WO2020017504A1 - ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法 - Google Patents

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WO2020017504A1
WO2020017504A1 PCT/JP2019/027943 JP2019027943W WO2020017504A1 WO 2020017504 A1 WO2020017504 A1 WO 2020017504A1 JP 2019027943 W JP2019027943 W JP 2019027943W WO 2020017504 A1 WO2020017504 A1 WO 2020017504A1
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eel
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文子 中島
壮一 渡邊
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キッコーマン株式会社
国立大学法人東京大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates generally to a method for screening palatability components for eels and the like.
  • T1R family molecules which are G protein-coupled receptors (GPCRs)
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • the T1R family is composed of three molecular species of T1R1, T1R2 and T1R3.
  • a heterodimer of T1R1 + T1R3 such as L-amino acid is used as a heterodimer
  • a heterodimer of T1R2 + T1R3 is used as a sweet substance such as sugar and artificial sweetener.
  • T1R3s are expressed in some taste cells and receive high concentrations of sugar.
  • T1R2 + T1R3 also functions as an L-amino acid receptor in fish (Oike et al., J. Neurosci., 2007).
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-204214 discloses sequences thought to correspond to T1R2 and T1R3 of medaka, and also describes that these are related to amino acid preference.
  • T1R2 + T1R3 functions as a sweet receptor, but some animals such as birds do not have T1R2, but it cannot be inferred that sweetness cannot be perceived, and in hummingbirds that accept flower nectar (sweetness), It has been demonstrated that T1R1 + T1R3 accepts sweetness (Baldwin et al., Science, 2014).
  • an object of the present invention is to provide a novel method for screening palatability components for eels, and a feed for eels containing the screened palatability components.
  • the present inventors have determined that a heterodimer consisting of any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family responds to stimulation of a palatability component for eel. And completed the present invention.
  • a method for screening palatability components for eels (A) contacting a heterodimer consisting of any one member of the eel-derived taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a candidate substance for palatability components, and (b) E) evaluating the candidate substance that increases the activity of the heterodimer as a palatability component.
  • a method for screening palatability components for eels (A) contacting a heterodimer consisting of any one member of the eel-derived taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a candidate substance for palatability components, and (b) E) evaluating the candidate substance that increases the activity of the heterodimer as a palatability component.
  • the T1R2 family member is a protein selected from the group consisting of (a1) to (a6): (A1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9; (A2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10; (A3) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9, which protein responds to L-amino acid; (A4) a protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, wherein the protein responds to an L-amino acid; (A5) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 has
  • the T1R2 family member is selected from the group consisting of AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3 and AjT1R2b-4; The method according to [4].
  • the T1R3 family member is a protein selected from the group consisting of (b1) to (b6): (B1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; (B2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12; (B3) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, which protein responds to L-amino acid; (B4) a protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, which protein responds to L-amino acid; (B5) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 have been deleted, substituted and / or added, and which responds to an L-amino acid; or
  • a feed for eels comprising a palatability component screened using the method according to any one of [1] to [9].
  • a feed for eels which contains one or more of creatinine, N, N-dimethylglycine and sarcosine as palatability components.
  • a substance that directly acts on the taste receptor of eel can be screened as a palatable ingredient, and therefore, a new ingredient that has not been used in eel farming until now, replacing conventional ingredients such as shark eggs. Can be searched.
  • FIG. 1 shows an alignment of Japanese eel T1R.
  • FIG. 2 shows the evaluation of G protein in AjT1R2a + AjT1R3 and each AjT1R2b + AjT1R3.
  • FIG. 3 shows the evaluation of the concentration dependency of AjT1R2b-1 + AjT1R3 on sarcosine, creatinine, and N, N-dimethylglycine.
  • the present invention is a method of screening palatability components for eel, (A) contacting a heterodimer comprising any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family with a candidate substance for a palatability component; Evaluating a candidate substance that increases the activity of the dimer as a palatability component.
  • a palatability component for eel refers to a negative control that does not contain a ligand such as a candidate substance, e.g., a substance that has a significant effect on the taste receptor of eel in comparison with a buffer. Alternatively, it means a taste substance preferred by the eel or an ingredient which promotes eating of the eel.
  • L-amino acids such as alanine, arginine, glycine, proline, lysine, serine, histidine, betaine, and the like are known as a taste substance favored by eels or a component that promotes eating of eels.
  • Such a known palatability component can also be used as an index for screening.
  • eel refers to any one member of the taste receptor T1R2 family and any one member of the T1R3 family among eels of the order Eel, particularly fish of the genus Eel (Anguilla). Having a heterodimer consisting of Other T1R families may be used instead of the T1R2 family as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • major eels are roughly divided into four: Japanese eel (A. japonica), European eel (A. anguilla), American eel (A. rostrata), and eel (A. marmorata). You. Other eels include New Guinea eel (A.
  • African eel A. bengalensis @ labiaata
  • continental freshwater eel A. breviceps
  • continental eel A. shore eel
  • A. e. .Malgumora There are two main types of food: Japanese eel and European eel.
  • the eels include other eels, eel, moray eel, and spiders other than those described above.
  • eel Conger. Myriaster
  • Japanese eel C. japonica
  • scallop Ariosoma meeki
  • ginago Gnatophis ⁇ ⁇ st ⁇ ⁇ st st. (Synaphobranchus kaupii)
  • moray eel (Gymnothorax kidako), spiders (Muraenesox cinereus), and sea cucumber (Muraenesox bagio) can also be included in the eels of the present invention.
  • Eels that are expected to consume the screened palatability component may be at any stage of development as long as they express any one member of the T1R2 family and a member of the T1R3 family. And natural ones.
  • Taste receptor protein A receptor for taste is a membrane protein called a seven-transmembrane protein, and is also called a G protein-coupled receptor (GPCR) because it is linked to a G protein.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • Taste receptor proteins are roughly classified into two types, one having a large extracellular region and the other having no such region, based on their structure. The former is a T1R family (Taste Receptor type-1), and the latter is a T2R family ( This is referred to as “TEST Receptor type-2).
  • T1R family consists of three molecular species, T1R1, T1R2, and T1R3.
  • the present inventors obtained five types of full-length sequences of T1R2 and one type of full-length sequence of T1R3, and used them for AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, and AjT1R2b-4, respectively. , AjT1R3.
  • These AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, AjT1R2b-4 and AjT1R3 have the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, It has 8, 10, and 12 base sequences.
  • FIG. 1 shows an alignment of the obtained full-length amino acid sequences.
  • T1R1, T1R2 and T1R3 families have been found in mammals.
  • T1R1 + T1R3 receives umami substances and T1R2 + T1R3 receives sweet substances.
  • T1R1 and T1R3 families have one member and T1R2 family has a plurality of members in fishes such as medaka and torchfish which have been reported on taste receptors.
  • T1R2 + T1R3 and T1R2 + T1R3 also receive umami substances.
  • T1R2 may be diversified due to gene duplication as in other fishes.
  • receptor candidates other than the sequences found this time It is considered that there is a possibility that there is a gene sequence that
  • a taste receptor to be contacted with a candidate substance of a palatability component includes any one member of the T1R2 family such as AjT1R2a, AjT1R2b-1, AjT1R2b-2, AjT1R2b-3, AjT1R2b-4 and AjT1R3. It is a heterodimer composed of any one member of the T1R3 family.
  • AjT1R2a and AjT1R3 responds to L-alanine, L-serine, L-arginine, glycine, and L-proline.
  • the combination of AjT1R2b-1 and AjT1R3 responds to L-proline and L-alanine.
  • the combination of AjT1R2b-1 and AjT1R3 also responds to sarcosine, creatinine, N, N-dimethylglycine.
  • the combination of AjT1R2b-2 and AjT1R3 responds to L-histidine, L-serine, L-phenylalanine, L-alanine, L-asparagine.
  • the combination of AjT1R2b-4 and AjT1R3 is responsive to L-alanine, glycine, L-serine, L-proline.
  • the T1R2 family member may be selected from the group consisting of: (a1) to (a6): (A1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9; (A2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10; (A3) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9, which protein responds to L-amino acid; (A4) a protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, wherein the protein responds to an L-amino acid; (A5) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 has been deleted, substituted, and / or added, and which responds to L-
  • the T1R3 family member may be selected from the group consisting of: (b1) to (b6): (B1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; (B2) a protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12; (B3) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, which protein responds to L-amino acid; (B4) a protein encoded by a gene consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12, which protein responds to L-amino acid; (B5) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 have been deleted, substituted and / or added, and which responds to an L-amino acid; or (b6) a sequence A protein that is encoded by a nucleo
  • the amino acid sequence may be a wild-type such as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11 if it responds to a stimulus of a known palatability component such as an L-amino acid or a palatability component identified by screening.
  • a known palatability component such as an L-amino acid or a palatability component identified by screening.
  • the amino acid sequence of the type protein from 1 to a plurality, for example, 100 amino acids in the amino acid sequence as one unit, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20, preferably even an amino acid sequence having deletion, substitution, addition, etc. of several amino acids. Good.
  • the range of “1 to several” in the “deletion, substitution, and addition of one to several amino acids” in the amino acid sequence is not particularly limited, but is preferably 1, 2, 3, 4 About 5, 6, 7, 8, 9 or 10 pieces, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5 pieces.
  • “deletion of amino acid” means deletion or disappearance of an amino acid residue in a sequence
  • “substitution of amino acid” means that an amino acid residue in a sequence is replaced with another amino acid residue.
  • “addition of an amino acid” means that a new amino acid residue is added so as to be inserted into the sequence.
  • “deletion, substitution, and addition of amino acids” include wild-type as long as the response to a stimulus of a known palatability component such as an L-amino acid and a palatability component identified by screening is maintained.
  • the amino acid in has been replaced with another chemically similar amino acid.
  • a case where a certain hydrophobic amino acid is substituted with another hydrophobic amino acid a case where a certain polar amino acid is substituted with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • Non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • Basic amino acids having a positive charge include arginine, histidine, lysine and the like.
  • negatively charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequences having a wild-type protein such as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 or 11.
  • Amino acid sequences having the above sequence identity are mentioned, for example, 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably the amino acid sequence of the wild-type protein. Amino acid sequences having 95% or more identity.
  • the nucleotide sequence to be used may be one that generates a desired sequence via splicing after transcription of the nucleotide sequence when introduced into a host organism, or one that generates a desired sequence without passing through splicing after transcription. Good.
  • the nucleotide sequence used may not be completely identical to the wild-type sequence, and may be of the wild-type as long as it maintains a response to a known palatability component such as an L-amino acid or a palatability component identified by screening. It may be a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the gene.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a DNA corresponding to a part of the base sequence of a wild-type gene such as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12.
  • base sequence When used as a probe, it means the nucleotide sequence of DNA obtained by using colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot hybridization, or the like.
  • stringent conditions are conditions under which a signal of a specific hybrid is clearly distinguished from a signal of a non-specific hybrid. And length. Such conditions can be determined by changing the temperature of hybridization, the temperature of washing, and the salt concentration.
  • specificity when a signal of a non-specific hybrid is strongly detected, specificity can be increased by increasing the temperature of hybridization and washing and, if necessary, decreasing the salt concentration of washing.
  • the hybrid When no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, increasing the washing salt concentration.
  • specific examples of stringent conditions include: For example, a DNA probe is used as a probe, and hybridization is performed in 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v) nucleic acid hybridization blocking reagent (Boehringer Mannheim), 0.1% (w / v) N -Perform overnight (about 8 to 16 hours) using lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS. Washing is performed twice for 15 minutes using 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS. Do. The temperature at which hybridization and washing are performed is 65 ° C. or higher, preferably 68 ° C. or higher.
  • Examples of the DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions include, for example, a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or a plaque or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized, using the above-mentioned stringent.
  • a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or a plaque or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized using the above-mentioned stringent.
  • the nucleotide sequence of the wild-type gene taking into account other conditions such as the probe concentration, the probe length, and the reaction time.
  • the conditions for obtaining a DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to can be appropriately set.
  • a DNA having at least a certain degree of sequence identity with the nucleotide sequence of the wild-type gene used as a probe For example, DNA having a sequence identity of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with the nucleotide sequence of the wild-type gene.
  • the base sequence of the wild-type gene Per unit, from 1 to a plurality, for example, from 1 to 125, from 1 to 100, from 1 to 75, from 1 to 50, from 1 to 30, from 1 to 20, preferably from 1 to several, For example, it includes a base sequence having 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 base deletions, substitutions, additions, and the like.
  • a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed that is, a condition of high stringency is preferable.
  • high stringency conditions include conditions under which nucleic acids having high identity hybridize with each other and nucleic acids having lower identity do not hybridize with each other.
  • deletion of a base means that there is a deletion or disappearance of a base in the sequence
  • substitution of a base means that a base in the sequence is replaced with another base
  • addition of a base means that a new base is added so as to be inserted.
  • the protein encoded by the nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the wild-type gene has one to more than one amino acid sequence in the protein encoded by the nucleotide sequence of the wild-type gene. It is likely that the protein has an amino acid sequence having deletions, substitutions, additions, and the like of several, preferably several amino acids, but it is considered to have the same effect as the protein encoded by the nucleotide sequence of the wild-type gene.
  • a gene encoding a protein is a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence identical or similar to the amino acid sequence of an enzyme encoded by a wild-type gene, utilizing the fact that there are several types of codons corresponding to one amino acid. And may contain a base sequence different from that of the wild-type gene.
  • the nucleotide sequence may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage of the host used.
  • the method for determining the sequence identity between the nucleotide sequence and the amino acid sequence is not particularly limited.
  • the amino acid sequence of the wild-type gene or the enzyme encoded by the wild-type gene may be used by using a generally known method. It is determined by aligning the base sequence or the amino acid sequence and using a program for calculating the identity rate of the two sequences.
  • Examples of a program for calculating the coincidence rate between two amino acid sequences and base sequences include, for example, the algorithm of Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA # 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. @ USA 90: 5873-5877, 1993), and a BLAST program using this algorithm has been developed by Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Furthermore, Gapped @ BLAST, which is a program for determining sequence identity with higher sensitivity than BLAST, is also known (Nucleic Acids Res. @ 25: 3389-3402, 1997).
  • Each of the above methods can be generally used to search a sequence showing sequence identity from a database, but as a means for determining the sequence identity of an individual sequence, Genetyx network version ⁇ version ⁇ 12.0. 1 (manufactured by Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science # 227: 1355-1441, 1985). When analyzing the sequence identity of a nucleotide sequence, a region (CDS or ORF) encoding a protein is used, if possible.
  • the heterodimer consisting of the G proteins T1R2 and T1R3 is conjugated to the heterotrimer G protein specifically expressed in taste receptor cells.
  • the G protein may be co-expressed.
  • Gq family, gustducin, transducin and the like are known as such G proteins.
  • G protein is composed of G ⁇ ( ⁇ subunit) and G ⁇ subunit. When screening for palatability components, at least the G ⁇ subunit among them may be expressed. The G ⁇ subunit may be expressed together with the G ⁇ subunit. It is known that the G ⁇ subunit includes a group of Gi, Gq or Gs, and G12 / 13. Above all, chimeric proteins in which G ⁇ 15 or G ⁇ 16 alone or their C-terminal 5, 25 or 44 residues are substituted with the corresponding C-terminal residues of members belonging to the Gi, Gq or Gs family Can be suitably used. Such substitution of the C-terminal residue is known to those skilled in the art (see, for example, Li et al., PNAS April 2, 2002. 99, (7) 4692-469, etc.). It is considered that such substitution of the C-terminal residue facilitates coupling with the receptor.
  • the “corresponding C-terminal residue” means, for example, when the C-terminal sequence of G ⁇ 15 is replaced with another G ⁇ subunit, the five amino acids constituting the C-terminal sequence of the G ⁇ subunit.
  • the expression rG15-rGi3-5 means rat G ⁇ 15 (hereinafter, G ⁇ 15 may be referred to as “G15”, rat G ⁇ 15 may be referred to as “rG15”, mouse G ⁇ 15 may be referred to as “mG15”, Human G ⁇ 16 may be referred to as “hG16” or the like.) Means that 5 amino acids of the C-terminal sequence of rat Gi3 have been substituted.
  • rG15-rGi3-5 (SEQ ID NO: 13); rG15-rGi2-5 (SEQ ID NO: 15); hG16-rGi3-5 (SEQ ID NO: 17); mG15 (SEQ ID NO: 19); rG15 (SEQ ID NO: 21); rG15-rGgust-5 (SEQ ID NO: 23); hG16 (SEQ ID NO: 25); hG16-rGgust-25 (SEQ ID NO: 27); hG16-rGi2-44 (SEQ ID NO: 29); hG16-rGs-25 (SEQ ID NO: 31); hG16-rGs-44 (SEQ ID NO: 33); rG15-rGgust-25 (SEQ ID NO: 35)
  • the protein used in the screening can be prepared by operably linking the base sequences alone or in any combination together and expressing them in desired cells. Each sequence can be inserted into the same or different vectors.
  • the nucleotide sequence encoding the heterodimer is expressed in a suitable host, for example, a mammal such as a human, an animal cell such as an amphibian such as a frog, an insect cell, or a yeast.
  • a suitable host for example, a mammal such as a human, an animal cell such as an amphibian such as a frog, an insect cell, or a yeast.
  • the host is a cell, such as an insect or a mammal.
  • the mammalian cells are human cells. Examples of mammalian cells include Human Embronic Kidney (HEK), for example, HEK293T, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), Chinese Hamster Ovary cells (CHO), and the like.
  • HEK Human Embronic Kidney
  • MDCK Madin-Darby Canine Kidney
  • CHO Chinese Hamster Ovary cells
  • the introduction of the base sequence encoding the heterodimer into the host cell can be performed by a known method, for example, the method described in Sambrook, ⁇ J. , Fritsch, E. F. , ⁇ And ⁇ Maniatis, ⁇ T. , "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), and the like.
  • the screening method of the present invention may include any step used for screening in addition to the following steps.
  • ⁇ ⁇ Increase in the activity of the heterodimer can be measured using a calcium ion measurement reagent or the like.
  • a calcium ion measurement reagent for example, a calcium-sensitive luminescent protein, specifically, a protein such as aequorin that emits light according to the concentration of calcium ions is preferable.
  • calcium imaging in which receptor activation is observed based on the image, the number of responding cells is counted from the obtained image, and the degree of response can be judged, can be used. Instruments for measuring such activation include a CCD camera CoolSNAP @ HQ2 (Nippon Roper), an inverted microscope IX-81 (OLYMPUS), and software for imaging such as MetaMorph, MetaFlour (Molecular Devices).
  • a well-based assay that obtains a numerical value of the cell response on a multiwell plate may be used.
  • FlexStation3 Molecular Devices
  • FLIPR Molecular Devices
  • GPCRs such as T1R2 and T1R3 cause structural changes (activation) upon binding to ligands, ie, palatability components, attract G proteins such as gustducin, and raise various downstreams in addition to increasing intracellular calcium. (Eg, GTP binding to low molecular weight G protein Rho, etc., with varying cyclic AMP concentration). By detecting these intracellular events, the activity of the heterodimer can also be measured.
  • a sample containing no ligand such as a candidate substance for example, a buffer
  • a candidate substance for example, a buffer
  • Candidate substances having comparable or greater activity compared to such controls can be evaluated as palatability components.
  • known palatability components such as L-amino acids, for example, L-alanine, L-arginine, glycine, L-proline, L-lysine, L-serine, L-histidine are used. You may.
  • the present invention provides a feed for eels, comprising a palatability component screened using the above method.
  • the feed may be for larvae, fry, or adult fish. Eel larvae become active in secretion of digestive enzymes around the 7th day after hatching at a water temperature of 23 ° C. At such a stage, the feed of the present invention is considered to be useful.
  • Preference components screened according to the present invention include sarcosine, N, N-dimethylglycine or creatinine, or analogs thereof.
  • the palatability component may contain one or more of sarcosine, N, N-dimethylglycine or creatinine.
  • Sarcosine is one of the components of the Chionoecetes opilio leg meat extract (Kawai, 2011) and is reported to respond to pufferfish (Kiyohara et al., 1985). It has been reported that creatinine is mainly contained in muscles of higher animals than fish, and as a guanidino compound contained in mackerel fish. Although creatinine imparts a strong meat-like taste to humans, there is a report that it has the effect of improving soup stock, but there is no report examining the taste response in fish, and the present inventors have newly found it. It is likely that it is a taste component.
  • the amount of the palatability component can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of eel to be fed, the growth state thereof, the number of times of feeding, and the like.
  • the amount thereof in the feed is preferably, for example, 3% by mass or more.
  • Eel diets mainly include raw fish-based ingredients such as sardines, or fish-based ingredients such as dried fish, such as sardines, mackerel, herring or horse mackerel, and shark egg powder. May be used.
  • Minerals such as soy peptide, krill hydrolyzate, starch, calcium phosphate, salt and other minerals, yeast, and herbal extracts, as long as the effects of the palatability components added to the feed are not impaired, in addition to fish-derived components used in conventional feeds And the like may be added to the feed.
  • chimeric G protein known rG15-rGi3-5, rG15-rGi2-5 and hG16-rGi3-5 were used. According to the following procedure, how each receptor responds to 15 kinds of amino acids in combination with each chimeric G protein was examined.
  • HEK293T cells were seeded on a 12-well plate and cultured overnight at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • 2) For the cells of 1) use the respective plasmids (pEAK10 vector (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) expressing AjT1R2, AjT1R3, chimeric G protein, and apoaequorin, and use the respective sequences for AscI and NotI restriction enzyme sites. Was inserted using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 3) After 6 to 7 hours, the medium was changed and the cells were cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • FIG. 2 shows the response results of AjT1R2a + AjT1R3 and each of AjT1R2b + AjT1R3 to specific amino acids among 15 types of amino acids.
  • the ligand concentration was 50 mM in each case.
  • the vertical axis represents the light emission intensity.
  • AjT1R2a + AjT1R3 is L-alanine, L-serine, L-arginine, glycine, L-proline
  • AjT1R2b-1 + AjT1R3 is L-proline, L-alanine
  • AjT1R2b-2 + AjT1R3 responds to L-histidine
  • AjT1R2b-4 + AjT1R3 responds to L-alanine, glycine, L-serine, L-proline.
  • AjT1R2b-3 + AjT1R3 tended to respond to L-serine, L-threonine, L-alanine and L-arginine, but the response was low overall.
  • Test group Each test group was provided by accommodating 10 Japanese eels immature fish in a 200 L water tank. Feeding was performed once a day, and daily. A feed excluding known ingredients such as betaine, glycine, alanine, and krill meal from a compound feed for eel cultivation (for adult eel, sold by Hayashikane Sangyo Co., Ltd.) was used as a palatable ingredient-removed feed.
  • known ingredients such as betaine, glycine, alanine, and krill meal from a compound feed for eel cultivation (for adult eel, sold by Hayashikane Sangyo Co., Ltd.) was used as a palatable ingredient-removed feed.
  • N, N-dimethylglycine-added feed A feed obtained by adding 3% of N, N-dimethylglycine to a palatable ingredient-removed feed (hereinafter referred to as “N, N-dimethylglycine-added feed”) is fed to young Japanese eels as described above, and The preference of N, N-dimethylglycine was evaluated by measuring the amount of feed, feed efficiency, and the like.
  • As a comparative group there were a group of feeds from which palatability components were removed, and a group of feeds for eel cultivation. The test period was 31 days. The water temperature during the test was 30-34 ° C.
  • the screening method of the present invention it is possible to search for new components such as N, N-dimethylglycine that have not been used in eel farming in the past.

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Abstract

本発明は、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、 （ａ）ウナギ由来の味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び （ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法、を提供する。

Description

ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法
　本発明は、広く、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法等に関する。
　ニホンウナギは年々漁獲高が減少傾向にあり、資源枯渇が危惧されており、２０１４年、ついに国際自然保護連合（ＩＵＣＮ）により絶滅危惧種の指定を受けた。長年完全養殖へむけた取り組みが行われているが、幼生時期を海で過ごすその生態については不明な点が多く、食性が不明であったなどの理由で、完全養殖に成功した今も、商業化ベースにのせるには程遠いという現状がある。
　現在、ウナギの仔魚の餌としては、サメの卵を主体とし、大豆ペプチド、オキアミ分解物、及び／又はミネラル等を加えた餌が使われている。将来にわたってサメの卵を用いることは資源の面から考えても現実的ではない等の理由により、その代替物質の探索に関する研究が進められている。一方で、養殖飼料全体に目をむけると、嗜好性も重要な要素の一つと考えられている。嗜好性には物性、形状、サイズ、味など多様な要因を含む。
　魚類は、一般的にＬ－アミノ酸に対して応答することが明らかになっている。味物質として感知している化学物質は、魚種によって異なることがわかっている。例えば、Ｌ－アミノ酸のうちのいずれに対する応答が強いかは魚種によって異なっており、味覚器の魚種間によるアミノ酸応答スペクトルの違いは種間の食性の違いを反映していると考えられている。近年、様々な動物種を対象とした味覚受容体の研究により、味覚受容体と食性には深い関係があることが示唆されている。
　脊椎動物において、甘味・旨味物質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であるＴ１Ｒファミリーの分子で、苦味物質はＴ２Ｒファミリーの分子で受容されることがわかっている。Ｔ１ＲファミリーはＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の３つの分子種からなり、哺乳類ではＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体でＬ－アミノ酸等の旨味物質を、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３のヘテロ二量体で糖及び人工甘味料等の甘味物質を受容する。一部の味細胞ではＴ１Ｒ３のみが発現し、高濃度の糖を受容することが知られている。一方、魚類ではＴ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３もＬ－アミノ酸の受容体として機能していることが明らかになってきている（Ｏｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　２００７）。また、特開２００６－２０４２１４号公報には、メダカのＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３に相当すると思われる配列が開示されており、これらがアミノ酸の嗜好に関わることも記載されている。
　味覚受容体と食性には深い関係があるものの、両者の関係は複雑である。上述のとおり、哺乳類では、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３が甘味受容体として機能するが、鳥類など一部の動物ではＴ１Ｒ２がないものの、甘味を知覚できないという推測はできず、花の蜜（甘味）を受容するハチドリではＴ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３で甘味を受容することが明らかになっている（Ｂａｌｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２０１４）。
特開２００６－２０４２１４号公報
Ｏｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　２００７ Ｂａｌｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２０１４
　上記事情に鑑みて、本発明は、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングするための新規方法、及びスクリーニングされた該嗜好性成分を含むウナギのための飼料を提供することを目的とする。
　本発明者らは、味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体が、ウナギのための嗜好性成分の刺激に対して応答することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ウナギ由来の味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法。
［２］ヘテロ二量体がＧタンパク質αサブユニットと共役している、［１］に記載の方法。
［３］Ｇタンパク質αサブユニットが、Ｇα１５又はＧα１６単独であるか、あるいはＧα１５又はＧα１６のＣ末端５残基、２５残基又は４４残基が、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓのファミリーに属するメンバーの対応するＣ末端残基で置換されているキメラタンパク質である、［２］に記載の方法。
［４］Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、（ａ１）～（ａ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法：
（ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
［５］Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、ＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３及びＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４から成る群から選択される、
［４］に記載の方法。
［６］Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーが（ｂ１）～（ｂ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法：
（ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
［７］Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーがＡｊＴ１Ｒ３である、［６］に記載の方法。
［８］活性がカルシウム感受性の発光タンパク質を用いて測定される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］発光タンパク質がイクオリンである、［８］に記載の方法。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載の方法を用いてスクリーニングされた嗜好性成分を含む、ウナギのための飼料。
［１１］嗜好性成分としてクレアチニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン及びサルコシンのうちの１つ以上を含む、ウナギのための飼料。
［１２］ウナギがニホンウナギ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）又はヨーロッパウナギ（Ａ．ａｎｇｕｉｌｌａ）、インドネシアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、又はニューギニアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｐａｃｉｆｉｃａ）である、［１１］に記載の飼料。
［１３］仔魚用、稚魚用、未成魚用又は成魚用である、［１０］～［１２］のいずれかに記載の飼料。
　本発明によれば、ウナギの味覚受容体に直接作用する物質を嗜好性成分としてスクリーニングできるため、サメの卵などの従来の成分に代わる、これまでウナギの養殖において使用されていなかった新たな成分の探索が可能になる。
図１は、ニホンウナギＴ１Ｒのアラインメントを示す。 図２は、ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３及び各ＡｊＴ１Ｒ２ｂ＋ＡｊＴ１Ｒ３でのＧタンパク質の評価を示す。 図３は、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３のサルコシン、クレアチニン及びＮ，Ｎ－ジメチルグリシンに対する濃度依存性の評価を示す。
（嗜好性成分のスクリーニング方法）
　第一の実施形態において、本発明は、ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、
（ａ）味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法を提供する。
　本明細書で使用する場合、「ウナギのための嗜好性成分」とは、その候補物質などのリガンドを含まないネガティブコントロール、例えば、バッファーとの比較でウナギの味覚受容体に有意に作用する物質、あるいは、ウナギが好む味物質又はウナギの摂食を促進するような成分を意味する。なお、ウナギが好む味物質又はウナギの摂食を促進するような成分として、Ｌ－アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、グリシン、プロリン、リジン、セリン、ヒスチジン及びベタイン等が知られている。このような既知の嗜好性成分をスクリーニングの指標として使用することもできる。
　本明細書で使用する場合、「ウナギ」とは、広くウナギ目魚類、特にウナギ属の魚類（Ａｎｇｕｉｌｌａ）のうち、味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体を有するものを意味する。本発明の効果を奏する限り、Ｔ１Ｒ２ファミリーに代えて、その他のＴ１Ｒファミリーを使用してもよい。生息地毎に分類すると、例えば、主要なウナギはニホンウナギ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａ．ａｎｇｕｉｌｌａ）、アメリカウナギ（Ａ．ｒｏｓｔｏｒａｔａ）、オオウナギ（Ａ．ｍａｒｍｏｒａｔａ）の４つに大別される。その他のウナギとしては、ニューギニアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｐａｃｉｆｉｃａ）、インドネシアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、モザンビークウナギ（Ａ．ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）、オーストラリアウナギ（Ａ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、オーストラリア淡水ウナギ（Ａ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ　ｓｃｈｍｉｄｔｉｉ）、オーストラリアヒレナガウナギ（Ａ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、セレベスウナギ（Ａ．ｃｅｌｅｂｅｓｅｎｓｉｓ）、ポリネシアヒレナガウナギ（Ａ．ｍｅｇａｓｔｏｍａ）、太平洋短鰭ウナギ（Ａ．ｏｂｓｃｕｒａ）、ニューギニア高山ウナギ（Ａ．ｉｎｔｅｒｉｏｒｉｓ）、インドマダラウナギ（Ａ．ｎｅｂｕｌｏｓａ）、ニュージーランドオオウナギ（Ａ．ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈｉｉ）、ルソンウナギ（Ａ．ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベンガルウナギ（Ａ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ　ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、アフリカウナギ（Ａ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ　ｌａｂｉａｔａ）、大陸淡水ウナギ（Ａ．ｂｒｅｖｉｃｅｐｓ）、大陸ウナギ（Ａ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、インドネシアヒレナガウナギ（Ａ．ｍａｌｇｕｍｏｒａ）なども挙げられる。食用としてはニホンウナギとヨーロッパウナギの二種が主である。
　ウナギには上記以外のウナギ目魚類、アナゴ、ウツボ、ハモなどが含まれ、例えば、マアナゴ（Ｃｏｎｇｅｒ　．ｍｙｒｉａｓｔｅｒ）、クロアナゴ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ゴテンアナゴ（Ａｒｉｏｓｏｍａ　ｍｅｅｋｉ）、ギンアナゴ（Ｇｎａｔｈｏｐｈｉｓ　ｎｙｓｔｒｏｍｉ　　ｎｙｓｔｏｒｏｍｉ）、イラコアナゴ（Ｓｙｎａｐｈｏｂｒａｎｃｈｕｓ　ｋａｕｐｉｉ）、ウツボ（Ｇｙｍｎｏｔｈｏｒａｘ　ｋｉｄａｋｏ）、ハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、及びスズハモ（Ｍｕｒａｅｎｅｓｏｘ　ｂａｇｉｏ）も本発明のウナギに含まれ得る。
　上記ウナギのうち、ニホンウナギは、外洋で孵化し、プレレプトセファルスという孵化仔魚を経て、レプトセファルス又は仔魚と呼ばれる透明な浮遊幼生となり、稚魚（シラスウナギ、クロコ）を経由して成魚となる。スクリーニングされた嗜好性成分を摂食すると予想されるウナギは、Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのメンバーとを発現している限りいずれの生育段階のものでもよく、また、人工孵化させたもの、天然のもののいずれでもよい。
味覚受容体タンパク質
　味覚に対する受容体は、７回膜貫通型タンパク質と称される膜タンパク質であり、Ｇタンパク質と連結することから、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる。味覚受容体タンパク質はその構造から、大きな細胞外領域を持つものと、この領域を持たないものとの二種類に大別され、前者はＴ１Ｒファミリー（Ｔａｓｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ－１）、後者はＴ２Ｒファミリー（Ｔａｓｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ－２）と称される。Ｔ１Ｒファミリーには、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、及びＴ１Ｒ３の３つの分子種からなる。
　ウナギのＴ１Ｒについて、本発明者らは、５種類のＴ１Ｒ２の全長配列と、１種類のＴ１Ｒ３の全長配列を取得し、それぞれをＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４、ＡｊＴ１Ｒ３と命名した。これらのＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４、ＡｊＴ１Ｒ３は、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２の塩基配列を有する。得られた全長アミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。
　上記６つの配列は、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の配列が既知の魚類の各配列と比較すると、Ｔ１Ｒ２では４４．２～５２．０％、Ｔ１Ｒ３では５１．５～５３．７％の相同性を有した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 他の魚類Ｔ１Ｒとの相同性
　また、ニホンウナギＴ１Ｒ間における相同性はＴ１Ｒ２同士では７６．９～９１．３％、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３では３０．０～３１．２％であった（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 ニホンウナギＴ１Ｒ間における相同性
　得られた全長配列をもとに分子系統樹を作成した結果、いずれも哺乳類のＴ１Ｒクラスターではなく、魚類Ｔ１Ｒのクラスターに含まれることが明らかになった（結果は示さず）。
　哺乳類ではＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３ファミリーはそれぞれ１つのメンバーが見つかっており、Ｔ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３で旨味物質を、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３で甘味物質を受容する。一方、これまで味覚受容体について報告のあるメダカ及びトラフグ等の魚類ではＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３ファミリーは１つのメンバー、Ｔ１Ｒ２ファミリーは複数のメンバーが存在し、Ｔ１Ｒ１＋Ｔ１Ｒ３に加え、Ｔ１Ｒ２＋Ｔ１Ｒ３でも旨味物質を受容する例が知られている。ウナギにおいても、他の魚類同様、遺伝子重複が起こることによって、Ｔ１Ｒ２が多様化している可能性が考えられた。なお、今回探索するにあたって対象としたゲノムデータベースのドラフトゲノムは、不完全な配列を含むうえ、全てのゲノム配列をカバーしているわけではないため、今回見出された配列以外にも受容体候補となる遺伝子配列が存在する可能性は十分にあると考えられる。
　本発明において嗜好性成分の候補物質と接触される味覚受容体は、ＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４等のＴ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーと、ＡｊＴ１Ｒ３等のＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体である。
　ＡｊＴ１Ｒ２ａとＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－プロリン、Ｌ－アラニンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、サルコシン、クレアチニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンにも応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギンに応答する。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４とＡｊＴ１Ｒ３の組み合わせは、Ｌ－アラニン、グリシン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリンに応答する。
　Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーは、以下の（ａ１）～（ａ６）から成る群から選択され得る：
（ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
　Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーは、以下の（ｂ１）～（ｂ６）から成る群から選択され得る：
（ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
（ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
（ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
　アミノ酸配列は、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分又はスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に応答するものであれば、配列番号１、３、５、７、９又は１１のような野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において、１から複数個、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、上記一単位あたり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分、及びスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に対する応答を維持する限度で、野生型におけるアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様が挙げられる。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　また、上記アミノ酸配列において、「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、配列番号１、３、５、７、９又は１１のような野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　使用する塩基配列は、宿主生物に導入された際に、塩基配列の転写後にスプライシングを経由して所望の配列を生成するものでも、転写後にスプライシングを経由せずに所望の配列を生成するものでもよい。
　使用する塩基配列は、野生型の配列と完全に同一でなくともよく、Ｌ－アミノ酸等の既知の嗜好性成分、又はスクリーニングにより同定された嗜好性成分の刺激に対する応答を維持する限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
　本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２のような野生型遺伝子の塩基配列の一部に相当するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
　本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。
　例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
　一部の態様において、ストリンジェントな条件の具体例としては以下のものを含む。例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡ、及び０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製及びハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７などに記載されている方法に準じて実施することができる。
　なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度及び温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数５００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から複数個、例えば、１から１２５個、１から１００個、１から７５個、１から５０個、１から３０個、１から２０個、好ましくは１から数個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。
　ストリンジェントな条件の中でも、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、つまり、高ストリンジェントな条件が好ましい。高ストリンジェントな条件としては、同一性が高い核酸同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。
　ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ効果を有すると考えられる。
　また、タンパク質をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含んでもよい。塩基配列は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
　塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子又は野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列又はアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
　２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば、上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
　上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づく。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
Ｇタンパク質
　Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３から成るヘテロ二量体は、味覚受容体細胞に特異的に発現しているヘテロ三量体のＧタンパク質と共役するため、スクリーニングの際には細胞内でヘテロ二量体とＧタンパク質とを共発現させてもよい。このようなＧタンパク質として、Ｇｑファミリー、ガストデューシン、トランスデューシン等が知られている。
　Ｇタンパク質は、Ｇα（αサブユニット）及びＧβγサブユニットからなる。嗜好性成分をスクリーニングするとき、これらのうち少なくともＧαサブユニットが発現していればよい。また、ＧαサブユニットとともにＧβγサブユニットが発現してもよい。Ｇαサブユニットには、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓ、Ｇ１２／１３のグループが含まれることが知られている。中でも、Ｇα１５又はＧα１６単独、あるいは、それらのＣ末端５残基、２５残基又は４４残基が、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓのファミリーに属するメンバーの対応するＣ末端残基で置換されているキメラタンパク質が好適に使用され得る。このようなＣ末端残基の置換は、当業者に公知である（例えば、Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ　Ａｐｒｉｌ　２，　２００２．　９９　（７）　４６９２－４６９等を参照のこと）。このようにＣ末端残基を置換することで受容体とカップリングしやすくなると考えられる。
　「対応するＣ末端残基」とは、例えば、Ｇα１５のＣ末端配列５アミノ酸が他のＧαサブユニットに置き換えられる場合、そのＧαサブユニットのＣ末端配列を構成する５アミノ酸を意味する。また、キメラタンパク質の表記に関して、例えば、ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５という表現は、ラットＧα１５（以下、Ｇα１５を「Ｇ１５」と記載する場合があり、ラットＧα１５を「ｒＧ１５」、マウスＧα１５を「ｍＧ１５」、ヒトＧα１６を「ｈＧ１６」などと記載する場合がある。）のＣ末端配列５アミノ酸がラットＧｉ３のＣ末端配列５アミノ酸で置換されていることを意味する。
　Ｇタンパク質の選択にあたり、公知文献、例えば、ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５については、Ｔｗｏ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３　（ｔｈｅ　ｕｍａｍｉ　ｔａｓｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）　Ｔｏｄａ　Ｙ，　Ｎａｋａｇｉｔａ　Ｔ，　Ｈａｙａｋａｗａ　Ｔ，　Ｏｋａｄａ　Ｓ，　Ｎａｒｕｋａｗａ　Ｍ，　Ｉｍａｉ　Ｈ，　Ｉｓｈｉｍａｒｕ　Ｙ，　Ｍｉｓａｋａ　Ｔ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１３　Ｄｅｃ　２７；２８８（５２）：３６８６３－７７．　ｄｏｉ等を、また、ｍＧ１５については、Ｓｅｎｓｏｒｙ　ｂｉｏｌｏｇｙ．　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｗｅｅｔ　ｔａｓｔｅ　ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄｓ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｕｍａｍｉ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．　Ｂａｌｄｗｉｎ　ＭＷ，　Ｔｏｄａ　Ｙ，　Ｎａｋａｇｉｔａ　Ｔ，　Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ　ＭＪ，　Ｋｌａｓｉｎｇ　ＫＣ，　Ｍｉｓａｋａ　Ｔ，　Ｅｄｗａｒｄｓ　ＳＶ，　Ｌｉｂｅｒｌｅｓ　ＳＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２０１４　Ａｕｇ　２２；３４５（６１９９）：９２９－３３．　ｄｏｉ：　１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５５０９７等を参照することができる。
　主要なＧタンパク質のＡＣＳＥＳＳＩＯＮ番号（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を以下に示す。
マウス　Ｇ１５：ＮＭ＿０１０３０４
ラット　Ｇ１５：ＮＭ＿０５３５４２
ヒト　Ｇ１６：ＮＭ＿００２０６８
ヒト　Ｇｇｕｓｔ：ＮＭ＿００１１０２３８６
ラット　Ｇｇｕｓｔ：ＮＭ＿１７３１３９
ラット　Ｇｉ２：ＮＭ＿０３１０３５
ラット　Ｇｉ３：ＮＭ＿０１３１０６
ラット　Ｇｓ：ＮＭ＿０１９１３２
　実施例で使用したキメラタンパク質の配列情報について以下に記載する。
アミノ酸配列：
ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５（配列番号１３）；
ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５（配列番号１５）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５（配列番号１７）；
ｍＧ１５（配列番号１９）；
ｒＧ１５（配列番号２１）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－５（配列番号２３）；
ｈＧ１６（配列番号２５）；
ｈＧ１６－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号２７）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ２－４４（配列番号２９）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－２５（配列番号３１）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－４４（配列番号３３）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号３５）
塩基配列：
ｒＧ１５－ｒＧｉ３－５（配列番号１４）；
ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５（配列番号１６）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５（配列番号１８）；
ｍＧ１５（配列番号２０）；
ｒＧ１５（配列番号２２）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－５（配列番号２４）；
ｈＧ１６（配列番号２６）；
ｈＧ１６－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号２８）；
ｈＧ１６－ｒＧｉ２－４４（配列番号３０）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－２５（配列番号３２）；
ｈＧ１６－ｒＧｓ－４４（配列番号３４）；
ｒＧ１５－ｒＧｇｕｓｔ－２５（配列番号３６）
　スクリーニングで使用するタンパク質は、各塩基配列を単独で、又は共に任意の組み合わせで作用可能に連結して、所望の細胞内で発現させることにより調製することができる。各配列は、同一の又は異なるベクター内に挿入することができる。
　ヘテロ二量体をコードする塩基配列は、適当な宿主、例えば、ヒト等の哺乳動物、カエル等の両生類のような動物細胞、昆虫細胞又は酵母で発現される。好ましくは、宿主は昆虫又は哺乳動物などの細胞である。より好ましくは、哺乳動物細胞はヒト細胞である。哺乳動物細胞の例は、Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などがある。
　宿主細胞へのヘテロ二量体をコードする塩基配列の導入は、公知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．，　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ”，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　（１９８９）等に記載されている技術を用いて行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法は、以下の工程に加え、スクリーニングに使用される任意の工程を含み得る。
（ａ）味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程
　ヘテロ二量体の活性増大、例えば、細胞におけるカルシウムイオン濃度の増大は、カルシウムイオン測定試薬などを用いて測定することができる。そのような試薬として、例えば、カルシウム感受性の発光タンパク質、具体的にはカルシウムイオンの濃度に応じて発光するイクオリンなどのタンパク質が好ましい。試薬の代わりに、受容体の活性化を、画像を基に観察し、得られた画像から応答細胞数を計数し、応答度合を判断するカルシウムイメージングを使用することもできる。そのような活性化を測定する機器として、ＣＣＤカメラＣｏｏｌＳＮＡＰ　ＨＱ２（日本ローパー）、倒立顕微鏡ＩＸ－８１（ＯＬＹＭＰＵＳ）が、そして、イメージングのためのソフトウェアとして、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ，ＭｅｔａＦｌｏｕｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）などがある。
　他にも、マルチウェルプレート上の細胞応答を数値として取得するウェルベースアッセイを使用してもよい。このようなウェルベースアッセイにはＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）などを使用することができる。
　Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３のようなＧＰＣＲは、リガンド、つまり嗜好性成分と結合すると構造変化（活性化）を起こし、ガストデューシンのようなＧタンパク質を呼び寄せ、細胞内カルシウムの上昇以外にも、さまざまな下流のシグナルを誘導する（例えば、サイクリックＡＭＰ濃度の変動低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏへのＧＴＰ結合など）。これらの細胞内イベントを検出することにより、ヘテロ二量体の活性を測定することもできる。
　嗜好性成分と評価する工程においては、コントロールとして、候補物質などのリガンドを含まないサンプル、例えば、バッファーが使用され得る。そのようなコントロールとの比較で活性が同程度又はそれ以上の候補物質を嗜好性成分と評価され得る。バッファーなどのネガティブコントロールの代わりに、Ｌ－アミノ酸、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－リジン、Ｌ－セリン、Ｌ－ヒスチジン等の既知の嗜好性成分を使用してもよい。
（ウナギのための飼料）
　第二の実施形態において、本発明は、上記方法を用いてスクリーニングされた嗜好性成分を含む、ウナギのための飼料を提供する。
　飼料は、仔魚用、稚魚用、成魚用のいずれでもよい。ウナギの仔魚は、水温２３℃で孵化後７日目頃には消化酵素の分泌が活発になるため、このような段階であれば、本発明の飼料は有用であると考えられる。
　本発明によりスクリーニングされる嗜好性成分としては、サルコシン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシン又はクレアチニン、あるいはそれらの類似体などがある。
　嗜好性成分として、サルコシン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルグリシン又はクレアチニンの一つ又は二つを以上含んでもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　サルコシンは、ズワイガニ脚肉エキスの成分の１つで（河合、２０１１）、フグが応答するという報告がある（Ｋｉｙｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５）。またクレアチニンは、主に魚類以上の高等動物の筋肉中に含まれ、サバ科魚類に含まれるグアニジノ化合物として含まれるとの報告がある。クレアチニンについては、ヒトにおいて強い肉質様の呈味を付与する、だし風味を向上する効果があるという報告があるものの、魚類における味覚応答を検討した報告はなく、本発明者らが新たに見出した呈味成分である可能性が高い。
　嗜好性成分の配合量は給餌されるウナギの種類やその生育状態、給餌回数等を考慮して当業者が適宜決定することができる。例えば、ニホンウナギの成魚にＮ，Ｎ‐ジメチルグリシンを１日１回与える場合、飼料におけるその配合量は、例えば、３質量％以上が好ましい。
　ウナギの餌としては、従来使用されている、イワシなどの生餌、又はイワシ、サバ、ニシン若しくはアジ等の青魚を乾燥させた魚粉、サメ卵粉末などをベースとする、魚由来の成分を主とする配合飼料などを用いてもよい。飼料に添加する嗜好性成分の効果を損なわない限度で、従来の餌に使用されている魚由来の成分に加え、大豆ペプチド、オキアミ分解物、デンプン、リン酸カルシウム、食塩等のミネラル、酵母、薬草エキス等の成分を飼料に配合してもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（味覚受容体発現細胞を用いた評価系の構築）
　各ＡｊＴ１Ｒ２をＡｊＴ１Ｒ３と共発現させ、ウェルベースアッセイによる発光検出系を用いて、アミノ酸に対する応答の有無を調べた。発光タンパク質としてはイクオリンを使用した。
　キメラＧタンパク質は、公知であるｒＧ１５－ｒＧｉ３－５、ｒＧ１５－ｒＧｉ２－５、ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５を用いた。以下の手順に従い、各キメラＧタンパク質との組み合わせで各受容体が１５種類のアミノ酸に対してどのように応答するかを調べた。
１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２穴プレートへ播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
２）１）の細胞に対し、各ＡｊＴ１Ｒ２、ＡｊＴ１Ｒ３、キメラＧタンパク質、アポイクオリンを発現するそれぞれのプラスミド（ｐＥＡＫ１０ベクター（Ｅｄｇｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　ＭＤ）を使用。ＡｓｃＩとＮｏｔＩの制限酵素サイトに各配列を挿入した）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてトランスフェクションした。
３）６～７時間後に培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
４）翌日、測定用９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，　ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）　Ｓｕｒｆａｃｅ）へ細胞を播き直し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。
５）アッセイ当日、細胞をアッセイバッファーにて洗浄後、１０μＭ　ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅを含むアッセイバッファー（０．１％　ＢＳＡを含む）中で、２７℃で４時間静置した（遮光下）。
６）リガンド添加時の発光強度の変化をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）で検出した。
（結果と考察）
　事前の検討として、ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３におけるＬ－アラニンに対する濃度依存性を評価した。その結果、いずれもＥＣ50値は１ｍＭ前後と算出されたが、応答強度に違いが見られた。ある程度高い応答を示したＧタンパク質のうち、いくつかの結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３及び各ＡｊＴ１Ｒ２ｂ＋ＡｊＴ１Ｒ３について、１５種類のアミノ酸のうち、特定のアミノ酸に対する応答結果を図２に示す。図２においては、リガンド投与時の発光強度の変化をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で検出した（平均値、ｎ＝２）。リガンド濃度はいずれも５０ｍＭ。縦軸は発光強度を表す。
　図２に示すように、共発現させるキメラＧタンパク質の種類によって応答の程度に差が見られたが、おおよそいずれのＧタンパク質でも応答プロファイルは似ていた。
　図２に示していない結果も踏まえて考察すると、使用した１５種類のアミノ酸のうち、ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－アラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、グリシン、Ｌ－プロリン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－プロリン、Ｌ－アラニン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－ヒスチジン、Ｌ－セリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４＋ＡｊＴ１Ｒ３はＬ－アラニン、グリシン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリンに応答が見られた。ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３＋ＡｊＴ１Ｒ３は、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニンに応答する傾向が見られたが、全体的に応答が低かった。
　ＡｊＴ１Ｒ２ａ＋ＡｊＴ１Ｒ３及び各ＡｊＴ１Ｒ２ｂ＋ＡｊＴ１Ｒ３におけるＬ－アラニンに対する濃度依存性の評価結果から、応答強度に差はあれ、いずれのキメラＧタンパク質も使用することが可能であることがわかった。また、キメラＧタンパク質に関して、以降の実験では全ての受容体の組み合わせに共通して、ベースラインが低く、ある程度高い応答を示すｈＧ１６－ｒＧｉ３－５を使用することとした。
（サルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、クレアチニンに対する応答評価）
　アッセイの方法は、上述のアミノ酸に対する応答の確認と同様に行った。
　ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３は、サルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、クレアチニンのそれぞれに濃度依存的に応答した。図３にＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３のサルコシン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、及びクレアチニンに対する濃度応答曲線を示す（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，　ｎ＝３）。ｈＧ１６－ｒＧｉ３－５のみの導入した培養細胞ではいずれのリガンドに対しても応答が見られなかったため、これらのリガンドはＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１＋ＡｊＴ１Ｒ３を介して受容されることが明らかになった（結果は示さない）。
　（給餌試験）
　２００Ｌ容水槽にニホンウナギ未成魚を１０尾ずつ収容して各試験区を設けた。給餌は、１日１回とし、毎日給餌を行った。
　ウナギ育成用配合飼料（成鰻用、林兼産業株式会社販売）から、公知の嗜好性成分であるベタイン、グリシン、アラニン、オキアミミールを除いたものを嗜好性成分除去飼料とした。嗜好性成分除去飼料にＮ，Ｎ－ジメチルグリシンを３％添加して得られた飼料（以下、「Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン添加飼料」という）をニホンウナギ未成魚に上記のとおり給餌し、それらの摂餌量、飼料効率等を測定することで、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンの嗜好性を評価した。比較群として、嗜好性成分除去飼料群、ウナギ育成用配合飼料群をおいた。
　試験期間は３１日間とした。試験期間中の水温は、３０～３４℃であった。
　結果を表４に示す（Ａ群：嗜好性成分除去飼料群、Ｂ群：Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン添加飼料群、Ｃ群：ウナギ育成用配合飼料群）。摂餌量は、残餌量をもとに評価し、乾燥重量で示した。
　この結果から、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシンはニホンウナギの摂餌を誘引し、成長促進効果を有することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明のスクリーニング方法によれば、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン等の従来ウナギの養殖において使用されていなかった新たな成分の探索が可能になる。

Claims (13)

  1. 　ウナギのための嗜好性成分をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ウナギ由来の味覚受容体Ｔ１Ｒ２ファミリーのいずれか一つのメンバーとＴ１Ｒ３ファミリーのいずれか一つのメンバーとから成るヘテロ二量体と、嗜好性成分の候補物質とを接触させる工程、及び
    （ｂ）ヘテロ二量体の活性を増大させる候補物質を嗜好性成分と評価する工程、を含む、方法。
  2. 　ヘテロ二量体がＧタンパク質αサブユニットと共役している、請求項１に記載の方法。
  3. 　Ｇタンパク質αサブユニットが、Ｇα１５又はＧα１６単独であるか、あるいはＧα１５又はＧα１６のＣ末端５残基、２５残基又は４４残基が、Ｇｉ、Ｇｑ又はＧｓのファミリーに属するメンバーの対応するＣ末端残基で置換されているキメラタンパク質である、請求項２に記載の方法。
  4. 　Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、（ａ１）～（ａ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ１）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
    （ａ２）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ａ３）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
    （ａ４）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
    （ａ５）配列番号１、３、５、７又は９に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
    （ａ６）配列番号２、４、６、８又は１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
  5. 　Ｔ１Ｒ２ファミリーのメンバーが、ＡｊＴ１Ｒ２ａ、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－１、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－２、ＡｊＴ１Ｒ２ｂ－３及びＡｊＴ１Ｒ２ｂ－４から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 　Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーが（ｂ１）～（ｂ６）から成る群から選ばれるタンパク質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法：
    （ｂ１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
    （ｂ２）配列番号１２に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｂ３）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
    （ｂ４）配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；
    （ｂ５）配列番号１１に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質；あるいは
    （ｂ６）配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であって、Ｌ－アミノ酸に応答するタンパク質。
  7. 　Ｔ１Ｒ３ファミリーのメンバーがＡｊＴ１Ｒ３である、請求項６に記載の方法。
  8. 　活性がカルシウム感受性の発光タンパク質を用いて測定される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　発光タンパク質がイクオリンである、請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の方法を用いてスクリーニングされた嗜好性成分を含む、ウナギのための飼料。
  11. 　嗜好性成分としてクレアチニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン及びサルコシンのうちの１つ以上を含む、ウナギのための飼料。
  12. 　ウナギがニホンウナギ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａ．ａｎｇｕｉｌｌａ）、インドネシアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｂｉｃｏｌｏｒ）、又はニューギニアウナギ（Ａ．ｂｉｃｏｌｏｒ　ｐａｃｉｆｉｃａ）である、請求項１１に記載の飼料。
  13. 　仔魚用、稚魚用、未成魚用又は成魚用である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の飼料。
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