WO2020059242A1 - 心不全の病態の評価方法 - Google Patents

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WO2020059242A1
WO2020059242A1 PCT/JP2019/025885 JP2019025885W WO2020059242A1 WO 2020059242 A1 WO2020059242 A1 WO 2020059242A1 JP 2019025885 W JP2019025885 W JP 2019025885W WO 2020059242 A1 WO2020059242 A1 WO 2020059242A1
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heart failure
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test animal
coa
succinyl
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PCT/JP2019/025885
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高田　真吾
前川　聡
卓 横田
亮介 白川
壽孝 佐邊
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国立大学法人北海道大学
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    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the pathology of heart failure, a method for evaluating a candidate compound for a medicament for treating heart failure, and a pharmaceutical composition used for treating or preventing heart failure.
  • Mitochondria play a central role in producing energy, and ATP is produced by oxidative phosphorylation. Mitochondrial oxidative phosphorylation is carried out by complexes I, II, III and IV constituting the electron transport system and complex V which is an ATP synthase. Among the complexes that constitute mitochondrial oxidative phosphorylation, complexes I, III, and IV constitute additional complexes, supercomplexes (SCs).
  • Complex II is a protein also called succinate dehydrogenase (SDH), and is composed of four subunits (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD). Complex II is a protein involved in both the TCA cycle and the electron transport system. It is unique in that it does not function as a proton pump, the only protein constituting the electron transport system, and does not contain proteins encoded by the mitochondrial genome. It is a protein with various characteristics.
  • the present invention provides a method for evaluating the pathology of heart failure based on a new mechanism of action for heart failure, a method for evaluating a candidate compound for a medicament for treating heart failure using the mechanism of action, and
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing heart failure utilizing a mechanism.
  • the present inventors have found that in myocardial infarction model mice after myocardial infarction, myocardial mitochondrial function is reduced in a function-dependent manner of mitochondrial complex II, and that this reduction involves reduction of succinyl-CoA.
  • the present inventors have found that administration of succinyl-CoA to isolated mitochondria of mice improves mitochondrial function, thereby completing the present invention.
  • the present inventors have found that in chronic heart failure, the respiratory ability (oxidative phosphorylation ability) of mitochondrial complex II of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is lower in the severely ill patients than in the mildly ill patients.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present inventors have found that a large amount of reactive oxygen species (ROS) is released from, and that the severity of heart failure can be evaluated using these as an index, thereby completing the present invention.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present invention is as follows.
  • the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from a test animal, the respiratory capacity of mitochondrial complex II of peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal, or the peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal Measure the amount of reactive oxygen species released from the sphere,
  • a method for evaluating the pathology of heart failure comprising evaluating the presence or absence of heart failure or the severity of heart failure in the test animal based on the obtained measurement value.
  • the test animal has unknown onset of heart failure, and measures the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from the test animal; The method of [1], wherein the test animal is evaluated to be highly likely to have developed heart failure when the obtained measured value is less than a predetermined reference value.
  • the test animal has been confirmed to have developed heart failure, and the respiratory ability of mitochondrial complex II of peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal is measured. When the obtained measurement value is less than a predetermined reference value, the heart failure of the test animal is evaluated to be highly likely to be severe, The method of [1], wherein the heart failure of the test animal is evaluated to be highly likely to be mild when the measured value is equal to or greater than the reference value.
  • the test animal has been confirmed to have developed heart failure, and measures the respiratory ability of mitochondrial complex II of peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal, The obtained measurement value is lower than the measurement value of the respiratory ability of mitochondrial complex II of peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal before the time of collection of the peripheral blood mononuclear cells.
  • the method of [1] wherein the heart failure of the test animal is highly likely to be severe.
  • the test animal is confirmed to have developed heart failure, and measures the amount of reactive oxygen species released from peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal, When the obtained measurement value is higher than a predetermined reference value, it is evaluated that heart failure of the test animal is highly likely to be severe,
  • the test animal has been confirmed to have developed heart failure, and measures the amount of reactive oxygen species released from peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal, The obtained measurement value is greater than the measurement value of the amount of reactive oxygen species released from peripheral blood mononuclear cells collected from the test animal before the time of collection of the peripheral blood mononuclear cells.
  • the method of [1], wherein the heart failure of the test animal is highly likely to be severe.
  • [13] Contacting a candidate compound with a cell and measuring the respiratory ability of mitochondrial complex II of the cell or the amount of reactive oxygen species released from the cell, A method for evaluating a candidate compound for a medicament for treating heart failure, comprising evaluating the usefulness of the candidate compound as a medicament for treating heart failure based on the obtained measurement values.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound having an action of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes as an active ingredient and used for treating or preventing heart failure.
  • the method for evaluating the pathology of heart failure according to the present invention the presence or absence of heart failure in a test animal and the severity of heart failure can be evaluated. Further, the pharmaceutical composition according to the present invention is useful for treating or preventing heart failure.
  • FIG. 4 is a diagram showing survival curves of an HF model mouse and a control mouse in Reference Example 1.
  • FIG. 7 is a diagram showing echo data of an HF model mouse and a control mouse in Reference Example 1.
  • Reference Example 1 it is a figure showing the results of Western blot of mitochondrial proteins in the myocardium of HF model mice and control mice.
  • Reference Example 1 it is a figure showing the measurement results of the relative content of mitochondrial protein in the myocardium of the HF model mouse and the control mouse.
  • Example 1 the amount of ATP in the myocardial fiber tissue of the HF model mouse and the control mouse (A), the respiratory ability (CI + II_OXPHOS) related to the mitochondrial complex I and the mitochondrial complex II in the myocardial fiber tissue (B), Respiratory capacity associated with mitochondrial complex II in myocardial fibrous tissue (CII_OXPHOS) (C), respiratory capacity associated with mitochondrial complex II in mitochondria isolated from heart (CII_OXPHOS) (D), and isolated from heart It is a figure showing the measurement result of respiratory capacity (CI_OXPHOS) (E) related to mitochondrial complex I in the mitochondria subjected to the measurement.
  • Example 7 is a diagram showing the measurement results of the relative contents of succinate (A), succinyl-CoA (B), and ⁇ -ketoglutarate (C) in cardiac muscle tissues of an HF model mouse and a control mouse in Example 1. is there.
  • Example 1 the results of Western blot analysis of mitochondrial proteins (A), the relative content of SUCLA2 (B), and the relative content of SUCLG1 (C) of the mitochondrial protein isolated from the myocardium of the HF model mouse and the control mouse were determined.
  • FIG. 3 is a view showing the measurement results of the amount (C) and the relative content (D) of ⁇ -OHB in plasma.
  • Example 1 the results of Western blot of mitochondrial proteins isolated from myocardium of HF model mouse and control mouse (A), relative content of ALAS1 in mitochondria (B), and relative content of mitochondrial heme (C)
  • FIG. 5 is a diagram showing the measurement results of FIG. In Example 1, it is the figure which showed the result (A) of the western blot of the mitochondrial protein isolated from the cardiac muscle of HF model mouse and control mouse, and the measurement result of the relative content of SIRT5 in mitochondria (B).
  • Example 1 Western blot results of mitochondrial proteins isolated from the left ventricle of wild-type mice after incubation in the presence of various concentrations of succinyl-CoA (A), and succinylation levels of mitochondrial proteins (B
  • FIG. 7 is a diagram showing the measurement results of FIG. FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the respiratory ability of mitochondria associated with mitochondrial complex II isolated from the left ventricle of a wild-type mouse in Example 1.
  • Example 1 the result of Western blot of the protein after adding and incubating succinyl-CoA to mitochondria isolated from the HF model mouse (A), succinylation level of mitochondrial protein (B), and mitochondrial complex II It is a figure showing a measurement result of respiratory ability (C) related to.
  • Example 1 results of Western blot of mitochondria proteins isolated from control mice and HF model mice, and mitochondria proteins isolated from HF model mice and treated with 1 mM succinyl-CoA (A), and mitochondrial complex
  • FIG. 8 is a view showing a measurement result of respiratory ability (B) related to body II.
  • the results of Western blot of mitochondrial protein in H9c2 cells treated with glycine or glycine and succinyl-CoA (A), succinylation level of mitochondrial protein (B), and respiratory activity related to mitochondrial complex II It is the figure which showed the measurement result of (C).
  • Example 2 after mitochondria isolated from the HF model mouse were added with ALA and incubated, respiratory activity (A) related to mitochondrial complex II, succinic acid, a substrate of mitochondrial complex II, was maximized. Respiratory capacity associated with mitochondrial complex II when loaded (B), respiratory capacity associated with mitochondrial complex I (C), respiratory capacity associated with mitochondrial complex I and mitochondrial complex II (D), and FIG. 7 is a view showing the measurement results of respiratory ability (E) related to mitochondrial complex IV. In Example 2, it is the figure which showed the measurement result of the left ventricle diameter shortening rate (% FS) obtained by the echocardiography about the HF model mouse which does not administer ALA, and the HF model mouse which administers ALA.
  • % FS left ventricle diameter shortening rate
  • Example 2 it is the figure which showed the measurement result of exercise ability (exercise time x body weight) about the HF model mouse which does not administer ALA, and the HF model mouse which administers ALA.
  • Example 3 the results of the measurement of the respiratory function related to mitochondrial complex II of PBMC collected after a cardiopulmonary exercise test for the mild heart failure group (NYHA III-II group) and the severe heart failure group (NYHA III group) are shown.
  • FIG. In Example 3 a graph showing the results of measuring the amount of hydrogen peroxide released from PBMC collected after a cardiopulmonary exercise test for the mild heart failure group (NYHA III-II group) and the severe heart failure group (NYHA III group) It is.
  • the method for evaluating the pathology of heart failure measures the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from a test animal and, based on the obtained measurement value, indicates the occurrence of heart failure in the test animal. It is a method for evaluating the presence or absence or the severity of heart failure. For example, when it is unknown whether the test animal has developed heart failure, and the measured value of the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from the animal is less than a predetermined reference value set in advance. The test animal can be evaluated as having a high possibility of developing heart failure.
  • the measured value of the amount of succinyl-CoA in the cardiomyocytes is equal to or higher than a predetermined reference value, it can be evaluated that the test animal has a low possibility of developing heart failure.
  • the measured value of the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from the animal is a predetermined reference value. When the value is less than the value, it can be evaluated that the heart failure of the test animal is highly likely to be severe. Conversely, when the measured value of the amount of succinyl-CoA in the cardiomyocytes is equal to or higher than a predetermined reference value, heart failure of the test animal is less likely to be severe, or more likely to be mild. Can be evaluated.
  • the reference value used when evaluating the measured value of the succinyl-CoA amount of the cardiomyocyte can be appropriately set in consideration of the type of the method of measuring the succinyl-CoA amount and by performing necessary preliminary tests and the like. . For example, from the results of other test methods, it was confirmed that the measured value of the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from a test animal confirmed not to have developed heart failure, and that heart failure had developed By comparing the measured value of the amount of succinyl-CoA in myocardial cells collected from the test animal, a threshold for discriminating between a group that has developed heart failure and a group that has not developed heart failure is appropriately set, This can be used as a reference value.
  • the method for measuring the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes is not particularly limited as long as the method is capable of quantitatively or semi-quantitatively measuring organic compounds in cells, and is used for detecting organic compounds in a sample. It can be appropriately selected from known methods and used. Each method can be performed by a conventional method. For example, first, a myocardium collected from a test animal is homogenized with a polar solvent, for example, a mixed solvent of alcohol and water, to extract various organic compounds including succinyl-CoA. The obtained extract is subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) to separate succinyl-CoA from other organic compounds. Based on the peak area value of the succinyl-CoA peak in the obtained chromatograph, the amount of succinyl-CoA can be measured by an ordinary method.
  • a polar solvent for example, a mixed solvent of alcohol and water
  • Mitochondrial dysfunction and oxidative stress play important roles in the development of heart failure.
  • the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC and the amount of ROS released from PBMC depend on the severity of heart failure. Specifically, as the severity of heart failure is higher, the respiratory ability of mitochondrial complex II of PBMC tends to decrease, and the amount of ROS released from PBMC tends to increase. Also, in animals that have developed heart failure, the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC tends to be lower than before the onset of heart failure, and the amount of ROS released from PBMC tends to increase.
  • the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC and the amount of ROS released from PBMC depend on the pathology of heart failure, specifically, the occurrence or possibility of heart failure, and the severity or possibility of heart failure.
  • the biomarker is useful as a biomarker used to evaluate the disease and the like, and the pathology of heart failure can be evaluated based on the biomarker.
  • the evaluation method is particularly suitable for evaluating chronic heart failure.
  • the method for evaluating the pathological condition of heart failure includes measuring the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC collected from a test animal or the amount of ROS released from PBMC, and the obtained measured value. And a method for evaluating the presence or absence of heart failure in the subject animal or the severity of heart failure based on the above.
  • the obtained measured value can be evaluated based on a predetermined reference value set in advance.
  • the test animal when the test animal is unknown whether the onset of heart failure, the measured value of the respiratory ability of mitochondrial complex II of PBMC collected from the animal is less than a predetermined reference value set in advance In this case, the test animal can be evaluated as having a high possibility of developing heart failure. Conversely, when the measured value of the respiratory ability of the mitochondrial complex II of PBMC is equal to or higher than a predetermined reference value, it is evaluated that the test animal is less likely to have developed heart failure. Can be. Further, when the test animal is an animal that has been confirmed to have developed heart failure, the measured value of the respiratory ability of mitochondrial complex II of PBMC collected from the animal was set in advance.
  • the value is less than the predetermined reference value, it can be evaluated that heart failure of the test animal is highly likely to be severe. Conversely, when the measured value of the respiratory function of mitochondrial complex II of PBMC is equal to or higher than a predetermined reference value, heart failure of the subject animal is unlikely to be severe or may be mild. Can be evaluated as high.
  • the measured value of the amount of ROS released from PBMC collected from the animal exceeds a predetermined reference value set in advance. Can be evaluated as having a high possibility that the test animal has developed heart failure. Conversely, when the measured value of the amount of ROS released from the PBMC is equal to or less than a predetermined reference value, it can be evaluated that the test animal has a low possibility of developing heart failure. . Further, when the test animal is an animal that has been confirmed to have developed heart failure, the measured value of the amount of ROS released from PBMC collected from the animal is a predetermined predetermined value. When the value exceeds the reference value, it can be evaluated that heart failure of the test animal is highly likely to be severe. Conversely, when the measured value of the amount of ROS released from the PBMC is equal to or less than a predetermined reference value, the heart failure of the subject animal is unlikely to be severe or may be mild. Can be evaluated as high.
  • the measured value of the respiratory activity of mitochondrial complex II of PBMC collected from the test animal was the respiratory activity of mitochondrial complex II of PBMC collected from the same test animal before the time of collection of the PBMC. If the measured value is lower than the measured value, it is evaluated that heart failure of the subject animal is highly likely to have become severe. Similarly, the measured value of the amount of ROS released from PBMC collected from the test animal is larger than the measured value of the amount of ROS released from PBMC collected from the same test animal before the time of collection of the PBMC. If so, it is evaluated that heart failure of the subject animal is highly likely to be severe.
  • the reference value used in evaluating the measured value of the respiratory function of mitochondrial complex II of PBMC is determined by taking into account the type of the method of measuring the respiratory function of mitochondrial complex II and performing necessary preliminary tests. Can be set as appropriate. Similarly, the reference value used when evaluating the measured value of the ROS amount released from the PBMC is appropriately set in consideration of the type of the method of measuring the ROS amount and by performing necessary preliminary inspections and the like. be able to.
  • the measured value of the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC collected from a test animal that has not been confirmed to have developed heart failure or the amount of ROS released from PBMC Developing heart failure by comparing the measured respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC or the amount of ROS released from PBMC collected from a test animal confirmed to have developed heart failure
  • a threshold for discriminating between the affected group and the unaffected group can be set as appropriate, and this can be used as a reference value.
  • respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC collected from a test animal confirmed that heart failure has developed but is not severe, that is, mild
  • the measured value of the amount of ROS released from PBMC and the measured value of the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC collected from the test animal confirmed to have severe heart failure or the amount of ROS released from PBMC
  • a threshold for discriminating between the mild heart failure group and the severe heart failure group can be appropriately set, and can be used as a reference value.
  • PPBMC can be collected from the test animal by a conventional method such as density gradient centrifugation from the collected blood.
  • the measurement of the respiratory ability of the mitochondrial complex II of the collected PBMC can be performed by a conventional method such as a high-resolution respiration measurement method. It is preferable to use a device such as a mitochondrial oxygen activity / cell metabolic energy analyzer for measuring the respiratory ability of mitochondrial complex II of PBMC by high-resolution respirometry.
  • the measurement of the amount of ROS released from PBMC can be performed by a conventional method such as fluorescence spectroscopy.
  • the subject test animals to be used as the diagnostic markers for evaluating the succinyl-CoA content of cardiomyocytes, the respiratory capacity of mitochondrial complex II of PBMC, or the ROS content released from PBMC as a diagnostic marker for evaluating the pathology of heart failure are particularly limited. However, it may be a human or an animal other than a human. Non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters, guinea pigs, and birds such as chickens, quails, ducks, and the like.
  • the method for treating heart failure is a method for increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes in an animal that has developed heart failure. For example, by administering an effective amount of a compound having an effect of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes to an animal that has developed heart failure, the pathology of heart failure in the animal can be improved. Further, by administering an effective amount of a compound having an action of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes to an animal that may develop heart failure, the animal can be prevented from developing heart failure. .
  • a compound having an action of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition used for treating or preventing heart failure.
  • the compound those capable of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes to 110% or more, preferably 100% or more, when the amount of succinyl-CoA in the cells before administration is set to 100%, are preferable. More preferably, those that can be increased to 150% or more are further preferable.
  • Examples of the compound having an action of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes include succinyl-CoA, 5-aminolevulinic acid (ALA), a derivative of ALA, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • a derivative of ALA or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutically acceptable salt of ALA, the derivative of ALA, and the pharmaceutically acceptable salt of the derivative of ALA for example, those described in WO 2010/050179 can be used.
  • compositions for treating heart failure containing, as an active ingredient, a compound having an action of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes and used for treating or preventing heart failure.
  • the administration route is not particularly limited.
  • the administration route of the pharmaceutical composition includes oral administration, transdermal administration, nasal administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, enema administration and the like.
  • the pharmaceutical composition for treating heart failure can be prepared by a usual method, such as powders, granules, capsules, tablets, chewables, solid preparations such as sustained-release preparations, solutions, syrups, etc., injections, and sprays. , A patch, an ointment and the like.
  • the pharmaceutical composition is preferably an orally administrable solid preparation.
  • composition for treating heart failure is a compound having an effect of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes as an active ingredient, if necessary in the formulation, excipients, binders, lubricants, disintegrants, Formulated by blending fluidizing agents, solvents, dissolution aids, buffers, suspending agents, emulsifiers, tonicity agents, stabilizers, preservatives, antioxidants, flavoring agents, coloring agents, etc.
  • excipient examples include lactose, glucose, sugars such as D-mannitol, starch, celluloses such as crystalline cellulose, sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, xylitol, dicalcium phosphate, calcium carbonate, kaolin and the like.
  • binder examples include pregelatinized starch, gelatin, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, D-mannitol, trehalose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and polyvinyl alcohol.
  • Examples of the lubricant include stearic acid, calcium stearate, talc, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol and the like.
  • Disintegrators include crospovidone (cross-linked polyvinyl pyrrolidone), low-substituted hydroxypropylcellulose, starch, alginic acid, sodium alginate and the like.
  • Examples of the fluidizing agent include silicic acid, silicic anhydride, aluminum silicate, calcium silicate, magnesium metasilicate aluminate compound, aluminum oxide, aluminum hydroxide, magnesium oxide, magnesium hydroxide and the like.
  • Examples of the solvent include purified water, physiological saline, and the like.
  • solubilizer examples include dextran, polyvinylpyrrolidone, sodium benzoate, ethylenediamine, salicylic acid amide, nicotinic acid amide, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil derivative.
  • buffer examples include sodium citrate hydrate, sodium acetate hydrate, sodium hydrogen carbonate, trometamol, boric acid, borax, sodium hydrogen phosphate hydrate, sodium dihydrogen phosphate, and the like.
  • suspending agent or emulsifier examples include sodium lauryl sulfate, gum arabic, gelatin, lecithin, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose such as sodium carboxymethyl cellulose, polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and the like.
  • tonicity agent examples include sugars such as lactose, glucose, D-mannitol, sodium chloride, potassium chloride, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, and urea.
  • stabilizer examples include polyethylene glycol, dextran sodium sulfate, sodium sulfite, and the like.
  • preservatives include p-hydroxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, chlorocresol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Antioxidants include sulfites, ascorbic acid and the like.
  • Flavoring agents include sweeteners, flavors and the like usually used in the pharmaceutical and food fields.
  • Coloring agents include coloring agents commonly used in the pharmaceutical and food fields.
  • the pharmaceutical composition may contain other active ingredients as long as the effect of increasing the amount of succinyl-CoA on cardiomyocytes is not impaired.
  • active ingredients for example, substances that are expected to have a therapeutic effect on heart failure, such as a therapeutic agent for heart failure that targets an amount other than succinyl-CoA for cardiomyocytes, and the like can be mentioned.
  • the subject animal to be treated or prevented for heart failure by the pharmaceutical composition for treating heart failure is not particularly limited, and may be a human or non-human animal.
  • Non-human animals include the same animals as those mentioned above.
  • the dose of the pharmaceutical composition for treating heart failure may be any amount that is sufficient to increase the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes of the administered animal than before administration. , Gender, age, body weight, diet, mode of administration, presence or absence of other diseases, and the like.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition for treating heart failure for an adult is preferably 0.01 to 5000 mg as a compound having an effect of increasing the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes as an active ingredient, 0.1-3000 mg is more preferable, and 1-1000 mg is still more preferable.
  • Such a dose can be administered once or in several divided doses.
  • ⁇ Evaluation method of candidate compounds for drugs for treating heart failure Pharmaceuticals used for treating or preventing heart failure (medicines for treating heart failure), based on an increase in the amount of succinyl-CoA in cells, an increase in respiratory capacity of mitochondrial complex II in cells, or a decrease in the amount of ROS released from cells. ) Can be screened for active ingredients.
  • the method for evaluating a candidate compound for a medicament for treating heart failure comprises contacting a cell with a candidate compound to obtain a succinyl-CoA amount of the cell, mitochondrial complex II of the cell, or the cell This is a method for measuring the amount of ROS released from, and evaluating the usefulness of the candidate compound as a medicament for treating heart failure based on the obtained measurement value.
  • the amount of succinyl-CoA in cells, the respiratory capacity of mitochondrial complex II of cells, or the amount of ROS released from cells are the amount of succinyl-CoA in cardiomyocytes collected from the animal, the respiratory capacity of mitochondrial complex II in cells, Alternatively, it can be measured in the same manner as the measurement of the amount of ROS released from cells.
  • the cells used in the evaluation method may be primary subculture, but are preferably cultured cells from the viewpoint of stability of the evaluation method.
  • the cultured cells are preferably cultured cells derived from myocardium, more preferably cultured cells derived from mammalian myocardium, and human cardiac muscle is preferably used. More preferably, it is a cultured cell of origin.
  • the cultured cell is preferably a cultured cell derived from a blood cell line containing PBMC. Cultured cells derived from mammalian blood cells are more preferable, and cultured cells derived from human blood cells are more preferable.
  • cells used in the evaluation method are preferably cells with reduced mitochondrial complex II function.
  • Examples of cells in which the function of mitochondrial complex II is reduced include cells in which cells used for evaluation have been treated with glycine in advance.
  • Glycine treatment like heart failure, reduces mitochondrial succinylation levels and reduces mitochondrial complex II-related respiratory capacity. Glycine treatment can be performed by culturing in a glycine-containing medium.
  • the method of bringing the candidate compound into contact with the cells is not particularly limited.
  • a candidate compound can be brought into contact with a cell by adding the candidate compound to a cell culture medium.
  • the candidate compound When the increase in the amount of succinyl-CoA in the cells is used as an index, when the measured value of the amount of succinyl-CoA in the cells treated with the candidate compound is equal to or higher than a predetermined reference value, the candidate compound is treated with heart failure. It can be evaluated as being useful as an active ingredient of a therapeutic drug. Conversely, when the measured value of the amount of succinyl-CoA in the cells treated with the candidate compound is less than a predetermined reference value, the candidate compound is not useful as an active ingredient of a medicament for treating heart failure. Can be evaluated.
  • the reference value used for evaluating a candidate compound in the method for evaluating a candidate compound uses the increase in the amount of succinyl-CoA as an index, the type of measurement method for the amount of succinyl-CoA, the type of cell used, etc. Then, it can be set as appropriate by performing necessary preliminary inspections and the like.
  • a measured value of the amount of succinyl-CoA in a cell treated with a compound that has been confirmed to have an effect of increasing the amount of succinyl-CoA in a cell from the results of other test methods The measured value of the amount of CoA is compared, and a threshold value for distinguishing a cell group treated with the compound from an untreated cell group is appropriately set, and this can be used as a reference value.
  • Compounds that have been confirmed to have the effect of increasing the amount of succinyl-CoA in cells include succinyl-CoA, ALA, ALA derivatives, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the measured value of the respiratory capacity of the mitochondrial complex II of the cell treated with the candidate compound is equal to or greater than a predetermined reference value set in advance. Can be evaluated as being useful as an active ingredient of a medicament for treating heart failure. Conversely, when the measured value of mitochondrial complex II respiratory activity of cells treated with the candidate compound is less than a predetermined reference value, the candidate compound is useful as an active ingredient of a medicament for treating heart failure Not, can be evaluated.
  • the candidate The compound can be evaluated as being useful as an active ingredient of a medicament for treating heart failure. Conversely, when the measured value of the amount of ROS released from the cells treated with the candidate compound exceeds a predetermined reference value, the candidate compound is not useful as an active ingredient of a medicament for treating heart failure. , Can be evaluated.
  • the reference value used when evaluating the candidate compound in the method for evaluating a candidate compound is determined by the type of the method for measuring the respiratory capacity of mitochondrial complex II. It can be set appropriately by taking into account and performing necessary preliminary inspections and the like. For example, a measured value of the respiratory capacity of mitochondrial complex II of cells treated with a compound that has been confirmed to have an action to increase the respiratory capacity of mitochondrial complex II of cells from the results of other test methods, Compare the measured value of the respiratory ability of mitochondrial complex II of the cells before treatment with the compound, appropriately set a threshold value for distinguishing the cell group treated with the compound from the untreated cell group, and set this as a reference. It can be a value.
  • the reference value used for evaluating the candidate compound in the method for evaluating a candidate compound is determined by considering the type of the method for measuring the amount of ROS and the like. By performing a preliminary inspection and the like, it can be set as appropriate. For example, a measured value of the ROS amount of a cell treated with a compound that has been confirmed to have an action of lowering the ROS amount of a cell from the results of other test methods, and a measurement of the ROS amount of the cell before the treatment with the compound. By comparing the measured value with the measured value, a threshold value for discriminating a cell group treated with the compound from an untreated cell group can be appropriately set, and this can be used as a reference value.
  • Echocardiography was performed under anesthesia (abvertin 8 ⁇ L / g BW, intraperitoneal administration) with a short-acting type and little cardiac suppression.
  • the extremities and tail were fixed with tape on the examination table in a supine position, and the anterior chest wall of the mouse was shaved with shaving cream.
  • an ultrasonic diagnostic apparatus and a 12 MHz linear probe an optimal image was drawn at the level of the 2D parasternal short axis papillary muscle.
  • Mitochondrial isolation from mice was performed as follows. First, hearts excised mice were sacrificed under anesthesia (left ventricle) is a tissue preservation solution BIOPS (2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 5.77mM Na 2 ATP, 6.56mM MgCl After immersion in 2 / 6H 2 O, 20 mM Taurine, 15 mM Na 2 phosphocreatine, 20 mM Imidazole, 0.5 mM Dithiothreitol, 50 mM MES hydrate, pH 7.1, an isolation buffer for tissue (100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose, 100 mM Sucrose,
  • a protease was added to the shredded product to carry out an enzymatic reaction, and then homogenized. The resulting homogenized solution was centrifuged to remove the supernatant, and the precipitate was washed twice with a tissue isolation buffer. A suspension buffer (225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) was added to the precipitate after washing to dissolve it.
  • a suspension buffer 225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
  • Cell membrane permeation treatment of myocardial fibrous tissue collected from a mouse was performed as follows. The myocardium removed from the post-euthanized mouse was immediately immersed in BIOPS cooled with ice, and the surrounding tissue was removed as much as possible in the BIOPS. Next, the myocardial fibers were loosened using two 18-gauge injection needles in BIOPS, and then shaken in a BIOPS solution containing saponin (surfactant) for 30 minutes to perform a cell membrane permeation treatment.
  • the myocardial fibers after the cell membrane permeation treatment were immersed in MiR05 buffer (0.5 mM EGTA, 3 mM MgCl 2 , 20 mM Taurine, 10 mM KH 2 PO 4 , 20 mM HEPES, 110 mM Sucrose, 60 mM Potassium lactobionate, 1 g / L BSA) for 10 minutes. Thereafter, a washing treatment for removing the supernatant was performed twice.
  • MiR05 buffer 0.5 mM EGTA, 3 mM MgCl 2 , 20 mM Taurine, 10 mM KH 2 PO 4 , 20 mM HEPES, 110 mM Sucrose, 60 mM Potassium lactobionate, 1 g / L BSA
  • Mitochondrial respiratory capacity (oxidative phosphorylation capacity: OXPHOS) was measured by high-resolution respirometry. Specifically, using an isolated mitochondria (50 to 100 ⁇ g) or a myocardial fibrous tissue (1.5 to 3 mg) after cell membrane permeation treatment as a test sample, a mitochondrial oxygen activity / cell metabolic energy analyzer (product name: Using "OROBOROS Oxygraph-2k” (manufactured by Innsbruck) (hereinafter sometimes referred to as "mitochondrial respiratory measurement apparatus”), the measurement was carried out at 37 ° C in accordance with the following protocol. Oxygen consumption was calculated using Datlab software, with corrections made per tissue weight or per mitochondria.
  • Mitochondria-related respiration was stopped by adding 2.5 ⁇ mol / L of antimycin A, an inhibitor of mitochondrial complex II (ROX).
  • ROX an inhibitor of mitochondrial complex II
  • Respiratory ability was measured when 2 mmol / L of ascorbic acid, a substrate of mitochondrial complex IV, and 0.5 mmol / L of TMPD (N, N, N ', N'-tetramethyl-p-phenylendiamine) were added. .
  • TMPD N, N, N ', N'-tetramethyl-p-phenylendiamine
  • LC-MS liquid chromatography mass spectrometry
  • LCMS-8040 high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry
  • the mobile phases were eluent A (15 mM acetic acid, 10 mM tributylamine, 3% methanol) and eluent B (100% methanol).
  • the eluent B concentration was gradually increased as follows: the eluent B concentration was 0% in 0 to 6 minutes, and the eluent B concentration was linear from 0% to 90% in 6 to 26 minutes.
  • the eluent B concentration was then reduced to 0% for 26-41 minutes.
  • the flow rate was 0.3 mL / min
  • the column oven temperature was 40 ° C.
  • the parameters for electrospray ionization were as follows: drying gas flow rate 15 L / min; nebulizer gas flow rate 3 L / min; heating gas 10 L / min.
  • Desolvation line temperature 250 ° C .
  • heat block temperature 400 ° C .
  • collision gas 230 kPa.
  • Data analysis used Labsolutions ⁇ software ⁇ (manufactured by Shimadzu Corporation), and the signal intensity was based on the MES signal.
  • PCA 6M perchloric acid
  • Myocardial mitochondrial heme was measured using a QuantiChrom® Heme Assay Kit (DIHM-250, BioAssay Systems). Specifically, first, mitochondria were isolated from myocardium collected from a mouse, and a sample solution having a protein concentration of 100 ⁇ g / 50 ⁇ L was prepared. Next, 50 ⁇ L of the sample solution and 200 ⁇ L of Reagent were added to the wells of the 96-well plate, and the absorbance at a wavelength of 400 nm was measured using a microplate reader. As a control, the absorbance was similarly measured using the Calibrator attached to the kit. The control heme concentration was 62.5 ⁇ M, and the mitochondrial heme concentration of the sample was calculated based on the measured absorbance.
  • DIHM-250 QuantiChrom® Heme Assay Kit
  • the mitochondrial protein succinylation assay was performed as follows. Succinyl-CoA (0, 0.3, 1, 3, or 10 mM) was added to mitochondria isolated from tissues or cells, and left at 30 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the level of mitochondrial protein succinylation was measured by Western blotting (WB).
  • WB Western blotting
  • ⁇ Desuccinylation assay of mitochondrial protein The desuccinylation assay of mitochondrial proteins was performed by adding the protein to be succinylated and measuring the succinylation level of the protein. Protein succinylation levels were measured by LC / MS / MS.
  • lysine When lysine was used, lysine (1.0 or 10 mM) was added to mitochondria isolated from mouse myocardium and incubated for 15 minutes. Taking into account the effect of pH change by adding lysine, HCl was added to adjust the pH. Thereafter, the level of mitochondrial protein succinylation was measured by WB.
  • SIRT5 When SIRT5 is used, recombinant SIRT5 (20 ⁇ g) and NAD (5 mM) are added to mitochondria isolated from mouse myocardium, succinyl-CoA (0, 3, or 10 mM) is further added, and the mixture is treated at 60 ° C at 37 ° C. Let stand for minutes. Thereafter, the level of mitochondrial protein succinylation was measured by WB.
  • glycine When glycine was used, glycine was added to the culture medium of the cultured H9c2 cells to a concentration of 100 mM and cultured for 6 hours. After the culture, the cells were collected, and mitochondria were isolated. Thereafter, the level of mitochondrial protein succinylation was measured by WB.
  • Statistical processing was performed using GraphPad Prism 7 software (manufactured by Graphpad Software). Data are shown as mean ⁇ standard error. The test of the difference between the mean values of the two groups was performed by the Student's t test. The test for the difference between the mean values of the multiple groups was performed using a one-way analysis of variance. When a significant difference was found, a multiple comparison test was performed by the Tukey method or the Dunnett method. A P value ⁇ 0.05 was determined to be statistically significant. In the drawings, asterisks indicate values that are statistically significant.
  • HF model mouse used in the subsequent experiments was prepared as follows.
  • Myocardial infarction (MI) was induced by ligating the left anterior descending coronary artery of the heart of male 10-12 week old C57BL / 6J mice weighing 23-26 g.
  • the body weight of the mouse was measured before the operation, and a mixed anesthetic of 0.3 mg / kg BW of medetomedine hydrochloride, 4.0 mg / kg BW of midazolam, and 5.0 mg / kg BW of butorphanol tartrate was intraperitoneally administered to obtain a sufficient depth of anesthesia. I confirmed that.
  • the mouse was fixed on the operating table with its extremities and tail fixed with tape, and the incisor was pulled with silk thread for tracheal intubation, and the neck was fixed in the extended position. After incision of the skin from the midline of the neck, the submandibular gland and pretracheal muscle were developed, and it was confirmed under direct vision that a 23-gauge polyethylene tube passed through the translucent tracheal cartilage while keeping the trachea straight. Thereafter, it was connected to a volume-controlled experimental animal ventilator, and artificial ventilation was started 110 times each time with a tidal volume of 0.4 mL, and it was confirmed that the anterior chest was well lifted during insufflation.
  • Disinfection was performed with 70% alcohol, and the operation was performed under a stereoscopic microscope. After incision of the left precordium, the pectoralis major and small pectoralis muscles were towed and preserved, exposing the intercostal muscles. After incising the intercostal muscle at the fourth intercostal space, the visual field was developed with a thoracotomy device to confirm the heart. After incision of the pericardium, the heart was turned counterclockwise to confirm the running of the left coronary artery, and the instrument was tied using 8-0 silk suture about 0.5 mm distal from the lower edge of the left atrial appendage. .
  • the creation of MI was confirmed by confirming the change in color tone of the myocardium distal to the ligated part from red to white. Thereafter, the wound was closed with 4-0 silk suture, and the operation was completed. The mice in the control group underwent Sham surgery. For this, a procedure was performed except for ligating the left coronary artery from the above series of procedures.
  • Echocardiography was performed on HF model mice and control mice on day 28 after surgery, and the heart rate (HR: bpm), left ventricular end diastolic diameter (LVDd: mm), left ventricular end systolic diameter (LVDs: mm) , Left ventricle front wall thickness (LVAWT: mm), left ventricle rear wall thickness (LVPWT: mm), and left ventricle diameter reduction rate (% FS).
  • HR heart rate
  • RVDd left ventricular end diastolic diameter
  • LVDs left ventricular end systolic diameter
  • % FS left ventricle diameter reduction rate
  • FIG. 1 shows the survival curves of the HF model mouse and the control mouse.
  • the survival rate (%) of the HF model mouse group 3 to 4 weeks after myocardial infarction was significantly lower than that of the control mouse group, and was about 50%.
  • FIG. 2 shows the echo data of the HF model mouse and the control mouse 28 days after the operation.
  • the anterior wall of the left ventricle was thinned, and the posterior wall was enlarged in compensation.
  • EDD end-diastolic diameter
  • FIG. 3 shows the results of Western blot of each mitochondrial protein.
  • FIG. 4 shows the measurement results of the relative content of each mitochondrial protein (the control mouse content is 1) calculated based on the band intensity in the Western blot of FIG.
  • the content of all mitochondrial proteins was reduced, and it was confirmed that the mitochondrial amount was reduced in the cardiac muscle of the HF model mouse.
  • Example 1 HF model mice were analyzed to examine the relationship between the pathology of heart failure and the function of the mitochondrial complex.
  • myocardial fibrous tissues were collected from HF model mice and control mice, and the amount of ATP in myocardial fibrous tissues, the respiratory capacity related to mitochondrial complex I and mitochondrial complex II (CI + II_OXPHOS), and mitochondrial complex II
  • the respiratory capacity (CII_OXPHOS) and the respiratory capacity related to mitochondrial complex II (CII_OXPHOS) and the mitochondrial complex I in mitochondria isolated from the heart (CI_OXPHOS) were measured.
  • the respiratory ability related to mitochondrial complex I and the respiratory ability related to mitochondrial complex II were compared in the myocardial tissue of control mice.
  • FIG. 5 shows the results. In the HF model mouse, the myocardial ATP level was decreased (FIG.
  • Succinyl-CoA provides succinic acid to mitochondrial complex II, and thus the complex measured by high resolution respirometry under conditions where succinate (the substrate of mitochondrial complex II) is saturated It was inferred that II-related respiration was significantly reduced in HF model mice (FIGS. 1 (C) and (D)).
  • SUCLA2 and SUCLG1 are enzymes that convert succinyl-CoA to succinic acid and CoA in the TCA cycle. Specifically, mitochondrial proteins isolated from the myocardium of each mouse were electrophoresed, transferred to a PVDF membrane, and a rabbit anti-SUCLA2 monoclonal antibody (1: 1,000, ab202582, manufactured by Abcam) and a rabbit anti-SUCLG1 polyclonal antibody (1: 1,000, ab204432, manufactured by Abcam), Western blotting was performed, and the concentration was measured based on the staining intensity of each protein band.
  • the relative content of SUCLA2 and SUCLG1 was set to 1 based on the control mouse content. Was calculated.
  • the expression levels of these succinyl-CoA synthetases were reduced in the HF model mice, and it was confirmed that the decrease in the amount of succinate in the HF model mice was not due to an increase in these enzymes.
  • ketone metabolism when 3-keto acid coenzyme A transferase (OXCT-1) produces acetoacetyl-CoA from acetoacetate, it converts succinyl-CoA as a source of CoA to succinate. Therefore, the amount of OXCT-1 in the mitochondria isolated from the heart muscle of each mouse and the amount of ⁇ -OHB in the heart muscle and plasma were examined, and the relative content was determined with the content of the control mouse being 1.
  • the expression level of OXCT-1 per mitochondria was significantly increased in the HF model mouse compared to the control mouse. Further, the amount of ⁇ -OHB in the HF model mouse decreased in myocardial tissue and increased in blood. Increased expression of OXCT-1, an important protein for ketone synthesis, increased ketone metabolism in HF model mice, suggesting that succinyl-CoA may have decreased.
  • succinylation is one of the post-translational modifications of proteins, and is thought to be controlled by sirtuin 5 (SIRT5), a protein that acts on desuccinylation and succinyl-CoA.
  • SIRT5 sirtuin 5
  • Succinyl-CoA serves as a donor of a succinyl group to lysine residues, while being de-succinylated by SIRT5. Therefore, the amount of SIRT5 in the myocardium of each mouse was examined, and the relative content was determined by setting the content of the control mouse to 1.
  • An initial reaction in the heme synthesis process includes a reaction in which glycine and succinyl-CoA react to synthesize ALA.
  • glycine and succinyl-CoA react to synthesize ALA.
  • an aqueous solution 50 mg / L of ALA ( ⁇ 98%, manufactured by Sigma-Aldrich) was administered to HF model mice by forced drinking (6 to 8 mg / kg / L). day), 28 days after the operation, echocardiography and measurement of mitochondrial function using a mitochondrial respiratory system were performed. As a control, echocardiography and mitochondrial function measurement were similarly performed on control mice bred without ALA administration.
  • FIG. 16 shows the results of mitochondrial function measurement.
  • FIG. 16 (A) shows the results of measurement of respiratory activity related to mitochondrial complex II
  • FIG. 16 (B) relates to mitochondrial complex II when succinic acid, a substrate of mitochondrial complex II, was loaded to the maximum.
  • FIG. 16 (C) shows the results of measurement of respiratory function related to mitochondrial complex I
  • FIG. 16 (D) shows the results of measurement of respiratory function related to mitochondrial complex I and mitochondrial complex II.
  • FIG. 16 (E) shows the results of measurement of respiratory activity associated with mitochondrial complex IV.
  • the respiratory capacity related to mitochondrial complex II, the respiratory capacity related to mitochondrial complex I and mitochondrial complex II, and the respiratory capacity related to mitochondrial complex IV were increased by ALA administration. It was confirmed to improve.
  • FIG. 17 shows the measurement results of the rate of shortening of the left ventricle diameter (% FS) obtained by echocardiography for the HF model mouse not administered with ALA and the HF model mouse administered with ALA.
  • the rate of shortening the left ventricle diameter was significantly improved by ALA administration, and it was confirmed that cardiac function was improved.
  • ALA administered to HF model mice improves the respiratory ability of myocardial mitochondria and thus improves cardiac function, indicating that ALA or a derivative thereof is an effective therapeutic agent for heart failure.
  • Example 3 In chronic HF patients, the amount of mitochondrial ROS released from PBMC and the oxidative stress of mitochondria in PBMC were examined, and the influence of HF on severity and exercise intolerance was examined.
  • FIG. 19 shows the measurement results of the respiratory ability related to mitochondrial complex II in the PBMC of each group
  • FIG. 20 shows the measurement results of the amount of hydrogen peroxide released from the PBMC.
  • the bars in FIGS. 19 and 20 indicate the mean ⁇ SD, and the asterisk indicates a P value ⁇ 0.05.
  • the oxygen consumption in the figure is the maximum respiratory capacity associated with mitochondrial complex II (corresponding to “CII_ETS” described above).
  • the respiratory ability of PBMC associated with mitochondrial complex I, the mitochondrial complex I + II, and the mitochondrial complex IV of PBMC after oxidative stress were significantly reduced in the mild heart failure group.
  • the maximum respiratory function associated with mitochondrial complex II was significantly lower in the severe heart failure group than in the mild heart failure group than the maximum respiratory function associated with mitochondrial complex II was similar.
  • the amount of hydrogen peroxide (ROS amount) released from mitochondria of PBMC was very large.
  • BNP B-type natriuretic peptide

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Abstract

本発明は、心不全の新たな作用機序に基づいて、心不全の病態を評価する方法、当該作用機序を利用して、心不全治療用医薬のための候補化合物を評価する方法、並びに、当該作用機序を利用した、心不全の治療又は予防のための医薬用組成物を提供する。すなわち、本発明は、被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量、前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は、前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、得られた測定値に基づいて、前記被験動物の心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価する、心不全の病態の評価方法である。

Description

心不全の病態の評価方法
　本発明は、心不全の病態を評価する方法、心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法、及び心不全の治療又は予防に使用される医薬用組成物に関する。
　本願は、２０１８年９月２０日に、米国に出願された仮出願６２／７３３６６２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ミトコンドリアはエネルギーを産生する上で中心的な役割を担っており、酸化的リン酸化によりＡＴＰが産生される。ミトコンドリアの酸化的リン酸化は、電子伝達系を構成する複合体I、II、III、IVとＡＴＰ合成酵素である複合体Vにより担われている。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を構成する複合体の中で、複合体I、III、IVはさらなる複合体である超複合体（ＳＣｓ：supercomplexes）を構成する。複合体IIは、コハク酸脱水素酵素（ＳＤＨ：succinate dehydrogenase）とも呼ばれるタンパク質であり、４つのサブユニット（ＳＤＨＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ）から構成される。複合体II は、ＴＣＡサイクルと電子伝達系の両者に関わるタンパクであり、電子伝達系を構成するタンパク質では唯一プロトンポンプとしての働きを持たない、ミトコンドリアゲノムにコードされるタンパク質を含まない等のユニークな特徴をもつタンパク質である。
　心筋梗塞は、心不全の発症をもたらし、これは心筋梗塞後の患者の主な死因である。ミトコンドリア機能不全、すなわちリモデリングに基づく左心室形状の変化及びＡＴＰ産生の減少は、心筋梗塞後の心不全における心機能低下の発症に寄与する。左心室の非梗塞領域には、酸素とＡＴＰが必要であるため、心不全では、ヘムとケトン体の合成が増加すると報告されている（非特許文献１参照。）。これらの合成に必要とされる重要な酵素はスクシニルＣｏＡである。スクシニルＣｏＡは、ＴＣＡサイクルにおいて、ミトコンドリア複合体IIにコハク酸を提供するのに重要な役割を果たす。これまでに心不全においてスクシニルＣｏＡが減少することは報告されているが（非特許文献１参照。）、心不全におけるスクシニルＣｏＡ及びミトコンドリア複合体IIの役割は未だ明らかではない。
Bedi et al.，Circulation，2016，vol.133，p.706‐716.
　本発明は、心不全の新たな作用機序に基づいて、心不全の病態を評価する方法、当該作用機序を利用して、心不全治療用医薬のための候補化合物を評価する方法、並びに、当該作用機序を利用した、心不全の治療又は予防のための医薬用組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、心筋梗塞後心不全モデルマウスにおいて、心筋ミトコンドリア機能が、ミトコンドリア複合体IIの機能依存的に低下すること、この低下には、スクシニルＣｏＡの低下が関与していること、心不全モデルマウスの単離ミトコンドリアに対してスクシニルＣｏＡを投与すると、ミトコンドリア機能が改善されることを見出し、本発明を完成させた。さらに、本発明者らは、慢性心不全において、軽症患者群よりも重症患者群のほうが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のミトコンドリア複合体IIの呼吸能（酸化的リン酸化能）が低く、ＰＢＭＣから放出される活性酸素種（ＲＯＳ）の量が多いこと、これらを指標として心不全の重症度を評価できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］　被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量、前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は、前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
　得られた測定値に基づいて、前記被験動物の心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価する、心不全の病態の評価方法。
［２］　前記被験動物が、心不全の発症の有無が不明であり、かつ前記被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を測定し、
　得られた測定値が、所定の基準値未満の場合に、前記被験動物は、心不全を発症している可能性が高い、と評価する、前記［１］の心不全の病態の評価方法。
［３］　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能を測定し、
　得られた測定値が、所定の基準値未満の場合に、前記被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価し、
　前記測定値が、前記基準値以上の場合に、前記被検動物の心不全は軽症である可能性が高いと評価する、前記［１］の心不全の病態の評価方法。
［４］　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能を測定し、
　得られた測定値が、前記末梢血単核球の採取時期よりも前に前記被検動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値よりも低下している場合に、前記被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する、前記［１］の心不全の病態の評価方法。
［５］　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
　得られた測定値が、所定の基準値超の場合に、前記被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価し、
　前記測定値が、前記基準値以下の場合に、前記被検動物の心不全は軽症である可能性が高いと評価する、前記［１］の心不全の病態の評価方法。
［６］　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
　得られた測定値が、前記末梢血単核球の採取時期よりも前に前記被検動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量の測定値よりも増大している場合に、前記被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する、前記［１］の心不全の病態の評価方法。
［７］　前記心不全が慢性心不全である、前記［１］～［６］のいずれかの心不全の病態の評価方法。
［８］　心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量からなり、
　心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価するために用いられる、バイオマーカー。
［９］　末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は末梢血単核球から放出される活性酸素種量からなり、
　心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価するために用いられる、バイオマーカー。
［１０］　細胞に候補化合物を接触させて、当該細胞のスクシニルＣｏＡ量を測定し、
　得られた測定値に基づいて、前記候補化合物の心不全治療用医薬としての有用性を評価する、心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
［１１］　前記細胞が、心筋由来の培養細胞である、前記［１０］の心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
［１２］　前記細胞が、予めグリシン処理がなされた細胞である、前記［１０］又は［１１］の心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
［１３］　細胞に候補化合物を接触させて、当該細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は当該細胞から放出された活性酸素種量を測定し、
　得られた測定値に基づいて、前記候補化合物の心不全治療用医薬としての有用性を評価する、心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
［１４］　心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物を有効成分とし、心不全の治療又は予防に使用される、医薬用組成物。
［１５］　前記化合物が、スクシニルＣｏＡ、５－アミノレブリン酸、５－アミノレブリン酸の誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩である、前記［１４］の医薬用組成物。
［１６］　心不全を発症している動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる、心不全の治療方法。
［１７］　前記動物に、スクシニルＣｏＡ、５－アミノレブリン酸、５－アミノレブリン酸の誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩を投与する、前記［１６］の心不全の治療方法。
　本発明に係る心不全の病態の評価方法により、被験動物の心不全の発症の有無や、心不全の重症度を評価することができる。また、本発明に係る医薬用組成物は、心不全の治療又は予防に有用である。
参考例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの生存曲線を示した図である。 参考例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスのエコーデータを示した図である。 参考例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋における、ミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果を示した図である。 参考例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋における、ミトコンドリアタンパク質の相対含有量の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの、心筋繊維組織中のＡＴＰ量（Ａ）、心筋繊維組織中のミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩ＋ＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）（Ｂ）、心筋繊維組織中のミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）（Ｃ）、心臓から単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）（Ｄ）、及び心臓から単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能（ＣＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）（Ｅ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋組織中の、コハク酸エステル（Ａ）、スクシニルＣｏＡ（Ｂ）、及びα－ケトグルタル酸（Ｃ）の相対含有量の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋から単離したミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、ＳＵＣＬＡ２の相対含有量（Ｂ）、及びＳＵＣＬＧ１の相対含有量（Ｃ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋から単離したミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、ミトコンドリア中のＯＸＣＴ－１の相対含有量（Ｂ）、心筋のβ－ＯＨＢの相対含有量（Ｃ）、及び血漿中のβ－ＯＨＢの相対含有量（Ｄ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋から単離したミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、ミトコンドリア中のＡＬＡＳ１の相対含有量（Ｂ）、及びミトコンドリアヘムの相対含有量（Ｃ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋から単離したミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、及びミトコンドリア中のＳＩＲＴ５の相対含有量の測定結果（Ｂ）を示した図である。 実施例１において、野生型マウスの左心室から単離したミトコンドリアタンパク質を、各種濃度のスクシニルＣｏＡ存在下でインキュベートした後のタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、及びミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベル（Ｂ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、野生型マウスの左心室から単離したミトコンドリアのミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の測定結果を示した図である。 実施例１において、ＨＦモデルマウスから単離されたミトコンドリアにスクシニルＣｏＡを添加してインキュベートした後のタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベル（Ｂ）、及びミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ｃ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、コントロールマウス及びＨＦモデルマウスから単離されたミトコンドリア、並びにＨＦモデルマウスから単離された後に１ｍＭのスクシニルＣｏＡで処理したミトコンドリアのタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、及びミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ｂ）の測定結果を示した図である。 実施例１において、グリシン処理又はグリシンとスクシニルＣｏＡ処理を行ったＨ９ｃ２細胞のミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果（Ａ）、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベル（Ｂ）、及びミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ｃ）の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＨＦモデルマウスから単離されたミトコンドリアにＡＬＡを添加してインキュベートした後の、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ａ）、ミトコンドリア複合体IIの基質であるコハク酸を最大まで負荷した際のミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ｂ）、ミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能（Ｃ）、ミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（Ｄ）、及びミトコンドリア複合体IVに関連する呼吸能（Ｅ）の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＡＬＡ未投与のＨＦモデルマウスとＡＬＡ投与されたＨＦモデルマウスについて、心エコー検査で得られた左室内径短縮率（％ＦＳ）の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＡＬＡ未投与のＨＦモデルマウスとＡＬＡ投与されたＨＦモデルマウスについて、運動能力（運動時間×体重）の測定結果を示した図である。 実施例３において、軽症心不全群（NYHA I-II群）と重症心不全群（NYHA III群）について、心肺運動テスト後に採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能を測定した結果を示した図である。 実施例３において、軽症心不全群（NYHA I-II群）と重症心不全群（NYHA III群）について、心肺運動テスト後に採取されたＰＢＭＣから放出された過酸化水素量を測定した結果を示した図である。
＜心不全の病態の評価方法及びバイオマーカー＞
　心不全では、スクシニルＣｏＡが減少し、ひいてはミトコンドリア複合体IIの機能が低下する。すなわち、心不全を発症している動物では、心不全の発症前よりも、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量は少ない。また、心不全の病態が重症であるほど、ミトコンドリア複合体IIの機能の低下が大きく、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量も少ない。このため、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量は、心不全の病態、具体的には、心不全の発症若しくはその可能性の有無、及び心不全の重症度若しくはその可能性等を評価するために用いられるバイオマーカーとして有用であり、これに基づいて心不全の病態を評価することができる。当該評価方法は、特に慢性心不全の評価に好適である。
　具体的には、本発明に係る心不全の病態の評価方法は、被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を測定し、得られた測定値に基づいて、前記被験動物の心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価する方法である。例えば、被検動物が心不全の発症の有無が不明である場合であって、当該動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が、予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該被検動物は、心不全を発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該被検動物は心不全を発症している可能性は低い、と評価することができる。また、被験動物が、心不全を発症していることが確認されている動物である場合であって、当該動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が、予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価することができる。逆に、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該被検動物の心不全が重症である可能性は低い、又は軽症である可能性が高いと評価することができる。
　心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値を評価する際に用いる基準値は、スクシニルＣｏＡ量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から、心不全を発症していないことが確認されている被検動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値と、心不全を発症していることが確認されている被検動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値とを比較することにより、心不全を発症している群と発症していない群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。
　心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定方法としては、細胞中の有機化合物を定量的又は半定量的に測定可能な方法であれば特に限定されるものではなく、検体中の有機化合物の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。各方法は常法により行うことができる。例えば、まず、被験動物から採取された心筋を、極性溶媒、例えば、アルコールと水との混合溶媒でホモジナイズして、スクシニルＣｏＡをはじめとする各種有機化合物を抽出する。得られた抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、スクシニルＣｏＡとその他の有機化合物とを分離する。得られたクロマトグラフ中のスクシニルＣｏＡのピークのピーク面積値に基づいて、常法によりスクシニルＣｏＡ量を測定することができる。
　また、ミトコンドリア機能障害と酸化ストレスは心不全の発症に重要な役割を果たしている。心不全、特に慢性心不全を発症している動物では、心不全の重症度依存的に、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能と、ＰＢＭＣから放出されるＲＯＳ量が変化する。具体的には、心不全の重症度が高いほど、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能が低下し、ＰＢＭＣから放出されるＲＯＳ量が増大する傾向にある。また、心不全を発症している動物では、心不全の発症前よりも、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能が低下し、ＰＢＭＣから放出されるＲＯＳ量が増大する傾向にある。このため、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能とＰＢＭＣから放出されるＲＯＳ量は、心不全の病態、具体的には、心不全の発症若しくはその可能性の有無、及び心不全の重症度若しくはその可能性等を評価するために用いられるバイオマーカーとして有用であり、これに基づいて心不全の病態を評価することができる。当該評価方法は、特に慢性心不全の評価に好適である。
　具体的には、本発明に係る心不全の病態の評価方法には、被験動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されるＲＯＳ量を測定し、得られた測定値に基づいて、前記被験動物の心不全の発症の有無、又は、心不全の重症度を評価する方法も含まれる。得られた測定値は、予め設定された所定の基準値に基づいて評価できる。
　例えば、被検動物が心不全の発症の有無が不明である場合であって、当該動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が、予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該被検動物は、心不全を発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該被検動物は心不全を発症している可能性は低い、と評価することができる。また、被験動物が、心不全を発症していることが確認されている動物である場合であって、当該動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が、予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価することができる。逆に、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該被検動物の心不全が重症である可能性は低い、又は軽症である可能性が高いと評価することができる。
　例えば、被検動物が心不全の発症の有無が不明である場合であって、当該動物から採取されたＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値が、予め設定された所定の基準値超の場合には、当該被検動物は、心不全を発症している可能性が高いと評価することができる。逆に、ＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値が予め設定された所定の基準値以下の場合には、当該被検動物は心不全を発症している可能性は低い、と評価することができる。また、被験動物が、心不全を発症していることが確認されている動物である場合であって、当該動物から採取されたＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値が、予め設定された所定の基準値超の場合には、当該被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価することができる。逆に、ＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値が予め設定された所定の基準値以下の場合には、当該被検動物の心不全が重症である可能性は低い、又は軽症である可能性が高いと評価することができる。
　また、心不全を発症していることが確認されている被検動物に対して、経時的にＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量を測定することにより、心不全の重症化を評価することもできる。具体的には、被験動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が、同一の被検動物から当該ＰＢＭＣの採取時期以前に採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値よりも低下している場合に、当該被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する。同様に、被験動物から採取されたＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値が、同一の被検動物から当該ＰＢＭＣの採取時期以前に採取されたＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値よりも増大している場合に、当該被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する。
　ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値を評価する際に用いる基準値は、ミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。同様に、ＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値を評価する際に用いる基準値は、ＲＯＳ量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から、心不全を発症していないことが確認されている被検動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値と、心不全を発症していることが確認されている被検動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値とを比較することにより、心不全を発症している群と発症していない群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。同様に、その他の検査方法の結果から、心不全は発症しているが重症ではないこと、すなわち軽症であることが確認されている被検動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値と、重症心不全であることが確認されている被検動物から採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定値とを比較することにより、軽症心不全群と重症心不全群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。
　被検動物からのＰＢＭＣの採取は、採血された血液から密度勾配遠心法等の常法により行うことができる。採取されたＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定は、高解像度呼吸測定法等の常法により行うことができる。高解像度呼吸測定法によるＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定には、ミトコンドリア酸素活性／細胞代謝エネルギー分析装置等の装置を用いることが好ましい。また、ＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量の測定は、蛍光分光法等の常法により行うことができる。
　心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量、ＰＢＭＣのミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又はＰＢＭＣから放出されたＲＯＳ量を、心不全の病態を評価するための診断マーカーとして用いる対象の被検動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
＜医薬用組成物及び心不全の治療方法＞
　心不全において、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を増大させることにより、ミトコンドリア複合体IIの機能が改善し、心不全の病態が改善する。すなわち、本発明に係る心不全の治療方法は、心不全を発症している動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる方法である。例えば、心不全を発症している動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物を有効量投与することにより、当該動物の心不全の病態を改善することができる。また、心不全を発症する可能性のある動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物を有効量投与することにより、当該動物が心不全を発症することを予防することができる。
　心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物は、心不全の治療又は予防に使用される医薬用組成物の有効成分として有用である。当該化合物としては、心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を、投与前の当該細胞のスクシニルＣｏＡ量を１００％とした場合に、１１０％以上に増大させられるものが好ましく、１２０％以上に増大させられるものがより好ましく、１５０％以上に増大させられるものがさらに好ましい。
　心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物としては、例えば、スクシニルＣｏＡ、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ＡＬＡの誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。ＡＬＡの薬学的に許容される塩、ＡＬＡの誘導体、及びＡＬＡの誘導体の薬学的に許容される塩としては、例えば、国際公開第２０１０／０５０１７９号に記載のものを用いることができる。
　心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物を有効成分とし、心不全の治療又は予防に使用される医薬用組成物（以下、「心不全治療用医薬用組成物」ということがある。）の投与経路は特に限定されるものではない。例えば、当該医薬用組成物の投与経路としては、経口投与、経皮投与、経鼻投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
　当該心不全治療用医薬用組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤、注射剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。当該医薬用組成物としては、経口投与可能な固形剤であることが好ましい。
　心不全治療用医薬用組成物は、有効成分である心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物に、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して製剤化される。
　賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトールなどの糖類、デンプン、結晶セルロースなどのセルロース類、エリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖アルコール類、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、カオリンなどが挙げられる。結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ－マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、クロスポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。流動化剤としては、ケイ酸、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム化合物、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられる。溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが挙げられる。溶解補助剤としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン、サリチル酸アミド、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体などが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム水和物、酢酸ナトリウム水和物、炭酸水素ナトリウム、トロメタモール、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。等張化剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ－マンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、尿素などが挙げられる。安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、クロロクレゾール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。矯味矯臭剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが挙げられる。着色剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
　当該医薬用組成物は、心筋細胞に対するスクシニルＣｏＡ量の増量作用を損なわない限り、その他の有効成分を含有していてもよい。その他の有効成分としては、例えば、心筋細胞に対するスクシニルＣｏＡ量以外を標的とする心不全治療剤等のように、心不全に対する治療効果が期待される物質が挙げられる。
　心不全治療用医薬用組成物により心不全を治療又は予防する対象の被検動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、前記で挙げられた動物と同様の動物が挙げられる。
　心不全治療用医薬用組成物（これを製剤化したものも含む。）の投与量は、投与された動物の心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を投与前よりも増大させるために充分な量であればよく、投与対象の生物種、性別、年齢、体重、食餌、投与の形態、その他の疾患の有無等によって異なる。例えば、成人（体重６０ｋｇとして）に対する心不全治療用医薬用組成物の１日当たりの投与量は、有効成分である心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物として０．０１～５０００ｍｇが好ましく、０．１～３０００ｍｇがより好ましく、１～１０００ｍｇがさらに好ましい。このような投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
＜心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法＞
　細胞のスクシニルＣｏＡ量の増大、細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の増大、又は、細胞から放出されたＲＯＳ量の低下を指標として、心不全の治療又は予防に使用される医薬（心不全治療用医薬）の有効成分をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明に係る心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法は、細胞に候補化合物を接触させて、当該細胞のスクシニルＣｏＡ量、当該細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は当該細胞から放出されたＲＯＳ量を測定し、得られた測定値に基づいて、前記候補化合物の心不全治療用医薬としての有用性を評価する方法である。細胞のスクシニルＣｏＡ量、細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は細胞から放出されたＲＯＳ量は、前記の動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量、細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は細胞から放出されたＲＯＳ量の測定と同様にして測定することができる。
　当該評価方法に使用する細胞としては、初代継代培養であってもよいが、評価方法の安定性の点から、培養細胞であることが好ましい。細胞のスクシニルＣｏＡ量の増大を指標とする場合には、当該培養細胞としては、心筋由来の培養細胞であることが好ましく、哺乳動物の心筋由来の培養細胞であることがより好ましく、ヒトの心筋由来の培養細胞であることがさらに好ましい。細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の増大又は細胞から放出されたＲＯＳ量の低下を指標とする場合には、当該培養細胞としては、ＰＢＭＣを含む血球系細胞由来の培養細胞であることが好ましく、哺乳動物の血球系細胞由来の培養細胞であることがより好ましく、ヒトの血球系細胞由来の培養細胞であることがさらに好ましい。
　細胞のスクシニルＣｏＡ量の増大を指標とする場合には、当該評価方法に使用する細胞としては、ミトコンドリア複合体IIの機能が低下している細胞が好ましい。ミトコンドリア複合体IIの機能が低下している細胞は、例えば、評価に用いる細胞を予めグリシン処理された細胞が挙げられる。グリシン処理により、心不全と同様に、ミトコンドリアのスクシニル化レベルが低下し、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能が低下する。グリシン処理は、グリシンを含有する培地中で培養することにより行うことができる。
　当該評価方法において、候補化合物を細胞に接触させる方法は、特に限定されるものではない。例えば、細胞の培養培地に候補化合物を添加させることにより、候補化合物を細胞に接触させることができる。
　細胞のスクシニルＣｏＡ量の増大を指標とする場合には、候補化合物で処理した細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が、予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分として有用であると評価することができる。逆に、候補化合物で処理した細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値が予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分としては有用ではない、と評価することができる。
　候補化合物の評価方法において候補化合物を評価する際に用いる基準値は、細胞のスクシニルＣｏＡ量の増大を指標とする場合には、スクシニルＣｏＡ量の測定方法の種類、使用する細胞の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から細胞のスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有することが確認されている化合物によって処理された細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値と、当該化合物による処理前の細胞のスクシニルＣｏＡ量の測定値とを比較し、当該化合物で処理した細胞群と未処理の細胞群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。細胞のスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有することが確認されている化合物としては、スクシニルＣｏＡ、ＡＬＡ、ＡＬＡ誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
　細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の増大を指標とする場合には、候補化合物で処理した細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が、予め設定された所定の基準値以上の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分として有用であると評価することができる。逆に、候補化合物で処理した細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値が予め設定された所定の基準値未満の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分としては有用ではない、と評価することができる。
　細胞から放出されたＲＯＳ量の低下を指標とする場合には、候補化合物で処理した細胞から放出されたＲＯＳ量の測定値が、予め設定された所定の基準値以下の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分として有用であると評価することができる。逆に、候補化合物で処理した細胞から放出されたＲＯＳ量の測定値が予め設定された所定の基準値超の場合には、当該候補化合物は、心不全治療用医薬の有効成分としては有用ではない、と評価することができる。
　細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の増大を指標とする場合に、候補化合物の評価方法において候補化合物を評価する際に用いる基準値は、ミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能を増大させる作用を有することが確認されている化合物によって処理された細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値と、当該化合物による処理前の細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値とを比較し、当該化合物で処理した細胞群と未処理の細胞群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。
　細胞から放出されたＲＯＳ量の低下を指標とする場合に、候補化合物の評価方法において候補化合物を評価する際に用いる基準値は、ＲＯＳ量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から細胞のＲＯＳ量を低下させる作用を有することが確認されている化合物によって処理された細胞のＲＯＳ量の測定値と、当該化合物による処理前の細胞のＲＯＳ量の測定値とを比較し、当該化合物で処理した細胞群と未処理の細胞群とを識別するための閾値を適宜設定し、これを基準値とすることができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜心エコー検査＞
　心エコー検査は、短時間作用型であり心抑制の少ない麻酔下（アバーチン８μＬ/ｇＢＷ、腹腔内投与）にて行った。検査台に臥位で四肢と尾をテープで固定し、除毛クリームでマウスの前胸壁を除毛した。超音波診断装置及び１２ＭＨｚリニアプローブを用いて、２Ｄ胸骨傍短軸像乳頭筋レベルで最適な像を描出した。Ｍモード法に切り替え、記録紙スピード４０ｍｍ／秒で記録の上、心拍数、左室拡張末期径、左室収縮末期径、左室前壁壁厚、左室後壁壁厚、左室内径短縮率を計測した。
＜ミトコンドリア単離＞
　マウスからのミトコンドリア単離は、次の通りにして行った。
　まず、麻酔下でマウスを屠殺して摘出した心臓（左心室）を組織保存溶液であるＢＩＯＰＳ（２．７７ｍＭ　ＣａＫ２ＥＧＴＡ、７．２３ｍＭ　Ｋ２ＥＧＴＡ、５．７７ｍＭ　Ｎａ２ＡＴＰ、６．５６ｍＭ　ＭｇＣｌ２／６Ｈ２Ｏ、２０ｍＭ　Ｔａｕｒｉｎｅ、１５ｍＭ　Ｎａ２ ｐｈｏｓｐｈｏｃｒｅａｔｉｎｅ、２０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、５０ｍＭ　ＭＥＳ　ｈｙｄｒａｔｅ、ｐＨ７．１）に浸漬させた後、組織用アイソレーションバッファー（１００ｍＭ　Ｓｕｃｒｏｓｅ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．２％ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、ｐＨ７．４）中で細断した。この細断物に、プロテアーゼを添加して酵素反応を行った後、ホモジナイズした。得られたホモジナイズ溶液を、遠心分離して上清を除去し、沈殿物を、組織用アイソレーションバッファーで２回洗浄した。洗浄後の沈殿物にサスペンションバッファー（２２５ｍＭ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ、７５ｍＭ　Ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加えて溶解させた。
＜ミトコンドリアタンパク質の濃度測定＞
　単離されたミトコンドリアのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce社製）を用いて測定した。検量線は、アルブミンを標準物質として作製した。タンパク濃度測定は、ｎ＝２で行い、２つの測定値の平均値を採用した。
＜心筋線維組織の細胞膜透過処理＞
　マウスから採取された心筋線維組織の細胞膜透過処理は、次の通りにして行った。
　安楽死後のマウスから取り出された心筋を、直ちに氷冷したＢＩＯＰＳに浸漬させた後、ＢＩＯＰＳ内で周辺組織を可及的に除去した。次いで、ＢＩＯＰＳ内で１８ゲージの注射針２本を用いて心筋線維をほぐした後、サポニン（界面活性剤）を含むＢＩＯＰＳ溶液内で３０分間振蕩し、細胞膜透過処理を行った。細胞膜透過処理後の心筋線維は、ＭｉＲ０５バッファー（０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭＴａｕｒｉｎｅ、１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１１０ｍＭ　Ｓｕｃｒｏｓｅ、６０ｍＭ　Ｐｏｔｔａｓｉｕｍ　ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ、１ｇ／Ｌ　ＢＳＡ）で１０分間浸漬させた後に上清を除去する洗浄処理を２回行った。
＜ミトコンドリア呼吸能の測定＞
　ミトコンドリア呼吸能（酸化的リン酸化能：ＯＸＰＨＯＳ）は、高解像度呼吸測定法により測定した。具体的には、単離ミトコンドリア（５０～１００μｇ）又は細胞膜透過処理後の心筋線維組織（１．５～３ｍｇ）を供試サンプルとして用いて、ミトコンドリア酸素活性／細胞代謝エネルギー分析装置（製品名：「OROBOROS Oxygraph-2k」、Innsbruck社製）（以下、「ミトコンドリア呼吸能測定装置」ということがある。）を使用し、３７℃の環境下で、以下のプロトコルに従って測定した。酸素消費量は、Ｄａｔｌａｂ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計算し、その際に、組織重量当たり又はミトコンドリア当たりの補正を行った。
（１）　２ｍＬ容のチャンバーに、ＭｉＲ０５バッファーで満たし、蓋をして空気を追い出した。次いで、供試サンプルを当該チャンバー内に投入し、さらに、塩化マグネシウム　３ｍｍｏｌ／ＬとＡＤＰ　１０ｍｍｏｌ／Ｌを加えた。
（２）　ミトコンドリア複合体Iに関連する基質であるグルタミン酸　１０ｍｍｏｌ／Ｌとリンゴ酸　２ｍｍｏｌ／Ｌとピルビン酸　５ｍｍｏｌ／Ｌとを加え、酸素消費量を測定した（ＣＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）。
（３）　ミトコンドリア複合体IIに関連する基質であるコハク酸　１０ｍｍｏｌ／Ｌを加え、酸素消費量を測定した（ＣＩ＋ＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）。
（４）　ミトコンドリア複合体II単独のＯＸＰＨＯＳの呼吸を観察するため、ミトコンドリア複合体Iの阻害剤であるロテノン（rotenone）　０．５μｍｏｌ／Ｌを加え、酸素消費量を測定した（ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）。
（５）　ＡＤＰ非依存的なリーク状態の呼吸を観察するため、ＡＴＰａｓｅの阻害薬であるオリゴマイシン　２．５μｍｏｌ／Ｌを加え、酸素消費量を測定した（ＣＩＩ＿ＬＥＡＫ）。
（６）　最大の呼吸機能を見るため、脱共役剤であるＦＣＣＰ（carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone）　１μｍｏｌ／Ｌを加え、酸素消費量を測定した（ＣＩＩ＿ＥＴＳ）。
（７）　ミトコンドリア複合体IIの阻害薬であるアンチマイシンＡ　２．５μｍｏｌ／Ｌを加えて、ミトコンドリアに関係する呼吸を停止させた（ＲＯＸ）。
（８）　ミトコンドリア複合体IVの基質であるアスコルビン酸　２ｍｍｏｌ／ＬとＴＭＰＤ（N,N,N',N'-tetramethyl-p- phenylendiamine）　０．５ｍｍｏｌ／Ｌを加えた時の呼吸能を測定した。次に、阻害剤であるアジ化ナトリウム　１００ｍｍｏｌ／Ｌを加えた時の呼吸能を測定し、その差分を計算した（ＣＩＶ＿ＯＸＰＨＯＳ）。
＜液体クロマトグラフィー質量分析による、心筋からの代謝産物の解析＞
　マウスから採取された心筋線維組織の代謝産物の解析は、次の通りにして行った。
　まず、液体窒素で凍結した心筋組織（７０～９０ｍｇ）を、金属小片でMultiBeads Shockerを用いて２，０００ｒｐｍ、１０秒間で破砕した。破砕したサンプルに、溶解用バッファー（７０％　メタノール、１０ｍｇ／ｍＬ　ＭＥＳ（2-（N-Morpholino）-ethanesulfonic acid））を混合し、超音波破砕処理を用いて溶解した（３０秒間超音波処理した後、３０秒間冷却を５セット繰り返した）。得られた溶解物を、２１，５００ｇで５分間遠心分離処理し、上清を回収して、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）用のサンプルとした。
　５μＬのＬＣ－ＭＳ用サンプルを、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＢＥＨカラム（Waters社製）にアプライして分離し、高速液体クロマトグラフ－トリプル四重極型質量分析装置（ＬＣＭＳ－８０４０、島津製作所製）を使用して分析した。移動相は、溶離液Ａ（１５ｍＭ　酢酸、１０ｍＭ　トリブチルアミン、３％　メタノール）と溶離液Ｂ（１００％　メタノール）とした。グラジエント溶離は、次のように溶離液Ｂの割合を徐々に上げた：０～６分は溶離液Ｂ濃度は０％とし、６～２６分で溶離液Ｂ濃度を０％から９０％までリニアに増大させ、次いで、２６～４１分は溶離液Ｂ濃度０％に低下させた。流速は、０．３ ｍＬ／分、カラムオーブン温度は４０℃、エレクトロスプレーイオン化に関するパラメータは以下の通りとした：ドライイングガス流速　１５Ｌ／分；ネブライザーガス流速　３Ｌ／分；ヒーティングガス　１０Ｌ／分；脱溶媒管（Desolvation line）温度　２５０℃；ヒートブロック温度　４００℃；衝突ガス　２３０ｋＰａ。データ解析は、Labsolutions software （島津製作所製）を使用し、シグナル強度はＭＥＳシグナルを標準とした。
＜ケトン体（β－ＯＨＢ）の測定＞
　心筋のβ－ＯＨＢは、ｂｅｔａ　ＨＢ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ab83390、Abcam社製）を使用して測定した。
　具体的には、マウスから採取した心筋（１５～２０ｍｇ）と２００μＬのｂｅｔａ　ＨＢ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒをガラス製のホモジナイザーに入れ、１５回ホモジナイズした後、２０，０００ｇで５分間遠心分離処理し、上清を回収した。回収した上清１００μＬに対して、６Ｍ　過塩素酸（ＰＣＡ）を２０μＬ加え、氷上で５分間インキュベートした後、１３，０００ｇで２分間遠心分離処理して上清を回収した。回収した上清に、ｐＨ６．５～８．０となるように２Ｍ　ＫＯＨを加えた後、１３，０００ｇで１５分間遠心分離処理して上清を回収した。この回収した上清を測定用サンプルとした。
　９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬの測定用サンプルと５０μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（ｂｅｔａ　ＨＢ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ　４６μＬ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ　２μＬ、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｍｉｘ　２μＬの混合液）を添加し、遮光して３０分間室温でインキュベートした後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長の吸光度を計測した。キット添付のスタンダードの吸光度から得られる検量線を元にして、計測された吸光度からサンプルのβ－ＯＨＢ量を算出した。
＜ミトコンドリアヘムの測定＞
　心筋のミトコンドリアヘムは、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（登録商標）　Ｈｅｍｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（DIHM-250、BioAssay Systems社製）を使用して測定した。
　具体的には、まず、マウスから採取した心筋からミトコンドリアを単離し、タンパク質濃度が１００μｇ／５０μＬのサンプル溶液を調製した。
　次いで、９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬのサンプル溶液と２００μＬのＲｅａｇｅｎｔを添加し、マイクロプレートリーダーで４００ｎｍ波長の吸光度を計測した。コントロールとして、キット添付のＣａｌｉｂｒａｔｏｒを用い、同様にして吸光度を測定した。コントロールのヘム濃度を６２．５μＭとし、吸光度の測定値を元にしてサンプルのミトコンドリアヘム濃度を算出した。
＜ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化アッセイ＞
　ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化アッセイは、次の通りにして行った。
　組織又は細胞から単離したミトコンドリアに、スクシニルＣｏＡ（０、０．３、１、３、又は１０ｍＭ）を加えて、３０℃で１５分間静置した。その後、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベルを、ウェスタンブロット法（ＷＢ）により測定した。
＜ミトコンドリアタンパク質の脱スクシニル化アッセイ＞
　ミトコンドリアタンパク質の脱スクシニル化アッセイは、スクシニル化されるタンパク質を添加し、当該タンパク質のスクシニル化レベルを測定することにより行った。タンパク質のスクシニル化レベルは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定した。
　リジンを用いる場合には、マウスの心筋から単離したミトコンドリアに、リジン（１．０又は１０ｍＭ）を加えて、１５分間インキュベートした。リジンを加えることによるｐＨ変化の影響を考慮して、ＨＣｌを加えてｐＨを調製した。その後、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベルを、ＷＢにより測定した。
　ＳＩＲＴ５を用いる場合には、マウスの心筋から単離したミトコンドリアに、リコンビナントＳＩＲＴ５（２０μｇ）とＮＡＤ（５ｍＭ）を加えて、さらにスクシニルＣｏＡ（０、３、又は１０ｍＭ）を加えて、３７℃で６０分間静置した。その後、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベルを、ＷＢにより測定した。
　グリシンを用いる場合には、培養細胞Ｈ９ｃ２細胞の培地に、グリシンを１００ｍＭとなるように加え、６時間培養した。培養後に細胞を回収し、ミトコンドリアを単離した。その後、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベルを、ＷＢにより測定した。
＜統計学的解析＞
　統計処理は、GraphPad Prism 7 software（Graphpad Software社製）を用いて行った。データは、平均値±標準誤差で示した。２群間の平均値の差の検定は、スチューデントのt検定で行った。多群間の平均値の差の検定は、一元配置分散分析を用いて行い、有意差がみられた場合にＴｕｋｅｙ法又はＤｕｎｎｅｔｔ法による多重比較検定を行った。Ｐ値＜０．０５をもって、統計学的に有意と判定した。
　なお、図面中、アスタリスクが付されている値は、統計学的に有意であることを示す。
［参考例１］心不全（ＨＦ）モデルマウスの作製
　以降の実験で使用したＨＦモデルマウスは、次の通りにして作製した。
　雄１０～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重２３～２６ｇ）の心臓の左前下行冠状動脈を結紮して心筋梗塞（ＭＩ）を引き起こした。術前にマウスの体重を測定し、塩酸メデトメジン０．３ｍｇ／ｋｇＢＷ、ミダゾラム４．０ｍｇ／ｋｇＢＷ、酒石酸ブトルファノール５．０ｍｇ／ｋｇＢＷの３種混合麻酔薬を腹腔内投与し、十分な麻酔深度になったことを確認した。マウスを、手術台に臥位で四肢と尾をテープで固定し、気管挿管のために切歯を絹糸で牽引し頸部を進展位で固定した。頸部正中より皮膚切開の後に、顎下腺と気管前筋を展開し、気管の直線形状を保ちながら２３ゲージのポリエチレンチューブが半透明の気管軟骨を通過することを直視下で確認した。その後、従量式実験動物人工呼吸器に接続し、毎回１１０回、１回換気量０．４ｍＬで人工呼吸を開始し、送気時に前胸部が良好に挙上していることを確認した。
　７０％　アルコールで消毒を行い、手術は、実体顕微鏡下で行った。左前胸部を皮切した後に、大胸筋と小胸筋を牽引して温存し、肋間筋を露出した。第４肋間で肋間筋を切開した後に開胸器で視野を展開して心臓を確認した。心膜を切開した後に心臓を半時計方向に旋回させて左冠動脈の走行を確認し、左心耳下縁から０．５ｍｍ程度遠位で８－０シルク縫合糸を使用して器械結びを行った。冠動脈結紮後に結紮部遠位の心筋が赤から白色へ色調変化を確認することで、ＭＩの作成を確認した。その後、４－０シルク縫合糸で閉創し、手術を終了した。
　コントロール群のマウスにはＳｈａｍ手術を施した。これは上記一連の手技から左冠動脈結紮術を除いた処置を行った。
　術後は、麻酔からの回復が得られるまで、３７℃の保温パッドで保温を継続しながら待機した。抜管までの時間は、十分に覚醒して自発呼吸が安定して再開し、術後の急性期死亡が少ない４時間とした。手術時間は１０～１５分間、開胸時間は５分間前後であった。
ＭＩを作製したマウスを心不全（ＨＦ）群とし、ｓｈａｍ手術を施行したマウスをコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）群として、以降の実験を行った。
　手術後２８日目のＨＦモデルマウスとコントロールマウスに対して心エコー検査を行い、心拍数（ＨＲ：ｂｐｍ）、左室拡張末期径（ＬＶＤｄ：ｍｍ）、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ：ｍｍ）、左室前壁壁厚（ＬＶＡＷＴ：ｍｍ）、左室後壁壁厚（ＬＶＰＷＴ：ｍｍ）、左室内径短縮率（％ＦＳ）を計測した。結果を表１に示す。また、ＨＦモデルマウスではコントロールマウスと比較して、心機能が有意に低下し、心臓と肺の重量が有意に増加していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの生存曲線を図１に示す。心筋梗塞３～４週間後のＨＦモデルマウス群の生存率（％）は、コントロールマウス群と比較して有意に低下し、およそ５０％であった。また、図２に、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの、手術後２８日目におけるエコーデータを示す。ＨＦモデルマウスでは、左室前壁は菲薄化しており、後壁は代償的に肥大していた。また、拡張末期径（ＥＤＤ）も大きくなっていた。
　ＨＦモデルマウスとコントロールマウスの心筋繊維組織中のミトコンドリアタンパク質のうち、Ａｃｏｎｉｔａｓｅ　２、ＶＤＡＣ（電位依存性陰イオンチャネル）、ＭＴＣＯ１、Ｔｏｍ２０、及びＣＯＸ IV（シトクロムｃオキシダーゼ複合体IV）の含有量をイムノブロッティングにより比較した。イムノブロッティングは、ウサギ抗Ａｃｏｎｉｔａｓｅ２ポリクローナル抗体（1:1,000、ab71440、Abcam社製）、ウサギ抗ＶＤＡＣポリクローナル抗体（1:1,000、#4866、CST社製）、マウス抗ＭＴＣＯ１モノクローナル抗体（1:1,000、ab14705、Abcam社製）、ウサギ抗Ｔｏｍ２０モノクローナル抗体（1:1,000、ab186734、Abcam社製）、及びウサギ抗ＣＯＸ IVポリクローナル抗体（1:2,000、ab16056、Abcam社製）を用いウェスタンブロッティングにより行った。
　図３に、各ミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。また、図４に、図３のウェスタンブロットにおけるバンド強度に基づいて算出された各ミトコンドリアタンパク質の相対含有量（コントロールマウスの含有量を１とする。）の測定結果を示す。ＨＦモデルマウスの心筋では、いずれのミトコンドリアタンパク質の含有量も低下しており、ＨＦモデルマウスの心筋ではミトコンドリア量が低下していることが確認された。
［実施例１］
　ＨＦモデルマウスを解析し、心不全の病態とミトコンドリア複合体の機能の関係について調べた。
　まず、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスから心筋繊維組織を採取し、心筋繊維組織中のＡＴＰ量、ミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩ＋ＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）、及びミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）、並びに、心臓から単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）及びミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能（ＣＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）を測定した。さらに、コントロールマウスの心筋組織について、ミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能とミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能を比較した。結果を図５に示す。ＨＦモデルマウスでは、心筋のＡＴＰ量が低下しており（図５（Ａ））、ミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能（ＣＩ＋ＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳ）も低下していた（図５（Ｂ））。ミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能は、ＨＦモデルマウスとコントロールマウスでは差はなかったが（図５（Ｅ））、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は、ＨＦモデルマウスではコントロールマウスよりも低下していた（図５（Ｃ）及び（Ｄ））。例えば、ＣＩＩ＿ＯＸＰＨＯＳは、コントロールマウス群は４，７２４ｐｍｏｌ／ｓ／ｍｇであったのに対して、ＨＦモデルマウス群は４，３０６ｐｍｏｌ／ｓ／ｍｇであった（Ｐ＜０．０５、図５（Ｃ））。さらに、もともと心筋においては、ミトコンドリア機能はミトコンドリア複合体Iよりもミトコンドリア複合体IIの方が高かった（図５（Ｆ））。このため、心筋ＡＴＰ量の低下は、ミトコンドリア複合体II機能の低下によるものと示唆された。
　次いで、各マウスの心筋繊維組織のコハク酸エステル、スクシニルＣｏＡ、及びα－ケトグルタル酸の含有量を、液体クロマトグラフィー質量分析により測定した。各成分のコントロールマウスの含有量を１とした相対含有量の結果を図６に示す（ｎ＝６）。この結果、コハク酸エステル量及びα－ケトグルタル酸の量は、ＨＦマウスとコントロールマウスにおいて差はなかったが、スクシニルＣｏＡの量は、ＨＦマウスはコントロールマウスよりも有意に低下していた。スクシニルＣｏＡは、ミトコンドリア複合体IIにコハク酸を提供しており、このため、コハク酸塩（ミトコンドリア複合体IIの基質）が飽和している条件での高解像度呼吸測定法によって測定された複合体II関連呼吸は、ＨＦモデルマウスにおいて有意に低下した（図１（Ｃ）及び（Ｄ））と推察された。
　コハク酸エステル量の減少の原因を調べるために、各マウスの心筋から単離したミトコンドリア中のＳＵＣＬＡ２及びＳＵＣＬＧ１の量を調べた。ＳＵＣＬＡ２及びＳＵＣＬＧ１は、ＴＣＡサイクルでスクシニルＣｏＡをコハク酸とＣｏＡに変換する酵素である。
　具体的には、各マウスの心筋から単離したミトコンドリアのタンパク質を電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＳＵＣＬＡ２モノクローナル抗体 （1:1,000、ab202582、Abcam社製）及びウサギ抗ＳＵＣＬＧ１ポリクローナル抗体（1:1,000、ab204432、Abcam社製）を用いてウェスタンブロッティングを行い、各タンパク質のバンドの染色強度に基づいて濃度を測定し、ＳＵＣＬＡ２及びＳＵＣＬＧ１のコントロールマウスの含有量を１とした相対含有量を算出した。測定結果を図７に示す（ｎ＝６）。これらのスクシニルＣｏＡ合成酵素の発現量は、ＨＦモデルマウスでは減少しており、ＨＦモデルマウスにおけるコハク酸エステル量の低下は、これらの酵素の増大によるものではないことが確認された。
　ケトン代謝では、３ケト酸コエンザイムＡトランスフェラーゼ（ＯＸＣＴ－１）がアセトアセテートからアセトアセチルＣｏＡを産生する際に、ＣｏＡの供給源としてスクシニルＣｏＡをコハク酸エステルに変換する。そこで、各マウスの心筋から単離したミトコンドリア中のＯＸＣＴ－１の量と、心筋及び血漿中のβ－ＯＨＢ量を調べ、コントロールマウスの含有量を１とした相対含有量を求めた。測定結果を図８に示す（ｎ＝４～１２）。ＨＦモデルマウスではコントロールマウスと比べて、ＯＸＣＴ－１のミトコンドリア当たりの発現量は有意に増加していた。また、ＨＦモデルマウスのβ－ＯＨＢ量は、心筋組織で減少し、血中で増加していた。ケトン合成の重要なタンパク質であるＯＸＣＴ－１の発現量が増大していたことから、ＨＦモデルマウスではケトン代謝が亢進しており、これによりスクシニルＣｏＡが低下した可能性が示唆された。
　スクシニルＣｏＡはヘム合成にも関与している。ヘム合成の初期段階の反応はミトコンドリア内で起こり、５－アミノレブリン酸合成酵素（ＡＬＡＳ）によってグリシンとスクシニルＣｏＡからＡＬＡが合成される。そこで、各マウスの心筋のＡＬＡＳ量及びミトコンドリアヘム量を調べ、コントロールマウスの含有量を１とした相対含有量を求めた。測定結果を図９に示す（ｎ＝６）。ＨＦモデルマウスではコントロールマウスと比べて、ＡＬＡＳの発現量やミトコンドリアヘム量は有意に増加していた。ヘム合成の重要なタンパク質であるＡＬＡＳの発現量が増大していたことから、ＨＦモデルマウスでは、スクシニルＣｏＡはケトン代謝やヘム合成の亢進により消費されて減少している可能性が示唆された。
　また、スクシニル化はタンパク質翻訳後修飾の１つであり、ｓｉｒｔｕｉｎ　５（ＳＩＲＴ５）という脱スクシニル化に働くタンパク質とスクシニルＣｏＡにより制御されていると考えられている。スクシニルＣｏＡは、リジン残基へのスクシニル基のドナーとなり、一方でＳＩＲＴ５により脱スクシニル化される。そこで、各マウスの心筋のＳＩＲＴ５量を調べ、コントロールマウスの含有量を１とした相対含有量を求めた。測定結果を図１０に示す（ｎ＝３～１０）。ＨＦモデルマウスとコントロールマウスでは、ＳＩＲＴ５の発現量には有意差はなかった。これらの結果から、ＨＦモデルマウスにおけるスクシニル化の低下はＳＩＲＴ５の機能亢進によるものではなく、スクシニルＣｏＡの低下によるものであると考えられた。
　次いで、スクシニルＣｏＡを補充することにより、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化やミトコンドリア複合体IIの機能を改善できるかを調べた。
　具体的には、まず、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の左心室から採取したミトコンドリアに、スクシニルＣｏＡ（０、１、３、又は１０ｍＭ）を加えてスクシニル化アッセイを行い、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベル（スクシニルＣｏＡ無添加（０ｍＭ）のスクシニル化タンパク質量を１とする相対量）を調べた。結果を図１１に示す（ｎ＝３～１９）。この結果、マウスの心筋から単離したミトコンドリアにスクシニルＣｏＡを加えることによって、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化を増加させることが明らかになった。
　また、野生型マウスから単離したミトコンドリアに、スクシニルＣｏＡ（０、１、３、又は１０ｍＭ）を加えてスクシニル化アッセイを行い、ミトコンドリアに関連する呼吸能を調べた。結果を図１２に示す（ｎ＝３～１９）。興味深いことに、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は、ミトコンドリアに１０ｍＭのスクシニルＣｏＡを加えた場合には有意に低下したのに対し、１ｍＭのスクシニルＣｏＡを加えた場合には逆に増加する傾向だった。このことから、スクシニルＣｏＡの添加によるスクシニル化とミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は二峰性を示し、過剰なスクシニル化はタンパク質の機能を低下させるが、適度なスクシニルＣｏＡを加えた場合のスクシニル化は、タンパク質が正常に機能するためには必要な修飾である可能性が考えられた。
　ＨＦモデルマウスから単離されたミトコンドリアに、０．１ｍＭのスクシニルＣｏＡを添加してスクシニル化アッセイを行い、スクシニル化レベルとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能を調べた。対照としてコントロールマウスにも同様の実験を行った。結果を図１３に示す（ｎ＝３～１０）。ＨＦモデルマウスでは、スクシニルＣｏＡの低下とともに、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化とミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は、いずれも有意に低下した。このスクシニル化レベルとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の低下は、スクシニルＣｏＡの添加により改善した。ＨＦモデルマウスから単離したミトコンドリアを０．１ｍＭ　スクシニルＣｏＡと共に１５分間インキュベートすることによって、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は、３，２９１ｐｍｏｌ／ｓ／ｍｇから４，０３７ｐｍｏｌ／ｓ／ｍｇにまで改善された（Ｐ＜０．０５、図１３（Ｃ））。
　これらの結果から、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化は心不全で低下し、スクシニルＣｏＡ投与により、スクシニル化レベルと共にミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能が改善することが確認された。そして、スクシニルＣｏＡの補給は、ＨＦモデルマウスの心臓におけるミトコンドリア複合体II機能の低下を改善できることから、スクシニルＣｏＡは、心不全患者におけるミトコンドリア機能不全に対する潜在的な治療標的となることがわかった。
　これまでの結果から、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能は、ミトコンドリア当たりのミトコンドリア複合体II発現量により制御され得ることが明らかとなった。そこで、コントロールマウス及びＨＦモデルマウスから単離されたミトコンドリア、並びにＨＦモデルマウスから単離された後に１ｍＭのスクシニルＣｏＡで処理したミトコンドリアについて、ミトコンドリア当たりのミトコンドリア複合体IIの発現量を、ブルーネイティブ法でマウス抗ＳＤＨＡモノクローナル抗体（1:1,000、ab14715、Abcam社製）を使用して評価した。結果を図１４に示す（ｎ＝６）。ミトコンドリア当たりのミトコンドリア複合体IIの発現量は、ＨＦモデルマウスで有意に低下した。ＨＦモデルマウスのミトコンドリアにスクシニルＣｏＡを加えても、ミトコンドリア複合体IIの量は低下したままであった。これらの結果から、ＨＦモデルマウスにおけるミトコンドリア複合体IIの機能低下の原因は、ミトコンドリア複合体IIの会合ではないことがわかった。
　また、ヘム合成の過程でグリシンとスクシニルＣｏＡが反応してＡＬＡが合成される。そこで、この反応工程と心不全におけるスクシニルＣｏＡ量低下の関係を調べた。スクシニル化レベルと、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能を調べた。結果を図１５に示す（ｎ＝４～８）。Ｈ９ｃ２細胞をグリシン処理することにより、ＨＦモデルマウスと同様に、ミトコンドリアタンパク質のスクシニル化レベルが低下した。また、グリシン処理と共にスクシニルＣｏＡを添加することによって、スクシニル化レベルとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の両方が改善された。これらの結果から、スクシニル化の低下がミトコンドリア複合体IIの機能低下に関与することが示唆された。
［実施例２］
　ヘム合成過程の初期反応に、グリシンとスクシニルＣｏＡが反応してＡＬＡを合成する反応がある。そこで、ＡＬＡを補給することによる、ＨＦモデルマウスの心筋ミトコンドリア機能に対する影響を調べた。
　具体的には、ＨＦモデルマウスに対して、左冠動脈結紮手術後から、ＡＬＡ（≧９８％、Sigma Aldrich社製）の水溶液（５０ｍｇ／Ｌ）を強制飲水により投与し（６～８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、手術後２８日目に、心エコー検査と、ミトコンドリア呼吸能測定装置によるミトコンドリア機能の測定を行った。対照として、ＡＬＡを投与せずに飼育したコントロールマウスに対しても、同様に心エコー検査とミトコンドリア機能測定を行った。
　ミトコンドリア機能測定は、各マウスから採取された心筋繊維組織から単離したミトコンドリアに対して行った。ミトコンドリア機能測定の結果を図１６に示す。図１６（Ａ）はミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の測定結果を、図１６（Ｂ）はミトコンドリア複合体IIの基質であるコハク酸を最大まで負荷した際のミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の測定結果を、図１６（Ｃ）はミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能の測定結果を、図１６（Ｄ）はミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の測定結果を、図１６（Ｅ）はミトコンドリア複合体IVに関連する呼吸能の測定結果を、それぞれ示す。この結果、ＨＦモデルマウスのミトコンドリアでは、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能、ミトコンドリア複合体Iとミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能、及びミトコンドリア複合体IVに関連する呼吸能が、ＡＬＡ投与により改善することが確認された。
　また、ＡＬＡ未投与のＨＦモデルマウスとＡＬＡ投与されたＨＦモデルマウスについて、心エコー検査で得られた左室内径短縮率（％ＦＳ）の測定結果を図１７に示す。この結果、ＨＦモデルマウスでは、ＡＬＡ投与により左室内径短縮率が顕著に改善しており、心機能が改善することが確認された。
　また、ＡＬＡ未投与のＨＦモデルマウスとＡＬＡ投与されたＨＦモデルマウスについて、運動能力を調べた。運動能力は、運動時間と体重の積で表した。運動時間は、小動物用トレッドミルを用いて、安静１０分間、ｗ－ｕｐ１０分間の後（６ｍ／分、傾斜１０度）、漸増負荷（２ｍ／２分）により、マウスが疲労困憊になるまで走らせて測定した。結果を図１８に示す。この結果、ＨＦモデルマウスでは、ＡＬＡ投与により運動能力が顕著に改善していた。これは、ＡＬＡ投与により心機能が改善したためである。
　ＨＦモデルマウスにＡＬＡを投与することによって心筋のミトコンドリアの呼吸能が改善され、ひいては心機能が改善することから、ＡＬＡ又はこの誘導体が心不全の有効な治療薬となることがわかった。
［実施例３］
　慢性ＨＦ患者において、ＰＢＭＣから放出されたミトコンドリアＲＯＳ量、及びＰＢＭＣにおけるミトコンドリアの酸化ストレスを調べ、ＨＦの重症度及び運動不耐性に対する影響を調べた。
　３６名の慢性ＨＦ患者（６２±１３歳）を、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）の機能クラスI～IIの患者からなる軽症心不全群（NYHA I-II群：ｎ＝１７）及びＮＹＨＡの機能クラスIIIの患者からなる重症心不全群（NYHA III群：ｎ＝１９）の２つのグループに分けた。各患者群の情報を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらの患者に対して、運動能力を評価するために、自転車エルゴメーターを用いた心肺運動テストを実施し、ＰＢＭＣを採取した。各患者から採取されたＰＢＭＣを細胞膜透過処理した後、ミトコンドリア呼吸能と放出されたＲＯＳ量を測定した。ＲＯＳ量は、蛍光分光法を用いて測定した。
　各群のＰＢＭＣにおけるミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能の測定結果を図１９に、ＰＢＭＣから放出された過酸化水素量の測定結果を図２０に、それぞれ示す。図１９及び図２０中のバーは平均値±ＳＤを、アスタリスクはＰ値＜０．０５であることを示す。また、図の酸素消費量はミトコンドリア複合体IIに関連する最大呼吸能（前記の「ＣＩＩ＿ＥＴＳ」に相当）である。
　図１９及び２０に示すように、酸化ストレス後のＰＢＭＣのミトコンドリア複合体Iに関連する呼吸能、ミトコンドリア複合体I＋IIに関連する呼吸能、及びミトコンドリア複合体IVに関連する呼吸能は、軽症心不全群と重症心不全群で同等であったが、ミトコンドリア複合体IIに関連する最大呼吸能は、重症心不全群では軽症心不全群よりも有意に低かった。また、重症心不全群では、ＰＢＭＣのミトコンドリアから放出される過酸化水素の量（ＲＯＳ量）が非常に多かった。
　また、ＨＦの重症度のバイオマーカーであるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の血漿レベルは、重症心不全群では２８６．０±２５１．０ｐｇ／ｍＬであり、軽症心不全群では９３．４±１０１．２ｐｇ／ｍＬであり、重症心不全群は軽症心不全群よりも明らかに高かった（Ｐ＜０．０１）。また、ピーク酸素摂取量（ＶＯ２）は、重症心不全群では１４．４±４．１ｍＬ／ｋｇ／分であり、軽症心不全群では１９．７±４．５ｍＬ／ｋｇ／分であり、重症心不全群は軽症心不全群よりも明らかに低かった（Ｐ＜０．０１）。
　ＰＢＭＣにおけるミトコンドリア複合体IIに関連する最大呼吸能は、低下したピークＶＯ２と関連して、重症心不全群において有意に減少した。特に、重症心不全群では、ＰＢＭＣから放出されたミトコンドリアＲＯＳ（過酸化水素）の量が非常に多量であり、かつこの放出されたＲＯＳ量は、血漿ＢＮＰレベルの増加及びピークＶＯ２の低下と、それぞれ密接に相関していた。
　これらの結果から、ＰＢＭＣから放出されたミトコンドリアＲＯＳ量の増加を特徴とするミトコンドリア酸化ストレスの増強は、慢性ＨＦ患者におけるＨＦの重症度及び運動不耐性と関連していることがわかった。また、ＨＦ患者においても、ＨＦモデルマウスと同様に、ミトコンドリア複合体IIに関連する呼吸能が低下しており、このミトコンドリア複合体IIの機能低下が共通することから、心不全一般において、ミトコンドリア複合体IIの機能が低下していることが示唆された。

Claims (18)

  1. 　被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量、前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は、前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
    　得られた測定値に基づいて、前記被験動物の心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価する、心不全の病態の評価方法。
  2. 　前記被験動物が、心不全の発症の有無が不明であり、かつ前記被験動物から採取された心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量を測定し、
    　得られた測定値が、所定の基準値未満の場合に、前記被験動物は、心不全を発症している可能性が高い、と評価する、請求項１に記載の心不全の病態の評価方法。
  3. 　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能を測定し、
    　得られた測定値が、所定の基準値未満の場合に、前記被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価し、
    　前記測定値が、前記基準値以上の場合に、前記被検動物の心不全は軽症である可能性が高いと評価する、請求項１に記載の心不全の病態の評価方法。
  4. 　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能を測定し、
    　得られた測定値が、前記末梢血単核球の採取時期よりも前に前記被検動物から採取された末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能の測定値よりも低下している場合に、前記被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する、請求項１に記載の心不全の病態の評価方法。
  5. 　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
    　得られた測定値が、所定の基準値超の場合に、前記被験動物の心不全は重症である可能性が高いと評価し、
    　前記測定値が、前記基準値以下の場合に、前記被検動物の心不全は軽症である可能性が高いと評価する、請求項１に記載の心不全の病態の評価方法。
  6. 　前記被験動物が、心不全の発症が確認されており、かつ前記被験動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量を測定し、
    　得られた測定値が、前記末梢血単核球の採取時期よりも前に前記被検動物から採取された末梢血単核球から放出された活性酸素種量の測定値よりも増大している場合に、前記被検動物の心不全は重症化した可能性が高い、と評価する、請求項１に記載の心不全の病態の評価方法。
  7. 　前記心不全が慢性心不全である、請求項１～６のいずれか一項に記載の心不全の病態の評価方法。
  8. 　心筋細胞のスクシニルＣｏＡ量からなり、
    　心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価するために用いられる、バイオマーカー。
  9. 　末梢血単核球のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は末梢血単核球から放出される活性酸素種量からなり、
    　心不全の発症の有無、又は心不全の重症度を評価するために用いられる、バイオマーカー。
  10. 　細胞に候補化合物を接触させて、当該細胞のスクシニルＣｏＡ量を測定し、
    　得られた測定値に基づいて、前記候補化合物の心不全治療用医薬としての有用性を評価する、心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
  11. 　前記細胞が、心筋由来の培養細胞である、請求項１０に記載の心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
  12. 　前記細胞が、予めグリシン処理がなされた細胞である、請求項１０又は１１に記載の心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
  13. 　細胞に候補化合物を接触させて、当該細胞のミトコンドリア複合体IIの呼吸能、又は当該細胞から放出された活性酸素種量を測定し、
    　得られた測定値に基づいて、前記候補化合物の心不全治療用医薬としての有用性を評価する、心不全治療用医薬のための候補化合物の評価方法。
  14. 　心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる作用を有する化合物を有効成分とし、心不全の治療又は予防に使用される、医薬用組成物。
  15. 　前記化合物が、スクシニルＣｏＡ、５－アミノレブリン酸、５－アミノレブリン酸の誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の医薬用組成物。
  16. 　心不全を発症している動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる、心不全の治療方法。
  17. 　前記動物に、スクシニルＣｏＡ、５－アミノレブリン酸、５－アミノレブリン酸の誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩を投与する、請求項１６に記載の心不全の治療方法。
  18. 　請求項１に記載の心不全の病態の評価方法により、心不全の発症の有無を評価し、心不全を発症している可能性が高いと評価された動物に対して、心筋細胞におけるスクシニルＣｏＡ量を増大させる、心不全の治療方法。
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