WO2020046163A1 - Препарат для лечения онкологических заболеваний - Google Patents

Препарат для лечения онкологических заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2020046163A1
WO2020046163A1 PCT/RU2018/000674 RU2018000674W WO2020046163A1 WO 2020046163 A1 WO2020046163 A1 WO 2020046163A1 RU 2018000674 W RU2018000674 W RU 2018000674W WO 2020046163 A1 WO2020046163 A1 WO 2020046163A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nanoparticles
drug
tumor
mass fraction
drug according
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000674
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Елена Дмитриевна НИКОЛЬСКАЯ
Оксана Геннадьевна ТЕРЕЩЕНКО
Ольга Александровна ЖУНИНА
Борис Игоревич КРУГЛЫЙ
Никита Григорьевич ЯББАРОВ
Евгений Сергеевич СЕВЕРИН
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Нпк Альфа-Онкотехнологии"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Нпк Альфа-Онкотехнологии" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Нпк Альфа-Онкотехнологии"
Publication of WO2020046163A1 publication Critical patent/WO2020046163A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • This invention relates to the field of medicine and biotechnology, and in particular to methods of treating tumor diseases using a synergistic combination of two cytostatic agents enclosed in biodegradable polymer nanoparticles.
  • MDR multidrug resistance
  • nanosomal drugs in the treatment of cancer is determined by the ability of nanoparticles to provide passive targeted transport of related drugs to a solid tumor or to tumor cells circulating in the bloodstream during leukemia.
  • vector molecules can be used antibodies, RNA-, or peptide aptamers to surface proteins, as well as ligands of receptors specific for tumor cells, or their fragments [2-4].
  • the drug When using such vectors, the drug will penetrate into the cell, after binding to the corresponding receptor, through receptor-mediated endocytosis in the composition of the clathrin-borne membrane vesicle. Inside this vesicle, the drug does not have an affinity for MDR pumps. Thus, this approach is one way to overcome multidrug resistance.
  • the present invention was the creation of an effective and safe drug for the treatment of a wide range of oncological diseases. This problem is solved by creating a new combination of known antiproliferative agents with various mechanisms of action in combination with an innovative method of their delivery to tumor cells.
  • the invention uses protein-vector delivery of two cytostatic agents encapsulated in biodegradable nanoparticles, which provides a significant potentiating antitumor effect and increased safety for patients through the use of reduced doses of drugs.
  • the C-terminal domain (rZdAFP) of oncofetal alpha-fetoprotein protein (AFP) was used as a vector molecule for the delivery of nanoparticles containing cytostatic agents, and a copolymer of lactic and glycolic acid (poly (lactic-soglycolic) acid) was used as biodegradable nanoparticles or PLGA).
  • a new drug for the treatment of malignant neoplasms which is a composition of two macromolecular components, including (a) nanoparticles with an average diameter of 100 to 200 nm, consisting of at least a biodegradable polymer, a vector molecule and vincristine with a mass fraction 0, 4-5-1, 0 wt.%; (b) nanoparticles with an average diameter of 100 to 200 nm, consisting of at least a biodegradable polymer, a vector molecule and methotrexate with a mass fraction of 0, 4-5-1, 0 wt.%.
  • the medicament is characterized in that a polypeptide with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is used as a vector molecule.
  • the mass fraction of the polypeptide in the nanoparticles is 0.1-5-0.3% by weight. .
  • the medicament is characterized in that a lactic and glycolic acid copolymer is used as the biodegradable polymer in the nanoparticles, wherein the ratio of lactic and glycolic acid monomers in the copolymer is 1: 1.
  • the average molecular weight of the copolymer molecule is from 10 to 20 kDa.
  • the drug is characterized in that the mass fraction of the copolymer in the nanoparticles is 10.0-5-50.0 wt.%, And the nanoparticles additionally contain D-mannitol, while the mass fraction of D-mannitol is 60.0 -5-90.0 wt.%. In some embodiments, the implementation of the nanoparticles additionally contain polyvinyl alcohol, while the mass fraction of polyvinyl alcohol is 3, 5-5-4, 0 wt.%.
  • this problem is also solved by creating a new method of treating malignant neoplasms in a subject, comprising parenterally administering to the subject a therapeutically effective amount of the aforementioned drug.
  • this method is characterized in that the effective amount of the drug when administered to a subject is from 17.1 / 6.0 ⁇ g / kg to 51, 4 / 42.0 ⁇ g / kg of the weight of the subject, where A / B indicates amount of vincristine encapsulated in the polymer shell / amount of methotrexate encapsulated in the polymer shell.
  • the method is characterized in that the malignant neoplasm is acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic B-cell leukemia, hairy cell leukemia, non-Hodgkin’s lymphomas, lymphogranulomatosis (Hodgkin’s lymphoma), or myeloid sarcoma.
  • a new effective drug for the treatment of a wide range of oncological diseases is created, consisting of two macromolecular components, and providing a more effective and safer cytotoxic effect for the patient in relation to tumor cells in comparison with its cytotoxic agents .
  • Fig. 1 The study of antitumor activity according to the criterion of lengthening the life expectancy (VL) of conjugates of nanomethotrexate with rzdAFP and nano-vincristine, as well as their composition.
  • Fig. 2 The study of antitumor activity according to the criterion of inhibition of tumor growth (SRW) of conjugates of nanomethotrexate with rzdAFP and nano-vincristine, as well as their composition.
  • SRW tumor growth
  • Fig. 3 The study of antitumor activity by the criterion of lengthening life expectancy (VL) of various ratios of the composition of the conjugates of nanomethotrexate with rZdAFP and nano-vincristine.
  • Fig. 4 The study of antitumor activity by the criterion of inhibition of tumor growth (SRW) of various ratios of the composition of the conjugates of nanomethotrexate with rzdAFP and nano-vincristine.
  • Fig. 5 Survival of mice of DBA 2 females with a solid model of P388 lymphocytic leukemia in an acute experiment when exposed to the composition of the drugs Methotrexate-Teva and Vincristine, nano-methotrexate and nano-vincristine conjugated with rzdAFP.
  • Fig. 6 Structure of the recombinant C-terminal domain of the alpha-fetoprotein protein (rZdAFP).
  • Fig. 7 Comparative cytotoxic activity of the drugs Methotrexate-Teva, Vincristine-Ebeve, nano-methotrexate and nano-vincristine conjugated with rzdAFP in relation to B-16 melanoma cells.
  • biodegradable nanoparticles that can be used to deliver cytotoxic agents to tumor cells refers to any pharmaceutically acceptable synthetic particles with a linear size of 50 to 500 nanometers, preferably consisting of aliphatic polyesters.
  • examples of such particles are polylactide, polyglycolide polymers, polylactide-polyglycolide copolymers and their block copolymers with polyethylene glycol.
  • Copolymers are a variety of polymers whose molecular chains are composed of two or more different structural units.
  • a block copolymer is a linear copolymer whose macromolecule consists of regularly or statistically alternating homopolymer blocks that differ in composition or structure.
  • Biodegradable polymers can have an average molecular weight of from 1,000 to 200,000 Daltons.
  • pharmaceutically acceptable carrier, solvent and / or excipient refers to such carriers, solvents and / or excipients that, being inactive ingredients, within the framework of a medical report, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation allergic reaction, etc. and meet a reasonable balance of benefits and risks.
  • “Inactive ingredients” are part of a drug or vaccine preparation to improve its solubility and / or stability, as well as to improve pharmacokinetics and more efficient delivery to specific organs or tissues.
  • Inactive ingredients include a variety of substances known to those skilled in the pharmaceutical art, such as pH or osmotic pressure control agents, antibacterial agents, antioxidants, surfactants (e.g., Polysorbate 20 or 80), cryostabilizers, preservatives, solvents, thickeners, fillers , carriers (micro- or nano-particles) and other substances.
  • examples of pharmaceutically acceptable solvents in the framework of the present invention can be sterile water for injection, 5% solution of dextrose (glucose) in water (D5W), physiological saline, in particular, isotonic saline, and others.
  • a therapeutically effective amount or a therapeutic dose, is meant the amount of a drug substance (or drug) administered or delivered to a patient in which the patient is most likely to exhibit the expected therapeutic effect.
  • the exact amount required can vary from subject to subject depending on the age, body weight and general condition of the patient, the severity of the disease, the method of administration of the drug, combined treatment with other drugs, etc.
  • Parenteral administration herein refers to intravenous, intraarterial, intramuscular, intraosseous, articular, subcutaneous or intrathecal administration.
  • the introduction can be carried out by injection of small volume (up to 100 ml) or by infusion, in particular, by intravenous drip infusion (intravenous drip).
  • a preferred method for administering to the subject the nanoparticles of the present invention is parenteral.
  • the introduction of nanoparticles to a subject in need of treatment is carried out in a dose sufficient to achieve a therapeutic effect.
  • the introduction can be carried out both once and several times a week (or another time interval).
  • the drug can be introduced into the patient’s body every day for a certain period of days (for example, 2-10 days), followed by a period without taking the drug (for example, 1-30 days).
  • the treatment regimen, as well as the duration of treatment can also vary from patient to patient and range from the minimum course of treatment to treatment with courses throughout the patient's life.
  • Teva Metalhotrexate-Teva
  • Ebeve Vincristine-Ebeve
  • rhabdomyosarcoma as a neoadjuvant therapy, it is possible to administer intravenously dropwise in 400 ml of an isotonic solution at a dose of 6, 4 / 6.0 mg / m 2 of the body 1 time in 7 days, 5-10 injections per treatment course (A / B numbers indicate the number Vincristine encapsulated in a polymer coating (amount of methotrexate encapsulated in a polymer coating).
  • a method for producing polymer particles (PM) containing anticancer drugs methotrexate and vincristine, as well as macromolecular design of the drug targeted delivery based on them The recombinant C-terminal domain of alpha-fetoprotein protein (rZdAFP), the structure and sequence of which is shown in Fig. 6, was used as a vector molecule for the delivery of cytostatics. Receptors of alpha-fetoprotein in the adult organism are not found normally, but occur on the surface of cells with the development of certain types of tumors, such as cancer of the liver, lung, breast and others [10].
  • Alpha-fetoprotein is a large glycoprotein (70 kDa), consisting of one polypeptide chain, and is one of the main circulating proteins found in mammals during the development of the embryo and fetus. It is also considered an oncofetal marker, as it is secreted by various tumors.
  • AFP consists of a polypeptide chain of 590 amino acid residues in size, divided into three domains of approximately 195 amino acids each. The selectivity of binding and endocytosis of the C-terminal domain of AFP by tumor cells has been demonstrated both in vitro and in vivo. Patent studies have shown that, based on AFP, a number of drugs and methods for their preparation from natural sources, as well as methods of treatment with these drugs, have been developed, including by the authors [1, 2,4,10].
  • AFP protein derived from human milk.
  • the preparation of a recombinant protein is greatly complicated by its complex structure.
  • the disadvantage of using full-sized AFP is an increase in the size of the combined molecule, which can be difficult for receptor-mediated endocytosis.
  • a nanosomal form of a composition of two cytotoxic drugs of a different mechanism of action is used (vincristine, which blocks the mitosis phase by exposing microtubules to tubulin, and methotrexate, an antimetabolite, a folic acid antagonist), based on a lactic and glycolic acid copolymer (PLGA-COOH 50 / 50 with a viscosity of 0.4 dl / g) containing the rZdAFP peptide vector for targeted drug delivery to tumor cells.
  • a lactic and glycolic acid copolymer PLGA-COOH 50 / 50 with a viscosity of 0.4 dl / g
  • the mechanical strength of a PLGA polymer depends on physical properties such as molecular weight and polydispersity. These properties also affect the ability to act as a drug delivery device and can control the rate of particle degradation. Studies have shown that the type of molecules encapsulated in a PLGA polymer also affects the rate of release.
  • the mechanical strength of the PLGA polymer, its swelling rate, tendency to hydrolysis, and the rate of biodegradation of the polymer directly depend on the degree of crystallinity of the PLGA, which further depends on the type and molar ratio of individual monomer components in the copolymer chain.
  • a higher PGA content in PLGA results in faster degradation rates, with the exception of a 1: 1 ratio for PLA: PGA, which exhibits the most rapid degradation (Makadia NK and Siegel SJ.
  • PLGA Poly Lactic-co-Glycolic Acid
  • the drug being developed is a composition of two macromolecular components, each of which is stable nanoparticles and includes a cytostatic agent, a biodegradable polymer, a vector molecule for targeted delivery of particles to affected organs and tissues, and also, preferably, a surfactant and cryoprotectant.
  • cytostatic agent a biodegradable polymer
  • a vector molecule for targeted delivery of particles to affected organs and tissues
  • a surfactant and cryoprotectant also, preferably, a surfactant and cryoprotectant.
  • the combined effect of these components is very different from the composition of pure cytotoxic drugs of different mechanisms of action (vincristine, which blocks the mitosis phase by affecting microtubules on tubulin, and methotrexate, an antimetabolite, a folic acid antagonist).
  • the combined effect of two macromolecular components is described as potentiating.
  • the spectrum of the antitumor action of the active components of the drug it can be indicated for the following nosologies: acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic B-cell leukemia, hairy cell leukemia, non-Hodgkin lymphoma, lymphogranulomatosis (Hodgkin's lymphoma) .
  • PCs polymer particles
  • IFs were obtained by nanoprecipitation [4] as a polymer matrix, a copolymer of lactic and glycolic acids (PLGA-COOH 50/50 with a viscosity of 0.4 dl / g) was used.
  • the excess surfactant (0.5% polyvinyl alcohol) and non-methotrexate and vincristine were removed using size exclusion chromatography on Superose 6 media.
  • the average particle diameter was 120-170 nm, the methotrexate incorporation efficiency was 56%, and vincristine -65% - respectively.
  • the resulting polymer particles were further conjugated to rzdAFP.
  • the organic solvent was removed on a rotary evaporator Laborota 4000 Efficient (Germany) at a vacuum of 0.9-1 kgf / m 2 and a water bath temperature of 35 ° C.
  • the resulting mixture was rotated in a J2-J21 centrifuge (Beckman, USA) for 20 min at 14,000 rpm.
  • the resulting precipitate was separated from the supernatant and resuspended on a Vibrofix VF1 Electronic vibration suspension (IKA, West Germany), after adding 5 ml of distilled water. After this, the mixture was subjected to low-frequency sonication in a Transsonic 420 ultrasonic bath (Elma, Germany) for 2 minutes.
  • the mixture was then passed through a glass filter (POR class 40-110 ⁇ m) into a 250 ml round-bottom flask.
  • the flask with the filtrate was additionally evacuated using a water-jet pump.
  • To the resulting solution was added 100 mg of cryoprotectant — D-mannitol — and frozen in a bath with liquid nitrogen.
  • the flask was dried on an ALFA 1-5 freeze dryer (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany) for 20 hours, after which it was stored at 4 ° C.
  • Methotrexate was encapsulated as follows: a 20 mg sample of methotrexate was dissolved in 5 ml of acetone, stirring on a magnetic stirrer (Variomag Multipoint, USA). Then, 50 mg of PLGA50 / 50-COOH polymer was added to the solution and mixed until completely dissolved. Using an insulin syringe with vigorous stirring, methotrexate and a polymer in acetone were added to 25 ml of 0.5% polyvinyl alcohol. Stirred for 30 minutes. Next, the organic solvent was removed on a Laborota 4000 Efficient rotary evaporator (Germany) under a vacuum of 0.9-1 kgf / m 2 and a water bath temperature of 35 ° C.
  • the resulting mixture was rotated in a J2-J21 centrifuge (Beckman, USA) for 20 min at 14,000 rpm.
  • the resulting precipitate was separated from the supernatant and resuspended on a Vibrofix VF1 Electronic vibro-suspension (IKA, Germany), after adding 10 ml of distilled water.
  • the mixture was subjected to low-frequency sonication in a Transsonic 420 ultrasonic bath (Elma, Germany) for 2 minutes.
  • the mixture was then passed through a glass filter (POR class 40-110 ⁇ m) into a 250 ml round-bottom flask.
  • the flask with the filtrate was additionally evacuated using a water-jet pump.
  • To the resulting solution was added 100 mg of cryoprotectant — D-mannitol — and frozen in a bath with liquid nitrogen.
  • the flask was dried on an ALFA 1-5 freeze dryer (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany) for 20 hours, after which it was stored at 4 ° C.
  • rZdAFP The preparation of rZdAFP was performed by constructing a plasmid vector and expression of a recombinant peptide preparation (AFP fragment) in E. coli cells [2].
  • the following technology can be used to conjugate an IF with a protein vector for delivery: 15 mg of polymer particles containing vincristine and 15 mg of polymer particles containing methotrexate are suspended in 1 ml of phosphate buffered saline (PBS), after whereupon 240 ⁇ l of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC) and N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide, NHS) from stock solution in PBS were added to the solution with a concentration of 5 mg / ml and stirred for 20 minutes; then 3 ⁇ l of b-mercaptoethanol (b-mercaptoethanol, BME) was added and stirred for another 10 min, after which 10 mg of recombinant Zd AFP was added to the reaction mass; the resulting mixture was stirred for another 30 minutes.
  • PBS
  • cytotoxic activity of the obtained preparation was confirmed on tumor cells of melanoma B-16 after 72 hours of incubation with the composition of substances MTX + Vincristine and a mixture of their conjugates with rAFP (see Fig. 7).
  • P388 lymphocytic leukemia was inoculated subcutaneously (experimental solid model) of DBA / 2 mice with a suspension of ascites-derived cells at a vaccination dose of 10 6 cells per individual, the injection volume was 0.1 ml per individual (experimental solid model).
  • the intravenous route of administration of the drug was used.
  • a strain of mouse lymphocytic leukemia P388 was used as a tumor cell strain.
  • the source of cell culture is the Russian Cancer Research Center. Blokhina RAMS, Moscow. Cells were stored at liquid nitrogen temperature. The strain was maintained on DBA / 2 mice. After thawing P388 cells, the cell suspension was pre-transplanted intraperitoneally to 2-3 DBA / 2 mice.
  • a mouse lymphocytic leukemia strain P388 was used for an experimental model of transplantable mouse leukemia. Cells were stored at liquid nitrogen temperature. After thawing P388 cells were previously intraperitoneally inoculated with 2-3 mice of the DE3A / 2 line. For experiments, the tumor material in the form of a suspension of tumor cells is taken from ascites fluid. The counting of viable tumor cells is carried out in a Goryaev chamber using a microscope. Ascitic fluid is diluted in sterile saline to a concentration of 1x10 7 cells / ml and inoculated into DBA / 2 mice intraperitoneally or subcutaneously.
  • P388 lymphocytic leukemia cells were inoculated subcutaneously to DBA / 2 mice by introducing a suspension of cells under the skin into the right subscapular region at a dose of 10 6 cells per individual, injection volume 0.2 ml per individual. The day of inoculation of tumor cells was considered the end day of the passage and was the day of the study "0".
  • mice After transplantation of tumor cells, animals were randomized, experimental groups of 10 animals (males) were formed and individual labels were applied with a saturated solution of picric acid. Animals were randomly assigned to groups using body weight as a criterion, so that the individual weight of the animals did not differ by more than 10% from the average weight of animals of the same sex.
  • Intravenous administration was performed by injecting the drug with a disposable syringe of 1 ml fixed mouse into the lateral tail vein.
  • the injected volume is 0.2 ml, in accordance with the methodological recommendations.
  • each animal was examined daily.
  • the examination included an assessment of the general behavior and general condition of the animals.
  • Determining the size of the tumor Using a caliper, 3 sizes of a solid tumor were determined in each animal in the group.
  • a, b and c are the length, width and height of the tumor node. Then, the average tumor volume in the Vcp group is calculated.
  • the degree of inhibition of tumor growth is determined by the parameters of TPO and T / C [4, 8, 9], calculated by the formulas:
  • SRW (%) ( ⁇ / control - ⁇ / experience) / Control c 100;
  • V is the average tumor volume (mm 3 ) in the drug and control groups, respectively, for a specific period; T - treated group; C — control group, T / C — inverse of SRW, is used in cases where there is stimulation of tumor growth and in all cases of treatment of the developed tumor.
  • TPO and T / C are calculated on the 1st, 7th and 14th day after the end of treatment. A significant antitumor effect should be maintained for at least 7 days.
  • Quantitative criteria for assessing activity on xenografts of human tumors were the following:
  • the studied substance is administered in combination with the most effective and widely used drugs in clinical oncology (cyclophosphamide, doxorubicin, cisplatin, methotrexate, taxol, gemzar, etc.). It is advisable to use a tumor that is sensitive and resistant to the known drug and to administer the combines in doses that are half of the MTD and the maximum effective dose, if they do not match. As a positive control, the substance and the drug are administered in full or doubled doses, which makes it possible to evaluate the therapeutic effect of the combination (EC) with an equal antitumor effect in the compared groups:
  • Additive effect - EC is less than the sum of the effects of combinants, but more than the effect of a more active combinator: A + B> ECAB> Etah (A or B).
  • Synergistic effect - EC is less than the total effect of peers equal in effect, but more than with the introduction of one of them A or B ⁇ ECAB ⁇ 3S (A + B).
  • the level of SRW of the combination of 64.0 -85.7 is in the range of “positive effect” (range of SRW ⁇ 51—80%) and “pronounced effect”, while this indicator for each of the substances individually varies from “no effect” to the "doubtful effect.”
  • the composition falls into the range ⁇ 201– 301%, that is, a pronounced effect, while the effectiveness of each of the substances turned out to be from doubtful to doubtful.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение описывает новый противоопухолевый препарат, представляющий собой стабильные наночастицы из биодеградирующего полимера, включающие 2 цитостатических агента с различными механизмами действия и векторную молекулу для адресной доставки частиц в опухолевые ткани. Предпочтительно, в лекарственную композицию также входят поверхностно-активное вещество и криопротектор. В качестве цитостатиков используются винкристин и метотрексат, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в опухолевые ткани - С-концевой домен альфа-фетопротеина. Изобретение обеспечивает существенное повышение эффективности и безопасности указанных цитостатиков. Лекарственной средство представляет собой образец готовой формы препарата, который по параметрам растворения, однородности, пирогенности, уровню эндобактериальных токсинов, стабильности, стерильности соответствует стандартам использования стерильных лекарственных форм для медицинского применения у человека. Показаниями к применению препарата могут являться острый и хронический миелоидный лейкоз, лимфобластный лейкоз и другие онкологические заболевания мягких тканей.

Description

ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Область техники
Данное изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к методам лечения опухолевых заболеваний при помощи синергидной комбинации двух цитостатических агентов, заключенных в биодеградируемые полимерные наночастицы.
Уровень техники
В настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Серьезным недостатком используемых в настоящее время низкомолекулярных противоопухолевых препаратов является их высокая общая токсичность. Химиотерапия онкологических заболеваний существующими сильнодействующими препаратами сопровождается выраженной интоксикацией организма больного и побочными эффектами, что существенно ограничивает возможности применения и использования в полной мере цитостатического и цитотоксического потенциала современных противоопухолевых средств. Возникновение токсических и побочных эффектов при проведении химиотерапии онкологических больных связано с низкой избирательностью существующих лекарств, необходимостью длительно поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, что приводит к сильному отрицательному воздействию на здоровые органы и ткани.
Кроме того, серьезной проблемой, снижающей эффективность химиотерапии злокачественных новообразований, является также множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток. Одной из основных причин МЛУ является гиперэкспрессия трансмембранных белков, относящихся к семейству АВС-транспортеров (MDR1 , MRP1 , BCRP и др.), выбрасывающих химиопрепараты, в том числе молекулы противоопухолевых препаратов, из клетки [6,9].
Один из способов решения данных проблем связан с созданием систем адресной доставки лекарственных веществ путем их включения в полимерные частицы или липосомы, имеющие размеры не более 200 нм. Высокая терапевтическая активность наносомальных препаратов при лечении онкологических заболеваний определяется способностью наночастиц обеспечивать пассивный направленный транспорт связанных с ними лекарственных веществ в солидную опухоль или в опухолевые клетки, циркулирующие в кровотоке при лейкозах.
Возможно также создание механизма активного направленного транспорта «нанопрепаратов» с помощью присоединения к ним «молекулярного адреса» или вектора, обеспечивающего связывание данных частиц со специфическими рецепторами на поверхности опухолевых клеток-мишеней. В качестве векторных молекул могут быть использованы антитела, РНК-, или пептидные аптамеры к поверхностным белкам, а также лиганды рецепторов, специфических для опухолевых клеток, или их фрагменты [2- 4].
Наиболее интересные данные получены при использовании олигонуклеотидного вектора А10 PSMA для «адресной» доставки полимерных частиц с паклитакселом в клетки рака предстательной железы мышей LNCaP [4].
При использовании таких векторов препарат будет проникать внутрь клетки, после связывания с соответствующим рецептором, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в составе окаймленного клатрином мембранного пузырька. Внутри такого пузырька препарат не обладает сродством к MDR-насосам. Таким образом, данный подход является одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости.
Существующие на сегодняшний день терапевтические подходы для лечения миелоидных лейкозов, а также других злокачественных новообразований мягких тканей недостаточно эффективны. Несмотря на то, что в литературе описаны многие низкомолекулярные агенты, способные эффективно останавливать рост раковых клеток, их применение в клинике приводит к успеху в очень ограниченном числе случаев, в том числе из-за отсутствия специфичных способов доставки в клетки опухоли и быстрого возникновения резистентных раковых клеток. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения проблемы доставки низкомолекулярных агентов внутрь клеток, описывает их эффективную комбинацию, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения широкого круга онкологических заболеваний, таких как острый и хронический миелоидный лейкоз, лимфобластный лейкоз и другие.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения являлось создание эффективного и безопасного препарата для лечения широкого круга онкологических заболеваний. Указанная задача решается путем создания новой комбинации известных антипролиферативных агентов с различными механизмами действия в сочетании с инновационным способом их доставки в опухолевые клетки. В изобретении используется белково-векторная доставка двух цитостатических агентов, инкапсулированных в биодеградируемые наночастицы, что обеспечивает значительный потенцирующий противоопухолевый эффект и повышенную безопасность для пациентов за счет использования сниженных доз препаратов. В качестве векторной молекулы для доставки наночастиц, содержащих цитостатические агенты, был использован С-концевой домен (рЗдАФП) онкофетального белка альфа- фетопротеина (АФП), а в качестве биодеградируемых наночастиц - сополимер молочной и гликолевой кислот (поли(молочная-согликолевая) кислота, или PLGA). Указанная задача решается путем создания нового лекарственного препарата для лечения злокачественных новообразований, представляющего собой композицию из двух макромолекулярных компонентов, включающую (а) наночастицы со средним диаметром от 100 до 200 нм, состоящие по меньшей мере из биодеградируемого полимера, векторной молекулы и винкристина с массовой долей 0, 4-5-1 , 0 мас.%; (б) наночастицы со средним диаметром от 100 до 200 нм, состоящие по меньшей мере из биодеградируемого полимера, векторной молекулы и метотрексата с массовой долей 0, 4-5-1 , 0 мас.%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения данный лекарственный препарат характеризуется тем, что в качестве векторной молекулы используют полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения массовая доля полипептида в наночастицах составляет 0, 1 -5-0,3 мас.%.
В некоторых вариантах осуществления изобретения данный лекарственный препарат характеризуется тем, что в качестве биодеградируемого полимера в наночастицах используют сополимер молочной и гликолевой кислот, при этом соотношение мономеров молочной и гликолевой кислот в сополимере составляет 1 :1. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения средняя молекулярная масса молекулы сополимера составляет от 10 до 20 кДа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения данный лекарственный препарат характеризуется тем, что массовая доля сополимера в наночастицах составляет 10,0-5-50,0 мас.%, и наночастицы дополнительно содержат D-маннит, при этом массовая доля D-маннита составляет 60,0-5-90,0 мас.%. В некоторых вариантах осуществления наночастицы дополнительно содержат поливиниловый спирт, при этом массовая доля поливинилового спирта составляет 3, 5-5-4, 0 мас.%.
Указанная задача также решается путем создания нового способ лечения злокачественных новообразований у субъекта, включающий парентеральное введение субъекту терапевтически эффективного количества вышеуказанного лекарственного препарата. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения данный способ характеризуется тем, что эффективное количество лекарственного препарата при введении субъекту составляет от 17,1/6,0 мкг/кг до 51 ,4/42,0 мкг/кг массы субъекта, где цифры А/Б обозначают количество инкапсулированного в полимерную оболочку винкристина/ количество инкапсулированного в полимерную оболочку метотрексата. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный способ характеризуется тем, что злокачественным новообразованием является острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный В-клеточный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, неходжкинские лимфомы, лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина) или миелоидная саркома.
При осуществлении изобретения достигается следующий технический результат: создан новый эффективный лекарственный препарат для лечения широкого круга онкологических заболеваний, состоящий из двух макромолекулярных компонентов, и обеспечивающий более эффективный и безопасный для пациента цитотоксический эффект по отношению к клеткам опухоли по сравнению с входящими в его состав цитотоксическими агентами.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Исследование противоопухолевой активности по критерию удлинение продолжительности жизни (УПЖ) конъюгатов нанометотрексата с рЗдАФП и нановинкристина, а также их композиции.
Рис. 2. Исследование противоопухолевой активности по критерию торможение роста опухоли (ТРО) конъюгатов нанометотрексата с рЗдАФП и нановинкристина, а также их композиции.
Рис. 3. Исследование противоопухолевой активности по критерию удлинение продолжительности жизни (УПЖ) различных соотношений композиции конъюгатов нанометотрексата с рЗдАФП и нановинкристина.
Рис. 4. Исследование противоопухолевой активности по критерию торможение роста опухоли (ТРО) различных соотношений композиции конъюгатов нанометотрексата с рЗдАФП и нановинкристина.
Рис. 5. Выживаемость мышей самок DBA2 с солидной моделью лимфолейкоза Р388 в остром эксперименте при воздействии композиции препаратов Метотрексат-Тева и Винкристин, нано-метотрексата и нано-винкристина, конъюгированных с рЗдАФП.
Рис. 6. Структура рекомбинантного С-концевого домена белка альфа- фетопротеина (рЗдАФП).
Рис. 7. Сравнительная цитотоксическая активность препаратов Метотрексат- Тева, Винкристин-Эбеве, нано-метотрексат и нано-винкристин конъюгированных с рЗдАФП в отношении клеток меланомы В-16. Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Под «субъектом» следует понимать человека или другое млекопитающее. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Термин «биодеградируемые наночастицы», которые могут быть использованы для доставки цитотоксических агентов в опухолевые клетки, обозначает любые фармацевтически приемлемые синтетические частицы с линейным размером от 50 до 500 нанометров, состоящие, предпочтительно, из алифатических полиэфиров. Примерами таких частиц могут служить полимеры полилактида, полигликолида, сополимеры полилактида-полигликолида и их блок-сополимеры с полиэтиленгликолем. Сополимерами называют разновидность полимеров, цепочки молекул которых состоят из двух или более различных структурных звеньев. Блок-сополимер — это линейный сополимер, макромолекула которого состоит из регулярно или статистически чередующихся гомополимерных блоков, различающихся по составу или строению. Биодеградируемые полимеры могут иметь средний молекулярный вес от 1 000 до 200 000 Дальтон.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель» относится к таким носителям, растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства или вакцинного препарата для улучшения его растворимости и/или стабильности, а также для улучшения фармакокинетики и более эффективной доставки к специфическим органам или тканям. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля pH или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества (например, полисорбат 20 или 80), криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, наполнители, носители (микро- или нано-частицы) и другие вещества. Примерами фармацевтически приемлемых растворителей в рамках настоящего изобретения могут быть стерильная вода для инъекций, 5 % раствор декстрозы (глюкозы) в воде (D5W), физиологический раствор, в частности, изотонический физиологический раствор, и другие. Под терапевтически эффективным количеством, или терапевтической дозой, подразумевается количество лекарственной субстанции (или лекарственного препарата), вводимой или доставляемой пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.
Под парентеральным введением в настоящем документе подразумевается внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрикостное, внутрисуставное, подкожное или интратекальное введение. Введение может осуществляться путем инъекций малого объёма (до 100 мл) или инфузией, в частности, путем внутривенной капельной инфузии (внутривенного капельного вливания).
Предпочтительный способ введения субъекту наночастиц по настоящему изобретению - парентеральный. Введение наночастиц субъекту, нуждающемуся в лечении, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в неделю (или другой временной интервал). Кроме того, лекарственное средство может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), после которого следует период без приема лекарственного средства (например, 1-30 дней). Схема лечения, а также длительность лечения также могут варьировать от пациента к пациенту и составлять от минимального курса лечения до проведения лечения курсами на протяжении всей жизни пациента.
При осуществлении настоящего изобретения в качестве метотрексата использовали метотрексат компании Тева (Метотрексат-Тева), а в качестве винкристина винкристин компании Эбеве (Винкристин-Эбеве).
В зависимости от формы и тяжести заболевания возможны нижеследующие режимы введения. Например, при рабдомиосаркоме в качестве неоадъювантной терапии возможно введение внутривенно капельно медленно в 400 мл изотонического раствора в дозе 6, 4/6.0 мг/м2 тела 1 раз в 7 дней, 5-10 введений на курс лечения (цифры А/Б обозначают количество инкапсулированного в полимерную оболочку винкристина/ количество инкапсулированного в полимерную оболочку метотрексата). При остром лимфобластном лейкозе для индукции ремиссии возможно введение внутривенно капельно в 400 мл изотонического раствора в дозе 2.15/0,76 мг/м2 1 раз в 48 часов ( через день), 5-10 введений.
В настоящем изобретении был разработан способ получения полимерных частиц (ПЧ), содержащих противоопухолевые препараты метотрексат и винкристин, а также высокомолекулярной конструкции препарата адресной доставки на их основе. В качестве векторной молекулы для доставки цитостатиков использовали рекомбинантный С- концевой домен белка альфа-фетопротеина (рЗдАФП), структура и последовательность которого приведена на рис.6. Рецепторы альфа-фетопротеина во взрослом организме не обнаруживаются в норме, но возникают на поверхности клеток при развитии некоторых видов опухолей, таких как рак печени, легкого, молочной железы и другие [10]. Альфа- фетопротеин представляет собой крупный гликопротеин (70 кДа), состоящий из одной полипептидной цепи, и является одним из основных циркулирующих белков, обнаруживаемых у млекопитающих в процессе развития эмбриона и плода. Он считается также онкофетальным маркером, поскольку секретируется различными опухолями. АФП состоит из полипептидной цепи размером 590 аминокислотных остатков, разделенной на три домена примерно по 195 аминокислот каждый. Селективность связывания и эндоцитоза С-концевого домена АФП опухолевыми клетками была продемонстрирована как in vitro, так и in vivo. Патентные исследования показали, что на основе АФП разработаны, в том числе и авторами, ряд препаратов и способов их получения из природных источников, а также способы лечения этими препаратами [1 ,2,4,10].
Для использования АФП в терапевтических целях необходимы значительные количества белка, которые трудно обеспечить выделением из природных источников. Получение рекомбинантного белка сильно осложнено его сложной структурой. Кроме того, недостатком использования полноразмерного АФП является увеличение размера комбинированной молекулы, что может создавать затруднения при рецептор- опосредованном эндоцитозе.
Избежать этих затруднений удается при использовании генно-инженерных конструкций, обеспечивающих получение не цельного АФП, а его активных фрагментов, что, во-первых, значительно упрощает и удешевляет процедуру получения препарата, а во-вторых, облегчает эндоцитоз препарата в опухолевые клетки. В данной изобретении использовали С-концевой домен альфа-фетопротеина (рЗдАФП), описанный ранее [1 ,2], для получения конъюгатов с наночастицами, с инкорпорированными в них цитостатическими агентами - метотрексатом и винкристином. Исходя из электрофореграммы, молекулярная масса фрагмента белка составляет приблизительно 23 кДа. По данным масс-спектрометрического анализа она оказалась равной 22480 Да. Также на масс-спектре виден пик, соответствующий 22620 Да. Он может соответствовать целевому белку с добавлением N-концевого метионина. Селективность связывания и эндоцитоза С-концевого домена АФП опухолевыми клетками была продемонстрирована как in vitro, так и in vivo [1 ,2]. Данное свойство указывает на перспективность использования полученного рекомбинантного белка в качестве векторной молекулы для адресной доставки противоопухолевых веществ как в виде конъюгатов, так и в составе полимерных наночастиц.
В предпочтительных вариантах изобретения используют наносомальную форму композиции из двух цитотоксических препаратов разного механизма действия (винкристина, блокирующего фазу митоза путем воздействия на тубулин микротрубочек, и метотрексата - антиметаболита, антагониста фолиевой кислоты), на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA-COOH 50/50 с вязкостью 0,4 дл/г), содержащая пептидный вектор рЗдАФП, для адресной доставки лекарства в опухолевые клетки.
Механическая прочность полимера PLGA зависит от физических свойств, таких как показатели молекулярной массы и полидисперсности. Эти свойства также влияют на способность выступать в качестве устройства доставки лекарственного средства и могут контролировать скорость деградации частиц. Исследования показали, что тип инкапсулированных в полимере PLGA молекул также влияет на скорость высвобождения. Механическая прочность полимера PLGA, его скорость набухания, склонность к гидролизу и скорость биодеградации полимера непосредственно зависят от степени кристалличности PLGA, которая далее зависит от типа и молярного соотношения отдельных мономерных компонентов в цепи сополимера. Как правило, более высокое содержание PGA в составе PLGA приводит к более быстрым темпам деградации, за исключением соотношения 1 :1 для PLA:PGA, которое демонстрирует наиболее быструю деградацию (Makadia НК и Siegel SJ. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 2011 Sep 1 ;3(3): 1377-1397). Биораспределение и фармакокинетика полимеров PLGA показывают нелинейные и дозозависимые профили. Более того, период жизни в кровотоке и поглощение мононуклеарной фагоцитарной системой будет зависеть от дозы и состава PLGA частиц (Makadia НК и Siegel SJ. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 2011 Sep 1 ;3(3): 1377-1397). Соответственно, способ приготовления и состав частиц PLGA (в том числе карго) будет влиять на их тропность к определенным органам и тканям в организме человека.
В предпочтительных вариантах изобретения разрабатываемый лекарственный препарат представляет собой композицию из двух макромолекулярных компонентов, каждый из которых представляет собой стабильные наночастицы и включает цитостатик, биодеградирующий полимер, векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани, а также, предпочтительно, поверхностно-активное вещество и криопротектор. Сочетанное действие этих компонентов сильно отличается от композиции чистых цитотоксических препаратов разного механизма действия (винкристина, блокирующего фазу митоза путем воздействия на тубулин микротрубочек, и метотрексата - антиметаболита, антагониста фолиевой кислоты). По параметрам протестированной противоопухолевой эффективности (ТРО и УПЖ) сочетанное действие двух макромолекулярных компонентов описывается как потенцирующее. Исходя из анализа спектра противоопухолевого действия активных компонентов препарата, он может быть показан при следующих нозологиях: острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный В-клеточный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, неходжкинские лимфомы, лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина) или миелоидная саркома.
Использование одновременно двух цитостатических агентов с разным механизмом антинеопластического действия, а именно: ингибирование синтеза ДНК и РНК, путем блокировки активности дигидрофолатредуктазы (метотрексат) и нарушение митотической активности за счет полимеризации тубулина (винкристин) приводит к потенцированию противоопухолевого действия, что позволяет использовать более низкие эффективные терапевтические дозы. Такое решение в данной ситуации имеет ключевое значение, поскольку эффективная доставка больших дозировок этих препаратов невозможна из-за ограниченного включения их в наночастицы.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Примеры получения полимерных частиц (ПЧ) и инкапсуляции цитотоксических препаратов.
ПЧ получали методом нанопреципитации [4] в качестве полимерной матрицы использовали сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA-COOH 50/50 с вязкостью 0,4 дл/г). Удаление избытка поверхностно-активного вещества (0,5% поливиниловый спирт) и не включенного метотрексата и винкристина проводились помощью экскпюзионной гель-хроматографии на носителе Superose 6. Средний диаметр полученных частиц составлял 120-170 нм, эффективность включения метотрексата составила 56%, а винкристина -65% - соответственно. Полученные полимерные частицы далее конъюгировали с рЗдАФП.
Для производства ПЧ использовали разработанную авторами технологию инкапсуляции винкристина в полимерные частицы: навеску 10 мг винкристина растворяли в 5 мл ацетона, перемешивая на магнитной мешалке (Variomag Multipoint, США). Затем в раствор добавляли 50 мг полимера PLGA50/50-COOH и перемешивали до полного растворения. С помощью инсулинового шприца при интенсивном перемешивании к 25 мл 0,5% поливинилового спирта добавляли винкристин и полимер в ацетоне. Перемешивали 30 мин. Далее удаляли органический растворитель на роторном испарителе Laborota 4000 Efficient (Германия) при вакууме 0,9-1 кгс/м2 и температуре водяной бани 35°С. С целью удаления поливинилового спирта полученную смесь вращали на центрифуге J2-J21 (Beckman, США) в течение 20 мин при 14 000 об/мин. Полученный осадок отделяли от супернатанта и ресуспендировали на виброподвесе Vibrofix VF1 Electronic (IKA, ФРГ), предварительно добавив 5 мл дистиллированной воды. После этого смесь подвергали низкочастотной соникации на ультразвуковой бане Transsonic 420 (Elma, Германия) в течение 2 мин. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр (класс ПОР 40-110 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно вакуумировали с помощью водоструйного насоса. К полученному раствору добавляли 100 мг криопротектора— Д-маннита— и замораживали в бане с жидким азотом. Колбу сушили на лиофильной сушке ALFA 1-5 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) в течение 20 ч, после чего хранили при 4°С.
Инкапсуляцию метотрексата производили следующим образом: навеску 20 мг метотрексата растворяли в 5 мл ацетона, перемешивая на магнитной мешалке (Variomag Multipoint, США). Затем в раствор добавляли 50 мг полимера PLGA50/50-COOH и перемешивали до полного растворения. С помощью инсулинового шприца при интенсивном перемешивании к 25 мл 0,5% поливинилового спирта добавляли метотрексат и полимер в ацетоне. Перемешивали 30 мин. Далее удаляли органический растворитель на роторном испарителе Laborota 4000 Efficient (Германия) при вакууме 0,9-1 кгс/м2 и температуре водяной бани 35°С. С целью удаления поливинилового спирта полученную смесь вращали на центрифуге J2-J21 (Beckman, США) в течение 20 мин при 14 000 об/мин. Полученный осадок отделяли от супернатанта и ресуспендировали на виброподвесе Vibrofix VF1 Electronic (IKA, ФРГ), предварительно добавив 10 мл дистиллированной воды. После этого смесь подвергали низкочастотной соникации на ультразвуковой бане Transsonic 420 (Elma, Германия) в течение 2 мин. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр (класс ПОР 40-110 мкм) в круглодонную колбу на 250 мл. Колбу с фильтратом дополнительно вакуумировали с помощью водоструйного насоса. К полученному раствору добавляли 100 мг криопротектора— Д-маннита— и замораживали в бане с жидким азотом. Колбу сушили на лиофильной сушке ALFA 1-5 (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия) в течение 20 ч, после чего хранили при 4°С.
Пример получения препарата белково-векторной доставки.
Получение рЗдАФП проводили путем конструирования плазмидного вектора и экспрессия рекомбинантного пептидного препарата (фрагмента АФП) в клетках Е. coli [2]. Очистку и выделение рЗдАФП осуществляли на аффинной колонке (мышиные антитела 4аЗ, смола BrCN-Sepharose), достигая чистоты конечного продукта 95% (по данным электрофореза и иммуноблоттинга). Для осуществления конъюгации ПЧ с белковым вектором для доставки может быть использована следующая технология: 15 мг полимерных частиц, содержащих винкристин, и 15 мг полимерных частиц, содержащих метотрексат, суспендировали в 1 мл фосфатно- солевого буфера (Phosphate-Buffered Saline, PBS), после чего к раствору добавляли 240 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC) и N-гидроксисукцинимида (N-hydroxysuccinimide, NHS) из стокового раствора в PBS с концентрацией 5 мг/мл и перемешивали 20 мин; затем добавляли 3 мкл b-меркаптоэтанола (b-mercaptoethanol, ВМЕ) и перемешивали еще 10 мин, после чего к реакционной массе добавляли 10 мг рекомбинантного Зд АФП; полученную смесь перемешивали еще 30 мин. Для остановки реакции к полученному конъюгату добавляли 3 мкл этаноламина. Проводили гель-фильтрацию реакционной массы на сорбенте Superose 12 (GE Healthcare, США). Фракцию с целевым продуктом лиофилизировали на лиофильной сушке ALFA 1-5 в течение 20 ч, после чего хранили при -20°С.
Цитотоксическую активность полученного препарата (рЗдАФП -МТХ + рЗдАФП - ВНК) подтверждали на опухолевых клетках меланомы В-16 после 72 ч. инкубации с композицией субстанций МТХ+ Винкристин и смеси их конъюгатов с рАФП (см. рис.7).
Примеры доклинического изучения лекарственного препарата.
Изучение сравнительной противоопухолевой активности композиции препаратов Метотрексат-Тева + Винкристин-Эбеве (МТХ + ВНК ) и коньюгатов нано-Метотрексата с рЗдАФП и наноВинкристина с рЗдАФП (нМТЗД+ нВНЗД) проводили на солидной модели лимфолейкоза Р388 у мышей самок DBA/2.
Исследование проводили на экспериментальной модели перевиваемого лимфолейкоза мышей Р388. Лимфолейкоз Р388 прививали мышам линии DBA/2 подкожно (экспериментальная солидная модель) суспензией клеток, полученных из асцита, в прививочной дозе 106 клеток на особь, объем инъекции составлял или 0,1 мл на особь (экспериментальная солидная модель). При исследования противоопухолевой активности препаратов использовали внутривенный способ введения препарата.
В качестве штамма опухолевых клеток использовали штамм лимфолейкоза мыши Р388. Источник культуры клеток - Российский онкологический научный центр им. Блохина РАМН, Москва. Клетки хранили при температуре жидкого азота. Штамм поддерживали на мышах линии DBA/2. После разморозки клеток Р388, суспензию клеток предварительно перевивали внутрибрюшинно 2-3 мышам линии DBA/2.
Подготовка культуры клеток для перевивки опухоли.
Использовали штамм лимфолейкоза мыши Р388 для экспериментальной модели перевиваемого лейкоза мышей. Клетки хранили при температуре жидкого азота. После размораживания клетки Р388 предварительно перевивали внутрибрюшинно 2-3 мышам линии DE3A/2. Для проведения экспериментов опухолевый материал в виде суспензии опухолевых клеток берут из асцитной жидкости. Подсчет жизнеспособных опухолевых клеток проводят в камере Горяева с помощью микроскопа. Асцитную жидкость разводят в стерильном физиологическом растворе до концентрации 1x107 клеток/мл и перевивают мышам линии DBA/2 внутрибрюшинно или подкожно.
Перевивка опухоли.
Для развития солидной опухоли клетки лимфолейкоза Р388 прививали мышам линии DBA/2 подкожно путем введения суспензии клеток под кожу в правую подлопаточную область в дозе 106 клеток на особь, объем инъекции 0,2 мл на особь. День перевивки опухолевых клеток считался днем окончания пассажа и являлся днем исследования «0».
Распределение по группам.
После перевивки опухолевых клеток животных рандомизировали, формировали экспериментальные группы по 10 животных (самцов) и наносили индивидуальные метки насыщенным раствором пикриновой кислоты. Животных распределяли по группам случайным образом, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 10% от средней массы животных одного пола.
Процедура введения препаратов.
Внутривенное введение проводили путем инъецирования препарата одноразовым шприцем объемом 1 мл фиксированной мыши в латеральную хвостовую вену. Вводимый объем - 0,2 мл, в соответствии с методическими рекомендациями.
Методы исследования
Ежедневный осмотр
В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных.
Внешний вид и падеж в течение периода введения.
Наблюдение за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья и смертности проводили постоянно, в течение всего эксперимента.
Взвешивание животных.
Взвешивание животных осуществлялось через 24 часа на поверенных весах фирмы «Sartorius GMBH», определялась динамика изменения массы тела.
Определение размеров опухоли. С помощью штангенциркуля, у каждого животного в группе производили определение 3 размеров солидной опухоли.
Вскрытие (некропсия).
Проводилась некропсия и паталогоанатомический анализ павших и забитых после эксперимента животных.
Статистика.
Анализ полученных данных проводился в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств [5].
Оценка эффективности противоопухолевого действия лекарственных средств
Для оценки противоопухолевого эффекта по торможению роста опухоли проводится определение 2-3 размеров опухоли у каждого животного в группе, после чего вычисляется объем (V, мм3) опухоли по формулам:
V = а*Ь*с или V = (axb)2/2 ,
где а, b и с— длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем вычисляется средний объем опухоли в группе Vcp.
Степень торможения роста опухоли определяется по показателям ТРО и Т/С [4, 8, 9], вычисляемым по формулам:
ТРО (%) = (\/контроля - \/опыта)/ Уконтроля c 100;
Т/С (%) = (Уопыта / Уконтроля) c 100,
где V— средний объем опухоли (мм3) в получавшей препарат и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок; Т— леченая группа; С— контрольная группа, Т/С— величина, обратная ТРО, используется в случаях, когда имеется стимуляция роста опухоли и во всех случаях лечения развившейся опухоли.
Допустимо определять ТРО и Т/С, используя в качестве показателя среднюю массу опухоли у погибших и забитых в различные сроки исследования животных. ТРО и Т/С рассчитываются на 1 , 7 и 14 сутки после окончания лечения. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток.
Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта на опухолях животных были следующие:
ТРО<20% - 0
ТРО<20— 50% ±
ТРО<51— 80% +
ТРО<81— 90% ++
ТРО<91— 100%+<50% ПР/излечения +++
ТРО<91— 100%+>50% ПР/излечения ++++
Количественные критерии оценки активности на ксенографтах опухолей человека были следующие:
Т/С=51— 100% 0
Т/С=36— 50% +
Т/С=21— 35% ++
Т/С=6— 20% +++
Т/С<5% ++++
Минимальные значения для трех обязательных для изучения чувствительных к препарату солидных опухолей или подкожно перевитых лейкозов:
ТРО>70%, Т/С<30%.
Минимальные значения для единственной чувствительной к препарату опухоли из всего спектра обязательных для изучения опухолей:
ТРО>90%, Т/С<10%.
Оценка эффективности в комбинации противоопухолевых препаратов
Изучаемое вещество вводят в комбинации с доступными наиболее эффективными и широко используемыми в клинической онкологии препаратами (циклофосфаном, доксорубицином, цисплатином, метотрексатом, таксолом, гемзаром и пр.). Целесообразно использовать чувствительную и резистентную к известному препарату опухоли и вводить комбинаты в дозах, составляющих половину от МПД и максимальной эффективной дозы, если таковые не совпадают. В качестве положительного контроля вещество и препарат вводят в полных или удвоенных дозах, что позволяет при равном противоопухолевом эффекте в сравниваемых группах оценить терапевтический эффект комбинации (ЭК):
Аддитивный эффект - ЭК меньше суммы эффектов комбинантов, но больше эффекта более активного комбинанта: А + В > ЭКАВ> Этах (А или В).
Синергический эффект - ЭК меньше суммарного эффекта равных по эффекту комбинантов, но больше, чем при введении одного из них А или В< ЭКАВ < 3S (А + В).
Суммационный эффект— ЭК равен суммарному эффекту комбинантов: ЭКАВ = 3S (А + В).
Потенцирующий эффект— ЭК больше суммарного эффекта комбинантов: ЭКАВ >3S (А + В).
Снижение эффекта— ЭК меньше эффекта более активного комбинанта: ЭКАВ <Этах (А или В).
Отсутствие эффекта— ЭК меньше минимального критерия эффективности: ЭКАВ
<3min.
Экспериментальные группы и схемы лечения, использовавшиеся при осуществлении изобретения, представлены в Таблице 1. Таблица 1. Экспериментальные группы и схемы лечения.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Как показано на Таблице 1 и на Рис. 1 и 2, сочетанный противоопухолевый эффект исследуемой комбинации субстанций по критериям эффективности и безопасности в общем существенно превышает таковой при воздействии каждой из этих субстанций по отдельности. При этом уровень ТРО комбинации 64,0 -85,7 находится в диапазоне «положительного эффекта» (диапазон ТРО <51— 80%) и «выраженного эффекта», тогда как этот показатель у каждой из субстанций по отдельности колеблется от «отсутствия эффекта» до «сомнительного эффекта».
По критерию «УПЖ» у композиции (значение 253,9-296,1) входит в диапазон <201— 301 %, то есть выраженного эффекта, тогда как эффективность каждой из субстанций оказалась от отсутствия таковой до сомнительной.
При этом:
1. По критерию ТРО, композиция 350/130 ЭКАВ> Э£(А+В), где А=13,3%, В=49,3% ЭКАВ=64,0 т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
По критерию УПЖ, соответственно: ЭКАВ> Э£(А+В), где А=1 12,6%, В=137,4%, ЭКАВ= 253%, т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
2. По критерию ТРО, композиция 1000/130 ЭКАВ> Э£(А+В), где А=29,3%, В=49,3% ЭКАВ=79,3 т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
По критерию УПЖ, соответственно: ЭКАВ> Э£(А+В), где А=122,3%, В=137,4%, ЭКАВ= 259,7%, т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
3. По критерию ТРО, композиция 350/260 ЭКАВ> Э£(А+В), где А= А=13,3%, В=58,6% ЭКАВ=82,3 т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
По критерию УПЖ, соответственно: ЭКАВ> Э£(А+В), где А=1 12,6%, В=147,1 %, ЭКАВ= 292,7%, т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект. 4. По критерию ТРО, композиция 1000/260 ЭКАВ<Э£(А+В), где А= А=29,3%, В=58,6% ЭКАВ=85,7 т.е. комбинация оказывает синергический эффект.
По критерию УПЖ, соответственно: ЭКАВ> Э£(А+В), где А=112,6%, В=147,1%, ЭКАВ= 296,1%, т.е. комбинация оказывает потенцирующий эффект.
Таблица 2. Исследование противоопухолевой активности по критериям торможение роста опухоли (ТРО) и удлинение продолжительности жизни (УПЖ) различных соотношений композиции конъюгатов нанометотрексата с р.ЗдАФП и нановинкристина.
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Переносимость терапии препаратами МТХ + ВНК и нМТЗД+ нВНЗД животными
После введения композиции препаратов МТХ + ВНК наблюдалось угнетение двигательной активности животных, которое прогрессировало при повторных введениях. Кроме этого, через некоторое время после введения наблюдалась дозозависимая местная реакция - отек, иногда очаги некроза. Введение нМТЗД+ нВНЗД животные переносили значительно лучше, седация и местная реакция практически отсутствовали. Как показано на Таблице 2 и рис. 3,4, в группах животных, получавших композицию
нМТЗД+ нВНЗД, гибели животных не зарегистрировано. В группе животных, получавших композиции препаратов МТХ + ВНК в дозе 350 мкг/кг/130, гибели животных не
отмечалось; в группе животных, получавших композиции препаратов МТХ + ВНК в дозе 350 мкг/кг/360 к 20 дню, погибло 2 животных из 10 (20%); в дозе 350 мкг/кг/780 - 8 из 10 (80%). Впоследствии у выживших животных возобновился рост опухоли, и они погибли на 34 день от начала эксперимента.
Выживаемость мышей самок DBA2 с солидной моделью лимфолейкоза
Р388.
Таблица 3. Изучение сравнительной противоопухолевой активности композиции препаратов Метотрексата + Винкристина (МТХ + ВНК) и конъюгата нано-Метотрексата с рЗдАФП и наноВинкристина с рЗдАФП (нМТЗД+ нВНЗД) на солидной модели лимфолейкоза Р388 у мышей самок DBA2.
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Как показано на Таблице 3 и Рис. 5, острая токсичность препарата конъюгата нано- Метотрексата с ЗДАФП и наноВинкристина с ЗДАФП (нМТЗД+ нВНЗД) уменьшается в 3,9 раза (LD5Q (МТХ + ВК) /1_О50 (нМТЗД+ нВНЗД)= 3,9).
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Источники информации.
1. Годованный А. В., и др. Изучение противоопухолевой активности in vitro конъюгата рекомбинантного С-концевого домена АФП // Молекулярная медицина, 2011 , Ns . 1 , с.44- 48.
2. RU 2285537 С; опубл. 20.10.2006.
3. Караулов А. В, и др. "Характеристика моноклональных антител к рецептору афп в сравнении с афп по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека" Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2001. -N З.-С.19-25
4. Круглый Б. И., и др. "Сравнительные исследования противоопухолевой активности и безопасности нового препарата белково-векторной доставки актиномицинового ряда на экспериментальных опухолевых моделях у мышей" Онкопедиатрия, т.З/Ns 3, стр.188-199, 2016.
5. Ред. Миронов А.Н., Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая.— М.: Гриф и К, 2012.— 944 с.
6. Петров Р.В., и др. "Направленный транспорт противоопухолевых и антибактериальных препаратов". Аллергология и иммунология. 2003. 4(Ns3):91-96
7. RU 2105567 С1 , опубл. 27.02.1998.
8. RU 2154468 С1 ; опубл. 09.11.1999.
9. Северин Е. С., и др. «Разработка новых технологий создания лекарственных препаратов избирательного действия». Аллергология и иммунология, 16(4): 347-350, 2015.
10. Северин Е.С, и др. "Противоопухолевая активность конъюгатов альфа-фетопротеина с доксорубицином в отношении клеток карциномы яичника человека in vitro". Акушерство и гинекология, 1998.-N З.-С.45-47.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Лекарственный препарат для лечения злокачественных новообразований, представляющий собой композицию из двух макромолекулярных компонентов, включающую
(а) наночастицы со средним диаметром от 100 до 200 нм, состоящие по меньшей мере из биодеградируемого полимера, векторной молекулы и винкристина с массовой долей 0,4+1 ,0 мас.%;
(б) наночастицы со средним диаметром от 100 до 200 нм, состоящие по меньшей мере из биодеградируемого полимера, векторной молекулы и метотрексата с массовой долей 0, 4+1 , 0 мас.%.
2. Лекарственный препарат по п. 1 , характеризующийся тем, что в качестве векторной молекулы используют полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID 140:1.
3. Лекарственный препарат по п. 2, характеризующийся тем, что массовая доля полипептида в наночастицах составляет 0,1 +0,3 мас.%.
4. Лекарственный препарат по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве биодеградируемого полимера в наночастицах используют сополимер молочной и гликолевой кислот, при этом соотношение мономеров молочной и гликолевой кислот в сополимере составляет 1 :1.
5. Лекарственный препарат по п. 4, характеризующийся тем, что средняя молекулярная масса молекулы сополимера составляет от 10 до 20 кДа.
6. Лекарственный препарат по п. 4, характеризующийся тем, что массовая доля сополимера в наночастицах составляет 10,0+50,0 мас.%.
7. Лекарственный препарат по п. 4, характеризующийся тем, что наночастицы дополнительно содержат D-маннит, при этом массовая доля D-маннита составляет 60,0+90,0 мас.%.
8. Лекарственный препарат по п. 7, характеризующийся тем, что наночастицы дополнительно содержат поливиниловый спирт, при этом массовая доля поливинилового спирта составляет 3, 5+4,0 мас.%.
9. Способ лечения злокачественных новообразований у субъекта, включающий парентеральное введение субъекту терапевтически эффективного количества лекарственного препарата по п. 1.
10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что эффективное количество лекарственного препарата при введении субъекту составляет от 17,1/6,0 мкг/кг до 51 ,4/42,0 мкг/кг массы субъекта.
11. Способ лечения по п. 10, характеризующийся тем, что злокачественным новообразованием является острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный В-клеточный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, неходжкинские лимфомы, лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина) или миелоидная саркома.
PCT/RU2018/000674 2018-08-28 2018-10-11 Препарат для лечения онкологических заболеваний WO2020046163A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201800477 2018-08-28
EA201800477A EA201800477A1 (ru) 2018-08-28 2018-08-28 Препарат для лечения онкологических заболеваний

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020046163A1 true WO2020046163A1 (ru) 2020-03-05

Family

ID=69636676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000674 WO2020046163A1 (ru) 2018-08-28 2018-10-11 Препарат для лечения онкологических заболеваний

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA201800477A1 (ru)
WO (1) WO2020046163A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2285537C1 (ru) * 2005-04-05 2006-10-20 Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики (АНО "ИнМоДи") Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его конъюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей
RU2451509C1 (ru) * 2011-03-31 2012-05-27 Автономная некоммерческая организация "Институт Молекулярной Диагностики" (АНО "ИнМоДи) Противоопухолевый препарат
EA023175B1 (ru) * 2007-09-28 2016-05-31 Бинд Терапьютикс, Инк. Таргетирование раковых клеток с использованием наночастиц

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2285537C1 (ru) * 2005-04-05 2006-10-20 Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики (АНО "ИнМоДи") Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его конъюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей
EA023175B1 (ru) * 2007-09-28 2016-05-31 Бинд Терапьютикс, Инк. Таргетирование раковых клеток с использованием наночастиц
RU2451509C1 (ru) * 2011-03-31 2012-05-27 Автономная некоммерческая организация "Институт Молекулярной Диагностики" (АНО "ИнМоДи) Противоопухолевый препарат

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DINARVAND R. ET AL.: "Polylactide-co-glycolide nanoparticles for controlled delivery of anticancer agents", INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE, vol. 6, 2011, pages 877 - 895, XP055168931 *
KANO YASUHIKO ET AL.: "Effects of Vincristine in Combination with Methotrexate and Other Antitumor Agents in Human Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Culture", CANCER RESEARCH, vol. 48, 1988, pages 351 - 356, XP055689264 *
PIMPLE SMITA ET AL.: "PLGA nanoparticles loaded with etoposide and quercetin dihydrate individually: in vitro cell line study to ensure advantage of combination therapy", CANCER NANO, vol. 3, 2012, pages 25 - 36 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201800477A1 (ru) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Engineering endogenous tumor‐associated macrophage‐targeted biomimetic nano‐RBC to Reprogram tumor immunosuppressive microenvironment for enhanced chemo‐immunotherapy
Guo et al. Thrombin-responsive, brain-targeting nanoparticles for improved stroke therapy
Liu et al. Development of a hypoxia-triggered and hypoxic radiosensitized liposome as a doxorubicin carrier to promote synergetic chemo-/radio-therapy for glioma
Saeed et al. Engineering nanoparticles to reprogram the tumor immune microenvironment for improved cancer immunotherapy
AU2017202970B2 (en) Method of treating cancer
Zhao et al. In situ activation of STING pathway with polymeric SN38 for cancer chemoimmunotherapy
Sun et al. Tumor microenvironment-triggered charge reversal polymetformin-based nanosystem co-delivered doxorubicin and IL-12 cytokine gene for chemo–gene combination therapy on metastatic breast cancer
Yu et al. Advances of nanomedicines in breast cancer metastasis treatment targeting different metastatic stages
Xie et al. Immunoengineering with biomaterials for enhanced cancer immunotherapy
CN106237340B (zh) 透明质酸纳米颗粒在制备治疗淋巴系统肿瘤的药物的用途
US20160213788A1 (en) Active targeting antitumor drug and preparation method therefor
US11679160B2 (en) Castration resistant prostate cancer
Huang et al. Nanomedicine-combined immunotherapy for cancer
Zhao et al. Nanomedicine enables spatiotemporally regulating macrophage-based cancer immunotherapy
Zhou et al. Bio-mimicking nanoparticles for targeted therapy of malignant melanoma
CN112135639B (zh) 细胞组装介导的癌症免疫治疗检查点抑制剂的递送
Lv et al. Enhanced antiglioblastoma efficacy of neovasculature and glioma cells dual targeted nanoparticles
KR20100062990A (ko) 국소적 약물전달을 위한 주사용 고분자-지질 배합물
Dai et al. Nanomedicines modulating myeloid-derived suppressor cells for improving cancer immunotherapy
US20140296173A1 (en) Stable nanocomposition comprising epirubicin, process for the preparation thereof, its use and pharmaceutical compositions containing it
Zhang et al. Hyaluronate-based self-stabilized nanoparticles for immunosuppression reversion and immunochemotherapy in osteosarcoma treatment
Xiao et al. Nanodrug simultaneously regulates stromal extracellular matrix and glucose metabolism for effective immunotherapy against orthotopic pancreatic cancer
Sharma et al. Multifunctional nanocomposites modulating the tumor microenvironment for enhanced cancer immunotherapy
RU2451509C1 (ru) Противоопухолевый препарат
Lahooti et al. Targeting endothelial permeability in the EPR effect

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18931367

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18931367

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1