WO2020074042A1 - Probenhalter für den automatisierten probenwechsel - Google Patents

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WO2020074042A1
WO2020074042A1 PCT/DE2019/100863 DE2019100863W WO2020074042A1 WO 2020074042 A1 WO2020074042 A1 WO 2020074042A1 DE 2019100863 W DE2019100863 W DE 2019100863W WO 2020074042 A1 WO2020074042 A1 WO 2020074042A1
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holder
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Christian Feiler
Manfred Weiss
Dirk Wallacher
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Helmholtz-Zentrum Berlin Für Materialien Und Energie Gmbh
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    • G01N23/20—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by using diffraction of the radiation by the materials, e.g. for investigating crystal structure; by using scattering of the radiation by the materials, e.g. for investigating non-crystalline materials; by using reflection of the radiation by the materials
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    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
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    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • G01N2223/00—Investigating materials by wave or particle radiation
    • G01N2223/60—Specific applications or type of materials
    • G01N2223/602—Specific applications or type of materials crystal growth

Definitions

  • the invention relates to a sample holder for mounting on a goniometer head, in automated sample change, as is done with the aid of a robot.
  • Crystallization generally begins with a protein solution in a relatively high protein concentration of 2 to 50 mg / ml. Reagents are added to this solution, which slowly increase the protein concentration and should thus lead to spontaneous crystallization. If the conditions are optimal, nucleation nuclei form, from which the growth of the protein crystal can proceed. In practice, it looks like that in a first screening, for example in a so-called 96-well microtiter plate, a number of conditions are tested, the conditions in the individual cavities (wells), which serve as crystallization vessels, being slightly varied. Conditions in which crystallization nuclei were formed are then systematically optimized. A crystal that can be used for the X-ray structure analysis should have a size of 0.1 to 0.2 mm in at least two spatial dimensions.
  • the hanging drop method a few (one to two) microliters of the protein solution are mixed with an equal or varying volume of a reservoir solution containing the precipitant. A drop of this mixture is placed on a glass slide that covers the reservoir and seals it airtight. Since the solution in the reservoir contains a higher concentration of the precipitant than the drop, water passes over time from the drop into the reservoir and both the protein concentration and the concentration of the precipitant in the drop gradually increase.
  • An alternative method is one in which mass transport is used by means of diffusion over a phase boundary: protein solution and precipitant solution are brought into contact in a capillary over a common phase boundary. The precipitant, with its much smaller particle size, diffuses through the interface into the protein solution.
  • Another method is the batch process. Here the solution must already be in the nucleation area. Sample and precipitant mixture are mixed together to form a droplet under an insulating oil layer. This process requires microscopic observation to identify crystallization nuclei, which can extend over weeks and months. This procedure is now largely automated and so-called screening kits with a large number of different precipitants are commercially available.
  • WO 2007/089 658 A2 seeks to address this problem. It is disclosed to provide a flexible sample support in the form of a film that is as thin as possible, on which the crystals are already growing and thus do not have to be removed from the mother solution.
  • DE 10 2017 129 761.8 discloses a sample holder for mounting on a goniometer head, which also serves as a cover for cavities for crystal growth, such as wells in microtiter plates, and on which the crystals grow directly on a film. This sample holder is only suitable for the manual arrangement of the same on a goniometer head.
  • the invention is based on the object of providing a sample holder which is suitable both as a cover for cavities in crystal growing and also directly for automatic (e.g. robot-assisted) handling in the implementation on a goniometer head and in further process steps in crystal structure elucidation.
  • one aspect of the invention relates to a sample holder for mounting on a goniometer head.
  • the sample holder according to the invention has an outer peripheral edge element and an inner peripheral edge element spaced apart from the outer edge element.
  • the two edge elements are connected to one another by at least one strut.
  • the sample holder has a cover film spanning the outer edge element and a sample film spanning the inner edge element.
  • the two foils are spaced apart.
  • the sample holder according to the invention has the advantage that, in addition to its function as a sample holder in an X-ray measurement, it can also be used as a substrate for growing crystals, in particular protein crystals.
  • the outer edge element serves as a holder when the sample holder is arranged on a crystallization vessel, for example a glass, a beaker or a cavity, in such a way that it closes an open side of the vessel.
  • the sample holder accordingly serves as a lid for the crystallization vessel, the outer edge element resting on or enclosing the edge of the vessel and the cover film delimiting the opening of the vessel from the outside.
  • the inner edge element is arranged on the side of the cover film facing the interior of the vessel.
  • the sample film faces the mother solution in such a way that crystals form on the surface of the sample film in the sense of the “hanging drop” method.
  • the resulting crystals adhere to the surface, so that the sample holder can be removed from the crystallization vessel and immediately mounted on a goniometer head, arranged horizontally or vertically.
  • the crystal on the Advantageously, the film is immediately accessible to an X-ray measurement, ie in particular without further sample preparation.
  • the crystals thus remain stable since they do not have to be mechanically processed, that is to say neither individually nor fixed on a sample holder.
  • the sample holder according to the invention thus enables in-situ analysis of the crystals without further manipulative interventions.
  • the sample holder additionally has a holder or a handle which is attached to the inner edge element and extends beyond the outer edge element.
  • This holder serves in particular as a handle, is therefore preferably elongated, and enables easier and gentler removal of the sample holder after successful crystallization from the crystallization vessel, as well as convenient mounting of the sample holder on the goniometer head.
  • the holder can also be used to mount the sample holder on the goniometer head itself, for this purpose the holder is designed to be form-fitting.
  • the sample holder according to the invention has the further advantage that it can be used directly for automated handling in crystal structure analysis.
  • predetermined breaking points are integrated at the transitions of the outer edge element to the holder and the at least one strut at the transition to the inner edge element.
  • the outer edge element can also be attached to the holder only at a transition and can be provided there with a predetermined breaking point.
  • the predetermined breaking points serve to strip off the outer edge element of the sample holder, in which the sample holder is guided, for example, through an opening which is adapted in shape or through retention elements which have a smaller diameter than the outer edge element and which is at the same time larger than that of the inner edge element .
  • the sample holder is carried out perpendicular to the planes of the edge elements and in the rear direction on the cover film, so that the outer edge element can be stripped in this direction without colliding with the inner edge element.
  • the bracing takes place by breaking the predetermined breaking points due to the pressure resulting from the passage on the outer edge element, the arrangement of the predetermined breaking points causing the outer edge element to break off.
  • This step which reduces the outer limit of the sample holder to a size that is suitable or optimized for further crystal structure analysis, can now also be carried out automatically.
  • the sample holder now fulfills the function, on the one hand, of serving as a lid and crystal growth surface for crystallization vessels in crystal growing and, at the same time, being able to be fed to automated handling without further manual manipulation.
  • the dimensions and the shape of the outer edge element can also advantageously be adapted to any crystallization vessel and the dimensions and the shape of the inner edge element based on specifications in the crystal structure determination. It is also advantageous that the removal of the outer edge element minimizes shading and scattered radiation in the crystal structure determination.
  • At least one further predetermined breaking point is integrated in the outer edge element, which favors the process of stripping the outer edge element.
  • any variation in the design of the elements or the strut at a locally limited point which is suitable for a smaller pressure at directed pressure perpendicular to the plane spanned by the edge elements, is less at these points Ensure structural integrity than in the rest of the sample holder.
  • the shape of the outer edge element corresponds to the type of an outer shape of a lid of a cavity of a microtitration plate according to the ANSI standard, so that the sample holder can be attached as a lid on such a cavity.
  • the cover in this embodiment closes the cavity in an airtight manner.
  • the edge element closes the interior of the cavity, for example in the form of a plug with lamellae, and / or at least part of the outer edge of the opening of the cavity in a form-fitting manner.
  • the latter embodiment can be implemented, for example, via a recess in the outer edge, which forms a negative of the corresponding part of the opening.
  • the sample holder according to the invention can thus be used on all customary crystal growth vessels for protein crystal growth.
  • the shape of the sample holder is particularly preferably adapted to the shape of the cavities of a so-called 24-well format, in particular to one in which the cavities have a diameter of 22 mm and in particular also smaller diameters of e.g. 18 mm or 15 mm.
  • Each of the edge elements advantageously has a height which defines the distance between two base areas, the cover film and the sample film corresponding to base areas of the respective edge element lying opposite one another.
  • the distance between the mutually facing surfaces of the two foils preferably corresponds to the height of the edge elements or the height of the higher edge element.
  • the sample film is arranged on one side of the inner edge element, which faces the mother solution during crystal growth.
  • a plateau-shaped goniometer head in which the sample holder is mounted horizontally, i.e.
  • the sample holder can in particular also be mounted by means of an integrated holder in a magnetic base, which in turn is used for mounting on the goniometer.
  • the cover film has a transparency for visible light of at least 85%, in particular at least 90%, preferably at least 95%, and is impermeable to air and steam.
  • the quality class of the cover film corresponds to the so-called “high clarity” quality class. This improves the suitability of the sample holder when used as a cover during crystal growth, since the progress of crystal growth can be observed through the cover film.
  • the impermeability to air and steam ensures that the concentration of the mother liquor is only influenced as a function of the progress of crystal growth, but not by escaping solvent. Scattering for visible light is in particular ⁇ 5% and the film preferably has a thickness of not more than 70 pm, in particular not more than 40 pm.
  • the cover film is detachably connected to the outer edge element and in particular has a tab that extends beyond the edge of the outer edge element.
  • the detachable connection enables the cover film to be easily removed before mounting the sample holder on a goniometer head, so that as far as possible no vibrations can damage the crystal to be measured.
  • the tab reinforces this advantage, since the film is easy to grasp over the tab and can be easily removed.
  • the principle can be compared to removing a standard yoghurt lid. It is therefore particularly preferred if the cover film is glued or welded to the edge element, in particular if the cover film is a so-called heat seal film.
  • the sample film has a perforation with particular advantage.
  • This preferably consists of holes which are regular or irregular in shape, size and / or position.
  • the perforation allows solutions or solvents to pass through, especially mother liquor through the sample sheet.
  • mother liquor or excess solvent behind the crystals that is to say on the surface of the sample film facing away from the crystals, can be suctioned off and thus liquid can be removed from the crystal without contact.
  • the perforation serves as an irregularity on the surface on which crystallization nuclei are easily arranged, which in turn trigger crystal growth.
  • the perforation is introduced, for example, by laser, stamp, needle or other methods.
  • irregular in shape, size and position is to be understood to mean that the holes on the surface of the sample film only permit liquid transport in some areas, that is to say, for example, perforation islands form. This is possible, but fully perforated films are also preferred.
  • the sample film is as transparent as possible to X-rays.
  • An optical transparency in particular a light scatter of at most 5%, an Abbe number of at least 50 and or an optical anisotropy of not more than 0.02% is preferred.
  • Suitable materials are therefore, in particular, polyimides, such as Kapton® (Du Pont), which is also known under the brand name, or cycloolefin copolymers (COC).
  • the sample holder has centering pins which are arranged on at least one of the edge elements and are used for easier pre-orientation and fixing of the films on both sides of the holder in the manufacturing process.
  • the centering pins are functionally irrelevant for the measurement and handling of the sample holder, but represent a purely manufacturing optimization by guaranteeing exact positioning of the cover film and sample film when adhering to the sample holder so that the films cover the inside and outside of the sample holder Close the sample holder cleanly. Due to the corresponding holes in the respective foils, slipping of the foils when gluing or handling the holder is impossible.
  • the holder has positioning aids arranged on the outer ring, which ensure safe, quick and, above all, correct closing of the corresponding crystallization cavity. Further preferred refinements of the invention result from the others in the
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a sample holder according to the invention in a preferred embodiment of the invention in a view of the side of the cover film
  • Figure 2 is a schematic representation of the sample holder in the preferred embodiment
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the sample holder according to the invention in the preferred embodiment in an oblique view of the side of the sample film, with the cover and sample film applied,
  • Figure 4 is a schematic representation of the sample holder according to the invention in the preferred embodiment in a view of the side of the cover sheet after stripping the outer edge element.
  • FIG. 1 shows a sample holder 1 according to the invention, viewed from the side on which a cover film 6 is to be applied to the outer edge element 2.
  • the cover film is not available in the illustration.
  • the sample holder 1 has a holder 5 which is arranged on the inner edge element 3 and extends outward beyond the outer edge element 2.
  • the inner edge element 3 and the outer edge element 3 are connected via struts 4 which stabilize the sample holder.
  • predetermined breaking points S are integrated.
  • the predetermined breaking points S are designed as a taper.
  • FIG. 2 shows a sample holder 1 according to the invention of the embodiment shown in FIG. 1 in a view of the side on which the sample film 7 is to be applied to the inner edge element.
  • the stops 8 provided on the outer edge element 2 are visible in the form of side elevations. These elevations are arranged in an inner and an outer circumference of the outer edge element 3 and extend on the side facing the sample film 7 over the height of the outer edge element 2.
  • the stops 8 serve for the form-fitting fixing of the sample holder when used as a lid of a crystallization vessel ( Not shown).
  • fixing pins 9 are arranged on the inner edge element 3, which help with the arrangement of a sample film 7.
  • the framework made of inner edge element 2, outer edge element 3, struts 4 and holder 5 is preferably made of a thermoplastic material which is temperature stable at least in a temperature range from -180 ° C to 160 ° C.
  • the scaffold can be produced, for example, using a 3-D printer (temperature up to 60 degrees) or by injection molding (significantly higher temperature possible).
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of the sample holder according to the invention in the preferred embodiment in an oblique plan view of the side of the sample sheet, with the cover sheet 6 and sample sheet 7 applied.
  • a sample sheet 7 is arranged on the inner edge element 3 in such a way that it Embodiment shown circular spanned the inner edge member 3.
  • the sample film can have perforations (not shown).
  • the sample film 7 is made of a material that is as transparent as possible for X-rays.
  • the material of the sample film 7 should be biologically inert, X-ray transparent and as thin as possible, that is to say in particular not exceed a thickness of 40 ⁇ m, but thicker designs are not excluded. Materials which have a light scattering of less than 5% and a transmission for visible light of at least 90% are particularly suitable. Particularly good results were achieved with polyimides, such as Kapton®, and with cycloolefin copolymers.
  • the sample holder 1 according to the invention can be arranged by means of the holder 5 on vertical or horizontal goniometer heads.
  • the removal of the outer edge element 2 together with the cover film 6 can be done either before assembly or afterwards.
  • FIG. 4 shows the sample holder according to the invention after the outer edge element 2 has been stripped off by breaking the predetermined breaking points S. Only the holder 5 and the inner edge element 3 remain. This is optimized in terms of dimension and shape for arrangement in a device for crystal structure elucidation. The dimensions usually range from 18 mm x 5 mm x 2.5 mm.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Probenhalter (1) zur Montage auf einem Goniometerkopf, der ein äußeres umlaufendes Randelement (2) und ein vom äußeren Randelement (2) beabstandetes inneres umlaufendes Randelement (3) umfasst. An dem inneren Randelement (3) ist eine Halterung (5) angeordnet, die sich über das äußere Randelement (2) hinaus erstreckt. Weiterhin ist zumindest eine Strebe (4), die die beiden Randelemente (2, 3) miteinander verbindet, eine das äußere Randelement (2) überspannende Deckfolie (6) und eine das innere Randelement (3) überspannende Probenfolie (4) umfasst, wobei, die beiden Folien (6, 7) voneinander beabstandet sind. Der Probenhalter ist insbesondere angepasst um auch als Deckel für eine Kavität einer Mikrotiterplatte zu dienen. Erfindungsgemäß ist das äußere Randelement (2) an den Übergängen zu dem Halter und die Strebe (4) an dem Übergang zum inneren Randelement (3) mit Sollbruchstellen versehen.

Description

Beschreibung
Probenhalter für den automatisierten Probenwechsel
Die Erfindung betrifft einen Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf, im automatisierten Probenwechsel, wie er roboterunterstützt erfolgt.
Die Struktur vieler Proteine konnte erst mittels der Kristall-Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu kleinen organischen oder anorganischen Molekülen wie Zucker oder Salzen, die meist einfacher auskristallisieren, bilden die oft sehr großen Protein-Moleküle nur unter ganz bestimmten Bedingungen Kristalle, die in langen Versuchsreihen ermittelt werden müssen.
Die Kristallisation beginnt im Allgemeinen mit einer Proteinlösung in relativ hoher Proteinkonzentration von 2 bis 50 mg/ml. Dieser Lösung werden Reagenzien zugesetzt, die die Proteinkonzentration langsam erhöhen und somit zu einer spontanen Kristallisation führen sollen. Sind die Bedingungen optimal, bilden sich Nukleationskeime, von denen aus das Wachstum des Proteinkristalls fortschreiten kann. In der Praxis sieht es so aus, dass in einem ersten Screening, beispielsweise in einer sogenannten 96-Well Mikrotiterplatte, eine Reihe von Bedingungen getestet werden, wobei die Bedingungen in den einzelnen Kavitäten (Wells), die als Kristallisationsgefäße dienen, leicht variiert werden. Bedingungen in denen Kristallisationskeime gebildet wurden, werden anschließend systematisch optimiert. Ein für die Röntgenstrukturanalyse brauchbarer Kristall sollte in mindestens zwei Raumdimensionen 0, 1 bis 0,2 mm groß sein.
Es gibt zwei grundsätzlich verschiedene Methoden zur Kristallisation von größeren Biomolekülen mittels Dampfdiffusion, die„sitting-drop“- und die„hanging-drop“-Methode. Bei der hanging-drop- Methode werden wenige (ein bis zwei) Mikroliter der Protein-Lösung mit einem gleichen oder auch variierenden Volumen einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt und luftdicht verschließt. Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels enthält als der Tropfen, tritt im Laufe der Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die Proteinkonzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht sich sukzessive. Eine alternative Methode ist eine bei der man Stofftransport mittels Diffusion über eine Phasengrenze ausnutzt: Proteinlösung und Fällungsmittellösung werden in einer Kapillare über eine gemeinsame Phasengrenze miteinander in Kontakt gebracht. Das Fällungsmittel mit seiner viel kleineren Teilchengröße diffundiert dabei durch die Grenzfläche in die Proteinlösung. Eine weitere Methode ist das Batch- Verfahren. Hier muss sich die Lösung bereits im Nukleationsbereich befinden. Probe und Fällungsmittelgemisch werden unter einer isolierenden Ölschicht miteinander zu einem T ropfen vermischt. Dieser Vorgang bedarf einer mikroskopischen Observation um Kristallisationskeime zu identifizieren, die sich über Wochen und Monate erstrecken kann. Diese Vorgehensweise ist heute weitgehend automatisiert und so genannte Screening Kits mit einer großen Anzahl verschiedener Präzipitationsmittel sind kommerziell erhältlich.
Für die Kristallstrukturaufklärung benötigt man Einkristalle. Viel häufiger jedoch als diese entstehen entweder ein amorpher Niederschlag (Präzipitat) oder auch Kristalle, die nicht für eine derartige Untersuchung geeignet sind. Entscheidende Parameter wie z.B. pH-Wert,„salting in“, „salting out“, lonenstärke, organische Lösungsmittel (Dielektrizitätskonstante) und die Temperatur werden bei den Kristallisationsansätzen variiert.
Neben der Züchtung von Proteineinkristallen ist auch deren Probenpräparation im Vergleich zu anorganischen Kristallen aufwändiger. Die meist sehr fragilen Proteinkristalle zerfallen leicht unter mechanischem Druck aber auch bei Änderung äußerer Parameter, wie z.B. pH-Wert, Temperatur, relativer umgebender Feuchtigkeit. Zur Präparation werden die Kristalle manuell, also im Wesentlichen mechanisch oder durch Spülen vereinzelt und, beispielsweise mit einer Schlaufe, einem sogenannten Loop, auf einem Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf präpariert. Da die Aufnahme von Röntgendiffraktionsbildern am Einkristall üblicherweise bei Temperaturen um 100 Kelvin stattfindet, bedarf es gegebenenfalls eines weiteren Manipulationsschrittes. Der auf den Loop montierte Proteinkristall, circa 50% aus Wasser bestehend, muss vor der Montage auf das Goniometer und der Exposition mit Röntgenstrahlung bei 100 Kevin mit einem Frostschutzmittel behandelt werden.
Das Problem besteht demnach im Wesentlich darin, dass Kristalle bei der Probenpräparation zerstört oder beschädigt werden und somit nicht mehr einer Röntgenstrukturanalyse zur Verfügung stehen. Diesem Problem zu begegnen sucht die WO 2007/089 658 A2. Darin ist offenbart, einen flexiblen Probenträger in Form einer möglichst dünnen Folie bereitzustellen, auf dem die Kristalle bereits wachsen und somit nicht aus der Mutterlösung entnommen werden müssen. In der DE 10 2017 129 761.8 wird ein Probenhalter für die Montage auf einem Goniometerkopf offenbart, der zugleich auch als Abdeckung von Kavitäten zur Kristallzucht wie z.B. Wells in Mikrotiterplatten dient und an dem die Kristalle direkt auf einer Folie aufwachsen. Dieser Probenhalter eignet sich ausschließlich für die manuelle Anordnung desselben auf einem Goniometerkopf.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, einen Probenhalter bereitzustellen, der sowohl als Abdeckung von Kavitäten bei der Kristallzucht geeignet ist, als auch direkt zur automatischen (z.B. robotergestützten) Handhabung bei der Umsetzung auf einen Goniometerkopf sowie bei weiteren Verfahrensschritten in der Kristallstrukturaufklärung.
Diese Aufgabe wird durch einen Probenhalter mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs gelöst. Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung einen Probenhalter zur Montage auf einem Goniometerkopf. Der erfindungsgemäße Probenhalter weist ein äußeres umlaufendes Randelement sowie ein von dem äußeren Randelement beabstandetes inneres umlaufendes Randelement auf. Die beiden Randelemente sind durch zumindest eine Strebe miteinander verbunden. Ferner weist der Probenhalter eine, das äußere Randelement überspannende Deckfolie auf sowie eine das innere Randelement überspannende Probenfolie. Dabei sind die beiden Folien voneinander beabstandet.
Der erfindungsgemäße Probenhalter hat den Vorteil, dass er neben der Funktion als Probenhalter bei einer röntgenographischen Messung gleichzeitig als Untergrund zum Anzüchten von Kristallen, insbesondere Proteinkristallen, verwendbar ist. Hierbei dient das äußere Randelement als Halterung wenn der Probenhalter auf einem Kristallisationsgefäß, beispielsweise einem Gläschen einem Becher oder einer Kavität, derart angeordnet wird, dass er eine offene Seite des Gefäßes verschließt. Der Probenhalter dient demgemäß als Deckel für das Kristallisationsgefäß, wobei das äußere Randelement auf dem Rand des Gefäßes aufliegt oder diesen umschließt und die Deckfolie die Öffnung des Gefäßes nach außen hin abgrenzt. Das innere Randelement ist auf der, dem Innenraum des Gefäßes zugewandten Seite der Deckfolie angeordnet. Wird im Kristallisationsgefäß eine Mutterlösung zur Kristallzüchtung eingebracht und der Probenhalter erfindungsgemäß als Deckel auf dem Kristallisationsgefäß angeordnet, ist die Probenfolie der Mutterlösung derart zugewandt, dass sich auf der Oberfläche der Probenfolie, im Sinne der „hanging-drop“-Methode, Kristalle bilden. Die entstandenen Kristalle haften auf der Oberfläche, sodass der Probenhalter vom Kristallisationsgefäß entfernt werden und sofort auf einem Goniometerkopf, horizontal oder vertikal angeordnet, montiert werden kann. Der Kristall auf der Folie ist vorteilhafter Weise sofort, d.h. insbesondere ohne weitere Probenpräparation, einer Röntgenmessung zugänglich. Somit bleiben die Kristalle stabil, da sie nicht mechanisch bearbeitet, also weder vereinzelt noch auf einem Probenhalter fixiert, werden müssen. Damit ermöglicht der erfindungsgemäße Probenhalter eine in-situ Analyse der Kristalle ohne weitere manipulative Eingriffe.
Der Probenhalter weist zusätzlich eine Halterung bzw. eine Handhabung auf, die an dem inneren Randelement befestigt ist und sich über das äußere Randelement hinaus erstreckt. Diese Halterung dient insbesondere als Griff, ist daher vorzugsweise längserstreckt, und ermöglicht eine leichtere und schonendere Entfernung des Probenhalters nach einer erfolgreichen Kristallisation von dem Kristallisationsgefäß, sowie eine komfortable Montage des Probenhalters auf dem Goniometerkopf. In besonders bevorzugter Ausgestaltung eines Goniometerkopfes kann die Halterung auch der Montage des Probenhalters am Goniometerkopf selbst dienen, hierzu ist der Halter formschlüssig gestaltet.
Der erfindungsgemäße Probenhalter hat weiterhin den Vorteil, direkt zur automatisierten Handhabung in der Kristallstrukturanalyse nutzbar zu sein. Hierfür sind Sollbruchstellen an den Übergängen des äußeren Randelements zu dem Halter und der mindestens einen Strebe am Übergang zu dem inneren Randelement integriert. Das äußere Randelement kann dabei auch lediglich an einem Übergang an den Halter befestigt sein und dort mit einer Sollbruchstelle versehen sein. Die Sollbruchstellen dienen dazu, das äußere Randelement des Probenhalters abzustreifen, in dem der Probenhalter z.B. durch eine in der Form angepasste Öffnung oder durch Rückhalteelemente geführt wird, die gerade einen kleineren Durchmesser als das äußere Randelement aufweisen und der zugleich größer ist als der des inneren Randelements. Die Durchführung des Probenhalters geschieht dabei senkrecht zu den Ebenen der Randelemente und in rückwärtiger Richtung auf die Deckfolie, so dass das äußere Randelement in dieser Richtung abstreifbar ist, ohne mit dem inneren Randelement zu kollidieren. Das Absteifen erfolgt durch das Brechen der Sollbruchstellen durch den, durch die Durchführung auf das äußere Randelement entstehenden Druck, wobei die Anordnung der Sollbruchstellen das Abrechen des äußeren Randelements bewirkt. Dieser Schritt, der den Probenhalter in seiner äußeren Begrenzung auf eine Größe reduziert, die für die weitere Kristallstrukturanalyse geeignet bzw. optimiert ist, ist nunmehr auch automatisiert durchführbar. Der Probenhalter erfüllt nun zum einen die Funktion, als Deckel und Kristallaufwachsfläche für Kristallisationsgefäße in der Kristallzucht zu dienen und gleichzeitig ohne manuelle weitere Manipulation einer automatisierten Handhabung zuführbar zu sein. Die Dimensionen und die Ausformung des äußeren Randelements sind zudem in vorteilhafter weise an jegliches Kristallisationsgefäß anpassbar und die Dimensionen und die Ausformung des inneren Randelements an Vorgaben in der Kristallstrukturbestimmung. Des Weiteren vorteilhaft ist, dass durch die Entfernung des äußeren Randelements Verschattungen und Streustrahlungen in der Kristallstrukturbestimmung minimiert werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist in dem äußere Randelement mindestens eine weitere Sollbruchstelle integriert, die den Vorgang des Abstreifens des äußeren Randelements begünstigt.
Als Sollbruchstelle im Sinne des Erfindungsgegenstandes eignet sich jegliche Variation in der Ausführung der Elemente bzw. der Strebe an einer örtlich begrenzten Stelle, die dazu geeignet ist, bei gerichtetem Druck senkrecht zu der Ebene, die durch die Randelemente aufgespannt wird, an diesen Stellen eine geringere Strukturintegrität als in dem Rest des Probenhalters zu gewährleisten.
In weiter bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen dass die Form des äußeren Randelements der Art einer äußeren Form eines Deckels einer Kavität einer Mikrotitrierplatte nach ANSI-Standard entspricht, so dass der Probenhalter als ein Deckel auf einer solchen Kavität anbringbar ist. Insbesondere verschließt der Deckel in dieser Ausgestaltung die Kavität luftdicht. Dabei schließt das Randelement den Innenraum der Kavität, beispielsweise in Form eines Pfropfens mit Lamellen, und/oder zumindest einen Teil des äußeren Rands der Öffnung der Kavität formschlüssig ab. Letztere Ausgestaltung kann beispielsweise über eine Ausnehmung im äußeren Rand realisiert werden, die einem Negativ des korrespondierenden Teils der Öffnung bildet. Der Vorteil dieser Ausgestaltung liegt in der universellen Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Probenhalters. So ist der erfindungsgemäße Probenhalter in dieser Ausgestaltung auf allen üblichen Kristallzüchtungsgefäßen zur Proteinkristallzüchtung verwendbar. Besonders bevorzugt ist die Form des Probenhalters an die Form der Kavitäten eines sogenannten 24-Well Formats angepasst, insbesondere an ein solches in dem die Kavitäten einen Durchmesser von 22 mm aufweisen und insbesondere auch kleinere Durchmesser von z.B. 18 mm oder 15 mm.
Mit Vorteil weist jedes der Randelemente eine Höhe auf die den Abstand zweier Grundflächen definiert, wobei die Deckfolie und die Probenfolie einander gegenüberliegender Grundflächen des jeweiligen Randelements entsprechen. Mit anderen Worten, liegen die beiden Randelemente in einer Ebene zueinander, so entspricht der Abstand der einander zugewandten Oberflächen der beiden Folien bevorzugt der Höhe der Randelemente bzw. der Höhe des höheren Randelements. In dieser Ausgestaltung ist zum einen sichergestellt dass die Probenfolie auf einer Seite des inneren Randelementes angeordnet ist, die während der Kristallzüchtung der Mutterlösung zugewandt ist. Zum anderen ist bei der Verwendung eines Plateauförmigen Goniometerkopfes, bei dem der Probenhalter horizontal, also derart montiert wird, dass eine Grundfläche des äußeren Randelements auf dem Goniometerkopf aufliegt, sichergestellt das die Probenfolie respektive der auf der Probenfolie angeordnete Kristall bei der Montage auf dem Goniometerkopf den höchsten Punkt bildet. Abschattungen werden so auf ein Mindestmaß reduziert sind. Der Probenhalter kann dabei insbesondere auch mittels einer integrierten Halterung in einer magnetischen Basis montiert werden, welche wiederrum für die Montage auf dem Goniometer dient.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Deckfolie eine Transparenz für sichtbares Licht von mindestens 85 %, insbesondere von mindestens 90 % bei der bevorzugt von mindestens 95 %, aufweist und luft- und dampfundurchlässig ist. Mit anderen Worten entspricht die Güteklasse der Deckfolie der sogenannten„high clarity“-Güteklasse. Dies verbessert die Eignung des Probenhalters bei der Verwendung als Deckel während der Kristallzüchtung, da der Fortschritt des Kristallwachstums durch die Deckfolie hindurch beobachtet werden kann. Ferner stellt die Undurchlässigkeit für Luft und Dampf sicher, dass die Konzentration der Mutterlösung lediglich in Abhängigkeit vom Fortschritt des Kristallwachstums beeinflusst wird, hingegen nicht durch entweichendes Lösungsmittel. Eine Streuung für sichtbares Licht ist insbesondere <5 % und vorzugsweise weist die Folie eine Dicke von nicht mehr als 70 pm insbesondere nicht mehr als 40 pm auf.
Weiter bevorzugt ist die Deckfolie mit dem äußeren Randelement lösbar verbunden und weist insbesondere eine Lasche auf, die sich über den Rand des äußeren Randelements hinaus erstreckt. Die lösbare Verbindung ermöglicht, dass die Deckfolie vor der Montage des Probenhalters auf einem Goniometerkopf leicht entfernt werden kann, sodass möglichst keine Erschütterungen zu einer Schädigung des zu messenden Kristalls führen kann. Die Lasche verstärkt diesen Vorteil, da die Folie über die Lasche leicht greifbar ist und leicht entfernt werden kann. Das Prinzip kann mit dem Entfernen eines handelsüblichen Joghurtdeckels verglichen werden. Somit ist es besonders bevorzugt, wenn die Deckfolie auf dem Randelement geklebt oder geschweißt, insbesondere wenn die Deckfolie eine sogenannte Heißsiegelfolie ist.
Mit besonderem Vorteil weist die Probenfolie eine Perforation auf. Diese besteht vorzugsweise aus in Form, Größe und/oder Lage regelmäßigen oder unregelmäßigen Löchern. Die Perforation ermöglicht ein Passieren von Lösungen oder Lösungsmittel insbesondere von Mutterlösung durch die Probenfolie. Dies hat insbesondere den Vorteil, dass Mutterlösung oder überschüssiges Lösungsmittel hinter den Kristallen, also auf der von den Kristallen abgewandten Oberfläche der Probenfolie abgesaugt werden kann und somit Flüssigkeit vom Kristall berührungslos entfernt werden kann. Alternativ bietet sich die Möglichkeit auf der kristallabgewandten Seite eine Flüssigkeit aufzubringen, die dann durch die Probenfolie hindurch diffundieren kann und wieder entfernbar ist. Dies kann beispielsweise beim sogenannten Liganden-Soaking vorteilhaft sein. Zusätzlich dient die Perforation als Unregelmäßigkeit auf der Oberfläche an der sich leicht Kristallisationskeime anordnen die wiederum ein Kristallwachstum auslösen. Die Perforation ist beispielsweise durch Laser, Stempel, Nadeln oder aber durch andere Methoden eingebracht. Vorliegend ist unter in Form, Größe und Lage unregelmäßig zu verstehen, dass die Löcher auf der Oberfläche der Probenfolie nur bereichsweise einen Flüssigkeitstransport zulassen, sich also beispielsweise Perforationsinseln ausbilden. Dies ist eine mögliche Ausfertigung, jedoch voll perforierte Folien sind ebenfalls bevorzugt.
Für die Verwendung des Probenhalters bei einer röntgendiffraktometrischen Datensammlung ist es von Vorteil wenn die Probenfolie für Röntgenstrahlung möglichst transparent ist. Eine optische Transparenz also insbesondere eine Lichtstreuung von höchstens 5 %, eine Abbe Zahl von mindestens 50 und oder eine optische Anisotropie von nicht mehr als 0,02 % aufweist ist bevorzugt. Geeignete Materialien sind daher insbesondere Polyimide, wie das mit Markennamen bezeichnete Kapton® (Du Pont), oder aber Cycloolefin-Copolymere (COC).
Alternativ oder zusätzlich weist der Probenhalter Zentrierstifte auf welche auf zumindest einem der Randelemente angeordnet sind und zur einfacheren Vororientierung und Fixierung der Folien beidseitig des Halters im Herstellungsprozess dienen. Dadurch ist die Ausschussware so gering wie möglich gehalten. Die Zentrierstifte haben funktional für die Messung und die Handhabung des Probenhalters keine Relevanz, sondern stellen eine reine Herstellungsoptimierung dar, indem sie als Montagehilfen eine exakte Positionierung der Deckfolie und Probenfolie beim Aufkleben auf den Probenhalter gewährleisten, so dass die Folien die Innen- und Außenbereiche des Probenhalters sauber abschließen. Durch entsprechend eingebrachte Löcher in den jeweiligen Folien, ist ein Verrutschen der Folien beim Kleben oder beim Umgang mit dem Halter ausgeschlossen.
Weiterhin weist der Halter in einer bevorzugten Ausfertigung auf dem äußeren Ring angeordnete Positionierungshilfen auf, die ein sicheres, schnelles und vor allem korrektes Verschließen der entsprechenden Kristallisationskavität sicherstellen. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den
Unteransprüchen genannten Merkmalen.
Die verschiedenen in dieser Anmeldung genannten Ausführungsformen der Erfindung sind, sofern im Einzelfall nicht anders ausgeführt, mit Vorteil miteinander kombinierbar.
Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Probenhalters in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Aufsicht auf die Seite der Deckfolie,
Figur 2 eine schematische Darstellung des Probenhalters in der bevorzugten
Ausführungsform in Aufsicht auf die Seite der Probenfolie,
Figur 3 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Probenhalters in der bevorzugten Ausführungsform in schräger Aufsicht auf die Seite der Probenfolie, mit aufgebrachter Deck- und Probenfolie,
Figur 4 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Probenhalters in der bevorzugten Ausführungsform in Aufsicht auf die Seite der Deckfolie, nach dem Abstreifen des äußeren Randelements.
Figur 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenhalter 1 in Aufsicht auf die Seite, auf der eine Deckfolie 6 auf das äußere Randelement 2 aufzubringen ist. Die Deckfolie ist in der Darstellung nicht vorhanden. In der gezeigten Ausführungsform weist der Probenhalter 1 eine Halterung 5 auf die an dem inneren Randelement 3 angeordnet ist und sich bis über das äußere Randelement 2 nach außen erstreckt. Das innere Randelement 3 und das äußere Randelement 3 sind über Streben 4 verbunden, welche den Probenhalter stabilisieren. An den Übergängen der Streben 4 zum inneren Randelement 3 und den Übergängen des äußeren Randelements 2 zur Halterung 5 sind Sollbruchstellen S integriert. Die Sollbruchstellen S sind hier als Verjüngung ausgeführt.
Figur 2 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenhalter 1 der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform in Aufsicht auf die Seite, auf der die Probenfolie 7 auf das innere Randelement aufzubringen ist. In dieser Ansicht, sind die am äußeren Randelement 2 vorgesehenen Anschläge 8, in Form von seitlichen Erhöhungen, sichtbar. Diese Erhöhungen sind in einem inneren und einem äußeren Umfang des äußeren Randelements 3 angeordnet und erstrecken sich auf der der Probenfolie 7 zugewandten Seite über die Höhe des äußeren Randelements 2. Die Anschläge 8 dienen der formschlüssigen Fixierung des Probenhalters bei der Verwendung als Deckel eines Kristallisationsgefäßes (nicht gezeigt). Zusätzlich sind Fixierstifte 9 auf dem inneren Randelement 3 angeordnet, die bei der Anordnung einer Probenfolie 7 behilflich sind.
Das Gerüst aus innerem Randelement 2, äußerem Randelement 3, Streben 4 und Halterung 5 ist vorzugsweise aus einem thermoplastische Kunststoff gefertigt, welcher zumindest in einem Temperaturbereich von -180 °C bis 160 °C temperaturstabil ist. Das Gerüst ist beispielsweise mittels eines 3-D Druckers (Temperatur bis 60 Grad) oder aber mittels Spritzguss herstellbar (deutlich höhere Temperatur möglich).
In der Figur 3 ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Probenhalters in der bevorzugten Ausführungsform in schräger Aufsicht auf die Seite der Probenfolie gezeigt, mit aufgebrachter Deckfolie 6 und Probenfolie 7. Auf dem inneren Randelement 3 ist eine Probenfolie 7 derart angeordnet, dass sie eine in der gezeigten Ausführungsform kreisförmige Grundfläche des inneren Randelements 3 überspannt. Die Probenfolie kann Perforationen aufweisen (nicht gezeigt).
Die Probenfolie 7 ist aus einem für Röntgenstrahlung möglichst transparenten Material gefertigt. Das Material der Probenfolie 7 sollte biologisch inert, röntgentransparent und möglichst dünn sein, also insbesondere eine Dicke von 40 pm nicht überschreiten, dickere Ausführungen sind jedoch nicht ausgeschlossen. Besonders geeignet sind Materialien die eine Lichtstreuung von weniger als 5 % sowie eine Transmission für sichtbares Licht von mindestens 90 % aufweisen. Besonders gute Ergebnisse konnten mit Polyimiden, wie Kapton®, sowie mit Cycloolefin Copolymeren erzielt werden.
Der erfindungsgemäße Probenhalter 1 kann mittels dem Halter 5 auf vertikalen oder aber horizontalen Goniometerköpfen angeordnet werden. Die Entfernung des äußeren Randelements 2 mitsamt der Deckfolie 6 kann entweder vor der Montage oder danach erfolgen.
In Figur 4 ist der erfindungsgemäße Probenhalter gezeigt, nachdem das äußere Randelement 2 durch Brechen der Sollbruchstellen S abgestreift wurde. Zurück bleiben lediglich die Halterung 5 und das innere Randelement 3. Dieses ist optimiert in der Dimension und Form zur Anordnung in einer Vorrichtung zur Kristallstrukturaufklärung. Üblicherweise bewegen sich die Dimensionen im Rahmen von 18 mm x 5 mm x 2,5 mm.
Bezugszeichenliste
Probenhalter
äußeres Randelement
inneres Randelement
Strebe
Halterung
Deckfolie
a Lasche
Probenfolie
Anschläge
Fixierstifte
Sollbruchstelle

Claims

Patentansprüche
1. Probenhalter (1) für den automatisierten Probenwechsel, mindestens umfassend
- ein äußeres umlaufendes Randelement (2) ,
- ein vom äußeren Randelement (2) beabstandetes inneres umlaufendes Randelement
(3) ,
- zumindest eine Strebe (4), die die beiden Randelemente (2, 3) miteinander verbindet,
- eine das äußere Randelement (2) überspannende Deckfolie (6),
- eine das innere Randelement (3) überspannende Probenfolie (7),
- wobei die beiden Folien (6, 7) voneinander beabstandet sind,
dadurch gekennzeichnet, dass
- an dem inneren Randelement (3) eine Halterung (5) angeordnet ist, die sich über das äußere Randelement (2) hinaus erstreckt,
- die zumindest eine Strebe (4), die die beiden Randelemente (2, 3) miteinander verbindet, an dem Übergang zum inneren Randelement (2) mit einer Sollbruchstelle (S) versehen ist und
- das äußere Randelement (2) an den Übergängen zu der Halterung (5) mit
Sollbruchstellen (S) versehen ist.
2. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem äußeren Randelement (2) mindestens eine weitere Sollbruchstelle (S) für den Bruch des äußeren Randelements (2) integriert ist.
3. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Form des äußeren Randelements (2) derart einer äußeren Form eines Deckels einer Kavität einer Microtitrierplatte nach ANSI-Standard entspricht, dass der
Probenhalter (1) als ein Deckel auf einer solchen Kavität anbringbar ist, insbesondere diese luftdicht verschließt.
4. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Randelement (2, 3) eine Höhe aufweist, die den Abstand zweier Grundflächen definiert, wobei die Deckfolie (6) und die Probenfolie (7) einander gegenüberliegenden Grundflächen des jeweiligen Randelements (2, 3) entsprechen.
5. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckfolie (6) eine T ransparenz für sichtbares Licht von mindestens 85% aufweist und/oder luft- und dampfundurchlässig ist.
6. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckfolie (6) mit dem äußeren Randelement (2) lösbar verbunden ist und insbesondere eine Lasche (6a) aufweist, die sich über den Rand des äußeren Randelements (2) hinaus erstreckt.
7. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenfolie (7) eine Perforation aufweist.
8. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenfolie (7) ein röntgentransparentes Material, insbesondere ein Polyimid oder ein Cycloolefin Copolymer umfasst oder aus einem solchen besteht.
9. Probenhalter (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung (5) an dem über das äußere Randelement herausragender Seite formschlüssig ausgeformt ist zur Aufnahme in einen Goniometerkopf.
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