WO2019239042A1 - Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote - Google Patents

Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote Download PDF

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WO2019239042A1
WO2019239042A1 PCT/FR2019/051372 FR2019051372W WO2019239042A1 WO 2019239042 A1 WO2019239042 A1 WO 2019239042A1 FR 2019051372 W FR2019051372 W FR 2019051372W WO 2019239042 A1 WO2019239042 A1 WO 2019239042A1
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sequences
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Inventor
Didier Raoult
Said AZZA
Bernard La Scola
Eric Chabriere
Anthony Levasseur
Pierre Perrin
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Aix Marseille Universite
Fondation Mediterranee Infection
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Aix Marseille Universite
Fondation Mediterranee Infection
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease

Definitions

  • the present invention relates to a method of modifying a target nucleic acid sequence of a host cell comprising contacting said host cell in vitro or ex vivo with a biological system.
  • Prokaryotes are able to acquire adaptive immunity against the invasion of genetic elements, such as plasmids or phages, by incorporating into their genome short sequences of foreign DNA (from 21 to 72 nucleotides [nt] ), a system called CRISPR- Cas (short grouped and regularly spaced palindromic repetitions) [1, 2].
  • CRISPR- Cas short grouped and regularly spaced palindromic repetitions
  • giant amoeba viruses living in competition with other microbes, has challenged the classical definition of a virus [4, 5]. Since their discovery, giant viruses have revealed unique phenotypic and genotypic characteristics that go against the classical definition of a virus, placing them close to certain microbes. Mimiviruses with a diameter greater than 0.5 micrometer are easily visible with a simple optical microscope. They have a large and complex genome that contains sequences from other organisms [6]. In addition, their possible infection with viruses, virophages, which multiply in the Mimivirus virus factory, and the presence of mobile elements (transpovirons, polintons) have sparked lively debate on the origin of these viruses [7 ]. In addition, virophages, like bacteriophages, can integrate into the Mimivirus genome in the form of provirophagus [9]. One of virophages which parasitizes the family of Mimiviruses was baptized zamilon
  • MIMIVIRE Mimivirus Virophage Résistance Element
  • MIMIVIRE Inactivation of the MIMIVIRE complex has made it possible to restore the susceptibility of Mimivirus to virophageal infection.
  • the partner proteins included in this MIMIVIRE complex are involved in the specific degradation of foreign DNA.
  • the viral defense system, MIMIVIRE thus confers immunity to giant viruses which have been able to integrate the DNA of the infecting virophage into their genome.
  • 59 strains from the collection of giant viruses of the Mimiviridae family of Acanthamoeba polyphaga were infected by the zamilon or Sputnik virophages , another virophage [11]. After 24 hours, an increase in Sputnik DNA was observed in all three lines of Mimiviridae. In contrast, zamilon was able to replicate only with strains of lines B and C of Mimiviridae, but no strain of line A. A sequence of 28 nucleotides (nt), specific to zamilon, and three repetitions of 15 nt were were found in all of the genomes of line A, unlike the other two lines (B and C).
  • the giant viruses of line B and C are called respectively Momovirus for line B and Megavirus for line C, Mimivirus being reserved for line A.
  • Mimivirus being reserved for line A.
  • Mimivirus it it is therefore a giant Mimivirus virus of line A, the genome sequence of which is deposited in Genebank under the reference AY653733.1 and / or which has been deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Institut Pasteur (Paris) according to the Budapest Treaty under the registration number CNCM 1-5322 on May 31, 2018 under the reference APBC1.
  • Mimivirus proteins R350 and R354 are known to those skilled in the art and have been described [8, 17] and reproduced in the sequences SEQ. ID. N °: 1 and 2 of the sequence listing.
  • Mimivire Mimivirus virophage resistance element
  • the MIMIVIRE system can be adapted - but differently than the CRISPR-Cas system as described for example in EP 2 800 811 - to offer a new biological tool of the comparable “biological scissors” type. to the CRISPR-Cas system for foreign genes other than zamilon.
  • the aim of the present invention is therefore to research the methods according to which the Mimivire system can be adapted to provide a “biological scissors” system analogous to the CRISPR-Cas system for targeting genes other than the zamilon gene in Mimivirus and thus for modifying non-coding genes or sequences of bacteria or eukaryotic cells in particular.
  • the present invention provides a method of modifying by cut and / or total or partial degradation of a target nucleic acid sequence of a host cell comprising contacting said host cell in vitro or ex vivo. with a biological system comprising:
  • a first component comprising at least one protein chosen from the proteins R350 and R354 of giant virus Mimivirus of line A or at least one expression vector of at least one nucleic acid sequence of the R350 and / or R354 genes coding for respectively at least one said protein R350 and / or R354, and
  • a second component comprising at least one nucleic acid sequence, called affinity sequence, said affinity sequence comprising at least one sequence complementary to a specific sequence of said target sequence, said specific sequence of said target sequence comprising at least 10 nucleotides, preferably 15 nucleotides.
  • the target sequence can be a DNA sequence or an RNA sequence transcribed from the genome of a said host cell. It is understood that said specific sequence of said target sequence is other than a repeated sequence of the zamilon virophage contained in said R349 gene.
  • the host cell can be a bacterium or archaeal cell or a unicellular or multicellular eukaryotic cell, in particular of a plant or animal.
  • Mimivirus proteins R350 and R354 are known to those skilled in the art and have been described below in the sequences SEQ. ID. N °: 1 and 2 of the sequence listing.
  • These proteins R350 and R354 are known to have helicase and nuclease properties respectively comprising exonuclease and endonuclease activities so that the modification of said target sequence can comprise a cleavage at a specific site and / or a degradation total or partial of said target sequence.
  • sequence complementary to a specific sequence of 15 nucleotides of said target sequence means a DNA or RNA sequence which hybridizes with said target sequence and which does not hybridize with any other sequence of a said host cell and said R349, R350 or R354 genes.
  • flanking sequences are taken from said R349 gene.
  • the Mimivirus R349 gene is known to those skilled in the art and has been described below in the sequence SEQ. ID. N °: 5 of the sequence listing.
  • said second component comprises said affinity sequence in the form of DNA or preferably in the form of RNA.
  • said affinity sequence comprises at least 2 same so-called complementary sequences of the same specific sequence, preferably from 2 to 4, more preferably 4 same so-called complementary sequences of the same specific sequence, repeated spaced apart.
  • the said or each said complementary sequence of the same said specific sequence of the affinity sequence comprises is flanked in 3 'and 5' by adjacent sequences flanking a sequence of 15 nucleotides of the zamilon virophage contained and repeated 4 times in the giant Mimivirus R349 gene.
  • the same complementary sequences of the same specific sequence of the target sequence are flanked in 3 ′ and 5 ′ of flanking sequences which are different from each other between the same same complementary sequences and the said flanking sequences corresponding respectively to the flanking sequences of the same repeat sequences of the zamilon virophage contained in the said R349 gene from Mimivirus.
  • flanking sequences are taken from the 28 nucleotide sequence (SEQ.ID.N 24) including the said 15 nucleotide repeat sequence from the zamilon virophage (SEQ.ID.N6) in the R349 gene or taken from the sequences of 9, 48 and respectively 63 nucleotides (SEQ. ID. N ° 26-28) which separate the repeated sequences of the zamilon virophage in the R349 gene, or a flanking sequence 3 ′ of the last specific specific sequence repeated 3 ′ of 15 nucleotides of the zamilon virophage in the R349 gene.
  • said affinity sequence comprises the modified R349 gene in which only the 4 repeated sequences of 15 nucleotides of the zamilon virophage are replaced at the same locations by the said 4 same sequences complementary to a said specific sequence of the said target sequence.
  • Such a modified R349 gene is illustrated by the sequence SEQ.ID No. 7 including a specific sequence of 15 nucleotides of the tetracycline resistance gene of the sequence SEQ.ID No. 23.
  • said affinity sequence is integrated into a cloning vector of said affinity sequence capable of transforming or transfecting a said host cell and replicating said said affinity sequence therein.
  • the said affinity sequence is integrated in the form of DNA placed under the control of a transcription promoter capable of transcribing the said DNA affinity sequence into RNA in the said host cell.
  • said host cell is a bacterium or a eukaryotic cell.
  • said first component comprises an expression vector of at least one R350 and / or R354 nucleic acid sequence coding for and capable of expressing at least one said R350 and / or R354 protein respectively in a said host cell.
  • nucleic acid sequences coding for the proteins R350 and / or R354 are integrated into a plasmid, under the control of an expression promoter, for example the T7 promoter for a bacterium and the CMV promoter for a cell.
  • an expression promoter for example the T7 promoter for a bacterium and the CMV promoter for a cell.
  • eukaryotic, and framed nuclear localization sequences (NLS) in order to address proteins in the nucleus of the eukaryotic cell if necessary.
  • the said first and second components are integrated into the same said vector, preferably a plasmid.
  • the protein R350 is not a simple helicase but exhibits a specific endonuclease activity which specifically cuts the said specific specific sequences repeated within the target sequence of the host cell.
  • the present invention provides a method for at least cutting said target sequence at a specific site, characterized in that said first component comprises at least the R350 protein or at least one expression vector for at least one nucleic acid sequence of the R350 gene coding for respectively at least one said R350 protein.
  • the present invention provides a method for at least cutting at a specific site and at least partially degrading said target sequence, characterized in that said first component comprises at least the R350 protein and the R354 protein or at least one vector of expression of at least nucleic acid sequences of the R350 and R354 genes coding for at least the said proteins R350 and R354, respectively.
  • said first and second components are integrated into a same said vector comprising the sequences of Mimivirus of line A including:
  • the modified part of the R349 gene preferably the complete modified R349 gene, said modified part of the R349 gene including a part of the 349 gene including at least one of the 4 repeated sequences of 15 nucleotides of the zamilon virophage of the R349 gene, preferably the 4 repeated sequences, the said modification of the said modified part of the R349 gene consisting of the so-called repeated sequence (s) of 15 nucleotides of the zamilon virophage of the gene R349 is (or are) replaced by the same said sequence complementary to a specific sequence of said target sequence, and
  • said first and second components are integrated into the same said vector comprising the sequences of Mimivirus of line A including one of the sequences SEQ.ID. N ° 22 or SEQ.IDN ° 25 in which the sequence repeated 4 times specific for the gene for resistance to tetracycline SEQ. ID. No. 23 is replaced by a said sequence complementary to a specific sequence of 15 nucleotides of the target sequence.
  • said first and second components are integrated into the same said vector comprising the sequences of Mimivirus of line A including one of the sequences SEQ. ID. N ° 37 or SEQ.ID N ° 40 in which the sequence repeated 4 times specific for the gene for resistance to tetracycline SEQ. ID. No. 39 is replaced by a said sequence complementary to a specific sequence of 15 nucleotides of the target sequence.
  • the present invention also provides a biological system useful for the implementation of a method according to the invention of modification by cutting and / or total or partial degradation of a target nucleic acid sequence of a host cell comprising the implementation in contact with said host cell in vitro or ex vivo, as defined above comprising: a first component comprising at least one protein chosen from proteins R350 and R354 of giant virus Mimivirus of line A or at least one expression vector of at least one nucleic acid sequence of gene (s) R350 and / or R354 coding for respectively at least one said protein R350 and / or R354, and
  • a second component comprising a nucleic acid sequence, called the affinity sequence
  • the said affinity sequence comprising at least one sequence complementary to a specific sequence of the said target sequence
  • the said specific sequence of the said target sequence comprising at least minus 10 nucleotides, preferably 15 nucleotides, preferably the or each said sequence complementary to a specific sequence of said target sequence being flanked in 3 ′ and 5 ′ by adjacent sequences flanking a sequence of 15 nucleotides of the zamilon virophage contained and repeated 4 times in the giant Mimivirus R349 gene.
  • said or each said complementary sequence of the same said specific sequence of the affinity sequence is flanked in 3 'and 5' by adjacent sequences flanking a sequence of 15 nucleotides of the zamilon virophage contained and repeated 4 times in the gene R349 from giant Mimivirus virus.
  • the biological system according to the present invention obviously includes all of the characteristics stated upstream for said system when describing the method according to the invention.
  • the present invention also covers said biological methods and systems according to the invention implemented with said sequences of acids or proteins which are homologous or even orthologous to those of said sequences, and / or having similarities in particular with at least 90 % identity of said sequences.
  • FIGS. 1A-1 B and 2A-2B represent agarose electrophoresis gels of various nucleic acid sequences in the presence or not of the proteins R350 and / or R354.
  • Figure 3 is a diagram of the hypothetical mode of action of helicase R350 and nuclease R354.
  • Figure 4 shows a polyacrylamide electrophoresis gel (15%) showing the effect of RNA.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the mode of action of RNA on DNA replication in the presence of DNA polymerase.
  • FIG. 6 shows the constructs of the plasmids PP20 and PP21 for expression of the proteins R350 and R354.
  • FIGS. 7A-7B represent SDS-PAGE gels and Western-blot analysis of the proteins extracted from eukaryotic cells transfected or not by the plasmids PP20 and / or PP21 on a nitrocellulose membrane hybridized with an anti-FLAG antibody.
  • FIG. 8A represents the vector PP14 comprising the sequence SEQ.ID. N ° 25 including the modified Mimivire system of the sequence SEQ. ID. No. 22 comprising a sequence directed against the tetracycline resistance gene of the sequence SEQ.ID. # 23.
  • FIG. 8B represents the vector pACYC184 carrying a specific sequence of the gene for resistance to tetracycline (SEQ.ID. No. 23).
  • FIGS. 9 to 11 and 13 show comparative results of culture of bacteria with abolition of resistance to tetracycline for bacteria transformed by the vector PP14.
  • FIG. 12 shows the results of the action of the Mimivire system tested using an amplification (PCR) of the tetracycline resistance gene from the bacterial culture.
  • FIGS. 14 and 15 show comparative results of culture of bacteria with abolition of resistance to tetracycline for bacteria transformed by the vector PP37.
  • FIG. 16 shows comparative results relating to the capacity of the Mimivire system to abolish the resistance of bacteria to tetracycline for bacteria transformed by the vector PP37, in a liquid medium.
  • FIG. 17 shows the results showing that the action of the Mimivire system is not due to the expression of lethal proteins but to the abolition of the gene for resistance to tetracycline.
  • the first series of experiments (IA) aims to clarify the understanding of the mechanism of action of the Mimivire system.
  • the second series of experiments (I. B, IC) aims to confirm the results highlighted previously by using the MIMIVIRE system to modify a reporter gene in eukaryotic cells (I.
  • the 2 recombinant proteins R354 (Nuclease) and R350 (Helicase) were used on various nucleic substrates in particular (a) IORF4 of the zamilon virophage of 594 nucleotides (product amplified by the primers SEQ. ID. N ° 12 and 13 of the table 1 below) which carries the repeated sequence of 15 nucleotides of the zamilon virophage (SEQ. ID. No. 6) as well as (b) the R349 gene (SEQ. ID. No. 5), both obtained by PCR with the primers of sequences SEQ.ID.N 0 10 to 13 of Table 1).
  • Figures IA and IB represent agarose electrophoresis gels (1%) of DNA sequences of genes amplified by PCR of the ORF4 sequence of zamilon (fig.lA) and of the R349 gene of Mimivire (fig.lB) treated with a protein R354 (N), a protein R350 (N), the two proteins (N + H) and a control without protein (C).
  • 2A represents polyacrylamide electrophoresis gels (15%) of nucleic acid sequences comprising the single-stranded DNA of the ORF4 gene of zamilon and an RNA sequence of 15 nucleotides complementary to the repeated sequence of the zamilon virophage, with a protein R354 (N), a protein R350 (N), the two proteins (N + H) and a control without protein (C).
  • FIG. 2B represents polyacrylamide electrophoresis gels (15%) of nucleic acid sequences comprising the double stranded DNA of the ORF4 gene of zamilon and an RNA sequence of 15 nucleotides complementary to the repeated sequence of the zamilon virophage, with a protein R354 (columns N), a protein R350 (N), the two proteins (N + H) and a control without protein (C).
  • FIG. 3 illustrates the mode of action of helicase and nuclease on IORF4 of zamilon in vivo.
  • Figure 5 is a diagram illustrating the mode of action of RNA complementary to the repeated sequence unit (1) on DNA replication (2) in the presence of DNA polymerase (3) showing the importance crucial of this RNA in the action process of the Mimivire system.
  • Figure 6 shows the constructs of the transfection plasmids PP20 and PP21 used in this study to validate the MIMIVIRE system in which the MIMI_R354 (nuclease) and MIMI_R350 (helicase) genes are under the control of the CMV promoter and framed by nuclear localization sequences ( NLS) to address helicase and nuclease in the cell nucleus.
  • MIMI_R354 nuclease
  • MIMI_R350 helicase
  • 293GFP cells were transfected with these plasmids to establish a new HEK293 GFP cell line which expresses the proteins R350 and R354.
  • the expression of nuclease and helicase was confirmed by Western blotting with an anti-FLAG monoclonal antibody (FIGS. 7A-7B). This anti-FLAG antibody recognizes the bands at 101.6 KDa for helicase and 70.8 KDa for nuclease.
  • FIGS. 7A-7B show SDS-PAGE gels and Western blot analysis of proteins extracted from 293GFP cells. Electrophoresis was carried out on 10% SDS-PAGE gel of 50 ⁇ g of a protein extract originating from 293GFP cells transfected or not by the plasmids PP20 and / or PP21 (FIG. 7A) on a nitrocellulose membrane hybridized with an anti -FLAG at 1: 1000 (Fig.7B). The sizes are indicated on the left in KDa.
  • RNA of 45 nucleotides was synthesized (sense and antisense sequences SEQ.ID.No 20-21, Table 1) comprising 2 repeat specific sequence units of 15 nucleotides from GFP (sense sequences and antisense SEQ.ID.N ° 29-30, table 1) and framed with the same sequence as can be found in the R349 gene of Mimivirus (table 1, sense sequences SEQ.ID.No.20 including the sequence SEQ. ID. N ° 29 and antisense sequences SEQ.ID.N ° 21 including the sequence SEQ.ID. # 30).
  • This 15 nucleotide sequence is part of the RNA guide used to inactivate the GFP gene with the CRISPR / Cas9 system as described in the article Science. 2014 Jan 3; 343: 84-87.
  • This RNA was transfected into HEK293 GFP cells which express the R350 and R354 genes. Reading these experiments made it possible to follow the relative extinction of the fluorescence of GFP by FACS.
  • the system was vectorized in an expression vector PP14 (SEQ. ID. NO. 25) for prokaryote under the control of the T7 promoter inducible by IPTG.
  • the sequence of the R349 gene has been modified (SEQ.
  • Figures 8A-8B represent the Mimivire vector (PP14- Figure 8A) carrying the sequence SEQ. ID. N ° 25 including the sequence SEQ.ID.N ° 22 with the R349 gene modified (SEQ. ID. N ° 7) by a sequence directed against the tetracycline resistance gene (SEQ. ID. N ° 23) as well as genes R350 (SEQ. ID. N ° 3) and R354 (SEQ. ID. N ° 4) under the control of the same T7 promoter (SEQ. ID. N ° 31) with an "operon" organization at l using Lac operon sequences (SEQ. ID. # 32), Shine-Dalgarno sequence and T7 terminator (SEQ. ID. # 33).
  • the PP14 vector into which the R349, R350 and R354 genes are cloned is part of the family of pET vectors which are expression vectors in bacteria. These vectors embark among others, an inducible T7 promoter, that is to say that the expression is made only in the presence of a certain compound in the culture medium, namely IPTG (Isopropyl bDl-thiogalactopyranoside).
  • This vector makes it possible to synthesize constitutively a protein called lacl which binds to the Lac operator sequence and thus blocks the transcription of the cloned gene downstream of the T7 promoter because the T7 RNA polymerase previously fixed on the T7 promoter cannot transcribe the gene because of the steric hindrance created by the presence of the lacl protein.
  • lacl protein complexes with this IPTG molecule, causing a change in conformation of the lacl protein making it unable to bind to the lac operator sequence, which allows the T7 RNA polymerase to transcribe the gene.
  • the T7 terminator stops the T7 RNA polymerase at the end of the transcription.
  • the Shine-Dalgarno sequence is recognized by the ribosome of the bacteria.
  • a messenger RNA known as “polycistronic”, that is to say which contains the transcription of several genes in succession according to an “operon” organization.
  • each part of messenger RNA which contains the transcription of a gene must be preceded by a Shine-Dalgarno sequence recognized by the ribosome which can therefore bind to it and initiate the translation of the messenger RNA.
  • RNA of the modified R349 In the presence of IPTG in the medium, transcription into RNA of the modified R349 is carried out which carries the 4 repeat units corresponding to tetracycline on the one hand and on the other hand, transcription of another messenger RNA which is carried out carries the R350 (helicase) and R354 (nuclease) genes. The 2 transcriptions are independent of each other.
  • This PP14 vector is then transferred by electroporation into E.coli BL21 bacteria previously transformed by the vector.
  • pACYC184 FIG. 8B
  • the bacteria are established according to different dilutions on an LB / agar dish containing either Ampicilin / Tetracycline / IPTG (50pg / ml; 12pg / ml; O.lmM respectively) or Ampicilin / IPTG (50pg / ml; ImM respectively).
  • FIGS. 9 to 11 and 13 show comparative results of culture of bacteria with abolition of resistance to tetracycline for bacteria transformed by the vector PP14.
  • Figure 9 shows the results of the first experiment.
  • Amp / IPTG boxes there are (from left to right) 16; 3 and 48 bacteria for dilutions corresponding to 1/10 respectively; 1/50; and the rest of the transformation.
  • the boxes There are (from left to right) 16; 3 and 48 bacteria for dilutions corresponding to 1/10 respectively; 1/50; and the rest of the transformation.
  • the boxes There are (from left to right) 16; 3 and 48 bacteria for dilutions corresponding to 1/10 respectively; 1/50; and the rest of the transformation.
  • Amp / Tet / IPTG there are respectively 0; 0 and 8 bacteria.
  • Figure 10 shows the results of the second experiment.
  • Amp / IPTG boxes there are (from left to right) 5 and 28 bacteria for spread dilutions corresponding respectively to 1/5 and to the rest of the culture. Starting volume of 1ml.
  • Starting volume 1ml.
  • Figure 11 shows the effect of the induction of the Mimivire system:
  • the bacteria containing the vector pACYC184 are electroporated with the vector PP14 containing the Mimivire system and spread out at equal volume on LB / Agar Ampicillin / Tetracycline + or IPTG dishes.
  • FIG. 11 it is clearly seen that the induction of the expression of the genes of the Mimivire system results in the drastic reduction in the number of colonies regardless of the antibiotic.
  • a test of the action of the Mimivire system by PCR was carried out using the bacterial culture of 10 clones from the LB / Agar Ampicillin / Tetracycline box and pushed for 16 hours in Ampicillin alone or Ampicillin + IPTG.
  • the PCR result shows the amplification of a 1.3 kb fragment corresponding to the tetracycline resistance gene.
  • FIG. 13 shows the spread of clone 7 on a Tetracycline dish (284 bacteria) with IPTG and on a Tetracycline dish (402 bacteria) without IPTG at a dilution corresponding to 103 theoretical CFUs.
  • Clone 7 responds to the induction of the Mimivire system via IPTG because we go from 346 (Ampicillin / IPTG boxes) to 284 bacteria (Tetracycline / IPTG boxes), a decrease of about 18%, whereas we do not shows no significant difference in control without IPTG (passage from 393 to 402 bacteria).
  • E.coli bacteria were transformed with the plasmid pACYC184 containing the tetracycline resistance gene (SEQ. ID. N ° 35).
  • the vector Mimivire PP37 carries the sequence SEQ. ID. N ° 40 including the sequence SEQ.ID.N ° 37 with the R349 gene modified (SEQ. ID. N ° 38) by a sequence directed against the tetracycline resistance gene (SEQ. ID. N ° 39) as well as genes R350 (SEQ. ID. N ° 3) and R354 (SEQ. ID. N ° 4) under the control of the same T7 promoter (SEQ. ID. N ° 31) inducible by IPTG, with an organization in “operon” using Lac operon sequences (SEQ. ID. N ° 32), Shine-Dalgarno sequence and T7 terminator (SEQ. ID. N ° 33).
  • the vector PP37Vector (SEQ ID No. 40) into which the R349, R350 and R354 genes are cloned is part of the family of pET vectors which are expression vectors in bacteria. These vectors embark among others, an inducible T7 promoter, that is to say that expression is only done in the presence of a certain compound in the culture medium, namely IPTG (Isopropyl bDl-thiogalactopyranoside). This vector is the same as that of the PP14 vector but with the 15 nucleotides specific for the tetracycline resistance gene corresponding to the SEQ. ID. N ° 39: CGGCTCTTACCAGCC.
  • the E.coli BL21 bacteria previously transformed with the plasmid pACYC184 were transformed with the vector PP37Vector.
  • the bacteria were spread on dishes containing 100 mg / L of ampicillin and 12 mg / L of tetracycline supplemented or not with ImM of IPTG.
  • Figure 14 shows the results of the first experiment. On the Amp / Tet boxes there are (from left to right) 1597 and 259 bacteria for spread dilutions corresponding respectively to 1/1 and 1/10. It is noted that on the Amp / Tet / IPTG boxes, no bacteria are obtained.
  • Figure 15 shows the results of the second experiment.
  • Amp / Tet boxes there are (from left to right) 562 and 60 bacteria for spread dilutions corresponding respectively to 1/1 and 1/10. Starting volume of 1ml. It is noted that on the Amp / Tet / IPTG boxes, no bacteria are obtained.
  • FIGS. 14 and 15 show the absence of colonies on the agar containing tetracycline in the presence of IPTG which induces the expression of the proteins of the Mimivire system. These results highlight the ability of the Mimivire system to abolish the resistance of bacteria to tetracycline causing the death of bacteria.
  • the induction of the MIMIVIRE system was tested in a liquid medium.
  • two colonies of Escherichia coli having the plasmids PP37Vector and pACYC184 were selected on dishes containing ampicillin (100 mg / L) and tetracycline (12 mg / l) and cultivated in 2 ml of medium containing ampicillin (100 ⁇ g / L) and (12 ⁇ g / mL) at 37 ° C with stirring at 200 rpm.
  • each culture was divided into two tubes in which one tube was supplemented with ImM from IPTG to induce expression of proteins from the Mimivire system.
  • 10 ⁇ l was diluted in 1 ml from which 100 ⁇ L was spread on agar dishes containing 100 ⁇ g / L of ampicillin and 12 ⁇ g / mL of tetracycline.
  • E. coli bacteria To exclude the expression of lethal proteins by the Mimivire system in E. coli bacteria, their viability was tested on various media. To do this, 4 colonies of E. coli having the plasmids PP37Vector and pACYC184 were collected and cultured in 1 ml of medium containing ampicillin and tetracycline at 37 ° C. with stirring at 200 rpm. After two hours, each culture was supplemented with 1 mM IPTG to induce expression of proteins from the Mimivire system. After 4 hours, 10 ⁇ L was diluted in 1 ml, then 100 ⁇ L was spread on agar dishes containing ampicillin and tetracycline or containing ampicillin but no tetracycline.
  • the results presented in FIG. 17 confirm that the death of the bacteria is not due to the expression of lethal proteins but to the abolition of resistance to tetracycline. These results make it possible to prove that the Mimivire activity can be transferred into E. coli to act against a target gene by including 15 specific repeat sequences of nucleotides of said sequence. The substitution of 15 nucleotides of the Zamilon sequence by 15 nucleotides specific for the tetracycline resistance gene did not create an abortive protein. Only the amino acids encoding the DN ES repeat sequence of Zamilon have been mutated. These results exclude the possibility that the Mimivire system is mediated by protein interactions.
  • the enzymatic reactions were carried out by incubating each PCR, in vitro transcription (IVT) or primer product with the nuclease (R354), the helicase (R350) or the two enzymes.
  • the enzymatic reactions were carried out in CutSmart® buffer (Ref: B7204S) from New England Biolabs (potassium acetate 50 mM, trisium acetate 20 mM, magnesium acetate 10 mM, 100 ug ml-1 of BSA, pH 7, 9) at 32 ° C for 2 hours, using a protein concentration of 0.5 mg. ml-1 for each enzyme. After incubation, all reactions were treated with proteinase K to prevent DNA or RNA from spilling into the wells of the gels.
  • the Acanthamoeba castellanii amoebas (ATCC 30010) were seeded at 5 ⁇ 10 6 in Page's amoebic saline medium (PAS) as described previously (7).
  • the H line EK293 GFP human embryonic kidney cells, Clinisciences
  • DM EM Eagle medium modified by Dulbecco
  • FBS FBS
  • GlutaMAX 2 mM Life Technologies
  • 100 U / ml of penicillin 100 ug / ml. Streptomycin and 100 pg / ml of nonessential amino acid.
  • the chemically competent Escherichia Coli One Shot TM BL21 (DE3) bacteria were cultured in Luria-Bertani (LB) medium with an appropriate antibiotic.
  • the bacteria were spread on LB-agar with an appropriate antibiotic (12pg / ml for tetracycline and 50pg / ml for ampicillin).
  • the Mimivire system was induced by the addition of 0.2 mM isopropyl b-D-1-thigalactopyranoside (IPTG) on LB-agar plates.
  • the A. Castellanii amoebae were infected or co-infected with Mimivirus or Mimivirus and the zamilon virophage respectively using an MOI of 10. The cells were then incubated at 32 ° C and at regular points post-infection, the cells were collected for RNA extraction with the mirRena TM miRNA Isolation Kit (Ambion). The 293GFP cells were seeded on 6-well plates (Corning) 48 h before transfection at a density of 300,000 cells / well. The cells were transfected at 80-90% confluence using Lipofectamine 2000 (Life Technologies) following the protocol recommended by the manufacturer.
  • MIMI_R354 Nuclease
  • MIMI_R350 Helicase
  • the plasmids used in these experiments are the PP14 synthesized by Genscript hosting an inducible expression of the Mimivire system under the control of the T7 promoter (see appendix 1 and FIG. 8A), the vector PP37 hosting an inducible expression of the Mimivire system under the control of the T7 promoter (see Annex 2), and the vector pACYC184 (Mo Bi Tec company Ref: V32402).
  • the Escherichia Coli One Shot TM BL21 (DE3) bacteria were transformed by the plasmid pACYC184 according to the manufacturer's protocol and instructions. The bacteria were spread on a plate of LB-agar tetracycline (Tet) (day 1).
  • a clone was removed and cultured in 10 ml of Tet selective LB medium overnight at 37 ° C. with stirring at 200 rpm.
  • 200 ⁇ l of the culture was inoculated into 20 ml of fresh LB + Tet medium until the OD at 600 nm reached 0.7.
  • the bacteria were harvested by centrifugation at 7000 rpm for 1 minute at 4 ° C and washed three times with 10% glycerol. After the first centrifugation, all steps were carried out on ice and in a cold room. The bacteria were resuspended in 50 ⁇ l of 10% glycerol and 200 ng of PP14 vector were added.
  • the mixture was transferred to a Geneuterer® cuvette with a space of 0.1 cm (Bio-Rad, Ref 165-2089) and an electric pulse was produced with the MicroPulser Electroporator (Bio-Rad, Ref: 165-2100 ) using the Ecl program.
  • the electroporation time indicated by the device after the pulse was 5.8 ms.
  • 1 ml of LB was added immediately and incubated for 1 hour at 37 ° C with shaking at 200 rpm.
  • Several dilutions were plated on TB / Amp / IPTG or Amp / IPTG selective LB-agar plates and incubated overnight at 37 ° C. The next day, the colonies were counted.
  • the sequences of the genes coding for the protein R350 and R354 of Mimivirus have been optimized to maximize expression in E.coli and synthesized by GenScript.
  • the protein R354 includes a polyhistidine tag (SEQ. ID. NO. 34) at the C-terminus.
  • the sequence of R349 remains unchanged with the exception of the repeat unit of 15 nucleotides which corresponds to a tetracycline sequence (SEQ.ID. No. 7 including SEQ.ID. N ° 23 repeated 4 times or SEQ. ID. N ° 38 including SEQ. ID. N ° 39 repeated 4 times).
  • These genes were inserted between the Xbal and Xhol cleavage sites of the plasmid pET22b (+) (annex 1, SEQ.ID. No. 22).
  • the recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 (DE3) -pGro7 / GroEL (TaKaRa) using ZYP-5052 medium. Each culture was cultivated at 37 ° C. until an absorbance at 600 nm of 0.8 was obtained, followed by the addition of L-arabinose (0.2% w / v) and induction with a transition. temperature at 18 ° C for 20 h. The cells were harvested by centrifugation (5,000 g, 30 min, 4 ° C) and the resulting pellets were resuspended in loading buffer (20 mM M ES pH 6.0) and stored at -80 ° C overnight.
  • loading buffer 20 mM M ES pH 6.0
  • the frozen cells were thawed and incubated on ice for 1 h after addition of lysozyme and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) at respective final concentrations of 0.25 mg ml-1 and 0.1 mM.
  • the partially lysed cells were then disturbed by three consecutive sonication cycles (30 s, amplitude 45) carried out on a Q700 sonication system (QSonica).
  • QSonica Q700 sonication system
  • the cellular debris was discarded after a centrifugation step (11,000 g, 20 min, 4 ° C).
  • the recombinant protein was purified using a cation exchange column from 6 ml of RESOURCE S (GE Heathcare) using 20 mM MES buffer pH 6.0 and a linear gradient to 0.5 M NaCl in 10 volumes. column. The fractions were analyzed by SDS-PAGE stained with Coomassie blue (10%) and the helicase activities were evaluated on an electrophoresis on denaturing polyacrylamide gel as described above (15% of d PAGE).
  • the active fractions (generating a cleavage at the level of the repeated unit of 15 nucleotides of zamilon) were pooled and further purified using an affinity chromatography on immobilized metal (loading and washing buffer: Tris 50 mM pH 8, 300 mM NaCI, 20 mM imidazole, elution buffer: Tris 50 mM pH 8, 300 mM NaCI, imidazole 250 and 500 mM) on a 5 ml column of raw HisTrap FF (GE Healthcare). The fractions were analyzed using 10% SDS-PAGE (Coomassie staining) and evaluated using helicase activity as previously described.
  • RNA samples were treated with the mirVana TM miRNA kit (Ambion). Enriched fractions of small RNA ( ⁇ 200 nt), as well as total RNA were obtained. The RNA samples were characterized using RNA 6000 Pico Total RNA chips (Agilent) combined with the Agilent 2100 Bioanalyzer or electrophoresis on denaturing polyacrylamide gel (d PAGE-15% acrylamide) for small RNAs.
  • RNA samples were denatured for 5 minutes at 95 ° C in a loading buffer containing 50% formamide followed by immediate cooling on ice.
  • RNA samples were run on denaturing Polyacrylamide gels with 15% urea (d PAGE), electrobiotized on Hybond N + membranes (GE Helathcare) at 20 V for 1 hour using a semi-dry transfer ( Hoefer TE 77, GE Healthcare). The membrane is then cross-linked to UV for 2 min.
  • Probes e.g. 5'-TCA-GAT-TCA-TTA-TCA-G-3 'and 5'- CTG-ATA-ATG-AAT-CTG-A-3', with digoxigenin (DIG) at both ends, were purchased with Eurogentec. Pre-hybridization and hybridization were performed using an Easy Hybridization buffer (Roche Applied Science) at 37 ° C. After hybridization, the membranes were washed twice using a low stringency buffer solution (2X SSC, 0.1% SDS) and a high stringency buffer solution (0.1X SSC 0.1% SDS) for ten minutes at room temperature and fifteen minutes at 60 ° C, respectively.
  • 2X SSC 0.1% SDS
  • 0.1X SSC 0.1% SDS high stringency buffer solution
  • the membranes were then hybridized with a probe marked with DIG as recommended by the manufacturer (DIG-System, Roche Diagnostics), with the exception of the detection of the hybridized probe which was carried out using a monoclonal anti-digoxin conjugated to horseradish peroxidase (Jackson Immunoresearch, 1: 5000). After several washes, transfers were revealed by chemiluminescence tests (ECL, GE Healthcare). The resulting signal was detected on Hyperfilm TM ECL (GE Healthcare) using an automated film processor (Hyperprocessor TM, GE Healthcare).
  • the DNA templates were hybridized with primers including the T7 promoter and lac operon (SEQ.ID. Nos. 14-15 and 16-17) and mixed with the T7 reaction buffer (1 x), a T7 solution NTP (7.5 mM), the enzyme T7 (2 ⁇ l for a reaction of 20 ⁇ l) for 4 hours at 37 ° C.
  • the DNA templates were degraded by TURBO DNase (2 U) for 15 minutes at 37 ° C.
  • the RNA transcripts were precipitated with ethanol. The final pellets were resuspended in nuclease-free water.
  • the DNA matrices were incubated with the complementary RNAs corresponding to the repeat unit of zamilon of 15 nucleotides (SEQ.ID. No. 18-19) as well as an elongation primer at 95 ° C for 5 minutes then by gradually cooling to 25 ° C. All mixtures were incubated with 5 U of Klenow exo- from ThermoFisher (ref: EP0422) for 1 hour at 37 ° C. The controls were carried out with the same conditions at without the RNA or Klenow.
  • RNAseq Single-stranded DNA samples of 65 nucleotides were sequenced using MiSeq technology (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). The RNAseq approach was chosen and the banks were built using Truseq stranded mRNA strategy and were bar-coded with another RNAseq project.
  • the samples were measured on the Nanodrop and the maximum volume of 16.5 pL, between 36 and 160ng, was involved in synthesizing the second strand DNA.
  • the Truseq strand mRNA procedure was followed from there and all of the purification steps of Ampure were replaced by alcoholic precipitation due to the small size of the DNA fragments.
  • the library profiles were visualized by DNA1000 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA, USA) at 71, 78, 130 base pairs. The final concentration of the banks was 143 and 333 nmol / l for the 6 samples.
  • the 293GFP cells [PP20 / PP21] were seeded on 6-well plates at 150,000 cells / well 24 h before transfection.
  • the cells were transfected using lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) following the protocol recommended by the manufacturer. A total of 30 pmol of RNA was used for the transfection.
  • the transfected cells were analyzed by FACS three days after transfection.
  • the transfected or non-transfected cells were lysed by sonication in a solubilization buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 30 mM Tris, 4% CHAPS (w / v) and centrifuged at 10,000 g, 20 min, 4 ° C. Soluble proteins were collected and the concentration was determined using the Bio-Rad De Protein Assay (Bio-rad).
  • the immunostained bands were visualized with the chemiluminescence-based kit, as described by the manufacturer (GE Healthcare, Vél izy-Vi I la co u bl ay, France). The resulting signal was captured by a Fusion FX7 imaging system (Vilber Lourmat, France).
  • the excised bands of the gels were discolored and subjected to digestion in the gel with trypsin (Proteomics grade trypsin, Agilent Technologies, Cedar Creek, TX).
  • trypsin Proteomics grade trypsin, Agilent Technologies, Cedar Creek, TX.
  • the tryptic peptides were then extracted from the gel by successive treatments with water and acetonitrile (H PLC quality).
  • the extracts were combined and concentrated in a Speedvac evaporator.
  • the peptide solution was then deposited on the matrix-assisted laser desorption ionization target (MALDI).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization target
  • Mass analyzes were carried out on a Brüker Autoflex Speed MALDI - time of flight (MALDI-TOF) speed spectrometer (Brüker Daltonique, Wissembourg, France).
  • the mass spectra were calibrated externally using peptides from the tryptic digestion of bovine serum albumin (Brüker). Mass lists of tryptic peptides were used to identify proteins, using Mascot software (Matrixscience). Searches were performed against an internal database containing the labeled sequence of MIMI_R350 (Helicase like), including a polyhistidine tag at the amino-N-terminus.
  • SEQ.ID. No. 22 insert synthesized and cloned by genscript into pET-22b (+) at the Xba I / Xho I restriction sites successively comprising the sequences of: a) T7 promoter (SEQ.ID. No. 31) TAATACGACTCACTATAG; b) operonLac (SEQ.ID. N ° 32) G AA TTGTGA G CG G A T AA CAA TTCQ
  • SEQ.ID. N ° 34 CACCACCACCACCACCAQ i) the terminator T7 SEQ.ID.N ° 33:
  • SEQ.ID.N ° 22 sequences organized in operon including the modified R349 gene with specific sequence of 15 nucleotides of the tetracycline resistance gene (SEQ ID N ° 23) and the R350 and 354 genes.
  • AGCTGTATGTT CAGC AG AT GG ACG AATGCG ACTT CCTGCAGTGCAAAATT G CAG AGT ACG AT AGCTGGG AAG CADTC GTG AAGG AT AGCAACCCG AT CGTT CCGGGT CT G AGCAAAACCACCAA CTC GG AG AAGGGCT GCCT GATT CAGCT G AGCG ACAAAAACCT G AT CGGCAGCG ACG ACAAGG AAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAA T CG AG AAGTGG ATT AGCAGCG STW CAT G AACT ACCACAACAACG ACCT G AGCG AG AACT AT A
  • SEQ.ID. No. 37 insert synthesized and cloned by genscript in pET-22b (+) at the Xba I / Xho I restriction sites successively comprising the sequences of: a) T7 promoter (SEQ.ID. No. 31) TAATACGACTCACTATAG; b) operonLac (SEQ.ID.N ° 32) G AA TTGTGA G CG G A T AA CAA TTCC;
  • SEQ.ID.No.37 sequences organized in operon including the modified R349 gene with specific sequence of 15 nucleotides of the tetracycline resistance gene (SEQ ID No.39) and the R350 and 354 genes.
  • CT CTT ACCAGCCAT CT AT G ACT G AAAAAGCTGG AAT AATTTT GTT AAACG
  • AAATT AAAACCAT GGTAG AT G AAATTTT GT CT CAAAAAAAT ATT AATT CT GTTGG AATT AACG AT ATT GTT ATT CG
  • GGTCT G AATT ATTTT G AAAGTTT CATT GT AGTT ATTGT CAAT AAT CCAAAT AT GTT G ACG AT A
  • AGCTGTATGTT CAGC AG AT GG ACG AATGCG ACTT CCTGCAGTGCAAAATT G CAG AGT ACG AT AGCTGGG AAG CADTC GTG AAGG AT AGCAACCCG AT CGTT CCGGGT CT G AGCAAAACCACCAA CTC GG AG AAGGGCT GCCT GATT CAGCT G AGCG ACAAAAACCT G AT CGGCAGCG ACG ACAAGG AAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAA T CG AG AAGTGG ATT AGCAGCG STW CAT G AACT ACCACAACAACG ACCT G AGCG AG AACT AT A
  • SEQ. ID. N ° 1 protein R350 of Mimivirus
  • SEQ. ID. N ° 2 protein R354 from Mimivirus
  • SEQ.ID.No.10 primer of the mimivirus R349 gene
  • SEQ.ID.N ° 11 primer of the mimivirus R349 gene
  • SEQ.ID.N ° 12 primer of the zamilon virophage IORF4 gene
  • SEQ.ID.N ° 13 primer of the IORF4 gene of the zamilon virophage TT AAGTT AT AATTTTGTAT A
  • SEQ.ID.N ° 14 primer of a sense sequence including the T7 promoter and Lac operon sequences
  • SEQ.ID.No.15 primer of a sense sequence including the T7 promoter and Lac operon sequences
  • SEQ.ID.No.16 primer of an antisense sequence including the T7 promoter and Lac operon sequences
  • SEQ.ID.N ° 17 primer of an antisense sequence including the T7 promoter and Lac operon sequences
  • SEQ.ID.N ° 18 sense sequence of the RNA of the repeated sequence of the zamilon virophage
  • SEQ.ID.N ° 19 RNA anti-sense sequence of the repeated sequence of the zamilon virophage UCAGAU UCAU UAUCA
  • SEQ. I D. N ° 20 RNA sense sequence of the repeated G FP gene sequence
  • SE D. I D. N 0 22 sequences organized in operon with the modified R349 gene with specific sequence of 15 nucleotides of the tetracycline resistance gene (SEQ IDN 23 ) and the R350 and 354 genes.
  • SEQ. I D. N ° 26 sequence of the first spacer of the modified R349 gene (NB: do not take into account the first nu cleotide A added only to make a total of 10 nt as required by the sequence listing software)
  • SEQID ° 27 sequence of the second spacer of the modified R349 gene
  • SEQ. ID. N ° 28 sequence of the third spacer of the modified R349 gene
  • SEQ. ID. N ° 29 sense sequence of RNA specific for the GFP gene
  • SEQ. ID. N ° 30 anti-sense sequence of RNA specific for the GFP gene ACGUCGCCGUCCAGC
  • SEQ.ID. No. 35 Sequence of the plasmid pACYC184 carrying the tetracycline resistance gene
  • SEQ.ID. # 36 tetracycline resistance gene sequence

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et - un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.

Description

Méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte.
La présente invention concerne une méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique.
Les procaryotes sont capables d'acquérir une immunité adaptative contre l'invasion d'éléments génétiques, tels que les plasmides ou les phages, via l'incorporation dans leur génome de courtes séquences d'ADN étranger (de 21 à 72 nucléotides [nt]), système appelé CRISPR- Cas (courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacée) [1, 2] . L'acquisition de ces séquences d'ADN étranger survient de façon adjacente aux gènes Cas qui ont pour rôle de cliver l'ADN étranger en fragments de petites tailles. CRISPR-Cas confère ainsi une résistance face à une seconde infection [ 14, 15]
À ce jour, le système CRISPR-Cas n'avait été observé que chez les bactéries et les archées [ 16], mais pas chez des virus [1, 2] .
La découverte des virus géants d'amibes, vivant en compétition avec d'autres microbes, a contesté la définition classique d'un virus [4, 5] . Depuis leur découverte, les virus géants ont révélé des caractéristiques phénotypiques et génotypiques uniques qui vont à l'encontre de la définition classique d'un virus, les plaçant à proximité de certains microbes. Les Mimivirus au diamètre supérieur à 0,5 micromètre, sont aisément visibles avec un simple microscope optique. Ils possèdent un génome large et complexe qui contient des séquences provenant d'autres organismes [6]. En outre, leur infection possible par des virus, les virophages, qui se multiplient dans l'usine à virus des Mimivirus, et la présence des éléments mobiles (transpovirons, polintons) ont suscité de vifs débats sur l'origine de ces virus [7]. De plus, les virophages, comme les bactériophages, peuvent s'intégrer au génome de Mimivirus sous la forme de provirophage [9] . Un des virophages qui parasite la famille des Mimivirus a été baptisé zamilon
[ 10] .
Dans cette étude publiée dans le journal Nature [8], les chercheurs ont observé qu'un groupe parmi les Mimivirus (appelé lignées A) a développé une résistance contre l'infection par un virophage nommé zamilon, alors que les virus géants des lignées B et C sont sensibles à l'infection par ce virophage. Les chercheurs ont trouvé la présence d'une séquence répétée d'ADN de zamilon qui sert à accrocher le virophage uniquement dans la lignée A. Ce complexe a ainsi été nommé MIMIVIRE (Mimivirus Virophage Résistance Elément) et présente des similarités fonctionnelles avec le système de défense CRISPR-Cas existant jusqu'alors uniquement chez les bactéries et les archées et comportant une enzyme déroulant l'ADN (hélicase R350) et une autre le coupant (nucléase R354). L'inactivation du complexe MIMIVIRE a permis de restaurer la susceptibilité de Mimivirus à l'infection par le virophage. Les protéines partenaires comprises dans ce complexe MIMIVIRE sont impliquées dans la dégradation spécifique de l'ADN étranger. Le système de défense virale, MIMIVIRE, confère ainsi une immunité aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome l'ADN du virophage infectant.
Plus précisément, 59 souches de la collection des virus géants de la famille des Mimiviridae d'Acanthamoeba polyphaga (dont 28 de la lignée A, 8 de la lignée B et 23 de la lignée C), ont été infectées par les virophages zamilon ou Sputnik, un autre virophage [ 11] . Après 24 heures, une augmentation de l'ADN de Sputnik a été observée dans l'ensemble des trois lignées de Mimiviridae. En revanche, zamilon a été capable de se répliquer uniquement avec les souches des lignées B et C de Mimiviridae, mais aucune souche de la lignée A. Une séquence de 28 nucléotides (nt), spécifique de zamilon, et trois répétitions de 15 nt ont été retrouvées dans l'ensemble des génomes de la lignée A contrairement aux deux autres lignées (B et C). Ces séquences sont localisées dans un gène codant une transposase-A chez zamilon, et sont intégrées dans le gène R349 de Mimivirus et dans les gènes orthologues, chez tous les Mimivirus de la lignée A. Ces séquences répétées sont séparées par des séquences de 9,48 et 63 nt respectivement. L'étude de l'environnement génomique au voisinage des séquences répétées de zamilon a mis en évidence des ORF (open reading frame, cadre de lecture ouvert) conservés chez les Mimiviruses. Ces ORF possèdent une similarité distante avec les Cas protéines qui sont de type hélicase et nucléase. Silencés par RNA interférence, l'inactivation des ORF contenant la séquence répétée d'ADN de zamilon, ou des ORF proche des Cas protéines, a permis de restaurer la susceptibilité de la lignée A des Mimivirus à l'infection par zamilon. En outre, l'expression des gènes a confirmé qu'ils codent une hélicase R350 et une nucléase R354.
Désormais, les virus géants des lignée B et C sont dénommés respectivement Momovirus pour la lignée B et Mégavirus pour la lignée C, Mimivirus étant réservé à la lignée A. Dans la suite de la présente demande de brevet lorsqu'il est indiqué Mimivirus, il s'agit donc de virus géant Mimivirus de la lignée A dont la séquence du génome est déposée dans Genebank sous la référence AY653733.1 et/ou qui a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (Paris) selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-5322 le 31 Mai 2018 sous la référence APBC1.
Dans un article récent [17] la structure et l'activité nucléase de la protéine R354 ont été étudiées.
Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrite [8, 17] et reproduites dans les séquences SEQ. ID. N° : 1 et 2 du listage de séquences.
Ce système de défense virale confère ainsi une immunité adaptative aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome l'ADN du virophage infectant. C'est pourquoi ce complexe a été nommé Mimivire (Mimivirus virophage résistance element) [ 11]. Suite à l'étude de Nature 2016 (8), il a été toutefois contesté que Mimivirus puisse être également capable de développer un outil de type ciseaux biologiques analogue à celui de CRISPR-Cas [ 12] .
Toutefois, selon la présente invention, on a démontré que le système MIMIVIRE peut être adapté - mais différemment que le système CRISPR-Cas tel que décrit par exemple dans EP 2 800 811- pour offrir un nouvel outil biologique du type « ciseaux biologiques » comparable au système CRISPR-Cas pour des gènes étrangers autres que zamilon.
Le but de la présente invention est donc de rechercher les modalités selon lesquelles le système Mimivire peut être adapté pour fournir un système de « ciseaux biologiques » analogue au système CRISPR-Cas pour cibler des gènes autres que le gène zamilon dans Mimivirus et ainsi pour modifier des gènes ou séquences non codantes de bactéries ou cellules eucaryotes notamment.
Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant :
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides. La séquence cible peut être une séquence d'ADN ou une séquence d'ARN transcrite du génome d'une dite cellule hôte. On comprend que ladite séquence spécifique de ladite séquence cible est autre qu'une séquence répétée du virophage zamilon contenue dans ledit gène R349.
La cellule hôte peut être une cellule de bactérie ou d'archée ou une cellule eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire, notamment de plante ou d'animal.
Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrites ci-après dans les séquences SEQ. ID. N° : 1 et 2 du listage de séquences.
Ces protéines R350 et R354 sont connues comme ayant des propriétés d'hélicase et respectivement nucléase comprenant des activités d'exonucléase et d'endonucléase de sorte que la modification de la dite séquence cible peut comprendre une coupure en un site spécifique et/ou une dégradation totale ou partielle de la dite séquence cible.
On entend par « séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de ladite séquence cible », une séquence d'ADN ou d'ARN qui s'hybride avec la dite séquence cible et qui ne s'hybride avec aucune autre séquence d'une dite cellule hôte et desdits gènes R349, R350 ou R354.
En revanche on comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées dudit gène R349.
Le gène R349 de Mimivirus est connu de l'homme de l'art et a été décrit ci-après dans la séquence SEQ. ID. N° : 5 du listage de séquences.
Des séquences des gènes R350 et 354 codant pour les protéines 350 et 354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrites dans les séquences SEQ. ID. N° : 3 et 4 du listage de séquences.
Plus particulièrement, ledit deuxième composant comprend la dite séquence d'affinité sous forme d'ADN ou de préférence sous forme d'ARN .
De préférence, ladite séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées de façon espacée.
De préférence encore, la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité comprend est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
De préférence encore, les dites même séquences complémentaires de la même séquence spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues dans ledit gène R349 de Mimivirus.
On comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées de la séquence de 28 nucléotides (SEQ.ID. N 24) incluant la dite séquence répétée de 15 nucléotides du virophage zamilon (SEQ. ID. N 6) dans le gène R349 ou tirées des séquences de 9, 48 et respectivement 63 nucléotides (SEQ. ID. N°26-28) qui séparent les séquences répétées du virophage zamilon dans le gène R349, ou une séquence flanquante en 3' de la dernière séquence spécifique répétée en 3' de 15 nucléotides du virophage zamilon dans le gène R349. Plus particulièrement, ladite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux mêmes localisations par les dites 4 mêmes séquences complémentaires d'une dite séquence spécifique de la dite séquence cible.
Un tel gène R349 modifié est illustré par la séquence SEQ.ID N° 7 incluant une séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID N°23.
Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité.
Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de transcription apte à transcrire la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte.
Plus particulièrement encore, ladite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote.
Plus particulièrement encore, ledit premier composant comprend un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique R350 et/ou R354 codant pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte.
Plus particulièrement, les séquences d'acides nucléiques codant pour les protéines R350 et/ou R354 sont intégrés dans un plasmide, sous le contrôle d'un promoteur d'expression, par exemple le promoteur T7 pour une bactérie et le promoteur CMV pour une cellule eucaryote, et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser les protéines dans le noyau de la cellule eucaryote le cas échéant. Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur, de préférence un plasmide.
Selon la présente invention, on a en particulier découvert que la protéine R350 n'est pas une simple hélicase mais présente une activité d'endonucléase spécifique qui coupe spécifiquement les dites séquences spécifiques répétées au sein de la séquence cible de la cellule hôte.
Dans un mode préféré de réalisation, la présente invention fournit une méthode pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350.
Plus particulièrement, la présente invention fournit une méthode pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séq uences d'acides nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354.
Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant :
- au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et
- une séquence permettant la transcription en ARN dans une dite cellule hôte de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du gène R349 modifié complet, et
- les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte.
Plus particulièrement encore, pour une cellule hôte de bactérie, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant l'une des séquences SEQ.ID. N°22 ou SEQ.IDN°25 dans laquelle la séquence répétée 4 fois spécifique du gène de résistance à la tétracycline SEQ. ID. N°23 est remplacée par une dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de la séquence cible.
Plus particulièrement encore, pour une cellule hôte de bactérie, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant l'une des séquences SEQ. ID. N°37 ou SEQ.ID N°40 dans laquelle la séquence répétée 4 fois spécifique du gène de résistance à la tétracycline SEQ. ID. N°39 est remplacée par une dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de la séquence cible.
La présente invention fournit aussi un système biologique utile pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que définie ci-dessus comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique de(s) gène(s) R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
Plus particulièrement, la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
Le système biologique selon la présente invention comprend évidemment l'ensemble des caractéristiques énoncées en amont pour ledit système lors de la description de la méthode selon l'invention.
La présente invention couvre également des dites méthodes et systèmes biologiques selon l'invention mis en œuvre avec des dites séquences d'acides ou de protéines qui sont homologues voire orthologues à celles des dites séquences, et/ou présentant des similarités notamment avec au moins 90% d'identité de dites séquences.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
Les figures 1A-1 B et 2A-2B représentent des gels d'électrophorèse d'agarose de diverses séquences d'acides nucléiques en présence ou non des protéines R350 et/ou R354.
La figure 3 est un schéma du mode d'action hypothétique de l'hél icase R350 et la nucléase R354.
La figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN.
La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action de l'ARN sur la réplication de l'ADN en présence d'ADN polymérase.
La figure 6 montre les constructions des plasmides PP20 et PP21 d'expression des protéines R350 et R354.
Les figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules eucaryotes transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21 sur une membrane de nitrocellulose hybridée avec un anticorps anti-FLAG.
La figure 8A représente le vecteur PP14 comprenant la séquence SEQ.ID. N°25 incluant le système Mimivire modifié de la séquence SEQ. ID. N°22 comprenant une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID. N°23.
La figure 8B représente le vecteur pACYC184 portant une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline (SEQ.ID. N°23).
Les figures 9 à 11 et 13 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition de la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14. La figure 12 montre les résultats de l'action du système Mimivire testée à l'aide d'une amplification (PCR) du gène de résistance à la tétracycline à partir de la culture bactérienne.
Les figures 14 et 15 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition de la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP37.
La figure 16 montre des résultats comparatifs relatifs à la capacité du système Mimivire à abolir la résistance des bactéries à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP37, en milieu liquide.
La figure 17 montre les résultats mettant en évidence que l'action du système Mimivire n'est pas due à l'expression de protéines létales mais à l'abolition du gène de la résistance à la tétracycline.
Les résultats des exemples d'expériences réalisées sont rapportés ci-après (paragraphes I.A, I. B, I.C) et les matériels et méthodes sont explicités en fin de description (Paragraphe II). Un listage de séquences reprend des séquences SEQ. ID. N°1 à 40 mentionnées ci-après.
On a réalisé ci-après deux séries d'expériences. La première série d'expériences (I.A) vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire. La deuxième série d'expériences (I. B, I.C) vise à confirmer les résultats mis en évidence précédemment en utilisant le système MIMIVIRE pour modifier un gène rapporteur dans des cellules eucaryotes (I. B) en réalisant l'inactivation d'un gène rapporteur qui sera facilement identifiable, pour modifier une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline dans un système procrayote ( E.coli ) (I.C. l), pour vérifier la capacité du système Mimivire à abolir la résistance des bactéries à la tétracycline en milieu liquide (I.C.2), pour vérifier si la mort d'un système procaryote ( E.coli ) en présence de tétracycline est due à la modification d'une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline dans ledit système par le système Mimivire (I.C.3) sans médiation protéique. I.A) Première série d'expériences vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire.
1) On a utilisé les 2 protéines recombinantes R354 (Nucléase) et R350 (Hélicase) sur différents substrats nucléiques notamment (a) IORF4 du virophage zamilon de 594 nucléotides (produit amplifié par les amorces SEQ. ID. N° 12 et 13 du tableau 1 ci-après) qui porte la séquence répétée de 15 nucléotides du virophage zamilon (SEQ. ID. N°6) ainsi que (b) le gène R349 (SEQ. ID. N°5), tous 2 obtenus par PCR avec les amorces de séquences SEQ.ID.N0 10 à 13 du tableau 1). Les figures IA et IB représentent des gels d'électrophorèse d'agarose (1%) de séquences d'ADN des gènes amplifiés par PCR de la séquence ORF4 de zamilon (fig.lA) et du gène R349 de Mimivire (fig.lB) traités avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
Seule une activité exonucléasique de la protéine R354 a été observée avec dégradation totale non spécifique de l'ADN (Figures IA et IB).
2) On a recherché si l'action du système Mimivire impliquerait l'assistance de l'ARN correspondant à la séquence répétée, qui formerait ainsi un hétéroduplexe avec le simple brin de IORF4 notamment lors de la réplication de l'ADN du virophage et provoquerait ainsi l'arrêt de la réplication de l'ADN virophage.
Pour ce faire, on a réalisé des tests in vitro utilisant une matrice d'ADN synthétique correspondant à (a) une zone de 130 nucléotides de IORF4 de zamilon incluant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 8 et séquence anti-sens ou« reverse SEQ. ID. N° 9) et (b) un ARN de 15 nucléotides correspondant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 18 et séquence anti-sens ou « reverse » SEQ. ID. N° 19). Après hybridation, l'action de la nucléase R354, hélicase R350ou nucléase + hélicase a été testée. La figure 2A représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant l'ADN simple brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage zamilon, avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
La figure 2B représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant l'ADN double brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage zamilon, avec une protéine R354 (colonnes N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
Le résultat montre de façon surprenante que l 'hé I i case coupe au niveau du l'héteroduplexe alors que le nucléase dégrade totalement la matrice ADN (Figure 2A). Parallèlement, aucune action des deux protéines n'a été observée sur le double brin (Figure 2B).
Ces résultats suggèrent que la protéine codée par le gène R350 a une fonction d'endonucléase contrairement aux prédictions bioinformatique (hélicase). Afin de déterminer le site de coupure de manière exacte, les fragments issus de cette digestion ont été séquencés. Le séquençage nous a permis de situer entre la 8ieme et 9ieme nucléotide de la séquence répétée le site de coupure (TGATAATG vAATCTGA).
Ceci suggère que son action n'intervient que sur l'hétéroduplexe ADN/ARN retrouvé notamment lors de la réplication de l'ADN. Le mécanisme de résistance de Mimivirus envers zamilon pourrait s'opérer à travers l'introduction de cette coupure au niveau de IORF4 de zamilon par la protéine codée par le gène R350 suivie par la dégradation par la nucléase R354 comme illustré sur le schéma de la figure 3 sur laquelle l'ARN est référencé par A, la protéine R350 par B, et la protéine R354 par C. La figure 3 illustre le mode d'action de l'hélicase et la nucléase sur IORF4 de zamilon in vivo.
De plus, on a observé que la présence de cet ARN de séquence répétée bloque la polymérisation d'une zone de IORF4 de zamilon incluant la séquence répétée et génère des formes tronquées (Figure 4). On peut donc en inférer qu'à l'échelle de la réplication de zamilon, la réplication est stoppée comme illustré dans la figure 5 au niveau de IORF4.
La Figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN de séquence complémentaire (SEQ. ID. N° 18 et 19) à l'unité de séquence répétée sur la réplication d'un oligonucléotide de 130 bases (SEQ. ID. N° 8 et 9) correspondant la séquence de IORF4. On a réalisé l'electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (15 % PAGE) d'un ADN synthétique (sens (SEQ. ID. N° 8) ou anti-sens (SEQ. ID. N° 9) utilisé comme matrice par l'ADN polymérase ADN dépendante (Klenow) après une hybridation préalable avec un ARN complémentaire correspondant à l'unité de séquence répétée (SEQ. ID. N° 18 et 19). Les contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions en absence de Klenow (C= sans Klenow) ou d'ARN ( + = avec ARN ou - = sans ARN).
La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action de l'ARN complémentaire à l'unité de séquence répétée (1) sur la réplication de l'ADN (2) en présence d'ADN polymérase (3) montrant l'importance cruciale de cet ARN dans le processus d'action du système Mimivire.
I.B) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules eucaryotes.
On a cherché à confirmer les résultats précédemment mis en évidence en utilisant le système MIMIVIRE dans un système eucaryote en effectuant l'inactivation d'un gène rapporteur facilement identifiable. On a choisi d'inactiver le gène de la Green Fluorescent Protein (GFP) dans la lignée de cellules humaines HEK293. Dans un premier temps, on a cloné respectivement les gènes R350 et R354 étiquetés FLAG et flanqués des séquences NLS dans les plasmides pcDNA3.1/Hygro ou pcDNA3.1/Zeo comme illustré dans la figure 6.
La figure 6 montre les constructions des plasmides de transfection PP20 et PP21 utilisées dans cette étude pour valider le système MIMIVIRE dans lesquels les gènes MIMI_R354 (nucléase) et MIMI_R350 (hélicase) sont sous le contrôle du promoteur CMV et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser l'hélicase et la nucléase dans le noyau de la cellule.
On a transfecté les cellules 293GFP avec ces plasmides afin d'établir une nouvelle lignée de cellules HEK293 GFP qui exprime les protéines R350 et R354. L'expression de la nucléase et de l'hélicase a été confirmée par Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (figures 7A-7B). Cet anticorps anti-FLAG reconnaît les bandes a 101.6 KDa pour l'hélicase et 70.8 KDa pour la nucléase.
Les Figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules 293GFP. On a réalisé des électrophorèses sur gel 10% SDS-PAGE de 50 pg d'un extrait protéique provenant des cellules 293GFP transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21(Fig.7A) sur une membrane de nitrocellulose hybridée avec un anticorps anti-FLAG au 1:1000 (Fig.7B). Les tailles sont indiquées à gauche en KDa.
Dans un second temps, on a fait synthétiser un ARN de 45 nucléotides (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°20-21, tableau 1) comprenant 2 unités de séquence spécifique répétées de 15 nucléotides provenant de la GFP (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°29-30, tableau 1) et encadrée de la même séquence que l'on peut trouver dans le gène R349 de Mimivirus (tableau 1, séquences sens SEQ.ID.N°20 incluant la séquence SEQ.ID. N°29 et séquences antisens SEQ.ID.N°21 incluant la séquence SEQ.ID. N°30). Cette séquence 15 nucléotides est une partie du guide ARN utilisé pour inactiver le gène de la GFP avec le système CRISPR/Cas9 tel que décrit dans l'article Science. 2014 Jan 3;343:84-87. On a transfecté cet ARN dans les cellules HEK293 GFP qui expriment les gènes R350 et R354. La lecture de ces expérimentations a permis de suivre l'extinction relative de la fluorescence de la GFP par FACS.
I.C) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules procaryotes.
I.C.l. Modification d'une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline chez la bactérie E.coli
On a vectorisé le système dans un vecteur d'expression PP14 (SEQ. ID. N°25) pour procaryote sous contrôle du promoteur T7 inductible par l'IPTG. La séquence du gène R349 a été modifiée (SEQ.
ID. N°7) afin d'agir contre le gène de la résistance à la tétracycline en remplaçant les 15 nucléotides de la séquence répétée de zamilon par 15 nucléotides spécifique du gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°23 : CACCCTGGATGCTGT). Les gènes R350 et R354 ont été ajoutés à la suite du R349 et sont organisés en opéron sous contrôle du promoteur inductible T7 (annexe 1, SEQ. ID. N°22).
Les figures 8A-8B représentent le vecteur Mimivire (PP14-figure 8A) portant la séquence SEQ. ID. N°25 incluant la séquence SEQ.ID.N°22 avec le gène R349 modifié (SEQ. ID. N°7) par une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°23) ainsi que des gènes R350 (SEQ. ID. N°3) et R354 (SEQ. ID. N°4) sous la commande d'un même promoteur T7 (SEQ. ID. N°31) avec une organisation en « opéron » à l'aide de séquences d'opéron Lac (SEQ. ID. N°32), séquence de Shine-Dalgarno et terminateur T7 (SEQ. ID. N°33). Le vecteur PP14 dans lequel sont clonés les gènes R349, R350 et R354 fait partie de la famille des vecteurs pET qui sont des vecteurs d'expression chez les bactéries. Ces vecteurs embarquent entres autres, un promoteur T7 inductible c'est-à-dire que l'expression ne se fait qu'en présence d'un certain composé dans le milieu de culture à savoir l'IPTG (Isopropyl b-D-l-thiogalactopyranoside). Ce vecteur permet de synthétiser de manière constitutive une protéine appelée lacl qui se fixe sur la séquence Lac operator et ainsi bloque la transcription du gène cloné en aval du promoteur T7 du fait que la T7 ARN polymérase fixée au préalable sur le promoteur T7 ne peut pas transcrire le gène à cause de l'encombrement stérique que lui crée la présence de la protéine lacl. Néanmoins, en présence d'IPTG, la protéine lacl se complexe avec cette molécule IPTG entraînant un changement de conformation de la protéine lacl la rendant incapable de se fixer sur la séquence lac operator, ce qui permet à la T7 RNA polymérase de transcrire le gène cloné en aval du promoteur T7. Et, le terminateur T7 stoppe la T7 RNA polymérase à la fin de la transcription.
La séquence Shine-Dalgarno est reconnue par le ribosome de la bactérie. Chez les bactéries il est possible de faire traduire un ARN messager dit « polycistronique » c'est-à-dire qui contient la transcription de plusieurs gènes à la suite selon une organisation en « opéron ». Pour ce faire, chaque partie de TARN messager qui contient la transcription d'un gène doit être précédée d'une séquence Shine- Dalgarno reconnue par le ribosome qui pourra donc se fixer dessus et initier la traduction de l'ARN messager.
En présence de l'IPTG dans le milieu, on réalise la transcription en ARN du R349 modifié qui embarque les 4 unités repeat correspondant à la tétracycline d'une part et d'autre part, on réalise la transcription d'un autre ARN messager qui embarque les gènes R350 (hélicase) et R354 (nucléase). Les 2 transcriptions sont indépendantes l'une de l'autre.
Ce vecteur PP14 est ensuite transféré par électroporation dans des bactéries E.coli BL21 préalablement transformées par le vecteur pACYC184 (figure 8B) permettant l'expression du gène de la résistance à la tétracycline. Les bactéries sont établies selon différentes dilutions sur boite LB/agar contenant soit Ampiciline/Tetracycline/IPTG (50pg/ml ; 12pg/ml ; O.lmM respectivement) soit Ampiciline/IPTG (50pg/ml ; ImM respectivement).
Les figures 9 à 11 et 13 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition de la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14.
La Figure 9 montre les résultats de le la première expérience. Sur les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 16 ; 3 et 48 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/10 ; 1/50 ; et au reste de la transformation. Sur les boites
Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 0 ; 0 et 8 bactéries.
La Figure 10 montre les résultats de la seconde expérience. Sur les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 5 et 28 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/5 et au reste de la culture. Volume de départ de 1ml. Sur les boites
Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 9 et 4 bactéries. Ces résultats montrent que le système Mimivire permet bien d'abolir la résistance à la tétracycline. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences assurant de la présence ou l'absence du vecteur conférant la résistance à la tétracycline.
Dans un premier temps, on a testé l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire par l'IPTG sur la croissance d'E. coli BL21- DE3 doublement transformée (pACYC184 et PP14).
La Figure 11 montre l'effet de l'induction du système Mimivire : Les bactéries contenant le vecteur pACYC184 sont électroporées avec le vecteur PP14 contenant le système Mimivire et étalées à volume égal sur des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline +ou- IPTG. Sur la figure 11, on voit clairement que l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire se traduit par la diminution drastique du nombre de colonies quel que soit l'antibiotique.
Suite à ces résultats, on a voulu caractériser des clones bactériens doublement transformés du système Mimivire. Pour ce faire, on a mis en culture les clones bactériens issus des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline sans IPTG, en milieu Ampicilline +IPTG dans le but d'activer le système Mimivire et en parallèle, les mêmes clones sont mis en culture en milieu Ampicilline sans IPTG comme control négatif. L'action du système Mimivire est testée à l'aide d'une amplification (PCR) du gène de résistance à la Tétracycline à partir de la culture bactérienne. Dans l'hypothèse d'une action du système Mimivire, cette amplification devrait être impossible.
Un test de l'action du système Mimivire par PCR a été réalisé à partir de la culture bactérienne de 10 clones issus de la boite LB/Agar Ampicilline/Tétracycline et poussé 16h en Ampicilline seul ou Ampicilline + IPTG.
Le résultat de la PCR montre l'amplification d'un fragment de 1.3 kb correspondant au gène de résistance de la tétracycline.
Dans les conditions expérimentales utilisées pour l'amplification du gène de résistance à la tétracycline, ce résultat ne permet pas de visualiser une absence totale ou partielle du vecteur pACYC184 portant le gène de résistance à la Tétracycline. Une faible présence de vecteur intact peut engendrer un fragment lors de l'amplification et expliquer ainsi les résultats obtenus dans la figure 12. Une amplification en temps réel (q PCR) a permis une meilleure interprétation de l'action du système Mimivire.
Il est à noter que sur les 10 clones, 2 seulement ont poussé en milieu Ampicilline/IPTG (clone 7 et 10) alors que les 10 clones ont poussé en milieu Ampicilline seul . Ce dernier résultat montre majoritairement que l'induction du système Mimivire à un effet sur la pousse des bactéries tout comme le résultat issu de la figure 11.
La Figure 13 montre l'étalement du clone 7 sur boite Tétracycline (284 bactéries) avec IPTG et sur boite Tétracycline (402 bactéries) sans IPTG à une dilution correspondante à 103 CFU théorique.
Le clone 7 répond à l'induction du système Mimivire via l'IPTG car on passe de 346 (boites Ampicilline/IPTG) à 284 bactéries (boites Tétracycline/IPTG) soit une diminution d'environ 18%, alors que l'on ne montre pas de différence notable sur le contrôle sans IPTG (passage de 393 à 402 bactéries).
L'absence de colonies sur tétracycline confirme une action du système Mimivire sur l'inhibition de la résistance à la Tétracycline.
I.C.2. Etude de la capacité du système Mimivire à abolir la résistance des bactéries à la tétracycline en milieu liquide
Des bactéries E.coli ont été transformées avec le plasmide pACYC184 contenant le gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°35).
Le vecteur Mimivire PP37 porte la séquence SEQ. ID. N°40 incluant la séquence SEQ.ID.N°37 avec le gène R349 modifié (SEQ. ID. N°38) par une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°39) ainsi que des gènes R350 (SEQ. ID. N°3) et R354 (SEQ. ID. N°4) sous la commande d'un même promoteur T7 (SEQ. ID. N°31) inductible par l'IPTG, avec une organisation en « opéron » à l'aide de séquences d'opéron Lac (SEQ. ID. N°32), séquence de Shine-Dalgarno et terminateur T7 (SEQ. ID. N°33).
Le vecteur PP37Vector (SEQ ID n° 40) dans lequel sont clonés les gènes R349, R350 et R354 fait partie de la famille des vecteurs pET qui sont des vecteurs d'expression chez les bactéries. Ces vecteurs embarquent entres autres, un promoteur T7 inductible c'est-à-dire que l'expression ne se fait qu'en présence d'un certain composé dans le milieu de culture à savoir l'IPTG (Isopropyl b-D-l- thiogalactopyranoside). Ce vecteur est le même que celui du vecteur PP14 mais avec les 15 nucléotides spécifiques du gène de résistance à la tétracycline correspondant à la SEQ. ID. N°39 : CGGCTCTTACCAGCC.
Les bactéries E.coli BL21 préalablement transformées avec le plasmide pACYC184 ont été transformées avec le vecteur PP37Vector. Les bactéries ont été étalées sur des boîtes contenant 100 mg/L d'ampicilline et 12 mg/L de tétracycline supplémenté ou non avec ImM d'IPTG.
La Figure 14 montre les résultats de la première expérience. Sur les boites Amp/Tet on dénombre (de gauche à droite) 1597 et 259 bactéries pour des dilutions étalées correspondant respectivement au 1/1 et 1/10. On constate que sur les boites Amp/Tet/IPTG, on n'obtient aucune bactérie.
La Figure 15 montre les résultats de la seconde expérience. Sur les boites Amp/Tet on dénombre (de gauche à droite) 562 et 60 bactéries pour des dilutions étalées correspondant respectivement au 1/1 et 1/10. Volume de départ de 1ml . On constate que sur les boites Amp/Tet/IPTG, on n'obtient aucune bactérie.
Les résultats obtenus (figure 14 et 15) montrent l'absence de colonies sur l'agar contenant de la tétracycline en présence d'IPTG qui induit l'expression des protéines du système Mimivire. Ces résultats mettent en évidence la capacité du système Mimivire à abolir la résistance des bactéries à la tétracycline causant la mort des bactéries.
L'induction du système MIMIVIRE a été testée dans u n milieu liquide. Pour ce faire, deux colonies d'Escherichia coli présentant les plasmides PP37Vector et pACYC184, ont été sélectionnées sur des boîtes contenant de l'ampicilline (100 mg/L) et de la tétracycline (12 mg/l) et cultivées dans 2 mL de milieu contenant de l'ampicilline (100 ug/L) et (12 ug/mL) à 37°C sous agitation à 200 rpm. Après 2 heures, chaque culture a été divisée en deux tubes dans lesquels un tube a été supplémenté avec ImM d'IPTG pour induire l'expression des protéines du système Mimivire. A intervalle de temps régulier, 10 pl ont été dilué dans 1 ml_ à partir duquel 100 pL ont été étalé sur des boîtes d'agar contenant 100 pg/L d'ampicilline et 12 pg/mL de tétracycline.
Tel que présenté en figure 16, l'induction de l'expression des protéines du système Mimivire par l'IPTG induit la mort des bactéries 4 heures après induction. On constate en effet que 30 et 20 fois moins de colonies ont été obtenues pour le clone 1 et le clone 2 respectivement après addition d'IPTG. Ces résultats mettent en évidence la capacité du système Mimivire à abolir la résistance des bactéries à la tétracycline en milieu liquide, causant la mort des bactéries.
I.C.3. Vérification de l'implication de protéines médiatrices dans l'activité du système Mimivire
Pour exclure l'expression de protéines létales par le système Mimivire dans les bactéries E.coli, leur viabilité a été testée sur différents milieux. Pour ce faire, 4 colonies d 'E.coli présentant les plasmides PP37Vector et pACYC184 ont été collectées et cultivées dans lmL de milieu contenant de l'ampicilline et de la tétracycline à 37°C sous agitation à 200 rpm. Après deux heures, chaque culture a été supplémentée avec 1 mM d'IPTG pour induire l'expression des protéines du système Mimivire. Après 4 heures, 10 pL ont été dilués dans 1 ml_, puis 100 pL ont été étalé sur des boîtes d'agar contenant de l'ampicilline et de la tétracycline ou contenant de l'ampicilline mais pas de tétracycline.
Les résultats présentés en figure 17 confirment que la mort des bactéries n'est pas due à l'expression de protéines létales mais à l'abolition de la résistance à la tétracycline. Ces résultats permettent de prouver que l'activité Mimivire peut être transférée dans E. coli pour agir contre un gène cible en incluant 15 séquences spécifiques répétées de nucléotides de ladite séquence. La substitution de 15 nucléotides de la séquence Zamilon par 15 nucléotides spécifiques du gène de résistance à la tétracycline n'a pas créé de protéine abortive. Seuls les acides aminés codant pour la séquence répétée DN ES du Zamilon ayant été mutés. Ces résultats excluent la possibilité que le système Mimivire soit médié par des interactions protéiques.
II) Matériels et Méthodes
1) Traitement enzymatique
Les réactions enzymatiques ont été effectuées en incubant chaque produit de PCR, de transcription in vitro (IVT) ou d'amorce avec la nucléase (R354), l'hélicase (R350) ou les deux enzymes. Les réactions enzymatiques ont été conduites dans du tampon CutSmart® (Ref: B7204S) de New England Biolabs (acétate de potassium 50 mM, acétate de trisium 20 mM, acétate de magnésium 10 mM, 100 ug ml-1 de BSA, pH 7,9) à 32° C pendant 2 heures, en utilisant une concentration de protéine de 0,5 mg . ml-1 pour chaque enzyme. Après incubation, toutes les réactions ont été traitées par la protéinase K pour éviter que l'ADN ou l'ARN ne se répande dans les puits des gels. Après incubation, les produits des réactions enzymatiques ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose (1,5%) ou de PolyAcrylamide dénaturant (d PAGE) à 15%. Les contrôles ont été effectués avec les mêmes conditions, en absence de l'enzyme R354 ou R350.
2) Conditions de cultures.
2.1) Dans des cellules eucaryotes :
Les amibes Acanthamoeba castellanii (ATCC 30010) ont été ensemencées à 5 x 106 dans le milieu salin amibien (PAS) de Page comme décrit précédemment (7). La lignée H EK293 GFP (cellules humaine de rein embryonnaire, Clinisciences) a été cultivée à 37°C dans un incubateur à C02 à 5% dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DM EM) additionné de 10% de FBS (Gibco), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml . Streptomycine et 100 pg / ml d'acide aminé non essentiel.
2.2) Dans des cellules procaryotes :
Les bactéries Escherichia Coli One Shot™ BL21 (DE3) chimiquement compétente (Thermo Fischer, Réf: C600003) ont été cultivées dans du milieu Luria-Bertani (LB) avec un antibiotique approprié. Les bactéries ont été étalées sur LB-agar avec un antibiotique approprié (12pg / ml pour la tétracycline et 50pg / ml pour l'ampicilline). Le système Mimivire a été induit par l'ajout de 0,2 mM d'isopropyl b-D-l-thigalactopyranoside (IPTG) sur des plaques de LB- agar.
3) Test d'infection et de transfection.
Les amibes A. Castellanii ont été infectées ou co-infectées respectivement avec Mimivirus ou Mimivirus et le virophage zamilon en utilisant une MOI de 10. Les cellules ont ensuite été incubées à 32 ° C et à des points réguliers post-infection, les cellules ont été recueillies pour l'extraction d'ARN avec le Kit d'isolation mirRena™ miRNA (Ambion). Les cellules 293GFP ont été ensemencées sur des plaques 6 puits (Corning) 48 h avant la transfection à une densité de 300 000 cellules/puits. Les cellules ont été transfectées à 80-90% de confluence en utilisant la Lipofectamine 2000 (Life Technologies) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Un total de 4 ug de PP20vector/PP21vector (hébergeant respectivement la séquence NLS- R350-NLS et N LS-R354-N LS) ont été utilisés pour la transfection. MIMI_R354 (Nucléase) et MIMI_R350 (Hélicase) sont marqués par 3 séquences FLAG à l'extrémité N-terminale (3xDYKDDDDK) pour confirmer l'expression des protéines correspondantes par des expériences de Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (Clone M2, Sigma). Le lendemain, ces cellules sont ensemencées dans une flask T75. Une sélection avec de l'hygromycine (100 ug / ml) et de la zéocine (100 ug / ml) a été appliquée au jour 3 après la transfection. Ces cellules ont été cultivées dans ces conditions pendant 3 semaines afin d'isoler des cellules doublement transfectée stables (lignée 293GFP [PP20 / PP21]).
4) Test de transformation.
Les plasmides utilisés dans ces expériences sont le PP14 synthétisé par Genscript hébergeant une expression inductible du système Mimivire sous le contrôle du promoteur T7 (voir l'annexe 1 et la figure 8 A), le vecteur PP37 hébergeant une expression inductible du système Mimivire sous le contrôle du promoteur T7 (voir l'annexe 2), et le vecteur pACYC184 (société Mo Bi Tec Ref: V32402). Les bactéries Escherichia Coli One Shot™ BL21 (DE3) a été transformé par le plasmide pACYC184 selon le protocole et les instructions du fabricant. Les bactéries ont été étalées sur une plaque de LB-agar tétracycline (Tet) (jour 1). Le lendemain, un clone a été prélevé et cultivé dans 10 ml de milieu LB sélectif Tet pendant une nuit à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Au jour 3, 200 pl de la culture ont été inoculés dans 20 ml de milieu LB+Tet frais jusqu'à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,7. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 7000 tr / min pendant 1 minute à 4° C et lavées trois fois avec du glycérol 10%. Après la première centrifugation, toutes les étapes ont été réalisées sur glace et en chambre froide. Les bactéries ont été remises en suspension dans 50 ul de glycérol 10% et 200 ng de vecteur PP14 ont été ajoutés. Le mélange a été transféré dans une cuvette Gene Puiser® avec un espace de 0, 1 cm (Bio-Rad, Réf 165-2089) et une impulsion électrique a été produite avec le MicroPulser Electroporator (Bio-Rad, Réf: 165-2100) en utilisant le programme Ecl . Le temps d'électroporation indiqué par le dispositif après l'impulsion était de 5,8 ms. Après électroporation, 1 ml de LB a été ajouté immédiatement et incubé pendant 1 heure à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Plusieurs dilutions ont été étalées sur des plaques de LB-agar sélectif Tet / Amp/IPTG ou Amp/IPTG et incubées pendant une nuit à 37° C. Le lendemain, les colonies ont été comptées.
5) Clonage, expression et purification. Les séquences des gènes codant pour la protéine R350 et R354 de Mimivirus ont été optimisées pour maximiser l'expression dans E.coli et synthétisé par GenScript. La protéine R354 inclut u ne étiquette polyhistidine (SEQ. ID. N°34) à l'extrémité C-terminale. La séquence du R349 reste inchangée à l'exception de l'unité repeat de 15 nucléotides qui correspond à une séquence de la tétracycline (SEQ.ID. N°7 incluant SEQ.ID. N°23 répétée 4 fois ou SEQ. ID. N°38 incluant SEQ. ID. N°39 répétée 4 fois). Ces gènes ont été inséré entre les sites de coupure Xbal et Xhol du plasmide pET22b ( + ) (annexe 1, SEQ.ID. N°22).
Les protéines recombinantes ont été exprimées dans E. coli BL21 (DE3) -pGro7 / GroEL (TaKaRa) en utilisant un milieu ZYP-5052. Chaque culture a été cultivée à 37° C jusqu'à obtention d'une absorbance à 600 nm de 0,8 suivie de l'addition de L-arabinose (0,2% m / v) et d'une induction avec une transition de température à 18° C pendant 20 h. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5 000 g, 30 min, 4° C) et les culots résultants ont été remis en suspension dans du tampon de charge (20 mM M ES pH 6,0) et conservés à -80° C pendant une nuit. Les cellules congelées ont été décongelées et incubées sur de la glace pendant 1 h après addition de lysozyme et de fluoru re de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à des concentrations finales respectives de 0,25 mg ml-1 et 0, 1 mM. Les cellules partiellement lysées ont ensuite été perturbées par trois cycles consécutifs de sonication (30 s, amplitude 45) effectués sur un système de sonication Q700 (QSonica). Les débris cellulaires ont été jetés après une étape de centrifugation (11 000 g, 20 min, 4° C).
La protéine recombinante a été purifiée en utilisant une colonne échangeuse de cations à partir de 6 ml de RESOURCE S (GE Heathcare) en utilisant un tampon MES 20 mM pH 6,0 et un gradient linéaire à 0,5 M de NaCI dans 10 volumes de colonne. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie (10%) et les activités d'hélicase ont été évaluées sur une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dénaturant comme décrit précédemment (15% de d PAGE). Les fractions actives (générant un clivage au niveau de l'unité répétée de 15 nucléotides de zamilon) ont été regroupées et purifiées davantage en utilisant une Chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (tampon de chargement et de lavage: Tris 50 mM pH 8, NaCI 300 mM, imidazole 20 mM, tampon d'élution : Tris 50 mM pH 8, NaCI 300 mM, imidazole 250 et 500 mM) sur une colonne de 5 ml d'HisTrap FF brut (GE Healthcare). Les fractions ont été analysées en utilisant SDS- PAGE à 10% (coloration de Coomassie) et évaluées en utilisant l'activité hélicase comme décrit précédemment.
6) Extraction ARN et caractérisation
Les cultures obtenues ont été traitées avec le kit mirVana™ miRNA (Ambion). Des fractions enrichies de petits ARN (<200 nt), ainsi que de l'ARN total ont été obtenus. Les échantillons d'ARN ont été caractérisés en utilisant des puces RNA 6000 Pico Total RNA (Agilent) combinées avec le Bioanalyzer Agilent 2100 ou une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (d PAGE-15% acrylamide) pour les petits ARN .
7) Analyse par Northern Blot
Pour confirmer l'expression et la taille de "l'ARN repeat", des hybridations par Northern Blot ont été effectuées en utilisant 10 ug d'ARN total ou 2 ug de petit ARN. Les échantillons d'ARN ont été dénaturés pendant 5 minutes à 95° C dans un tampon de charge contenant 50% de formamide suivi d'un refroidissement immédiat sur de la glace. Des échantillons d'ARN ont été passés sur des gels de Polyacrylamide dénaturants à 15% d'urée (d PAGE), électrobiotés sur des membranes Hybond N + (GE Helathcare) à 20 V pendant 1 heure en utilisant un transfert semi-sec (Hoefer TE 77, GE Healthcare). La membrane est ensuite cross-linked aux UV pendant 2min.
Les sondes (LNA), par ex. 5'-TCA-GAT-TCA-TTA-TCA-G-3 'et 5'- CTG-ATA-ATG-AAT-CTG-A-3', avec de la digoxigénine (DIG) aux deux extrémités, ont été acheté auprès d'Eurogentec. La pré-hybridation et l'hybridation ont été réalisées en utilisant un tampon Easy Hybridization (Roche Applied Science) à 37° C. Après hybridation, les membranes ont été lavées deux fois en utilisant une solution tampon de faible stringence (2X SSC, 0, 1% SDS) et une solution tampon de stringence élevée (0, 1X SSC, 0, 1% SDS), pendant dix minutes à température ambiante et quinze minutes à 60°C, respectivement.
Les membranes ont ensuite été hybridées avec une sonde marquée au DIG comme recommandé par le fabricant (DIG-System, Roche Diagnostics), à l'exception de la détection de la sonde hybridée qui a été réalisée en utilisant un anti-digoxine monoclonal conjugué à la peroxydase de raifort (Jackson Immunoresearch, 1 : 5000). Après plusieurs lavages, des transferts ont été révélés par des tests de chimioluminescence (ECL, GE Healthcare). Le signal résultant a été détecté sur Hyperfilm™ ECL (GE Healthcare) en utilisant un processeur de film automatisé (Hyperprocessor™, GE Healthcare).
8) Transcription in vitro
Toutes les transcriptions in vitro ont été réalisées selon les instructions et les recommandations du fabricant (Kit MegashortscriptTM de Thermofisher, ref: AM 1354). Brièvement, les matrices ADN ont été hybridées avec des amorces incluant les promoteur T7 et opéron lac (SEQ.ID. N°14-15 et 16-17) et mélangées avec le tampon de réaction T7 (1 x), une solution de T7 NTP (7,5 mM), l'enzymes T7 (2 ul pour une réaction de 20 ul) pendant 4 heures à 37° C. Les matrices d'ADN ont été dégradées par TURBO DNase (2 U) pendant 15 minutes à 37° C. Les transcrits d'ARN ont été précipités à l'éthanol . Les culots finaux ont été remis en suspension dans de l'eau exempte de nucléase.
9) PCR avortée
Les matrices ADN ont été incubées avec les ARN complémentaire correspondant à l'unité repeat de zamilon de 15 nucléotides (SEQ.ID. N°18-19) ainsi qu'une amorce d'élongation à 95°C pendant 5 minutes puis en les refroidissant progressivement jusqu'à 25°C. Tous les mélanges ont été incubés avec 5 U de Klenow exo-, provenant de ThermoFisher ( réf : EP0422) pendant 1 heure à 37°C. Les contrôles ont été effectués avec les mêmes conditions à sans l'ARN ou Klenow.
10) Purification des ARNs ou ADNs à partir de gel de polyacrylamide
La récupération d'acide nucléique à partir de bandes de polyacrylamide excisées à partir de gels a été réal isée par la méthode d'écrasement et de trempage comme décrit précédemment (18).
11) Séquençage des ARN et ADN
Les échantillons d'ADN simple brin de 65 nucléotides ont été séquencés sur la technologie MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). L'approche RNAseq a été choisie et les banques ont été construites en utilisant Truseq stranded mRNA strategy et ont été barre-codé avec un autre projet RNAseq.
Les échantillons ont été mesurés sur le Nanodrop et le volume maximum de 16,5 pL, compris entre 36 et 160ng, a été impliqué pour synthétiser l'ADN du second brin. La procédure d'ARNm brin Truseq a été suivie à partir de là et toutes les étapes de purifications d'Ampure ont été remplacées par une précipitation alcoolique en raison de la petite taille des fragments d'ADN . Les profils de bibliothèques ont été visualisés par bioanalyseur DNA1000 (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA, USA) à 71, 78, 130 paire de bases. La concentration finale des banques ont été de 143 et 333 nmol/l pour les 6 échantillons.
Les banques ont été normalisées à 2 nM et regroupées. Après une étape de dénaturation et une dilution à 15 pM, le pool a été chargé sur la cartouche de réactif, puis sur l'instrument avec la cellule d'écoulement. La génération automatisée de grappe et l'exécution de séquençage ont été effectuées sur le kit MiSeq Reagent V3 en 150 cycles. Une information totale de 5 Gb a été obtenue à partir d'une densité de grappe de 1618 K / mm2 avec un filtre de contrôle de qualité passant de 85,6% (18644000 lectures de paires appariées). Au sein de cette série, les représentations de l'indice ont été déterminées comme étant respectivement de 0,69%, 0,47%, 0,84%, 0,65%, 0,76% à 0,94%. Le minimum de 152 675 au maximum de 302 220 lectures appariées en fonction des échantillons conduit à un nombre global de 1 407 155 lectures appariées qui ont été ajustées puis analysées.
12) Test Mimivire
Les cellules 293GFP [PP20 / PP21] ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits à 150000 cellules/puits 24h avant la transfection. Les cellules ont été transfectées en utilisant la lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Un total de 30 pmol d'ARN a été utilisé pour la transfection. Les cellules transfectées ont été analysées par FACS trois jours après la transfection.
13) SDS-PAGE et Western Blot
Les cellules transfectées ou non ont été lysées par sonication dans un tampon de solubilisation (urée 7 M, thiourée 2 M, Tris 30 mM, CHAPS 4% (p / v) et centrifugées à 10 000 g, 20 min, 4 ° C. Les protéines solubles ont été collectées et la concentration a été déterminée en utilisant le Bio-Rad De Protein Assay (Bio-rad).
Cinquante microgrammes de protéines solubles ont été fractionnés sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% puis révélés par InstantBIue Protein Stain (Expedeon). De plus, des protéines résolues ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Trans-blot
Transfer Medium, Biorad, Hercules, CA, USA) à 100 V pendant 1 h en utilisant une unité de transfert semi-sèche (Hoefer TE 77, GE
Healthcare, Vél izy-Vi I la cou bl ay, France). Les membranes ont ensuite été bloquées dans du PBS additionné de 0,3% de Tween-20 et de 5% de lait écrémé en poudre (PBS-Tween-Milk) pendant 1,5 h et incubées avec des anticorps anti-FLAG monoclonaux de souris (1 : 1000). Les bandes immunoréactives ont été détectées en utilisant une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de la peroxydase (GE Healthcare, Vélizy- Villacoublay, France) diluée à 1 : 5000 dans le tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante. Trois lavages de 15 min ont été appliqués entre chaque étape. Les bandes immunocolorées ont été visualisées avec le kit à base de chimioluminescence, tel que décrit par le fabricant (GE Healthcare, Vél izy-Vi I la co u bl ay, France). Le signal résultant a été capturé par un système d'imagerie Fusion FX7 (Vilber Lourmat, France).
14) Prédiction de structure secondaire pour l'ARN hébergeant deux séquences répétées de GFP de 15 nucléotides
Les structures secondaires ont été prédites en utilisant le serveur web Mfold. Nous avons conservé la structure secondaire avec l'énergie libre minimale.
15) Digestion sur gel et spectrométrie MALDI-TOF
Les bandes excisées des gels ont été décolorées et soumises à une digestion dans le gel avec de la trypsine (Proteomics grade trypsine, Agilent Technologies, Cedar Creek, TX). Les peptides tryptiques ont ensuite été extraits du gel par des traitements successifs avec de l'eau et de l'acétonitrile (qualité H PLC). Les extraits ont été regroupés et concentrés dans un évaporateur Speedvac. La solution de peptides a ensuite été déposée sur la cible d'ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI). Les analyses de masse ont été effectuées sur un spectromètre de vitesse Brüker Autoflex Speed MALDI- temps de vol (MALDI-TOF) (Brüker Daltonique, Wissembourg, France). Les spectres de masse ont été calibrés de manière externe en utilisant des peptides de digestion trypsique de sérum albumine bovine (Brüker). Des listes de masse de peptides tryptiques ont été utilisées pour identifier les protéines, en utilisant le logiciel Mascot (Matrixscience). Les recherches ont été effectuées contre une base de données interne contenant la séquence étiquetée de MIMI_R350 (Helicase like), y compris une Étiquette de polyhistidine à l'extrémité amino-N-terminale.
Tableau 1 :
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Annexe 1 :
SEQ.ID. N°22 =insert synthétisé et cloné par genscript dans pET- 22b( + ) aux sites de restriction Xba I/Xho I comprenant successivement les séquences des : a) promoteur T7 (SEQ.ID. N°31) TAATACGACTCACTATAG ; b)opéronLac(SEQ.ID. N°32) G AA TTGTGA G CG G A T AA CAA TTCQ
c) site de restriction Xba 1= TCTAGA ;
d) séquence Shine-Dalgarno: AAGGAGA ; e) première séquence soulignée= SEQ.ID. N°7 du gène 349 modifié incluant l'unité répétée 4 fois tirée du gène de résistance à la tétracycline SEQ.ID. N°23 = CACCCTGGATGCTGT_avec les 3 séquences de spacer intercalées SEQ.ID. N°26,27 et 28, f) premier spacer entre les première et deuxième séquences soulignées incluant le terminateur T7 SEQ.ID. N°33 CTA GCA T AA CCCCTT GGGGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGG / / / / / IG, la séquence du Promoteur T7, SEQ.ID. N0 31 TAATACGACTCACTATAG e. t la séquence du Lac operator, SEQ.ID. N°32 : GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC et une Séquence Shine-Dalgarno; g) deuxième séquence soulignée= Séquence du gène R350 ; h) deuxième spacer entre les deuxième et troisième séquences soulignées incluant une séquence Shine-Dalgarno, et i) troisième séquence soulignée = Séquence du gène R354 ; j) site de restriction Xho I = CTCGAG ; k) séquence de l'étiquette poly histidine
SEQ.ID. N°34 : CACCACCACCACCACCAQ i) le terminateur T7 SEQ.ID.N°33 :
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
SEQ.ID.N°22 : séquences organisées en opéron incluant le gène R349 modifié avec séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline (SEQ ID N°23) et les gènes R350 et 354.
TAA TACGACTCACTA 771 GGG GAA TTGTGA GCGGA T AA CAA TTCCCCX CT AG AAAT AATTTT GT TT AACTTT NKG AA GGA GAT AT AG AT ATGG AATT AATT AGT CGT GT CTTT ACT CAT GG AG AAAA T ATPT ACTT GTT AGTT CT ACAAAT AAGTT AT AT ATT ATGGGT AAT AAT G AAT ATGGTT CAT GT GGTTT CAAAAT AGGT ACAG AT AAAACTT AT ATT G AAAGT CCAGT AT AT ATT G ACATT AAATT A GAT GAT GAT GATT CT GTT AAAGCGTTTT ATT CTT GT AATTT ATT CACG AT G ATTCAT ACAT CCA AAGG AAAAATTT AT CT ATCAAG AT CATTT ATTT GT GGTGG AGGT G AAAT CG AT GCAT AT GAT A GTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGATTCA G A AA AT CAT ACT CAAAAT AAT ACAAAT ACT CCC AT AAAT AAT AT CACACT AATT AATTT G GATT CAT CAAAT AATT CCACT CAAT CCACCCTGG AT GCT GTT AAT G AAT CCACCCT GG AT GCT GT CA AT G AAT CTG AT CAAT CAT GT AGT G ATPT G ACT GT GG ACCT CG AT CCACCCT GGATGCTGTTG AAGAAG I I I I I GTTG ATCGT AAT GAT AAT AATT CAG AT AAT ATT GGT AATT CAAAT AGT AT CA CCCT G G ATGCTGTATCTAT G ACT G AAAAAG CT G G AAT AATTTT GTT AAACG AAATT AAAACC A TGGTAG AT G AAATPT GTCT CAAAAAAAT 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AGCG AT G ACCG ACATT AG CT ACT AT AACAACG AG AT C G AT AAAATT CT GTGG AACAT CCT GGGT G ACG ATT ATTT CACCCAAG ACG AATTT G ACG AT CT G GT G AACAGCGTTGCG AACACCATTT ACCAGT AT G ACAACG AAGT G AGCAT CG AT AAGCTG AAA GT G AT CAT CG AATT CGTT AT CCT G AACAAGTT CAAGCT GTGCT ACAT CT ACG AT AACG ACAGC AT CCT G AACCAAGT G AAAT ACG AG AAG AAAAGCGTT GGT AGCAAAACCAT CGGCAAG AACAG CACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATTAAGCTGAGCGATATTGAGG CGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAATCAGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGAC AAAGTT G AGGT GGCG ACCT ACG AAG ACCT G AT CAGCCACAAGCACG ATT ACCCG AAAG AG AT TT AT AAGG AAAGCCACT ACAT CCGT CGT AACACCCGT CTGG AT GT G AT CAAG AAAATT CCGCA ATTCGAGCAGAAGAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACCGCGACCGCGA
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GTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAGTATGAACAAATCG GCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGTGAGTACGGCCTGCTGCAGCAC AGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGGATGGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGG TGGCCTGAGCAAACTGGTGGGTCGTCTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCA ACAACAGCGGT G AT CTGG ACGGCG AT AT CT GCCCGCACT ACT ATPT CT GCAGGT GCAAACCC
AGCTGTATGTT ACCG AG AT GG ACG AATGCG ACTT CCTGCAGTGCAAAATT G ACG AGT ACG AT AGCTGGG AAG ACTTT GTG AAGG AT AGCAACCCG AT CGTT CCGGGT CT G AGCAAAACCACCAA CCT GG AG AAGGGCT GCCT GATT CAGCT G AGCG ACAAAAACCT G AT CGGCAGCG ACG ACAAGG AAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAA T CG AG AAGTGG ATT AGCAGCG AAAT CAT G AACT ACCACAACAACG ACCT G AGCG AG AACT AT A
T GATT G AT CGT GT G AT CT ACTGGCGT CT G AGCCAAGTT ACCTGCAACCT GATT AAGCTG AACA AAGAAGCGTTCGAGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTTCTGTTTTATC GTCAGCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGATAAC AGCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAAGATAGCAAGTAC G AGCCGCTGT AT CAGG AAG AG ACCG AAT GGCGT AAG AAAT AT AACCAAAT CAAGGCG AAG AA
AGCGCAGATGT ACAAG AACAAG AGCTACAACAAGT ACACCAAGTTCAGCAACCTCGAG CA CCA
CCA CCA CCA CCA CT G AG AT CCGGCT GCT AACAAAGCCCG AAAGG AAGCT G AGTTGGCT GCTG CCACCGCTG AGCAAT AA CTA GCA T AA CCCCTTGGGGCCT C
Figure imgf000041_0002
TG.
Annexe 2 :
SEQ.ID. N°37 = insert synthétisé et cloné par genscript dans pET- 22b( + ) aux sites de restriction Xba I/Xho I comprenant successivement les séquences des : a) promoteur T7 (SEQ.ID. N°31) TAATACGACTCACTATAG ; b)opéronLac(SEQ.ID. N°32) G AA TTGTGA G CG G A T AA CAA TTCC;
c) site de restriction Xba 1= TCTAGA ;
d) séquence Shine-Dalgarno: AAGGAGA ; e) première séquence soulignée= SEQ.ID. N°38 du gène 349 modifié incluant l'unité répétée 4 fois tirée du gène de résistance à la tétracycline SEQ.ID. N°39= CGGCTCTTACCAGCC_avec les 3 séquences de spacer intercalées SEQ.ID. N°26,27 et 28, f) premier spacer entre les première et deuxième séquences soulignées incluant le terminateur T7 SEQ.ID. N°33 CTA GCA TAA CCCCTTGGGGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTTG, la séquence du
Promoteur T7, SEQ.ID. N0 31 TAATACGACTCACTATAG e. t la séquence du Lac operator, SEQ.ID. N°32 : GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC et une Séquence Shine-Dalgarno; g) deuxième séquence soulignée= Séquence du gène R350 ; h) deuxième spacer entre les deuxième et troisième séquences soulignées incluant une séquence Shine-Dalgarno, et i) troisième séquence soulignée = Séquence du gène R354 ; j) site de restriction Xho I = CTCGAG ; k) séquence de l'étiquette poly histidine SEQ.ID. N°34 \ CAC CAC CAC CAC CAC CAC; i) le terminateur T7 SEQ.ID.N°33 :
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
SEQ.ID.N°37 : séquences organisées en opéron incluant le gène R349 modifié avec séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline (SEQ ID N°39) et les gènes R350 et 354.
T AAT ACG ACT CACT AT AGGGG AATT GT G AGCGG AT AACAATT CCCCT CT AG AAAT AATPT GT TT AACTTT AAG AAGG AG AT AT AG AT ATGG AATT AATT AGT CGT GT CTTT ACT CAT GG AG AAAA T ATPT ACTT GTT AGTT CT ACAAAT AAGTT AT AT ATT ATGGGT AAT AAT G AAT ATGGTT CAT GT
GGTTT CAAAAT AGGT ACAG AT AAAACTT AT ATT G AAAGT CCAGT AT AT ATT G ACATT AAATT A
G AT G AT G AT GATT CT GTT AAAGCGTTTT ATT CTT GT AATTT ATT CACG AT G ATTCAT ACAT CCA
AAGG AAAAATTT AT CT ATCAAG AT CATTT ATTT GT GGTGG AGGT G AAAT CG AT GCAT AT G AT A
GTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGATTCA G A AA AT CAT ACT CAAAAT AAT ACAAAT ACT CCC AT AAAT AAT AT CACACT AATT AATTT G GATT
CAT CAAAT AATT CCACT CAAT CCGGCT CTT ACCAGCCT AAT G AAT CCGGCTCTT ACCAGCCCAA
T G AAT CT G AT CAAT CAT GT AGT G ATPT G ACT GT GG ACCT CG AT CCGGCT CTT ACCAGCCT GA
AGAAG I I I I I GTT G AT CGT AAT G AT AAT AATT CAG AT AAT ATT GGT AATT CAAAT AGT AT CGG
CT CTT ACCAGCCAT CT AT G ACT G AAAAAGCTGG AAT AATTTT GTT AAACG AAATT AAAACCAT GGTAG AT G AAATTTT GT CT CAAAAAAAT ATT AATT CT GTTGG AATT AACG AT ATT GTT ATT CG
T CCAAGCGG ACAGT ATGTG AGT AAT ATGGG ATAT ATT ACAG AAT CAGGT AGT GTAT CATTT CA
T ACCAAT AAAAATGGTTTCTT ATT ATT CAAGTCCAAT GTTCAT G AAAT CCTTTT CGTT G AAG AA
AT GTTT AT GT ACT CT AAAAAT AATTTT ATTT ATTT GGCCAT ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCAT
CT CT AAG AG AT ATT GCT CCTTTT CAT ACAATT AAT AAAACAAAAAAT GGT ATT AAAT GG AAGT A TTT CAAAAT AGT GTTT CCATTT G ACACT G AAAAAAT AG AATTTT GT G AT AATTTCTTTT AT ACT
T AT G AAT CCAAT ACTT GTT AT CAT CAT GTT ATTT CATT CT ACAAAAAT GT AAATT ATT AT CCTT
CTT GG AT AT ATTT CAAATCT G AG ATT G AT ATT AAT AGT AAAAAT AT GTT CTTTT CAAGT G AT AC
T AAT AGT GT GT AT GTT AAAG AT AAT AACAACGT GTAT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTT
G AAAAAT ACAT CG AT AACAAACT CG ACTT GG ATGT CGT AATT GTGCCT G AT AGTT AT AG ACCA AT GG AAAT G AG ACT ACT ATT AAAGTT AGGT AT AACATT GTAT AGCG ATT ACAATTTT AAT GG A
T GT G AGG AT G AT G AAG AACAT ATPT CG AAATT AT G AAAAAT CAAT AT GT ACCT CAT ATT AT C
GGTCT G AATT ATTTT G AAAGTTT CATT GT AGTT ATTGT CAAT AAT CCAAAT AT GTT G ACG AT A
ACAACTGACGATGGTAAAA I I I I CTTTAACATTCATGATATTAC I I I I I ACAAAAGATTTTATA
AT GG AAT CGTTT AT CTT G AT AAT GGTT CGTT ATTTT AT CT CACAG AT AGT G AAATTT CAG AT C AAAAT GT AT GG AAACT AACTGG AT GT CAATT GTGT G AGCT AGCTG ATT CT ACCAT AT AT AG I I ACCT ATTT A ATTT ACCG G AC AA AATT G AT G A AATTT ACT CTT CGT CT G A ATTT ATT GTTCT A AA ATT AATT GG AAACAAAT A I I I I I ATTATCCGGTTGAAAATTTTGATACTGCTCAAGATTTTAAG ACAAG AT GTGGGG AAATTT CATT G AAAAAT AATT CAGTT CTT G AACT CGTT AAT ACT AGT ATT ATT AACAG ACAAT CT AAAAGTT AT CAT ACT ACAGT AT CT ATT AAT ATT G AT ACGG ATT GT ACT A CT CAT AATT CTTT CG AG AG ATT GTTT AT CCT G ACACAAT CT CTT AGTT ATT CCGCAG AAT ATT C T ATT CG AATT GT AG ACG ACAAAAAT ATT GGTTTTGGT G AT GGGCCT AAAATT G AATPT GTG A ATCGG CT ATT AT GC AATPT ATT AT AAGT ATTT AATT G CT CAT AATTTT C ACACAG AGTTT AAT TT ACAAG AATTT GCCAAACT G AAACCCACCG AAATT AAAT ATTT GGG AT CAAT GTTT CAT AT G GTT AT CT GT CAAAAT AATT CTT CGTT ACCG ATT AG ATT ACCT CT AGCTTTT GCTGT AG AAATTT AT GG AAAAG AACCCACAATT G AT G AATTGG AAT ATTTT GCTT GT AAT G AAG AT G AAACTGG AT T CAAACAT ATTT AT CCAGCCAAAT ACAAT CCCG AATT AGTT AAAG AATT CGGTT AT G AAT CTT A T G AACATT GT CT AAAAACTTT GTGT AAAT AT AATT AT G AAG AT G AT ACT G AT AAAAAT AT CTT G ACG AAAAAAT ATT GCG AGCAATT AGCT GCCGGTTTT AAAAG AT ACGGCAAT AT CAAG AACAT A AAACAAAT G AATTT ACCCAC ATT G G ACT ATT ACATTT CT G GCCC AT ACAAAATT AAT AG AACCA T ATT AATT AAT AAT CTT GTTTT AT CGGG AGGT AAGG AT AAAAAT AAT AATT ATTT GG AAAT GT T CAAAG AATTT ATT AACT CTTT GT CT G AAAAT G AATT AAAAAT CTTGCTAAAAAATT GG ACAGC AT CAACTT GTGT AAG ACCAG AT AACAAAT AT AG AATT AT CATT ATTT CCAAAT CT AAAAACG CT AAAGCAGGT ATT CG ATTT GGT ACTT GT AATTT AG AAATT CAT AT CG ACG AAAAAAT GTTGG AT G AACAT AAT ATT G AT ACAGT CAAAG AGGTTTT AATT ACACCT GCT CAAGG ATT CAAAG ATT AA GATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGG I I I I I I G AG AT CT CG AT CCC G CG A AATT AAT ACG ACTCACTAT AG GG G A ATT GTG AG CG G AT AACA ATT CCCCACT AG AA AT A ATTTT GTTT AACTTT AAG AAGG AG AT AT AGCAAT G AACCGT CGT AACCGT AGCAACG ACCT GA ACCCGGAGCCGAGCATCGAAAACCCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAAC AGCGT GT AT AAAAGCG ACGGCT ACGTT G AT CT G AAG AACAACGGT CGT CT GTT CCCG AT CT G GATT CT G AAG AACTTT AAACAAT ACAAGCT GCCGG AG AT CATT CGT AAAG AG AACG AAG ACCC GTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCAGGAATTCGTGGGCCAATACCTGA ACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCTGTACCATGGTCTGGGTAGCGGCAAGACCGCG AGCGCG AT CAACCT G AT G AACATT CT GT ACAACT AT G ACAACGGCACCAACTTT AT CGTT CT G ATTAAAGCGAGCCTGCACAACGACCCGTGGATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGA T CCGAGCG AACAG AACGT GG ACAACGTT ACCAAGCTGG AT CGTT ACAAAAACATCCACTT CGT GCACT ATG ACAGCCCGTTCGCGG AT AGCAGCTTTATG AGCGTT ATT AAG ACCCTGGACCTGA GCAAACCG ACCAT GT ACAT CATT G AT G AGGCGCACAACTTT AT CCGT AACGT GT AT AGCAACA TT AACAGCAAACT GGGCAAGCGT GCG AAAGTT AT CT ACG AGT ACAT CAT G AAGG ACAAGCGT G AAAACAAG AACACCCGT AT CGTGCT GATT AGCGCG ACCCCGGCG AT CAACACCCCGTT CG AA CTGGCGCTGATGTTTAACCTGCTGCGTCCGGGTATTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAA CCGT ACCTTT GT G ACCG AAAGCAGCTACCCG AT CCT G AACCCG AT G AAG AAAAACAT GTTT G A GCGTCGTATCCTGGGCCTGGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCGCGTC AAG AACT G AAGT ACAT CAACCTGCCG AT G AGCGCGT ACCAGT AT G AT AT CT ACCGT ATPT CG AGAAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTGGCAAGCAGAGCCAACTGTAC CGT ACCT AT ACCCGT CAGGCGT GCAACTT CGT GTTT CCGT ACGTT AACAT G AACGT G AACGGT GAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGTTCCGTCTGAGCGAAAAACTGGCGGACGATTTTAGCAA GGGCAAAAACCTGGACGTTCCGGATACCGAGAAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGA TT G AG AACT ACCT G AACG AG ACCG AACGTT ATPT CAG AACAT CAACAAG AAAG ACGCGG AG A ACGGTCGT ACCAT CATT AACG ACCTGG AT G AATT CAAG AAAGGCTTT GGT ACCAAGTT CAACA GCTTT CT GCAGT ACT AT CAAAGCG AGGGT CCGCGT AGCAGCCT GCT G ACCG AAAT GT ACAAC T GCAGCCCG AAAAT GCTGGCG AT CGCGTT CAT G ACCT AT ATT AGCCCGGGCAAGGT G AT G AT CT ACAGCAACT AT GTGGTT ATGG AAGGCAT CG ACGTT AT G AAAATTT ACTTT CGTCTG ATCGG TTT CAACG ATPT ACG ATCGCGCGT G AGT ACATGGGCTATT GCG AAT ACCACGGT CGT AT CG A CCCG AAGG AT CGT GT GCGT AT CAAG AACAT GTT CAACG ACAAG AACAACGT GT ACGGCAACAA GTGCAAAGTT 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ACG AATTT G ACG AT CT G GT G AACAGCGTTGCG AACACCATTT ACCAGT AT G ACAACG AAGT G AGCAT CG AT AAGCTG AAA GT G AT CAT CG AATT CGTT AT CCT G AACAAGTT CAAGCT GTGCT ACAT CT ACG AT AACG ACAGC AT CCT G AACCAAGT G AAAT ACG AG AAG AAAAGCGTT GGT AGCAAAACCAT CGGCAAG AACAG CACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATTAAGCTGAGCGATATTGAGG CGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAATCAGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGAC AAAGTT G AGGT GGCG ACCT ACG AAG ACCT G AT CAGCCACAAGCACG ATT ACCCG AAAG AG AT TT AT AAGG AAAGCCACT ACAT CCGT CGT AACACCCGT CTGG AT GT G AT CAAG AAAATT CCGCA ATTCGAGCAGAAGAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACCGCGACCGCGA
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GTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAGTATGAACAAATCG GCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGTGAGTACGGCCTGCTGCAGCAC AGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGGATGGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGG TGGCCTGAGCAAACTGGTGGGTCGTCTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCA ACAACAGCGGT G AT CTGG ACGGCG AT AT CT GCCCGCACT ACT ATPT CT GCAGGT GCAAACCC
AGCTGTATGTT ACCG AG AT GG ACG AATGCG ACTT CCTGCAGTGCAAAATT G ACG AGT ACG AT AGCTGGG AAG ACTTT GTG AAGG AT AGCAACCCG AT CGTT CCGGGT CT G AGCAAAACCACCAA CCT GG AG AAGGGCT GCCT GATT CAGCT G AGCG ACAAAAACCT G AT CGGCAGCG ACG ACAAGG AAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAA T CG AG AAGTGG ATT AGCAGCG AAAT CAT G AACT ACCACAACAACG ACCT G AGCG AG AACT AT A
T GATT G AT CGT GT G AT CT ACTGGCGT CT G AGCCAAGTT ACCTGCAACCT GATT AAGCTG AACA AAGAAGCGTTCGAGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTTCTGTTTTATC GTCAGCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGATAAC AGCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAAGATAGCAAGTAC G AGCCGCTGT AT CAGG AAG AG ACCG AAT GGCGT AAG AAAT AT AACCAAAT CAAGGCG AAG AA
AGCGCAGATGTACAAGAACAAGAGCTACAACAAGTACACCAAGTTCAGCAACCTCGAGCACCA CCACCACCACCACT G AG AT CCGGCT GCT AACAAAGCCCG AAAGG AAGCT G AGTTGGCT GCTG CCACCGCTG AGCAAT AACT AGCAT AACCCCTTGGGGCCTCT AAACGGGTCTT GAGGGG I I I I I TG
LISTAGE DE SEQUENCE
SEQ. ID. N°1 : protéine R350 de Mimivirus
MNRRNRSNDLNPEPSIENPNNQIAEEFPGNNSVYKSDGYVDLKNNGRLFPIWILKN FKQYKLPEIIRKENEDPCNVQVKLELRKYQEFVGQYLNPQGPYTSILLYHGLGSGKT ASAINLMNILYNYDNGTNFIVLIKASLHNDPWMQDLKEWLGRDPSEQNVDNVTKL DRYKNIHFVHYDSPFADSSFMSVIKTLDLSKPTMYIIDEAHNFIRNVYSNINSKLGK RAKVIYEYIMKDKRENKNTRIVLISATPAINTPFELALMFNLLRPGIFPSSELDFNRT FVTESSYPILNPMKKNMFERRILGLVSYYIGATPDLYARQELKYINLPMSAYQYDIY RIFEKLEAEIQERARRRGKQSQLYRTYTRQACNFVFPYVNMNVNGELRPRPGKFRL SEKLADDFSKGKNLDVPDTEKEILNKYTKAIENYLNETERYFQNINKKDAENGRTII NDLDEFKKGFGTKFNSFLQYYQSEGPRSSLLTEMYNCSPKMLAIAFMTYISPGKVMI YSNYVVMEGIDVMKIYFRLIGFNDFTIAREYMGYCEYHGRIDPKDRVRIKNMFNDK NNVYGNKCKVIMLSPSATEGIQLLDIRQEHIMEPYWTEVRIQQVIGRGVRQCSH RD LPMSERIVDIYRYKVIKPENLDPDDTVRQSTDEYVEDQAKSKANLIESFLGAMKEAA VDCELFKEHNMMSQSYYCFKFPESAVTKTNVGPAYREDIKDDVKYDSGLNSKNSIV ERIRVVKVNAVYQINTDNNNPVYSSPTKYWYNKKTGMVYDFETHYPVGQVEFIDN LPNKLDKDTYIMRIDVIIPSITGSVNT
SEQ. ID. N°2: protéine R354 de Mimivirus
MTDISYYNNEIDKILWNILGDDYFTQDEFDDLVNSVANTIYQYDNEVSIDKLKVIIE FVILNKFKLCYIYDNDSILNQVKYEKKSVGSKTIGKNSTNDDEDDDEDIAVIKLSDIE AGENWFKKSPKISSKQFQSVDKVEVATYEDLISHKH DYPKEIYKESHYIRRNTRLDV IKKIPQFEQKSKEWLKQRTESLTATAISVVFDEDPYKHPIVILLDKCGRGLPFVENKF VHHGNKYEQIGTMFYSFRNNVEVGEYGLLQHSGHKFIAASPDGICSKKANTGGLSK LVGRLLEIKFPFSREINNSGDLDGDICPHYYFLQVQTQLYVTEMDECDFLQCKIDEY DSWEDFVKDSNPIVPGLSKTTNLEKGCLIQLSDKNLIGSDDKEKCLYNSKYIYPPKL HMTNEEIEKWISSEIMNYHNNDLSENYMIDRVIYWRLSQVTCNLIKLNKEAFEEKI PLLQQFWDYVLFYRQHSDKLDKLIKFVEKVKEDNSAEIFSYINEDFLSLNKDSKYEP LYQEETEWRKKYNQIKAKKAQMYKNKSYNKYTKFSN
SEQ. ID. N°3: gène R350 de Mimivirus ATGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGCCGAGCATCGAAAAC CCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACAGCGTGTATAAAAGC GACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCCCGATCTGGATTCTG AAGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAAAGAGAACGAAGACC CGTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCAGGAATTCGTGGGCC AATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCTGTACCATGGTCTGG GTAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAACATTCTGTACAACTATG ACAACGGCACCAACTTTATCGTTCTGATTAAAGCGAGCCTGCACAACGACCCGTG GATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGATCCGAGCGAACAGAACGTGG ACAACGTTACCAAGCTGGATCGTTACAAAAACATCCACTTCGTGCACTATGACAG CCCGTTCGCGGATAGCAGCTTTATGAGCGTTATTAAGACCCTGGACCTGAGCAA ACCGACCATGTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGTAACGTGTATAGC AACATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTACGAGTACATCATGA AGGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATTAGCGCGACCCCGG CGATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAACCTGCTGCGTCCGGGTA TTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGTACCTTTGTGACCGAAAGCAGCT ACCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAAAACATGTTTGAGCGTCGTATCCTGGGCC TGGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCGCGTCAAGAACTGA AGTACATCAACCTGCCGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCTACCGTATTTTCGA GAAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTGGCAAGCAGAGCCA ACTGTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGTTTCCGTACGTTAAC ATGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGTTCCGTCTGAGCGAA AAACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGACGTTCCGGATACCGAG AAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATTGAGAACTACCTGAACGAGACCG AACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGAAAGACGCGGAGAACGGTCGTACCATCAT TAACGACCTGGATGAATTCAAGAAAGGCTTTGGTACCAAGTTCAACAGCTTTCTG CAGTACTATCAAAGCGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCTGACCGAAATGTACAAC TGCAGCCCGAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTATATTAGCCCGGGCAAG GTGATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCATCGACGTTATGAAAATT TACTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCGCGTGAGTACATGGGCT ATTGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGTGTGCGTATCAAGAACA TGTT CAACG ACAAG AACAACGT GT ACGGCAACAAGTGCAAAGTT AT CATGCT G A GCCCGAGCGCGACCGAGGGTATTCAACTGCTGGATATCCGTCAGGAGCACATTA TGGAACCGTATTGGACCGAAGTTCGTATCCAGCAAGTGATTGGCCGTGGTGTTC GTCAATGCAGCCACCGTGACCTGCCGATGAGCGAGCGTATCGTGGATATTTACC GTTATAAGGTTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGACGATACCGTGCGTCAAA GCACCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAAGCGAACCTGATTGAGA GCTTCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGCGAGCTGTTTAAGGAAC ACAACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTCCGGAGAGCGCGGTGA CCAAGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGACATCAAGGACGATGTGAAAT ATGATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAGCATCGTTGAGCGTATTCGTGTGGTTA AGGTGAACGCGGTTTACCAAATCAACACCGACAACAACAACCCGGTGTATAGCA GCCCG ACCAAGTACTGGTAT AACAAG AAAACCGGCATGGTTT ATG ACTTCG AG A CCCACTACCCGGTGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTGCCGAACAAGCTGG ACAAAGATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGAGCATTACCGGTAG CGTT AACACCT AA
SEQ. I D. N °4 : gène R354 de M i m ivi rus ATGACCGACATTAGCTACTATAACAACGAGATCGATAAAATTCTGTGGAACATCC TGGGTGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGACGATCTGGTGAACAGCGTTG CGAACACCATTTACCAGTATGACAACGAAGTGAGCATCGATAAGCTGAAAGTGAT CATCGAATTCGTTATCCTGAACAAGTTCAAGCTGTGCTACATCTACGATAACGAC AGCAT CCT G AACCAAGTG AAAT ACG AG AAG AAAAGCGTTGGT AGCAAAACCAT C GGCAAGAACAGCACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATT AAGCTGAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAATC AGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGGCGACCTACGAAGAC CT GATCAGCCACAAGCACGATT ACCCGAAAGAG ATTT AT AAGGAAAGCCACT ACA TCCGTCGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAAAATTCCGCAATTCGAGCAGAA GAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACCGCGACCGCGATTAG CGTGGTTTTTGATGAAGACCCGTATAAACACCCGATCGTTATTCTGCTGGACAAG TGCGGTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAG TATGAACAAATCGGCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGT GAGTACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGGAT GGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCAAACTGGTGGGTCGT CTGCTGG AG ATT AAGTTCCCGTTT AGCCGTG AAAT CAACAACAGCGGTG AT CT G GACGGCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAGGTGCAAACCCAGCTGTAT GTTACCGAGATGGACGAATGCGACTTCCTGCAGTGCAAAATTGACGAGTACGAT AGCTGGGAAGACTTTGTGAAGGATAGCAACCCGATCGTTCCGGGTCTGAGCAAA ACCACCAACCTGGAGAAGGGCTGCCTGATTCAGCTGAGCGACAAAAACCTGATC GGCAGCGACGACAAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCG AAGCTGCACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAGCAGCGAAATCATG AACTACCACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGATCGTGTGATCTACT GGCGTCTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAACAAAGAAGCGTTCG AGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTTCTGTTTTATCGTCA GCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGA TAACAGCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAA GATAGCAAGTACGAGCCGCTGTATCAGGAAGAGACCGAATGGCGTAAGAAATAT AACCAAATCAAGGCGAAGAAAGCGCAGATGTACAAGAACAAGAGCTACAACAAG TACACCAAGTTCAGCAAC
S EQ . I D . N ° 5 : gène R349 d e M i m ivi ru s
ATGG AATT AATT AGTCGTGTCTTT ACT CATGG AG AAAAT ATTTT ACTTGTT AGTT CTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAA AAT AGGT ACAG AT AAAACTT AT ATTG AAAGTCCAGTAT AT ATTG ACATT AAATT A G ATG ATG AT GATT CT GTT AAAG CGTTTT ATT CTTGTAATTT ATT C ACG ATG ATT C AT ACATCCAAAG G AAAAATTT AT CT AT C AAG AT CATTT ATTTGTG GTG G AG GT G A AATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGC TG AGT CT G ATGCTG AAT CAG ATT CAG AAAAT CAT ACT CAAAAT AAT ACAAAT ACT CCCAT AAAT AAT AT CACACT AATT AATTT G G ATT CAT CAAAT AATTCC ACT CAAT C TG AT AAT G AAT CT G AT AATG AAT CTG AT AAT G AAT CTG ACAATG AAT CTG AT CAA TCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCTGATAATGAATCTGATGAAGAAG TTTTTGTT G AT CGT AATG AT AAT AATT CAG AT AAT ATTGGTAATT CAAAT AGT AT TG AT AAT G AAT CT G AAT CT ATG ACTG AAAAAG CT G G AAT AATTTTGTT AAACG AA ATT AAAACCATGGT AG ATG AAATTTTGTCT CAAAAAAAT ATT AATT CTGTTGG AA TT AACG AT ATT GTT ATTCGTCCAAGCGG ACAGT ATGTG AGT AAT ATGG GATAT AT T ACAG AAT CAG GT AGTGTAT CATTT CAT ACC AAT AAAAAT G GTTT CTT ATT ATT C AAGT CCAAT GTT CAT G AAAT CCTTTT CGTTG AAG AAATGTTT ATGTACT CT AAAA AT AATTTT ATTT ATTTGGCCAT ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCAT CT CT AAG AG A T ATTGCTCCTTTT C AT ACAATT AAT AAAAC AAAAAAT G GT ATT AAAT G G AAGT AT TT CAAAAT AGTGTTTCCATTTG ACACT G AAAAAAT AG AATTTTGTG AT AATTT CT TTT AT ACTT ATG AATCCAAT ACTTGTT AT CAT CATGTT ATTT CATT CT ACAAAAAT GT AAATT ATT ATCCTT CTTGG AT AT ATTT CAAAT CTG AG ATTG AT ATT AAT AGT A AAAAT AT GTT CTTTT C AAGT G AT ACT AAT AGTGTGTATGTT AAAG AT AAT AACAA CGTGT AT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTTG AAAAAT ACAT CG AT AACAAA CTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAGA CT ACT ATT AAAGTT AGGTAT AACATTGT AT AGCG ATT ACAATTTT AATGG AT GTG AGG ATG AT G AAG AACAT ATTTT CG AAATT AT G AAAAAT CAAT ATGT ACCT CAT AT T AT CGGT CTG AATT ATTTTG AAAGTTT CATTGTAGTT ATTGTCAAT AATCCAAAT AT GTTG ACG AT AACAACTG ACG ATGGT AAAATTTT CTTT AACATT CATG AT ATT A CTTTTT ACAAAAG ATTTT AT AATGG AATCGTTT AT CTTG AT AATGGTTCGTT ATT TT AT CT CACAG AT AGTG AAATTT CAG AT CAAAATGT ATGG AAACT AACTGG AT GT CAATT GT GTG AGCT AGCTG ATT CT ACCAT AT AT AGTT ACCT ATTT AATTT ACCGG ACAAAATT G AT G AAATTT ACT CTTCGT CTG AATTT ATTGTT CT AAAATT AATTGG AAACAAAT ATTTTT ATT AT CCG GTTG AAAATTTTG AT ACT G CT C AAG ATTTT AAG ACAAG AT GTG G GG AAATTT C ATTG AAAAAT AATT CAGTT CTTG AACTCGTT AAT A CT AGT ATT ATT AACAG ACAAT CT AAAAGTT AT CAT ACT ACAGT AT CT ATT AAT ATT GATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAAT CT CTT AGTT ATTCCGCAG AAT ATT CT ATTCG AATTGT AG ACG ACAAAAAT ATTGG TTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTAT T AT AAGT ATTT AATT G CT CAT AATTTT C ACAC AG AGTTT AATTT AC AAG AATTT G CCAAACT G AAACCCACCG AAATT AAAT ATTTGGG AT CAATGTTT CAT ATGGTT AT CTGTCAAAATAATTCTTCGTTACCGATTAGATTACCTCTAGCTTTTGCTGTAGAA ATTTATGGAAAAGAACCCACAATTGATGAATTGGAATATTTTGCTTGTAATGAAG AT G AAACTGG ATT CAAACAT ATTT AT CCAGCCAAAT ACAATCCCG AATT AGTT AA AG AATTCG GTT ATG AAT CTT ATG AACATTGTCT AAAAACTTTGT GT AAAT AT AAT T AT G AAG ATG AT ACTG AT AAAAAT AT CTTG ACG AAAAAAT ATTGCG AGCAATT AG CTGCCGGTTTT AAAAG AT ACGGCAAT AT CAAG AACAT AAAACAAATG AATTT ACC CACATTGG ACT ATT ACATTT CTGGCCCAT ACAAAATT AAT AG AACCAT ATT AATT AATAATCTTGTTTTATCGGGAGGTAAGGATAAAAATAATAATTATTTGGAAATGT T CAAAG AATTT ATT AACT CTTTGTCTG AAAATG AATT AAAAAT CTTGCT AAAAAA TTGG ACAGCAT CAACTTGTGTAAG ACCAG AT AACAAAT AT AG AATT AT CATT ATT TCCAAAT CT AAAAACGCT AAAGCAGGTATTCG ATTTGGTACTTGTAATTT AG AAA TT CAT AT CG ACG AAAAAATGTTGG ATG AACAT AAT ATTG AT ACAGTCAAAG AGGT TTT AATT AC ACCT G CT CAAG G ATT CAAAG ATT AA
SEQ. I D . N °6 : séq uence répétée d u virophage za m i lon
TGATAATGAATCTGA SEQ. I D. N °7 : Gène R349 mod ifié avec des séq uences répétées d u gène de résista nce à la tétracycl ine (SEQ I D N °23)
ATGG AATT AATT AGTCGTGTCTTT ACT CATGG AG AAAAT ATTTT ACTTGTT AGTT CTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAA AAT AGGT ACAG AT AAAACTT AT ATTG AAAGTCCAGTAT AT ATTG ACATT AAATT A G ATG ATG AT GATT CT GTT AAAG CGTTTT ATT CTTGTAATTT ATT C ACG ATG ATT C AT ACATCCAAAG G AAAAATTT AT CT AT CAAG AT CATTT ATTTGTG GTG G AG GT GA AATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGC TG AGTCTG ATGCTG AAT CAG ATT CAG AAAAT CAT ACT CAAAAT AAT ACAAAT ACT CCCAT AAAT AAT AT CAC ACT AATT AATTT G G ATT CAT CAAAT AATTCC ACT CAAT C CACCCTGGATGCTGTTAATGAATCCACCCTGGATGCTGTCAATGAATCTGATCAA TCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCCACCCTGGATGCTGTTGAAGAA GTTTTT GTTG ATCGT AATG AT AAT AATT CAG AT AAT ATT G GT AATT CAAAT AGTA T CACCCT G G ATG CTGTATCT ATG ACTG AAAAAGCT G G AAT AATTTTGTT AAACG A AATT AAAACCATGGTAG ATG AAATTTTGTCT CAAAAAAAT ATT AATT CTGTTGG A ATTAACGATATTGTTATTCGTCCAAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATA TT ACAG AAT CAGGTAGTGT AT CATTT CAT ACCAAT AAAAATGGTTT CTT ATT ATT CAAGTCCAATGTT C ATG AAATCCTTTTCGTTG AAG AAATGTTT ATGT ACT CT AAA AAT AATTTT ATTT ATTTGGCCAT ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCATCT CT AAGAG AT ATT G CTCCTTTT CAT AC AATT AAT AAAACAAAAAAT G GT ATT AAAT G G AAGT A TTT CAAAAT AGTGTTT CCATTTGACACTG AAAAAAT AG AATTTTGT G AT AATTT C TTTT AT ACTT ATG AAT CCAAT ACTTGTT AT CAT CATGTT ATTT CATT CT ACAAAAA TGT AAATT ATT ATCCTT CTTGG AT AT ATTT CAAAT CTG AG ATTG AT ATT AAT AGT AAAAAT ATGTT CTTTT CAAGTG AT ACT AAT AGTGTGT ATGTT AAAG AT AAT AACA ACGT GT AT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTTG AAAAAT ACATCG AT AACAA ACTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAG ACT ACT ATT AAAGTT AGGT AT AACATT GT AT AGCG ATT ACAATTTT AATGG AT GT GAGGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCTCATA TT AT CGGTCTG AATT ATTTTG AAAGTTT CATTGT AGTT ATTGTCAAT AATCCAAA T AT GTTG ACG AT AACAACTG ACG ATGGTAAAATTTT CTTT AACATT CATG AT ATT ACTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTATCTTGATAATGGTTCGTTAT TTTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATG T CAATTGTGTG AG CT AG CT GATT CT ACCAT AT AT AGTT ACCT ATTT AATTT ACCG G ACAAAATTG ATG AAATTT ACT CTTCGTCTG AATTT ATTGTT CT AAAATT AATT G G AAAC AAAT ATTTTT ATT AT CCG GTTG AAAATTTTG AT ACT G CT C AAG ATTTT AA G ACAAGATGTGGGG AAATTT CATTG AAAAAT AATT CAGTT CTTG AACT CGTT AAT ACT AGT ATT ATT AACAG ACAAT CT AAAAGTT AT CAT ACT ACAGT AT CT ATT AAT AT TGATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAA T CT CTT AGTT ATTCCG CAG AAT ATT CT ATTCGAATTGTAG ACG AC AAAAAT ATT G GTTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTA TT AT AAGTATTT AATTGCT CAT AATTTT CACACAG AGTTT AATTT ACAAG AATTT GCCAAACTGAAACCCACCG AAATT AAAT ATTTGGG AT CAATGTTT CAT ATGGTT A T CT GTCAAAAT AATT CTTCGTT ACCG ATT AG ATT ACCT CT AGCTTTT G CTGTAG A AATTT ATGG AAAAG AACCCACAATTG ATG AATTGG AAT ATTTTGCTT GT AAT G AA G ATG AAACT G G ATT C AAAC AT ATTT ATCC AG CCAAAT AC AATCCCG AATT AGTT A AAG AATT CGGTT ATG AAT CTT ATG AACATTGTCT AAAAACTTTGT GT AAAT AT AA TTATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTA GCTGCCGGTTTT AAAAG AT ACGGCAAT ATCAAGAACAT AAAACAAATG AATTT AC CC AC ATT G G ACT ATT ACATTT CTG G CCCAT AC AAAATT AAT AG AACC AT ATT AAT T AAT AAT CTTG TTTT ATCG G G AG GT AAG G AT AAAAAT AAT AATT ATTT G G AAAT G TT CAAAG AATTT ATT AACT CTTTGTCTG AAAATG AATT AAAAAT CTTGCT AAAAA ATTGG ACAGCAT CAACTTGTGT AAG ACCAG AT AACAAAT AT AG AATT AT CATT AT TT CCAAAT CT AAAAACG CT AAAG C AG GTATT CG ATTT G GTACTTGTAATTT AG AA ATTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATATTGATACAGTCAAAGAGG TTTT AATT AC ACCTGCT C AAG G ATT CAAAG ATT AA
SEQ. ID. N°8 séq uence sens de 130 nu cléotides de I O RF4 de za mi lon AT AG AACAACCAAAAAAAT AT CAAAAT CT AG AG ATG AAT CAAGT G AAT CAG AAG A ATCTGATAATGAATCTGATAATGAATCCGATGAGGAAGTTGAATCAGAAACTGAG ATAGAACCAGTCAAATCTAA
SEQ. ID. N°9 séquence anti sens de 130 nucléotides de IORF4 de zamilon
TT AG ATTTG ACTGGTT CT AT CT CAGTTT CTG ATT CAACTT CCT CATCGG ATT CAT T AT CAG ATT CATT AT CAG ATT CTT CTG ATT CACTTG ATT CAT CT CT AG ATTTTG A T ATTTTTTTGGTTGTT CT AT
SEQ.ID.N°10 : amorce du gène R349 de mimivirus
ATGGAATTAATTAGTCGTGTC
SEQ.ID.N°11 : amorce du gène R349 de mimivirus
TT AAT CTTTG AATCCTTG AG C
SEQ.ID.N°12 : amorce du gène de IORF4 du virophage zamilon
ATGTCTGTTCTAGAAAACCT
SEQ.ID.N°13 : amorce du gène de IORF4 du virophage zamilon TT AAGTT AT AATTTTGTAT A
SEQ.ID.N°14 : amorce d'une séquence sens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
T AAT ACG ACT CACT AT AGGGT ACT CCCAT AAAT AAT AT CAC
SEQ.ID.N°15 : amorce d'une séquence sens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
G AG AC AAAATTT CAT CT ACC
SEQ.ID.N°16 : amorce d'une séquence antisens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
T AAT ACG ACT CACT AT AG G G AG AC AAAATTT CAT CT ACC
SEQ.ID.N°17 : amorce d'une séquence antisens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
T ACT CCCAT AAAT AAT AT CAC
SEQ.ID.N°18 : séquence sens de l'ARN de la séquence répétée du virophage zamilon
UGAUAAUGAAUCUGA
SEQ.ID.N°19 : séquence anti sens de l'ARN de la séquence répétée du virophage zamilon UCAGAU UCAU UAUCA
SEQ . I D. N °20 : séq uence sens de l 'ARN de la séq uence répétée d u gène G FP
AAUCGCUGGACGGCGACG U UAAUGAAUCGCUGGACGGCGACGUCA SEQ . I D. N °21 : séq uence a nti sens de l 'ARN de la séq uence répétée d u gène G FP
UGACG UCGCCGUCCAGCGAU UCAU UAACG UCGCCG UCCAGCGAU U
SE D. I D. N 0 22 : séq uences orga n isées en opéron i ncl ua nt le gène R349 mod ifié avec séq uence spécifiq ue de 15 n ucléotides d u gène de résista nce à la tétracycl i ne (SEQ I D N °23) et les gènes R350 et 354.
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT AATTTTGTTT AACTTT AAG AAGG AG AT AT AG AT ATGG AATT AATT AGTCGTGT CT TT ACT CATGG AG AAAAT ATTTT ACTTGTT AGTT CT ACAAAT AAGTT AT AT ATT AT GGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAAAATAGGTACAGATAAAACTTAT ATTGAAAGTCCAGTATATATTGACATTAAATTAGATGATGATGATTCTGTTAAAG CGTTTT ATT CTTGT AATTT ATT CACG ATG ATT CAT ACATCCAAAGG AAAAATTT A TCTATCAAGATCATTTATTTGTGGTGGAGGTGAAATCGATGCATATGATAGTGAA AGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGAT T CAG AAAAT CAT ACT C AAAAT AAT ACAAAT ACTCCC AT AAAT AAT AT C ACACT AAT T AATTTGG ATT CAT CAAAT AATTCCACT CAATCCACCCTGG ATGCTGTT AATG AA TCCACCCTGGATGCTGTCAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTG GACCTCGATCCACCCTGGATGCTGTTGAAGAAGTTTTTGTTGATCGTAATGATAA T AATT CAG AT AAT ATTGGT AATT CAAAT AGT AT CACCCTGG ATGCTGTAT CT AT G ACTG AAAAAGCTGG AAT AATTTTGTT AAACG AAATT AAAACCATGGTAG ATG AAA TTTTGTCT CAAAAAAAT ATT AATT CTGTTGG AATT AACG AT ATTGTT ATT CGTCC AAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATATTACAGAATCAGGTAGTGTATC ATTT CAT ACCAAT AAAAAT G GTTT CTT ATT ATT CAAGTCCAATGTT C ATG AAAT C CTTTTCGTTG AAG AAATGTTT ATGTACT CT AAAAAT AATTTT ATTT ATTTGGCCA T ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCAT CT CT AAG AG AT ATTGCTCCTTTT CAT ACAAT T AAT AAAAC AAAAAAT G GT ATT AAAT G G AAGTATTT C AAAAT AGTGTTTCCATTT G ACACTG AAAAAAT AG AATTTTGT G AT AATTT CTTTT AT ACTT ATG AAT CCAAT A CTTGTT AT CAT CATGTT ATTT CATT CT ACAAAAATGTAAATT ATT ATCCTT CTTGG AT AT ATTT CAAAT CTG AG ATTG AT ATT AAT AGTAAAAAT ATGTT CTTTT CAAGTG AT ACT AAT AGTGT GT ATGTT AAAG AT AAT AACAACGTGT AT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTTG AAAAAT ACATCG AT AACAAACTCG ACTTGG ATGTCGT AATT GTGCCTG AT AGTT AT AG ACCAATGG AAATG AG ACT ACT ATT AAAGTT AGGT AT AA CATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGTGAGGATGATGAAGAACATATTTT CG AAATT ATG AAAAAT CAAT ATGTACCT CAT ATT ATCGGTCTG AATT ATTTTG AA AGTTT CATTGT AGTT ATTGTCAAT AATCCAAAT ATGTTG ACG AT AACAACTG ACG ATGGT AAAATTTT CTTT AACATT CATG AT ATT ACTTTTT ACAAAAG ATTTT AT AAT GG AATCGTTT AT CTTG AT AATGGTTCGTT ATTTT AT CT CACAG AT AGTG AAATTT 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AAAAAAT ATTGCG AGCAATT AGCTGCCGGTTTT AAAAG AT ACGG CAAT AT CAAG AACAT AAAACAAAT G AATTT ACCCACATTGG ACT ATT ACATTT CT GGCCCAT ACAAAATT AAT AG AACCAT ATT AATT AAT AAT CTTGTTTT ATCGGG AG GT AAGG AT AAAAAT AAT AATT ATTTGG AAATGTT CAAAG AATTT ATT AACT CTTT GTCTG AAAATG AATT AAAAAT CTTGCT AAAAAATTGG ACAGCAT CAACTTGTGT A AG ACCAG AT AACAAAT AT AG AATT AT CATT ATTT CCAAAT CT AAAAACGCT AAAG CAGGT ATTCG ATTTGGT ACTTGTAATTT AG AAATT CAT ATCG ACG AAAAAATGTT GG AT G AACAT AAT ATTG AT ACAGTCAAAG AGGTTTT AATT ACACCTGCT CAAGG A TTCAAAGATTAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCT GCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTC TTG AGGGGTTTTTTG AG AT CT CG AT CCCGCG AAATT AAT ACG ACT CACT AT AGG GG AATTGTG AGCGG AT AACAATTCCCCACT AG AAAT AATTTTGTTT AACTTT AAG AAGGAGATATAGCAATGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGC CGAGCATCGAAAACCCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACA GCGTGTATAAAAGCGACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCC CGATCTGGATTCTGAAGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAA 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CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATG GTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGG AT G AACG AAAT AG ACAG ATCGCT G AG AT AGGTGCCT CACTG ATT AAGCATTGGT AACTGTCAG ACCAAGTTT ACT CAT AT AT ACTTT AG ATTG ATTT AAAACTT CATTT TT AATTT AAAAGG AT CT AGGTG AAG ATCCTTTTTG AT AAT CT CATG ACCAAAAT C CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG G AT CTT CTTG AG AT CCTTTTTTT CTGCGCGTAAT CTGCTGCTTGCAAACAAAAAA ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT CCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTG T AGCCGTAGTT AGGCCACCACTT CAAG AACT CTGTAGCACCGCCT ACAT ACCT CG CTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTA CCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAA CGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGA GATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTT
SEQ . I D. N °26 : séq uence d u premier spacer d u gène R349 mod ifié (N . B. : ne pas teni r compte d u premier nu cléotide A ajouté u n iq uement pour faire un total de 10 nt comme requis par le logiciel de listage de séquence)
ATAATGAATC
SEQID°27 : séquence du deuxième spacer du gène R349 modifié
CAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATC
SEQ. ID. N°28 : séquence du troisième spacer du gène R349 modifié
TG AAG AAGTTTTTGTTG AT CGTAATG AT AAT AATT CAG AT AAT ATTGGT AATT CA A AT AG T AT
SEQ. ID. N°29 : séquence sens d'ARN spécifique du gène GFP
GCUGGACGGCGACGA
SEQ. ID. N°30 : séquence anti sens d'ARN spécifique du gène GFP ACGUCGCCGUCCAGC
SEQ.ID.N°31: séquence du Promoteur T7
T AAT ACG ACT CACT AT AG SEQ.ID.N°32: séquence de l'opéron Lac
GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC.
SEQ.ID.N°33 : séquence du terminateur T7
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG SEQ.ID.N°34 :séquence de l'étiquette polyhistidine
CACCACCACCACCACCAC
SEQ.ID. N°35 : Séquence du plasmide pACYC184 portant le gène de résistance à la tétracycline
GAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATA AAACTTGTGCTT ATTTTT CTTT ACG GT CTTT AAAAAGG CCGT AAT ATCCAG CTG A ACG GTCT G GTTATAG GT ACATTG AG C AACTG ACTG AAATGCCT CAAAATGTT CTT T ACG ATGCCATTGGG AT AT AT CAACGGTGGTAT AT CCAGTG ATTTTTTT CT CCAT TTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGT GATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTC ATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGAT TTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGGCGCAAAGTGC GTCGGGTGATGCTGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGTGTTTTTGAGGTG CTCCAGTGGCTTCTGTTTCTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGT GGTGCGTAACGGCAAAAGCACCGCCGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTG GCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGTCAGTGAAGTGCTTCATGTGGCAGGA GAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATGTGATACAGGATATATTCCG CTTCCTCGCTCACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGAAA TGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGCCAGGAAGATACTTAACA GGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGA CAAGCATCACGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACT ATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCT GCCTTTCGGTTTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCA CGCCTGACACTCAGTTCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCAC GAACCCCCCGTTCAGTCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCACCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGAT TTAGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGGTTAAGGCTAAACTGAAAGGACA AGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCCAGTTACCTCGGTTCAAAGAGTTGGTA GCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTCGTTTTCAGAG CAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAATCAGA T AAAAT ATTT CT AG ATTT C AGTG CAATTT AT CT CTT CAAATGTAG C ACCTG AAGT CAGCCCCAT ACG AT AT AAGTTGTAATT CT CATGTTTG ACAGCTT AT CAT CG AT AA GCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGT ATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTG TAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCC ATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGA TGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCC GCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGG CGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCA CCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGG AAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCAT TCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAA TGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACC CAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGA CTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCA TTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTG CGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCAC CAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCT GGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTAT GATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTC CAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCT TACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCC TCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTT GTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGA ATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCA ATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATC CATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGG GTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGG CTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAAC GTG AAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCG ACCTG AGCAACAACATGAATGGT CTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCCCCTACGTGCTG CTGAAGTTGCCCGCAACAGAGAGTGGAACCAACCGGTGATACCACGATACTATG ACTGAGAGTCAACGCCATGAGCGGCCTCATTTCTTATTCTGAGTTACAACAGTCC GCACCGCTGTCCGGTAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCC GCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCG CCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCG CCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGT GG AACACCT ACAT CT GT ATT AACG AAGCGCT AACCGTTTTT AT CAGGCT CTGGG A GGCAGAATAAATGATCATATCGTCAATTATTACCTCCACGGGGAGAGCCTGAGC AAACTGGCCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAA TAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAA CCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATC ACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAA ATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCT GCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCAT CAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAA GAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGA TTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGT TTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATC GT CGTGGTATT CACT CCAG AGCG ATG AAAACGTTT CAGTTTGCT CATGG AAAAC GGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCC ATACG
SEQ.ID. N°36 : séquence du gène de résistance à la tétracycline
AT G AAAT CT AACAAT GCGCT CAT CGT CAT CCT CGGCACCGT CACCCT GG ATGCTGT AGGCAT A GGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGC CAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCT CGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCA CT AT CG ACT ACGCG AT CATGGCG ACCACACCCGT CCT GTGG AT CCT CT ACGCCGG ACGCAT CG TGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGAT GGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGG CAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCG GCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGG AGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGG G CAT G ACT AT CGT CGCCGCACTT AT G ACT GT CTT CNT AT CAT GCAACT CGT AGG ACAGGT GC CGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGC CTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCC ACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTA CGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTC CGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATC AGGG ACAGCTTCAAGG AT CGCT CGCGGCT CTT ACCAGCCT AACTT CG AT CACT GG ACCGCTG ATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGG CGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCT CGACCTGA SEQ.ID. N°37 : séquences organisées en opéron incluant le gène R349 modifié avec séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline (SEQ ID N°39) et les gènes R350 et 354.
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT AATTTTGTTT AACTTT AAG AAGG AG AT AT AG AT ATGG AATT AATT AGTCGTGT CT TT ACT CATGG AG AAAAT ATTTT ACTTGTT AGTT CT ACAAAT AAGTT AT AT ATT AT GGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAAAATAGGTACAGATAAAACTTAT ATTGAAAGTCCAGTATATATTGACATTAAATTAGATGATGATGATTCTGTTAAAG CGTTTT ATT CTTGT AATTT ATT CACG ATG ATT CAT ACATCCAAAGG AAAAATTT A TCTATCAAGATCATTTATTTGTGGTGGAGGTGAAATCGATGCATATGATAGTGAA AGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGAT T CAG AAAAT C AT ACT C AAAAT AAT AC AAAT ACTCCC AT AAAT AAT AT C ACACT AAT T AATTTGG ATT CAT CAAAT AATTCC ACT C AATCCG G CT CTT ACC AG CCT AAT G AA TCCGGCTCTTACCAGCCCAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTG GACCTCGATCCGGCTCTTACCAGCCTGAAGAAGTTTTTGTTGATCGTAATGATAA T AATT CAG AT AAT ATT G GT AATT CAAAT AGT ATCG GCT CTT ACCAG CCAT CT AT G ACTG AAAAAGCTGG AAT AATTTTGTT AAACG AAATT AAAACCATGGTAG ATG AAA TTTTGTCT CAAAAAAAT ATT AATT CTGTTGG AATT AACG AT ATTGTT ATT CGTCC AAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATATTACAGAATCAGGTAGTGTATC ATTT CAT ACCAAT AAAAAT G GTTT CTT ATT ATT CAAGTCCAATGTT C ATG AAAT C CTTTT CGTTG AAG AAATGTTT ATGTACT CT AAAAAT AATTTT ATTT ATTTGGCCA T ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCAT CT CT AAG AG AT ATTGCTCCTTTT CAT ACAAT T AAT AAAAC AAAAAAT G GT ATT AAAT G G AAGTATTT C AAAAT AGTGTTTCCATTT G ACACTG AAAAAAT AG AATTTTGT G AT AATTT CTTTT AT ACTT ATG AAT CCAAT A CTT GTT AT CAT CATGTT ATTT C ATT CT AC AAAAATGTAAATT ATT ATCCTT CTT G G AT AT ATTT CAAAT CTG AG ATTG AT ATT AAT AGTAAAAAT ATGTT CTTTT CAAGT G AT ACT AAT AGTGT GT ATGTT AAAG AT AAT AACAACGTGT AT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTTG AAAAAT ACATCG AT AACAAACTCG ACTTGG ATGTCGT AATT GTGCCTG AT AGTT AT AG ACCAATGG AAATG AG ACT ACT ATT AAAGTT AGGT AT AA CATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGTGAGGATGATGAAGAACATATTTT CG AAATT ATG AAAAAT CAAT ATGTACCT CAT ATT ATCGGTCTG AATT ATTTTG AA AGTTT CATTGT AGTT ATTGTC AAT AATCC AAAT ATGTTG ACG AT AAC AACTG ACG ATGGT AAAATTTT CTTT AACATT CATG AT ATT ACTTTTT ACAAAAG ATTTT AT AAT GG AATCGTTT AT CTTG AT AATGGTTCGTT ATTTT AT CT CACAG AT AGTG AAATTT CAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATGTCAATTGTGTGAGCTAGCTGATTC T ACCAT AT AT AGTT ACCT ATTT AATTT ACCGGACAAAATTG ATG AAATTT ACT CT TCGTCTG AATTT ATTGTT CT AAAATT AATTGG AAACAAAT ATTTTT ATT AT CCGG TTG AAAATTTTG AT ACTGCT CAAG ATTTT AAG ACAAG AT GTGGGG AAATTT CATT G AAAAAT AATT CAGTT CTTG AACT CGTT AAT ACT AGTATT ATT AACAG ACAAT CT AAAAGTT AT CAT ACT ACAGT AT CT ATT AAT ATTG AT ACGG ATTGT ACT ACT CAT A ATT CTTT CG AG AG ATT GTTT AT CCTG ACACAAT CT CTT AGTT ATTCCGCAG AAT A TTCTATTCGAATTGTAGACGACAAAAATATTGGTTTTGGTGATGGGCCTAAAATT G AATTTTGTG AATCGGCT ATT ATGCAATTTT ATT AT AAGT ATTT AATTGCT CAT A ATTTTCACACAGAGTTTAATTTACAAGAATTTGCCAAACTGAAACCCACCGAAAT T AAAT ATTTGGG AT CAATGTTT CAT ATGGTT AT CTGTCAAAAT AATT CTT CGTT A CCG ATT AG ATT ACCT CT AGCTTTTGCTGTAG AAATTT ATGG AAAAG AACCCACAA TTG ATG AATTGG AAT ATTTTGCTTGTAATG AAG AT G AAACTGG ATT CAAACAT AT TT AT CCAGCCAAAT ACAAT CCCG AATT AGTT AAAG AATT CGGTT ATG AAT CTT AT G AACATTGTCT AAAAACTTTGTGT AAAT AT AATT ATG AAG ATG AT ACT G AT AAAA ATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTAGCTGCCGGTTTTAAAAGATACGG CAAT AT CAAG AACAT AAAACAAAT G AATTT ACCCACATTGG ACT ATT ACATTT CT GGCCCAT ACAAAATT AAT AG AACCAT ATT AATT AAT AAT CTTGTTTT ATCGGG AG GT AAGG AT AAAAAT AAT AATT ATTTGG AAATGTT CAAAG AATTT ATT AACT CTTT GT CTG AAAATG AATT AAAAAT CTTGCT AAAAAATTGG ACAGCAT CAACTTGTGT A AG ACC AG AT AAC AAAT AT AG AATT AT CATT ATTT CC AAAT CT AAAAACG CT AAAG CAGGT ATTCG ATTTGGT ACTTGTAATTT AG AAATT CAT ATCG ACG AAAAAAT GTT GG AT G AACAT AAT ATTG AT ACAGTCAAAG AGGTTTT AATT ACACCTGCT CAAGG A TTCAAAGATTAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCT GCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTC TTG AGGGGTTTTTTG AG AT CT CG AT CCCGCG AAATT AAT ACG ACT CACT AT AGG GG AATTGTG AGCGG AT AACAATTCCCCACT AG AAAT AATTTTGTTT AACTTT AAG AAGGAGATATAGCAATGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGC CGAGCATCGAAAACCCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACA GCGTGTATAAAAGCGACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCC CGATCTGGATTCTGAAGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAA AGAGAACGAAGACCCGTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCA GGAATTCGTGGGCCAATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCT GTACCATGGTCTGGGTAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAACAT T CT GT ACAACT AT G ACAACGGCACCAACTTT ATCGTT CTG ATT AAAGCG AGCCT G CACAACGACCCGTGGATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGATCCGAGC GAACAGAACGTGGACAACGTTACCAAGCTGGATCGTTACAAAAACATCCACTTCG TGCACT ATG ACAGCCCGTTCGCGG AT AGCAGCTTT ATG AGCGTT ATT AAG ACCCT GGACCTGAGCAAACCGACCATGTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGT AACGTGTATAGCAACATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTAC GAGTACATCATGAAGGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATT AGCGCGACCCCGGCGATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAACCTG CTGCGTCCGGGTATTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGTACCTTTGTG ACCGAAAGCAGCTACCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAAAACATGTTTGAGCGT CGTATCCTGGGCCTGGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCG CGTCAAGAACTGAAGTACATCAACCTGCCGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCT ACCGTATTTTCGAGAAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTG GCAAGCAGAGCCAACTGTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGT TTCCGTACGTTAACATGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGT TCCGTCTGAGCGAAAAACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGACG TTCCGGATACCGAGAAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATTGAGAACTA CCTGAACGAGACCGAACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGAAAGACGCGGAGAA CGGT CGT ACCAT CATT AACG ACCTGG ATG AATT CAAG AAAGGCTTTGGTACCAA GTTCAACAGCTTTCTGCAGTACTATCAAAGCGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCT GACCGAAATGTACAACTGCAGCCCGAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTA TATTAGCCCGGGCAAGGTGATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCAT CGACGTTATGAAAATTTACTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCG CGTGAGTACATGGGCTATTGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGT GTGCGTATCAAGAACATGTTCAACGACAAGAACAACGTGTACGGCAACAAGTGC AAAGTTATCATGCTGAGCCCGAGCGCGACCGAGGGTATTCAACTGCTGGATATC CGTCAGGAGCACATTATGGAACCGTATTGGACCGAAGTTCGTATCCAGCAAGTG ATTGGCCGTGGTGTTCGTCAATGCAGCCACCGTGACCTGCCGATGAGCGAGCGT ATCGTGGATATTTACCGTTATAAGGTTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGAC GATACCGTGCGTCAAAGCACCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAA GCGAACCTGATTGAGAGCTTCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGC GAGCTGTTTAAGGAACACAACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTC CGGAGAGCGCGGTGACCAAGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGACATCA AGGACGATGTGAAATATGATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAGCATCGTTGAGC GTATTCGTGTGGTTAAGGTGAACGCGGTTTACCAAATCAACACCGACAACAACAA CCCGGTGTATAGCAGCCCGACCAAGTACTGGTATAACAAGAAAACCGGCATGGT TTATGACTTCGAGACCCACTACCCGGTGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTG CCGAACAAGCTGGACAAAGATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGA GCATT ACCGGTAGCGTT AACACCT AACACT AG AAAT AATTTTGTTT AACTTT AAG AAGG AG AT AT AGCG ATG ACCG ACATT AGCT ACT AT AACAACG AG AT CG AT AAAAT TCTGTGGAACATCCTGGGTGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGACGATCTG GTGAACAGCGTTGCGAACACCATTTACCAGTATGACAACGAAGTGAGCATCGAT AAGCTGAAAGTGATCATCGAATTCGTTATCCTGAACAAGTTCAAGCTGTGCTACA TCTACGATAACGACAGCATCCTGAACCAAGTGAAATACGAGAAGAAAAGCGTTG GTAGCAAAACCATCGGCAAGAACAGCACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAG ATATCGCGGTGATTAAGCTGAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGA AAAGCCCGAAAATCAGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGG CGACCTACGAAGACCTGATCAGCCACAAGCACGATTACCCGAAAGAGATTTATAA GGAAAGCCACTACATCCGTCGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAAAATTCCG CAATTCGAGCAGAAGAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACC GCGACCGCGATTAGCGTGGTTTTTGATGAAGACCCGTATAAACACCCGATCGTT ATTCTGCTGGACAAGTGCGGTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTT CACCACGGTAACAAGTATG AACAAATCGGCACCAT GTT CT ACAGCTTT CGTAACA ACGTTGAGGTGGGTGAGTACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCG CGGCGAGCCCGGATGGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCA AACTGGTGGGTCGTCTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCAACA ACAGCGGTGATCTGGACGGCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAGGTGC AAACCCAGCTGTATGTTACCGAGATGGACGAATGCGACTTCCTGCAGTGCAAAA TTGACGAGTACGATAGCTGGGAAGACTTTGTGAAGGATAGCAACCCGATCGTTC CGGGTCTGAGCAAAACCACCAACCTGGAGAAGGGCTGCCTGATTCAGCTGAGCG ACAAAAACCTGATCGGCAGCGACGACAAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATA CATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAG CAGCGAAATCATGAACTACCACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGAT CGTGTGATCTACTGGCGTCTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAAC AAAGAAGCGTTCGAGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTT CTGTTTTATCGTCAGCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAG 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I D. N °38 : Gène R349 mod ifié avec des séq uences répétées d u gène de résista nce à la tétra cycl ine (SEQ I D N°39)
ATGG AATT AATT AGTCGTGTCTTT ACT CATGG AG AAAAT ATTTT ACTTGTT AGTT CTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAA AAT AGGTACAG AT AAAACTT AT ATTG AAAGTCCAGTAT AT ATTG ACATT AAATT A G ATG ATG AT GATT CT GTT AAAG CGTTTT ATT CTTGTAATTT ATT C ACG ATG ATT C AT ACATCCAAAG G AAAAATTT AT CT AT C AAG AT CATTT ATTTGTG GTG G AG GT GA AATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGC TG AGTCTG ATGCTG AAT CAG ATT CAG AAAAT CAT ACT CAAAAT AAT ACAAAT ACT CCCAT AAAT AAT AT CAC ACT AATT AATTT G G ATT CAT CAAAT AATTCC ACT CAAT C CGGCTCTTACCAGCCTAATGAATCCGGCTCTTACCAGCCCAATGAATCTGATCAA TCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCCGGCTCTTACCAGCCTGAAGAA GTTTTTGTTG ATCGT AATG AT AAT AATT CAG AT AAT ATT G GT AATT CAAAT AGTA TCGGCTCTTACCAGCCATCTATGACTGAAAAAGCTGGAATAATTTTGTTAAACGA AATT AAAACCATGGTAG ATG AAATTTTGTCT CAAAAAAAT ATT AATT CTGTTGG A ATTAACGATATTGTTATTCGTCCAAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATA TT ACAG AAT CAGGTAGTGT AT CATTT CAT ACCAAT AAAAATGGTTT CTT ATT ATT CAAGTCCAATGTT C ATG AAATCCTTTTCGTTG AAG AAATGTTT ATGT ACT CT AAA AAT AATTTT ATTT ATTTGGCCAT ACCATTT AAAAAAT ACCAGGCATCT CT AAGAG AT ATTGCTCCTTTT C AT AC AATT AAT AAAACAAAAAAT G GT ATT AAAT G G AAGT A TTT CAAAAT AGTGTTT CCATTTGACACTG AAAAAAT AG AATTTTGT G AT AATTT C TTTT AT ACTT ATG AAT CCAAT ACTTGTT AT CAT CATGTT ATTT CATT CT ACAAAAA TGT AAATT ATT ATCCTT CTTGG AT AT ATTT CAAAT CTG AG ATTG AT ATT AAT AGT AAAAAT ATGTT CTTTT CAAGTG AT ACT AAT AGTGTGT ATGTT AAAG AT AAT AACA ACGT GT AT AAAT ACCAT AATTT CAAT AATT CT CTTG AAAAAT ACATCG AT AACAA ACTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAG ACT ACT ATT AAAGTT AGGT AT AACATT GT AT AGCG ATT ACAATTTT AATGG ATGT GAGGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCTCATA TT ATCGGTCTG AATT ATTTTG AAAGTTT CATTGT AGTT ATTGTCAAT AATCCAAA T ATGTTG ACG AT AACAACTG ACG ATGGTAAAATTTT CTTT AACATT CATG AT ATT ACTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTATCTTGATAATGGTTCGTTAT TTTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATG T CAATTGTGTG AG CT AG CT GATT CT ACCAT AT AT AGTT ACCT ATTT AATTT ACCG G ACAAAATTG ATG AAATTT ACT CTTCGTCTG AATTT ATTGTT CT AAAATT AATT G G AAAC AAAT ATTTTT ATT AT CCG GTTG AAAATTTTG AT ACT G CT C AAG ATTTT AA G ACAAGATGTGGGG AAATTT CATTG AAAAAT AATT CAGTT CTTG AACT CGTT AAT ACT AGTATT ATT AACAG ACAAT CT AAAAGTT AT CAT ACT ACAGT AT CT ATT AAT AT TGATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAA T CT CTT AGTT ATTCCG CAG AAT ATT CT ATTCGAATTGTAG ACG AC AAAAAT ATT G GTTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTA TT AT AAGTATTT AATTGCT CAT AATTTT CACACAG AGTTT AATTT ACAAG AATTT GCCAAACTGAAACCCACCG AAATT AAAT ATTTGGG AT CAATGTTT CAT ATGGTT A T CTGTCAAAAT AATT CTTCGTT ACCG ATT AG ATT ACCT CT AGCTTTTGCTGTAG A AATTT ATGG AAAAG AACCCACAATTG ATG AATTGG AAT ATTTTGCTT GT AATG AA G ATG AAACT G G ATT C AAAC AT ATTT ATCC AG CCAAAT AC AATCCCG AATT AGTT A AAG AATT CGGTT ATG AAT CTT ATG AACATTGTCT AAAAACTTTGT GT AAAT AT AA TTATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTA GCTGCCGGTTTT AAAAG AT ACGGCAAT ATCAAGAACAT AAAACAAATG AATTT AC CC AC ATT G G ACT ATT ACATTT CTG G CCC AT AC AAAATT AAT AG AACC AT ATT AAT T AAT AAT CTTG TTTT ATCG G G AG GT AAG G AT AAAAAT AAT AATT ATTT G G AAAT G TT CAAAG AATTT ATT AACT CTTTGTCTG AAAATG AATT AAAAAT CTTGCT AAAAA ATTGG ACAGCAT CAACTTGTGT AAG ACCAG AT AACAAAT AT AG AATT AT CATT AT TT CCAAAT CT AAAAACG CT AAAG C AG GTATT CG ATTT G GTACTTGTAATTT AG AA ATTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATATTGATACAGTCAAAGAGG TTTT AATT AC ACCTGCT C AAG G ATT CAAAG ATT AA
SEQ . I D. N °39 : séq uence spécifiq ue de 15 n u cléotides d u gène de résista nce à la tétracycl i ne
CGGCTCTTACCAGCC SEQ . I D . N °40 : vecteu r PP37 CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGG AGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGT CGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGG GCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTT TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGAT AACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACC GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTT CTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTAC AATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGAC GGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGA GCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGC GGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCAT CCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAA GCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTA AGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCT CACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGG 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Claims

REVEN DICATIONS
1. Méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant :
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dit deuxième composant comprend la dite la séquence d'affinité sous forme d'ADN ou de préférence sous forme d'ARN.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la dite la séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes d ites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées de façon espacée.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les dites mêmes séquences complémentaires de la même séquence spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues dans ledit gène R349 de Mimivirus.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux même localisations par les dites 4 mêmes séquences complémentaires dune dite séquence spécifique de la dite séquence cible.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de transcription apte à transcrire de la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la dite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote.
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique de gène R350 et/ou R354 codant pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte.
11 Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur, de préférence un plasmide.
12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350.
13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séquences d'acides nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354.
14. Méthode selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant :
- au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les ) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et - une séquence permettant la transcription en ARN de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du gène R349 modifié complet dans une dite cellule hôte, et
- les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte.
15. Système biologique utile pour la mise en œuvre d'un procédé de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 14 comprenant :
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus de lignée A.
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