WO2020040293A1 - 間葉系幹細胞の製造方法 - Google Patents
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- separating cells means that cells of interest in a cell population are 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 99% or more. Means to operate.
- a cell population comprising mesenchymal stem cells and CD45 positive cells is cultured in the presence of IL-33.
- the cell population may be cultured in a medium containing IL-33, or IL-33 may be added to the medium in which the cell population is being cultured.
- concentration of IL-33 in the medium can be, for example, about 0.01-100 ng / mL, about 0.1-10 ng / mL, or about 0.5-5 ng / mL.
- Method of culturing mesenchymal stem cells also includes a step of co-culturing mesenchymal stem cells with CD45-positive cells in the presence of a substance that activates CD45-positive cells (eg, IL-33).
- a method for culturing a stem cell is provided. This culture method promotes the growth of mesenchymal stem cells.
- “Co-culture” means that cells are cultured in a state where cell-to-cell contact between mesenchymal stem cells and CD45-positive cells is possible. Co-culture can be performed according to the culture in the above-described method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells.
- IL-33 is a) a polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence of full-length or mature IL-33 protein; b) a polypeptide comprising the amino acid sequence of mature IL-33 protein and consisting of a partial amino acid sequence of full-length IL-33 protein; c) a polypeptide comprising or consisting of a partial amino acid sequence of the full-length or mature IL-33 protein, and functionally equivalent to the full-length or mature IL-33 protein; d) Substitution, deletion, insertion or addition of one or more, for example, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence of the full-length or mature IL-33 protein
- a polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or functionally equivalent to the full-length or mature IL-33 protein; e) the amino acid sequence of the full-length or mature IL-33 protein is at least about 80%, such as at least about 85%, at least
- IL-33 is a polypeptide comprising the amino acid sequence of full-length or mature IL-33 protein.
- IL-33 is a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a full-length or mature IL-33 protein.
- IL-33 is a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8.
- IL-33 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 8.
- a medium or a medium additive for use in culturing mesenchymal stem cells which contains CD45-positive cells.
- a medium or medium additive for promoting the growth of mesenchymal stem cells comprising a CD45-positive cell.
- the bone marrow-derived cells may be cultured in a medium containing IL-33, or IL-33 may be added to the medium in which the bone marrow-derived cells are being cultured.
- concentration of IL-33 in the medium can be, for example, about 0.01-100 ng / mL, about 0.1-10 ng / mL, or about 0.5-5 ng / mL.
- the present disclosure provides a method of culturing bone marrow-derived cells on a solid phase in the presence of IL-33, the method comprising: Provided is a method for culturing derived adherent cells.
- This culture method can be carried out according to the method for producing bone marrow-derived adherent cells containing mesenchymal stem cells described above.
- bone marrow-derived adherent cells including mesenchymal stem cells can be efficiently proliferated.
- the proliferation of both mesenchymal stem cells contained in the bone marrow-derived adherent cells and adherent cells other than mesenchymal stem cells can be promoted.
- step 3 When the number of mesenchymal stem cells contained in the adherent cells obtained in step 3) is at least 10% larger than the number of mesenchymal stem cells contained in the adherent cells obtained in step 1) 29.
- IL-33 significantly increased bone marrow-derived MSCs (FIG. 5b). At the same time, IL-33 significantly increased not only MSC but also CD45 + cells (FIG. 5c), suggesting that IL-33 may act on multiple cell populations in bone marrow.
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Abstract
本開示は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法もしくは培養方法；これらの方法に用いる培地もしくは培地添加剤；間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法；または、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法などに関する。
Description
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８－１５７１７５号および第２０１９－０６８４５９号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、それらの全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本開示は、間葉系幹細胞の製造方法もしくは培養方法、これらの方法に用いる培地もしくは培地添加剤、または、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法に関する。本開示は、また、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法に関する。
本開示は、間葉系幹細胞の製造方法もしくは培養方法、これらの方法に用いる培地もしくは培地添加剤、または、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法に関する。本開示は、また、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法に関する。
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、神経、上皮等、種々の組織に分化できる能力（多分化能）を有していることから、近年、間葉系幹細胞を用いて再生医療（細胞移植治療）を行う試みが広くなされている。間葉系幹細胞を治療に用いるには大量の細胞が必要になるが、生体内における間葉系幹細胞の存在量は極めて少なく、間葉系幹細胞のソースとして代表的な骨髄においても、その存在頻度は骨髄細胞１万～１０万個あたり１個程度である。また、骨髄液の採取はドナーへの負担が大きいため、大量には採取できない。そこで、骨髄液に含まれる間葉系幹細胞を取得し、培養によって増殖させてから治療に用いるのが通常であるが、間葉系幹細胞は体外で継代培養を続けると次第に増殖能力や分化能を低下させてしまうことが知られている。かかる背景から、効率良く間葉系幹細胞を増殖させる方法の開発が望まれている。
インターロイキン－３３（interleukin-33、ＩＬ－３３）は、ＩＬ－１ファミリーのメンバーとして同定されたサイトカインであり、細胞の傷害または壊死が起こると細胞外に放出され、免疫細胞を活性化してＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）および／または炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ）の分泌を誘発する。間葉系幹細胞の培養効率の改善を目的として特定のサイトカイン（ｂＦＧＦ）を培地に添加する方法が提案されているが（特許文献１）、ＩＬ－３３に関しては間葉系幹細胞の増殖に対する作用等は知られていない。
Nat Rev Immunol. 2010 Feb;10(2):103-10.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 31;109(5):1673-8.
本開示の目的の１つは、インビトロで間葉系幹細胞の増殖を促進することである。
本発明者らは、間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養することにより、間葉系幹細胞の増殖が促進されることを見出した。
ある態様において、本開示は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法を提供する。
ある態様において、本開示は、間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
ある態様において、本開示は、ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤を提供する。
ある態様において、本開示は、ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤を提供する。
ある態様において、本開示は、以下の工程：
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程、
を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
ある態様において、本開示は、以下の工程：
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および、
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程、
を含む、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
ある態様において、本開示は、間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
ある態様において、本開示は、ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤を提供する。
ある態様において、本開示は、ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤を提供する。
ある態様において、本開示は、以下の工程：
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程、
を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
ある態様において、本開示は、以下の工程：
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および、
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程、
を含む、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
本開示により、インビトロで間葉系幹細胞の増殖を促進することが可能になる。
本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
本開示において、「細胞」は、文脈に応じて１個の細胞または複数の細胞を意味する。複数の細胞を「細胞集団」と呼ぶ場合もあり、細胞集団は、文脈に応じて一種類の細胞からなる細胞集団または複数種の細胞を含む細胞集団であり得る。
本開示において、「間葉系幹細胞」は、「間葉系間質細胞」と区別なく用いられ、「ＭＳＣ」と略記される場合もある。一般に、幹細胞とは、単一の細胞から一または複数の組織または細胞種へ分化できる能力と、自己複製能とを併せ持つ細胞を意味する。本開示の間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉などの間葉系組織の内、一または複数の間葉系組織への分化能を有する。間葉系幹細胞は、中胚葉性間葉系組織に加えて、胚葉を超えて上皮系組織、神経組織、心・血管組織への分化能を有してもよい。ある実施形態では、間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞の内の複数の細胞へ分化できる能力を有する。ある実施形態では、間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の内の複数の細胞へ分化できる能力を有する。ある実施形態では、間葉系幹細胞は、骨芽細胞および脂肪細胞へ分化できる能力を有する。ある実施形態では、間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞へ分化できる能力を有する。ある実施形態では、間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の内の少なくともいずれか一つに分化できる能力を有する。
「間葉系幹細胞」の用語を細胞集団の意味で使用する場合、間葉系幹細胞のみで構成される細胞集団であってもよく、細胞集団が間葉系幹細胞と同等の分化能力を示す限り、間葉系幹細胞および間葉系幹細胞と間葉系組織の中間の分化段階にある細胞を含む不均一な細胞集団であってもよい。
間葉系幹細胞は、骨髄、血液、例えば末梢血または臍帯血、皮膚、脂肪、歯髄等の組織から取得し得る。間葉系幹細胞は、固相、例えば、培養皿への付着細胞として培養・増殖可能である。従って、ある実施形態では、骨髄または血液に含まれる付着性細胞から間葉系幹細胞を取得し得る。ある実施形態では、コロニー形成能を有することを指標として間葉系幹細胞を判別できる。間葉系幹細胞を含む組織、例えば骨髄から、少なくとも１つの間葉系幹細胞のマーカーを指標とするセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により、間葉系幹細胞を分離してもよい。あるいは、多能性幹細胞から分化誘導された間葉系幹細胞、または、樹立された間葉系幹細胞株を使用してもよい。
ヒト間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、Ｌｉｎ陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ－１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７１陽性、Ｓｔｒｏ－１陽性、ＣＤ１０６陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性が例示できるが、これらに制限されるものではない。ある実施形態では、ヒト間葉系幹細胞のマーカーは、ＰＤＧＦＲα陽性である。ある実施形態では、ヒト間葉系幹細胞のマーカーは、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性である。
マウス間葉系幹細胞のマーカーとしては、ＣＤ４４陽性、ＰＤＧＦＲα陽性、ＰＤＧＦＲβ陽性、ＣＤ４５陰性、Ｌｉｎ陰性、Ｓｃａ－１陽性、ｃ－ｋｉｔ陰性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２９陽性、Ｆｌｋ－１陰性、ＣＤ２７１陽性、ＣＤ１１ｂ陰性が例示できるが、これらに制限されるものではない。ある実施形態では、マウス間葉系幹細胞のマーカーは、ＰＤＧＦＲα陽性である。ある実施形態では、マウス間葉系幹細胞のマーカーは、ＰＤＧＦＲα陽性且つＣＤ４５陰性である。
本開示において、ＣＤ４５を発現している細胞を「ＣＤ４５陽性細胞」と称する。ＣＤ４５は、膜貫通ドメインを有するＩ型糖タンパク質であって、白血球共通抗原としても知られており、多くの有核の造血系細胞に発現するチロシンホスファターゼである。ＣＤ４５は、細胞増殖、分化、有糸分裂、癌化等の様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子として知られている。様々な動物種におけるＣＤ４５のアミノ酸配列は公知である。
ＣＤ４５陽性細胞としては、例えば、ヒト白血球、すなわちリンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球、樹状細胞、マクロファージが例示されるがこれに限られるものではない。
ＣＤ４５陽性細胞は、骨髄、血液、リンパ節等の組織から取得し得る。ＣＤ４５陽性細胞は、通常、浮遊細胞として培養・増殖可能であるが、これに限られるものではなく、一部のＣＤ４５陽性細胞は付着性細胞として培養・増殖可能である。ＣＤ４５陽性細胞を含む組織、例えば骨髄から、ＣＤ４５を指標とするセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により、ＣＤ４５陽性細胞を分離してもよい。あるいは、多能性幹細胞から分化誘導されたＣＤ４５陽性細胞、または、樹立されたＣＤ４５陽性細胞株を使用してもよい。
「間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団」は、少なくとも１つの間葉系幹細胞および少なくとも１つのＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団であり、これらの細胞の他に、いかなる細胞を含んでもよい。また、細胞集団は間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞のみを含むものであってもよい。当該細胞集団には、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞が接触可能な状態で含まれる。例えば、当該細胞集団は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む組織から採取した細胞集団であってもよく、分離された間葉系幹細胞と、分離されたＣＤ４５陽性細胞の混合物であってもよい。間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞は、同じ組織に由来してもよく、異なる組織に由来してもよい。
間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団として、骨髄由来細胞を使用し得る。「骨髄由来細胞」とは、骨髄内から骨髄外に取り出された骨髄細胞（骨髄内に存在する細胞集団）を意味する。骨髄細胞は、生体から骨髄穿刺等の方法により取り出すことができる。動物から取り出された骨のサンプルがある場合は、骨を破砕して内容物を回収する、または、骨の断面を露出させ、シリンジの針を骨髄内に挿してバッファーと共に押し出す等の方法も可能である。ある実施形態では、本開示の製造方法は、動物から骨髄細胞を採取する工程を含み得る。
骨髄由来細胞の中には、固相に付着して増殖することができる細胞の集団（付着性細胞）とできない細胞の集団（非付着性細胞）が含まれる。本開示において、骨髄由来細胞を固相上で培養することにより得られる細胞集団を、「骨髄由来付着性細胞」と称する。実施例により立証される通り、骨髄由来付着性細胞は間葉系幹細胞を含み、ＣＤ４５陽性細胞を含み得る。
本開示に関して、固相とは、細胞が付着できる固体の支持体を意味し、例えば、プラスチック製またはガラス製の培養皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどが含まれる。固相はコーティングされていてもよく、コーティング用の物質としては、例えば、コラーゲンＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリＬ－リジン、ポリＬ－オルニチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、固相はコラーゲンＩでコーティングされている。
骨髄細胞を採取する生物種としては、ヒト、および非ヒト動物、例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。骨髄細胞を採取する骨の種類としては、大腿骨、椎骨、胸骨、腸骨、脛骨等が挙げられるが、特に限定されない。ある実施形態では、骨髄細胞は、大腿骨または椎骨から採取される。
骨髄由来細胞から、間葉系幹細胞および／またはＣＤ４５陽性細胞を分離して使用してもよい。分離は、例えば、上記の表面マーカーを指標とするセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により行い得る。
本開示において、「細胞を分離する」とは、細胞集団における目的の細胞が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上になるように操作することを意味する。
本開示において、「ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質」とは、ＣＤ４５陽性細胞から他の細胞へのシグナル伝達を亢進する物質を意味し、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などであり得る。シグナル伝達の亢進は、シグナル伝達に関する反応、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路における反応の増加によるものであってもよく、ＣＤ４５陽性細胞の数の増加によって生じるものであってもよい。即ち、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質には、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質が含まれる。また、シグナル伝達の亢進には、シグナル伝達の惹起および促進が含まれる。ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質として、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質、例えば、ＩＬ－５、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、リポ多糖（Lipopolysaccharide, ＬＰＳ）またはＩＬ－３３を使用し得るが、これらに限定されない。また、これらは単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
ＩＬ－３３は、ＩＬ－１ファミリーのメンバーとして同定されたサイトカインであり、生物種により異なるが全長２７０残基前後のアミノ酸配列からなる核タンパク質である。ＩＬ－３３は、細胞の傷害または壊死が起こると細胞外に放出され、免疫細胞を活性化してＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）および／または炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ）の分泌を誘発する。全長のＩＬ－３３タンパク質も活性を有するが、全長ＩＬ－３３タンパク質が生体内でプロテアーゼ（例えばカテプシンＧ（Accession No. P08311等）や好中球エラスターゼ（Accession No. P08246等））によって切断されて生じるＣ末端側のポリペプチド断片が成熟ＩＬ－３３タンパク質として機能することが知られている。
本開示において、「ＩＬ－３３」は、全長ＩＬ－３３タンパク質、成熟ＩＬ－３３タンパク質またはそれらと機能的に同等なポリペプチドであり得る。
本開示において、ＩＬ－３３の起源となる生物種としては、ヒト、および非ヒト動物、例えばマウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。
全長ＩＬ－３３タンパク質とは、ＩＬ－３３をコードするｍＲＮＡから翻訳された後、プロテアーゼによるプロセシングを受ける前のＩＬ－３３タンパク質を意味する。本開示において、全長ＩＬ－３３タンパク質としては、全長マウスＩＬ－３３タンパク質（配列番号１、Accession No. Q8BVZ5）、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質（配列番号４、Accession No. O95760）が挙げられるが、これらに限定されない。
成熟ＩＬ－３３タンパク質とは、全長ＩＬ－３３タンパク質がプロテアーゼによるプロセシングを受けて生じることが確認または示唆されているＣ末端側のポリペプチドであって、生物学的活性を有するものを意味する。
成熟ＩＬ－３３タンパク質の例としては、全長マウスＩＬ－３３タンパク質の１０２番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号２）からなるポリペプチド、全長マウスＩＬ－３３タンパク質の１０９番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質の９５番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質の９９番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチド、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質の１０９番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号７）からなるポリペプチド、および全長ヒトＩＬ－３３タンパク質の１１２番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドが知られている。これらのタンパク質はいずれも、本開示の方法等において用い得る。ある実施形態では、成熟ＩＬ－３３タンパク質は配列番号３または８のアミノ酸配列を有する。
例えば、全長マウスＩＬ－３３タンパク質の１０９番目から２６６番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるポリペプチドは、ＴＮＦ－αの産生を誘導する活性を有することが確認されている（Bae et al, J Biol Chem. 2012 Mar 9;287(11):8205-13）。また、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質の１１２番目から２７０番目のアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドは、全長ヒトＩＬ－３３タンパク質と同等の生物学的活性（例えばＳＴ２との結合を介したＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化）を有することが知られている（Cayrol and Girard, PNAS 2009 Jun 2;106(22):9021-6）。
全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と「機能的に同等」とは、当該タンパク質と同質の生物学的活性を有することをいい、ここにいう「同質」とは定性的評価において同じであることを意味する。本開示における全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の生物学的活性としては、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路の活性化、免疫細胞からのＴｈ２サイトカインおよび／または炎症性サイトカイン分泌の誘発、ＳＴ２（ＩＬ－３３の受容体）との結合を介したＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖促進、ＣＤ４５陽性細胞の活性化の促進等が挙げられる。一つの実施形態において、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の生物学的活性は、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させることである。
例えば、ＩＬ－３３は、以下のａ）～ｇ）から選択されるポリペプチドであり得る：
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド。
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド。
本開示において、アミノ酸配列または核酸配列の同一性とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列の一致の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（アミノ酸またはヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一のアミノ酸またはヌクレオチドを決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸またはヌクレオチドの総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質またはそれらと機能的に同等なポリペプチドの入手方法は特に限定されず、例えば組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成等によって製造できるほか、市販品を購入することも可能である。
間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本開示の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することを特徴とする。この製造方法は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することにより、細胞集団に含まれる間葉系幹細胞を増殖させるものである。これらの細胞を培養する培地は、動物細胞（例えば間葉系幹細胞）の培養に用いることが可能なものであれば特に限定されない。例えば、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、MesenCultTM（STEMCELL Technologies）が挙げられる。
本開示の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することを特徴とする。この製造方法は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することにより、細胞集団に含まれる間葉系幹細胞を増殖させるものである。これらの細胞を培養する培地は、動物細胞（例えば間葉系幹細胞）の培養に用いることが可能なものであれば特に限定されない。例えば、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、MesenCultTM（STEMCELL Technologies）が挙げられる。
培養方法は、細胞の利用目的等に応じて適宜調整できる。培養条件は、間葉系幹細胞の生存を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、一般的なインキュベーター内で、「３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２」、「３７℃、５％ＣＯ２」等の条件下で、固相上で培養（接着培養）または浮遊培養（例えば、撹拌培養または振盪培養）し得る。なお、好適には接着培養が用いられる。
培養する間葉系幹細胞の密度は、培養可能な範囲であれば特に限定されないが、例えば１個～約１×１０１０個／ｍＬ、１０個～約１×１０９個／ｍＬ、約１×１０２個～約１×１０８個／ｍＬ、約１×１０３個～約１×１０７個／ｍＬ、約１×１０４個～約１×１０７個／ｍＬであり得る。培養するＣＤ４５陽性細胞の密度は、例えば約１×１０２個～約１×１０１０個／ｍＬ、約１×１０３個～約１×１０９個／ｍＬ、約１×１０３個～約１×１０８個／ｍＬ、約１×１０４個～約１×１０８個／ｍＬ、約１×１０４個～約１×１０７個／ｍＬであり得る。培地の交換は、典型的には１～７日に１回、例えば４日または５日に１回、行えばよい。培養の期間は、間葉系幹細胞を含む細胞集団のコロニーが形成されるのに十分な期間であればよく、数日間～数ヵ月間、例えば、３日間～３ヵ月間、４日間～１ヵ月間、５日間～３週間または７日間～１４日間であり得る。
培地は、間葉系幹細胞の増殖またはＣＤ４５陽性細胞の増殖（活性化）を阻害しない限り、さらに他の成分を含んでもよい。ある実施形態では、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質の存在下で培養する。培養培地に当該物質を添加してもよく、または、含有させてもよい。
ある実施形態では、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団をＩＬ－３３の存在下で培養する。ＩＬ－３３を含有する培地中で細胞集団を培養してもよく、細胞集団を培養中の培地にＩＬ－３３を添加してもよい。培地中のＩＬ－３３の濃度は、例えば、約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬ、約０.１～１０ｎｇ／ｍＬまたは約０.５～５ｎｇ／ｍＬであり得る。
間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を、Ｎｏｔｃｈ活性化剤の存在下で培養してもよい。Ｎｏｔｃｈ活性化剤としては、例えば、特表２０１３－５１８５８８に記載のｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ １、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ３、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ４、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、Ｄｌｋ１／Ｐｒｅｆ１、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ１、Ｃｏｎｔａｃｔｉｎ６、ＣＣＮ３／ＮＯＶ、ＭＡＧＰ１およびＭＡＧＰ２；特表２０１７－５１６４８６に記載のＮｏｔｃｈ１アゴニストおよびＮｏｔｃｈ２アゴニスト；特表２００９－５０２９６２に記載のＰＤＧＦ受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＡＧ－３７０又はＡＧ－１２９６（６，７－ジメトキシ－３－フェニルキノキサリン））、Ｋ＋及びＨ＋イオノフォア（例えば、ナイジェリシン・Ｎａ）、アクチン重合の阻害剤（例えば、サイトカラサンＤ）、ナトリウム・ポンプ（Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ）の阻害剤（例えば、ウアバイン）、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化の阻害剤（例えば、ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルヒドラゾン）、及びｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤（例えば、ＳＰ６００１２５）が挙げられるが、これらに限定されない。かかるＮｏｔｃｈ活性化剤の中から、適宜選択して使用することができる。これらＮｏｔｃｈ活性化剤は、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質、例えばＩＬ－３３と共に用いても良い。
ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質によってＣＤ４５陽性細胞を活性化した後、活性化されたＣＤ４５陽性細胞と間葉系幹細胞とを共培養してもよい。ここで、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させた後に、当該物質とＣＤ４５陽性細胞とを分離し、ＣＤ４５陽性細胞を間葉系幹細胞と共培養してもよい。ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質がＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質である場合、活性化したＣＤ４５陽性細胞と間葉系幹細胞との共培養は、増殖したＣＤ４５陽性細胞と間葉系幹細胞との共培養を意味する。
ある実施形態では、培地は分化誘導剤を含まない。換言すれば、当該培地は、分化用途ではなく、細胞の増殖または維持のために使用される培地である。本開示において、分化誘導剤とは、特定の細胞種への分化を誘導する物質を意味し、特に、間葉系の細胞種への分化を誘導する物質である。分化誘導剤の例には、骨芽細胞への分化誘導剤としてデキサメタゾン、β－グリセロリン酸、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸が含まれ、脂肪細胞への分化誘導剤として、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、インスリン、インドメタシンが含まれ、軟骨細胞への分化誘導剤として、デキサメタゾン、インスリン、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸、Ｌ－プロリン、ピルビン酸塩、形質転換増殖因子（ＴＧＦ－ｂ３)、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）が含まれる。なお、「分化誘導剤を含まない」とは、培地が分化誘導剤を実質的に含まないこと、すなわち、分化を誘導するレベルまたは量で含まないことを意味する。
上記製造方法により得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団は、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞以外の他のいかなる細胞を含んでもよく、例えば、非幹細胞を例示できる。
上記製造方法において、培養後の間葉系幹細胞を分離してもよい。例えば、間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を固相上で培養することにより、間葉系幹細胞を分離し得る。間葉系幹細胞を分離するための固相上の培養においては、例えば、１回以上の継代培養を行ってもよく、継代後の培地はＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を含まない培地としてもよい。培養終了後に、固相に付着している細胞を、間葉系幹細胞を含む細胞集団として回収し得る。例えば、非付着性細胞を含む培地を除去することにより、間葉系幹細胞を含む細胞集団を回収し得る。さらに、トリプシンなどの酵素処理により付着性細胞を固相から剥離させてもよい。
あるいは、間葉系幹細胞の分離は、間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により行ってもよい。間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングは、例えば間葉系幹細胞の表面マーカーに対する抗体を用いて行うことができる。得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、他の細胞、例えばＣＤ４５陽性細胞の生存または増殖を抑制する薬剤（例えば、Mesenpure（STEMCELL Technologies））の存在下で培養することにより、間葉系幹細胞を分離（精製）してもよい。
尚、間葉系幹細胞の分離に際しては、継代培養とセルソーティングの一方のみを行ってもよく、両方行ってもよい。
尚、間葉系幹細胞の分離に際しては、継代培養とセルソーティングの一方のみを行ってもよく、両方行ってもよい。
間葉系幹細胞の培養方法
本開示はまた、間葉系幹細胞を、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する。「共培養」とは、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の細胞間接触が可能な状態で細胞を培養することを意味する。共培養は、上記の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法における培養に準じて実施し得る。
本開示はまた、間葉系幹細胞を、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する。「共培養」とは、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の細胞間接触が可能な状態で細胞を培養することを意味する。共培養は、上記の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法における培養に準じて実施し得る。
ＣＤ４５陽性細胞の培養方法または製造方法
本開示はまた、ＣＤ４５陽性細胞をＩＬ－３３の存在下で培養する工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する。この培養方法は、上記の間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団の培養に準じて、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することにより、実施し得る。ここで、細胞集団は、間葉系幹細胞を含んでも含まなくてもよい。また、この培養方法によりＣＤ４５陽性細胞を増殖させる工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団の製造方法が提供される。
本開示はまた、ＣＤ４５陽性細胞をＩＬ－３３の存在下で培養する工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する。この培養方法は、上記の間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団の培養に準じて、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養することにより、実施し得る。ここで、細胞集団は、間葉系幹細胞を含んでも含まなくてもよい。また、この培養方法によりＣＤ４５陽性細胞を増殖させる工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団の製造方法が提供される。
当該ＣＤ４５陽性細胞の培養方法または製造方法は、間葉系幹細胞との共培養または間葉系幹細胞を培養するための培地もしくは培地添加剤のために使用されるＣＤ４５陽性細胞を製造する方法として適用されるものであってよい。
培地または培地添加剤
ある実施形態では、本開示は、上記の方法のいずれかに用いることができる培地または培地添加剤を提供する。例えば、ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤；ＣＤ４５陽性細胞およびＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤；ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤；ＩＬ－３３を含有する、ＣＤ４５陽性細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤が提供され得る。ある実施形態では、培地または培地添加剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進するための培地または培地添加剤である。
ある実施形態では、本開示は、上記の方法のいずれかに用いることができる培地または培地添加剤を提供する。例えば、ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤；ＣＤ４５陽性細胞およびＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤；ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質（例えばＩＬ－３３）を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤；ＩＬ－３３を含有する、ＣＤ４５陽性細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤が提供され得る。ある実施形態では、培地または培地添加剤は、間葉系幹細胞の増殖を促進するための培地または培地添加剤である。
培地は、例えば、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法について先に記載した一般的な動物細胞培養用の培地に、ＣＤ４５陽性細胞および／またはＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を添加したものであり得る。培地のＣＤ４５陽性細胞および／またはＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質以外の成分組成は、当該培地が動物細胞（例えば間葉系幹細胞）の培養に用いることが可能なものである限り、特に限定されない。培地は、間葉系幹細胞またはＣＤ４５陽性細胞の増殖を阻害しない限り、さらに他の成分を含んでもよく、例えば、Ｎｏｔｃｈ活性化剤を含み得る。また、例えば、培地は分化誘導剤を含まないものとしてもよい。培地はいかなる形態で提供されてもよく、例えば、そのまま使用できる液体培地、希釈または溶解して使用するための濃縮物、固形物または凍結乾燥物として提供され得る。培地は、いかなる容器中に提供されてもよい。
培地添加剤は、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法について先に記載したＣＤ４５陽性細胞および／またはＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質を、動物細胞の培養に許容し得る任意の成分と共に含み得る。培地添加剤は、間葉系幹細胞の増殖またはＣＤ４５陽性細胞の増殖（活性化）を阻害しない限り、さらに他の成分を含んでもよく、例えば、Ｎｏｔｃｈ活性化剤を含み得る。培地添加剤はいかなる剤形で提供されてもよく、例えば、顆粒、粉末、錠剤などの固体、溶液、懸濁液、乳濁液などの液体、あるいは、固体、半固体または液体を封入したカプセルとして提供され得るが、これらに限定されない。培地添加剤は、いかなる容器中に提供されてもよい。培地添加剤は、例えば、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法について先に記載した一般的な動物細胞培養用の培地に添加し得る。
間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法
ある態様では、本開示は、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、工程１）にて、対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養し、工程２）にて、対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する。そして、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する。
ある態様では、本開示は、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、工程１）にて、対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養し、工程２）にて、対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する。そして、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する。
本開示のスクリーニング方法の工程１）および２）は、上記の間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法および培養方法を参照して実施し得る。
「被験物質」には、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などの、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製または未単離の粗精製品、または、被験物質を生成する生細胞であってもよい。被験物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。
「被験物質」には、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物などの、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製または未単離の粗精製品、または、被験物質を生成する生細胞であってもよい。被験物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。
本開示の間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法の工程３）では、コロニー数を計数して細胞数とみなしてもよく、細胞数を計数してもよい。細胞を固相上で培養した場合は、細胞を固相に付着したままの状態で計数してもよく、細胞を酵素処理等により固相から剥離させ、細胞数を計数してもよい。細胞数の計数には、当業者に周知の方法を用いることができる。「間葉系幹細胞の数」は、例えば間葉系幹細胞の代表的な表面マーカーの発現（例えばＰＤＧＦＲα陽性、且つＣＤ４５陰性）を指標にしたＦＡＣＳ解析等により決定し得る。あるいは、免疫蛍光染色等を行い、間葉系幹細胞の表面マーカーを発現する細胞を固相に付着したままの状態で計数して間葉系幹細胞の数とみなしてもよい。ここで、「細胞の数が多い」とは、細胞の数が比較対象よりも少なくとも３％、５％または１０％多いことを意味し、少なくとも１０％多いことが好ましい。
本開示のスクリーニング方法では、陽性対照として、ＩＬ－３３を使用してもよい。ＩＬ－３３を添加した培地において間葉系幹細胞の増殖が促進されれば、実験系が機能していることが担保される。従って、本開示のスクリーニング方法は、１’）対照培地にＩＬ－３３を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程をさらに含み得、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択し得る。
従って、ある実施形態では、以下の工程を含む、陽性対照を用いて間葉系幹細胞の増殖を促進する物質をスクリーニングする方法が提供される：
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
１’）対照培地にＩＬ－３３を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
１’）対照培地にＩＬ－３３を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
ある態様では、以下の工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法が提供される：
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
この方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質をスクリーニングする方法に準じて実施し得る。
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
この方法は、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質をスクリーニングする方法に準じて実施し得る。
本開示により、例えば、下記の実施形態が提供される。
［１］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］間葉系幹細胞の増殖を促進するために間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［３］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
［４］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来の間葉系幹細胞を含む、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来のＣＤ４５陽性細胞を含む、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来細胞である、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団から間葉系幹細胞を分離する工程をさらに含む、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］間葉系幹細胞を分離する工程が、ａ）１回以上の継代培養、および／または、ｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングを含む、第７項に記載の方法。
［１］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］間葉系幹細胞の増殖を促進するために間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［３］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
［４］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来の間葉系幹細胞を含む、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来のＣＤ４５陽性細胞を含む、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来細胞である、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団から間葉系幹細胞を分離する工程をさらに含む、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］間葉系幹細胞を分離する工程が、ａ）１回以上の継代培養、および／または、ｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングを含む、第７項に記載の方法。
［９］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を固相上で培養する、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］培養後に固相に付着している細胞を間葉系幹細胞を含む細胞集団として回収する工程をさらに含む、第９項に記載の方法。
［１１］固相がコーティングされている、第９項または第１０項に記載の方法。
［１２］固相がコラーゲンＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリＬ－リジンまたはポリＬ－オルニチンでコーティングされている、第９項～第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］固相がコラーゲンＩでコーティングされている、第９項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団が、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞である、第９項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１０］培養後に固相に付着している細胞を間葉系幹細胞を含む細胞集団として回収する工程をさらに含む、第９項に記載の方法。
［１１］固相がコーティングされている、第９項または第１０項に記載の方法。
［１２］固相がコラーゲンＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリＬ－リジンまたはポリＬ－オルニチンでコーティングされている、第９項～第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］固相がコラーゲンＩでコーティングされている、第９項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］得られる間葉系幹細胞を含む細胞集団が、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞である、第９項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質の存在下で培養する、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質がＩＬ－３３である、第１５項に記載の方法。
［１７］間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
［１８］間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
［１９］ＣＤ４５陽性細胞をＩＬ－３３の存在下で培養する工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の培養方法。
［１６］ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質がＩＬ－３３である、第１５項に記載の方法。
［１７］間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
［１８］間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
［１９］ＣＤ４５陽性細胞をＩＬ－３３の存在下で培養する工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の培養方法。
［２０］ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
からなる群から選択される、第１６項～第１９項のいずれかに記載の方法。
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
からなる群から選択される、第１６項～第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド
からなる群から選択される、第１６項～第２０項のいずれかに記載の方法。
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド
からなる群から選択される、第１６項～第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２３項に記載の方法。
［２５］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列を含む、第１６項～第２５項のいずれかに記載の方法。
［２７］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２６項のいずれかに記載の方法。
［２８］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２７項のいずれかに記載の方法。
［２９］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列を含む、第１６項～第２８項のいずれかに記載の方法。
［３０］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２９項のいずれかに記載の方法。
［３１］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第３０項のいずれかに記載の方法。
［３２］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列を含む、第１６項～第３１項のいずれかに記載の方法。
［３３］ＩＬ－３３の濃度が約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３２項のいずれかに記載の方法。
［３４］ＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３３項のいずれかに記載の方法。
［３５］ＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３４項のいずれかに記載の方法。
［３６］骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法。
［２３］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２３項に記載の方法。
［２５］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列を含む、第１６項～第２５項のいずれかに記載の方法。
［２７］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２６項のいずれかに記載の方法。
［２８］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第２７項のいずれかに記載の方法。
［２９］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列を含む、第１６項～第２８項のいずれかに記載の方法。
［３０］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１６項～第２９項のいずれかに記載の方法。
［３１］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１６項～第３０項のいずれかに記載の方法。
［３２］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列を含む、第１６項～第３１項のいずれかに記載の方法。
［３３］ＩＬ－３３の濃度が約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３２項のいずれかに記載の方法。
［３４］ＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３３項のいずれかに記載の方法。
［３５］ＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第１６項～第３４項のいずれかに記載の方法。
［３６］骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法。
［３７］ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤。
［３８］ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の増殖を促進するための培地または培地添加剤。
［３９］ＩＬ－３３をさらに含有する、第３７項または第３８項に記載の培地または培地添加剤。
［４０］ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤。
［４１］ＩＬ－３３を含有する、ＣＤ４５陽性細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤。
［４２］ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチドからなる群から選択される、第３９項～第４１項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［３８］ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の増殖を促進するための培地または培地添加剤。
［３９］ＩＬ－３３をさらに含有する、第３７項または第３８項に記載の培地または培地添加剤。
［４０］ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤。
［４１］ＩＬ－３３を含有する、ＣＤ４５陽性細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤。
［４２］ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質と機能的に同等なポリペプチドからなる群から選択される、第３９項～第４１項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４３］ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド
からなる群から選択される、第３９項～第４２項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド
からなる群から選択される、第３９項～第４２項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４４］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第４３項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４５］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４４項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４６］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第４５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４７］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４６項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４８］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列を含む、第３９項～第４７項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４９］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第４８項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５０］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４９項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５１］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列を含む、第３９項～第５０項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５２］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第５１項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５３］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第５２項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５４］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列を含む、第３９項～第５３項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５５］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５４項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５６］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５７］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５６項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４５］ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４４項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４６］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第４５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４７］ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４６項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４８］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列を含む、第３９項～第４７項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［４９］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第４８項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５０］ＩＬ－３３が、配列番号３または８のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第４９項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５１］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列を含む、第３９項～第５０項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５２］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第３９項～第５１項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５３］ＩＬ－３３が、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第３９項～第５２項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５４］ＩＬ－３３をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列を含む、第３９項～第５３項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５５］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５４項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５６］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５７］培地中のＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第３９項～第５６項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
［５８］以下の工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
［５９］工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第５８項に記載のスクリーニング方法。
［６０］１’）対照培地に第３９項～第５７項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程をさらに含み、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第５８項または第５９項に記載のスクリーニング方法。
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
［５９］工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第５８項に記載のスクリーニング方法。
［６０］１’）対照培地に第３９項～第５７項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程をさらに含み、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第５８項または第５９項に記載のスクリーニング方法。
［６１］以下の工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）第３９項～第５７項のいずれかに記載の培地添加剤を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および、
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
［６２］工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質をＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第６１項に記載のスクリーニング方法。
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）第３９項～第５７項のいずれかに記載の培地添加剤を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および、
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
［６２］工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質をＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第６１項に記載のスクリーニング方法。
間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法
ある態様では、本開示は、骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法を提供する。
ある態様では、本開示は、骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法を提供する。
この方法では、骨髄由来付着性細胞を効率良く取得することができる。骨髄由来付着性細胞には、間葉系幹細胞と、間葉系幹細胞以外の付着性細胞が含まれるが、ＩＬ－３３の存在下における固相培養により、間葉系幹細胞および間葉系幹細胞以外の付着性細胞、両方の増殖が促進される。この方法によれば、少量の骨髄組織から高効率で間葉系幹細胞を含む付着性細胞を取得し得る。また、初代培養の段階で多くの間葉系幹細胞を含む付着性細胞が得られるため、短い培養期間で目的の細胞数を達成し、培養による間葉系幹細胞の能力低下を回避することも期待される。
この方法では、ＩＬ－３３を含有する培地中で骨髄由来細胞を培養してもよく、骨髄由来細胞を培養中の培地にＩＬ－３３を添加してもよい。培地中のＩＬ－３３の濃度は、例えば、約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬ、約０.１～１０ｎｇ／ｍＬまたは約０.５～５ｎｇ／ｍＬであり得る。
骨髄由来細胞を培養する培地は、動物細胞（例えば間葉系幹細胞）の培養に用いることが可能なものであれば特に限定されない。例えば、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、MesenCultTM（STEMCELL Technologies社）が挙げられる。培地は、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を阻害しない限り、さらに他の成分を含んでもよい。また、例えば、培地は分化誘導剤を含まないものとしてもよい。
培養の条件および期間は、細胞の利用目的等に応じて適宜調整できる。培養条件は、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の生存を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、一般的なインキュベーター内で、「３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２」、「３７℃、５％ＣＯ２」等の条件下で実施し得る。培養する骨髄由来細胞の密度は、例えば約１×１０４個～約１×１０７個／ｍｌであり得る。培地の交換は、典型的には１～７日に１回、例えば４日または５日に１回、行えばよい。培養の期間は、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞のコロニーが形成されるのに十分な期間であればよく、数日間～数ヵ月間、例えば、３日間～３ヵ月間、４日間～１ヵ月間、５日間～３週間または７日間～１４日間であり得る。
培養終了後に、固相に付着している細胞を、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞として回収し得る。例えば、非付着性細胞を含む培地を除去することにより、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞を回収し得る。さらに、トリプシンなどの酵素処理により付着性細胞を固相から分離させてもよい。
上記製造方法において、培養後の間葉系幹細胞を分離してもよい。間葉系幹細胞の分離は、例えば、ａ）１回以上の継代培養、および／または、ｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティング（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ等）により行ってもよい。間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングは、例えば間葉系幹細胞の表面マーカーに対する抗体を用いて行うことができる。得られた間葉系幹細胞を含む細胞集団を、他の細胞、例えばＣＤ４５陽性細胞の生存または増殖を抑制する薬剤（例えば、Mesenpure（STEMCELL Technologies））の存在下で培養することにより、間葉系幹細胞を分離（精製）してもよい。
間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養方法
ある態様では、本開示は、骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、上記の間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法に準じて実施し得る。当該培養方法によれば、効率良く間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞を増殖させることができる。当該培養方法によれば、骨髄由来付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞および間葉系幹細胞以外の付着性細胞の増殖が共に促進され得る。
ある態様では、本開示は、骨髄由来細胞をＩＬ－３３の存在下において固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養方法を提供する。この培養方法は、上記の間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法に準じて実施し得る。当該培養方法によれば、効率良く間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞を増殖させることができる。当該培養方法によれば、骨髄由来付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞および間葉系幹細胞以外の付着性細胞の増殖が共に促進され得る。
間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地
ある態様では、本開示は、ＩＬ－３３を含有することを特徴とする、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地を提供する。当該培地は、例えば、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法について先に記載した一般的な動物細胞培養用の培地にＩＬ－３３を添加したものであり得る。
ある態様では、本開示は、ＩＬ－３３を含有することを特徴とする、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地を提供する。当該培地は、例えば、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法について先に記載した一般的な動物細胞培養用の培地にＩＬ－３３を添加したものであり得る。
培地のＩＬ－３３以外の成分組成は、当該培地が動物細胞（例えば間葉系幹細胞）の培養に用いることが可能なものである限り、特に限定されない。培地は、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を阻害する成分を含まないことが好ましい。培地はいかなる形態で提供されてもよく、例えば、そのまま使用できる液体培地、希釈または溶解して使用するための濃縮物、固形物または凍結乾燥物として提供され得る。培地は、いかなる容器中に提供されてもよい。
間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地添加剤
ある態様では、本開示は、ＩＬ－３３を含有することを特徴とする、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地添加剤を提供する。
ある態様では、本開示は、ＩＬ－３３を含有することを特徴とする、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地添加剤を提供する。
培地添加剤は、ＩＬ－３３を動物細胞の培養に許容し得る任意の成分と共に含み得る。培地添加剤は、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を阻害する成分を含まないことが好ましい。培地添加剤はいかなる剤形で提供されてもよく、例えば、顆粒、粉末、錠剤などの固体、溶液、懸濁液、乳濁液などの液体、あるいは、固体、半固体または液体を封入したカプセルとして提供され得るが、これらに限定されない。培地添加剤は、いかなる容器中に提供されてもよい。培地添加剤は、例えば、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法について先に記載した一般的な動物細胞培養用の培地に添加することにより、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に使用し得る。
骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法
ある態様では、本開示は、以下の工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する：
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
ある態様では、本開示は、以下の工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する：
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
別の態様では、本開示は、以下の工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法を提供する：
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
一般的に、対照培地における骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖と、被験物質を添加した培地における骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を比較することにより、被験物質の活性の有無を評価することは可能である。しかし、被験物質を添加した培地において骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖促進が見られない場合、被験物質に活性が無いのか、実際には活性があるが細胞の状態や実験条件等に問題があって活性が検出できないのかを判別することができない。これは、陽性対照となる物質を用いていないことが原因である。
上記の両スクリーニング方法では、陽性対照として、ＩＬ－３３を使用する。ＩＬ－３３を添加した培地において骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖が促進されれば、実験系が機能していることは担保される。従って、陽性対照であるＩＬ－３３による骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖促進を確認した上で被験物質を添加した培地の評価を行うことにより、スクリーニングの精度および効率を向上させることができる。
本開示の両スクリーニング方法の工程１）、２）および３）は、上記の間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法または培養方法を参照して実施し得る。「対照培地」は、ＩＬ－３３を含まない培地を意味する。
本開示の骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法の工程４）では、コロニー数を計数して細胞数とみなしてもよく、コロニーに含まれる細胞を固相に付着したままの状態で計数してもよく、細胞を酵素処理等により固相から分離させ、細胞数を計数してもよい。細胞数の計数には、当業者に周知の方法を用いることができる。
本開示の間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法の工程４）において、「付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数」は、例えば間葉系幹細胞の代表的な表面マーカーの発現（例えばＰＤＧＦＲα陽性、且つＣＤ４５陰性）を指標にしたＦＡＣＳ解析等により決定することができる。あるいは、免疫蛍光染色等を行い、間葉系幹細胞の表面マーカーを発現する細胞を固相に付着したままの状態で計数して間葉系幹細胞の数とみなしてもよい。
本開示の両スクリーニング方法の工程５）において、「細胞の数が多い」とは、細胞の数が比較対象よりも少なくとも３％、５％または１０％多いことを意味し、少なくとも１０％多いことが好ましい。
本開示により、例えば、下記の実施形態が提供される。
（１）ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地添加剤。
（２）ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地。
（３）ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択され、かつ、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を促進する活性を有するポリペプチドである、第１項に記載の培地添加剤または第２項に記載の培地。
（４）ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択され、かつ、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を促進する活性を有するポリペプチドである、第１項～第３項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（５）ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１項～第４項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（６）ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１項～第５項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１）ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地添加剤。
（２）ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養に用いるための培地。
（３）ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個、例えば、１～１０個、１～５個、１～３個または１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択され、かつ、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を促進する活性を有するポリペプチドである、第１項に記載の培地添加剤または第２項に記載の培地。
（４）ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択され、かつ、骨髄由来付着性細胞または間葉系幹細胞の増殖を促進する活性を有するポリペプチドである、第１項～第３項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（５）ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第１項～第４項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（６）ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、第１項～第５項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（７）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列である、第３項～第６項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（８）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列である、第３項～第７項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（９）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３または８のアミノ酸配列である、第３項～第８項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１０）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列である、第３項～第９項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１１）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸配列である、第３項～第１０項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１２）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列である、第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（８）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号９～１６のいずれかの核酸配列である、第３項～第７項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（９）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３または８のアミノ酸配列である、第３項～第８項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１０）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１１または１６の核酸配列である、第３項～第９項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１１）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸配列である、第３項～第１０項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１２）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１１の核酸配列である、第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤または培地。
（１３）ＩＬ－３３の濃度が約０.０１～１００ｎｇ／ｍＬである、第２項～第１２項のいずれかに記載の培地。
（１４）ＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第２項～第１３項のいずれかに記載の培地。
（１５）ＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第２項～第１４項のいずれかに記載の培地。
（１６）間葉系幹細胞を増殖させるための第１項～第１５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
（１４）ＩＬ－３３の濃度が約０.１～１０ｎｇ／ｍＬである、第２項～第１３項のいずれかに記載の培地。
（１５）ＩＬ－３３の濃度が約０.５～５ｎｇ／ｍＬである、第２項～第１４項のいずれかに記載の培地。
（１６）間葉系幹細胞を増殖させるための第１項～第１５項のいずれかに記載の培地または培地添加剤。
（１７）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法。
（１８）間葉系幹細胞の増殖を促進するために、骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法。
（１９）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
（２０）培養後に固相に付着している細胞を間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞として回収する工程をさらに含む、第１７項～第１９項のいずれかに記載の方法。
（２１）１）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程、ならびに２）工程１）によって得られた付着性細胞に対してａ）１回以上の継代培養および／またはｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングを行って間葉系幹細胞を分離する工程を含む、間葉系幹細胞の製造方法。
（２２）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養方法。
（２３）固相がコーティングされている、第１７項～第２２項のいずれかに記載の方法。
（２４）固相がコラーゲンＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリＬ－リジンまたはポリＬ－オルニチンでコーティングされている、第１７項～第２３項のいずれかに記載の方法。
（２５）固相がコラーゲンＩでコーティングされている、第１７項～第２４項のいずれかに記載の方法。
（１８）間葉系幹細胞の増殖を促進するために、骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の製造方法。
（１９）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する方法。
（２０）培養後に固相に付着している細胞を間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞として回収する工程をさらに含む、第１７項～第１９項のいずれかに記載の方法。
（２１）１）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程、ならびに２）工程１）によって得られた付着性細胞に対してａ）１回以上の継代培養および／またはｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングを行って間葉系幹細胞を分離する工程を含む、間葉系幹細胞の製造方法。
（２２）骨髄由来細胞を、第２項～第１６項のいずれかに記載の培地中、固相上で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の培養方法。
（２３）固相がコーティングされている、第１７項～第２２項のいずれかに記載の方法。
（２４）固相がコラーゲンＩ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリＬ－リジンまたはポリＬ－オルニチンでコーティングされている、第１７項～第２３項のいずれかに記載の方法。
（２５）固相がコラーゲンＩでコーティングされている、第１７項～第２４項のいずれかに記載の方法。
（２６）以下の工程を含む、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）対照培地に第１項および第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
（２７）工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第２６項に記載のスクリーニング方法。
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）対照培地に第１項および第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
（２７）工程３）によって得られた付着性細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第２６項に記載のスクリーニング方法。
（２８）以下の工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）対照培地に第１項および第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
（２９）工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第２８項に記載のスクリーニング方法。
１）対照培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
２）対照培地に第１項および第３項～第１１項のいずれかに記載の培地添加剤を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて骨髄由来細胞を固相上で培養する工程、
４）工程１）～３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数を各々計数する工程、および
５）工程２）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
（２９）工程３）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた付着性細胞に含まれる間葉系幹細胞の数よりも少なくとも１０％多い場合に、当該被験物質を間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、第２８項に記載のスクリーニング方法。
本開示で引用するすべての文献は、出典明示により本開示の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
実施例１
ＩＬ－３３含有培地による間葉系幹細胞の増殖促進
（１）材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢、メス）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を骨髄由来細胞として得た。骨髄由来細胞を下記の培地ＡまたはＢに懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して、培地３ｍＬ中、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で１０日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
ＩＬ－３３含有培地による間葉系幹細胞の増殖促進
（１）材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢、メス）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を骨髄由来細胞として得た。骨髄由来細胞を下記の培地ＡまたはＢに懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して、培地３ｍＬ中、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で１０日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
・培地Ａ（対照）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、下記培地Ｂに添加される成熟マウスＩＬ－３３タンパク質溶液と同容量のＰＢＳを添加したもの）
・培地Ｂ（ＩＬ－３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ－３３タンパク質（配列番号３）を終濃度２ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
培養開始１０日目に培地を除去し、プレート上に付着している細胞をディフ・クイック（シスメックス）を用いて染色し、観察した。
・培地Ｂ（ＩＬ－３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ－３３タンパク質（配列番号３）を終濃度２ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
培養開始１０日目に培地を除去し、プレート上に付着している細胞をディフ・クイック（シスメックス）を用いて染色し、観察した。
（２）結果
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄由来細胞についても、ＩＬ－３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上にコロニーとして得られる細胞の数が著しく増大した（図１）。また、骨髄由来細胞の培養にコラーゲンＩコーティングなしの６ウェルプレート（costar, Cat No.3516）を用いた点を除いて上記と同じ方法および条件で実験を行った場合でも、同様の結果が得られた。
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄由来細胞についても、ＩＬ－３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上にコロニーとして得られる細胞の数が著しく増大した（図１）。また、骨髄由来細胞の培養にコラーゲンＩコーティングなしの６ウェルプレート（costar, Cat No.3516）を用いた点を除いて上記と同じ方法および条件で実験を行った場合でも、同様の結果が得られた。
骨髄由来細胞を固相上で培養すると、間葉系幹細胞を含む付着性の細胞が固相に付着してコロニーを形成することが良く知られている。従って、当該実施例における実験結果は、ＩＬ－３３存在下での培養によって間葉系幹細胞を含む骨髄由来付着性細胞の増殖が促進されることを示すものである。
実施例２
ＩＬ－３３含有培地を用いて培養した骨髄由来細胞の解析
（１）材料および方法
ＰＤＧＦＲαプロモーターの下流にＨ２Ｂ－ＧＦＰ融合タンパク質の遺伝子（ｃＤＮＡ）がノックインされたマウス（Hamilton TG, Mol Cell Biol. 2003 Jun;23(11):4013-25）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて溶血反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を骨髄由来細胞として得た。骨髄由来細胞を下記の培地Ｃ（対照）または培地Ｄ（ＩＬ－３３含有）に懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して、培地３ｍＬ中、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で８日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
ＩＬ－３３含有培地を用いて培養した骨髄由来細胞の解析
（１）材料および方法
ＰＤＧＦＲαプロモーターの下流にＨ２Ｂ－ＧＦＰ融合タンパク質の遺伝子（ｃＤＮＡ）がノックインされたマウス（Hamilton TG, Mol Cell Biol. 2003 Jun;23(11):4013-25）から大腿骨および椎骨を切り出し、周囲に付着した他の組織を取り除いた後、乳鉢内で骨を細かく破砕し、ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて細胞を回収した。次いで４０μｍナイロンメッシュに通し、細胞塊や筋組織を除去した。３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞をRBC Lysis buffer（Biolegend）に懸濁し、室温で５分間反応させて赤血球を溶解（溶血）させた。RBC Lysis bufferと等量のＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）を加えて溶血反応を停止させた後、３００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を骨髄由来細胞として得た。骨髄由来細胞を下記の培地Ｃ（対照）または培地Ｄ（ＩＬ－３３含有）に懸濁し、コラーゲンＩでコートされたプラスチック製の６ウェルプレート（Corning Inc., Cat No.356400）に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種して、培地３ｍＬ中、３７℃、５％Ｏ２、５％ＣＯ２の条件下で８日間培養した（培養４または５日目に一度、同じ組成の新鮮な培地に交換した）。
・培地Ｃ（対照）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、下記培地Ｄに添加される成熟マウスＩＬ－３３タンパク質溶液と同容量のＰＢＳを添加したもの）
・培地Ｄ（ＩＬ－３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ－３３タンパク質（配列番号３）を終濃度１ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
・培地Ｄ（ＩＬ－３３含有）：ＭＥＭα（Gibco）（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；L-Glutamineを終濃度４ｍＭになるように添加し、且つ、成熟マウスＩＬ－３３タンパク質（配列番号３）を終濃度１ｎｇ／ｍＬになるよう添加したもの）
培養開始８日目に、プレートに付着している細胞をトリプシン処理により剥がして回収し、間葉系幹細胞の代表的なポジティブマーカーであるＰＤＧＦＲαと代表的なネガティブマーカーであるＣＤ４５の発現をＦＡＣＳで解析した。
（２）結果
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄由来細胞についても、ＩＬ－３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上でコロニーを形成する付着性細胞の数が著しく増大した（図２）。また、表面マーカーの発現パターン別に細胞数を調べたところ、ＰＤＧＦＲα陽性ＣＤ４５陰性（ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－）細胞と、ＰＤＧＦＲα陰性ＣＤ４５陽性（ＰＤＧＦＲα－ＣＤ４５＋）細胞が有意に増加していた（図３および４）。ＩＬ－３３存在下での培養により、間葉系幹細胞の代表的なマーカー発現パターンである「ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－」の付着性細胞が顕著に増えていることから、この実験結果は、ＩＬ－３３の作用によって間葉系幹細胞の増殖が促進されたことを示すものと考えられる。
大腿骨および椎骨のいずれから採取した骨髄由来細胞についても、ＩＬ－３３を含む培地を用いて培養することにより、プレート上でコロニーを形成する付着性細胞の数が著しく増大した（図２）。また、表面マーカーの発現パターン別に細胞数を調べたところ、ＰＤＧＦＲα陽性ＣＤ４５陰性（ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－）細胞と、ＰＤＧＦＲα陰性ＣＤ４５陽性（ＰＤＧＦＲα－ＣＤ４５＋）細胞が有意に増加していた（図３および４）。ＩＬ－３３存在下での培養により、間葉系幹細胞の代表的なマーカー発現パターンである「ＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－」の付着性細胞が顕著に増えていることから、この実験結果は、ＩＬ－３３の作用によって間葉系幹細胞の増殖が促進されたことを示すものと考えられる。
実施例３
材料と方法
マウス
本実施例では、野生型マウスとしてＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ（CLEA Japan）を使用した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスとしてＢ６．１２９Ｓ４－Ｐｄｇｆｒａｔｍ１１（ＥＧＦＰ）Ｓｏｒ (Jackson Laboratory, 007669）を使用した。ＭｙＤ８８ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（Adachi, O. et al. Targeted Disruption of the MyD88 Gene Results in Loss of IL-1- and IL-18-Mediated Function. Immunity 9, 143-150, doi:10.1016/S1074-7613(00)80596-8 (1998)）はオリエンタルバイオサービスから購入した。マウスは、自動給水下に固形飼料を用いて明暗各１２時間に維持された動物飼育室で飼育した。
材料と方法
マウス
本実施例では、野生型マウスとしてＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ（CLEA Japan）を使用した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスとしてＢ６．１２９Ｓ４－Ｐｄｇｆｒａｔｍ１１（ＥＧＦＰ）Ｓｏｒ (Jackson Laboratory, 007669）を使用した。ＭｙＤ８８ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（Adachi, O. et al. Targeted Disruption of the MyD88 Gene Results in Loss of IL-1- and IL-18-Mediated Function. Immunity 9, 143-150, doi:10.1016/S1074-7613(00)80596-8 (1998)）はオリエンタルバイオサービスから購入した。マウスは、自動給水下に固形飼料を用いて明暗各１２時間に維持された動物飼育室で飼育した。
骨髄由来細胞の単離
マウスから大腿骨を採取し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ）中で、乳鉢・乳棒を用いて細胞を取り出した。細胞懸濁液を40μm Cell Strainer（Falcon）に通し、骨などの凝集塊を取り除いた。遠心後、RBC lysis buffer（Biolegend）で溶血して赤血球を取り除き、骨髄由来細胞を得た。
マウスから大腿骨を採取し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ）中で、乳鉢・乳棒を用いて細胞を取り出した。細胞懸濁液を40μm Cell Strainer（Falcon）に通し、骨などの凝集塊を取り除いた。遠心後、RBC lysis buffer（Biolegend）で溶血して赤血球を取り除き、骨髄由来細胞を得た。
骨髄由来細胞の培養
骨髄由来細胞は、コラーゲン被覆６ウェルプレート（Corning Inc.）で１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM Supplement（Gibco, Cat No. 35050061）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Nacalai Tesque）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Nacalai Tesque）、１×モノチオグリセロール溶液（Wako）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭ（３ｍＬ／ウェル）で、低酸素インキュベーターを用いて培養した。分取をせず全骨髄由来細胞を培養するときには、５×１０５個／ウェルで培養した。骨髄由来細胞からＦＡＣＳを用いて間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を分取するときには、ＰＤＧＦＲα＋細胞を８００個／ウェルで分取した。共培養実験においては、さらに骨髄由来細胞を５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５＋細胞を４.７５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５－細胞を２.５×１０３個／ウェルで分取し、それぞれをＭＳＣと共培養した。Transwell（Corning Inc.）を用いた培養時には、コラーゲン被覆６ウェルプレート上に分取したＰＤＧＦＲα＋細胞８００個を播種すると共に、骨髄由来細胞を５×１０５個分取してTranswell上に播種し培養した。ＩＬ－３３（Biolegend）（配列番号３）は１ｎｇ／ｍＬで添加し、コントロールには等量のＰＢＳを添加した。ＤＡＰＴ（ＴＣＩ）は終濃度１μＭまたは１０μＭで添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加した。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（SB203580, AdipoGen）、ＮＫ－κＢ阻害剤（BAY-11-7082, Cayman Chemical）は終濃度５μＭで添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯを添加した。培地は４日毎に交換した。分取操作をしていない細胞は１０日間、ＦＡＣＳにて分取した細胞は１２日間培養し、ＦＡＣＳでの解析または Diff-Quick溶液（Sysmex）で染色しコロニー数の解析を行った。
骨髄由来細胞は、コラーゲン被覆６ウェルプレート（Corning Inc.）で１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM Supplement（Gibco, Cat No. 35050061）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Nacalai Tesque）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Nacalai Tesque）、１×モノチオグリセロール溶液（Wako）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭ（３ｍＬ／ウェル）で、低酸素インキュベーターを用いて培養した。分取をせず全骨髄由来細胞を培養するときには、５×１０５個／ウェルで培養した。骨髄由来細胞からＦＡＣＳを用いて間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を分取するときには、ＰＤＧＦＲα＋細胞を８００個／ウェルで分取した。共培養実験においては、さらに骨髄由来細胞を５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５＋細胞を４.７５×１０５個／ウェル、ＣＤ４５－細胞を２.５×１０３個／ウェルで分取し、それぞれをＭＳＣと共培養した。Transwell（Corning Inc.）を用いた培養時には、コラーゲン被覆６ウェルプレート上に分取したＰＤＧＦＲα＋細胞８００個を播種すると共に、骨髄由来細胞を５×１０５個分取してTranswell上に播種し培養した。ＩＬ－３３（Biolegend）（配列番号３）は１ｎｇ／ｍＬで添加し、コントロールには等量のＰＢＳを添加した。ＤＡＰＴ（ＴＣＩ）は終濃度１μＭまたは１０μＭで添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を添加した。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（SB203580, AdipoGen）、ＮＫ－κＢ阻害剤（BAY-11-7082, Cayman Chemical）は終濃度５μＭで添加し、コントロールには等量のＤＭＳＯを添加した。培地は４日毎に交換した。分取操作をしていない細胞は１０日間、ＦＡＣＳにて分取した細胞は１２日間培養し、ＦＡＣＳでの解析または Diff-Quick溶液（Sysmex）で染色しコロニー数の解析を行った。
ＦＡＣＳによる細胞の解析、細胞分取
ＦＡＣＳによる細胞の解析、細胞分取は、FACSAriaTMIIIμ（BD Bioscience）またはFACSCantoTMII（BD Bioscience）を、データ解析はFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて行った。ＰＤＧＦＲαの発現解析にはＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスを用いた。培養細胞の解析時における培養プレートからの細胞剥離には、AccutaseTM（Nacalai Tesque）を用いた。抗体添加時には、Ｆｃ受容体への非特異な結合を阻害するため細胞懸濁液にTrustain FcXTM（Biolegend）を添加し５分間４℃でインキュベートした後、ＡＰＣ－結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103112）、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５－結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103132)、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５－結合ＴＥＲ１１９抗体（Biolegend, 116228）を添加し２０分間４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ解析前に、死細胞を取り除くためSYTOXTM Blue Dead Cell Stain（Thermo Fisher Scientific）で染色した。細胞分取時には、１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１×モノチオグリセロール溶液、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭへ分取した。
ＦＡＣＳによる細胞の解析、細胞分取は、FACSAriaTMIIIμ（BD Bioscience）またはFACSCantoTMII（BD Bioscience）を、データ解析はFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて行った。ＰＤＧＦＲαの発現解析にはＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウスを用いた。培養細胞の解析時における培養プレートからの細胞剥離には、AccutaseTM（Nacalai Tesque）を用いた。抗体添加時には、Ｆｃ受容体への非特異な結合を阻害するため細胞懸濁液にTrustain FcXTM（Biolegend）を添加し５分間４℃でインキュベートした後、ＡＰＣ－結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103112）、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５－結合ＣＤ４５抗体（Biolegend, 103132)、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５.５－結合ＴＥＲ１１９抗体（Biolegend, 116228）を添加し２０分間４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ解析前に、死細胞を取り除くためSYTOXTM Blue Dead Cell Stain（Thermo Fisher Scientific）で染色した。細胞分取時には、１５％ＦＢＳ、１×GlutaMAXTM、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１×モノチオグリセロール溶液、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を添加したαＭＥＭへ分取した。
実施例３－１：ＩＬ－３３は骨髄由来ＭＳＣのコロニー形成活性を増強する
ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞を５×１０５細胞ずつ６ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地３ｍＬ中、１０日間ＩＬ－３３添加培地で培養し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析したところ、ＩＬ－３３添加による有意な骨髄由来細胞の増加が確認できた（図５ａ）。ＭＳＣはＰＤＧＦＲαを発現し、血球系のマーカーであるＣＤ４５を発現しないことが知られるため、本実施例においてはＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－細胞をＭＳＣ分画とした。ＦＡＣＳにより、ＩＬ－３３が骨髄由来ＭＳＣを有意に増加させることが明らかになった（図５ｂ）。また同時に、ＩＬ－３３はＭＳＣのみでなくＣＤ４５＋細胞も有意に増加させており（図５ｃ）、ＩＬ－３３は骨髄内の複数の細胞集団に作用している可能性が示唆された。
ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞を５×１０５細胞ずつ６ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地３ｍＬ中、１０日間ＩＬ－３３添加培地で培養し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析したところ、ＩＬ－３３添加による有意な骨髄由来細胞の増加が確認できた（図５ａ）。ＭＳＣはＰＤＧＦＲαを発現し、血球系のマーカーであるＣＤ４５を発現しないことが知られるため、本実施例においてはＰＤＧＦＲα＋ＣＤ４５－細胞をＭＳＣ分画とした。ＦＡＣＳにより、ＩＬ－３３が骨髄由来ＭＳＣを有意に増加させることが明らかになった（図５ｂ）。また同時に、ＩＬ－３３はＭＳＣのみでなくＣＤ４５＋細胞も有意に増加させており（図５ｃ）、ＩＬ－３３は骨髄内の複数の細胞集団に作用している可能性が示唆された。
骨髄由来ＭＳＣは、培養において線維芽細胞様のコロニーを形成するため、線維芽細胞様コロニー形成単位（Colony forming unit-fibroblast; CFU-F）を測定することにより、ＭＳＣの存在率、増殖率を評価できる。ＩＬ－３３添加培地で１０日間培養後にコロニーアッセイを施行したところ、ＩＬ－３３添加によりコロニー数が約７倍有意に増加し（図５ｄ）、ＩＬ－３３が骨髄由来ＭＳＣのコロニー形成活性を増強することが示された。
実施例３－２：ＩＬ－３３はＣＤ４５ ＋ 細胞とＭＳＣの細胞間接触を介して骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性を増強する
ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強メカニズムについて、ＩＬ－３３が直接骨髄由来ＭＳＣに作用し、そのＣＦＵ－Ｆ活性を増強させるか、あるいは他の細胞のシグナルを介しているのかを検討した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞から、ＦＡＣＳによりＭＳＣ（ＰＤＧＦＲα＋細胞）を分取し、ＩＬ－３３添加培地で培養した。しかし、ＭＳＣ単独の培養条件下では、ＩＬ－３３によってＣＦＵ－Ｆ活性は変化しなかった（図６）。このことから、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、骨髄中に存在するＭＳＣ以外の細胞によって間接的に制御されている可能性が示唆された。
ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強メカニズムについて、ＩＬ－３３が直接骨髄由来ＭＳＣに作用し、そのＣＦＵ－Ｆ活性を増強させるか、あるいは他の細胞のシグナルを介しているのかを検討した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞から、ＦＡＣＳによりＭＳＣ（ＰＤＧＦＲα＋細胞）を分取し、ＩＬ－３３添加培地で培養した。しかし、ＭＳＣ単独の培養条件下では、ＩＬ－３３によってＣＦＵ－Ｆ活性は変化しなかった（図６）。このことから、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、骨髄中に存在するＭＳＣ以外の細胞によって間接的に制御されている可能性が示唆された。
ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強が、ＭＳＣと他の骨髄由来細胞との細胞間接触に依拠しているか調べた。Transwellを用いて、骨髄由来細胞と骨髄由来ＭＳＣが培地を共有するが細胞同士の接触は起こらない培養条件を作り出し、骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性を調査した。骨髄由来ＭＳＣを骨髄由来細胞と共培養（Co-culture）するとＩＬ－３３によりＣＦＵ－Ｆ活性が増加したが、骨髄由来ＭＳＣと骨髄由来細胞の細胞間接触を抑制した条件下（Transwell）ではＩＬ－３３によるＣＦＵ－Ｆ活性に変化は見られず、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強には、ＭＳＣ以外の他の細胞とＭＳＣとの細胞間接触が必須であることが示された（図７ａ）。なお、ＩＬ－３３存在下で骨髄由来細胞を培養すると、液性因子としてＣＣＬ２、ＣＣＬ２２、オステオポンチンの分泌が促進されることが明らかとなったため（データ非開示）、これらの物質を、それぞれ培地に添加して骨髄由来細胞を培養したが、いずれの物質の添加によってもＣＦＵ－Ｆ活性は変化しなかった（データ非開示）。
さらに骨髄中に存在するどの細胞との接触が骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性を増強させるのか検討した。実施例３－１においてＩＬ－３３が骨髄由来細胞中のＣＤ４５陽性（ＣＤ４５＋）細胞を増加させたことから（図５ｃ）、ＣＤ４５陽性細胞との細胞間接触が必要なのではないかと予想し、ＣＤ４５陽性細胞とＣＤ陰性（ＣＤ４５－）細胞をそれぞれＦＡＣＳにより分取し、ＩＬ－３３存在下で骨髄由来ＭＳＣと共培養した。ＣＤ４５－細胞にはＰＤＧＦＲα＋細胞が含まれたが、無視できる量であった。ＣＤ４５＋細胞との共培養でのみ骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性の増強が確認でき、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、ＣＤ４５＋細胞との細胞間接触を介して誘導されることが示された（図７ｂ）。
実施例３－３：ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強はＭｙＤ８８シグナル経路依存的である
ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強の分子メカニズムをさらに詳細に検討した。ＩＬ－３３が細胞膜受容体であるＳＴ２／ＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡＰ）複合体に結合すると、この受容体にアダプタータンパク質であるミエロイド系分化因子（Myeloid differentiation primary response）８８（ＭｙＤ８８）が誘導され、ＭｙＤ８８は、ＮＦ－κＢ、ｐ３８、ＥＲＫやＪＮＫの活性化を介して、目的遺伝子の活性を制御することが知られている。そこで、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強におけるＭｙＤ８８シグナル経路の影響を調べるために、ＭｙＤ８８ノックアウト（ＫＯ）マウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞を、ＩＬ－３３添加培地で培養した。ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄由来細胞では、ＩＬ－３３添加によるＣＦＵ－Ｆ活性に変化は認められず、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強にはＭｙＤ８８シグナル経路が必須であるがことが示された（図８ａ）。さらに、ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄由来細胞では、ＩＬ－３３によるＣＤ４５＋細胞の増加も認められず（図８ｂ）、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、ＣＤ４５＋細胞におけるＭｙＤ８８シグナル経路に依存する可能性が示唆された。
ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強の分子メカニズムをさらに詳細に検討した。ＩＬ－３３が細胞膜受容体であるＳＴ２／ＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡＰ）複合体に結合すると、この受容体にアダプタータンパク質であるミエロイド系分化因子（Myeloid differentiation primary response）８８（ＭｙＤ８８）が誘導され、ＭｙＤ８８は、ＮＦ－κＢ、ｐ３８、ＥＲＫやＪＮＫの活性化を介して、目的遺伝子の活性を制御することが知られている。そこで、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強におけるＭｙＤ８８シグナル経路の影響を調べるために、ＭｙＤ８８ノックアウト（ＫＯ）マウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞を、ＩＬ－３３添加培地で培養した。ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄由来細胞では、ＩＬ－３３添加によるＣＦＵ－Ｆ活性に変化は認められず、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強にはＭｙＤ８８シグナル経路が必須であるがことが示された（図８ａ）。さらに、ＭｙＤ８８ＫＯマウスの骨髄由来細胞では、ＩＬ－３３によるＣＤ４５＋細胞の増加も認められず（図８ｂ）、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、ＣＤ４５＋細胞におけるＭｙＤ８８シグナル経路に依存する可能性が示唆された。
さらに、ＭｙＤ８８の下流で働くことが知られるｐ３８ＭＡＰＫ経路およびＮＦ－κＢ経路の関与を検討した。ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞において、ＤＭＳＯ添加コントロール群とＮＦ－κＢ阻害剤（ＢＡＹ－１１－７０８２）添加群ではＩＬ－３３によるＣＦＵ－Ｆ活性の増強が見られたが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０）添加群ではＩＬ－３３によるＣＦＵ－Ｆ活性の変化は認められなかった（図９）。これらの結果により、ＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強は、ＭｙＤ８８シグナル経路依存的であり、さらにｐ３８ＭＡＰＫ経路を介することが明らかになった。
ＩＬ－３３によってＭｙＤ８８シグナル経路依存的に活性化されたＣＤ４５＋細胞が、骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性増強を誘導する分子メカニズムを検討すべく、ＭＳＣの増殖や維持において重要であることが報告されているＮｏｔｃｈシグナル経路の影響を調べた。具体的には、ＰＤＧＦＲαＧＦＰノックインマウス大腿骨から調製した骨髄由来細胞において、Ｎｏｔｃｈシグナル経路の一部であるγ－セクレターゼを阻害するＤＡＰＴ（（３，５－ジフルオロフェニルアセチル）－Ｌ－アラニル－Ｌ－２－フェニルグリシンｔｅｒｔ－ブチルエステル）が、ＩＬ－３３添加によるＭＳＣ増殖に与える影響を検討した。その結果、ＤＡＰＴ存在下ではＩＬ－３３による骨髄由来ＭＳＣのＣＦＵ－Ｆ活性の増強が抑制された（図１０ａ）。さらに、ＤＡＰＴ／ＩＬ－３３添加培地で培養した骨髄由来細胞をＦＡＣＳで解析すると、ＤＡＰＴの濃度依存的にＭＳＣ数が減少した（図１０ｂ）。一方で、ＤＡＰＴ／ＩＬ－３３を添加しても、ＣＤ４５＋細胞数の増加は抑制されなかった（図１０ｃ）。
本開示により、間葉系幹細胞の取得効率の向上が可能になり、ドナーの負担軽減、間葉系幹細胞を用いる再生医療のコスト低減、間葉系幹細胞を利用した基礎研究や医薬品開発の促進等が期待される。
Claims (16)
- 間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
- 間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団が、骨髄由来の間葉系幹細胞および／またはＣＤ４５陽性細胞を含む、請求項１に記載の方法。
- 間葉系幹細胞およびＣＤ４５陽性細胞を含む細胞集団を、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質の存在下で培養する、請求項１または２に記載の方法。
- ＣＤ４５陽性細胞を活性化させる物質がＩＬ－３３である、請求項３に記載の方法。
- ＩＬ－３３が、
ａ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含み、且つ、全長ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｃ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質の一部のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｄ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｅ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなり、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、
ｆ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド、および
ｇ）全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質をコードする核酸配列と約９０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされ、ＣＤ４５陽性細胞を活性化させるポリペプチド
からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。 - ＩＬ－３３が、全長もしくは成熟ＩＬ－３３タンパク質のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
- ＩＬ－３３が、配列番号１～８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項６に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を分離する工程をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
- 間葉系幹細胞を分離する工程が、ａ）１回以上の継代培養、および／または、ｂ）間葉系幹細胞をターゲットとしたセルソーティングを含む、請求項８に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を、ＩＬ－３３の存在下でＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
- ＣＤ４５陽性細胞を含有する、間葉系幹細胞の培養に用いるための培地または培地添加剤。
- ＩＬ－３３をさらに含有する、請求項１１に記載の培地または培地添加剤。
- ＩＬ－３３を含有する、間葉系幹細胞とＣＤ４５陽性細胞の共培養に用いるための培地または培地添加剤。
- 以下の工程を含む、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、
２）対照培地に被験物質を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程、および、
３）工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。 - １’）対照培地にＩＬ－３３を添加した培地を用いて間葉系幹細胞をＣＤ４５陽性細胞と共培養する工程をさらに含み、工程３）において、工程２）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多く、且つ、工程１’）によって得られた間葉系幹細胞の数が工程１）によって得られた間葉系幹細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、間葉系幹細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質のスクリーニング方法：
１）対照培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
２）ＩＬ－３３を対照培地に添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、
３）対照培地に被験物質を添加した培地を用いてＣＤ４５陽性細胞を培養する工程、および、
４）工程２）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多く、且つ、工程３）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数が工程１）によって得られたＣＤ４５陽性細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、ＣＤ４５陽性細胞の増殖を促進する物質の候補として選択する工程。
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Cited By (1)
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