WO2020009430A1 - Si를 이용한 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법 및 이를 이용한 망막 변성 동물 모델 - Google Patents

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retinal degeneration
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김성우
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a retinal degeneration canine animal model using Sodium Iodate (SI) and a retinal degeneration dog animal model using the same.
  • SI Sodium Iodate
  • Retinal degeneration is a disease in which vision is deteriorated due to degeneration of visual cells and eventually blindness, and there is no effective treatment yet.
  • Retinal degeneration in order to apply gene therapy, stem cell therapy, and artificial retina, which are developed for the treatment of diseases such as hereditary retinal degeneration and retinitis pigmentosa (RP) that damage the retina's eye cells and lead to blindness Development of experimental animals with disease is essential.
  • diseases such as hereditary retinal degeneration and retinitis pigmentosa (RP) that damage the retina's eye cells and lead to blindness
  • genetically modified animal models or models for inducing degeneration with drugs have been developed to apply various treatment methods.
  • animal models of drug-induced retinal degeneration once drug degeneration protocols are established, they are less expensive than genetically modified animal models, and shorter periods of degeneration can cause degeneration in large quantities and free the investigator from various regulations. There is an advantage.
  • SI Sodium Iodate
  • AMD age-related Macular Degeneration
  • congenital retinal degeneration and Pigmentosa retinitis.
  • Retinal degeneration was observed by electrophysiological, anatomical, and histopathological changes in rats treated with 10 mg systemic iodine (NaIO 3 ) per body weight and 20 mg body weight per body in rabbits.
  • systemic iodine NaIO 3
  • dogs have similar human and physiological characteristics and similar disease development patterns in humans, in addition to the advantages of being familiar with humans, being easy to handle and training to control and communicate behaviors compared to other animals. Because of this, it is attracting attention as an appropriate animal model. In fact, the number of genetic diseases applicable to human disease research is 224, compared to 65 pigs or 136 cats. In addition, the structure of the eye is anatomically very close to humans compared to other animals, providing many advantages as an animal model.
  • the inventors performed vitrectomy prior to injecting SI into the eye, causing retinal degeneration only in one eye, and inducing an animal model of uniform degeneration throughout the retina, or loss of conical cells of the retina,
  • the present invention has been completed by discovering that only a cell layer comprising both cells and rod cells can produce a selectively lost animal model.
  • the present invention is to solve the problems of the prior art, the object of the present invention is limited to one eye, to provide a method of manufacturing a retinal degeneration dog animal model induced uniform degeneration throughout the retina and a dog animal model using the same will be.
  • SI Sodium Iodate
  • the SI may be a concentration of 18mg / ml to 26mg / ml.
  • the SI may be a dilution of 0.9mg to 1.3mg of SI in 0.05ml injection solution.
  • the SI may be injected into the vitreous cavity of the eye.
  • step b) may be performed at least three days after the step a).
  • the animal model may cause uniform degeneration throughout the retina.
  • the animal model may be degeneration of cone cells of the retina.
  • the animal model may be lost in the cell layer including the cone and rod cells of the retina.
  • genetic retinal degeneration model of the retinal degeneration dog model of the present invention by performing a vitrectomy prior to the injection of SI, causing uniform degeneration of the entire retina compared to the case without performing vitrectomy, genetic retinal degeneration model such as retinal pigment degeneration It is suitable for the production of, and can selectively lose the cone cell, or the cell layer containing the cone and rod cells.
  • animal model of the dog produced by the manufacturing method of the present invention can be advantageously used for the development of artificial retina, stem cell treatment research, etc. by inserting artificial retinal device because the structure of the eye is anatomically close to human and the volume is large. Can be.
  • 1 is a wide-field fundus image and autofluorescence image of a rabbit eye according to the presence of vitrectomy and SI concentration.
  • FIG. 2 is a near infrared (IR) photograph, light interference tomography (OCT) photograph and H & E tissue staining photograph 1 month after SI injection into rabbit eye.
  • IR near infrared
  • OCT light interference tomography
  • Figure 3 shows the wide-field fundus image, autofluorescence image, near-infrared image, light interference tomography (OCT) and EGR test results of rabbit eye when SI 0.4mg / 0.05ml was injected after vitrectomy.
  • FIG. 5 shows optical coherence tomography (OCT), near-infrared (IR) fundus photographs after 2 weeks of intraocular vitreous injection of 0.05 mg (0.8 mg) intraocularly after 2 weeks of vitrectomy with a drug of 16 mg / ml into the dog eye. Retinal potential.
  • OCT optical coherence tomography
  • IR near-infrared
  • FIG. 6 shows optical coherence tomography (OCT) and near-infrared light at 2 weeks, 4 weeks, and 12 weeks after intravitreal intravitreal injection of 0.05 ml (1.0 mg) of intravenous intravitreal injection of 20 mg / ml of the drug into the dog eye.
  • OCT optical coherence tomography
  • IR fundus photograph and retinal potential.
  • FIG. 7 shows optical coherence tomography (OCT), near-infrared radiation at 2 weeks, 7 weeks, and 12 weeks after intravitreal intravitreal injection of 0.05 ml (12.0 mg) of intravenous intravitreal injection of 24 mg / ml of the drug in the dog eye.
  • OCT optical coherence tomography
  • IR fundus photograph and retinal potential.
  • FIG. 8 shows H & E staining of retinal tissues in dogs comparing dogs with 0.05 mg (12.0 mg) intravitreal intravitreal injection 2 weeks after vitrectomy with 20 mg / ml drug. to be.
  • FIG. 9A is a schematic diagram showing a subretinal injection method of SI
  • FIG. 9B is a schematic diagram showing an intravitral injection method.
  • the present invention finds that when SI is injected without vitrectomy, no degeneration or irregularity occurs in the entire retina, whereas vitrectomy prior to injection of SI can cause uniform degeneration throughout the retina. It is completed.
  • SI Sodium Iodate
  • PSV Pars Plana Vitrectomy
  • a vitrectomy a surgical procedure consisting of mechanically removing vitreous tissue by mechanically cutting and aspirating vitreous fluid through a surgical device called a vitrectomy. Vitrectomy can be classified according to the thickness of the vitrectomy needle. Currently, there are 27, 25, 23, and 20 gauge types of vitrectomy needles, and 23G vitrectomy 25 G vitrectomy is most commonly used.
  • Vitrectomy in the canine animal model production method of the present invention is performed after the scleral incision (trocar insertion), insertion of infusion cannula, control of the perfusion pressure using a balanced salt solution, PVD (Posterior vitreous detachment) Vitreous detachment) induction, retinal torsion treatment steps, and some steps may be omitted as needed.
  • SI is preferably injected at a concentration of 18 mg / ml to 26 mg / ml, more preferably at a concentration of 20 mg / ml. Injecting SI at less than 18 mg / ml does not cause retinal degeneration, and injecting more than 26 mg / ml is highly toxic and causes problems such as loss of the cell layer and atrophy of the entire retina. It is not preferred because it is difficult to use as an animal model. In addition, since the volume of the eyeball of the dog is constant about 4 ⁇ 6ml, it is preferable to dilute and inject the SI of 0.9mg to 1.3mg in 0.05ml injection solution.
  • SI can be injected into the vitreous cavity of the eye.
  • This can solve problems such as binocular blindness, drug toxicity, etc. that occur when systemic injection, such as intraperitoneal administration, and since SI is injected directly into the eye, there is an advantage that can cause retinal degeneration only in one eye.
  • FIGS. 9A and 9B unlike injection into the subretinal eye where only localized degeneration is induced, uniform retinal degeneration throughout the eye when injected intravitreal It is possible.
  • the injected drug will leak out of the needle that pierced the retina, and no further injection is possible.
  • the SI injection of step b) may be carried out at least 3 days after the vitrectomy of step a), preferably after 4 to 10 days, more preferably after 5 to 9 days, more preferably Preferably 6 to 8 days later. If SI is injected 3 days before vitrectomy, the recovery period after vitreous injury may be too short, so the SI may not be uniformly injected. If SI is injected for more than 10 days from vitrectomy, the animal model It takes a long time to manufacture, which is undesirable in terms of efficiency.
  • the dog's eye structure is anatomically close to the human, and the volume is easy to insert the artificial retina device, the dog animal model manufactured through the development of the artificial retina stem It may be advantageously used for cell therapy research.
  • the retinal degeneration dog animal model prepared by the production method of the present invention may cause uniform degeneration of the entire retina, degeneration of the retinal cone cells, or loss of the cell layer including the retinal cone and rod cells. .
  • the retinal degeneration animal model of the present invention can be used in experiments when the pattern of retinal degeneration after SI injection is confirmed by an optical fundus camera or an OCT to meet the purpose of the study.
  • the rabbits were anesthetized with alfaxalone (5 mg / kg; Alfaxan®, Vetoquinol, West Wales, UK) and xylazine (4 mg / kg; Rompun®, Bayer Corp., Shawnee Mission, KA, USA). Two drugs were injected intramuscularly 1 cc each. In case of lack of anesthesia, an additional 0.5cc was injected intramuscularly.
  • the pupil of the rabbit was expanded with 0.5% tropicamide and phenylephrine HCl 2.5% eye drops (Mydrin-P®) and treated with proparacine HCl 0.5% (Alcaine®) topical eye drops.
  • Dilute sodium iodate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with a molecular weight of 191.89 g / mol to an amount of SI of 0.05 mg, 0.1 mg, 0.3 mg, and 0.5 mg per 0.05 ml of phosphate buffered saline (PBS), respectively.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 1 After one week from the vitrectomy of Example 1, the prepared drugs were injected at about 4 mm from the rabbit corneal limbus using a 30 gauge needle.
  • Experimental Example 1 (0.05mg / 0.05ml), Experimental Example 2 (0.1mg / 0.05ml), Experimental Example 3 (0.3mg / 0.05ml), Experimental Example 4 (0.5mg / 0.05ml) according to the concentration of the injected SI
  • Comparative Example 1 a group injected with SI 0.5mg / 0.05ml without vitrectomy was performed as Comparative Example 2, and a group in which only vitrectomy was performed.
  • FIG. 1 One month after the SI scan, the pattern of retinal degeneration was shown in FIG. 1 by wide-field fundus imaging and autofluorescence fundus imaging. Autofluorescence coherence tomography (OCT), near-infrared (IR), and H & E tissue staining images are shown in FIG. 2. .
  • OCT Autofluorescence coherence tomography
  • IR near-infrared
  • H & E tissue staining images are shown in FIG. 2. .
  • FIG. 1 the left two rows are photographs before the injection and the right two columns are photographs one month after the injection.
  • a ⁇ d is a group injected with 0.5 mg / 0.05 ml of SI without vitrectomy (Comparative Example 1).
  • a very long paving stone shaped white lesion on the fundus photograph shows a visual streak of the fundus. It was confirmed as the center.
  • In the autofluorescence very increased autofluorescence lesions in the shape of paving stones were observed.
  • e ⁇ h is a group performed only vitrectomy (Comparative Example 2), it can be confirmed that there is no change.
  • i to l are the group injected with SI 0.05mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 1). No significant change was observed in both fundus and autofluorescence.
  • m ⁇ p was a group injected with SI 0.1mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 2), no significant change was observed in both fundus and autofluorescence.
  • u ⁇ x is a group injected with SI 0.5mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 4). After surgery, a bright band was observed along the visual streak area in the fundus photograph. Long, increased autofluorescence lesions were observed.
  • Figure 2 shows a near-infrared (IR) picture, light interference tomography (OCT) picture, and H & E tissue staining picture in order from the left.
  • IR near-infrared
  • OCT light interference tomography
  • a, b is a group injected with 0.5 mg / 0.05 ml of SI without vitrectomy (Comparative Example 1).
  • IR near infrared
  • OCT images of the paving stone showed that the increased reflectors were deposited between the inner and outer layers of the retina, and the surrounding tissues also severely contracted.
  • c and d were the only vitrectomy group (Comparative Example 2). All of the IR, OCT and histological findings were normal.
  • e, f is the group injected with SI 0.05mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 1). All of the IR, OCT and tissue findings were normal.
  • g and h are the group injected with SI 0.1mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 2). All of the IR, OCT and histological findings were normal.
  • i and j are the group injected with SI 0.3mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 3). All of the IR, OCT and histological findings were normal.
  • k, l is the group injected with SI 0.5mg / 0.05ml after vitrectomy (Experimental Example 4).
  • IR near-infrared
  • the lesion showed a long elongated reflex in the visual streak area.
  • the entire retinal layer was observed to be atrophy.
  • the biopsy also revealed severe shrinkage of the entire layer.
  • m is a diagram of the pattern of living and dead cells according to the concentration of SI.
  • the group injected with 0.05 mg / 0.05 ml showed a similar pattern to the group not injected with SI, indicating that no retinal degeneration was induced.
  • the group injected with 0.5 mg / 0.05 ml most of the cells were lost. Can be.
  • the first type (left) is a lesion of a long elongated reflex finding observed in the e fundus photograph and the f visual streak region, and in the OCT photograph of the region, the outer cell layer is lost only in the visual streak region.
  • the normal retinal structure was observed in the remaining areas.
  • the rod reaction a dark adaptation reaction
  • conical cells of the retina were lost through the loss of the light reaction in the positive adaptation reaction. This appears to be due to the loss of cones in the retina because they are fewer than the rods.
  • an ERG test showed a lesion with long elongated reflexes in the i fundus and j visual streak areas. While lost, the rest of the site was observed to maintain normal retinal structure. In particular, it was confirmed that the cell outer layer was lost in the entire retina through the loss of both the rod reaction and the light response in the dark adaptation reaction in the h ERG test.
  • Two rabbits were prepared and injected with a 30-gauge needle at concentrations of 0.3 mg / 0.05 ml and 0.4 mg / 0.05 ml without vitrectomy at about 4 mm from the rabbit corneal limbus. 4 weeks after SI injection, retinal degeneration was confirmed and shown in FIG. 4.
  • retinal degeneration was induced at both the 0.3 mg / 0.05 ml and 0.4 mg / 0.05 ml concentrations, but the retinal degeneration did not occur uniformly throughout the eye and the portion where normal degeneration was not induced remained. I could confirm it.
  • Example 3-1 and Example 4 suggest that vitrectomy prior to the injection of SI is essential to induce even retinal degeneration in the whole eye.
  • the dogs were anesthetized using halothane (5 mg / kg; Alfaxan®, Vetoquinol, Westshire, UK) and xylazine (4 mg / kg; Rompun®, Bayer Corp., Shawnee Mission, KA, USA).
  • the pupils of the dogs were expanded with 0.5% tropicamide and 2.5% phenylephrine HCl eye drops (Mydrin-P®) and treated with proparacine HCl 0.5% (Alcaine®) topical eye drops.
  • Sodium iodate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) of molecular weight 191.89 g / mol is prepared by diluting the amount of SI to 0.8 mg, 1.0 mg and 1.2 mg per 0.05 ml of phosphate buffered saline (PBS), respectively. .
  • Example 5-1 After one week from the vitrectomy of Example 5-1, the prepared drugs were injected at about 4 mm from the limbal limbus of the dog using a 30 gauge needle.
  • the baseline of the SI drug and the injection of SI at concentrations of 0.8 mg / 0.05 ml, 1.0 mg / 0.05 ml, and 1.2 mg / 0.05 ml, respectively, are shown in FIGS. 5 to 7.
  • the upper photo is a near-infrared fundus photograph and light interference tomography (OCT), and the lower photo shows the retinal potential.
  • OCT near-infrared fundus photograph and light interference tomography
  • the retinal outer layer corresponding to the cell layer was selectively lost in the OCT after injection, and the retinal inner layer was thinner than the SI 1.0mg / 0.05ml injection. See FIG. 7).
  • the light reaction was completely lost in both rod and cone cells in both the dark adaptation reaction and the positive adaptation reaction.
  • the SI was injected after the vitrectomy unlike the control group.
  • the outer cell layer of the outer retina was lost.

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Abstract

본 발명은 a) 개의 안구 내 유리체 절제술을 수행하는 단계; 및 b) 상기 개의 안구 내에 SI(Sodium iodate)을 주입하는 단계; 를 포함하는, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법에 관한 것이다.

Description

SI를 이용한 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법 및 이를 이용한 망막 변성 동물 모델
본 발명은 SI(Sodium Iodate)를 이용한 망막 변성 개(canine) 동물 모델의 제조방법 및 이를 이용한 망막 변성 개 동물 모델에 관한 것이다.
망막 변성은 시세포의 변성으로 시력이 저하되어 결국 실명되는 질환으로, 아직 효과적인 치료법이 없다. 유전성 망막 변성, 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP) 등 망막의 시세포가 손상되어 실명에 이르는 질환들의 치료를 위하여 개발되는 유전자 치료, 줄기세포 치료, 나아가 인공망막 등 여러 치료방법을 적용하기 위해서는 망막 변성 질환을 가진 실험동물의 개발이 필수적이다.
이와 같이 여러 치료방법을 적용하기 위해 유전자 변성 동물 모델이나 약물로 변성을 유발하는 모델 등이 개발되고 있다. 약물로 망막 변성을 유발한 동물 모델의 경우, 일단 약물 변성 프로토콜이 확립되면 유전자 변성 동물 모델보다 가격이 저렴하며, 변성 유발기간이 짧아 대량으로 변성을 유발할 수 있고, 연구자가 각종 규제로부터 자유로울 수 있는 장점이 있다.
현재 망막 변성 동물 모델을 만들기 위해 사용되는 약제 중 하나인 요오드산 나트륨(Sodium Iodate, SI)는 망막독성물질로, 망막색소상피를 일차적으로 손상시키며 이차적으로 망막의 다른 층까지 손상시켜 시력저하를 일으킨다. 이러한 SI의 독성작용이 망막 변성과 유사한 병리생태학적 변성을 보이면서 다양한 질환에 대한 모델유발물질로 사용되었다. 이러한 질환들에는 연령관련 황반변성 (Age-related Macular Degeneration; AMD), 선천성 망막 변성 그리고 망막색소변성증(Pigmentosa retinitis)이 있다.
과거 토끼에게 염화 요오드산 (NaIO 3)을 체중 당 10 mg 전신 투여한 군과 체중 당 20 mg 전신 투여한 군에서의 망막 변성을 전기생리학적, 해부학적, 그리고 조직병리학적 변화를 관찰하여 요오드산염에 의해 망막색소 상피와 광수용체 세포의 변성과 전반적인 망막 퇴축을 일으켜 시력 저하가 나타나는 것을 확인한 연구도 있었다. 그러나, 이는 요오드산 염의 전신 주사를 수행한 것으로, 이 경우 전신적으로 투여된 약물은 두 눈의 시세포에 모두 영향을 미쳐 실험 개체의 양안 실명을 유발 이는 장기간 실험개체를 사육하며 치료효과를 보아야 하는 연구에서 부적절한 어려움이 있다.
한편, 개는 사람과의 친밀도가 높으며, 다루기가 쉽고, 훈련을 통해 행동의 제어 및 의사 소통이 다른 동물에 비해 용이하다는 장점 외에도, 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 인간과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 보이기 때문에 적절한 동물 모델로 각광받고 있다. 실제로, 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교하여 개는 224개로 월등히 많다. 또한, 다른 동물에 비해 눈의 구조가 해부학적으로 인간과 매우 가까워 동물 모델로서 많은 이점을 제공한다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 안구 내로 SI를 주입하기 전 유리체 절제술을 수행함으로써 한쪽 눈에만 망막 변성이 유발되고, 망막 전체에 균일한 변성의 유발된 동물 모델이나, 망막의 원뿔세포만 소실되거나, 원뿔세포와 막대세포 모두를 포함하는 시세포층만이 선택적으로 소실된 동물 모델을 제조할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 한쪽 눈에 국한되며, 망막 전체에 균일한 변성이 유발된 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법 및 이를 이용한 개 동물 모델을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, a) 개의 안구 내 유리체 절제술을 수행하는 단계; 및 b) 유리체 절제술을 수행한 상기 개의 안구 내에 SI(Sodium Iodate)을 주입하는 단계; 를 포함하는, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 SI는 18mg/ml 내지 26mg/ml의 농도일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 SI는 0.05ml의 주사액에 0.9mg 내지 1.3mg 용량의 SI가 희석된 것 일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 SI는 안구의 유리체강 내로 주입될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 단계 b)는, 상기 단계 a)로부터 적어도 3일 이후에 수행되는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 동물 모델은 망막 전체에 균일한 변성이 유발될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 동물 모델은 망막의 원뿔세포가 변성될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 동물 모델은 망막의 원뿔세포와 막대세포를 포함하는 시세포층이 소실될 수 있다.
본 발명의 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법은 SI의 주입 전에 먼저 유리체 절제술을 수행함으로써, 유리체 절제술을 수행하지 않은 경우에 비해 망막 전체에 균일한 변성을 유발하므로 망막 색소 변성증 등의 유전성 망막변성 모델의 제조에 적합하고, 원뿔세포나 원뿔세포와 막대세포를 포함하는 시세포층을 선택적으로 소실시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 개 동물 모델은 눈의 구조가 해부학적으로 인간과 가깝고, 용적이 크기 때문에 인공망막 장치를 삽입하여 인공망막의 개발, 줄기세포 치료 연구 등에 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 유리체 절제술 유무 및 SI 농도에 따른 토끼 안구의 광시야 안저영상 및 자가 형광 영상 사진이다.
도 2는 토끼 안구 내로 SI 주사 1달 후 근적외선(IR) 사진, 빛 간섭 단층촬영(OCT) 사진 및 H&E 조직염색사진이다.
도 3은 유리체 절제술 후 SI 0.4mg/0.05ml를 주사한 경우 토끼 안구의 광시야 안저영상 사진과 자가 형광 영상 사진, 근적외선 사진, 빛 간섭 단층촬영(OCT) 사진 및 EGR 검사 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 유리체 절제술을 수행하지 않고 SI를 안구 내 주사한 토끼 안구의 광시야 안저영상 및 자가 형광 영상 사진이다.
도 5는 개 안구 내로 농도가 16mg/ml의 약물을 유리체 절제술 2주 후 0.05ml (0.8mg)를 안구 유리체강내 주사한 2주 후의 빛간섭 단층촬영(OCT), 근적외선(IR) 안저 촬영 사진 및 망막전위도이다.
도 6은 개 안구 내로 농도가 20mg/ml의 약물을 유리체 절제술 2주 후 0.05ml (1.0mg)를 안구 유리체강내 주사한 2 주, 4주, 12주 후의 빛간섭 단층촬영(OCT), 근적외선(IR) 안저 촬영 사진 및 망막전위도이다.
도 7은 개 안구 내로 농도가 24mg/ml의 약물을 유리체 절제술 2주 후 0.05ml (12.0mg)를 안구 유리체강내 주사한 2 주, 7주, 12주 후의 빛간섭 단층촬영(OCT), 근적외선(IR) 안저 촬영 사진 및 망막전위도이다.
도 8은 개 안구 내로 농도가 20mg/ml의 약물을 유리체 절제술 2주 후 0.05ml (12.0mg)를 안구 유리체강내 주사한 경우와 아무런 처치를 하지 않은 대조군을 비교한 개 안구의 망막 조직 H&E 염색소견이다.
도 9a는 SI의 망막 아래(subretinal) 주사 방식을 나타내는 모식도이고, 도 9b는 유리체강 내(intravitral) 주사 방식을 나타내는 모식도이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 유리체 절제술을 수행하지 않고 SI를 주입하는 경우 망막 전체에 변성이 유발되지 않거나 불규칙적으로 생기는 반면, SI를 주입하기 전 유리체 절제술을 수행하면 망막 전체에 균일한 변성을 유발할 수 있음을 발견하여 완성된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, a) 개의 안구 내 유리체 절제술을 수행하는 단계; 및 b) 유리체 절제술을 수행한 상기 개의 안구 내에 SI(Sodium Iodate)을 주입하는 단계; 를 포함하는, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법이 제공된다.
본 명세서에서 "유리체 절제술(Pars Plana Vitrectomy, PPV)"은 유리체 절제침(vitrector)라 불리우는 외과장치를 통해 유리체 체액을 기계적으로 절단 및 흡입함으로써 유리체 조직을 기계적으로 제거하는 것으로 이루어지는 외과 시술이다. 유리체 절제술은 유리체 절제침의 굵기(gauge)에 따라서 분류될 수 있는데, 현재 사용되고 있는 유리체 절제침의 종류는 27 게이지, 25 게이지, 23 게이지, 20 게이지가 있으며, 23게이지 유리체 절제술(23G vitrectomy)과 25 게이지 유리체 절제술(25G vitrectomy)이 가장 많이 사용된다.
본 발명의 개 동물 모델 제조방법에서 유리체 절제술은 공막 절개(trocar insertion), 주입관 삽입(insertion of infusion cannula), 평형염액(balanced salt solution)을 이용한 관류 압력의 조절, PVD(Posterior vitreous detachment, 후유리체박리) induction, 망막견인막 처치 단계를 포함할 수 있으며, 필요에 따라 일부 단계가 생략될 수 있다.
SI는 18mg/ml 내지 26mg/ml의 농도로 주입되는 것이 바람직하며, 20mg/ml의 농도로 주입되는 것이 보다 바람직하다. SI를 18mg/ml 미만으로 주입하는 경우 망막 변성이 유발되지 않으며, 26mg/ml를 초과하여 주입하는 경우 독성이 커서 망막 전체에서 시세포층이 소실되고 망막 전층이 위축되는 등의 문제가 발생하여 망막 변성 동물 모델로서 사용하기 어려우므로 바람직하지 않다. 또한, 개의 안구의 용적은 4~6ml 정도로 일정하므로, 0.05ml의 주사액에 0.9mg 내지 1.3mg 용량의 SI를 희석하여 주입하는 것이 바람직하다.
한편, SI는 안구의 유리체강 내로 주입될 수 있다. 이를 통해 복강 내 투여 등 전신 주사하는 경우 발생하는 양안 실명, 약물 독성 등의 문제를 해결할 수 있으며, SI를 직접 안구에 주입하므로 한쪽 눈에만 망막 변성을 유발할 수 있는 장점이 있다. 또한, 도 9a 및 도 9b에서 알 수 있는 바와 같이, 국소적 변성만이 유발되는 안구 망막 아래(subretinal)에 주사와 달리, 유리체강 내(intravitreal)로 주사하는 경우 안구 전체에 균일한 망막 변성이 가능하다. 망막 아래로 SI를 주사하는 경우에는, 약물이 충분히 주입되더라도 일정 수준 이상으로 망막이 부풀게 되면 이후에 주입되는 약물은 망막을 찌른 주사바늘 옆으로 새어 나와 더 이상의 주입이 불가능하기 때문이다.
한편, 단계 b)의 SI 주입은 단계 a)의 유리체 절제술 수행으로부터 적어도 3일 이후에 수행될 수 있으며, 바람직하게는 4일 내지 10일 이후, 보다 바람직하게는 5일 내지 9일 이후, 더욱 바람직하게는 6일 내지 8일 이후에 수행될 수 있다. 유리체 절제술 수행으로부터 3일 경과 이전에 SI를 주입하는 경우 유리체 손상 후 회복 기간이 지나치게 짧아 SI가 균일하게 주입되지 않을 수 있고, 유리체 절제술 수행으로부터 10일을 초과하여 SI를 주입하는 경우에는 동물 모델의 제조에 장기간이 소요되어 효율성 측면에서 바람직하지 않다.
본 발명의 개 동물 모델 제조방법에 따르면, 개의 눈 구조가 해부학적으로 인간과 가깝고, 용적이 크기 때문에 인공망막 장치를 삽입하기에 용이하며, 이를 통해 제조된 개 동물 모델은 인공망막의 개발, 줄기세포 치료 연구 등에 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 망막 변성 개 동물 모델은 망막 전체에 균일한 변성이 유발되거나, 망막의 원뿔세포가 변성되거나, 망막의 원뿔세포와 막대세포를 포함하는 시세포층이 소실될 수 있다.
또한, 본 발명의 망막 변성 동물 모델은 SI 주사 이후 나타나는 망막 변성의 패턴을 광학 안저 카메라나 OCT로 확인하여 연구 목적에 부합하는 경우 실험에 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
다음의 실시예는 Ophthalmic and Vision Research를 위한 동물의 사용법에 대하여 규제하고 있는 ARVO 선언의 규제에 따라 실시한 것이다.
실시예 1: 유리체 절제술의 시행
2.5 내지 3.5 kg 범위의 뉴질랜드 흰토끼를 준비한다. A-scan을 이용하여 측정한 토끼의 안구 길이는 평균 15.75 mm (범위: 15.0~16.5 mm)이었다.
준비한 토끼를 alfaxalone (5 mg/kg; Alfaxan®, Vetoquinol, West Sussex, UK) 과 xylazine (4 mg/kg; Rompun®, Bayer Corp., Shawnee Mission, KA, USA)을 이용하여 마취를 시행했다. 두 가지 약을 각각 1cc 근육 주사하였다. 마취가 부족한 경우 0.5cc씩 추가로 근육 주사하였다. 토끼의 동공은 tropicamide 0.5%와 phenylephrine HCl 2.5% eye drops (Mydrin-P®)에 의해 확장되었고, proparacine HCl 0.5% (Alcaine®) 국부 안약 마취제를 처리하였다.
먼저 토끼 안구에 23게이지 크기의 유리체 절제침을 이용하여 토끼 각막 윤부에서 약 4mm 지점에 두개의 트로카를 삽입한 후 트로카 한 곳으로는 평형 염기액을 주입하여 부피를 유지하면서 나머지 하나의 트로카를 이용하여 유리체 절제술을 시행했다. 이 때, 수술현미경의 조명을 이용하고, 수술 시야의 확보를 위해 direct concave lens를 이용하여 안구내 구조물을 확인하면서 수술을 진행하였다.
실시예 2: SI 약물의 준비
분자량 191.89g/mol의 sodium iodate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 phosphate buffered saline (PBS) 0.05 ml 당 SI가 각각 0.05mg, 0.1mg, 0.3mg, 0.5mg의 양이 되도록 희석하여 준비한다.
실시예 3: SI 농도에 따른 망막 변성 패턴의 평가
실시예 3-1
상기 실시예 1의 유리체 절제술로부터 1주일 이후, 준비된 약물들을 30 게이지 바늘을 이용하여 토끼 각막 윤부로부터 약 4mm 지점에 주사하였다. 주입된 SI의 농도에 따라 실험예 1(0.05mg/0.05ml), 실험예 2(0.1mg/0.05ml), 실험예 3(0.3mg/0.05ml), 실험예 4(0.5mg/0.05ml)로 하고, 유리체 절제술 없이 SI 0.5mg/0.05ml를 주사한 군을 비교예 1, 유리체 절제술만 시행한 군을 비교예 2로 하였다.
SI 주사 1달 이후, 망막 변성의 패턴을 광시야 안저 촬영 및 자가 형광 안저 촬영하여 도 1에 나타내고, 자가 형광 빛 간섭 단층촬영(OCT), 근적외선(IR), H&E 조직염색 사진은 도 2에 나타냈다.
도 1에서 좌측 두 열은 주사 전 사진, 우측 두 열은 주사 1달 이후 사진이다. a ~ d는 유리체 절제술 없이 SI 0.5mg/0.05ml를 주사한 군(비교예 1)으로, 수술 후 안저 사진에서 매우 심한 paving stone(보도블록) 모양의 흰색의 기다란 병변이 안저의 visual streak부위를 중심으로 확인되었다. 자가 형광 사진에서도 해당부위에 paving stone(보도블록) 모양의 매우 증가된 자가 형광 병변을 관찰할 수 있었다.
e ~ h는 유리체 절제술만 시행한 군(비교예 2)으로, 변화가 없음을 확인할 수 있다.
i ~ l은 유리체 절제술 후 SI 0.05mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 1)으로, 안저사진과 자가 형광 사진 모두 큰 변화가 관찰되지 않았다.
m ~ p는 유리체 절제술 후 SI 0.1mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 2)으로 안저사진과 자가 형광 사진 모두 큰 변화가 관찰되지 않았다.
q ~ t는 유리체 절제술 후 SI 0.3mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 3)으로 안저사진과 자가 형광 사진 모두 큰 변화가 관찰되지 않았다.
u ~ x는 유리체 절제술 후 SI 0.5mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 4)으로 수술 후 안저 사진에서 visual streak부위를 따라 띠모양으로 밝게 보이는 부위가 관찰되었고, 자가 형광 사진에서 해당부위의 가늘고 길게 증가된 자가 형광 병변이 관찰되었다.
도 2에서는 좌측부터 순서대로 근적외선(IR) 사진, 빛 간섭 단층촬영(OCT) 사진, H&E 조직염색 사진을 나타낸다.
a, b는 유리체 절제술 없이 SI 0.5mg/0.05ml를 주사한 군(비교예 1)으로, 근적외선 (IR) 사진에서 visual streak 부위에 paving stone 모양의 하얀 병변들이 관찰되었다. 해당 paving stone 부위의 OCT 사진에서는 증가된 반사 물질들이 망막의 내층과 외층 사이에 침착 된 것을 확인할 수 있었으며, 그 주변 조직도 전층이 심하게 위축된 것이 관찰되었다.
c, d는 유리체 절제술만 시행한 군(비교예 2)으로 IR 사진, OCT 사진 및 조직 소견 모두 정상으로 나타났다.
e, f는 유리체 절제술 후 SI 0.05mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 1)으로 IR 사진, OCT 사진 및 조직 소견 모두 정상으로 나타났다.
g, h는 유리체 절제술 후 SI 0.1mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 2)으로 IR 사진, OCT 사진 및 조직 소견 모두 정상으로 나타났다.
i, j는 유리체 절제술 후 SI 0.3mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 3)으로 IR 사진, OCT 사진 및 조직 소견 모두 정상으로 나타났다.
k, l은 유리체 절제술 후 SI 0.5mg/0.05ml를 주사한 군(실험예 4)으로 근적외선 (IR) 사진에서 visual streak 부위에 띠처럼 길게 증가된 반사소견의 병변이 나타났고, 해당 부위의 OCT 영상에서 망막 전층이 위축된 것으로 관찰되었다. 조직검사에서도 전층이 심하게 위축된 것이 확인되었다.
m은 SI의 농도에 따른 살아있는 세포와 죽은 세포의 패턴을 도식화한 것이다. 0.05mg/0.05ml를 주사한 군에서는 SI를 주사하지 않은 군과 유사한 패턴을 나타내어 망막 변성이 유발되지 않은 것을 확인할 수 있고, 0.5mg/0.05ml를 주사한 군에서는 대부분의 시세포가 소실된 것을 확인할 수 있다.
이상의 결과를 통해 SI를 너무 많이 투여하는 경우(비교예 1, 실험예 4) 망막 전층이 소실되고, SI를 너무 적게 투여하는 경우(실험예 1 ~ 3) 망막 변성이 유발되지 않아 망막 변성 동물 모델에 적합하지 않다는 것을 알 수 있다.
실시예 3-2
두 마리의 토끼를 준비하고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 유리체 절제술을 시행한 다음 1주일 이후에 0.4mg/0.05ml 농도의 SI를 30 게이지 바늘을 이용하여 토끼 각막 윤부로부터 약 4mm 지점에 주사하고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3을 참고하면, 첫 번째 타입(좌측)은 e 안저 사진과 f visual streak 부위에 띠처럼 긴 증가된 반사소견의 병변이 관찰되고, 해당 부위의 OCT 사진에서는 visual streak 부위에서만 시세포 외층이 소실된 반면 나머지 부위에서는 정상적인 망막 구조가 유지되는 것이 관찰되었다. 특히, h ERG 검사에서 암순응 반응인 rod 반응이 현저히 감소하고, 양순응 반응에서는 빛 반응이 소실된 것을 통해 망막의 원뿔세포가 소실된 경우임을 확인할 수 있다. 이는 망막에서 원뿔세포 수가 막대세포보다 적기 때문에 먼저 소실되기 때문인 것으로 보인다.
두 번째 타입(우측)은 ERG 검사에서 i 안저 사진과 j visual streak 부위에 띠처럼 길게 증가된 반사소견의 병변이 관찰되고, k 해당 부위의 OCT 사진에서는 visual streak 부위뿐만 아니라 망막 전체에서 시세포 외층이 소실된 반면, 나머지 부위는 정상적인 망막 구조가 유지되는 것이 관찰되었다. 특히, h ERG 검사에서 암순응 반응인 rod 반응과 양순응 반응에서 빛 반응이 모두 소실된 것을 통해 망막 전체에서 시세포 외층이 소실된 경우임을 확인할 수 있다.
실시예 4: 유리체 절제술을 수행하지 않는 경우의 망막 변성
두 마리의 토끼를 준비하고, 유리체 절제술 없이 0.3mg/0.05ml, 0.4mg/0.05ml 농도의 SI를 각각 30 게이지 바늘을 이용하여 토끼 각막 윤부로부터 약 4mm 지점에 주사하였다. SI 주입으로부터 4주 후, 망막 변성 발생여부를 확인하여 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 0.3mg/0.05ml, 0.4mg/0.05ml 농도 모두에서 망막 변성이 유발되었으나, 망막 변성이 안구 전체에 균일하게 유발되지 않고 정상으로 변성이 유발되지 않은 부분이 남아 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 실험결과를 통해 SI 주사 전 유리체 절제술을 수행하지 않는 경우에는 불규칙적인 망막 변성이 유발되어, 안구 전체에 균일한 망막 변성을 유발할 수 없는 문제점이 발생하게 된다는 것을 알 수 있다.
결론적으로, 상기 실시예 3-1 및 실시예 4에서 나타난 결과는 안구 전체에 고른 망막 변성이 유발되도록 하기 위해서는 SI를 주사하기 전 유리체 절제술이 필수적임을 시사한다.
실시예 5: 개 동물 모델의 제조
5-1. 유리체 절제술의 시행
25 내지 35 kg 범위의 혼혈종 개를 준비한다. A-scan을 이용하여 측정한 개의 안구 길이는 평균 21.47 mm (범위: 20.82~22.07 mm)이었다.
준비한 개를 halothane (5 mg/kg; Alfaxan®, Vetoquinol, West Sussex, UK) 과 xylazine (4 mg/kg; Rompun®, Bayer Corp., Shawnee Mission, KA, USA)을 이용하여 마취를 시행했다. 개의 동공은 tropicamide 0.5%와 phenylephrine HCl 2.5% eye drops (Mydrin-P®)에 의해 확장되었고, proparacine HCl 0.5% (Alcaine®) 국부 안약 마취제를 처리하였다.
먼저, 개 안구에 23게이지 크기의 유리체 절제침을 이용하여 개 각막 윤부로부터 약 4mm 지점에 세개의 트로카를 삽입한 후 트로카 한 곳으로는 평형 염기액을 주입하여 부피를 유지하면서 나머지 두개의 트로카를 이용하여 유리체 절제술을 시행했다. 이 때, 한쪽 트로카에는 수술용 조명침을 삽입하여 수술시 조명을 공급하였고, 반대쪽에는 유리체 절제침을 이용하여 안구내 유리체를 제거하였다. 수술 시야의 확보를 위해 direct contact lens나 indirect lens system (Biom system)을 이용하여 안구내 구조물을 확인하면서 수술을 진행하였다.
5-2. SI 약물의 준비
분자량 191.89g/mol의 sodium iodate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 phosphate buffered saline (PBS) 0.05 ml 당 SI가 각각 0.8mg, 1.0mg, 1.2mg의 양이 되도록 희석하여 준비한다.
5-3. SI 농도에 따른 망막 변성 정도의 비교
상기 실시예 5-1의 유리체 절제술로부터 1주일 이후, 준비된 약물들을 30 게이지 바늘을 이용하여 개 각막 윤부로부터 약 4mm 지점에 주사하였다. 그 다음, SI 약물의 주사 전(baseline)과 SI를 각각 0.8mg/0.05ml, 1.0mg/0.05ml, 1.2mg/0.05ml의 농도로 주사한 후를 비교하여 도 5 내지 7에 나타냈다. 도 5 내지 7에서 상단의 사진은 근적외선 안저 사진과 빛 간섭 단층촬영 사진(OCT)이며, 하단은 망막전위도를 나타낸다.
그 결과, SI 주사 전과 비교하여 유리체 절제술 후 SI 0.8mg/0.05ml를 주사한 경우에는 모든 검사에서 망막에 아무런 변화를 보이지 않았으나(도 5 참조), 유리체 절제술 후 SI 1.0mg/0.05ml 주사한 4주, 12주 이후에는 OCT에서 시세포층에 해당하는 망막 외층이 선택적으로 소실된 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 또한, SI를 1.0mg/0.05ml의 농도로 주사한 경우 ERG 검사에서 암순응 반응 및 양순응 반응 모두에서 막대세포와 원추세포 모두 빛 반응이 완전히 소실되어, 망막 전체에서 시세포 외층이 소실된 경우임을 확인할 수 있었다.
SI 1.2mg/0.05ml 주사의 경우, 주사 전후를 비교하면 주사 후 OCT에서 시세포층에 해당하는 망막 외층이 선택적으로 소실되고, SI 1.0mg/0.05ml 주사에 비해 망막 내층도 얇아진 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조). 마찬가지로, 주사 후 ERG 검사를 진행한 결과 암순응 반응 및 양순응 반응 모두에서 막대세포와 원추세포 모두 빛 반응이 완전히 소실되어 망막 전체에서 시세포 외층이 소실된 경우임을 확인할 수 있다.
한편, 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 유리체 절제술 후 SI를 1.0mg/0.05ml의 농도로 주사한 3개월 후 조직 소견을 비교한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 대조군과 달리 유리체 절제술 후 SI를 주사한 군에서는 망막 외측의 시세포층이 소실된 것을 알 수 있었다.
이상의 결과는, 망막 변성 동물 모델의 제조 시 유리체 절제술을 수행한 후 특정 용량의 SI를 유리체강 내로 주사하는 경우 바람직한 망막 변성의 유발이 가능함을 시사한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (8)

  1. a) 개의 안구 내 유리체 절제술을 수행하는 단계; 및
    b) 유리체 절제술을 수행한 상기 개의 안구 내에 SI(Sodium Iodate)을 주입하는 단계; 를 포함하는, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 SI는 18mg/ml 내지 26mg/ml의 농도인, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 SI는 0.05ml의 주사액에 0.9mg 내지 1.3mg 용량의 SI가 희석된 것인, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 SI는 안구의 유리체강 내로 주입되는, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b)는, 상기 단계 a)로부터 적어도 3일 이후에 수행되는 것인, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 망막 전체에 균일한 변성이 유발된, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 망막의 원뿔세포가 소실된, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 망막의 원뿔세포와 막대세포를 포함하는 시세포층이 소실된, 망막 변성 개 동물 모델의 제조방법.
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