WO2020049206A1 - Sistema para el cultivo de organoides y método para esterilización de un sistema para el cultivo de organoides - Google Patents

Sistema para el cultivo de organoides y método para esterilización de un sistema para el cultivo de organoides Download PDF

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WO2020049206A1
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José Antonio COSTOYA PUENTE
Víctor Manuel ARCE VÁZQUEZ
Irene GOLÁN CANCELA
José Luis PARDO VÁZQUEZ
José Antonio ZUMALAVE RIVAS
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Universidade De Santiago De Compostela
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Definitions

  • Organoid culture system and method for sterilization of an organoid culture system Organoid culture system and method for sterilization of an organoid culture system
  • the present invention describes a system for organoid culture. Furthermore, the present invention also describes a method for sterilizing a culture system.
  • organoid culture also known as three-dimensional culture systems, have been described in the state of the art, as opposed to traditional two-dimensional monolayer culture.
  • iPSCs human induced pluripotent stem cells
  • the bioreactor was named SpinZ and fits into a standard 12-well tissue culture plate, dramatically reducing media consumption and incubator space.
  • the bioreactor also had a stackable version powered by a common engine, allowing a large number of conditions to be compared in parallel (to optimize the protocol) and to reduce the space required in the incubator.
  • the system is not modular nor is it a fully sterilizable system.
  • SpinZ also does not incorporate sensors that allow important parameters such as cell growth, pH, concentration of CO2 and O2, temperature to be measured in real time.
  • the system is not modular either, and although it allows characterizing the growth of organoids with the camera that it incorporates, it does not allow the automatic storage of these data, nor the monitoring and storage of other physicochemical parameters of interest such as pH, concentration of CO2 and O2, and temperature.
  • Patent application WO2015 / 184273 A1 teaches a bioreactor system for the preparation of a cardiac organoid.
  • the bioreactor system includes a first container with a hollow interior and an open top, in addition to a cannula with a lumen, a porous ring attached to the cannula, and a balloon catheter.
  • This invention presents an applicability problem, since the requirement for a balloon catheter limits organoid production to a single cardiac type.
  • it is not a modular bioreactor nor does it allow simultaneous culture of different tissues and / or different conditions.
  • This bioreactor also does not incorporate the possibility of using standard culture material.
  • it also does not allow to monitor in real time the growth of the organoid nor to monitor and store the data referring to physico-chemical parameters of interest of the culture.
  • Patent application WO2012 / 104437 A1 teaches a bioreactor for cell culture on a three-dimensional substrate. It consists of a conical shaped culture chamber.
  • the bioreactor is used in tissue engineering for the production of tissue grafts, in particular a bone or cartilage graft. This bioreactor does not allow simultaneous multiple cultivation nor the use of standard culture material. Furthermore, the bioreactor of said invention does not allow to monitor in real time the growth of the organoid nor to monitor and store the data referring to physico-chemical parameters of interest.
  • organoid culture system that is modular, sterilizable, that allows simultaneous multiple cultivation and that allows to monitor cell growth in real time as well as monitor and store parameters is evident.
  • physico-chemical relevant such as pH, concentration of C0 2 and O2 and temperature.
  • a system for organoid culture is described that includes the above characteristics, significantly improving the systems existing in the state of the art.
  • the present invention describes a system for organoid culture that allows simultaneous high-throughput, reuse of standard culture material and equipment, as well as real-time monitoring of organoid growth and physical parameters -Relevant chemicals. Furthermore, the system is modular and one module can be sterilized independently of another.
  • One aspect of the present invention relates to a sterilizable organoid culture system comprising:
  • a cultivation module comprising:
  • a stirring module comprising stirring means for each well
  • the stirring module comprises:
  • an air compressor system comprising flow control means configured to supply a flow of pressurized air at a given pressure
  • a nozzle for each well configured to channel pressurized air flow to each well
  • a pressure sensor and a controller the controller being configured to act on the flow control means by varying a supply power of the flow control means as a function of a pressure reading provided by the pressure sensor.
  • the present invention describes a system that has numerous advantages over other bioreactors for organoid culture described in the state of the art.
  • the bioreactor of the present invention allows multiple simultaneous cultivation, allowing experiments with different conditions to be carried out in parallel.
  • the present invention comprises a modular system, whereby different system modules can be coupled and uncoupled. Therefore, firstly, it is made possible for the culture module to be sterilizable in its entirety, without the need to separately sterilize the parts of the culture module, this being very convenient to preserve the entire sterile culture. That is, the culture module, which comprises one or more wells, can be removed as a block, without the need to disassemble its components.
  • the present invention also describes a method for sterilizing an organoid culture system comprising: providing a system as defined above in a resting configuration such that the agitation module and the control module are decoupled from the cultivation module; extract the culture module; and subjecting the culture module to sterilization.
  • FIG. 1 An exemplary embodiment of the present invention is shown in Fig. 1, where the organoid culture system comprises
  • a cultivation module (2) comprising:
  • a stirring module (8) comprising stirring means for each well (4); characterized in that:
  • the stirring module (8) comprises:
  • an air compressor system comprising flow control means (81) configured to supply a pressurized air flow at a given pressure;
  • a nozzle (82) for each well (4) configured to channel the pressurized air flow to each well (4);
  • FIG. 2 An embodiment of a cover (5) that is placed on the wells (4) is detailed in Fig. 2.
  • the cover (5) comprises perforations (51) on each of the wells (4) to lead exhaust air from each well (4) to the outside.
  • the evacuation air passes through the perforations (51) to an air chamber (52).
  • the nozzles (82) are also shown in Fig. 2.
  • FIG. 3 An embodiment is shown in Fig. 3 where the cultivation module (2) and the growth monitoring module (50) are comprised in a container (1).
  • FIG. 4 An embodiment of the growth monitoring module (50) and its coupling to the wells (4) included in the culture module (2) is illustrated in Fig. 4.
  • the growth monitoring (50) and culture (2) modules are separated by a transparent base (15).
  • Fig. 5 shows a schematic of a motorized system (52) to allow positioning of the vision system (511) by means of a Cartesian system with two motorized axes, X-Y.
  • FIGs. 6A and 6B a schematic of a motorized system (52) is shown to allow positioning of the vision system (511) by means of a Delta system with 3 motorized arms.
  • Fig. 7 shows a schematic of a motorized system (52) to allow positioning of the vision system (511) by means of an articulated arm with at least two articulations.
  • Fig. 8 illustrates a possible embodiment for locating visual codes (532, 533) that are part of visual guides (53) on a culture plate (104).
  • a freely identifiable two-dimensional code is shown in Fig. 8, such as QR (532), and two-dimensional markers (533), which allow defining the corners of the culture plate (104) and its characteristics.
  • FIG. 9 An embodiment of the invention is illustrated in Fig. 9 where the growth monitoring module (50) comprises diffuse lighting means (54) located on the edges of the filter holder (55). DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention relates to a sterilizable organoid culture system comprising:
  • a cultivation module (2) comprising:
  • a stirring module (8) comprising stirring means for each well (4); characterized in that:
  • the stirring module (8) comprises:
  • an air compressor system comprising flow control means (81) configured to supply a flow of pressurized air at a given pressure;
  • a nozzle (82) for each well (4) configured to channel the pressurized air flow to each well (4);
  • the base of the culture module (2) is the agitation of the culture by means of air bubbles, which also help to facilitate the gas exchange with the culture medium.
  • controller (84) is configured so that the pressure reading provided by pressure sensor (83) corresponds to the pressure / time transfer curve selected for each experiment.
  • the agitation module (8) comprises: a cover (5) comprising means for evacuating (51, 52) air from each well (4).
  • the air outlet from the wells (4) is made by means of perforations (51) made in the cover (5) on each of the wells (4), and is led to the outside through an air chamber (52) built in the cover (5), to avoid contamination of the crop.
  • the agitation module (8) comprises an air filter (85) between each nozzle (82) and the air compressor system (80).
  • the air filter 85 is a HEPA filter.
  • the air compressor system (80) collects the air from the incubator where the system of the invention is located and drives it towards the nozzles (82), previously passing through the filter (85), which prevents contamination of the culture medium.
  • the air compressor system (80) generates a constant air flow, which produces a bubbling in each one of the wells (4).
  • the system has a pressure sensor (83) that is used to regulate the speed of the flow control means (81), which can be a compressor, guaranteeing a constant air flow to the wells (4) through the air nozzles (82).
  • controller 84 is configured to detect a malfunction corresponding to a clogged nozzle 82, a dirty air filter 81, and both.
  • the control system has an air pumping control algorithm that, based on the compressor speed data and the pressure read in the chamber before the filter (85), allows detecting clogged nozzles (82) or filter (85). ) dirty.
  • the wells (4) are arranged on a support means (10).
  • the support medium (10) allows the manipulation of all the wells (4) used for organoid culture in solidarity.
  • the system described in the present invention can be used in combination with a standard culture plate (104).
  • a standard culture plate (104) the support medium (10) and the wells (4) form the same unit.
  • standard culture plates can be used in the organoid culture system described in the present invention, so that the bioreactor has great applicability and its use will not require special devices for organoid culture, unlike other systems described in the state of the art.
  • the use of standard culture plates allows simultaneous multiple culture, thus allowing cell culture under different physico-chemical conditions on the same plate, in the same experiment.
  • the system comprises: an environmental sensor module (43) comprising one or more sensors (41); where said one or more sensors (41) are configured to measure culture-related parameters selected from cell growth, CO2 concentration, O2 concentration, pH, temperature, humidity, and volatile organic compounds.
  • the one or more sensors (41) are configured to measure the parameters related to cultivation in real time.
  • system of the invention allows incorporating new sensors to record new information that may be relevant, in real time.
  • the system comprises: a growth monitoring module (50) comprising: a vision system based on individual images from each well (4).
  • the real-time monitoring of organoid growth is carried out by means of an artificial vision system, which obtains individual images of each well (4) and processes them to calculate their size.
  • the vision system comprises image capture means (51) selected from means comprising fixed focus lens, adjustable focus lens, light field technology and multi-camera technology.
  • image capture means (51) are adjusted to the resting plane of the organoids, to make an estimate of growth based on a 2D projection of the culture.
  • the image capture means (51) allow capturing several images from each well, corresponding to different planes of the culture, improving the estimation of growth, since it allows a 3D reconstruction of the organoid.
  • the image capture means (51) allow to see the growth in different planes without an adjustable lens, since the Light Field technology allows to modify the focal plane of the capture without the need for lenses with adjustable focus.
  • the image capture means (51) comprise several cameras that focus the culture from different angles, allowing its 3D reconstruction.
  • the growth monitoring module (50) comprises a motorized system (52) for positioning the vision system in each of the wells (4).
  • the motorized system (52) is configured to allow the vision system (511) to be positioned three-dimensionally, that is, at a point in space determined by three coordinates.
  • the motorized system (52) comprises a system selected from:
  • the vision system (511) is installed on a sliding axis (X), which can be operated by means of a gear and motor mechanism;
  • the sliding axis (X) is installed in turn on a perpendicular sliding carriage (Y), driven by a mechanism, which can be gear and motor, independent of the X axis;
  • the vision system (511) is installed on a support that is connected by three telescopic segments (521) to three configured trolleys (522) to slide vertically on respective vertical axes (523), the vertical axes (523) being arranged at the vertices of an equilateral triangle, seen on a horizontal plane;
  • a horizontal and vertical movement of the vision system is produced by a coordinated movement of the 3 carriages (522) along the vertical axes (523);
  • the link arm has a first link (52A) configured for positioning in a horizontal plane and a second link (52B) configured for positioning in a vertical plane.
  • the motorized system (52) comprises means for calibrating the positioning of the vision system by means of visual guides (53) attached to a culture plate (104) selected from geometric and visual codes.
  • the visual guides (53) are located at the corners of the culture plate (104), to allow the automatic alignment of a camera of the vision system, adapting to variations in location.
  • Visual codes can be one-dimensional or two-dimensional.
  • the visual guides (53) are encoded and selected from two-dimensional codes and two-dimensional markers.
  • Two-dimensional codes such as QR, allow you to store any type of alphanumeric information, encoded in the form of dots, forming a two-dimensional matrix.
  • Two-dimensional markers are also made up of a two-dimensional dot matrix, but unlike two-dimensional codes, the stored information is predefined and usually corresponds to a sequence number for each unique code in a predetermined dictionary. For example, In the case of April Tag codes, the 36H11 family provides 518 different codes.
  • Two-dimensional markers are often used as indices for automatic positioning or detection of predefined elements.
  • Two-dimensional codes such as QR, for the unique identification of the culture medium assigned to a specific experiment
  • Two-dimensional markers for the calibration and adjustment of the exact position of the culture medium on the vision system, as well as for the coding of other specific data from the culture plate (104) (format, number of wells, etc.).
  • Figure 8 shows a possible embodiment for the location of these codes on a culture plate (104).
  • the different codes are located, so that they do not obstruct the vision of the cuvettes so as not to interfere with the visual identification of the growth of the culture.
  • a freely identifiable two-dimensional code such as QR (532)
  • QR is used to encode the code for the culture medium and to associate it with a specific experiment.
  • the two-dimensional markers (533) are located, which allow defining the corners of the culture plate (104) and its characteristics.
  • the growth monitoring module comprises diffuse lighting means (54).
  • the diffuse lighting means (54) can be located on the edges of the filter holder (55).
  • the system comprises:
  • a control module (3) comprising:
  • aeration control means (31) comprising PID (proportional-integral-differential) regulation means configured to maintain a certain pressure in the agitation module (8) by air, the pressure being defined by a pressure transfer curve with respect to time, reading a data from of the pressure sensor (83) and acting on a speed of the flow control means (81), which may be a compressor;
  • PID proportional-integral-differential
  • pressure regulation means comprise calculation means that allow detecting problems in the agitation system (8) by air, such as the detection of plugged ducts or dirty filter;
  • sensors are connected to the control module (3) by means of standardized interfaces (analog ports, I2C port, SPI port);
  • Organoid growth quantification means (33) configured to establish:
  • growth estimation by quantification of the maximum two-dimensional contour of different focal planes growth estimation by volumetric quantification on a 3D reconstruction of the organoid obtained from several 2D images captured in different focal planes; real-time data capture means (34) configured for:
  • sampling interval is definable independently for each of the connected sensors; means of sending captured data to information systems (35):
  • the captured data will be sent to the information systems through standard protocols, compatible with remote connection means.
  • standard protocols compatible with remote connection means.
  • data transmission can be done through standard TCP / IP protocols;
  • connection of the control module (3) can be made through a wired or wireless connection.
  • connection modalities are supported, among others:
  • the control module (3) according to the invention may further comprise a system that gives real-time information of the aforementioned physical parameters: cell growth, CO2 concentration, O2 concentration, pH and temperature.
  • the cultivation module (2) and the growth monitoring module (50) are separated by a transparent base (15).
  • the number of wells (4) is an even number.
  • the number of wells (4) is 6, 8, 12, 24, 48 or 96.
  • the number of wells corresponds to the number of wells of a standard culture plate (104).
  • the system is adapted to be in an operating configuration and a resting configuration, wherein in the operating configuration the agitation module (8) is coupled to the culture module (2) and the culture module (2) is coupled to the growth monitoring module (50); and where in the resting configuration the culture module (2) is decoupled from the growth monitoring module (50) and from the agitation module (8), allowing the complete culture module (2) to be separated.
  • Another embodiment of the invention relates to a method for sterilizing an organoid culture system comprising: providing a system as defined above in a resting configuration, such that the agitation module (8) and the module growth monitoring devices (50) are decoupled from the culture module (2); extract the culture module (2); and subjecting the culture module (2) to sterilization.
  • the sterilization to which the culture module (2) is subjected is autoclaved, treatment with hydrogen peroxide or treatment with ionizing radiation.
  • a container (1) comprises the cultivation module (2) and the growth monitoring module (50).
  • the real-time measurement of the aforementioned parameters is highly advantageous in determining the correct growth of the organoid under suitable conditions.
  • the wells (4) are separated from the growth monitoring module (50) by a transparent base (15).
  • This transparent base (15) allows the growth monitoring module (50) to be isolated in the event of a spill of culture medium and / or sample contained in the wells (4).
  • the transparent base (15), in a preferred embodiment, is made of glass. All the information collected from the control module (3) is accessible at any time when the system is working, but it can also be stored for later analysis and / or quality control.
  • the form of information storage can be locally, preferably on a memory card, and / or remotely, in the cloud using any standard network connection.
  • the system also preferably includes an alarm protocol that continually alerts of a system failure or an unexpected alteration of the physical parameters measured by the control module (3).
  • the culture module (2) couples / decouples from the growth monitoring module (50) as shown in Figs. 1 and 3.
  • Example 2 The culture module (2) was sterilized as follows:
  • Example 3 Organoids were developed from two tumor cell lines previously obtained from primary astrocytes RbloxP / loxP HRasV12 (T653) and cRb - / - HRasV12 (T731) in SCID mouse. These cells were cultured in DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • DMEM Dulbecco modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • T653 and T731 cells were washed in phosphate buffered saline (PBS), trypsinized, and recovered by centrifugation in PBS at 1000 rpm for 5 minutes.
  • the cells were resuspended in the DMEM / F-12 nutrient mixture, GlutaMAX supplemented with 1X B-27 (50X) and growth factors 0.02 pg / ml EGF (Human Epidermal Growth Factor) and 0.02 pg / ml bFGF (basic fibroblast growth factor).
  • Cells were seeded in 60mm plates and grown at 37 ° C and 5% CO2.
  • the cells were kept in a humidified incubator for 48h, and after this time they were recovered by centrifugation at 1000rpm for 5min, they were resuspended in neuronal induction medium (DMEM / F-12 + GlutaMAX supplemented with 1% N2 (100X), MEM-NEAA 1% (MEM 100X non-essential amino acid solution) and 1 pg / ml heparin, seeded in 60mm plates and kept in this culture medium for 48 hours at 37 ° C and 5% CO2.
  • DMEM / F-12 + GlutaMAX supplemented with 1% N2 (100X), MEM-NEAA 1% (MEM 100X non-essential amino acid solution) and 1 pg / ml heparin
  • the composition of this medium was 50% DMEM / F12 + GlutaMAX and 50% neurobasal medium (1X), supplemented with 0.5% N2, 0.025% Insulin, 0.5% MEM-NEAA and 1% penicillin-streptomycin, 0.035% of 2 -Mercaptoethanol (1: 1000 dilution) in DMEM / F-12 + GlutaMAX and 1% B27- without vitamin A.
  • the neurospheres were maintained in Matrigel for 72 h before being transferred to the bioreactor.
  • the neurospheres were maintained in the bioreactor in the presence of differentiation medium supplemented with B27 with vitamin A (Lancaster MA et al., 2014). The medium was changed every 72 h.

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Abstract

Sistema modular y esterilizable para el cultivo de organoides que comprende un módulo de cultivo con uno o más pocillos y un módulo de agitación que incluye un compresor de aire con unos medios de control del caudal, una boquilla para cada pocillo, un sensor de presión y un controlador que actúa sobre los medios de control del caudal en función de la lectura de la presión. El método de esterilizar el sistema consiste en desacoplar ambos módulos, extraer el módulo de cultivo y esterilizarlo. El sistema puede contar con un módulo de monitorización del crecimiento de los organoides, así como de un módulo de control de parámetros físico-químicos del cultivo

Description

Sistema para el cultivo de organoides y método para esterilización de un sistema para el cultivo de organoides
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un sistema para el cultivo de organoides. Además, la presente invención describe también un método para esterilizar un sistema de cultivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el estado de la técnica se han descrito varios sistemas para el cultivo de organoides, también conocidos como sistemas de cultivo tridimensional, en contraposición con el cultivo tradicional bidimensional en monocapa.
Qian, X. y otros describieron en un artículo científico en 2016 (Cell, 165, 1238-1254) el desarrollo de un biorreactor giratorio miniaturizado para generar organoides específicos del cerebro a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) humanas. Estos organoides incorporaron características clave del desarrollo cortical humano, incluyendo la organización de la zona progenitora, la neurogénesis, la expresión génica y una capa de células glía radiales externas específicas del ser humano. El biorreactor se denominó SpinZ y encaja en una placa de cultivo de tejido estándar de 12 pocilios, reduciendo drásticamente el consumo de medio y el espacio en la incubadora. El biorreactor también disponía de una versión apilable accionada por un motor común, lo que permitía comparar un gran número de condiciones en paralelo (para optimizar el protocolo) y reducir el espacio necesario en la incubadora. Sin embargo, el sistema no es modular ni tampoco es un sistema totalmente esterilizable. Además, SpinZ tampoco incorpora sensores que permitan medir en tiempo real parámetros importantes como pueden ser el crecimiento celular, pH, concentración de CO2 y O2, temperatura.
Wilkinson y otros describieron en un artículo científico (Stem Cells Translational Medicine (2017), 6, 622-633) un método escalable para la generación de organoides pulmonares humanos auto-ensamblados. La generación de dichos organoides se consiguió mediante la combinación de microesferas de alginato funcionalizadas con colágeno y fibroblastos humanos en un biorreactor rotacional de vasos de alta relación de aspecto (HARV) de 4 mi. Además, los autores también enseñan que se puede montar una cámara GoPro en el HARV para caracterizar la cinética de la formación de organoides. Sin embargo, dicha invención no permite usar material de cultivo estándar, ni tampoco cultivo simultáneo múltiple. El sistema tampoco es modular, y aunque permite caracterizar el crecimiento de organoides con la cámara que incorpora, no permite almacenar automáticamente esos datos ni tampoco monitorizar y almacenar otros parámetros físico-químicos de interés como pueden ser el pH, concentración de CO2 y O2 y la temperatura.
La solicitud de patente WO2015/184273 A1 enseña un sistema de biorreactor para la preparación de un organoide cardíaco. El sistema del biorreactor incluye un primer recipiente con un interior hueco y una parte superior abierta, además de una cánula con un lumen, un anillo poroso acoplado a la cánula y un catéter de balón. Esta invención presenta un problema de aplicabilidad, puesto que el requisito de un catéter de balón limita la producción de organoides a un único tipo cardíaco. Además, no se trata de un biorreactor modular ni tampoco permite un cultivo simultáneo de distintos tejidos y/o distintas condiciones. Este biorreactor tampoco incorpora la posibilidad de usar material de cultivo estándar. Además, tampoco permite monitorizar a tiempo real el crecimiento del organoide ni monitorizar y almacenar los datos referidos a parámetros físico-químicos de interés del cultivo.
La solicitud de patente WO2012/104437 A1 enseña un biorreactor para cultivo celular sobre un sustrato tridimensional. Se compone de una cámara de cultivo de forma cónica. El biorreactor se utiliza en la ingeniería de tejidos para la producción de injertos de tejidos, en particular un injerto óseo o de cartílago. Este biorreactor no permite el cultivo múltiple simultáneo ni tampoco el uso de material de cultivo estándar. Además, el biorreactor de dicha invención no permite tampoco monitorizar a tiempo real el crecimiento del organoide ni monitorizar y almacenar los datos referidos a parámetros físico-químicos de interés.
A la vista de los documentos anteriormente citados, resulta evidente la necesidad de un sistema para el cultivo de organoides que sea modular, esterilizable, que permita el cultivo múltiple simultáneo y que permita monitorizar a tiempo real el crecimiento celular así como también monitorizar y almacenar parámetros físico-químicos relevantes tales como el pH, concentración de C02 y O2 y la temperatura. En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides que incluye las anteriores características mejorando de forma significativa los sistemas existentes en el estado de la técnica.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides que permite un cultivo múltiple simultáneo (high-throughput), la reutilización de material y equipamento de cultivo estándar, así como la monitorización en tiempo real del crecimiento del organoide y de parámetros físico-químicos relevantes. Además, el sistema es modular y se puede esterilizar un módulo independientemente de otro.
Un aspecto de la presente invención trata de un sistema esterilizable para el cultivo de organoides que comprende:
un módulo de cultivo que comprende:
uno o más pocilios;
un módulo de agitación que comprende medios de agitación para cada pocilio;
caracterizado porque:
el módulo de agitación comprende:
un sistema compresor de aire que comprende medios de control de caudal configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;
una boquilla para cada pocilio, configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio;
un sensor de presión y un controlador, estando configurado el controlador para actuar sobre los medios de control de caudal variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión.
Por tanto, en la presente invención se describe un sistema que presenta numerosas ventajas respecto a otros biorreactores para el cultivo de organoides descritos en el estado de la técnica. El biorreactor de la presente invención permite un cultivo simultáneo múltiple, lo que permite realizar experimentos con distintas condiciones en paralelo. Además, la presente invención comprende un sistema modular, por lo que distintos módulos del sistema se pueden acoplar y desacoplar. Por lo tanto, en primer lugar, se posibilita que el módulo de cultivo sea esterilizable en su totalidad, sin necesidad de esterilizar por separado las partes del módulo de cultivo, siendo esto muy conveniente para preservar la totalidad del cultivo estéril. Es decir, el módulo de cultivo, que comprende uno o más pocilios, se pueden extraer como un bloque, sin necesidad de desmontaje de sus componentes.
La presente invención también describe un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides que comprende: proporcionar un sistema como el que se define anteriormente en una configuración de reposo de manera que el módulo de agitación y el módulo de control están desacoplados del módulo de cultivo; extraer el módulo de cultivo; y someter el módulo de cultivo a esterilización.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de realización de la presente invención, en donde el sistema para el cultivo de organoides comprende
un módulo de cultivo (2) que comprende:
uno o más pocilios (4);
un módulo de agitación (8) que comprende medios de agitación para cada pocilio (4); caracterizado porque:
el módulo de agitación (8) comprende:
un sistema compresor de aire que comprende medios de control de caudal (81) configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;
una boquilla (82) para cada pocilio (4), configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio (4);
un sensor de presión (83) y un controlador (84), estando configurado el controlador (84) para actuar sobre los medios de control de caudal (81) variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal (81) en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83).
En la Fig. 2 se detalla una realización de una cubierta (5) que se coloca sobre los pocilios (4). En la Fig. 2 se ilustra que la cubierta (5) comprende perforaciones (51) sobre cada uno de los pocilios (4) para conducir al exterior aire de evacuación de cada pocilio (4). El aire de evacuación pasa a través de las perforaciones (51) a una cámara de aire (52). En la Fig. 2 también se muestran las boquillas (82).
En la Fig. 3 se muestra una realización donde el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están comprendidos en un contendor (1).
En la Fig. 4 se ilustra una realización del módulo de monitorización de crecimiento (50) y su acoplamiento a los pocilios (4) comprendidos en el módulo de cultivo (2). En la realización ilustrada en la Fig. 4, los módulos de monitorización de crecimiento (50) y de cultivo (2) están separados por una base transparente (15).
En la Fig. 5 se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un sistema cartesiano de dos ejes motorizados, X - Y.
En las Fig. 6A y 6B se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un sistema Delta con 3 brazos motorizados.
En la Fig. 7 se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un brazo articulado con al menos dos articulaciones.
En la Fig. 8 se ilustra una posible realización para la ubicación de códigos visuales (532, 533) que forman parte de guías visuales (53) sobre una placa de cultivo (104). En la Fig. 8 se muestra un código bidimensional de identificación libre, como QR (532), y marcadores bidimensionales (533), que permiten definir las esquinas de la placa de cultivo (104) y las características de la misma.
En la Fig. 9 se ilustra una realización de la invención donde el módulo de monitorización de crecimiento (50) comprende medios de iluminación difusa (54) situados en los bordes del portafiltro (55). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides así como un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides. En referencia a la Fig. 1 , en una realización particular, la presente invención trata de un sistema esterilizable para el cultivo de organoides que comprende:
un módulo de cultivo (2) que comprende:
uno o más pocilios (4);
un módulo de agitación (8) que comprende medios de agitación para cada pocilio (4); caracterizado porque:
el módulo de agitación (8) comprende:
un sistema compresor de aire (80) que comprende medios de control de caudal (81) configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;
una boquilla (82) para cada pocilio (4), configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio (4);
un sensor de presión (83) y un controlador (84), estando configurado el controlador (84) para actuar sobre los medios de control de caudal (81) variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal (81) en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83).
La base del módulo de cultivo (2) es la agitación del cultivo mediante burbujas de aire, que también ayudan a facilitar el intercambio gaseoso con el medio de cultivo.
En una realización de la invención, el controlador (84) está configurado para que la lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83) se corresponda con la curva de transferencia de presión/tiempo seleccionada para cada experimento.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 2, el módulo de agitación (8) comprende: una cubierta (5) que comprende medios de evacuación (51 , 52) de aire de cada pocilio (4). La salida de aire de los pocilios (4) se realiza por medio de unas perforaciones (51) realizadas en la cubierta (5) sobre cada uno de los pocilios (4), y se conduce al exterior a través de una cámara de aire (52) construida en la cubierta (5), para evitar la contaminación del cultivo.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el módulo de agitación (8) comprende un filtro de aire (85) entre cada boquilla (82) y el sistema compresor de aire (80). Conforme a una realización de la invención, el filtro de aire (85) es un filtro HEPA.
Conforme a una realización de la invención, el sistema compresor de aire (80) recoge el aire de la incubadora donde está ubicado el sistema de la invención y lo impulsa hacia las boquillas (82), pasando previamente a través del filtro (85), que evita la contaminación del medio de cultivo.
Como se ilustra en la Fig. 3, durante el crecimiento del organoide, las boquillas (82) de aire permanecen introducidas en el medio de cultivo. El sistema compresor de aire (80) genera un flujo de aire constante, que produce un burbujeo en cada uno de los pocilios (4). El sistema dispone de un sensor de presión (83) que se utiliza para regular la velocidad de los medios de control de caudal (81), que pueden ser un compresor, garantizando un flujo de aire constante a los pocilios (4) a través de las boquillas (82) de aire.
En una realización de la invención, el controlador (84) está configurado para detectar una anomalía de funcionamiento correspondiente a una boquilla (82) taponada, un filtro de aire (81) sucio y ambas. El sistema de control dispone de un algoritmo de control de bombeo de aire que, a partir de los datos de velocidad del compresor y la presión leída en la cámara previa al filtro (85), permite detectar boquillas (82) taponadas o filtro (85) sucio.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , los pocilios (4) se disponen sobre un medio de soporte (10).
El medio de soporte (10) permite la manipulación de forma solidaria de todos los pocilios (4) usados para el cultivo de organoides. Preferiblemente, el sistema descrito en la presente invención puede ser usado en combinación con una placa de cultivo (104) estándar. En una placa de cultivo (104) estándar, el medio de soporte (10) y los pocilios (4) forman una misma unidad. Así, en una realización preferida, se pueden utilizar placas de cultivo estándar en el sistema de cultivo de organoides descrito en la presente invención, de modo que el biorreactor tiene una gran aplicabilidad y su uso no precisará de dispositivos especiales para el cultivo de organoides, a diferencia de otros sistemas descritos en el estado de la técnica. Además, el uso de placas de cultivo estándar permite un cultivo múltiple simultáneo, permitiendo, por lo tanto, el cultivo celular en distintas condiciones físico-químicas en una misma placa, en un mismo experimento.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende: un módulo de sensorización ambiental (43) que comprende uno o más sensores (41); donde dichos uno o más sensores (41) están configurados para medir parámetros relacionados con el cultivo seleccionados entre crecimiento celular, concentración de CO2, concentración de O2, pH, temperatura, humedad y compuestos orgánicos volátiles.
Conforme a una realización de la invención, los uno o más sensores (41) están configurados para medir los parámetros relacionados con el cultivo en tiempo real.
Adicionalmente, el sistema de la invención permite incorporar nuevos sensores para registrar nueva información que pudiera ser relevante, en tiempo real.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende: un módulo de monitorización de crecimiento (50) que comprende: un sistema de visión basado en imágenes individuales de cada pocilio (4).
La monitorización en tiempo real del crecimiento de los organoides se realiza por medio de un sistema de visión artificial, que obtiene imágenes individuales de cada pocilio (4) y las procesa para calcular su tamaño.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema de visión comprende medios de captura de imágenes (51) seleccionados entre medios que comprenden lente con enfoque fijo, lente con enfoque ajustable, tecnología light field y tecnología multicámara. Mediante la lente con enfoque fijo, los medios de captura de imágenes (51) se ajustan al plano de reposo de los organoides, para realizar una estimación del crecimiento basada en una proyección 2D del cultivo.
Mediante la lente con enfoque ajustable, los medios de captura de imágenes (51) permiten capturar varias imágenes de cada pocilio, correspondientes a diferentes planos del cultivo, mejorando la estimación del crecimiento, ya que permite una reconstrucción 3D del organoide.
Mediante la tecnología light field,, los medios de captura de imágenes (51) permiten ver el crecimiento en diferentes planos sin lente ajustable, puesto que la tecnología Light Field, permite modificar el plano focal de la captura sin necesidad de lentes con enfoque ajustable.
Mediante la tecnología multicámara. los medios de captura de imágenes (51) comprenden varias cámaras que enfocan el cultivo desde ángulos diferentes, permitiendo la reconstrucción 3D del mismo.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el módulo de monitorización de crecimiento (50) comprende un sistema motorizado (52) para posicionamiento del sistema de visión en cada uno de los pocilios (4). El sistema motorizado (52) está configurado para permitir posicionar el sistema de visión (511) tridimensionalmente, es decir, en un punto del espacio determinado por tres coordenadas.
Conforme a diferentes realizaciones de la invención, el sistema motorizado (52) comprende un sistema seleccionado entre:
sistema cartesiano de dos ejes motorizados, X - Y, como el ilustrado en la Fig. 5, donde:
el sistema de visión (511) está instalado en un eje deslizante (X), que puede ser actuado mediante un mecanismo de engranajes y motor;
el eje deslizante (X) está instalado a su vez en un carro de desplazamiento perpendicular (Y), accionado por un mecanismo, que puede ser de engranajes y motor, independiente del eje X;
sistema Delta con 3 brazos motorizados donde:
el sistema de visión (511) está instalado en un soporte que está conectado mediante tres segmentos telescópicos (521) a tres carros (522) configurados para deslizar verticalmente sobre sendos ejes verticales (523), estando dispuestos los ejes verticales (523) en los vértices de un triángulo equilátero, vistos sobre un plano horizontal;
un movimiento horizontal y vertical del sistema de visión se produce mediante un movimiento coordinado de los 3 carros (522) a lo largo de los ejes verticales (523);
brazo articulado con al menos dos articulaciones (52A, 52B) donde el sistema de visión (511) se sitúa en un extremo libre del brazo que dispone de al menos dos articulaciones (52A, 52B) giratorias, cuyo movimiento coordinado permite posicionar el sistema de visión. En una realización, el brazo articulado tiene una primera articulación (52A) configurada para un posicionamiento en un plano horizontal y una segunda articulación (52B) configurada para un posicionamiento en un plano vertical.
Adicionalmente, conforme a una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema motorizado (52) comprende medios de calibración del posicionamiento del sistema de visión mediante guías visuales (53) adheridas a una placa de cultivo (104) seleccionadas entre geométricas y códigos visuales. En una realización de la invención, las guías visuales (53) están situadas en las esquinas de la placa de cultivo (104), para permitir la alineación automática de una cámara del sistema de visión, adaptándose a variaciones de ubicación. Los códigos visuales pueden ser unidimensionales o bidimensionales.
Conforme a una realización de la invención, las guías visuales (53) están codificadas y seleccionadas entre códigos bidimensionales y marcadores bidimensionales (fiducial markers).
Los códigos bidimensionales, como por ejemplo QR, permiten almacenar cualquier tipo de información alfanumérica, codificada en forma de puntos formando una matriz bidimensional.
Los marcadores bidimensionales (fiducial markers) también están formados por una matriz bidimensional de puntos, pero a diferencia de los códigos bidimensionales, la información almacenada está predefinida y suele corresponderse con un número de secuencia para cada código único de un diccionario predeterminado. Por ejemplo, para el caso de los códigos April Tag, la familia 36H11 permite disponer de 518 códigos diferentes.
Los marcadores bidimensionales suelen utilizarse como índices para posicionamiento automático o detección de elementos predefinidos.
En una realización de la invención, se utiliza una combinación de ambos tipos de códigos:
Códigos bidimensionales, como puede ser QR, para la identificación única del medio de cultivo asignado a un experimento concreto;
Marcadores bidimensionales, para la calibración y ajuste de la posición exacta del medio de cultivo sobre el sistema de visión, así como para la codificación de otros datos específicos de la placa de cultivo (104) (formato, número de pocilios, etc.).
En la figura 8 se presenta una posible realización para la ubicación de estos códigos sobre una placa de cultivo (104). En las esquinas de la placa de cultivo (104), se ubican los diferentes códigos, de forma que no obstaculicen la visión de las cubetas para no interferir en la identificación visual del crecimiento del cultivo. Por una parte, se utiliza un código bidimensional de identificación libre, como QR (532), para codificar el código del soporte de cultivo y poder asociarlo a un experimento concreto. Por otra parte, se ubican los marcadores bidimensionales (533), que permiten definir las esquinas de la placa de cultivo (104) y las características de la misma.
En cada realización particular se pueden utilizar diferentes tipos y combinaciones de códigos, ubicados en distintas posiciones de las placas de cultivo (104).
Adicionalmente, conforme a una realización de la invención ilustrada en la Fig. 9, el módulo de monitorización de crecimiento comprende medios de iluminación difusa (54). Los medios de iluminación difusa (54) pueden estar situados en los bordes del portaf iltro (55).
En otra realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende:
un módulo de control (3) que comprende:
medios de control de aireación (31): que comprenden medios de regulación PID (proporcional-integral-diferencial) configurados para mantener una presión determinada en el módulo de agitación (8) por aire, estando la presión definida por una curva de transferencia de presión con respecto al tiempo, leyendo un dato procedente del sensor de presión (83) y actuando sobre una velocidad de los medios de control de caudal (81), que pueden ser un compresor;
donde los medios de regulación de presión comprenden medios de cálculo que permiten detectar problemas en el sistema de agitación (8) por aire, como puede ser la detección de conductos taponados o filtro sucio;
medios de control de calidad de aire (32):
que comprenden una integración de sensores electrónicos de detección de gases, como puede ser la concentración de CO2, concentración de O2, compuestos orgánicos volátiles, etc.;
Estos sensores se conectan al módulo de control (3) por medio de interfaces normalizados (puertos analógicos, puerto I2C, puerto SPI);
medios de cuantificación de crecimiento de organoide (33) configurados para establecer:
un crecimiento de cada uno de los organoides a partir de las imágenes obtenidas por el sistema de visión, imágenes que pueden ser imágenes 2D; diferentes algoritmos de estimación de crecimiento, adaptables a diferentes tipos de cultivo mediante:
estimación de crecimiento mediante cuantificación de máximo contorno bidimensional de diferentes planos focales; estimación de crecimiento mediante cuantificación volumétrica sobre una reconstrucción 3D del organoide obtenida a partir de varias imágenes 2D capturadas en diferentes planos focales; medios de captura de datos en tiempo real (34) configurados para:
muestrear periódicamente una lectura del valor detectado por los sensores conectados para obtener datos capturados;
guardar los datos capturados en un dispositivo de almacenamiento a largo plazo, como una memoria flash;
El intervalo de muestreo es definible de forma independiente para cada uno de los sensores conectados; medios de envío de datos capturados a sistemas de información (35):
Los datos capturados se enviarán a los sistemas de información a través de protocolos estándar, compatibles con medios de conexión remota. En caso de utilizar conexión de red ethernet o inalámbrica WiFi, la transmisión de datos se puede realizar a través de protocolos TCP/IP estándar;
medios de conexión remota (36).
La conexión del módulo de control (3) se puede realizar a través de conexión cableada o inalámbrica. Se soportan, entre otras, las siguientes modalidades de conexión:
Red cableada ethernet
Red inalámbrica WiFi (802.11)
Conexión inalámbrica Bluetooth
Conexión cableada serie RS-232
Conexión cableada serie RS-485
Conexión cableada serie I2C
Conexión cableada serie SPI
El módulo de control (3) según la invención puede además comprender un sistema que da información a tiempo real de los parámetros físicos mencionados anteriormente: crecimiento celular, la concentración de CO2, la concentración de O2, el pH y la temperatura.
En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 4, el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están separados por una base transparente (15).
En otra realización preferida, el número de pocilios (4) es un número par.
En otra realización preferida, el número de pocilios (4) es 6, 8, 12, 24, 48 o 96. Preferiblemente, el número de pocilios se corresponde con el número de pocilios de una placa de cultivo (104) estándar.
Conforme a una realización de la invención, el sistema está adaptado para estar en una configuración de funcionamiento y una configuración de reposo, en donde en la configuración de funcionamiento el módulo de agitación (8) está acoplado al módulo de cultivo (2) y el módulo de cultivo (2) está acoplado al módulo de monitorización de crecimiento (50); y en donde en la configuración de reposo el módulo de cultivo (2) está desacoplado del módulo de monitorización de crecimiento (50) y del módulo de agitación (8), permitiendo la separación del módulo de cultivo (2) completo.
Otra realización de la invención se refiere a un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides que comprende: proporcionar un sistema como el definido anteriormente en una configuración de reposo, de manera que el módulo de agitación (8) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están desacoplados del módulo de cultivo (2); extraer el módulo de cultivo (2); y someter el módulo de cultivo (2) a esterilización.
En una realización del método de la invención, la esterilización a la que se somete el módulo de cultivo (2) es autoclavado, tratamiento con peróxido de hidrógeno o tratamiento con radiación ionizante.
En otra realización de la invención ilustrada en la Fig. 3, un contenedor (1) comprende el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50).
La medición a tiempo real de los parámetros anteriormente citados, como son el crecimiento celular, la concentración de CO2, la concentración de O2, el pH y la temperatura, resulta muy ventajosa para determinar el correcto crecimiento del organoide bajo unas condiciones adecuadas.
En referencia a la Fig. 4, en una realización particular, los pocilios (4) están separados del módulo de monitorización de crecimiento (50) por una base transparente (15). Esta base transparente (15) permite aislar el módulo de monitorización de crecimiento (50) en caso de un derrame de medio de cultivo y/o muestra contenida en los pocilios (4). La base transparente (15), en una realización preferida, es de cristal. Toda la información recabada desde el módulo de control (3) es accesible en cualquier momento en que el sistema está funcionando, pero puede ser también almacenada para análisis posteriores y/o control de calidad. La forma de almacenaje de la información puede ser de forma local, preferiblemente en una tarjeta de memoria, y/o de forma remota, en la nube (cloud) usando cualquier conexión de red estándar.
El sistema incluye también preferiblemente un protocolo de alarma que continuamente alerta de un fallo del sistema o de una alteración inesperada de los parámetros físicos medidos por el módulo de control (3).
EJEMPLOS Ejemplo 1
El módulo de cultivo (2) se acopla/desacopla del módulo de monitorización de crecimiento (50) tal y como se muestra en las Figs. 1 y 3.
Ejemplo 2 El módulo de cultivo (2) se esterilizó de la siguiente manera:
1. Autoclavado en autoclave STERIVAP 669 - 1 ED (BMT) a 134°C durante 7 minutos .
2. 4 fases de secado intensivo de 3 minutos cada una.
Ejemplo 3 Los organoides fueron desarrollados de dos líneas celulares tumorales previamente obtenidas de astrocitos primarios RbloxP/loxP HRasV12 (T653) y cRb-/- HRasV12 (T731) en ratón SCID. Estas células fueron cultivadas en DMEM (Dulbecco modified Eagle médium) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37°C y 5% C02.
Para establecer el cultivo de neuroesferas derivado del cultivo primario del tumor, las células T653 y T731 se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se tripsinizaron y se recuperaron por centrifugación en PBS a 1000 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en la mezcla de nutrientes DMEM/F-12, GlutaMAX suplementado con 1X B-27 (50X) y factores de crecimiento 0.02 pg/ml EGF (Factor de Crecimiento Epidérmico humano) y 0,02 pg/ml de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico). Las células se sembraron en placas de 60 mm y se cultivaron a 37°C y 5% de CO2. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada durante 48h, y después de este tiempo se recuperaron por centrifugación a 1000rpm durante 5min, se resuspendieron en medio de inducción neuronal (DMEM/F-12 + GlutaMAX suplementado con 1 % de N2 (100X) , MEM-NEAA al 1% (Solución de aminoácidos no esenciales MEM 100X) y 1 pg/ml de heparina, sembradas en placas de 60mm y mantenidas en este medio de cultivo durante 48 horas a 37°C y 5% de CO2.
Después de esto, las células se cultivaron en Matrigel en placas de 60mm y en presencia de medio de cultivo de diferenciación. La composición de este medio fue 50% DMEM / F12 + GlutaMAX y 50% de medio neurobasal (1X), suplementado con 0.5% N2, 0.025% Insulina, 0.5% MEM-NEAA y 1 % de penicilina-estreptomicina, 0.035% de 2-Mercaptoetanol (dilución 1 : 1000) en DMEM/F-12 + GlutaMAX y 1% B27- sin vitamina A. Las neuroesferas se mantuvieron en Matrigel durante 72 h antes de ser transferidas al biorreactor.
Las neuroesferas se mantuvieron en el biorreactor en presencia de medio de diferenciación suplementado con B27 con vitamina A (Lancaster MA et al., 2014). El medio fue cambiado cada 72 h.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un sistema esterilizable para el cultivo de organoides que comprende:
un módulo de cultivo (2) que comprende:
uno o más pocilios (4);
un módulo de agitación (8) que comprende medios de agitación para cada pocilio (4); caracterizado porque:
el módulo de agitación (8) comprende:
un sistema compresor de aire que comprende medios de control de caudal (81) configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;
una boquilla (82) para cada pocilio (4), configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio (4);
un sensor de presión (83) y un controlador (84), estando configurado el controlador (84) para actuar sobre los medios de control de caudal (81) variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal (81) en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83).
2. Sistema según la reivindicación 1 donde el controlador (84) está configurado para que la lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83) se corresponda con la curva de transferencia de presión/tiempo seleccionada para cada experimento.
3. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde el módulo de agitación (8) comprende: una cubierta (5) que comprende medios de evacuación (51 , 52) de aire de cada pocilio (4).
4. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el módulo de agitación (8) comprende: un filtro de aire (81) entre cada boquilla (82) y el sistema de compresor de aire.
5. Sistema según la reivindicación 4 donde el filtro de aire (81) es un filtro HEPA.
6. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 4-5 donde el controlador (84) está configurado para detectar una anomalía de funcionamiento correspondiente a una boquilla (82) taponada, un de filtro de aire (81) sucio y ambas.
7. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los pocilios (4) se disponen sobre un medio de soporte (10).
8. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el sistema comprende: un módulo de sensorización ambiental (43) que comprende uno o más sensores (41); donde dichos uno o más sensores (41) están configurados para medir parámetros relacionados con el cultivo seleccionados entre crecimiento celular, concentración de CO2, concentración de O2, pH, temperatura, humedad y compuestos orgánicos volátiles.
9. Sistema según la reivindicación 8 donde los uno o más sensores (41) están configurados para medir los parámetros relacionados con el cultivo en tiempo real.
10. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 donde el sistema comprende: un módulo de monitorización de crecimiento (50) que comprende:
un sistema de visión (511) basado en imágenes individuales de cada pocilio (4).
11. Sistema según la reivindicación 10 donde el sistema de visión (511) comprende medios de captura de imágenes (51) seleccionados entre medios que comprenden lente con enfoque fijo, lente con enfoque ajustable, tecnología light field y tecnología multicámara.
12. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 donde el módulo de monitorización de crecimiento (50) comprende un sistema motorizado (52) para posicionamiento del sistema de visión (511) en cada uno de los pocilios (4).
13. Sistema según la reivindicación 12 donde el sistema motorizado (52) comprende un sistema seleccionado entre:
sistema cartesiano de dos ejes motorizados, X - Y donde:
el sistema de visión (511) está instalado en un eje deslizante (X);
el eje deslizante (X) está instalado a su vez en un carro de desplazamiento perpendicular (Y), accionado por un mecanismo independiente del eje X; sistema Delta con 3 brazos motorizados donde:
el sistema de visión (511) está instalado en un soporte que está conectado mediante tres segmentos telescópicos (521) a tres carros (522) configurados para deslizar verticalmente sobre sendos ejes verticales (523), estando dispuestos los ejes verticales (523) en los vértices de un triángulo equilátero vistos sobre un plano horizontal;
un movimiento horizontal y vertical del sistema de visión se produce mediante un movimiento coordinado de los 3 carros (522) a lo largo de los ejes verticales (523);
brazo articulado con al menos dos articulaciones (52A, 52B) donde el sistema de visión (511) se sitúa en un extremo libre del brazo que dispone de al menos dos articulaciones (52A, 52B) giratorias, cuyo movimiento coordinado permite posicionar el sistema de visión.
14. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 12-13 donde el sistema motorizado (52) comprende medios de calibración del posicionamiento del sistema de visión mediante guías visuales (53) adheridas a una placa de cultivo (104) seleccionadas entre geométricas y códigos visuales.
15. Sistema según la reivindicación 14 donde las guías visuales (53) están codificadas y seleccionadas entre códigos bidimensionales y marcadores bidimensionales (fiducial markers).
16. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-15 donde el módulo de monitorización de crecimiento comprende medios de iluminación difusa (54).
17. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 donde el sistema comprende:
un módulo de control (3) que comprende:
medios de control de aireación (31):
que comprenden medios de regulación de presión PID (proporcional-integral- diferencial) configurados para mantener una presión determinada en el módulo de agitación (8) por aire, estando la presión definida por una curva de transferencia de presión con respecto al tiempo, leyendo un dato procedente del sensor de presión (83) y actuando sobre una velocidad de los medios de control de caudal (81);
donde los medios de regulación de presión comprenden medios de cálculo que permiten detectar problemas en el módulo de agitación (8) por aire;
medios de control de calidad de aire (32):
que comprenden una integración de sensores electrónicos de detección de gases, estando los sensores conectados al módulo de control (3) por medio de interfaces normalizados;
medios de cuantificación de crecimiento de organoide (33) configurados para establecer:
un crecimiento de cada uno de los organoides a partir de imágenes obtenidas por el sistema de visión; diferentes algoritmos de estimación de crecimiento, adaptables a diferentes tipos de cultivo mediante:
- estimación de crecimiento mediante cuantificación de máximo contorno bidimensional de diferentes planos focales;
- estimación de crecimiento mediante cuantificación volumétrica sobre una reconstrucción 3D del organoide obtenida a partir de varias imágenes 2D capturadas en diferentes planos focales;
medios de captura de datos en tiempo real (34) configurados para:
muestrear periódicamente una lectura del valor detectado por los sensores conectados para obtener datos capturados;
guardar los datos capturados en un dispositivo de almacenamiento a largo plazo; medios de envío de datos capturados a sistemas de información (35) a través de protocolos estándar, compatibles con medios de conexión remota (36);
medios de conexión remota (36) seleccionada entre cableada e inalámbrica, donde los medios de conexión remota (36) soportan al menos una de las modalidades de conexión seleccionadas entre red cableada ethernet, red inalámbrica WiFi (802.11), conexión inalámbrica Bluetooth, conexión cableada serie RS-232, conexión cableada serie RS-485, conexión cableada serie I2C, conexión cableada serie SPI y combinaciones de las mismas.
18. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 10-17 donde el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están separados por una base transparente (15).
19. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el sistema está adaptado para estar en una configuración de funcionamiento y una configuración de reposo, en donde en la configuración de funcionamiento el módulo de agitación (8) está acoplado al módulo de cultivo (2) y el módulo de cultivo (2) está acoplado al módulo de monitorización de crecimiento (50); y en donde en la configuración de reposo el módulo de cultivo (2) está desacoplado del módulo de monitorización de crecimiento (50) y del módulo de agitación (8), permitiendo la separación del módulo de cultivo (2) completo.
20. Método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides que comprende:
proporcionar un sistema como el que se define en la reivindicación 20 en una configuración de reposo, de manera que el módulo de agitación (8) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están desacoplados del módulo de cultivo (2); extraer el módulo de cultivo (2);
y someter el módulo de cultivo (2) a esterilización.
21. Método según la reivindicación 20 en donde la esterilización a la que se somete el módulo de cultivo (2) es autoclavado, tratamiento con peróxido de hidrógeno o tratamiento con radiación ionizante.
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