WO2020094907A1 - Método de diagnóstico de la hepatitis e (vhe) - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Definitions
- HEV Hepatitis E
- the present invention is within the field of Biotechnology and medicine. Particularly, it refers to a new method and a diagnostic kit or device that allows real-time genomic amplification of the Hepatitis E virus (EVH) in an isolated biological sample.
- ESH Hepatitis E virus
- HEV is transmitted mainly by the faecal-oral route (person or animal) and by the ingestion of contaminated food and water (especially of porcine or big game origin) [Kamar N et al. Hepatitis E.
- hepatitis E virus infection by genotypes 3 or 4 are highly variable, ranging from subclinical forms to symptomatic pictures (sometimes severe) such as acute hepatitis, Guillain-Barré syndrome, neuralgic amyotrophy, acute myelitis, meningoencephalitis, Bell's palsy, kidney disease (proliferative membranous glomerulonephriris), acute pancreatitis, thrombocytopenia, and aplastic anemia [Dalton HR, et al., Nat Rev Neurol.
- HEV infection may have an unfavorable impact on the clinical course of some comorbidities, such as chronic liver disease, which is associated with a higher rate of liver decompensation and death, or in immunosuppressed patients, where the disease can evolve into chronic forms with rapid progression of liver fibrosis and development of cirrhosis [Kumar Acharya, S., et al., J Hepatol 2007; 46: 387-94.]. For all these reasons, given the multiple routes of transmission of this disease, and given the increasing number of cases reported in Europe in recent years, Hepatitis E is considered an important Public Health problem in Europe.
- FIGURES Figure 1. Optimal annealing temperature gradient. Figure 2. Determination of the optimal concentration of primer. Figure 3. Comparison with higher concentrations. Figure 4. Optimal probe concentration.
- the authors of the present invention have developed and optimized a molecular diagnosis technique of HEV by PCR that covers the deficiencies of the currently commercialized diagnostic procedures. This technique has a great impact on routine clinical practice and the prognosis of patients infected with HEV, since it will substantially reduce the possibility of false negatives of the techniques currently in use.
- the proposed technique presents a high specificity and sensitivity for the molecular diagnosis of HEV infection. Compared to the commercial kits currently available for diagnosing HEV infection, the technique of the invention has the following improvements:
- Hepatitis E @ ceeramtools Kit (Ceeram; La chapelle-sur-Erdre, France): This diagnostic method specifies in its data sheet that it detects around 1 to 10 copies, but does not define its concentration (10 copies / uL or 10 copies / mL) and also does not specify with which standard chain the detection limit has been tested. Furthermore, sensitivity decreases significantly when HEV infections are analyzed with low loads produced by genotypes 3c (16% reduction), 3e (83% reduction) and 3f (33% reduction) [Abravanel et al., 2013. J Clin Microbiol. Jun; 51 (6): 1913-6] In addition, its ability to detect other viral genotypes is not specified in its data sheet [28]
- AmpliCube HEV RT-PCR kit (Mikrogen; Neuried, Germany): This diagnostic method specifies in its data sheet that it has a detection limit of 36.13 IU / mL. However, this limit has only been tested with the WHO standard chain corresponding to genotype 1a (PEI code 6329/10). In addition, its ability to detect other viral genotypes is not specified in its data sheet [https: //tools.thermofisher.eom/content/sfs/manuals/Hepatitis_E_Virus_Food_4489312.p df].
- the technique developed in this invention will notably improve the diagnostic capacity of HEV compared to the rest of the techniques currently used.
- One of the improvements provided by the proposed method with respect to the commercial methods available is that it has the capacity to detect all of the 11 WHO standard HEV chains: 1a (8567/13), 1a (8568 / 13s), 1e (8569/13), 3b (8570/13), 3c (8571/13), 3e (8572/13), 3f (8573/13), 3ra (8574 / 13s), 4c (8575/13), 4g ( 8576/13), 2a (8577 / 13s). This allows the detection limit to be determined for each of these genotypes and subtypes.
- a first aspect of the invention relates to a nucleotide primer set, hereafter the nucleotide primer set of the invention, of sequence SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO: 2.
- SEQ ID NO. 1 is the first forward, hereafter the first primer of the invention, of sequence:
- SEQ ID NO: 2. is the first reverse, hereinafter second primer of the invention, of sequence:
- a second aspect of the invention relates to a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 3. More preferably the nucleotide probe of the invention is labeled.
- a third aspect of the invention relates to an in vitro method of diagnosing HEV infection in an individual comprising:
- step (b) quantifying the amplification product obtained in step (a) using a probe of the invention.
- the term "probe” refers to a molecule that can detectibly distinguish between target molecules that differ in nucleotide structure or sequence. Detection can be done in several different ways depending on the type of probe used and the type of target molecule. Thus, for example, detection can be based on discrimination of activity levels of the target molecule, but preferably is based on detection of specific binding. Examples of such specific binding include antibody binding and nucleic acid probe hybridization.
- the probes can include enzyme substrates, antibodies, and antibody fragments, and preferably nucleic acid hybridization probes.
- the probes can be between 10 and 200 nucleotides, more preferably, between 12 and 50 nucleotides, and even more preferably the number of nucleotides of the probes of the invention.
- the term "primer”, as used herein, refers to an oligonucleotide that is capable of acting as a starting point for polynucleotide synthesis along a complementary strand under certain conditions. Such conditions include the presence of four nucleotide triphosphates or nucleoside analogs and one or more agents for polymerization, such as DNA polymerase and / or reverse transcriptase, in an appropriate buffer (“buffer” includes substituents that are cofactors or that affect the pH), ionic strength, etc.), and at a suitable temperature.
- a primer must be long enough to identify the specific sequence to be synthesized under the indicated conditions.
- Primers are short nucleotide sequences, approximately 15-24 nucleotides in length, that can be aligned with a target strand thanks to the complementarity of bases to form a hybrid between the primer and the target strand.
- Nucleic acids are extracted from the sample by procedures known to experts and commercially available, such as, but not limited to, the QIAcube systems (QIAgen, Hilden Germany), MagNA Puré (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), Maxwell (Promega , Madison, Wisconsin, USA), KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), among others.
- QIAcube systems QIAgen, Hilden Germany
- MagNA Puré Roche Diagnostics, Basel, Switzerland
- Maxwell Promega , Madison, Wisconsin, USA
- KingFisher Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA
- RNA / DNA extract when after submitting the biological sample to a procedure of extraction, separation, purification or cloning of nucleic acids, among others, it is obtained as a result either dry, in solution, whether or not attached to other molecules, whether or not adhered to various substances or beds, matter in which the RNA / DNA is found in a greater relative proportion with respect to the rest of the molecules present, compared to the starting biological sample.
- primer pair or “first pair” is understood to mean the set of two primers that, used in the same amplification or PCR reaction, allow multiple copies of a target sequence to be obtained.
- Each of the primers hybridizes to the target sequence, so that the bounded nucleotide sequence is amplified by each pair of primers.
- the extension of the primers during the PCR cycles determines the 2N exponential multiplication of the nucleotide sequence bounded by the primers, N being the number of cycles of the PCR reaction.
- an “isolated biological sample” includes, but is not limited to, biological cells, tissues and / or fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
- the term "individual” as used in the description refers to animals, preferably mammals, and more preferably, humans.
- the term “individual” is not intended to be limiting in any respect, as it may be of any age, sex and physical condition.
- detection by HEV is performed by PCR, and more preferably by qRT-PCR.
- the retrotranscriptase / s have a range of action of at least between 1 pg and 2 pg.
- Real-time RT-PCR real-time quantitative reverse transcription PCR
- This technique became possible after the introduction of an oligonucleotide probe that was designed to hybridize within the target sequence. Cleavage of the probe during PCR due to 5 'nuclease activity of Taq polymerase can be used to detect amplification of the target specific product.
- PCR corresponds to the acronym for polymerase chain reaction whereby millions of copies of the desired DNA regions can be obtained. It is characterized by the use of primer pairs that delimit the region from which millions of copies will be made, which is also known as "amplifying DNA” during PCR. PCR is made up of a set number of cycles, which in turn are made up of three stages in which the DNA strands are separated, the primers are joined and the new DNA strands are elongated. In each cycle, if the efficiency of the reaction is 100%, an exponential growth of the DNA fragments object of the amplification takes place.
- RT-PCR corresponds to the acronym for reverse transcriptase polymerase chain reaction. It is a variant of PCR and is also used to generate large numbers of copies of DNA (amplification). In RT-PCR, however, one strand of RNA is backtranscribed into complementary DNA (cDNA) using an enzyme called reverse transcriptase, and the result is amplified in traditional PCR. Exponential amplification by PCR in Reverse Transcription is a highly sensitive technique, which can detect a very low RNA copy number. It can be used as a method of molecular detection of genes and to study the genome of RNA viruses such as retroviruses.
- Another of its uses is related to the quantification of gene expression, by combining this technique with Northern blot analysis.
- One of the most important characteristics is that in the RT-PCR process, the generated cDNA no longer carries the introns that the original DNA would have. Thus, by expressing the cDNA produced by RT-PCR, an mRNA formed exclusively by exons will be generated.
- oligonucleotide refers to the sequence of nucleotide bases linked by phosphodiester linkages, usually not greater than 50 nucleotides.
- Amplification conditions or “extension conditions” refer interchangeably to conditions under which a polymerase can add nucleotides to the 3 'end of a polynucleotide.
- amplification conditions or extension are well known in the art (Sambrook and Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et to the, Current Protocols in Molecular Biology, 1987- 2007. , John Wiley & Sons.)
- virus herein, we mean all acellular microscopic infectious agents that can only multiply within the cells of other organisms.
- HEV is a positive chain ssRNA virus, species Orthohepevirus A, of the genus
- Orthohepeviruses Family Hepeviridae.
- diagnostic kit or device comprising a set of nucleotide primers of the invention and / or a probe of the invention.
- the kit of the invention can include positive and / or negative controls.
- the kit may also contain, without limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
- the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
- the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
- Another aspect of the invention relates to a primer of sequence SEQ ID NO. 1 for use as a medicine
- Another aspect of the invention relates to a primer of sequence SEQ ID NO. 2 for use as a medicine
- Another aspect of the invention relates to a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 3 for use as a medicine.
- Another aspect of the invention relates to the diagnostic kit or device of the invention for use in diagnosing HEV infection in an individual.
- medication refers to any substance used for the prevention, diagnosis, relief, treatment, or cure of diseases in man and animals. Specifically, it refers to the primers and probes of the invention used for the diagnosis of HEV infection in an individual.
- SEQ ID NO. 1 is the first forward, hereafter the first primer of the invention, of sequence:
- SEQ ID NO: 2. is the first reverse, hereinafter second primer of the invention, of sequence:
- Another aspect of the invention relates to a primer of sequence SEQ ID NO. one
- SEQ ID NO. 1 is the first forward, hereafter the first primer of the invention, of sequence:
- Another aspect of the invention relates to a primer of sequence SEQ ID NO. 2
- SEQ ID NO: 2. is the first reverse, hereinafter second primer of the invention, of sequence:
- Another aspect of the invention relates to a computer readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of the method of the invention.
- the readable storage medium comprises at least one sequence comprised in any of the probes of the invention.
- Another aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of the method of the invention.
- oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequentially elongating a single nucleotide growing strand using photolithography.
- the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a selective nucleotide activation method, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
- the photomask can be physical or virtual.
- the synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
- the supports could be, but are not limited to, NC or nylon filters or membranes (charged), silicon, or glass microscope holders covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes, or epoxy.
- the probe is each of the samples on the chip.
- the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
- a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine, and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit degradation of the probe; or as junction points for detectable debris or shielding debris.
- a polynucleotide of the invention may contain one or more base residues.
- nucleic acid or polynucleotide sequence can comprise one or more modified sugar residues including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and a hexose.
- Another aspect of the invention relates to a computer program stored on the computer readable medium of the invention, comprising software code adapted to carry out the steps of any of the methods of the invention.
- This stage consists of identifying the sequence of the pangenotypic primers using in silico techniques.
- the ORF3 region has been selected as a target for the development of these primers, since it has been identified as the ideal area for the development of molecular diagnostic techniques due to its low profile of mutations between viral genotypes / subtypes.
- Table 1 shows the sequences of the standard viral strains of the hepatitis E virus with infective capacity in humans and animals.
- the binding area of the conventional primers used today in virus quantification is highlighted in red and the probe binding area in orange. Highlighted in yellow highlights the mutations of the different viral strains comparing it with genotype 3a, standard of the World Health Organization (WHO) (GenBank accession number: AB630970).
- WHO World Health Organization
- BLAST® Basic Local Alignment Search Tool
- This section consists of carrying out tests in the laboratory for the development of the proposed technique.
- the QIAGEN OneStep kit was used RT-PCR (Qiagen; Hilden, Germany) together with the proposed primers and probe. This kit has the following technical specifications:
- Hot-Start Polymerase that produces extremely specific amplifications.
- Dual-cation PCR buffer that favors the highest specificity in a wide range of annealing temperatures, while preventing the inhibition of PCR by retrotranscriptases and inactivating RNases. Allows RNA amplification from 1 pg to 2 pg.
- Table 1 Sequence of genotypes and mutations compared to the WHO standard genotype 3a. The green check indicates the genotypes detected with the different PCR methods used in the different laboratories, while a red cross indicates the undetected genotypes. Once the optimal annealing temperature was obtained, the optimal thermocycling conditions are shown in Table 2.
- the primers and probe supplied by Integrated DNA Thecnology (IDT) and purified by desalting technique, were reconstituted at a concentration of 20uM and the labeled probe at 15uM.
- the volume of template was determined. For this, determinations were carried out with an increasing volume of template, in this case, 5, 10, 15, 20 and 25 uL of the WHO standard chain starting from a 1/512 dilution, corresponding to 976.5 IU / mL. Table 3 details the positive replicas for each of the templates used.
- Genotype 5 (Genbank: AB573435): 339pb
- Genotype 6 (Genbank: AB602441): 33bp
- Genotype 8 (Genbank: KX387867): 342bp
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Abstract
La presente invención se e refiere a un método y un kit o dispositivo de diagnóstico, con nuevos cebadores y sonda,que permite la amplificación genómica en tiempo real del virus de la Hepatitis E (HVE)enuna muestra biológica aislada
Description
DESCRIPCIÓN
Método de diagnóstico de la Hepatitis E (VHE).
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biotecnología y de la medicina. Particularmente, se refiere a un nuevo método y un kit o dispositivo de diagnóstico que permite la amplificación genómica en tiempo real del virus de la Hepatitis E (HVE) en una muestra biológica aislada.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La infección por el virus de la hepatitis E (VHE) es la principal causa mundial de hepatitis aguda de origen viral [Kamar N et al. Hepatitis E. Lancet 2012; 30: 2477-2488] Existen 4 genotipos virales (1 , 2, 3, 4) con capacidad infectiva a humanos [Kamar N et al. Hepatitis E. Lancet 2012; 30: 2477-2488, Hoofnagle JH, Nelson KE, Purcell RH. Hepatitis E. New Engl J Med 2012; 367: 1237-44] Debido a su carácter zoonótico, en los últimos años se han descrito nuevos genotipos y subtipos virales (genotipos 5, 6 y 7) con capacidad infectiva al ser humano [Smith DB, et al., J Gen Virol. 2016 Mar;97(3):537-42. doi: 10.1099/jgv.0.000393, Smith, D.B., et al. (2014). J. Gen. Virol. 95: 2223-2232] El VHE se transmite principalmente por vía fecal-oral (persona o animal) y por la ingestión de agua y alimentos contaminados (sobre todo de origen porcino o de caza mayor) [Kamar N et al. Hepatitis E. Lancet 2012; 30: 2477-2488, Hoofnagle JH, Nelson KE, Purcell RH. Hepatitis E. New Engl J Med 2012; 367: 1237-44] De esta forma, se han descrito varios brotes epidémicos en diferentes países europeos asociados al consumo de alimentos derivados de estos animales [Lee, G.H., et al. (2016). Gastroenterology. 150(2):355-7.e3] En ese sentido, este equipo de innovación demostró mediante análisis filogenético la transmisión zoonótica de VHE por consumo de carne de jabalí contaminada sugiriendo que esta especie es una importante vía de transmisión [Rivero-Juárez, A., et al. (2017). Zoonoses Public Health doi: 10.1111/zph.12343] Además, recientemente nuestro grupo ha comunicado la presencia de VHE en leche materna en el curso de la infección aguda por VHE que permite especular sobre la potencial transmisión del VHE mediante la lactancia o el consumo de leche procedente de animales infectados [Rivero-Juarez A et al., Clin Infecí Dis. 2016 Jun 1 ; 62 ( 11):1464]
Las manifestaciones clínicas de la infección por el virus de la hepatitis E por genotipos 3 ó 4 son muy variables abarcando desde formas subclínicas, hasta cuadros sintomáticos (a veces
graves) como hepatitis aguda, síndrome de Guillain-Barré, amiotrofia neurálgica, mielitis aguda, meningoencefalitis, parálisis facial de Bell, enfermedad renal (glomerulonefriris membranosa proliferativa), pancreatitis aguda, trombocitopenia y anemia aplásica [Dalton HR, et al., Nat Rev Neurol. 2016; 12: 77-85] Además, la infección aguda por el VHE puede incidir de forma desfavorable en el curso clínico de algunas comorbilidades, como sucede con las hepatopatías crónica, en las que se asocia a una mayor tasa de descompensación hepática y muerte, o en pacientes inmunodeprimidos, donde la enfermedad puede evolucionar a formas crónicas con progresión rápida de la fibrosis hepática y desarrollo de cirrosis [Kumar Acharya, S., et al., J Hepatol 2007; 46: 387-94.]. Por todo ello, dadas las múltiples vías de transmisión de esta enfermedad, y dado el creciente número de casos reportados en Europa en los últimos años, la Hepatitis E es considerada como un importante problema de Salud Pública en Europa.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs280/en/], anualmente ocurren 20 millones de infecciones por VHE, más de tres millones de casos sintomáticos y 57.000 muertes relacionadas con hepatitis E. Las mujeres embarazadas, los receptores de trasplantes, las personas con enfermedad hepática subyacente y los infectados con el VIH son las poblaciones con mayor riesgo de sufrir complicaciones por la infección por VHE y por tanto son los grupos de población especialmente tributarios a un programa de prevención y diagnóstico precoz de la enfermedad. En la actualidad, no existen métodos estandarizados para el diagnóstico de la infección por VHE. El diagnóstico indirecto a través de la detección de anticuerpos mediante estudio serológico es el procedimiento más comúnmente utilizada. Sin embargo, el diagnostico serológico de la infección por el VHE presenta diversas e importantes limitaciones que un obstáculo para su utilización en la práctica clínica habitual. En primer lugar, la sensibilidad y especificidad de los distintos métodos serológicos comercializados son muy variables [Drobeniuc J, et al. Clin Infecí Dis. 2010 Aug 1 ;51(3):e24-7] En segundo lugar, las técnicas serológicas no permiten discriminar entre infecciones pasadas e infecciones crónicas. En tercer lugar, su utilidad en el diagnóstico de pacientes inmunodeprimidos es muy limitada debido a la ausencia o retraso en la producción de anticuerpos. Y por último, las técnicas serológicas no son útiles para el diagnóstico de infección aguda en estadios precoces donde aún no se ha producido seroconversión.
El diagnóstico molecular mediante PCR es un método de diagnóstico directo con gran sensibilidad y especificidad para diagnosticar infección por VHE. Sin embargo, las técnicas comercializadas actualmente presentan limitaciones que pueden provocar resultados falsamente negativos que pueden tener importantes consecuencias en el pronóstico de los pacientes. Entre estas limitaciones son especialmente destacables:
1.- la incapacidad de amplificar genotipos con demostrada capacidad infectiva a humanos como es el genotipo 3ra, y
2.- la baja sensibilidad para detectar el genotipo 3f, el más frecuente de los genotipos del VHE aislados en nuestro medio [3, 4, Adlhoch C, et al., J Clin Virol. 2016 Sep;82:9-16. doi: 10.1016/j.jcv.2016.06.010. Epub 2016 Jun 23]
Las consecuencias e implicaciones que tienen estas limitaciones de la técnica sobre el retraso diagnóstico y el pronóstico de los pacientes son obviamente muy importantes. Por tanto, es necesario desarrollar nuevos métodos y kits de diagnóstico de la VHE.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Gradiente de temperatura óptima de annealing. Figura 2. Determinación de la concentración óptima de primer. Figura 3. Comparación con concentraciones superiores. Figura 4. Concentración óptima de sonda.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado y optimizado una técnica de diagnóstico molecular del VHE mediante PCR que cubre las deficiencias de los procedimientos diagnósticos comercializados en la actualidad. Dicha técnica tiene gran impacto en la práctica clínica habitual y el pronóstico de los pacientes infectados por el VHE, ya que reducirá sustancialmente la posibilidad de falsos negativos de las técnicas actualmente en uso.
La técnica propuesta presenta una alta especificidad y sensibilidad para el diagnóstico molecular de la infección por el VHE. En comparación con los kits comerciales disponibles actualmente para el diagnostico de la infección por el VHE, la técnica de la invención presenta las siguientes mejoras:
• RealStar HEV RT-PCR assay (Altona Diagnostic; Hamburgo, Alemania): Este método de diagnóstico especifica en su ficha técnica que posee un límite de detección de 310 UI/mL. Sin embargo, este límite de detección ha sido sólo testado con la cadena
estándar de la OMS correspondiente al genotipo 1a (PEI code 6329/10). Además, se ha demostrado que la sensibilidad de la técnica disminuye significativamente hasta en un 33% cuando se analizan infecciones por VHE con cargas virales bajas producidas por genotipo 3f (el de mayor prevalencia en nuestro medio) [Abravanel et al., 2013. J Clin Microbiol. Jun;51 (6):1913-6] Por último, no se especifica su límite de detección de otros genotipos virales en su ficha técnica [https://www.altona- diagnostics.com/tl_files/downloads/B%20-
%20neue%20Manuals%20ab%20Februar%202017/MAN-271010-EN- S02_HEV%20RTPCR%20Kit%201.0_WEB.pdf].
• HepatitisE@ceeramtools Kit (Ceeram; La chapelle-sur-Erdre, Francia): Este método de diagnóstico especifica en su ficha técnica que detecta en torno 1 a 10 copias sin embargo no define la concentración de la misma (10 copias/uL o 10 copias/mL) y tampoco especifica con que cadena estándar se ha testado el límite de detección. Además, la sensibilidad disminuye significativamente cuando se analizan infecciones por VHE con cargas bajas producidas por los genotipos 3c (reducción del 16%), 3e (reducción del 83%) y 3f (reducción del 33%) [Abravanel et al., 2013. J Clin Microbiol. Jun;51(6):1913-6] Además, no se especifica su capacidad de detección de otros genotipos virales en su ficha técnica [28]
• AmpliCube HEV RT-PCR kit (Mikrogen; Neuried, Alemania): Este método de diagnóstico especifica en su ficha técnica que tiene un límite de detección de 36,13 UI/mL. Sin embargo, este límite sólo ha sido testado con la cadena estándar de la OMS correspondiente al genotipo 1a (PEI code 6329/10). Además, no se especifica su capacidad de detección de otros genotipos virales en su ficha técnica [https://tools.thermofisher.eom/content/sfs/manuals/Hepatitis_E_Virus_Food_4489312.p df].
Por todo ello, la técnica desarrollada en esta invención mejorara notablemente la capacidad diagnostica del VHE respecto al resto de técnicas usadas en la actualidad. Una de las mejoras proporcionadas por él método propuesto respecto a los métodos comerciales disponibles radica en que tiene capacidad de detectar la totalidad de las 11 cadenas estándar de VHE de la OMS: 1a (8567/13), 1a (8568/13s), 1e (8569/13), 3b (8570/13), 3c (8571/13), 3e (8572/13), 3f (8573/13), 3ra (8574/13s), 4c (8575/13), 4g (8576/13), 2a (8577/13s). Ello permite determinar el límite de detección para cada uno de esos genotipos y subtipos. Además, presenta un límite de detección de 21.86 UI/mL, lo que supone que sea la técnica con mayor sensibilidad.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un juego de cebadores nucleotídicos, de ahora en adelante juego de cebadores nucleotídicos de la invención, de secuencia SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO. 1 es el primer forward, de ahora en adelante primer cebador de la invención, de secuencia:
5 '-RGTRGTTTCTGGGGT GAC-3 '
SEQ ID NO: 2. es el primer reverse, de ahora en adelante segundo cebador de la invención, de secuencia:
5 '-AKGG RTTGGTTGG RTGA-3 '
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una sonda nucleotídica de secuencia SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente la sonda nucleotídica de la invención está marcada.
SEQ ID NO: 3
Sonda marcada: 5 FAM-T G AYT CY CA RCCCTTCGC-T AM RA-3 '
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de diagnóstico de la infección por VHE en un individuo que comprende:
a) obtener un producto de amplificación del virus a partir de una muestra biológica aislada de dicho individuo usando juego de cebadores nucleotídicos de la invención, y
b) cuantificar el producto de amplificación obtenido en el paso (a) mediante una sonda de la invención.
En el contexto de esta invención, el término "sonda" se refiere a una molécula que puede distinguir de manera detectable entre moléculas diana que difieren en su estructura o secuencia nucleotídica. La detección se puede realizar de varias formas diferentes según el tipo de sonda utilizada y el tipo de molécula diana. Así, por ejemplo, la detección puede basarse en la discriminación de los niveles de actividad de la molécula diana, pero preferiblemente se basa en la detección de la unión específica. Los ejemplos de dicha unión específica incluyen la unión de anticuerpos y la hibridación de la sonda de ácido nucleico. Así, por ejemplo, las sondas pueden incluir sustratos enzimáticos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y preferiblemente sondas de hibridación de ácidos nucleicos. Las sondas pueden ser de entre 10 y 200 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 12 y 50 nucleótidos, y aún más preferiblemente del número de nucleótidos de las sondas de la invención.
El término "cebador", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis de polinucleótidos a lo largo de una cadena complementaria en determinadas condiciones. Tales condiciones incluyen la presencia de cuatro nucleótidos trifosfatos o análogos de nucleósidos y uno o más agentes para la polimerización, como la ADN polimerasa y/o la transcriptasa inversa, en un tampón apropiado ("tampón" incluye sustituyentes que son cofactores o que afectan al pH), fuerza iónica, etc.), y a una temperatura adecuada. Un cebador debe ser lo suficientemente largo para identificar la secuencia específica a sintetizar en las condiciones indicadas. Los cebadores son secuencias nucleotídicas cortas, aproximadamente de 15-24 nucleótidos de longitud que se pueden alinear con una hebra diana gracias a la complementariedad de bases para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana.
Los ácidos nucleicos se extraen de la muestra mediante procedimientos conocidos por los expertos y disponibles comercialmente, como por ejemplo, pero sin limitarnos, los sistemas QIAcube (QIAgen, Hilden Alemania), MagNA Puré (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), Maxwell (Promega, Madison, Wisconsin, EEUU), KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EEUU), entre otros.
En el contexto de la presente invención se entiende "extracto de ARN/ADN", cuando tras someter la muestra biológica a un procedimiento de extracción, separación, purificación o clonación de ácidos nucleicos, entre otros, se obtiene como resultado ya sea en seco, en solución, unido o no a otras moléculas, adherido o no a diversas sustancias o lechos, materia en la que el ARN/ADN se encuentra en mayor proporción relativa respecto al resto de moléculas presentes, en comparación con la muestra biológica de partida.
En el contexto de la presente invención se entiende por "pareja de cebadores" o " primer pair ", al conjunto de dos cebadores que, empleados en una misma reacción de amplificación o PCR, permiten obtener múltiples copias de una secuencia diana. Cada uno de los cebadores híbrida con la secuencia diana, de manera que se amplifica la secuencia de nucleótidos acotada mediante cada pareja de cebadores. La extensión de los cebadores durante los ciclos de PCR determina la multiplicación exponencial 2N de la secuencia de nucleótidos acotada por los cebadores, siendo N el número de ciclos de la reacción PCR.
Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia.
El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término “individuo” no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la detección por VHE se realiza mediante PCR, y más preferiblemente mediante qRT-PCR.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la/s retrotranscriptasa/s tienen un rango de actuación de al menos entre 1 pg y 2 pg.
La RT-PCR en tiempo real (PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real) es un importante desarrollo de la tecnología de PCR que permite la detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de proceso de PCR. Esta técnica se hizo posible después de la introducción de una sonda oligonucleotídica que fue diseñada para hibridar dentro de la secuencia diana. La escisión de la sonda durante la PCR debido a la actividad nucleasa 5 'de la Taq polimerasa se puede usar para detectar la amplificación del producto específico del objetivo.
El término“PCR” corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa mediante la cual se pueden obtener millones de copias de las regiones de ADN deseadas. Se caracteriza por el empleo de parejas de cebadores que acotan la región de la que se realizarán millones de copias, lo que también se conoce como "amplificar ADN" durante la PCR. La PCR está compuesta por un número determinado de ciclos, compuestos a su vez por tres fases en las que las hebras de ADN se separan, se unen los cebadores y se elongan las nuevas hebras de ADN. En cada ciclo, si la eficiencia de la reacción es del 100% se produce un crecimiento exponencial de los fragmentos de ADN objeto de la amplificación.
En el caso de la invención, el término“RT-PCR” corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. Es una variante de PCR y también se usa para generar una gran cantidad de copias de ADN (amplificación). En la RT-PCR, sin embargo, una hebra de ARN es retrotranscripta en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en una PCR tradicional. La amplificación exponencial mediante PCR en Transcripción Reversa supone una técnica altamente sensible, que puede detectar un número de copias de ARN muy bajo. Puede utilizarse como método de detección molecular de genes y para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus. Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la expresión génica, mediante la combinación de esta técnica con el análisis de Northern blot. Una de las
características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc generado ya no lleva los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente por exones.
El término "oligonucleótido" hace referencia a la secuencia de bases de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster, habitualmente no mayores de 50 nucleótidos.
Las "condiciones de amplificación" o "condiciones de extensión" se refieren indistintamente a condiciones bajo las cuales una polimerasa puede añadir nucleótidos al extremo 3' de un polinucleótido. Dichas condiciones de amplificación o extensión son muy conocidas en la técnica (Sambrook y Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987- 2007, John Wiley & Sons.)
Por “virus” en esta memoria, se entienden todos los agentes infecciosos microscópicos acelulares que solo pueden multiplicarse dentro de las células de otros organismos.
El VHE es un virus ssRNA, de cadena positiva, especie Orthohepevirus A, del género
Orthohepevirus, Familia Hepeviridae.
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN Y USOS
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo de diagnóstico, de ahora en adelante kit o dispositivo de diagnóstico de la invención, que comprende un juego de cebadores nucleotídicos de la invención y/o una sonda de la invención.
El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
USOS MEDICOS DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la invención se refiere a un cebador de secuencia SEQ ID NO. 1 para su uso como medicamento
Otro aspecto de la invención se refiere a un cebador de secuencia SEQ ID NO. 2 para su uso como medicamento
Otro aspecto de la invención se refiere a una sonda nucleotídica de secuencia SEQ ID NO: 3 para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al kit o dispositivo de diagnóstico de la invención para su uso el diagnóstico de la infección por VHE en un individuo.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En concreto se refiere a los cebadores y sondas de la invención empleados para el diagnóstico de la infección por VHE en un individuo.
SEQ ID NO. 1 es el primer forward, de ahora en adelante primer cebador de la invención, de secuencia:
5 '-RGTRGTTTCTGGGGT GAC-3 '
SEQ ID NO: 2. es el primer reverse, de ahora en adelante segundo cebador de la invención, de secuencia:
5 '-AKGG RTTGGTTGG RTGA-3 '
Otro aspecto de la invención se refiere a un cebador de secuencia SEQ ID NO. 1
SEQ ID NO. 1 es el primer forward, de ahora en adelante primer cebador de la invención, de secuencia:
5 '-RGTRGTTTCTGGGGT GAC-3 '
Otro aspecto de la invención se refiere a un cebador de secuencia SEQ ID NO. 2
SEQ ID NO: 2. es el primer reverse, de ahora en adelante segundo cebador de la invención, de secuencia:
5 '-AKGG RTTGGTTGG RTGA-3 '
MEDIOS AUTOMATIZADOS DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible comprende al menos una secuencia comprendida en cualquiera de las sondas de la invención.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendida cualquiera de las sondas de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base
modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6- terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina,1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), áster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador almacenado en el medio legible por un ordenador de la invención, que comprende código de software adaptado para llevar a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Desarrollo de los cebadores y la sonda
Esta etapa consiste en la identificación de la secuencia de los primers pangenotípicos mediante técnicas in silico. Se ha seleccionado la región ORF3 como diana para el desarrollo de estos primers, puesto que ésta ha sido identificada como la zona ideal para el desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular por su bajo perfil de mutaciones entre genotipos/subtipos virales.
En la Tabla 1 se muestran las secuencias de las cepas víricas estándar del virus de la hepatitis E con capacidad infectiva a humanos y animales. En rojo se resalta la zona de unión de los primers convencionales utilizados hoy en día en la cuantificación del virus y en naranja la zona de unión de la sonda. Resaltado en amarillo se destaca las mutaciones de las diferentes cepas víricas comparándola con el genotipo 3a, estándar de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (GenBank accession number: AB630970). De esta forma se identifica una secuencia específica de primers con la inclusión de bases degeneradas. Dichas secuencias de primers y sonda pangenotípicos serían:
Primer forward: 5 '-RGTRGTTTCTGGGGT GAC-3 '
Primer reverse: 5'-AKGGRTTGGTTGGRTGA-3'
Sonda marcada: 5 FAM-T G AYT CY CA RCCCTTCGC-T AM RA-3 '
Posteriormente, mediante BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool), se ha comprobado la especificidad de la región amplificada por estas secuencias para el virus de la Hepatitis E, sin obtener ninguna secuencia homologa o con un nivel de similitud superior al 70%.
Desarrollo de la técnica en laboratorio.
Este apartado consiste en la realización de pruebas en el laboratorio de cara al desarrollo de la técnica propuesta.
Optimización de condiciones de termociclado
Se realizó un gradiente de temperatura de 7 puntos, comprendidos entre 51 °C y 61 °C durante 40 ciclos de amplificación. Este proceso se llevó a cabo mediante qRT-PCR en un termociclador CFX Connect (Biorad; California, EEUU). Se utilizó el kit de QIAGEN OneStep
RT-PCR (Qiagen; Hilden, Alemania) junto con los primers y sonda propuestos. Este kit presenta las siguientes especificaciones técnicas:
• Mix con dos retrotranscriptasas distintas (SensiScript y OmniScript), con un rango de actuación entre 1 pg y 2 pg; por lo tanto, muestra muy alta sensibilidad.
· Polimerasa Hot-Start que produce amplificaciones extremadamente específicas.
• Buffer de PCR dual-cation que favorece la mayor especificidad en un amplio rango de temperaturas de annealing, a la vez que impide la inhibición de la PCR por las retrotranscriptasas y que inactiva las RNasas. Permite la amplificación de RNA desde 1 pg a 2 pg.
Para la realización de esta prueba se utilizó como muestra problema la cadena estándar de la Organización Mundial de la Salud (OMS), suministrada por Paul-Ehrlich-Institut (code 6329/10), y correspondiente al genotipo 3a con una concentración de 250.000 UI/mL. La temperatura óptima de alineamiento obtenida con este experimento fue de 57.1 °C (Figura 1)
Tabla 1. Secuencia de los genotipos y mutaciones en comparación con el genotipo 3a standard de la OMS. El check en verde indica los genotipos detectados con los diferentes métodos de PCR utilizados en los diferentes laboratorios, mientras que una cruz roja indica los genotipos no detectados.
Una vez obtenida la temperatura óptima de annealing, las condiciones óptimas de termociclado se recogen en la Tabla 2.
Tabla 2. Condiciones de termociclado
Concentración óptima de primers y sonda marcada
Los primers y sonda, suministrado por la casa comercial Integrated DNA Thecnology (IDT) y purificados mediante técnica desalting, se reconstituyeron a una concentración de 20uM y la sonda marcada a 15uM.
Se establecieron tres concentraciones distintas de primers dentro de los límites aconsejados por el fabricante (0,5-1 uM). De esta forma, comprobamos el rendimiento de los primers a las concentraciones de 0,25 uM, 0,5 uM, y 1 uM, mediante replicas. Los resultados obtenidos mostraron un mejor rendimiento con la concentración de 1 uM (Figura 2). Las pruebas fueron realizadas con una dilución 1/10 de la cadena estándar de la OMS.
Posteriormente fueron probadas concentraciones superiores (1 ,5 uM y 1 ,75 uM) pero el rendimiento fue subóptimo comparado con 1 uM (Figura 3).
Así mismo se determinó la concentración óptima para la sonda, siendo la concentración óptima 0,45 uM (Figura 4).
Determinación del témplate óptimo y límite de detección para la reacción.
Con el objetivo de obtener el menor límite de detección posible y de esta forma la posibilidad de detectar muestras con baja carga viral, se determinó el volumen de témplate. Para ello se realizaron determinaciones con un volumen creciente de témplate, en este caso, 5, 10, 15, 20 y 25 uL de la cadena estándar de la OMS partiendo de una dilución 1/512, correspondiente a 976,5 UI/mL. En la tabla 3 se detallan las replicas positivas para cada uno de los templates utilizados.
3,81 0/16 0/16 0/16 0/16 1/16
Tabla 3. Replicas para cada uno de los templates utilizados en distintas concentraciones de la cadena estándar de la OMS.
El límite de detección de la técnica para cada uno de los templates utilizados es el siguiente (Tabla 4).
25 uL 21 ,86 (17,38-34,30)
Tabla 4. Límite de detección para cada cantidad de témplate empleada. Ante estos resultados y para optimizar la detección de muestras con una carga viral muy baja se recomienda que el volumen de témplate utilizado sea de 25 uL. El límite de detección con este volumen de témplate es de 21,86 UI/mL, calculado mediante análisis Probit
Determinación límite mínimo de cuantificación de la técnica y diseño de una curva patrón.
Posteriormente, se realizó una RT-PCR para establecer el límite de cuantificación. Además, se diseñó una curva patrón con la cadena de la QMS anteriormente
mencionada. Esta prueba consistió en una qRT-PCR de 18 puntos de dilución con un factor de dilución de 1 :2. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Dilución
7l 500,000 29,50
1/16384 30.5 NA
Tabla 5. qRT-PCR realizada para el diseño de la curva patrón y la determinación del límite de cuantificación de la técnica.
Sensibilidad en panel de cadenas virales estándar de la OMS
En este paso se verificó la sensibilidad de la técnica frente al panel de cadenas estándar de la OMS suministrado por Paul-Ehrlich-Institut (código 8578/13). Este panel contiene 11 muestras positivas para VHE que incluyen los siguientes genotipos y subtipos virales: 1a (8567/13), 1a (8568/13s), 1e (8569/13), 3b (8570/13), 3c (8571/13), 3e (8572/13), 3f (8573/13), 3ra (8574/13s), 4c (8575/13), 4g (8576/13), 2a (8577/13s). La información adicional de este panel se especifica en la Tabla 6.
8571/13 3c plasma 2.511 (1.862-3.388) 630 7.585
8572/13 plasma 3.162 (2.290-4.365) 977 10.471
8573/13 3f plasma 6.918 (3.981-11.748) 251 138.038
8575/13 4c plasma I I .748 (6.606-20.417) 1.071 234.422
8576/13 plasma 5.888 (3.090-10.964) 1.348 1 12.201
8577/13 2a fecal 263.026 (125.892- 1.862 1.258.92 s 549.540) 5
Tabla 6. Panel de cadenas estándar de la OMS.
En la Figura 4 puede observarse como la técnica fue capaz de detectar todos los genotipos presentes en este panel de 11 genotipos.
Posteriormente se realizaron 10 replicas para cada uno de los genotipos de este panel y de esta forma obtendríamos una media Cq. Con esta media y la curva patrón diseñada en el apartado 2.4., obtendríamos la carga viral de cada uno de los genotipos para esta técnica propuesta (Tabla 7).
Genotipo Media Cq Carga viral PanHEVnotypic
1a 37,22 520
1a (fecal) 32.12 42.720
1e 35,51 2.320
3f 33,99 8.520
3ra (fecal) 29.29 448.840
4c 33,32 15.200
,
Tabla 7. Valores de Cq y de carga viral obtenidos utilizando la técnica desarrollada en el proyecto para diferentes genotipos virales suministrados por la OMS.
Ninguna de las cargas virales obtenidas por la técnica propuesta está por debajo del mínimo obtenido por la OMS. Incluso algunos genotipos son detectados con una carga viral superior al máximo obtenido por la OMS.
Capacidad de detección de la técnica de cadenas sintéticas víricas de genotipos emergentes
Para comprobar la capacidad de detección del procedimiento sobre genotipos virales emergentes (genotipos 5, 6, 7 y 8) se realizó la síntesis de un fragmento consistente con la región ORF3 de los mismos por parte de la empresa IDT. Las cadenas y secuencias sintetizadas fueron:
Genotipo 5 (Genbank: AB573435): 339pb
5'atgccaccatgcgccctagggctattttgctgctgctcgtcgtgcttctgcctatgttgcccgcgccaccggccggccagt cgtctggccgccgtcgcgggcggcgtagcggcggtgccggtagtggtttctggggtgaccgggttgactctcagcccttc gccctcccctatattcacccaaccaacccctttgcatccgataccatcgctgcaaccgggactggagctcgctctcggca gtcagcccgtccacttggctccgcctggcgcgatcagacccagcgcccccccgctgcctcccgtcgtagatctacccca accggggcttcgccgttga3'
Genotipo 6 (Genbank: AB602441): 33bp
5'atgccaccatgcgtcctagggctgtattgctgctgttcctcatgcttctgcctatgctgcccgcgccaccggccggtcagc cgtctgattacagattacagagcggcggttccggaggtggtttctggggtgaccgggttgactctcagcccttcgccctccc
ctatattcacccaaccaacccctttgcatccgatgtttccacttcgattacagattacacccgcgcacggcaggcagcccgt ccactcggctccgcctggcgcgaccagtcccagcgcccctccgcctctgcacgtcgtagacctaccccagctggggctt cgccgttga3' Genotipo 7 (Genbank: KJ496143): 342bp
5'atgggtacaccatgcgccctcgggctattttgctgttgctcctcttgcttttgcctatgctgcccgcgccaccggccggtca gtcgtctggccgtcgccgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgacagggttgattctcagccctt cgcactcccctatattcatccaaccaacccattcgccgctgatgtctccgcagcatccaggtctgggactggccttcgcca atcggcccgaccactcggtaccgcttggcgtgaccaatcccagcgcccccccgcttccactcgccgccgatctgcccca tccggggctgcgccgctga3'
Genotipo 8 (Genbank: KX387867): 342bp
5'atgggtacatcatgtgcactcgggctgtattgttgctgttcctcttgcttctgcctatgctgcccgcgccaccggccggtcag ccgtctggccgccgtcgtgggcggcgcagcggcggttccggcggtggtttctggggtgaccgggttgattctcagcccttc gcactcccctatattcatccaaccaacccctttgtcgcagacatcacctcttcatccggggctgggtctcgccctcgccagc catcccgaccactcggtaccgcttggcgcgaccaatcccagcgccccgccgctcccactcgtcgccgatctgcccccgc tggggcagcgccgttaa3'
Como control de síntesis se empleo la secuencia de la cadena de genotipo 1a (8567/13) del panel de la OMS. Las secuencias se reconstituyeron a la concentración recomendada por el fabricante (10ng/uL). En la Figura 5 puede observarse como la técnica fue capaz de detectar todos los genotipos sintéticos.
Claims
1.- Un juego de cebadores nucleotídicos de secuencia SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO: 2.
2.- Una sonda nucleotídica de secuencia SEQ ID NO: 3.
3.- Un método in vitro de diagnóstico de la infección por VHE en un individuo que comprende:
a) obtener un producto de amplificación del virus a partir de una muestra biológica aislada de dicho individuo usando los cebadores según la reivindicación 1 , y b) cuantificar el producto de amplificación obtenido en el paso (a) mediante una sonda según la reivindicación 2.
4 - El método de diagnóstico según la reivindicación 3, donde la detección por VHE se realiza mediante qRT-PCR.
5.- El método de diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la/s retrotranscriptasa/s tienen un rango de actuación de al menos entre 1 pg y 2 pg.
6.- Un kit o dispositivo de diagnóstico que comprende un juego de cebadores nucleotídicos según la reivindicación 1 y/o una sonda según la reivindicación 2.
7.- El uso del kit o dispositivo de diagnóstico según la reivindicación anterior para el diagnóstico de la infección por VHE en un individuo.
8.- Un cebador de secuencia SEQ ID NO. 1 para su uso como medicamento.
9.- Un cebador de secuencia SEQ ID NO. 2 para su uso como medicamento.
10.- Una sonda nucleotídica de secuencia SEQ ID NO: 3 para su uso como medicamento.
11.- El cebador según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, y/o la sonda según la reivindicación 10, para su uso en el diagnóstico de la infección por VHE en un individuo.
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