流値比の算出
　各作用電極について、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）を算出し、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図５（ａ）参照）。なお、図５～図９において、電流値比Ｉ／Ｉ０の区分「ｍ～ｎ」は「ｍ以上ｎ未満」を意味し、たとえば「０．９～１．０」という記載は「０．９以上１．０未満」を意味する。
（比較例１）
　グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図５（ｂ）参照）。
（実施例２）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号３）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図６（ａ）参照）。
（比較例２）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号３）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図６（ｂ）参照）。
（実施例３）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号４）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図６（ａ）参照）。
（比較例３）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＡＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号４）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図６（ｂ）参照）。
（実施例４）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号５）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図７（ａ）参照）。
（比較例４）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号５）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図７（ｂ）参照）。
（実施例５）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号６）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図７（ａ）参照）。
（比較例５）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号６）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図７（ｂ）参照）。
（実施例６）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号７）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図８（ａ）参照）。
（比較例６）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号７）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図８（ｂ）参照）。
（実施例７）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号８）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図８（ａ）参照）。
（比較例７）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と非相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号８）を用い、グローブボックス内に空気を満たした雰囲気下で前処理およびハイブリダイゼーション分析を行ったことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図８（ｂ）参照）。
（実験結果１：置換ガスの違いによる影響について）
　ｍｉＲＮＡとＰＮＡの核酸配列が非相補的な関係にある実施例１と比較例１、実施例２と比較例２、実施例３と比較例３、実施例４と比較例４、実施例５と比較例５、実施例６と比較例６、実施例７と比較例７とをそれぞれ比較すると、空気雰囲気下の場合に比べて、置換ガス（窒素：酸素＝７９：２１体積％）雰囲気下の電流値比Ｉ／Ｉ０の値が上昇していることが確認された。実質的にスーパーオキシドを含有しない雰囲気下とすることにより、核酸配列が非相補的な関係にあるｍｉＲＮＡとＰＮＡが擬似的にハイブリダイズするかのように見えることが抑制された結果と考えられる。
（実施例８）
　配列番号９のｍｉＲＮＡの核酸配列と相補的な核酸配列を有するＰＮＡ（ＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ－（ＡＥＥＡ）－Ｃｙｓ：配列番号２）を用いたことを除いて、実施例１と同様な手順で、電流値比Ｉ／Ｉ０の値（０．１刻み）に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図９（ａ）参照）。
（実施例９）
　グローブボックス内の雰囲気を窒素：酸素＝６０体積％：４０体積％としたことを除いて、実施例８と同様な手順でハイブリダイゼーションに関して電気化学的分析を実施し、電流値比Ｉ／Ｉ０の値に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図９（ｂ）参照）。
（比較例８）
　グローブボックス内の雰囲気を窒素１００体積％としたことを除いて、実施例８と同様な手順でハイブリダイゼーションに関して電気化学的分析を実施し、電流値比Ｉ／Ｉ０の値に対する作用電極数のヒストグラムを作成した（図９（ｃ）参照）。
（実験結果２：窒素によるハイブリダイゼーション阻害について）
　図９に示すように、比較例８のように、窒素１００体積％の雰囲気下で核酸配列が相補的な関係にあるｍｉＲＮＡとＰＮＡとを接触させると、ハイブリダイゼーションが阻害されることにより、電流値比Ｉ／Ｉ０が増加することが確認された。これに対して、実施例８、９のように、窒素に所定濃度の酸素が添加された雰囲気下で核酸配列が相補的な関係にあるｍｉＲＮＡとＰＮＡとを接触させると、比較例８に比べて電流値比Ｉ／Ｉ０の値が低下した。これは、酸素の存在により、窒素によるハイブリダイゼーションの阻害が抑制された結果と考えられる。
　この出願は、２０１８年１１月２１日に出願された日本出願特願２０１８－２１８４１５号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１０　多層基板
１２　基板
１４　導体
１６　レジスト層
２０　捕捉プローブ
２２　チオール種
３０　バイオプローブチップ
１００　グローブボックスシステム
１１０　グローブボックス
１２０　作業室
１３０　前面扉
１４０　作業用グローブ
２００　ガス流入系
２１０　ガス流入ライン
２２０　開閉弁
２３０　置換ガスボンベ
３００　ガス排出系
３１０　ガス排出ライン
３２０　陽圧安全弁
４００　標的核酸検出用パッケージ
４１０　ハウジング
４２０　蓋部
４３０　気体流入ライン
４３２　開閉弁
４４０　気体排出ライン
４４２　開閉弁
４５０　液体流入ライン
４５２　開閉弁
４６０　液体排出ライン
４６２　開閉弁

Claims (5)

  1. 　被検サンプル中の標的核酸の検出方法であって、
    　置換ガスの雰囲気下で、前記標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブを導体に結合させる工程と、
    　前記置換ガスの雰囲気下で前記被検サンプルを前記捕捉プローブに接触させ、前記捕捉プローブと前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程と、
    　を備える標的核酸の検出方法。
  2. 　前記置換ガスがヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンからなる群より得られる１種以上の希ガス、またはスーパーオキシドを実質的に含まない酸素と窒素との混合ガスである請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
  3. 　前記ハイブリダイゼーションの検出方法が前記捕捉プローブで修飾された導体への電子の授受に基づく電気化学的検出方法である請求項１または２に記載の標的核酸の検出方法。
  4. 　内部が気密に保たれる容器と、
    　前記内部に設置され、標的核酸と相補的な配列を有する捕捉プローブを含むバイオプローブチップと、
    　を備え、
    　前記内部がスーパーオキシドを実質的に含まない置換ガスで満たされている標的核酸検出用パッケージ。
  5. 　前記容器の一部に、被検サンプルを保持した注入手段を突き刺した状態で、前記バイオプローブチップ上に前記被検サンプルを注入できるように構成された蓋部が形成されている請求項４に記載の標的核酸検出用パッケージ。 
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