WO2020085534A1 - Sod3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Sod3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors

Definitions

  • composition for prevention or treatment of atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing ⁇ 3 as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient.
  • S0D3 super oxide di smutase 3
  • Atopic dermatitis is a chronic inflammatory skin disease accompanied by severe itching. Atopic dermatitis is known to occur due to a combination of genetic allergies, various environmental factors, and immune system abnormalities, but the specific mechanism of its development is not yet fully understood. When atopic dermatitis develops, the amount of ceramide in the stratum corneum layer decreases, and thus the skin becomes difficult to maintain sufficient moisture, resulting in drying and itching of the skin. When the skin becomes dry and damaged, various allergens (antibacterial) or bacteria easily pass through the skin and cause an inflammatory reaction.
  • moisturizers and steroids are mainly used. Although 91.9% of parents use moisturizers to relieve symptoms of atopic dermatitis in children, only 20,000 of them are satisfied with the moisturizers in use, and the main reason for dissatisfaction is that there is no effect or only temporary relief of symptoms. It has been investigated.
  • Steroids for example, adrenal cortical hormones, etc. deplete lymphocytes and monocytes in the spleen, lymph nodes and bone marrow, reducing the amount of these cells reach the inflammatory site or immunizing macrophages, neutrophils and antigenic antibodies. By interfering, the inflammatory response is suppressed.
  • atopic dermatitis is a chronic skin disease, steroid drugs There is a problem that various side effects appear due to long-term and high-dose use.
  • a swollen cheek like a squirrel or a squirrel a face with a rounded face shape (3 ⁇ 4011 6), a phenomenon in which the back of the neck is bent like a bison (buffalo hump_ hump), a sharp increase in appetite
  • a swollen cheek like a squirrel or a squirrel
  • a face with a rounded face shape 3 ⁇ 4011 6
  • buffalo hump_ hump a phenomenon in which the back of the neck is bent like a bison
  • a sharp increase in appetite Due to obesity, the redistribution of fat also redistributes the arms and legs, while the swelling of the face and belly causes the phenomenon to become round as it is today.
  • skin atrophy, vasodilation, discoloration, purpura, etc. weakening the skin, capillaries can be exposed due to the weakened skin, bruising easily, and psychological changes such as nervousness, irritation, depression, and insomnia. Also.
  • the resistance is generated and used, the effect is lowered, and by using it at a high dose, the susceptibility to infection increases, resulting in an unusually difficult infection.
  • it worsens diabetes, cataracts, and high blood pressure, increases the levels of cholesterol and triglycerides in the blood, inhibits growth in children, and decreases in adulthood when taken for 6 months or more.
  • Various types of Cushing's syndrome ((: disease manifestation and support such as bone, muscle, skin, etc. (31 1) 01'1: 113 ⁇ 4) tissue side effects may occur, and abnormalities in defense against hypertension and major infections may occur .
  • mesenchymal stem cells are cells having a multipotential ability to be separated from tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, fat, and muscle, and various studies on the function of MSC have been conducted.
  • Bone marrow is the most representative tissue of origin for obtaining mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells present in the bone marrow are limited in their application range due to limited differentiation and proliferative capacity, and due to limitations originating from the bone marrow, several stages of treatment are required, and the procedure is complicated, and the procedure is complicated. It is common to have temporal, mental and physical pain.
  • umbilical cord blood is known as a rich source of hematopoietic stem cells
  • many attempts have been made to treat various diseases clinically using umbilical cord blood, and frozen umbilical cord blood for autograft treatment can be used after many years.
  • Umbilical cord blood banks which are preserved as they are, are also being activated in Korea.
  • Umbilical cord blood unlike bone marrow, can be obtained through a simple procedure in the cord (11111 ⁇ 1 ⁇ ) discarded during delivery, and contains a number of hematopoietic stem cells and stem cells compared to the amount.
  • the graft-versus-host reaction that may occur during umbilical cord blood transplantation is considerably less than that of bone marrow transplantation, and research has been conducted worldwide to confirm the properties of stem cells contained in umbilical cord blood and to expand their application to clinical practice.
  • SOD super oxide di smutase
  • Mn-S0D S0D 2
  • EC-SOD extracel lular superoxide di smutase
  • EC-S0D protein S0D3 (super oxide di smutase 3, extracel lular) is secreted outside the cell
  • amino acid sequence of human normal (wi ld-type, WT) S0D3 protein is NP_003093.2 of NCBI Genbank database. It is known as the accession number.
  • the nucleotide sequence of mRNA encoding human S0D3 protein is known as an accession number such as ⁇ _003102.2.
  • the present inventors established a suitable cell source for S0D3 overexpression, identified a suitable promoter and infection multiplicity (mul t ipl ici ty of infect ion, M0I), and then used it to over-express the mast cell of cord blood-derived stem cells.
  • the present invention was completed by confirming the effect of suppressing degranulation.
  • the object of the present invention is superoxide dismutase 3 (super oxide) It is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing di smutase 3, S0D3) as an active ingredient.
  • the object of the present invention is a superoxide dismutase.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis composed of umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing 3 (superoxide dismutase 3, S0D3). It is also an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis consisting essentially of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing super oxide di smutase 3 (S0D3).
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis, comprising as an active ingredient stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide dismutase 3 (S0D3). It is also an object of the present invention to provide a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis consisting of umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing superoxide di smutase 3 (S0D3). It is also an object of the present invention to provide a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis consisting essentially of umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing superoxide di smutase 3 (S0D3).
  • Another object of the present invention is to provide the use of umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) for preparing an atopy treatment preparation.
  • S0D3 super oxide di smutase 3
  • Another object of the present invention is to administer an effective amount of a composition comprising umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient to an individual in need thereof. It is to provide a method for treating atopic disease.
  • S0D3 super oxide di smutase 3
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient do.
  • the present invention superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis composed of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S ⁇ 3).
  • the present invention superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • compositions for preventing or treating atopic dermatitis consisting essentially of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S0D3).
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis comprising cord blood-derived stem cells overexpressing superoxide dismutase 3 (S0D3) as an active ingredient.
  • S0D3 superoxide dismutase 3
  • the present invention superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis composed of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S0D3).
  • the present invention superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis consisting essentially of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S0D3).
  • the present invention is a superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • the present invention requires an effective amount of a composition comprising umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing superoxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient
  • a composition comprising umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing superoxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient
  • S0D3 superoxide di smutase 3
  • MSC Mesenchymal stem cells belonging to adult stem cells include bone, cartilage (cart i lage), fat tissue (fat ti ssue), tendons (tendon), and nerve tissue (nerve ti ssue). ), Fibroblasts (f ibroblast) and muscle cells (muscle cel l) refers to the multipotent progenitor cells (mul t ipotent progenitor) before differentiation into cells of specific organs. Unlike cells, there is no ethical problem and there is no risk of developing parasites, so it has been evaluated as a key cell in the future. Through various studies, bone marrow stem cells (cel l) have differentiated into muscle cells or hepatocytes.
  • adipose-derived stem cells derived from various tissues of the body such as brain, bone marrow, peripheral blood, blood vessels, and muscles are expected to have similar effects and abilities.
  • the two cells were similar overall, but adipose-derived stem cells expressed CD29, CD44, CD90, and CD105 more, and HLA-DR and c-ki t were not expressed, and thus, It has been shown that there is some difference, and it has been reported that adipose-derived stem cells may be more advantageous for maintaining differentiation ability (see Cel l Physiol Biochem 2004; 14: 311-324).
  • Stem cells derived from umbilical cord blood are mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord blood contained in the umbilical cord connecting the mother and the fetus, and have excellent proliferative ability among adult stem cells.
  • the results of the previous studies of the present inventors showed that 1751 cells of 1.5 acid 0 5 By 366 ⁇ , 1.5-2 acid 0 6 cells can be obtained after about 7 days (e.g., about 1.2 omega 4 cells obtained per 2 ).
  • stem cells derived from umbilical cord blood 3 0 5 cells are compared to 366 to 100ä non-north After about 3 days, 2-3x10 ® cells could be obtained (about 4.5 to 4 cells per 2 cells). In addition, it took about 3 days for umbilical cord blood-derived stem cells, compared to the initial number of 36 roots ⁇ ! 3 ⁇ 4 cells, which required 10 times the number of cells. Therefore, in the case of stem cells derived from umbilical cord blood in a culture vessel of the same area, there is an advantage in that the number of cells 3 to 4 times higher than that of bone marrow-derived stem cells can be secured at a faster rate. In addition, the ability of cells to proliferate can affect the introduction of viral vectors. Considering that, there is a possibility that umbilical cord blood-derived stem cells have a higher efficiency of introducing viral vectors than bone marrow-derived stem cells.
  • the inventors of the present invention over-expressed ⁇ 03 of bone marrow-derived stem cells and umbilical cord blood-derived stem cells, respectively, and evaluated and compared their potential as an atopic treatment.
  • a cell source suitable for overexpression of S0D3 in bone marrow or umbilical cord blood was analyzed.
  • Bone marrow or cord blood-derived stem cells labeled with green fluorescent protein (GFP) and infected with viruses for S0D3 transformation by concentration, and stem cells derived from cord blood for the purpose of overexpressing key factors through lentivirus was confirmed to be more suitable than bone marrow-derived stem cells (see Example 1, Figure 1).
  • GFP green fluorescent protein
  • the effect of the umbilical cord-derived stem cells and bone marrow-derived stem cells overexpressing ⁇ 3 was confirmed by the lentivirus on the effect of mast cell degranulation.
  • the bone marrow-derived stem cells promoted degranulation rather (see Example 3 and FIG. 4).
  • the 5003 overexpressing cord blood-derived stem cells of the present invention are It can be seen that it shows an excellent inhibitory effect on degranulation of mast cells. Particularly, the bone marrow-derived degranulation tended to have a different effect according to stem cell origin as described above.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient.
  • the present invention superoxide dismutase 3 (superoxide dismutase 3,
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis composed of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S0D3).
  • the present invention superoxide dismutase 3 (super oxide di smutase 3,
  • compositions for preventing or treating atopic dermatitis consisting essentially of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing S0D3).
  • the stem cells of the present invention are umbilical cord blood-derived stem cells that overexpress S0D3, the S0D3 can be expressed as a protein, and the S0D3 protein catalyzes a di smutat ion reaction and is secreted outside the cell It is present in the extracellular matrix (extracel lul ar matr ix) and exhibits anti-angiogenic, anti-chemotactic, anti-cancer activity. Specifically, it has an effective effect in treating diseases such as skin cancer, pigmentation disease, and photoaging, and is known to be effective in preventing and treating diseases caused by angiogenesis.
  • diseases such as skin cancer, pigmentation disease, and photoaging
  • colorectal cancer lung cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, villi cancer, ovarian cancer, breast cancer, thyroid cancer, brain cancer, head and neck cancer, malignant cancer It is known to have a beneficial effect on cancer diseases such as melanoma and lymphoma.
  • S0D3 refers to proteins derived from humans and mammals, including humans, preferably humans, and most preferably the amino acid sequence of human normal S0D3 protein represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. It may be included. Or it may be to include the amino acid sequence of the recombinant S0D3 protein (209E-SOD3) represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the human normal S0D3 is a signal peptide up to the 18th alanine, including the starting methionine amino acid at the N-terminal site, and activated S0D3 is composed of 222 amino acids from which the signal peptide is removed.
  • the C-terminal region of S0D3 (amino acid residues 210 'and 215) has a heparin binding domain.
  • the amino acid sequence of the full length human S0D3 consisting of 240 amino acids including the signal peptide is as shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • S0D3 is a 209 amino acid in which 13 amino acids (amino acid residues 210 to 222) are removed, which contain a signal peptide at the N-terminal region and a heparin binding domain at the C-terminal region of human S0D3 of full length. It may be made of.
  • the signal peptide and the heparin binding domain-removed S0D3 protein may be referred to as 209E- S0D3 or 209E in the present invention, and may preferably have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the 209E-SOD3 can also bind to the anti-S0D3 antibody, and has been confirmed to have the same enzyme activity and R0S removal activity as the normal S0D3 (Korean Patent Publication No. 10-2008-0108876).
  • S0D3 includes all functional equivalents (funct ional equivalent), functional derivatives (funct ional der ivat ive) and fragments of the S0D3 protein, which have substantially equivalent physiological activity to the normal S0D3 or 209E-S0D3 protein.
  • Substantially equivalent physiological activity means having the same level of enzyme activity and / or extracellular secretion properties and intracellular permeability as that of normal S0D3, and overexpression in stem cells, preferably mesenchymal stem cells, due to the enzyme activity equivalent to S0D3 When it is done, it improves the immune and inflammation control ability of stem cells.
  • the stem cell's immune and inflammatory control ability specifically refers to suppressing degranulation of mast cells, a key factor in the pathogenesis of atopic dermatitis, and stem cells derived from umbilical cord blood that overexpress S0D3 of the present invention described herein. It is as described in the properties.
  • the functional equivalent of ⁇ 3 is preferably at least 70%, preferably 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, more It may preferably be a polypeptide having at least 90% sequence homology.
  • the functional equivalent may be generated as a result of addition, substitution, or deletion of some of the amino acid sequences of S0D3 of the present invention.
  • the substitution of amino acids in the above is preferably a conservative substitution.
  • the functional equivalent includes a variant in which a part of the amino acid is deleted on the amino acid sequence of S0D3 of the present invention.
  • the deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region not directly related to the physiological activity of the S0D3 protein.
  • a variant in which several amino acids are added to both ends or sequences of the amino acid sequence of S0D3 is also included.
  • it may be a peptide in which a portion of the entire length of S0D3 is removed without affecting the enzyme activity of S0D3, such as 209E-SOD3, and SNP (smal 1 nucleot ide polymorphi sm) having a physiological activity substantially equivalent to the S0D3 protein.
  • SNP smal 1 nucleot ide polymorphi sm
  • It may also be a polymorphi sm protein of S0D3.
  • polypeptide derivatives in which some chemical structures of proteins have been modified while maintaining the basic framework and physiological activity of the S0D3 protein of the present invention.
  • structural modifications to change the stability, intracellular permeability, storage, volatile or solubility of the S0D3 protein of the present invention are included therein.
  • the stem cord stem derived from umbilical cord blood of the present invention may be derived from a saw oil, and may preferably be derived from a human.
  • Mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood or placenta have superior differentiation and proliferative properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • umbilical cord blood used in the present invention refers to blood collected from umbilical vein connecting the placenta and fetus of a mammal.
  • the umbilical cord blood can be easily collected from the donor's umbilical vein during childbirth. More specifically, in the case of normal vaginal delivery, the placenta still remained in the womb after childbirth, and then it was exposed outside. Can be collected from umbilical vein. Alternatively, in the case of a cesarean section, the placenta after birth is also taken from the umbilical vein in the state of being exposed outside the womb.
  • stem cells collected from the placenta may be described as a term "placental stem cells,” which are stem cells or precursors derived from mammalian placenta regardless of shape, cell surface labeling, or number of passages after primary culture.
  • a cell it refers to attachment to a tissue culture substrate, such as tissue culture plastic or fibronectin coated tissue culture plate, but the term “placental stem cell” used herein refers to a trophoblast. no.
  • Cells are at least one of the characteristics of stem cells. For example, it is a stem cell if it has the ability to differentiate into at least one cell type.
  • Mesenchymal stem cells can be isolated from placental or umbilical cord blood according to methods known in the art.
  • the mesenchymal stem cells can be separated by any conventionally known separation method. Examples include density gradient fractionation, immunological selection, and differential adhesion separation.
  • the method of separating and culturing mesenchymal stem cells from umbilical cord blood can be used for all of the methods previously used.
  • Cultivation of the mesenchymal stem cells isolated from the above can be performed in a cell culture medium known in the art, for example, but not limited to, DMEM medium, McCoys 5A medium, Eagle's basal medium, CMRL medium, Glasgow's minimum essential medium, Ham's F-12 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium, Liebovitz 'L-15 medium, RPMI 1640 medium and KSB-3 basal media.
  • auxiliary components may be added to the cell culture medium as necessary.
  • serum such as fetal bovine serum, horse or human, and antibiotics and antifungal agents for preventing contamination of microorganisms may be used. .
  • the isolated or cultured stem cells can be stored by methods known in the art until use.
  • stem cells are cryoprotected (001> 1 * sub6 ⁇ 10] 1) and frozen Can be stored.
  • the freeze protection treatment is known in the art ⁇ ⁇ , glycerol, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, albumin, dextran, sucrose, ethylene glycol, ⁇ erythritol, I)-ribitol, 1> mannitol, I) -Solbitol, Inositol, I)-Can be performed using a cryoprotectant such as lactose or choline chloride.
  • the umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing ⁇ 03 according to the present invention may be obtained by transducing a stem cell with a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding.
  • stem cells over-expressing S0D3 are specifically stem cells having an increased expression level of S0D3 protein, thereby increasing the activity of S0D3 protein.
  • nucleic acids are deoxyribonucleotides in the form of single- or double-strands or ribonucleotides (four o'clock.
  • known natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides. Included are analogues.
  • the most common way to overexpress S0D3 in stem cells is to artificially or experimentally introduce polynucleotides containing the S0D3 gene into stem cells to increase the copy number of the S0D3 gene.
  • Injecting an exogenous polynucleotide that is not possessed by the original cell into the cell is called transfection, and a phenomenon in which the genetic trait of the cell is changed is called transformation.
  • the process in which the exogenous polynucleotide is injected into a cell through a virus or a virus-derived vector is called transduction ion.
  • transformation As used herein, the terms transformation, 'transfection' and 'transfection' refer to an exogenous polynucleotide introduced into a cell to have a genetic trait different from that of a normal type or to refer to such a process. It has a similar meaning.
  • the polynucleotide encoding S0D3 may be a S0D3 gene derived from a mammal.
  • it may include a nucleotide sequence encoding human normal S0D3 represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • it may include a nucleotide sequence encoding 209E-SOD3 represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • S0D3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • S0D3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 Can be.
  • S0D3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • S0D3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be encoded by following the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 have.
  • polynucleotide encoding the S0D3 also includes a sequence showing substantial identity to the base sequence of human S0D3, preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8. Substantial identity aligns the nucleotide sequence of human polynucleotide encoding human S0D3 with any other nucleotide sequence to be compared as much as possible, and compares and analyzes the sequence using analysis methods and algorithms commonly used in the art. In the case, it means a sequence showing at least 70% homology.
  • the protein encoded by the base sequence substantially identical to the base sequence of the polynucleotide encoding S0D3 may be a functional equivalent of the S0D3 protein, preferably a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. .
  • the functional equivalent of the S0D3 protein is as previously described herein.
  • ⁇ recombinant expression vector '' is a vector capable of expressing a target protein or target nucleic acid (in a suitable host cell), and a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a polynucleotide (gene) insert is expressed. Sacrifice. Operably connected (Ae ⁇ 1 111 ⁇ 2 (1) '
  • the promoter and the protein or the nucleic acid sequence encoding the show must be operably linked to the nucleic acid sequence to be encoded. It may affect expression.
  • Operational linkage with a recombinant vector can be made using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific cleavage and linkage uses enzymes, etc., generally known in the art.
  • the recombinant expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a vector commonly used in the cloning field, and examples thereof include, but are not limited to, plasmid vector, cosmid vector, bacteriophage vector and virus vector.
  • vectors derived from viruses can be used.
  • the plasmid contains E. coli Bacillus subtil De Myo 1) 13, YEm and dae ⁇ 50), etc.
  • the virus may be used, such as lentivirus, retrovirus, animal virus such as adenovirus or vaccinia virus, insect virus such as baculo virus, etc.
  • a lentivirus may be preferably used.
  • Expression vectors containing nucleic acids according to the present invention are methods known in the art, for example, but not limited to, transient transfection (transient transfect ion), micro injection, transduction (transduct ion), cell fusion, calcium Phosphate precipitation method, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-medi ated transfect ion, polybrene-medi ated transfect ion, It can be introduced into stem cells by an electroporat ion, a gene gun, and a known method for introducing nucleic acids into cells.
  • Stem cells overexpressing ⁇ are transformed by injecting a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding ⁇ into mesenchymal stem cells, preferably using an electroporation method or a virus-mediated transduction method. It may have been done.
  • the stem cells of the present invention can be prepared using the recombinant virus vector through the following steps: ( a ) Shuttle vector, DNA construct encoding a S0D3 and / or protein transduction domain operably linked to a DNA construct.
  • Preparing a recombinant viral vector comprising; (b) transfecting the recombinant virus vector into a virus-producing cell line to produce a S0D3 expressing recombinant virus; And (c) infecting stem cells derived from umbilical cord blood with the S0D3 expressing recombinant virus.
  • the viral vector of the present invention is characterized in that it is selected from the group consisting of lentiviral vector, retroviral vector, adenovirus vector, adeno-associated virus ( ⁇ ⁇ vector, bexinaa virus vector, herpesvirus vector and abipoxvirus vector).
  • lentiviral vector adenovirus vector
  • adeno-associated virus ⁇ ⁇ vector, bexinaa virus vector, herpesvirus vector and abipoxvirus vector.
  • the viral vector, that is, the recombinant expression vector used in the present invention preferably includes a 0 ⁇ promoter or a mark promoter . It is preferred to include a promoter.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain ⁇ overexpressed cord blood-derived stem cells alone or may be formulated in a suitable form with a pharmaceutically acceptable carrier, and may additionally contain excipients or diluents.
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction or similar reaction, such as gastrointestinal disorder, dizziness, etc., when administered to humans.
  • a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration may be included.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like. In addition, it may contain various drug delivery materials used for oral administration to the peptide preparation.
  • the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, etc., and may further include a stabilizer and a preservative. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl guaraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention in addition to the above components Lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspension agents and the like may be further included.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be referenced as described in the following literature (Remington's Pharmaceut i cal Sciences, 19th ed., Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995).
  • composition of the present invention can be administered in any way to mammals, including humans.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • the parenteral administration method is not limited to this, but intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or intrarectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as a formulation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • the composition of the present invention may be formulated using a method known in the art as a powder, granule, tablet, pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, suspension, etc. Can be.
  • tablets or dragees can be obtained by mixing the active ingredient with a solid excipient, then crushing it and adding a suitable adjuvant to the granule mixture.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, starches including cellulose starch, rice starch and potato starch, cellulose, etc. Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone and the like may be included, including methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose. In addition, if necessary, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a preservative.
  • an anti-coagulant e.g., a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a preservative.
  • injection, cream, lotion, external ointment, oil, moisturizer, gel, aerosol, and nasal inhaler may be formulated by methods known in the art. These formulations are described in Remington's Pharmaceut i cal Science, 19th ed., Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995, a prescription generally known to all pharmaceutical chemistries.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to a patient in a single dose, and can be administered by a fract ionated treatment protocol that is administered for a long time in multiple doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the degree of disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 // g to 10,000 mg per kilogram of patient body weight per day, most preferably 0.1 to 500 mg per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, the administration route and the number of treatments, as well as the patient's age, weight, health status, sex, disease severity, diet and excretion rate, etc.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, route of administration and method of administration as long as it shows the effects of the present invention.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis comprising stem cells derived from umbilical cord blood overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis composed of umbilical cord blood-derived stem cells over-expressing super oxide di smutase 3 (S0D3).
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis consisting essentially of cord blood-derived stem cells overexpressing super oxide di smutase 3 (mut ID3).
  • the cosmetic composition of the present invention contains S0D3 overexpressing umbilical cord blood-derived stem cells as an active ingredient and a basic cosmetic composition with a dermatologically acceptable excipient (face wash, cream, essence, cleansing foam and cleansing water-like cleansing agent, pack, and vodioyl) , Hue cosmetic composition (foundation, lipstick, mascara, makeup base), hair product composition (shampoo, conditioner, hair conditioner, hair gel) and soap.
  • a dermatologically acceptable excipient face wash, cream, essence, cleansing foam and cleansing water-like cleansing agent, pack, and vodioyl
  • Hue cosmetic composition foundation, lipstick, mascara, makeup base
  • hair product composition shampoo, conditioner, hair conditioner, hair gel
  • soap soap.
  • the excipient is not limited to this, for example, may include skin emollients, skin penetration enhancers, colorants, fragrances, emulsifiers, thickeners and solvents.
  • fragrances, pigments, disinfectants, antioxidants, preservatives and moisturizers may be additionally included, and may include thickeners, inorganic salts, synthetic polymer materials, etc. for the purpose of improving physical properties.
  • the S0D3 overexpressing umbilical cord blood-derived stem cells can be easily added to the conventional cleanser and soap base.
  • the S0D3 overexpressing cord blood-derived stem cells can be easily added to the conventional cleanser and soap base.
  • a cream it can be prepared by adding S0D3 overexpressing cord blood-derived stem cells to a general oil-in-water type (0 / W) cream base. Synthetic or natural materials such as proteins, minerals, vitamins, etc.
  • the content of S0D3 overexpressing cord blood-derived stem cells contained in the cosmetic composition of the present invention is not limited thereto, but is preferably 0.001 to 10% by weight, more preferably 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the total composition. If the content is less than 0.001% by weight, a desired atopic dermatitis treatment effect cannot be expected, and if it is more than 10% by weight, there may be safety or difficulty in formulation.
  • the present invention provides the use of umbilical cord blood-derived stem cells overexpressing super oxide di smutase 3 (S0D3) for preparing an atopy treatment preparation.
  • S0D3 super oxide di smutase 3
  • the present invention is a superoxide dismutase 3 (super oxide dismutase 3, S0D3) overexpression of cord blood-derived stem cells containing an effective amount of a composition comprising as an active ingredient an atopy disease treatment characterized in that administered to an individual in need thereof Provide a method.
  • superoxide dismutase 3 super oxide dismutase 3, S0D3
  • the "effective amount" of the present invention when administered to an individual, refers to an amount of an atopic dermatitis disease improvement, treatment, prevention, detection, diagnosis, or an amount that exhibits an inhibitory or reduction effect of atopic dermatitis disease, wherein the 'object' is an animal, Preferably, it may be an animal including a mammal, particularly a human, or may be cells, tissues, organs, etc. derived from an animal. The individual may be a patient who needs the effect).
  • the 'treatment' of the present invention collectively refers to improving the symptoms of atopic dermatitis disease or atopic dermatitis disease, which may include healing, substantially preventing, or improving the condition of atopic dermatitis disease, It includes, but is not limited to, alleviating, healing or preventing one symptom or most symptoms resulting from atopic dermatitis disease.
  • the term 'compr i sing' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'as a feature', and in the composition or method, excludes additional component elements or method steps, etc. I never do that.
  • the term (consi st ing of) ” means excluding additional elements, steps or components, which are not described separately.
  • the term 'essential ial ly consi st ing of' includes, in the scope of a composition or method, a component element or step described, as well as a component element or step that does not substantially affect its basic properties, etc.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cells derived from overexpressed umbilical cord blood as an active ingredient, and a method for treating atopic dermatitis using the same. Since the composition according to the present invention shows an effect of suppressing degranulation of mast cells, which is a key etiology of atopic dermatitis, it can be usefully used for the prevention or treatment of atopic dermatitis.
  • FIG. 1 is for establishing a cell source suitable for ⁇ overexpression, and after infection with each concentration by using lentivirus in each of bone marrow-derived stem cells and cord blood-derived stem cells, the infection multiplicity 01) is confirmed, It is the result of comparison.
  • Figure 2 is for selecting a promoter with good expression efficiency, a result of comparing and comparing the seed ratio promoter and the promoter.
  • 3 is for selecting a promoter having good expression efficiency, and is a result of analyzing a virus vector copy number (VCN) that quantifies the level of EFla promoter and CMV promoter virus introduction into cells.
  • VCN virus vector copy number
  • hUCB-MSC Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood were collected from blood samples of human umbilical cord with the consent of the donor. Umbilical cord blood samples were collected and stored in blood collection packs containing citrate phosphate glucose, which acts as an anticoagulant. Treatment for the experiment was carried out within 24 hours. Mononuclear cell fractions were isolated by centrifugation under a Ficol 1-Paque PLUS concentration gradient (Amersham Biosciences).
  • Antibiotic / antifungal agent of HBSSUei l Biotech Servi ces hypoglycemic Dulbecco's modified Eagle culture (DMEM, Invitrogen Corp), 20% fetal calf serum (Gibco-BRL), 2 mM L-glutamine, ImM sodium pyruvate and W ( Li fe Technologies).
  • Antibiotic / antifungal agents include lOOU / ml penicillin, lOO ii g / ml streptomycin, 25 u / amphotericin B. After 7 days, unattached cells were removed, and the attached cells were cultured by changing the two cultures every week. Cells were cultured in 5% C02, 37 ° C wet conditions.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells The bone marrow recovered for cultivation is essence Leukocytosis was separated using hypaque (specific gravity 1.077), washed twice with phosphate buf fered sal ine (PBS), and cultured in 100 mm culture di sh (Nunc) at a concentration of 1X 10 7 cel lsAli sh.
  • DMEM-Low glucose (GibcoBRL) and 10% fetal calf serum (Gibco-BRL) were used as the culture medium.
  • Positive markers include CD90 (Thy-l), CD105 (endogl in) and SH3 (CD73), and hematopoietic lineage markers include endothelial cell markers such as CD34, CD45 and CD31.
  • Cells were positive for HLA class I, but negative for HLA-DR.
  • Each fluorescently labeled monoclonal antibody was purchased from Beet on Di ckinson (results not shown).
  • S0D3 Transformation S0D3 was transformed by electroporation on hUCB-MSC and bone marrow-derived stem cells prepared through the above.
  • the viral expression vector and transduction conditions for S0D3 transduction were that lentivirus was used as a viral expression vector, as well as for the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases including stem cells overexpressing S0D3, which is a prior art, as an active ingredient. It was performed in the same way as the patent (refer to the experimental method of Korean Patent Publication No. 10-2017-0032872).
  • Flow cytometry was analyzed by the concentration of GFP-tagged lentiviruses in bone marrow-derived MSC and cord blood-derived MSC by concentration and f low cytometry.
  • Expression efficiency comparison In order to select a viral promoter having good expression efficiency, S0D3 was mounted on two lentiviral promoters that are typically used to evaluate expression efficiency. Expression efficiency was evaluated after S0D3 was mounted on each of the lentiviral promoter, the EFla promoter and the CMV promoter. Protein was extracted from each promoter loaded with S0D3, and then separated on a 12% SDS-PAGE gel. This was transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories Inc.), and the membrane was blocked with 5% skim milk powder, and then reacted with primary and secondary antibodies diluted 1: 1000, respectively.
  • the viral vector copy number (VCN) which can be quantified and quantified, was analyzed by real-time PCR using the Lenti-X Provirus Quantitation Kit (Qiagen).
  • VCN viral vector copy number
  • 1 genomic DNA of 1X10 6 cells 72 hours elapsed was extracted using the genomic DNA isolation kit included in the product and quantified.
  • the lenti-X provirus (standard) included in the kit is diluted five-fold stepwise to reduce the number of provirus copies from 1 ⁇ ⁇ 10 5 to 2X10 4 , 4X10 3 , 8X10 2 , Two 1.6X10 and 32 were prepared.
  • the sample genomic DNA concentration previously quantified is diluted to 100ng / 2ul, 20ng / 2ul, 4ng / 2ul, and 0.8ng / 2ul.
  • the final diluted standard and the sample were added in 2 ul each, and mixed with a specific primer lul included in the kit, 10 ⁇ l of the cyberin reagent, and 7 ul of DEPC to perform a realtime PCR reaction (performance condition: 95-60 ° 40 cycle reaction).
  • performance condition: 95-60 ° 40 cycle reaction performance condition: 95-60 ° 40 cycle reaction.
  • Example 1 Establishment of S0D3 overexpressing suitable cell source
  • 0.2M Glycine pH10.7 (Sigma)
  • the degree of expression of GFP after infection with lentivirus tagged with GFP in each stem cell by concentration was analyzed through M () I.
  • MSC from umbilical cord blood showed more than 95% GFP expression from 2M0I, but bone marrow-derived MSC showed less than 60% GFP expression efficiency even at 10M0I. Therefore, it was confirmed that MSC derived from umbilical cord blood is more suitable than bone marrow-derived MSC for the purpose of overexpressing key factors through lentivirus.
  • Example 2 Selecting a promoter with excellent expression efficiency A promoter with higher efficiency was selected by comparing the S0D3 expression efficiency of the commonly used EFla promoter and CMV promoter.
  • the vi rus vector copy number (VCN) which can be recognized by quantifying the degree of virus introduction into cells, was analyzed by real-time PCR. As a result, as shown in Figure 2 and 3, CMV than the EFla promoter It was confirmed that the promoter showed better expression efficiency in the same 1) 1.
  • the higher the value of 3 ⁇ 4101 the higher the value of (: has the value of 0 ⁇ promoter, and the more the virus enters the cell than the seed promoter virus. Therefore, it is appropriate to prevent cell damage caused by virus introduction.
  • the value was set to 3 ⁇ 41, which does not exceed 10, and the condition was set to 5 ⁇ ) 1 meeting this criterion and efficacy evaluation was conducted.
  • Example 3 Confirmation of the effect on mast cells during S0D3 overexpression stem cell treatment
  • FIG. 4 As a result of measuring the degree of degranulation inhibition, it was confirmed that the bone marrow-derived MSC promotes degranulation, while the effect of umbilical cord blood-derived MSC overexpressing S0D3 with 5M0I overexpressing S0D3 is the best.
  • the ⁇ overexpressing cord blood-derived stem cells of the present invention show an effect of suppressing degranulation of mast cells, and thus can be usefully used for the prevention or treatment of atopic dermatitis.

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Abstract

본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3, SOD3)를 과발현시킨 제대혈 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 아토피 피부염 병인의 핵심 인자인 비만세포의 탈과립화를 억제하는 효과를 아토피 피부염 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
3（犯3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
【기술분야】 본·발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3（ super oxide di smutase 3 , S0D3）를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】 아토피성 피부염은 심한 가려움증을 수반하는 만성 염증성 피부 질환이다. 아토피성 피부염은 유전적 알레르기 성향， 다양한 환경 요인, 면역체계 이상 등이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있으나， 아직 구체적인 발병 메커니즘이 완전히 밝혀져 있지는 않다. 아토피성 피부염이 발병하면 피부 각질층의 세라마이드 양이 적어지고， 따라서 피부가 수분을 충분히 유지하기 힘들어져 결국 피부가 건조해지고 가려워진다. 피부가 건조해지고 손상되면, 각종 알러지 유발물질（ 대해）이나 균이 쉽게 피부를 통과해 염증반응 등을 일으키게 된다.
아토피상 피부염 치료를 위해 사용되는 약물로는 보습제와 스테로이드제가 주로 사용되고 있다. 어린이 아토피성 피부염의 증상완화를 위해 보습제를 사용하는 부모가 91.9%에 달하고 있으나， 이 가운데 2 만이 사용 중인 보습제에 만족하고 있는 실정이며, 불만족스러운 가장 큰 이유는 효과가 없거나 일시적인 증상 완화에 그치기 때문인 것으로 조사된 바 있다.
스테로이드제（예를 들어， 부신피질 호르몬제 등）는 비장, 림프노드 및 골수에 있는 림프구, 단핵구를 고갈시켜 이들 세포들이 염증부위에 이르는 양을 줄이거나 대식세포와 중성구 및 항원항체의 면역작용을 방해함으로써, 염증반응을 억제한다. 그러나, 아토피성 피부염은 만성 피부 질환이기 때문에, 스테로이드제의 장기간 및 고용량 사용으로 인하여 다양한 부작용이 나타나는 문제가 있다. 예를 들어， 외형적인 변화로서 붓거나 얼룩다람쥐같이 늘어지는 양볼, 얼굴형이 둥글게 변하는월상안（¾011 6）, 들소의 등처럼 뒷목부분이 굽어지는 현상（버팔로 험프_ 혹）, 식욕의 급격한증가로 인한 비만등이 나타나며， 또한지방 분포를 재분배하여 팔과 다리는 가늘어지는 한편， 얼굴과 배는 부어 오늘 듯 둥글게 커지는 현상을 일으킨다. 그리고 피부위축， 혈관확장, 탈색, 자반 등이 있고， 피부를 약화시키고, 약화된 피부로 인해 모세혈관이 드러날 수 있으며 쉽게 멍이 들기도 하고 심리적변화로는 신경과민, 초조, 우울증, 불면증이 나타나기도 한다. 또한， 내성이 생겨 사용할수록 효과가 떨어지게 되며, 고용량으로사용하게 됨으로써 감염에 대한 감수성이 증가하여 흔히 보기 힘든 별난 감염을 일으키게 된다. 예를 들어， 당뇨， 백내장， 고혈압을 악화시키고， 혈액내 콜레스테롤과중성지방의 수치를 증가시키며， 어린이에 있어서는 성장을 억제하고 6개월 이상 복용 시 어른이 되었을 때의 키가 줄어들기도 한다. 여러 형태의 쿠싱증후군（（: 질환의 발현 및 뼈, 근육 맟 피부과 같은 지지（31 1）01'1：11¾）조직의 부작용이 일어날 수 있으며 고혈압과 주요 감염에 대한 방어작용에 이상이 올 수 있다. 또한， 고관절， 견관절， 슬관절， 기타 다른 관절에서 뼈의 무혈관성 괴사를 일으킬 수 있으며， 위장관으로부터 칼슘의 흡수를 억제함으로써 뼈를 약화시켜 부러지기 쉽게 하고， 골다공증을 일으키기도 한다.
한편, 중간엽 줄기세포（mesenchymal stem cel ls , MSC）는 골수， 제대혈， 지방, 근육 등의 조직으로부터 분리될 수 있는 다분화능을 가진 세포로서， MSC의 기능에 관하여 다양한 연구가진행되고 있다. 현재 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수 （bone marrow）를 들 수 있다. 그러나， 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고， 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적， 정신적 및 육체적 고통을수반하는 것이 보통이다.
최근에는 제대혈에 많은 양의 줄기세포가 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 제대혈이 조혈모세포의 풍부한 원천으로 알려진 이후, 임상적으로 제대혈을 이용하여 다양한 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며， 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후사용가능한 상태로보존하는 제대혈은행이 국내에서도활성화되고 있다. 제대혈은 골수와는 달리 분만과정에서 버려지는 제대 (11111^ 1比 이 )에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며， 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 특히 제대혈 이식시 나타날 수 있는 이식편대 숙주반응이 골수이식에 비해 상당히 적어 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 성상 확인 및 그의 임상에의 응용 확대를위한 연구가 전세계적으로 이루어지고 있다.
활성산소를 제거할 뿐만 아니라 다른 항산화 효소가 작용할 수 있도록 하여 세포를 보호하는 기능을 가지는 SOD (super oxide di smutase)는 구리와 아연 원자를 가지고 있는 Cu/Zn S0D(S0D 1)， 망간 원자를 가지고 있는 Mn-S0D(S0D 2) 및 세포 표면 또는 세포 외액에 존재하는 EC-SOD(extracel lular superoxide di smutase)로 구분된다. 그 중 EC-S0D 단백질인 S0D3( super oxide di smutase 3, extracel lular)는 세포 외부로 분비되며 인간의 정상형 (wi ld-type, WT) S0D3 단백질의 아미노산 서열은 NCBI Genbank database의 NP_003093.2 등의 accession number로 공지되어 있다. 또한 인간의 S0D3 단백질을 암호화하는 mRNA의 염기서열은 ■_003102.2 등의 accession number로공지되어 있다.
상기와 같이 제대혈 줄기세포에 대한 많은 연구가 수행되고 있지만 S0D3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 아토피 차료효과에 대해서는보고된 바 없다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
이에, 본 발명자들은 S0D3 과발현에 있어서 적합한 세포 원천을 확립하고 적합한프로모터와 감염다중도 (mul t ipl ici ty of infect ion, M0I )를 파악한후， 이를 이용하여 를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 비만 세포 탈과립 억제 효과를 확인하여 본발명을완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 .유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제. 3(superoxide dismutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)룰 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3( super oxide dismutase 3， S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3( super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 아토피 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로포함하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3,
S孤 3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용화장료조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을특징으로 하는 아토피 질환의 치료 방법을 제공한다. 이하본 발명을상세히 설명한다.
성체 줄기세포에 속하는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC)"는 뼈 (bone) , 연골 (cart i lage) , 지방조직 ( fat t i ssue) , 힘줄 (건)， 신경조직 (nerve t i ssue) , 섬유아세포 (f ibroblast ) 및 근육세포 (muscle cel l ) 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 다분화 전구 세포 (mul t ipotent progeni tor)를 말한다. 상기 MSC는 다분화능을 가지고 있으면서도， 배아줄기세포와는 달리 윤리적인 문제가 없고 기생종 발생의 위험이 없다는 점에서 향후 주력 세포로 평가받고 있다. 현재까지 다양한 연구를 통해 골수줄기세포 (bone marrow stem cel l )가근육 세포나 간세포로 분화하거나， 지방 조직으로 분화함이 보고되며 뇌， 골수， 말초혈액 , 혈관， 근육 등 신체의 다양한 조직 유래 줄기세포가 비슷한 효과와 능력을 가질 것이라 예상되고 있다. 하지만 골수유래줄기세포와 지방유래 줄기세포의 표현형의 비교연구에서 두 세포가 전반적으로 유사하지만 지방유래 줄기세포는 CD29, CD44, CD90, CD105가 더 표현되며 HLA-DR과 c-ki t은 표현되지 않아 골수유래 줄기세포와다소 차이가 있음을 보였으며， 분화능력의 유지에 지방유래 줄기세포가 더 유리할 수 있다고 보고된 바 있다 (Cel l Physiol Biochem 2004； 14： 311-324참고) .
제대혈 유래 줄기세포는 모체와 태아를 연결하는 탯줄 내에 함유된 제대혈로부터 분리한 중간엽 줄기세포로 성체줄기세포 중에서 뛰어난 증식능을 보유하고 있다. 본 발명자들의 선행 연구 결과 세포 유래별로 확립된 최적의 배양액과 배양법을 이용하여 세포를 증식시켰을 때 골수 유래 줄기세포의 경우 1.5산05 세포를 1751
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366^ 하여 약 7일 후 1.5-2산06 세포를 수득할 수 있는 반면 (예2 당 약 1.2난04세포수득) 제대혈 유래 줄기세포의 경우 3 05세포를 100ä 비北에 366비 하여 약 3일 후 2-3x10® 세포를 수득할 수 있었다 (에2 당 약 4.5난04 세포 수득) . 또한 초기 36근^!¾한 세포 수 대비 10배의 세포수를 확보하기 위해 골수 유래 줄기세포가 약 7일이 소요됨에 비해 제대혈 유래 줄기세포는 약 3일이 소요되었다. 따라서 동일면적의 배양용기에서 제대혈 유래 줄기세포의 경우 골수 유래 줄기세포 대비 3~4배 이상의 세포수를 더 빠른 속도로 확보할 수 있다는 장점이 있다. 또한 바이러스 벡터의 도입에 세포의 증식 능력이 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려할 때， 제대혈 유래 줄기세포가 골수 유래 줄기세포 등에 비해 바이러스 벡터 도입 효율이 높을가능성이 있다.
본 발명의 발명자들은 이러한 점에 기반하여， 골수 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포를 각각 엤03를 과발현시키고 이의 아토피 치료제로의 가능성에 대하여 평가하고 비교하였다.
이를 위하여 먼저, 골수 또는 제대혈 중 S0D3 과발현에 적합한 세포 원천을 분석하였다. 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포에 녹색형광단백질（Green f luorescent protein, GFP）로 표지한， S0D3 형질전환을 위한 바이러스를농도별로 감염시킨 결과， 렌티바이러스를 통한 핵심인자 과발현을 위한 목적으로 제대혈 유래 줄기세포가 골수유래 줄기세포보다더 적합한 것을 확인하였다（실시예 1， 도 1 참조）.
또한 많이 사용되는 두 가지 렌티바이러스성 프로모터犯 比 프로모터 또는 프로모터）에 엤 3를 탑재한 뒤 발현 효율을 평가한 결과,
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프로모터의 발현 효율이 더 우수하며, 세포 내로 바이러스가 더 많이 유입되는 것을 확인하였다（실시예 2, 도 2 및 도 3참조）.
상기에서 확인한 바를 기반으로， 렌티바이러스를 통해 （犯3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포와 골수 유래 줄기세포의 비만세포 탈과립에 대한 영향을 확인해 본 결과， 제대혈 유래 줄기세포는우수한 비만세포 탈과립 억제 효과를 보인 반면， 골수유래 줄기세포는 오히려 탈과립을 촉진하는 양상을 확인하였다（실시예 3, 도 4참조）. 알레르기 항원에 피부가 노출되면 랑게르한스 세포의 표면에 있는 수용체에 항원 특이
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결합하고， 이 항원의 표면에 있는 I 세포에 전달되어 I 세포가 활성화 된다. 이 경우 정상과 달리 알레르기성 피부질환， 특히， 아토피 피부염에서는 1¾2가 활성화되어， 比-4， 比-5, 比-6, 比-8， 比-10， 比-13 등의 사이토카인이 분비되고， 그 결과 8 세포에서 묘의 생성이 촉진되고， 활성화된 비만세포의 탈과립을촉진시켜 염증성 사이토카인과 히스타민이 유리된다. 실시예 3에 따르면 본 발명의 5003 과발현 제대혈 유래 줄기세포는 상기 비만세포의 탈과립에 있어서 우수한 억제 효과를 보이는 것을 확인할수 있다. 특히 골수 유래 오히려 탈과립을 족진하는 양상을 보이는 바, 상기에서 기재한 바와같이 줄기세포 기원별 다른 효과를 가짐을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 ,
S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 줄기세포는 S0D3를 과발현하는 제대혈 유래 줄기세포로, 상기 S0D3는 단백질로 발현될 수 있고， 상기 S0D3 단백질은 음이온의 부동 변화 (di smutat ion) 반응을 촉매하고， 세포 외부로 분비되어 세포외 기질 (extracel lul ar matr ix)에 존재하며, 항혈관신생, 항화학주성， 항암활성 등의 효과를 나타낸다. 구체적으로는 피부암， 색소 침착성 질환， 광노화 등의 질환을 치료하는데 유효한 효과를 가지고 있으며， 혈관 신생에 의한 질병의 예방 및 치료에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한， 대장암, 폐암, 간암, 위암， 식도암， 췌장암， 담낭암, 신장암， 방광암， 전립선암, 고환암， 자궁경부암， 자궁내막암， 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암， 뇌암， 두경부암, 악성흑색종， 림프종등의 암 질환에도유효한효과를가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 S0D3는 인간 및 마우수를 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 단백질을 의미하며， 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 인간의 정상형 S0D3 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 재조합 S0D3 단백질 (209E-SOD3)의 아미노산서열을포함하는 것일 수 있다. 상기 인간의 정상형 S0D3는 N-말단 부위의 개시 메치오닌 아미노산을 포함하여 18번째의 알라닌까지는 시그날 펩타이드로 되어 있으며， 활성화된 S0D3는 상기 시그날 펩타이드가 제거된 222개의 아미노산으로 구성된다. S0D3의 C-말단 영역 (아미노산 잔기 210번'· 215번)에는 헤파린 결합 도메인 (hepar in binding domain)을 가지고 있다. 시그널 펩타이드를 포함하는 240개의 아미노산으로 이루어진 전체 길이의 인간 S0D3의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 표시된 바와같다.
또한본 발명에서의 S0D3는 전체 길이의 인간 S0D3 중 N-말단부위의 시그날 펩티드 및 C-말단 부위의 헤파린 결합 도메인이 포함된 13개의 아미노산 (아미노산 잔기 210번〜 222번)이 제거된 209개의 아미노산으로 이루어진 것일 수도 있다. 상기 시그널 펩타이드와 헤파린 결합 도메인이 제거된 S0D3 단백질은 본 발명에서 209E- S0D3 또는 209E로 지칭할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 209E-SOD3는 항- S0D3 항체와도 결합할 수 있으며， 정상형 S0D3와 동일한 효소 활성 및 R0S 제거 활성을 갖는 것으로 확인된 바 있다 (대한민국공개특허 제 10-2008-0108876호) .
본 발명에서의 S0D3는 정상형 S0D3 또는 209E-S0D3 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 기능적 동등물 ( funct ional equivalent ) , 기능적 유도체 ( funct ional der ivat ive) 및 상기 S0D3 단백질의 단편이 모두 포함된다. 실질적으로 동등한 생리 활성이란 정상형 S0D3와 동등한 수준의 효소 활성 및/또는 세포외 분비 특성과 세포내 투과성을 갖는 것을 의미하며， S0D3와 동등한 효소 활성으로 인하여 줄기세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포에서 과발현되었을 때 줄기세포의 면역 및 염증 조절능력을 향상시키게 된다. 상기 줄기세포의 면역 및 염증 조절능력이란 구체적으로는 아토피성 피부염 병인의 핵심인자인 비만세포의 탈과립을 억제하는 것을 의미하며, 본 명세서에서 서술한 본 발명의 S0D3를 과발현하는 제대혈 유래 줄기세포가갖는 특성에서 기재한바와같다.
상기 孤3의 기능적 동등물은 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (homo logy)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물은 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열 중 일부가 부가， 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산 (Gly， Ala, Pro) , 소수성 아미노산 ( l ie, Leu, Val ) , 방향족 아미노산 (Phe, Tyr , Trp) , 산성 아미노산 (Asp, Glu) , 염기성 아미노산 (Hi s , Lys , Arg, Gin, Asn) 및 황 함유 아미노산 (Cys , Met ) . 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 S0D3의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 S0D3 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 S0D3의 아미노산 서열의 양 말단또는서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 예를 들어 209E-SOD3과 같이 S0D3의 효소 활성에는 영향을 주지 않으면서 S0D3 전체 길이의 일부분이 제거된 펩티드일 수 있으며， S0D3 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 SNP(smal 1 nucleot ide polymorphi sm) 등 S0D3의 다형성 (polymorphi sm) 단백질일 수도 있다.
본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명의 S0D3 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어， 여기 한정되는 것은 아니지만， 본 발명의 S0D3 단백질의 안정성, 세포내 투과성， 저장성， 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한구조 변경아 이에 포함된다.
본 발명의 제대혈 유래 줄기세쏘는 쏘유류에서 유래한 것일 수 있으며 바람직하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다. 제대혈 또는 태반 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포보다 분화 능력 및 증식 능력이 뛰어난 특징을지닌다.
본 발명에서 사용된 용어 제대혈은 포유동물의 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 말한다. 상기 제대혈은 출산시 공여자의 제대정맥으로부터 용이하게 채취할 수 있다. 보다 구체적으로， 정상질삭분만의 경우에는 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있다. 또는 제왕절개의 경우에는 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.
본 명세서에서， 태반에서 채취된 줄기세포는 "태반 줄기세포’’라는 용어로 기재될 수 있고， 이는 형상, 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포로서 조직 배양 기질 (tissue culture substrate), 예를 들어 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴 피복 조직 배양판에 부착하는 것을 말한다. 그러나본 명세서에서 "태반줄기세포’'라는 용어는 영양막 세포 (trophoblast)를 가리키는 것은 아니다. 세포는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나, .예를 들어 적어도 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력 등을 갖추고 있으면 줄기세포이다.
태반 또는 제대혈로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 어떤 분리방법에 의해서도 분리될 수 있다. 예를 들면, 밀도차를 이용한 분리법 (density gradient fractionation) , 면역선택 (immunose lection) 및 감별 부착 분리법 (differential adhesion separation) 등이 있다. 제대혈으로부터 중간엽 줄기세포를 분리， 배양하는방법은 기존에 사용되어 온 방법은모두사용할수 있다.
상기에서 분리된 중간엽 줄기세포의 배양은 당업계에 공지된 세포 배양용 배지에서 수행할 수 있으며， 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나， DMEM 배지， McCoys 5A 배지, Eagle's basal 배지， CMRL 배지， Glasgow 최소 필수 배지， Ham's F-12 배지, Iscove’s modified Dulbecco's 배지, Liebovitz ' L-15 배지， RPMI 1640 배지 KSB-3 basal media등이 있다. 또한， 본 발명에서 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조 성분을 첨가할 수 있는데, 우태아혈청， 말 또는 인간 등의 혈청을 비롯하여， 미생물의 오염을 막기 위한항생제 및 항진균제 등을사용할 수 있다.
분리 또는 배양된 줄기세포는 사용 전까지 당업계에 공지된 방법에 의해 보관될 수 있다. 일반적으로 줄기세포는 동결보호 (001>1*아6<九10]1) 처리한 후 냉동 보관할 수 있다. 상기 동결보호 처리는 당업계에 공지된 溫엤, 글리세롤， 폴리비닐피롤리돈， 폴리에틸렌 글리콜， 알부민， 덱스트란， 수크로스, 에틸렌 글리콜， 卜에리스리톨， I) -리비톨， 1＞만니톨 , I) -솔비톨, 卜이노시톨， I) -락토스 또는 콜린 클로라이드와 같은 동결보호제를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 옜03를 과발현하는 제대혈 유래 줄기세포는 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 줄기세포에 형질도입시켜 수득한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 ’’발현 (expression) "은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하며， “과발현 (over express ion) "은 정상적인 상태 또는 일반적인 상태보다 특정 유전자의 발현의 수준이 과도하게 증가한 것을 의미한다. 본 발명에서 S0D3를 과발현하는 줄기세포는 구체적으로는 S0D3 단백질의 발현 수준이 증가하여 S0D3 단백질의 활성이 증가되어 있는 줄기세포이다.
본
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또는 핵산은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 ) 또는 리보뉴클레오티드 (四시를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
줄기세포에서 S0D3를 과발현시키는 가장 일반적인 방법은 S0D3 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 줄기세포에 인위적으로 또는 실험적으로 도입하여 S0D3 유전자의 복제개수 (copy number)를 증가시키는 것이다. 원래의 세포가 가지고 있던 것이 아닌 외인성 (exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내부로 주입하는 것을 형질감염 (transfect ion) , 그리고 이로 인하여 세포의 유전적 형질이 변화되는 현상을 형질전환 (transformat ion)이라고 한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터를 통하여 세포 내부로 주입되는 과정을 형질도입 (transduct ion)이라고 부른다. 본 명세서에서는 용어 형질전환’ , ‘형질감염’ 그리고 ‘형질도입’ 이 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입되어 정상형과 다른 유전적 형질을 갖게 된 것 또는 그러한 과정을 일컫는 것으로서 유사한의미로사용된다.
본 발명에서 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 포유류에서 유래한 S0D3 유전자일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 인간의 정상형 S0D3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 209E-SOD3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있고， 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있다. 또한 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는 서열번호 7로 표시되는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 S0D3는서열번호 8로표시되는 염기서열에 와하여 코딩될 수 있다.
또한 상기 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간의 S0D3의 염기서열， 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 표시되는 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 인간 S0D3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 비교 대상이 되는 임의의 다른 염기서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당해 기술분야에서 통상적으로 이용되는 분석 방법과 알고리즘을 이용하여 서열을 비교 분석하는 경우， 최소 70% 이상의 상동성을 나타내는서열을 의미한다. 상기 S0D3를 암호화하는폴리뉴클레오티드의 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열에 의해 암호화되는 단백질은 S0D3 단백질， 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 기능적 동등물일 수 있다. S0D3 단백질의 기능적 동등물에 대하여서는 본 명세서에서 앞서 서술한바와같다.
본 명세서에서 ’’재조합 발현 벡터’’란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산（ 을 발현할 수 있는 벡터로서， 폴리뉴클레오티드（유전자） 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 작동가능하게 연결된（애 油 1 11½（1）’|이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 쇼를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결（ 111（： 01131 此크용 되어 있는 것을 말한다. 즉， 단백질 또는 쇼를 코딩하는 핵산 서열이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 연결된 것을 의미하는 것으로, 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 쇼를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할수 있으며， 부위-특이적 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소등을사용한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가특별히 제한되지 않으며， 그 예로는플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터， 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을포함하나 이에 체한되지 않는다. 바람직하게는 바이러스에서 유래한 벡터를 사용할 수 있다 . 상기 플라스미드에는 대장균 바실러스 서브틸
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드 묘1)13, YEm 및 代切50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 렌티 바이러스， 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스， 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 렌티 바이러스를사용할수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfect ion) , 미세주사， 형질도입 (transduct ion) , 세포융합， 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 ( l iposomeuediated transfect ion) , DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- medi ated transfect ion) , 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-medi ated transfect ion) , 전기천공법 (electroporat ion) , 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을유입시키기 위한공지의 방법에 의해 줄기세포 내로도입할수 있다.
본 발명에 따른 此를 과발현하는 줄기세포는 엤 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 바람직하게는 전기천공법 또는 바이러스로 매개되는 형질도입 방법을 이용하여 중간엽 줄기세포에 주입하여 형질전환한 것일 수 있다. 또한본 발명의 줄기세포는 재조합 바이러스 벡터를 이용하여 다음의 단계를 거쳐 제조될 수 있다: (a) 셔틀벡터, S0D3를 암호화하는 핵산 및/또는 단백질 형질도입 도메인이 작동가능하게 연결된 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 S0D3 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 S0D3발현 재조합바이러스로 제대혈 유래 줄기세포를 감염시키는 단계.
본 발명의 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 , 레트로바이러스 벡터， 아데노바이러스 벡터， 아데노연관바이러스 (ᆻ刀 벡터 , 벡시나아바이러스 벡터， 허피스바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 또한 상기 바이러스 벡터， 즉 본 발명에서 사용되는 재조합 발현 벡터는 0^ 프로모터 또는 표 크 프로모터를 포함하는 것이 .바람직하며,
Figure imgf000017_0001
프로모터를 포함하는 것이 보다바람직하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 엤 과발현 제대혈 유래 줄기세포를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있으며， 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애， 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다 .
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를幸가로포함할수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분， 셀룰로스 유도체， 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러， 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다 . 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드 , 메틸-또는 프로필 과라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제 , 감미제， 향미제 , 유화제 , 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다 . 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington’s Pharmaceut i cal Sciences , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995) .
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내, 경막내, 심장내 , 경피 , 피하, 복강내， 비강내， 장관， 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 보다바람직하게는피하에 주입되는 것이나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는비경구투여용 제제로 제형화할수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말， 과립， 정제， 환제, 당의정제, 캡슐제， 액제， 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어， 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈, 수크로즈， 솔비톨, 만니톨， 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈， 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피롤리돈 등과 같은충전제가포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은항응집제， 윤활제, 습윤제， 향료, 유화제 및 방부제 등을추가로포함할수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제， 외용연고제， 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington’s Pharmaceut i cal Science, 19th ed. , Mack Publ i shing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (mult iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 ( fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 lkg 당 약 0.01//g 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1能 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법， 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태， 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한유효투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는한그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한， 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방또는 개선용화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 구성되는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, 就 ID3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포로 필수적으로 구성되는 아토피 피부염 예방또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물을 제조하기 위한 S0D3 과발현 제대혈 유래 줄기세포에 대하여서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 화장료조성물은 S0D3 과발현 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품조성물 (화장수， 크림, 에센스， 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제， 팩, 보디오일)， 색조 화장품 조성물 (화운데이션, 립스틱, 마스카라， 메이크업 베이스) , 두발 제품 조성물 (샴푸， 린스， 헤어컨디셔너， 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어， 피부연화제， 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제， 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한， 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며， 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면， 본 발명의 화장료조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 S0D3 과발현 제대혈 유래 줄기세포를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형 (0/W)의 크림베이스에 S0D3 과발현 제대혈 유래 줄기세포를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료， 킬레이트제， 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질， 미네랄， 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 S0D3 과발현 제대혈 유래 줄기세포의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001 중량% 미만에서는 목적하는 아토피 피부염 치료 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을수 있다.
본 발명은 아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide dismutase 3， S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를유효성분으로 포함하는조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 아토피 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’ 이란 ·개체에게 투여하였을 때， 아토피 피부염 질환의 개선, 치료， 예방, 검출, 진단 또는 아토피 피부염 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 ‘개체’ 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는상기 효과가필요한환자 ) 일 수 있다. 본 발명의 상기 ‘치료’ 는 아토피 피부염 질환 또는 아토피 피부염 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 아토피 피부염 질환을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 아토피 피부염 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ‘〜을 포함하는 (compr i sing)’ 이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’ 과동일하게 사용되며， 조성물 또는 방법에 있어서, 먼급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 로 구성되는 (consi st ing of )’ 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 수성되는 (essent ial ly consi st ing of )’ 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는단계 등을포함하는 것을 의미한다.
【발명의 효과】 따라서, 본 발명은 엤예 과발현 제대혈 유래 줄기세포를 유효 성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 아토피 피부염의 핵심 병인인 비만세포의 탈과립을 억제하는 효과를 보이므로 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한설명】 도 1은 此 과발현에 적합한 세포 원천을 확립하기 위한 것으로， 골수 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포 각각에 렌티바이러스를 이용하여 농도별로 감염시킨 후 감염다중도 01 )를 확인하고 비교한 결과이다.
도 2는 발현 효율이 좋은 프로모터를 선별하기 위한 것으로, 묘 比 프로모터와 프로모터의 이를 확인하고 비교한결과이다. 도 3은 발현 효율이 좋은 프로모터를 선별하기 위한 것으로， EFla 프로모터와 CMV 프로모터의 바이러스의 세포 내 도입 정도를 수치화한 VCN( virus vector copy number )을 분석한 결과이다.
도 4는 엤此를 과발현시킨 제대혈 또는 골수 유래의 줄기세포의 비만세포 탈과립에 대한 영향을 확인한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명을 상세히 설명한다 . 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
MSC의 배양 및 동정 인간의 제대혈에서 유래한 중간엽 줄기세포 (hUCB-MSC)는 제공자의 동의하에 인간 탯줄의 혈액 샘플로부터 수집하였다. 탯줄 혈액 샘플은 채취 후 항응고제로 작용하는 구연산 인산 포도당을 포함하는 혈액수집팩에 보관하였다. 실험을 위한 처리는 24시간 이내에 실시하였다. Ficol 1-Paque PLUS 농도 구배 (Amersham Biosciences)하에 원심분리하여 단핵 세포 분획을 분리하였다. HBSSUei l Biotech Servi ces)로 세척하고, 저혈당 Dulbecco의 변형된 Eagle 배양액 (DMEM, Invitrogen Corp) , 20%우태아 혈청 (Gibco-BRL) , 2mM L-글루타민， ImM 피루브산 나트륨 및 W의 항생제/항진균제 (Li fe Technologies)로 재현탁하였다. 항생제/항진균제는 lOOU/ml 페니실린, lOO ii g/ml 스트렙토마이신, 25 u요/ 의 암포테리신 B를 포함한다. 7일 후, 부착되지 않은 세포는 제거하고， 부착된 세포를 두 가지 배양액을 일주일마다 바꿔가며 배양하였다. 세포는 5% C02 , 37°C의 습윤 조건에서 배양하였다. 융합성 세포의 약 60%를 0. 1%트림신- EDTA로 분리하였고, 배양 플레이트에 옮겨 담았다. 골수 유래 중간엽줄기세포
Figure imgf000022_0001
배양을 위해 회수된 골수는 에卜 Hypaque (비중 1.077)을 이용하여 백혈구연증을 분리하고 phosphate buf fered sal ine(PBS)으로 두 번 세척 후 1X 107 cel lsAli sh의 농도로 100 mm cul ture di sh (Nunc)에서 배양하였다. 배양액은 DMEM-Low glucose(GibcoBRL) 및 10% 우태아혈청 (Gibco-BRL)을 사용하였다. 배양 시작 24시간 후 비부착세포들로 인한 중간엽줄기세포의 부착 및 증식이 감소되는 것을 막기 위하여 비부착세포를 흡입하여 제거하였다. 배지는 1주에 두 번씩 전체 교환하였으며， 부착 세포가 전체 면적의 70~80%7> 되었을 때 0.05% Trypsin/EDTA (Gibco)를사용하여 회수하여 175T Flask하나당 1.5X 105세포씩 계대 배양하며 증식시켰다. 분리한 hU期- MSC와 BM-MSC의 면역표현형을 분석하여 MSC와 관련된 항원 양성 마커의 존재와 조혈 계통 마커의 부재를 유동세포 분석법 (Epi cs XL, Beckman Coul ter)으로 조사하였다. 양성 마커로는 CD90(Thy-l) , CD105(endogl in) 및 SH3(CD73)가 있으며， 조혈계통 마커로는 CD34, CD45 및 CD31과 같은 내피 세포 마커가 있다. 세포는 HLA class I에는 양성이었지만, HLA-DR에는 음성이었다. 각각의 형광표지 단일클론 항체는 Beet on Di ckinson에서 구입하였다 (결과 도시하지 않음) .
S0D3형질전환 상기를 통해 준비한 hUCB-MSC 및 골수 유래 줄기세포에 전기천공법을 이용하여 S0D3를 형질전환시켰다. S0D3 형질도입을 위한 바이러스 발현 벡터 및 형질도입 조건은 렌티바이러스를 바이러스 발현 벡터로 사용하였다는 점 외에 종전 기술인 S0D3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 특허와 동일하게 수행하였다 (한국공개특허 10- 2017-0032872의 실험방법 참고) .
유세포분석 (Flow cytometry) 골수 유래 MSC와 제대혈 유래 MSC에 GFP가 tagging되어 있는 렌티바이러스를 농도별로 감염시킨 후 3일 뒤 GFP가 세포 내에서 얼마나 발현되는지 f low cytometry로분석하였다.
발현 효율 비교 발현 효율이 좋은 바이러스 프로모터를 선별하기 위해 대표적으로 쓰이는 두 가지 렌티바이러스성 프로모터에 S0D3를 탑재한 뒤 발현 효율을 평가하였다. 렌티바이러스성 프로모터인 EFla 프로모터 및 CMV 프로모터 각각에 S0D3를 탑재한 후 발현 효율을 평가하였다. S0D3가탑재된 각각의 프로모터로부터 단백질을 추출한 후， 12% SDS-PAGE 젤에서 분리하였다. 이를 nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories Inc.)으로 이동시키고, 상기 membrane을 5% 탈지 분유로 blocking한 후， 1:1000으로 희석된 1차 항체 및 2차 항체와 각각 반응시켰다. 항체와 반응시킨 membranes를 PBST 용액으로 씻은 후， Enhancecd Chemi -Luminescence 시약 (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)에 반응시키고, X-ray film에 노줄시켜 정량기준 단백질인 베타-튜블린 (|3 -tubulin) 대비 S0D3단백질 밴드를분석하였다. 상기 방법에서 사용한항체는 다음과 같다.
1차항체: anti-S0D3 (Abeam, Cambridge, United Kingdom) ant i-p -tubulin (Abeam, Cambridge, United Kingdom)
2차 항체: anti -rabbit IgG (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA,
USA) 더불어 바이러스의 세포 내 도입 정도를 수치화하여 알아볼 수 있는 virus vector copy number (VCN) 를 Lenti-X Provirus Quantitation Kit(Qiagen)을 이용하여 real-time PCR로 분석하였다. 먼저 바이러스를 감염시키고 72시간이 경과한 세포 1X106개의 genomic DNA를 제품 내 포함된 genomic DNA 분리 키트를 이용하여 추출한 뒤 정량을 하였다. 바이러스 양에 따른 표준 그래프를 그리기 위해 키트에 포함된 lenti-X provirus (스탠더드)를 단계적으로 다섯배씩 희석하여 provirus 카피 개수를 1 ñ＜105개부터 2X104개， 4X103개， 8X102개, 1.6X102개, 32개가 되도록 준비하였다. 앞서 정량한 샘플 genomic DNA 농도가 100ng/2ul , 20ng/2ul , 4ng/2ul , 0.8ng/2ul 이 되도록 희석해둔다. 최종 희석한 스탠더드와 샘플을 2ul씩 넣고 키트 내 포함된 특이 프라이머 lul, 사이버그린 시약 10ul, DEPC 7ul와 섞어서 realtime PCR 반응을 수행하였다 (수행조건: 95-60도 40싸이클 반응). 결과가 나오면 스탠더드 값을 이용하여 표준 그래프를 그린 뒤 샘플에 대항하는 카피 개수를 계산하였다.
비만세포의 탈과립에 대한 영향확인 아토피성 피부염 병인의 핵심 인자인 비만 세포 (LAD2)를 배양하여 생체와 유사하게 IgE 및 ant i-IgE로 활성화시켜 탈과립을 유도하였고 상기와 동일한 방법으로 S0D3를 과발현 시킨 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포와의 공배양을 진행하였다. 먼저 실험 하루 전 24wel l plate (Nunc)에 줄기세포를 3 X 105개 seeding 한 후 하루 동안 안정화를 시켰다. 다음 날 배양액을 제거하고 PBS(Gibco)로 2회 세척해 준 후 각 wel l에 줄기세포와 같은 갯수의 LAD2 세포와 함께 100ng/ml SCFCR&D systems) , 100ng/ml IgE(R&D systems)가 포함된 SteraProä- 34 SFM 배양액 (Gibco)을 500ul씩 넣어주고 24시간 배양하였다. 다음.날 약한 파이페팅으로 LAD2 세포와 배양액을 각 wel l로부터 수거한 뒤 PBS로 한번 세척 후 IgE를 제거하고 원심분리로 모아진 LAD2세포는 다시 원래 있던 wel l에 넣어주었다. 이 후 ant i-IgE 항체 (R&D systems)가 포함된 StemProä-34 SFM 배양액 500ul를 넣어서 1시간 동안 배양하며 반응시켰다. 1시간 후 반응을 끝내기 위해 얼음 위에 플레이트를 위치시키고 각 wel l에서 세포를 포함한 전체 상층액을 수거한 뒤 4도에서 원심분리를 하여 세포를 제외한상층액을새 튜브에 옮겼다. 각각의 상층액 60ul에 같은 볼륨의 7.5mM p-ni trophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide(sigma)를 넣고 2시간 동안 37도에서 100-120rpm 속도로 흔들어주면서 반응을 사켰다. 반응이 끝나면 120ul의 0.2M Glycine(pH10.7)(Sigma)를 넣어준 뒤 410nm에서 흡광도를 측정하여 탈과립 정도를 비교하였다. 실시예 1： S0D3과발현 적합세포 원천 확립 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포 중 S0D3가 과별현에 적합한 세포를 선별하기 위하여 각각의 줄기세포에 GFP가 tagging되어 있는 렌티바이러스를 농도별로 감염시킨 후 GFP의 발현 정도를 M()I를 통해 분석하였다. 그 결과 도 1과 같이, 제대혈 유래 MSC는 2M0I 부터 95% 이상의 GFP 발현을 보였으나 골수 유래 MSC는 10M0I에서도 60%에 못 미치는 GFP 발현 효율을 보였다. 따라서 렌티바이러스를 통한 핵심인자과발현을 위한목적으로 제대혈 유래 MSC가골수유래 MSC보다더 적합함을 확인할수 있었다.
실시예 2： 발현 효율이 우수한프로모터 선정 보편적으로 사용되는 EFla 프로모터와 CMV 프로모터의 S0D3 발현 효율을 비교하여 효율이 더 우수한 프로모터를 선정하였다. 더불어 바이러스의 세포 내 도입 정도를 수치화하여 알아볼 수 있는 vi rus vector copy number(VCN)를 real t ime PCR로 분석하였다. 그 결과 도 2 및 도 3과 같이， EFla 프로모터보다 CMV 프로모터가 같은 1）1에서 더 뛰어난 발현 효율을 보이는 것을 확인하였다. 더불어 ¾101 값이 높을수록 더 높은 （： 값을 가졌으며 0^ 프로모터를 가진 경우가 묘 프로모터 바이러스보다훨씬 더 많이 세포 내로 바이러스가들어감을 알수 있었다. 따라서 바이러스 도입에 의한 세포 손상을 방지하기 위해 적절한
Figure imgf000026_0001
값이 10을 넘지 않는 ¾1이를 설정하였으며 , 이 기준에 맞는 5^）1로 조건을 설정하고 효능 평가를 진행하였다.
실시예 3： S0D3과발현 줄기세포 처리시 비만세포에 대한 영향확인 아토피성 피부염 병인의 핵심 인자인 비만 세포의 탈과립에 있어서 본 발명에 따른 S0D3 과발현 줄기세포의 영향을 확인하고， 골수 또는 제대혈 유래에 따른 차이를 확인하였다. 그 결과 도 4와 같이, 탈과립 억제 정도를 측정한 결과 S0D3를 과발현 시킨 5M0I로 S0D3를 과발현시킨 제대혈 유래 MSC의 효과가가장좋은 반면 골수유래 MSC는오히려 탈과립을촉진하는 양상을 확인하였다.
이 연구는 한국 정부가 후원하는 의 바이오 & 의료 기술 개발 프로그램인 1 1）（ 術-2016 3쇼986903020）의 지원을 받았다.
【산업상 이용가능성】 이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 엤況 과발현 제대혈 유래 줄기세포는 비만세포의 탈과립을 억제하는 효과를 보이므로 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1] 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3 , S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
【청구항 2】 제 1항에 있어서， 상기 S0D3는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
【청구항 4] 제 1항에 있어서, 상기 3孤3를 과발현하는 제대혈 유래 줄기세포는 엤03를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제대혈 줄기세포에 형질감염시켜 얻는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학조성물.
【청구항 5】 제 4항에 있어서 , 상기 재조합 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터， 레트로바이러스 벡터， 아데노바이러스 벡터， 아데노연관바이러스 ( \0 벡터， 벡시니아바이러스 벡터， 허피스바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물.
【청구항 7] 제 4항에 있어서 , 상기 (©3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 표시되는 염기서열 중 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는， 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물.
【청구항 8]
제 4항에 있어서，
상기 재조합 발현 벡터는 «V프로모터 또는표比크프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방또는 치료용 약학조성물.
【청구항 9】
슈퍼옥사이드 디스무타아제 3(superoxide dismutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료조성물.
【청구항 10】
아토피 치료용 제제를 제조하기 위한 슈퍼옥사이드 디스무타아제
3 (super oxide di smutase 3, S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포의 용도.
【청구항 11】 슈퍼옥사이드 디스무타아제 3 (super oxide di smutase 3， S0D3)를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을특징으로하는 아토피 질환의 치료 방법 .
PCT/KR2018/012713 2018-10-25 2018-10-25 Sod3를 과발현시킨 제대혈 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 Ceased WO2020085534A1 (ko)

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KR20170032872A (ko) * 2015-09-15 2017-03-23 주식회사 강스템바이오텍 Sod3를 과발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

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