WO2020085936A1 - Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки - Google Patents

Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки Download PDF

Info

Publication number
WO2020085936A1
WO2020085936A1 PCT/RU2018/000703 RU2018000703W WO2020085936A1 WO 2020085936 A1 WO2020085936 A1 WO 2020085936A1 RU 2018000703 W RU2018000703 W RU 2018000703W WO 2020085936 A1 WO2020085936 A1 WO 2020085936A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
genes
sorafenib
expression levels
raf1
fgfr1
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000703
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Антон Александрович БУЗДИН
Максим Игоревич СОРОКИН
Валерий Иванович ШИРОКОРАД
Кирилл Юрьевич КАШИНЦЕВ
Андрей Владимирович ГАРАЖА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкобокс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкобокс" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкобокс"
Priority to RU2019132020A priority Critical patent/RU2747746C2/ru
Priority to PCT/RU2018/000703 priority patent/WO2020085936A1/ru
Publication of WO2020085936A1 publication Critical patent/WO2020085936A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the proposed technical solution relates to test systems that are used in personalized medicine for the diagnosis of cancer, namely, for kidney cancer, and to evaluate the effectiveness of treatment of this disease with Sorafenib.
  • the use of this method will allow you to choose a drug for the treatment of the patient based on an analysis of objective individual changes that have occurred in the pathological tissue.
  • the technical task of the present invention was to develop new approaches to the treatment of kidney cancer in patients, in particular, using a classifier that predicts an individual positive or negative clinical response to treatment with Sorafenib in kidney cancer (renal carcinoma) based on profiling of gene expression in tumor biopsy tissue .
  • the classifier developed in this invention uses at least 4 test genes in the analysis of changes in expression levels to build an individual prognosis of the clinical efficacy of Sorafenib in patients with kidney cancer. Based on the determined levels of gene expression, this method simulates the effect of Sorafenib and evaluates the effectiveness of its effect on an individual patient.
  • a method for treating renal carcinoma in a patient comprising administering sorafenib to a given patient when the patient has been determined to be responsive to sorafenib using the method, which includes the following steps: (a) measured in a sample of renal tissue carcinoma obtained from the indicated patient, expression levels of at least two of ten sorafenib target genes: BRAF, RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, PDGFRB, KIT, KDR, RET, as well as the expression level of at least two of the normalization genes selected from the list ⁇ ASTB, RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, AC01 AC02, ASOZ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, G
  • Sorafenib target genes The need to use at least two Sorafenib target genes is due to the fact that none of these genes individually is sufficient to reliably identify responders to this drug among patients with kidney cancer.
  • Sorafenib target genes the expression level of any one taken gene of 10 sorafenib target genes did not differ significantly between the groups of responders and non-responders. Reliability was checked by student criterion.
  • this method is characterized in that the threshold value is determined by calculating and minimizing the proportion of false-positive results and the proportion of false-negative results of determining the effectiveness of sorafenib in patients with a known response status to Sorafenib.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is performed using a lllumina HiSeq-3000 total RNA sequencer; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * 1ode (RAF1) + 2 * 1ode (FGFR1) + 1ode (FLT1) + logio (FL73) - ⁇ od- ⁇ o (NK) where NK is the geometric mean level of expression of the normalization genes ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP and the threshold value is 15.15.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is carried out using the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 microchip; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * ⁇ ogw (RAF1) + 2 * log-m (FGFR1) + logi 0 (FL77) + logi 0 (FL73) - ⁇ od TM (NK), while NK is the geometric mean expression level of the normalizing genes ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the threshold value is 12.4.
  • this method is characterized in that the expression levels of these genes are measured using a reverse transcription apparatus and polymerase chain reaction; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * ACt RAFI + 2 * ACt FGFRI + ACtFm + ACt FLT3, while ACt is the difference in the geometric mean of the threshold cycle of amplification of cDNA of normalization genes for ACTU GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP and values of the threshold cDNA amplification cycle of the analyzed gene; and the threshold value is -23.05.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is carried out using the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 microchip; as normalizing genes choose KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, AC02; and the value of the combination of expression levels of the genes RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR and normalization genes is calculated by the formula 1ode (RAF1) + 1ode (FGFR1) + logio (FL77) + logio (FL73) + logi 0 (6FAF + log 10 (K / 7) + logio (DR) + logio (PDGFRS) + logic ⁇ RET) + logio (FL74) - log w (HK), while NK is the geometric mean of the level of expression of normalization genes KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, AC02 and the threshold value is 13.14.
  • this method is characterized in that the threshold value is determined by calculating and minimizing the proportion of false-positive results and the proportion of false-negative results of determining the effectiveness of sorafenib in patients with a known response status to sorafenib. In some other embodiments of the invention, this method is characterized in that the threshold value is determined by calculating the proportion of false-positive results and the proportion of false-negative results of determining the effectiveness of sorafenib in patients with a known response status to sorafenib and minimizing the value of the following sum: 3 * the proportion of false-positive results + the proportion of false-negative results.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is performed using a lllumina HiSeq-3000 total RNA sequencer; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of the expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * 1ode (RAF1) + 2 * logm (FGFRl) + 1ode (FLT1) + 1ode (FLT3) - ⁇ od-yu (NK) where NK is the geometric mean level of expression of the normalization genes ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the threshold value is 15.15.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is carried out using microchip lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * ⁇ ogw (RAF1) + 2 * logi 0 (FGFR1) + logi 0 (FLT1) + logi 0 (FL73) - ⁇ ogw ( HK), while NK is the geometric mean level of expression of the normalizing genes ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the threshold value is 12.4.
  • this method is characterized in that the expression levels of these genes are measured using a reverse transcription apparatus and polymerase chain reaction; as normalizing genes choose ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; and the value of the combination of expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 genes and normalization genes is calculated by the formula 3 * ACI RAFI + 2 * ACt FGFRI + AC ⁇ FLTI + ACt FLT3, while ACt is the difference in the geometric mean of the threshold cycle of amplification of cDNA normalization genes ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP and values of the threshold cycle of amplification of cDNA of the analyzed gene; and the threshold value is -23.05.
  • this method is characterized in that the measurement of gene expression levels is carried out using the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 microchip; as normalizing genes choose KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, AC02; and the value of the combination of the expression levels of the RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR genes and normalization genes is calculated by the formula logm (RAF1) + ⁇ ogw (FGFR1) + 1 module (FLT1) + 1 module (FLT3 ) + 1ode (BRAF) + ⁇ od-yu (K1T) + 1odeu (KDR) + 1odeu (PDGFRB) + ⁇ ogw (RET) + log-m (FLT4) - 1uduu (NK), while the NK is the geometric average expression of normalization genes KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A
  • FIG. 1 The scheme of the test system for determining the clinical effectiveness of the drug Sorafenib for patients with kidney cancer.
  • FIG. 2 ROC-curve, which allows to assess the quality of the binary classifier of responders from non-responders to the drug sorafenib for kidney cancer, based on the calculation of the DS parameter. Large values of the DS parameter indicate that the patient will respond to the drug sorafenib according to the RECIST criterion.
  • FIG. 4 ROC-curve, which allows to assess the quality of the binary classifier of responders from non-responders to the drug sorafenib for kidney cancer, based on the calculation of the DS parameter. Large values of the DS parameter indicate that the patient will respond to the drug sorafenib according to the RECIST criterion.
  • FIG. 5 ROC-curve, which allows assessing the quality of the binary classifier of responders from non-responders to the drug Sorafenib for kidney cancer based on the calculation of the DS parameter, provided that all Sorafenib target genes and the alternative from FIG. 2-4 sets of normalization genes.
  • Large values of the DS parameter indicate that the patient will respond to Sorafenib according to the RECIST criterion.
  • the present invention discloses the creation of an effective approach to personalized therapy for patients with kidney cancer, that is, to the choice of an antitumor drug that is most suitable for a particular patient.
  • the expression data analysis method described here solves the problem of predicting the clinical efficacy of the targeted drug Sorafenib for patients with kidney cancer.
  • the proposed method is based on a bioinformatic analysis of the expression data of target genes - sorafenib targets, as well as normalization genes. Gene expression is measured in a tumor sample obtained from a patient. For this, it is first necessary to isolate the total fraction of RNA or messenger RNA (mRNA) from this sample. Data on gene expression can be obtained by different methods: RT-PCR, microarray hybridization, RNA sequencing of a new generation.
  • the proposed test system is a classifier based on data on the expression of a set of genes (gene signature), which predict a possible response or non-response of a patient to therapy with Sorafenib in case
  • sorafenib the administration of sorafenib or the drug Sorafenib in this invention means the use or administration of a drug, or the drug itself, containing sorafenib as an active ingredient, as well as additionally containing excipients (inactive substances), for example, salts, stabilizers, acidity regulators, etc.
  • excipients inactive substances
  • An example of such medications is, for example, Nexavar (Nexavar®) approved in the Russian Federation.
  • test system data are required on the expression level of at least two of the 10 genes - sorafenib targets (BRAF, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, KDR, KIT, PDGFRB, RAF1, RET), as well as at least two of any genes in the home households (ASTV, RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, AC01, AC02, ASOZ, KLHL9, KLHL13, KANK1, PANK1 RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, B2M, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, PPP2CA, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, analysis based on V
  • Sorafenib target genes were selected according to the drugbank open drug target database (https://www.drugbank.ca). To predict the patient's response to sorafenib, it was precisely the target genes of this drug that were selected for two reasons: (1) given that more than 20,000 protein-coding human genes are known, but the studied patient samples are two to three orders of magnitude less than this number and usually comprise dozens of patients , there is a significant risk that the found characteristic genes for one patient sample will not work for another sample due to the retraining of the model.
  • Tumor tissue samples including those fixed with formalin and embedded in paraffin blocks (FFPE), are used to obtain sections on the microtome.
  • Total RNA is isolated from the obtained sections.
  • profiling of gene expression is carried out on microarrays using either RT-PCR or new generation sequencing. In this case, the expression of at least four genes is determined, of which at least two are target and two are normalization.
  • i is the number of target genes of sorafenib, varies in the range from 2 to 10
  • j is the number of normalization genes, varies in the range of 1 to 49
  • the calculation of the drug efficacy coefficient (Drug Score, DS) for RT-PCR is carried out according to the formula (2): where ACt is the difference between the geometric mean of the threshold cDNA amplification cycle of normalization genes and the threshold cDNA amplification cycle of the analyzed gene.
  • This gene signature is applicable for analysis of gene expression measured using the reverse transcription method and polymerase chain reaction with real-time detection (RT-PCR).
  • Normalization genes are selected individually for each experimental platform based on the smallest variability in expression level between all kidney cancer samples profiled on this platform.
  • the following 6 genes were consensus least variable in the experimental platforms we studied: ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP, but this does not exclude the possibility of using another set of normalization genes.
  • DSHTGE 3 * logio (RAF1) + 2 * 1odeu (FGFR1) + log (FLT1) + log FLT3) - 1odeu (NK), where NK is the geometric mean expression level of normalization genes (ASTV, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP).
  • the proposed gene signature is applicable to data on gene expression obtained on the following platforms for measuring gene expression: microchip platform lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2, platform for sequencing the new generation of lllumina HiSeq-3000.
  • the calculation of the drug efficacy coefficient (Drug Score, DS) in the case of a new generation sequencing or microarray hybridization (HTGE - High-Throughput Gene Expression profiling), according to one embodiment of the present invention, is carried out according to the formula (4) :
  • DSHTGE ⁇ OQw (RAF1) + 1ode (FGFR1) + log ⁇ (FLTI) + log (FLT3) + log (BRAF) + 1 (/ T) + 1 (KDR) + logi 0 (PDGFRB) + 1 odyu (RET) + logi 0 (FLT4) - 1 odyu (NK), where HK is the geometric mean level of expression of normalization genes (KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, AC02).
  • the DS value allows us to make the following prediction for each individual patient with kidney cancer: will there be a clinical response using the RECIST system [Criteria for assessing the response of solid tumors; Eisenhauer EA, et al., New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009 Jan; 45 (2): 228-47] for treatment with sorafenib or not.
  • the observed clinical response will be an indication of the clinical efficacy of sorafenib.
  • the patient belongs to the group of responders to therapy. If the DS value is less than the specified threshold, the patient is referred to as non-responders.
  • the value of this threshold is chosen so that the total number of errors of the first kind (falsely identified responder) and second type (falsely identified non-responder) is minimal, provided that errors of the first kind are given three times the weight of errors of the second kind.
  • the DSPCR parameter (formula 2) will be calculated for each patient, and in the case of microarray hybridization or RNA sequencing of a new generation - DSHTGE (formula 3).
  • the DSHTGE parameter (formula 4) will be calculated for each patient. Based on the calculated coefficients, a prognosis is made of the clinical efficacy of sorafenib for an individual patient with kidney cancer. If the DS parameter exceeds a predetermined threshold, the patient belongs to the group of respondents. Otherwise, the patient is considered a non-responder. A detailed description of the selected thresholds for some commercial platforms is given in the examples of this patent.
  • Sorafenib target genes as well as normalization genes selected to calculate expression levels in a renal tissue carcinoma sample, are known in the art. The following is data on their nucleotide sequences disclosed in public sources.
  • the term “BRAF” or “human BRAF” refers to a gene encoding a serine-threonine protein kinase B-raf (Serine / threonine protein kinase B-raf), the sequence of which is given in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_004333 (https: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 004333), as well as allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • NM_004333 https: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccor
  • RAF1 or "human RAF1” refers to a gene encoding the serine-threonine protein kinase Raf-1 (Serine / threonine protein kinase Raf-1), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_002880 (https: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 002880), as well as allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • NM_002880 https: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 002880
  • allelic variants of this gene isoforms
  • FGFR1 or “human FGFR1” refers to a gene encoding a fibroblast growth factor receptor 1, the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_001174063
  • FLT1 refers to a gene encoding tyrosine kinase 1 similar to the macrophage stimulation factor (fms related tyrosine kinase 1), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_002019, as well as to allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • HGNC European Bioinformatics Institute
  • FLT3 refers to a gene encoding tyrosine kinase 3 similar to the macrophage stimulation factor (fms related tyrosine kinase 3), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_004119, as well as to allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • HGNC European Bioinformatics Institute
  • FLT4 refers to a gene encoding tyrosine kinase 4, similar to the macrophage stimulation factor (fms related tyrosine kinase 4), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_002020, as well as allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • NM_002020 allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • the unique identifier for this gene according to the Committee for the Nomenclature of Human Beings of the European Bioinformatics Institute (HGNC): 3767.
  • PDGFRB or "human PDGFRB” refers to a gene encoding a platelet derived growth factor receptor beta, the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_002609, as well as to allelic variants of this gene ( isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • allelic variants of this gene isoforms
  • KIT or “human KIT” refers to a gene encoding the tyrosine kinase KIT proto-oncogen receptor (KIT proton-oncogene receptor tyrosine kinase), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_000222, as well as allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • allelic variants of this gene isoforms present in the genomes of patients.
  • the unique identifier of this gene according to the Committee for the Nomenclature of Human Beings of the European Bioinformatics Institute (HGNC): 6342.
  • KDR or “human KDR” refers to a kinase insert domain receptor encoding gene shown in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under the number NM_002253, as well as to allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • NM_002253 allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • the unique identifier of this gene according to the Committee for the Nomenclature of Human Beings of the European Bioinformatics Institute (HGNC): 6307.
  • RET or “human RET” refers to a gene encoding the ret proto-oncogen ret (ret proto-oncogene), the sequence of which is shown in the National Center for Biotechnological Information (NCBI) under the number NM_020975, as well as to allelic variants of this gene (isoforms) present in the genomes of patients.
  • NCBI National Center for Biotechnological Information
  • HGNC European Bioinformatics Institute
  • HGNC Possible regulatory genes with corresponding sequence identifiers at the National Center for Biotechnological Information (NCBI), and also gene identifiers according to the Committee of the Human Genome Nomenclature of the European Bioinformatics Institute (HGNC) are listed below: ASTV (NM_001 101, HGNC: 132), RPL13A (NM_001270491, HGNC: 10304), RPL9 (NM_000661, HGNC: 10369), RPS29 (HGNC: 10369), RPS29 (HGNC: 10369), RPS29 (HGNC: 10369) : 10419), EN01 (NM_001428, HGNC: 3350), EN02 (NM_001975, HGNC: 3353), H6PD (NM_004285, HGNC: 4795), G6PD (NM_000402, HGNC: 4057), KIF1 B (NM_015074, HGNC KIF1A (NM_138483, HGNC: 888), NMNAT1 (
  • cancer and “carcinoma” describe the physiological state in mammals, which is usually characterized by unregulated cell growth.
  • Cancer pathology includes, for example, abnormal or uncontrolled cell growth, metastases, interference with the normal functioning of neighboring cells, release of cytokines or other secretory products at abnormal levels, suppression or exacerbation of the inflammatory or immunological response, neoplasia, malignancy, invasion of surrounding or distant tissues or organs such as lymph nodes, blood vessels, etc.
  • kidney cancer or "renal carcinoma” as used herein, refer to cancer that occurs in the epithelial layer of renal tubule cells. Renal carcinoma covers several relatively common histological subtypes: peptic ulcer cell carcinoma of the kidney, papillary (chromophilic) kidney cancer, collection duct carcinoma, medullary carcinoma, etc. (see Thyavihally Y., et al., Int Semin Surg Oncol 2:18 (2005 )).
  • good prognosis or “positive clinical outcome” mean the desired clinical outcome.
  • a good prognosis may be the expectation of no local relapses or metastases within two, three, four, five, or more years after the initial diagnosis of carcinoma.
  • the clinical outcome can be evaluated using any final indicator, including, without limitation, (1) the aggressiveness of tumor growth (for example, the transition to a higher stage); (2) metastases; (3) local repetition; (4) an increase in life expectancy after treatment; and / or (5) a reduction in mortality at a certain point in time after treatment.
  • the clinical outcome can be considered in the context of an individual’s outcome regarding the outcome of a population of patients with a comparable clinical diagnosis, and can be evaluated using various end-points, such as an increase in the duration of the relapse interval (RFI), an increase in the duration of overall survival (OS) in the population, an increase relapse-free survival duration (DFS), increased non-relapse recurrence distance (DRFI), and the like.
  • a patient with kidney cancer that responds to sorafenib is considered a patient who has a positive clinical result in one of the above end indicators after taking sorafenib.
  • Techniques for treating renal carcinoma with sorafenib are given, for example, in the review by Monzon and Heng, 2014 (Crit Rev Clin Lab Sci 51 (2): 85-97 (2014)).
  • RNA expression levels described may include, but are not limited to, reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR), microarray hybridization, next-generation high-performance sequencing, sequential gene expression analysis (SAGE).
  • Microarray hybridization refers to the ordered arrangement of hybridizable array elements, preferably polynucleotide probes, on a substrate.
  • the expression level of each gene can be determined using various elements of the gene, including exons, introns, and protein products.
  • gene expression is determined by the level of the corresponding mRNA or KflFIK.
  • the expression levels of the genes identified in the description can be measured in tumor tissue. For example, tumor tissue can be obtained by surgical resection of the tumor or by biopsy of the tumor.
  • Methods for obtaining a sample of renal tissue carcinoma from a patient are provided, for example (Landolt L. et al., Scand J Clin Lab Invest. Sep; 76 (5): 426-34, 2016).
  • the expression level of identified genes can also be measured in tumor cells isolated from areas removed from the tumor, including circulating tumor cells or body fluids (e.g. urine, blood, blood fraction, etc.).
  • Amplification methods e.g.
  • mRNA extraction can be performed using standard kits and reagents from commercial manufacturers in accordance with the manufacturers instructions.
  • Real-time quantitative PCR measures the accumulation of the PCR product through a two-labeled fluorescent probe (i.e., TaqMan® probe).
  • Real-time PCR is compatible with both quantitative competitive PCR, where an internal competitor is used for normalization for each target sequence, and also with quantitative comparative PCR using the normalization gene contained in the sample or the reference gene for RT-PCR (for more details, see, e.g. Dieffenbach, C. W. et al., "General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155).
  • expression level data measured for a gene product can be normalized relative to the average values of the expression level obtained for one or more reference genes.
  • Ct cycle threshold
  • a small number of genes are used as reference genes; genes selected for reference genes (housekeeping genes) usually show the minimum number of expression variations from sample to sample for both normal tissue samples and pathological tissue samples, and the expression level of other genes is compared with relatively stable expression of the reference genes.
  • the raw data from RT-PCR are expressed as the cycle threshold (Ct) - the number of polymerization cycles required for the detected signal to exceed a certain threshold.
  • Ct cycle threshold
  • a high Ct value indicates low expression, since more cycles are required to detect the amplification product.
  • Normalization can be done in such a way that a one-stage increase in the normalized level of expression of the product gene usually reflects a 2-fold increase in the amount of expression product present in the sample (Silva S et al. (2006) IUD Cancer 6,200). Then, gene expression can be standardized by dividing the normalized gene expression by the standard expression deviation for all patients for that particular gene. Specialists in the field know many statistical methods that suitable for comparing the level of gene expression in two groups and determining the statistical significance of the detected differences (Motulsky N., Intuitive Biostatistics, Oxford University Press, 1995).
  • Paraffinized blocks with samples of pathological tissue of individual patients were used as biomaterial for the study. Nucleic acids were isolated from the obtained paraffin blocks using the SileksMagNA kit (manufactured by Sileks) on magnetic particles, in accordance with the instructions of the kit manufacturer. Further, RNA preparations, using the BlueSorb DNAse enzyme (manufactured by Sileks), were freed from DNA impurities.
  • Example 1 The separation of responders from non-responders to the drug sorafenib in kidney cancer using data from gene expression obtained by microarray hybridization.
  • Microchip hybridization of samples of patients with kidney cancer and a known response status to sorafenib was performed using the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 platform according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • expression levels were obtained for each of the 10 genes in 26 patients with clear cell renal cancer.
  • DSHTGE indices were calculated for each individual patient.
  • a threshold value of DSHTGE was chosen at which the sum of errors of the first and second kind was minimal, provided that the errors of the first kind (false positive results) are three times more weight than the errors of the second kind (false negative results).
  • a threshold was chosen at which the value of the following sum would be minimal: 3 * the proportion of false positive results (FPR) + the proportion of false negative results (FNR). Based on this, the threshold value of DSHTGE was chosen to be 12.40 (Table 1) . If the DSHTGE value is greater than this threshold, then the patient belongs to the group of respondents. If less - to a group of non-responders. The area under the ROC curve for this binary classifier was 0.75 (Fig. 2).
  • Table 1 Binary classifier operation parameters based on the DSHTGE parameter separating responders from non-responders to Sorafenib with kidney cancer.
  • the DSHTGE parameter was calculated according to microchip hybridization data on the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 platform according to formula 2.
  • the optimal DSHTGE threshold is highlighted in gray.
  • Example 2 The separation of responders from non-responders to the drug sorafenib for kidney cancer using data from gene expression obtained by RT-PCR.
  • PCR mixture 25 ⁇ l
  • PCR amplifier CFX Touch Real-Time PCR Detection System manufactured by BioRad
  • DSPCR indices were calculated for each individual patient (Formula 1).
  • a threshold value of DSPCR was chosen at which the sum of errors of the first and second kind was minimal, provided that the errors of the first kind (false positive results) are three times more weight than errors of the second kind (false negative results).
  • a threshold was chosen at which the value of the following sum was minimal: 3 * the proportion of false positive results (FPR) + the proportion of false negative results (FNR).
  • the DSPCR threshold value was chosen to be -23.05 (Table 3) . If the DSPCR value is greater than this threshold, then the patient belongs to the group of respondents. If less - to a group of non-responders. The area under the ROC curve for this binary classifier was 0.95 (Fig. 3).
  • Example 3 Separation of responders from non-responders to the drug sorafenib in kidney cancer using gene expression data obtained by new generation RNA sequencing.
  • RNA sequencing of a new generation of samples of patients with kidney cancer and a known response status to Sorafenib was performed using the lllumina HiSeq-3000 platform according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • FASTQ files containing raw readings for each sample were obtained.
  • Read data were mapped to the reference genome (human genome, build GRCh38.89 from Ensembl, http://www.ensembl.org) using the STAR algorithm [Dobin A, et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013 Jan 1; 29 (1): 15-21].
  • files were obtained for each patient, which contain information on the number of uniquely mapped reads on human genes.
  • the sample was considered suitable for further investigation if there were more than 3,500,000 uniquely mapped reads on human genes. All 13 samples passed this quality control. For further analysis, information was used on 10 genes: 4 target and 6 normal. Based on these data, the DSHTGE indices were calculated for each individual patient: two responders and 11 non-responders. For this, Formula 2 was used. A threshold value of DSHTGE was chosen at which the sum of errors of the first and second kind was minimal, provided that the errors of the first kind (false positive results) are three times more weight than the errors of the second kind (false negative results). In other words, a threshold was chosen at which the value of the following sum was minimal: 3 * the proportion of false positive results (FPR) + the proportion of false negative results (FNR).
  • the threshold value of DSHTGE was chosen equal to 15.15 (Table 4). If the value of DSHTGE is greater than this threshold, then the patient belongs to the group of respondents. If less - to a group of non-responders. The area under the ROC curve for this binary classifier was 0.91 (Fig. 4). Table 4. Binary classifier operation parameters based on the DSHTGE parameter separating responders from non-responders to the sorafenib drug for kidney cancer. The DSHTGE parameter was calculated from a new generation of RNA sequencing. The optimal DSHTGE threshold is grayed out.
  • Example 4 The separation of responders from non-responders to the drug sorafenib for kidney cancer using data from gene expression obtained by microarray hybridization.
  • Microchip hybridization of samples of patients with kidney cancer and a known response status to sorafenib was performed using the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 platform according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • expression levels were obtained for each of the 10 genes in 26 patients with clear cell renal cancer.
  • the DSHTGE indices were calculated for each individual patient according to formula (4), i.e. all Sorafenib target genes were taken into account with equal coefficients, and an alternative set of normalization genes was used.
  • the threshold value DSHTGE was chosen at which the sum of errors of the first and second kind was minimal, provided that the errors of the first kind (false positive results) are three times more weight than the errors of the second kind (false negative results). In other words, a threshold was chosen at which the value of the following sum would be minimal: 3 * the proportion of false positive results (FPR) + the proportion of false negative results (FNR). Based on this, the threshold value of DSHTGE was chosen equal to 13.14 (Table 5). If the DSHTGE value is greater than this threshold, then the patient belongs to the group of respondents. If less - to a group of non-responders. The area under the ROC curve for this binary classifier was 0.76 (Fig. 5).
  • Table 5 Binary classifier operation parameters based on the DSHTGE parameter that separates responders from non-responders to Sorafenib for kidney cancer.
  • the DSHTGE parameter was calculated according to microchip hybridization data on the lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 platform according to formula 4.
  • the optimal DSHTGE threshold is 13.14 (highlighted in gray).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Предлагаемое техническое решение относится к области персонализированной медицины при онкологических заболеваниях, а именно, к тест-системам, применяемым для оценки эффективности терапии рака почки при помощи препарата сорафениб. Применение данного способа позволит выбрать для лечения пациента лекарственное средство на основании анализа объективных индивидуальных изменений, возникших в патологической ткани. Решение использует построение классификатора, дающего прогноз клинической эффективности применения сорафениба для индивидуальных онкологических пациентов, разделяя их на группы ответчиков и не ответчиков. В основе всех проводимых расчетов, помогающих разделять пациентов на группы ответчиков и не ответчиков на проводимую лекарственную терапию сорафенибом, находится математическая формула расчета генной подписи. Настоящее изобретение позволяет повысить степень надежности определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациентов.

Description

Тест-классификатор клинического ответа на лечение Сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки
Область техники
Предлагаемое техническое решение относится к тест-системам, имеющим применение в персонализированной медицине для диагностики онкологических заболеваний, а именно, при раке почки, и оценки эффективности терапии данного заболевания препаратом Сорафениб. Применение данного способа позволит выбрать для лечения пациента лекарственное средство на основании анализа объективных индивидуальных изменений, возникших в патологической ткани.
Уровень техники
Имеется ограниченное число платформ, использующих отдельные виды широкомасштабного генетического профилирования для консультирования докторов и пациентов. Примером является система Caris Molecular Intelligence. Использование платформы Caris Molecular Intelligence основано на анализе ограниченного спектра мутаций с ранее показанной клинической значимостью, а также на профилировании биообразцов пациентов на иммуногистохимической панели определения белковых онкомаркеров. Тем не менее, указанная система не адаптирована для предсказания клинического ответа таргетного лекарственного препарата на основе Сорафениба и не предназначена для одновременной обработки мультиомиксных данных. Кроме того, по указанной теме до настоящего времени отсутствуют российские патенты (имеются только международные):
1) США, US20110171633A1 , 14 июля 2011 г. «Метод оценки уровня экспрессии генов для прогнозирования клинического ответа у пациентов с раком почки». Патент предлагает ряд биомаркеров (наборы генов), анализ экспрессий которых позволяет делать клинические прогнозы, в том числе оценивать риск рецидива рака, вероятность положительного результата от операции или ответа на терапию. Авторы выявили корреляцию между уровнем экспрессии генов из различных представленных наборов с разными предсказываемыми параметрами, а именно, набор из 340 генов, экспрессия которых ассоциирована со сниженным риском рецидива заболевания, а набор, состоящий из 80 генов - с повышенным риском рецидива данного заболевания. Некоторые из разработанных наборов генов позволяют предсказывать пониженную и повышенную вероятность рецидива только с учетом анализа дополнительных факторов, таких как стадия опухоли, уровень злокачественности, размер, наличие некроза и прочее.
2) США, US20160208328A1 , 21 июля 2016г. «Применение генной подписи, предсказывающей ответ пациентов, страдающих различными формами онкозаболеваний, на лекарственную терапию с применением ингибиторов киназ, вовлеченными в (MEK)/ERK пути». Метод связан с возможностью предсказывать ответ при лечении онкобольных препаратами, являющимися ингибиторами тирозинкиназ, а именно: Сорафениб, Сунитиниб, Акситиниб, Вандетаниб, Пазопаниб, Кабозантиниб и др. Генетическая подпись в данном исследовании состояла из следующих генов: SEC14L2, H6PD, ТМЕМ140, SLC2A5, АСТА1, IRF8, STAT2, UGT2AJ Указанные гены вошли в состав платформы под названием HuTrial / HuSignature.
В настоящее время ожидаемый клинический результат для пациентов с раком почки основан на субъективных определениях клинических и патологических особенностей опухоли. Например, врачи принимают решения о соответствующих хирургических процедурах и адъювантной терапии на основании стадии, класса и степени некроза почек. Стандартные клинические критерии сами по себе имеют ограниченную способность точно оценивать прогноз пациента. На сегодняшний день в клинической практике не существует эффективных способов прогнозирования эффективности действия существующих противоопухолевых препаратов для конкретного пациента, которые бы учитывали особенности молекулярного дисбаланса, образующегося при развитии конкретной опухоли. Как следствие, большинство пациентов получают стандартные препараты, выбор которых основан на клинических или морфологических параметрах, таких как стадия заболевания, размер опухоли, агрессивность развития заболевания и др., что зачастую приводит к тому, что пациенты не отвечают на терапию, и рост опухоли продолжается. Развитие персонализированного подхода к лечению раковых заболеваний исходя из молекулярных изменений в организме пациента является актуальной задачей, и данное изобретение призвано расширить круг подходов, применяющихся для решения этой задачи.
Сущность изобретения
Техническая задача настоящего изобретения заключалась в разработке новых подходов к лечению рака почки у пациентов, в частности, при помощи классификатора, предсказывающего индивидуальный положительный или отрицательный клинический ответ на лечение препаратом Сорафениб при раке почки (карциномы почек) на основании профилирования экспрессии генов в ткани биоптата опухоли. Разработанный в данном изобретении классификатор использует в анализе изменения уровней экспрессии не менее 4 исследуемых генов для построения индивидуального прогноза клинической эффективности применения препарата Сорафениб у пациентов с раком почки. На основе определяемых уровней экспрессии генов, данный метод моделирует воздействие препарата Сорафениб и оценивает эффективность его воздействия на индивидуального пациента.
Указанная задача решается при помощи способа лечения карциномы почек у пациента, включающий введение сорафениба данному пациенту в том случае, когда данный пациент был определен, как реагирующий на сорафениб при помощи способа, который включает следующие стадии: (а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее двух из десяти генов- мишеней сорафениба: BRAF, RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, PDGFRB, KIT, KDR, RET, а также уровень экспрессии по меньшей мере двух из нормировочных генов, выбранных из списка {АСТВ, RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, АС01, АС02, АСОЗ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, В2М, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, РРР2СА, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; (б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов; (в) определяют пациента как реагирующего на сорафениб, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.
Необходимость использования не менее двух генов-мишеней сорафениба обусловлена тем, что ни одного из этих генов в отдельности не достаточно для того, чтобы среди пациентов с раком почки достоверно выявить ответчиков на данный препарат. Так, при исследовании когорты из 26 пациентов с раком почки с известным статусом ответа сорафениб, из которых 12 относились к ответчикам, 14 - к неответчикам, уровень экспрессии любого одного взятого гена из 10 генов мишеней сорафениба не отличался достоверно между группами ответчиков и неответчиков. Достоверность проверялась по критерию Стьюдента. P-значения для каждого гена при сравнении нормализованных на ген RPL9 экспрессий приведены ниже: BRAF (0,1815), RAF1 (0,3017), FGFR1 (0,8398), FLT1 (0,1073), FLT3 (0,156), FLT4 (0,125), PDGFRB (0,9314), KIT (0,2078), KDR (0,4341), RET (0,2667). В отличие от этого, анализ уровней экспрессии по меньшей мере двух из десяти генов-мишеней сорафениба уже позволяет выявить различия между группами ответчиков и неответчиков, тогда как оптимальным вариантом является анализ уровней экспрессии по меньшей мере четырех из десяти генов-мишеней сорафениба.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая и минимизируя долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на Сорафениб.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК lllumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * 1одю (RAF1) + 2 * 1одю (FGFR1) + 1одю (FLT1) + logio(FL73) - \од-\о(НК), где НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и пороговое значение равно 15,15.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1 , FGFR1 , FLT1 , FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * \ogw(RAF1) + 2 * log-m (FGFR1) + logi0(FL77) + logi0(FL73) - \од™(НК), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 12,4.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ACt RAFI + 2 * ACt FGFRI + ACtFm + ACt FLT3, при этом ACt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле 1одю (RAF1) + 1одю (FGFR1) + logio(FL77) + logio(FL73) + logi0(6FAF + log10(K/7) + logio( DR) + logio(PDGFRS) + logic {RET) + logio(FL74) - log w(HK), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02 и пороговое значение равно 13,14.
Указанная задача также решается путем создания способа определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента, включающего следующие стадии: (а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее двух генов из списка генов-мишеней Сорафениба: RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR, а также уровни экспрессии по меньшей мере двух нормировочных генов, выбранных из списка (АСТВ, RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, АС01, АС02, АСОЗ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, В2М, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, РРР2СА, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; (б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов; (в) определяют сорафениб как клинически эффективное средство для лечения карциномы почек у пациента, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.
В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая и минимизируя долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб. В некоторых других вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК lllumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * 1одю (RAF1) + 2 * logm(FGFRl) + 1одю (FLT1) + 1одю (FLT3) - \од-ю(НК), где НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 15,15.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * \ogw(RAF1) + 2 * logi 0(FGFR1) + logi 0(FLT1) + logi0(FL73) - \ogw(HK), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 12,4.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ACIRAFI + 2 * ACt FGFRI + АС \FLTI + ACt FLT3, при этом ACt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле logm (RAF1) + \ogw(FGFR1) + 1одю (FLT1) + 1одю (FLT3) + 1одю (BRAF) + \од-ю(К1Т) + 1одю (KDR) + 1одю (PDGFRB) + \ogw(RET) + log-m {FLT4) - 1одю (НК), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02 и пороговое значение равно 13,14.
Исследованиями, предоставляющими исходные данные для данного способа, могут быть мультиомиксное генетическое профилирование: высокопроизводительное профилирование экспрессии генов на уровне мРНК с использованием гибридизации на микрочипах, высокопроизводительное секвенирование нового поколения (использование известных специалистам способов секвенирования полного транскриптома или полногеномного секвенирование тотальной РНК), ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) в реальном времени. Настоящее изобретение позволяет повысить степень надежности определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациентов. Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Схема работы тест-системы определения клинической эффективности препарата Сорафениб для больных раком почки.
Фиг. 2. ROC-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи микрочипов lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 для двенадцати истинных ответчиков и четырнадцати истинных неответчиков - пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,76.
Фиг. 3. ROC-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат Сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи ОТ-ПЦР для шести истинных ответчиков и семи истинных неответчиков - пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,95.
Фиг. 4. ROC-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи секвенирования нового поколения на платформе lllumina HiSeq-3000 для двух истинных ответчиков и одиннадцати истинных неответчиков - пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,91.
Фиг. 5. ROC-кривая, позволяющая оценить качество бинарного классификатора ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки, основанного на расчёте параметра DS, при условии учета всех генов-мишеней Сорафениба и альтернативного от Фиг. 2-4 набора нормировочных генов. Большие значения параметра DS свидетельствуют в пользу того, что пациент ответит на препарат Сорафениб по критерию RECIST. Генная экспрессия измерена при помощи микрочипов lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 для двенадцати истинных ответчиков и четырнадцати истинных неответчиков - пациентов с раком почки с известным статусом ответа на сорафениб согласно данным клинических исследований. Площадь под кривой AUC = 0,76. Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
В настоящем изобретении раскрывается создание эффективного подхода к персонализированной терапии для пациентов с раком почки, то есть к выбору противоопухолевого препарата, наиболее подходящего для конкретного пациента. Описанный здесь метод анализа экспрессионных данных решает задачу прогноза клинической эффективности таргетного препарата Сорафениб для больных с раком почки. В основе предлагаемого метода лежит биоинформатический анализ данных экспрессии целевых генов - мишеней сорафениба, а также нормировочных генов. Экспрессия генов измеряется в образце опухоли, полученном от пациента. Для этого предварительно необходимо выделить тотальную фракцию РНК или матричной РНК (мРНК) из данного образца. Данные по генной экспрессии могут быть получены разными методами: ОТ-ПЦР, микрочиповая гибридизация, РНК-секвенирование нового поколения. Предлагаемая тест- система представляет собой классификатор, созданный на основе данных по экспрессии набора генов (генную подпись), которая предсказывают возможный вариант ответа или неответа пациента на терапию препаратом Сорафениб при раке почки.
Под применением сорафениба, введением сорафениба или препаратом Сорафениб в данном изобретении подразумевается применение или введение лекарственного препарата, или сам препарат, содержащий сорафениб в качестве активного ингредиента, а также дополнительно содержащий эксипиенты (неактивные вещества), например, соли, стабилизаторы, регуляторы кислотности и др. Примером таких лекарственных препаратов является, например, разрешенный на территории РФ препарат Нексавар (Nexavar®).
Для применения тест-системы необходимы данные об уровне экспрессии не менее двух из 10 генов - мишеней сорафениба ( BRAF , FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, KDR, KIT, PDGFRB, RAF1, RET), а также не менее двух из любых генов домашнего хозяйства ( АСТВ , RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, АС01, АС02, АСОЗ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, В2М, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, РРР2СА, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), полученные на основе анализа образца раковой опухоли индивидуального пациента при помощи исследования генной экспрессии методами микрочиповой гибридизации, ОТ-ПЦР или секвенирования нового поколения. Здесь и далее все обозначения генов даны согласно номенклатуре HGNC (Комитет Номеклатуры Генов Европейского Биоинформатического Института: https://www.genenarnes.orq). Гены мишени- сорафениба были отобраны согласно открытой базе данных мишеней лекарственных препаратов Drugbank (https://www.drugbank.ca). Для предсказания ответа пациента на сорафениб были выбраны именно гены-мишени данного препарата по двум причинам: (1) учитывая, что известно более 20000 белок-кодирующих генов человека, но исследуемые выборки пациентов на два-три порядка меньше данного числа и обычно составляют десятки пациентов, существует значительный риск того, что найденные характеристические гены для одной выборки пациентов не будут работать для другой выборки в связи с переобучением модели. Снижение количества признаков, необходимых для разделения ответчиков от неответчиков на препарат позволяет сделать более устойчивую тест-систему; (2) белки-мишени препарата сорафениб охарактериованы в литературе и подтверждены экспериментально (Wilhelm et al., Cancer Res., Oct 1 ;64(19):7099-109 (2004)). Учитывая, что данный препарат действует в первую очередь на конретные белки-мишени, логично предположить, что уровень экспрессии именно соответсвующих данным мишеням генов в первую очередь важен для предсказания эффективности действия препарата.
Образцы опухолевой ткани, в том числе зафиксированные с помощью формалина и залитые в парафиновые блоки (FFPE), используют для получения срезов на микротоме. Из полученных срезов выделяют тотальную РНК. Затем проводят профилирование генной экспрессии на микрочипах или с помощью ОТ-ПЦР или с помощью секвенирования нового поколения. При этом определяют экспрессию не менее четырех генов, из которых не менее двух являются целевыми и два - нормировочными.
Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в общем виде, согласно настоящему изобретению, проводится согласно формуле (1):
S /Уровень экспрессии \ /Уровень экспрессии
ai X log l гена— мишени )— / log [ нормировочного
i \ Сорафениба i ) j V гена j
Figure imgf000010_0001
где i - количество генов-мишеней сорафениба, меняется в диапазоне от 2 до 10, j - количество нормировочных генов, меняется в диапазоне от 1 до 49, а, - коэффициент целевого гена-мишени сорафениба, который зависит от типа экспериментальной платформы и может принимать любые положительные значения.
Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) для ОТ-ПЦР, согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (2):
Figure imgf000011_0001
где ACt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена.
Данная генная подпись применима для анализа генной экспрессии, измеренной с помощью метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР).
Нормировочные гены выбираются индивидуально для каждой экспериментальной платформы исходя из наименьшей вариабельности в уровне экспрессии между всеми образцами рака почки, профилированными на данной платформе. В исследованных нами экспериментальных платформах консенсусно наименее вариабельными оказались следующие 6 генов: АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP, однако это не исключает возможности использования другого набора нормировочных генов.
Расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае секвенирования нового поколения или микрочиповой гибридизации (HTGE - High- Throughput Gene Expression profiling - широкомасштабное профилированиие генной экспрессии), согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (3):
DSHTGE = 3 * logio (RAF1) + 2 * 1одю (FGFR1) + log (FLT1) + log FLT3) - 1одю (НК), где НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов (АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP).
Предлагаемая генная подпись применима к данным по генной экспрессии, полученным на следующих платформах для измерения генной экспрессии: микрочиповая платформа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2, платформа для секвенирования нового поколения lllumina HiSeq-3000.
Альтернативно, расчет коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае секвенирования нового поколения или микрочиповой гибридизации (HTGE - High-Throughput Gene Expression profiling - широкомасштабное профилированиие генной экспрессии), согласно одному из вариантов настоящего изобретения, проводится согласно формуле (4):
DSHTGE = \OQw(RAF1) + 1одю (FGFR1) + log ^(FLTI) + log-ю (FLT3) + log-ю (BRAF) + 1одю( /Т) + 1одю (KDR) + logi 0(PDGFRB) + 1одю (RET) + logi 0(FLT4) - 1одю (НК), где HK является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов (KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02). Другими словами, применяется формула (1), где у всех генов мишеней сорафениба коэффициент а, = 1 и используется аьтернативный набор нормировочных генов (генов домашнего хозяйства).
Также возможны другие варианты расчета коэффициента эффективности лекарственного препарата (Drug Score, DS) в случае выбора другой комбинации генов- мишеней и нормировочных генов.
Величина DS позволяет сделать следующее предсказание для каждого индивидуального пациента с раком почки: будет ли наблюдаться клинический ответ по системе RECIST [Критерии оценки ответа солидных опухолей; Eisenhauer ЕА, et al., New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-47] на лечение препаратом сорафениб или нет. Наблюдаемый клинический ответ будет являться указанием на клиническую эффективность препарата сорафениб. В случае, если данная величина выше порога (-23.05 - для ОТ-ПЦР; 12.4 для микрочипов lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; 15.15 для lllumina HiSeq-3000), то пациент относится к группе ответчиков на терапию. Если величина DS меньше указанного порога, пациент относится к неответчикам. Величина данного порога выбрана таким образом, чтобы суммарное количество ошибок первого рода (ложно идентифицированный ответчик) и второго рода (ложно идентифицированный неответчик) было минимальным, при условии, что ошибкам первого рода придаётся вес втрое превышающий вес ошибок второго рода.
Биоинформатический анализ данных зависит от метода, при помощи которого была измерена генная экспрессия. Так, в случае ОТ-ПЦР для каждого пациента будет рассчитан параметр DSPCR (формула 2), а в случае микрочиповой гибридизации или РНК секвенирования нового поколения - DSHTGE (формула 3). Альтернативно, в случае микрочиповой гибридизации или РНК секвенирования нового поколения для каждого пациента будет рассчитан параметр DSHTGE (формула 4). На основании рассчитанных коэффициентов делается прогноз клинической эффективности препарата сорафениб для индивидуального пациента с раком почки. В случае, если параметр DS превышает заданный порог, пациент относится к группе ответчиков. В обратном случае, пациент считается неответчиком. Подробное описание выбранных порогов для некоторых коммерческих платформ приведено в примерах к данному патенту.
Гены-мишени сорафениба, а также нормировочные гены, выбранные для подсчета уровней экспрессии в образце карциномы почечной ткани, известны из уровня техники. Ниже приведены данные об их нуклеотидных последовательностях, раскрытых в публичных источниках. Термин «BRAF» или «человеческий BRAF» относится к гену, кодирующему серин- треонин протеинкиназу B-raf (Serine/threonine protein kinase B-raf), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_004333 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 004333), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 1097.
Термин «RAF1 » или «человеческий RAF1 » относится к гену, кодирующему серин- треонин протеинкиназу Raf-1 (Serine/threonine protein kinase Raf-1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002880 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 002880), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 9829.
Термин «FGFR1 » или «человеческий FGFR1» относится к гену, кодирующему рецептор фактора роста фиброблостов 1 (fibroblast growth factor receptor 1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_001174063
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM 001174063), а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3688.
Термин «FLT1» или «человеческий FLT1 » относится к гену, кодирующему тирозин киназу 1 , схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 1), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002019, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3763.
Термин «FLT3» или «человеческий FLT3» относится к гену, кодирующему тирозин киназу 3, схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 3), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_004119, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3765. Термин «FLT4» или «человеческий FLT4» относится к гену, кодирующему тирозин киназу 4, схожую с фактором стимуляции макрофагов (fms related tyrosine kinase 4), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002020, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 3767.
Термин «PDGFRB» или «человеческий PDGFRB» относится к гену, кодирующему рецептор тромбоцитарного фактора роста (platelet derived growth factor receptor beta), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002609, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 8804.
Термин «KIT» или «человеческий KIT» относится к гену, кодирующему тирозинкиназный рецептор протоонкоген KIT (KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_000222, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 6342.
Термин «KDR» или «человеческий KDR» относится к гену, кодирующему киназный рецептор (kinase insert domain receptor), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_002253, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 6307.
Термин «RET» или «человеческий RET» относится к гену, кодирующему протоонкоген ret (ret proto-oncogene), последовательность которого приведена в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером NM_020975, а также к аллельным вариантам этого гена (изоформам), присутствующим в геномах пациентов. Уникальный идентификатор этого гена согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC): 9967.
Возможные нормировочные гены с соответствующими идентификаторами последовательности в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI), а также идентификаторами генов согласно Комитету номенклатуры генов человека Европейского биоинформатического института (HGNC) приведены ниже: АСТВ (NM_001 101 , HGNC: 132), RPL13A (NM_001270491 , HGNC: 10304), RPL9 (NM_000661 , HGNC: 10369), RPS29 (NM_001030001 , HGNC:10419), EN01 (NM_001428, HGNC:3350), EN02 (NM_001975, HGNC:3353), H6PD (NM_004285, HGNC:4795), G6PD (NM_000402, HGNC:4057), KIF1 B (NM_015074, HGNC:16636), KIF1A (NM_138483, HGNC:888), NMNAT1 (NM_001297778, HGNC: 17877), NMNAT2 (NM_015039, HGNC: 16789), NMNAT3 (NM 78177, HGNC:20989), UBE4B (NM_006048, HGNC: 12500), UBE4A (NM_004788, HGNC: 12499), AC01 (NM_002197, HGNC: 117), AC02 (NM_001098, HGNC: 118), IREB2 (NM_004136, HGNC:6115), KLHL9 (NM_018847, HGNC: 18732), KLHL13 (NM_033495, HGNC:22931 ), PANK1 (NM_138316, HGNC:8598), PAN КЗ (NM_024594, HGNC: 19365), KIF20B (NM_016195, HGNC:7212), KIF20A (NM_005733, HGNC:9787), RPL37A (NM_000998, HGNC: 10348), GAPDH (NM_002046, HGNC:4141), RPL13 (NM_000977, HGNC: 10303), HPRT1 (NM_000194, HGNC:5157), B2M (NM_004048, HGNC:914), RPL38 (NM_000999, HGNC: 10349), UBA52 (NM_003333, HGNC:12458), PSMC1 (NM_002802, HGNC:9547), RPL4 (NM_000968, HGNC: 10353), RPL37 (NM_000997, HGNC: 10347), SLC25A3 (NM_005888, HGNC: 10989), CLTC (NM_004859, HGNC:2092), TXNL1 (NM_004786, HGNC: 12436), PSMA1 (NM_002786, HGNC:9530), RPL8 (NM_000973, HGNC: 10368), MMADHC (NM_015702, HGNC:25221), PPP2CA (NM_002715, HGNC:9299), MRFAP1 (NM_033296, HGNC:24549), POLR2C (NM_032940, HGNC:9189), PSMB2 (NM_002794, HGNC:9539), DIABLO
(NM_019887, HGNC:21528), VCP (NM_007126, HGNC: 12666).
Термины «рак» и «карцинома» описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Патология рака включает в себя, например, аномальный или неконтролируемый рост клеток, метастазы, интерференцию нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов на аномальных уровнях, подавление или обострение воспалительного или иммунологического ответа, неоплазию, злокачественность, инвазию в окружающие или отдаленные ткани или органы, такие как лимфатические узлы, кровеносные сосуды и т. д.
Термины «рак почек» или «карцинома почек», используемые в данном описании, относятся к раку, который возникает в эпителиальном слое клеток почечных канальцев. Карцинома почек охватывает несколько относительно распространенных гистологических подтипов: язвенная клеточная карцинома почек, папиллярный (хромофильный) рак почек, карцинома коллекционного протока, медуллярная карцинома и др. (см. Thyavihally Y., et al., Int Semin Surg Oncol 2:18 (2005)). Термины «хороший прогноз» или «положительный клинический результат» означают желаемый клинический результат. Например, в контексте карциномы почек хороший прогноз может быть ожиданием отсутствия локальных рецидивов или метастазов в течение двух, трех, четырех, пяти или более лет после первоначального диагноза карциномы. Клинический результат можно оценить с использованием любого конечного показателя, включая, без ограничения, (1) агрессивность роста опухоли (например, переход на более высокую стадию); (2) метастазы; (3) локальное повторение; (4) увеличение продолжительности жизни после лечения; и / или (5) снижение смертности в определенный момент времени после лечения. Клинический результат может быть рассмотрен в контексте результата индивидуума относительно исхода популяции пациентов, имеющих сопоставимый клинический диагноз, и может быть оценен с использованием различных конечных показателей, таких как увеличение продолжительности интервала рецидива (RFI) , увеличение продолжительности общей выживаемости (ОС) в популяции, увеличение продолжительности безрецидивной выживаемости (DFS), увеличение продолжительности дистанции без повторения рецидива (DRFI) и тому подобное. Пациентом с раком почки, реагирующим на сорафениб, считают пациента, у которого наблюдается положительный клинический результат по одному из вышеуказанных конечных показателей после приема сорафениба. Методики лечения карциномы почек сорафенибом приведены, например, в обзоре Monzon and Heng, 2014 (Crit Rev Clin Lab Sci 51(2): 85-97 (2014)).
Различные технические подходы для определения уровней экспрессии генов изложены могут включать, без ограничения, обратную транскрипционную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР), микрочиповую гибридизацию, высокопроизводительное секвенирование нового поколения, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE). Микрочиповая гибридизация относится к упорядоченному расположению гибридизуемых элементов массива, предпочтительно полинуклеотидных зондов, на подложке. В конкретных аспектах уровень экспрессии каждого гена может быть определен с помощью различных элементов гена, включая экзоны, интроны и белковые продукты. В предпочтительных вариантах экспрессия генов определяется по уровню соответствующих мРНК или KflFIK. Уровни экспрессии генов, идентифицированных в описании, могут быть измерены в опухолевой ткани. Например, опухолевая ткань может быть получена при хирургической резекции опухоли или путем биопсии опухоли. Методики получения образца карциномы почечной ткани от пациента приведены, например (Landolt L. et al., Scand J Clin Lab Invest. Sep;76(5):426-34, 2016). Уровень экспрессии идентифицированных генов также может быть измерен в опухолевых клетках, выделенных из участков, удаленных из опухоли, включая циркулирующие опухолевые клетки или жидкость организма (например, мочу, кровь, фракцию крови и др.). Способы амплификации (например, с помощью ПЦР) нуклеиновых кислот, способы количественной оценки нуклеиновых кислот, общие методы экстракции мРНК из тканей пациентов хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995 and Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.). Экстракция мРНК может быть выполнена с использованием стандартных наборов и реагентов от коммерческих производителей в соответствии с инструкциями производителей.
Количественная ПЦР в реальном времени измеряет накопление продукта ПЦР через двухмеченный флуоресцентный зонд (т. е. зонд TaqMan®). ПЦР в реальном времени совместим как с количественной конкурентной ПЦР, где для нормализации используется внутренний конкурент для каждой целевой последовательности, а также с количественной сравнительной ПЦР с использованием гена нормализации, содержащегося в образце, или эталонного гена для ОТ-ПЦР (более подробно см., например, Dieffenbach, С. W. et al., "General Concepts for PCR Primer Design" in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155).
Чтобы минимизировать вариаций при измерениях экспрессии из-за технических различий в образцах (например, различное количество и качество продукта экспрессии), данные уровня экспрессии, измеренные для продукта гена (например, порог цикла (Ct) полученный с помощью ОТ-ПЦР), могут быть нормированы относительно средних значений уровня экспрессии, полученных для одного или нескольких эталонных генов. В одном из подходов к нормализации небольшое количество генов используется в качестве эталонных генов; гены, выбранные для эталонных генов (housekeeping genes), обычно показывают минимальное количество вариаций экспрессии от образца к образцу как для образцов нормальной ткани, так и для образцов патологической ткани, а уровень экспрессии других генов сравнивают с относительно стабильной экспрессией эталонных генов.
Необработанные данные из ОТ-ПЦР выражаются как порог цикла (Ct) - количество циклов полимеризации, необходимое для того, чтобы детектируемый сигнал превышал определенный порог. Высокое значение Ct указывает на низкую экспрессию, поскольку для обнаружения продукта амплификации требуется больше циклов. Нормализация может быть выполнена таким образом, что одноэтапное увеличение нормализованного уровня экспрессии гена продукта обычно отражает 2-кратное увеличение количества продукта экспрессии, присутствующего в образце (Silva S et al. (2006) ВМС Cancer 6, 200). Затем экспрессия гена может быть стандартизована путем деления нормированной экспрессии гена на стандартное отклонение экспрессии для всех пациентов для этого конкретного гена. Специалистам в области известно множество статистических методов, которые подходят для сравнения уровня экспрессии гена в двух группах и определения статистической значимости обнаруженных различий (Motulsky Н., Intuitive Biostatistics, Oxford University Press, 1995).
Для оценки предсказательной эффективности предложенного в данном описании подхода было проведено ретроспективное клиническое исследование. Набор образцов был получен от пациентов с раком почки, которые получали лечение Сорафенибом в Московской городской онкологической больнице Ns 62. Из 26 пациентов у 12 наблюдался положительный эффект от лечения по системе RECIST (частичный или полный ответ), 14 пациентов относились к группе неответчиков (стабилизация или прогрессирование при приеме сорафениба).
В качестве биоматериала для исследования использовались парафинизированные блоки (FFPE) с образцами патологической ткани индивидуальных больных. Из полученных парафиновых блоков выделялись нуклеиновые кислоты при помощи набора SileksMagNA (пр-во Sileks) на магнитных частицах, в соответствии с инструкциями производителя комплекта. Далее препараты РНК, при помощи фермента ДНКазы BlueSorb (пр-во Sileks), были освобождены от примесей ДНК.
Измерение экспрессии генов в образцах опухолей пациентов проводилось следующими методами:
1) Для всех пациентов: методом гибридизации РНК на микрочипах lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2.
2) Для 6 ответчиков и 7 неответчиков: ОТ-ПЦР.
3) Для 11 неответчиков и 2 ответчиков: при помощи РНК-секвенирования нового поколения на платформе lllumina HiSeq-3000.
Результаты биоинформатического анализа и предсказательные характеристики предложенного бинарного классификатора (ответчики на сорафениб против неответчиков) приведены в примерах к данному патенту. Все нижеприведенные примеры свидетельствуют в пользу того, что предложенный подход позволяет предсказывать эффективность препарата сорафениб при раке почки с высокой достоверностью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения получены нижеследующие результаты.
На основании данных профилирования генной экспрессии в тканях рака почки больных с известным статусом ответа на терапию сорафенибом с помощью микрочипов lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2, платформы секвенирования нового поколения lllumina HiSeq-3000, а также с помощью метода ОТ-ПЦР, указанная в настоящем изобретении тест-система, состоящая из 10 генов (4 целевых и шесть нормировочных), показала способность предсказывать индивидуальный ответ больных раком почки на монотерапию препаратом Сорафенибом с высоким значением площади под ROC-кривой (AUC = 0,76 для платформы lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; AUC = 0,95 для OT- ПЦР; AUC = 0.91 для платформы lllumina HiSeq-3000).
На основании данных профилирования генной экспрессии в тканях рака почки больных с известным статусом ответа на терапию сорафенибом с помощью микрочипов lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 указанная в настоящем изобретении тест-система, состоящая из 15 генов (10 целевых и 5 нормировочных), показала способность предсказывать индивидуальный ответ больных раком почки на монотерапию препаратом сорафениб с высоким значением площади под ROC-кривой (AUC = 0,76 для платформы lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2).
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом микрочиповой гибридизации.
Микрочиповая гибридизация образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на сорафениб была проведена с использованием платформы lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате проведенной микрочиповой гибридизации были получены уровни экспрессии для каждого из 10 генов у 26 пациентов со светлоклеточным раком почки. На основании этих данных были рассчитаны индексы DSHTGE ДЛЯ каждого индивидуального пациента. Было выбрано такое пороговое значение DSHTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода было минимальным, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было бы минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DSHTGE было выбрано равным 12,40 (Таблица 1). Если значение DSHTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше - к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,75 (фиг. 2).
Таблица 1. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DSHTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки. Параметр DSHTGE был рассчитан по данным микрочиповой гибридизации на платформе lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно формуле 2. Оптимальный порог DSHTGE выделен серым цветом.
Figure imgf000020_0001
Пример 2. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом ОТ-ПЦР.
Была разработана ОТ-ПЦР-панель для измерения уровня экспрессии четырех целевых и шести нормировочных генов в образцах рака почки. Праймеры, необходимые для детекции генов приведены в таблице 2. Параметры реакции ПЦР приведены ниже: ПЦР смесь (объемом 25 мкл):
Буфер (HS-qPCRmix-HS SYBR, пр-во ЗАО Евроген) - 5 мкл; Праймеры по 1 мкл (по 0,4 мкМ);
РНК - 1 - 3 мкл (2-6 нг на реакцию);
MMLV-RT (пр-во ЗАО Евроген) - 2 мкл;
Н20 - 13-15 мкл.
Программа для прохождения ПЦР:
95DC - 5 мин.
95 П С - 30 сек.
60DC - 30 сек.
72 DC - 30 сек.
Для ОТ-ПЦР был использован ПЦР амплификатор CFX Touch Real-Time PCR Detection System (пр-во BioRad).
Таблица 2. Последовательности пар праймеров для измерения уровня экспрессии 10 генов, необходимых для расчета параметра DSPCR.
Figure imgf000021_0001
В результате проведенной ОТ-ПЦР были получены показатели значений ACt для каждого целевого гена у всех 13 пациентов. На основании этих данных были рассчитаны индексы DSPCR для каждого индивидуального пациента (формула 1 ). Было выбрано такое пороговое значение DSPCR, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальна, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DSPCR было выбрано равным -23,05 (Таблица 3). Если значение DSPCR больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше - к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,95 (фиг. 3).
Таблица 3. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DSPCR, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки. Параметр DSPCR был рассчитан по данным ОТ-ПЦР. Оптимальный порог DSPCR выделен серым цветом.
Figure imgf000022_0001
Пример 3. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом РНК- секвенирования нового поколения.
РНК секвенирование нового поколения образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на Сорафениб было проведено с использованием платформы lllumina HiSeq-3000 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате были получены файлы в формате FASTQ, содержащие сырые прочтения для каждого образца. Данные прочтения были картированы на эталонный геном (геном человека, сборка GRCh38.89 от сервиса Ensembl, http://www.ensembl.org) при помощи алгоритма STAR [Dobin A, et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013 Jan 1 ;29(1): 15-21]. В результате для каждого пациента были получены файлы, в которых содержится информация о количестве уникально картированных прочтений на гены человека. Образец считали подходящим для дальнейшего исследования в случае, если находилось более 3500000 уникально картированных прочтений на гены человека. Все 13 образцов прошли данный контроль качества. Для дальнейшего анализа были использована информация по 10 генам: 4 целевым и 6 нормировочным. На основании этих данных были рассчитаны индексы DSHTGE ДЛЯ каждого индивидуального пациента: двух ответчиков и 11 неответчиков. Для этого была использована формула 2. Было выбрано такое пороговое значение DSHTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальной, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DSHTGE было выбрано равным 15,15 (Таблица 4) Если значение DSHTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше - к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,91 (фиг. 4). Таблица 4. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DSHTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки. Параметр DSHTGE был рассчитан по данным РНК-секвенирования нового поколения. Оптимальный порог DSHTGE выделен серым цветом.
Figure imgf000023_0001
Пример 4. Разделение ответчиков от неответчиков на препарат сорафениб при раке почки с использованием данных генной экспрессии, полученных методом микрочиповой гибридизации.
Микрочиповая гибридизация образцов пациентов с раком почки и известным статусом ответа на сорафениб была проведена с использованием платформы lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно протоколу, рекомендованному производителем. В результате проведенной микрочиповой гибридизации были получены уровни экспрессии для каждого из 10 генов у 26 пациентов со светлоклеточным раком почки. На основании этих данных были рассчитаны индексы DSHTGE ДЛЯ каждого индивидуального пациента согласно формуле (4), т.е. все гены-мишени Сорафениба учитывались при расчете с равными коэффициентами, и был использован альтернативный набор нормировочных генов. Было выбрано такое пороговое значение DSHTGE, при котором сумма ошибок первого и второго рода была минимальной, при условии, что ошибки первого рода (ложноположительные результаты) имеют втрое больший вес, чем ошибки второго рода (ложноотрицательные результаты). Другими словами, был выбран такой порог, при котором значение следующей суммы было бы минимальным: 3 * доля ложноположительных результатов (FPR) + доля ложноотрицательных результатов (FNR). Исходя из этого пороговое значение DSHTGE было выбрано равным 13,14 (Таблица 5). Если значение DSHTGE больше данного порога, то пациент относится к группе ответчиков. Если меньше - к группе неответчиков. Площадь под ROC-кривой для данного бинарного классификатора составила 0,76 (фиг. 5).
Таблица 5. Параметры работы бинарного классификатора, основанного на параметре DSHTGE, разделяющего ответчиков от неответчиков на препарат Сорафениб при раке почки. Параметр DSHTGE был рассчитан по данным микрочиповой гибридизации на платформе lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 согласно формуле 4. Оптимальный порог DSHTGE равен 13,14 (выделен серым цветом).
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения карциномы почек у пациента, включающий введение сорафениба данному пациенту в том случае, когда данный пациент был определен, как реагирующий на сорафениб при помощи способа, который включает следующие стадии:
(а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее четырех из десяти генов-мишеней сорафениба: BRAF , RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, PDGFRB, KIT, KDR, RET, а также уровни экспрессии по меньшей мере двух нормировочных генов, выбранных из списка ( АСТВ , RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, АС01, АС02, АСОЗ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, В2М, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, РРР2СА, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции;
(б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов;
(в) определяют пациента как реагирующего на сорафениб, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.
2. Способ по п.1 , в котором пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.
3. Способ по п.1 , в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК lllumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * \og (RAF1) + 2 * 1одю (FGFR1) + 1одю(Я-77) + 1одю (FLT3) - 1одю (НК), где НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 15,15.
4. Способ по п.1 , в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1 , FGFR1 , FLT1 , FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * logm (RAF1) + 2 * \ogw(FGFR1) + log™ (FLT1) + logi 0(FLT3) - \од-ю(НК), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 12,4.
5. Способ по п.1 , в котором измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * АС \RAFI + 2 * I^CXFGFRI + ACt^r* + ACtH.r3, при этом ACt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.
6. Способ по п.1 , в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле 1одю (RAF1) + logi 0(FGFR1) + 1одю (FLT1) + log 10(FL73) + 1одю (BRAF) + log10( /7) + \og (KDR) + logi0(PDGFR6) + \ogw(RET) +
1одю (FLT4) - 1одю (НК), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02 и пороговое значение равно 13,14.
7. Способ определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения карциномы почек у пациента, включающий следующие стадии:
(а) измеряют в образце карциномы почечной ткани, полученном от указанного пациента, уровни экспрессии не менее четырех генов из списка генов-мишеней сорафениба: RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR, а также уровни экспрессии по меньшей мере двух нормировочных генов, выбранных из списка (АСТВ, RPL13A, RPL9, RPS29, EN01, EN02, H6PD, G6PD, KIF1B, KIF1A, NMNAT1, NMNAT2, NMNAT3, UBE4B, UBE4A, АС01, АС02, АСОЗ, KLHL9, KLHL13, PANK1, PANK3, KIF20B, KIF20A, RPL37A, GAPDH, RPL13, HPRT1, В2М, RPL38, UBA52, PSMC1, RPL4, RPL37, SLC25A3, CLTC, TXNL1, PSMA1, RPL8, MMADHC, РРР2СА, MRFAP1, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP), при этом измерение уровней экспрессии производят при помощи одного из следующих приборов: прибор для секвенирования тотальной РНК, микрочип или прибор для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции;
(б) рассчитывают значение комбинации уровней экспрессии выбранной в (а) группы генов-мишеней сорафениба и нормировочных генов, и сравнивают это значение с пороговым значением, определенным для данного используемого прибора и выбранной комбинации генов;
(в) определяют сорафениб как клинически эффективное средство для лечения карциномы почек у пациента, когда значение комбинации уровней экспрессии генов превосходит указанное пороговое значение.
8. Способ по п.7, в котором пороговое значение определяют, рассчитывая долю ложноположительных результатов и долю ложноотрицательных результатов определения эффективности сорафениба у пациентов с известным статусом ответа на сорафениб и минимизируя значение следующей суммы: 3 * доля ложноположительных результатов + доля ложноотрицательных результатов.
9. Способ по п.7, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи прибора для секвенирования тотальной РНК lllumina HiSeq-3000; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * \og-\0(RAF1) + 2 * 1одю (FGFR1) + \og-\0(FLT1) + log w(FLT3) - log-ю (НК), где НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 15,15.
10. Способ по п.7, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * \ogw(RAF1) + 2 * \ogw(FGFR1) + \og (FLT1) + \ogw(FLT3) - \ogw(HK), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP ; и пороговое значение равно 12,4.
11. Способ по п.7, в котором измерение уровней экспрессии указанных генов производят при помощи прибора для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции; в качестве нормировочных генов выбирают АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3 и нормировочных генов рассчитывают по формуле 3 * ACt RAFI + 2 * ACt FGFRI + ACt FLTI + ACt FLT3, при этом ACt является разницей среднего геометрического значения порогового цикла амплификации кДНК нормировочных генов АСТВ, GAPDH, POLR2C, PSMB2, DIABLO, VCP и значения порогового цикла амплификации кДНК анализируемого гена; и пороговое значение равно -23.05.
12. Способ по п.7, в котором измерение уровней экспрессии генов производят при помощи микрочипа lllumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2; в качестве нормировочных генов выбирают KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02; а значение комбинации уровней экспрессии генов RAF1, FGFR1, FLT1, FLT3, FLT4, BRAF, PDGFRB, KIT, RET, KDR и нормировочных генов рассчитывают по формуле 1одю {RAF1) + log-ю (FGFR1) + 1одю (FLT1) + 1одю(Я_ГЗ) + log W{BRAF) + log«>( /7) + logio( DR) + log w{PDGFRB) + \ogw(RET) + 1одю(Я.Т4) - 1одю (НК), при этом НК является средним геометрическим уровня экспрессии нормировочных генов KLHL9, NMNAT3, NMNAT1, KIF1A, АС02 и пороговое значение равно 13,14.
PCT/RU2018/000703 2018-10-24 2018-10-24 Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки WO2020085936A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019132020A RU2747746C2 (ru) 2018-10-24 2018-10-24 Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки
PCT/RU2018/000703 WO2020085936A1 (ru) 2018-10-24 2018-10-24 Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000703 WO2020085936A1 (ru) 2018-10-24 2018-10-24 Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020085936A1 true WO2020085936A1 (ru) 2020-04-30

Family

ID=70331166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000703 WO2020085936A1 (ru) 2018-10-24 2018-10-24 Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2747746C2 (ru)
WO (1) WO2020085936A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015031604A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Crown Bioscience, Inc. Gene expression signatures predictive of subject response to a multi-kinase inhibitor and methods of using the same
WO2016056673A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Algorithms for gene signature-based predictor of sensitivity to mdm2 inhibitors
WO2016097285A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Centre Léon-Bérard Genomic classifier that predicts response to multi-kinase inhibitor treatment introduction
US20160224738A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Pathway Pharmaceuticals Ltd System, Method and Software for Predicting Drug Efficacy in a Patient

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX341866B (es) * 2010-01-11 2016-09-06 Genomic Health Inc Metodo para usar expresion genica para determinar la probabilidad de un desenlace clinico de cancer renal.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015031604A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Crown Bioscience, Inc. Gene expression signatures predictive of subject response to a multi-kinase inhibitor and methods of using the same
WO2016056673A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Algorithms for gene signature-based predictor of sensitivity to mdm2 inhibitors
WO2016097285A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Centre Léon-Bérard Genomic classifier that predicts response to multi-kinase inhibitor treatment introduction
US20160224738A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Pathway Pharmaceuticals Ltd System, Method and Software for Predicting Drug Efficacy in a Patient

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REBOUQAS E.L. ET AL.: "Real Time PCR and Importance of Housekeepings Genes for Normalization and Quantification of mRNA Expression in Different Tissues", BRAZILIAN ARCHIVES OF BIOLOGY AND TECHNOLOGY, vol. 56, no. 1, February 2013 (2013-02-01), pages 143 - 154, XP055708870 *
SOROKIN M. ET AL.: "Acquired resistance to tyrosine kinase inhibitors may be linked with the decreased sensitivity to X-ray irradiation", ONCOTARGET, vol. 9, no. 4, 2018, pages 5111 - 5124, XP055708871 *
SUNTSOVA M.V. ET AL.: "NEXAPROOF: Vosmigennaya ekspressionnaya «podpis» predskazyvaet otvet na sorafenib u patsientov s rakom pochki", MOLEKULYARNAYA DIAGNOSTIKA, vol. 1, 2017, pages 134 - 135 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019132020A3 (ru) 2021-04-12
RU2747746C2 (ru) 2021-05-13
RU2019132020A (ru) 2021-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Newell et al. Multiomic profiling of checkpoint inhibitor-treated melanoma: Identifying predictors of response and resistance, and markers of biological discordance
JP7186700B2 (ja) 腫瘍抑制ｆｏｘｏ活性を酸化ストレスから区別する方法
Tembe et al. MicroRNA and mRNA expression profiling in metastatic melanoma reveal associations with BRAF mutation and patient prognosis
EP2326734B1 (en) Pathways underlying pancreatic tumorigenesis and an hereditary pancreatic cancer gene
JP6704861B2 (ja) 癌処置のための個別化三剤治療を選択するための方法
US11851716B2 (en) Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
JP2021019631A (ja) チェックポイント不全およびそれに関する方法
US9410205B2 (en) Methods for predicting survival in metastatic melanoma patients
EP3881323A1 (en) Methods and systems for somatic mutations and uses thereof
WO2015049377A1 (en) Method for determining the prognosis of pancreatic cancer
CN111778337A (zh) 结直肠癌预后风险分数的计算方法、其试剂及其装置
JP6784673B2 (ja) 膵臓がんに冒された患者の生存予後を判断する方法
EP3655553B1 (en) Methods for detection of plasma cell dyscrasia
BR112020012280A2 (pt) composições e métodos para diagnosticar cânceres de pulmão usando perfis de expressão de gene
RU2747746C2 (ru) Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки
CA3212786A1 (en) Methods for assessing proliferation and anti-folate therapeutic response
WO2014130617A1 (en) Method of predicting breast cancer prognosis
JP7313374B2 (ja) Ｔｍｐｒｓｓ２－ｅｒｇ融合状態により選択された、ｐｄｅ４ｄ変異発現、及び術後の臨床変数に基づく、術後リスクの層別化
US20160304961A1 (en) Method for predicting the response to chemotherapy treatment in patients suffering from colorectal cancer
US20210102260A1 (en) Patient classification and prognositic method
JP2020524524A (ja) 黒色腫の検出方法
WO2011152884A2 (en) 14 gene signature distinguishes between multiple myeloma subtypes
EP4308927A1 (en) Methods and materials for identifying myeloma stage and drug sensitivity and treating myeloma
García-Carbonero et al. Method for predicting the response to chemotherapy treatment in patients suffering from colorectal cancer
WO2024023860A1 (en) Method for predicting the development of resistance to braf inhibiting drugs, alone or in combination with mek inhibiting drugs, in an anti-tumour treatment

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18938039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18938039

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1