WO2019221502A1 - 저선량 방사선을 이용한 초파리의 퇴행성 질환 치료를 확인하는 바이오마커 - Google Patents

저선량 방사선을 이용한 초파리의 퇴행성 질환 치료를 확인하는 바이오마커 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides an in vivo model and indicators for validating the efficacy and safety of Alzheimer's disease treatment using low dose radiation, and relates to a technology that can be used as a basic data for developing therapeutic markers for low dose radiation to degenerative diseases.
  • Alzheimer's model Drosophila (elav> A ⁇ 42) exists as a kind of degenerative disease that is useful in various studies. It is utilized in.
  • the Drosophila degenerative disease model has been established as an in vivo model that can be used to test the therapeutic effect of low-dose radiation before clinical trials.
  • the Drosophila degenerative disease model has been established as an in vivo model that can be used to test the therapeutic effect of low-dose radiation before clinical trials.
  • Patent Document 1 Korean Patent Publication No. 10-2017-0083704
  • An object of the present invention is to examine the efficacy and safety of Alzheimer's disease treatment using low-dose radiation by analyzing the cumulative dose rate differently from the head tissues of adult Drosophila adult embryos.
  • the in vivo model and indicator development method can be used for this purpose.
  • the present invention provides a biomarker responsive to the treatment of degenerative diseases of Drosophila using low dose radiation.
  • the low dose radiation is a cumulative dose, preferably from 0.01 to 0.2 Gy.
  • the fruit fly is an Alzheimer's disease model fruit fly.
  • the Alzheimer's disease model Drosophila is characterized in that GMR> A ⁇ 42 or elav> A ⁇ 42.
  • the degenerative disease is characterized by Alzheimer's disease.
  • the biomarker may include a gene involved in immune activity response, a gene involved in neuronal regeneration, a gene involved in motility function, and the representative genes responding to the immune activity are PGRP-SC1a and PGRP-SC1b, Representative genes involved in neuronal regeneration are en, Oseg4, PCNA, scra, and representative genes involved in motility function are Gas8 and TrpA1.
  • CG9272, ECSIT, and the like may also be included in the biomarker.
  • the efficacy and safety verification of Alzheimer's disease treatment using low dose radiation can be used as an in vivo model and indicator development method.
  • FIG. 1A illustrates the improvement effect according to the dose of low dose radiation in the Drosophila Alzheimer's model
  • FIG. 1B illustrates the improvement effect according to the dose rate of the low dose radiation in the Drosophila Alzheimer's model.
  • Figure 2 illustrates a functional group of genes that respond specifically to low dose radiation in the Alzheimer's model Drosophila.
  • FIG. 3 shows a list of low dose radiation specific response genes showing changes in expression in Alzheimer's relaxation direction.
  • Figure 4 shows the expression changes by real-time PCR for the genes shown in Figure 3 above.
  • a biomarker for treating Drosophila degenerative disease comprising an immunoactive gene sensitive to low-dose radiation, a gene involved in neuronal regeneration, and a gene involved in motility function.
  • the low-dose radiation is preferably irradiated so that the cumulative dose is 0.01 to 0.2 Gy, and the dose rate is different ( 137 Cs, 15.936 mGy / s, 3.147 mGy / s, 5 mGy / h), and the cumulative dose is 0.01 to 0.2 Gy. It is preferable to irradiate so that it is more preferable to irradiate so that the cumulative dose may be 0.05 Gy. According to the United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation (UNSCEAR), the cumulative dose is less than 100 mGy. Therefore, the low dose standard of the present invention also complies with the UNSCEAR standard.
  • the fruit fly is an Alzheimer's disease model fruit fly.
  • the Alzheimer's disease model Drosophila is characterized in that GMR> A ⁇ 42 or elav> A ⁇ 42.
  • the GMR> A ⁇ 42 and the elav> A ⁇ 42 are Drosophila model of Alzheimer's disease, and overexpress the Drosophila nerve (neuron; using elav-GAL4) specifically using the UAS / GAL4 system to overexpress Alzheimer's causative gene A ⁇ 42 (using UAS-A ⁇ 42). Drosophila was produced and used in the experiment.
  • the Drosophila eye (using GMR-GAL4) was specifically overexpressed with A ⁇ 42 (using UAS-A ⁇ 42), and an Alzheimer's model fruit fly was produced. There is a characteristic that the phenotype of decreasing size is observed.
  • the degenerative disease is characterized by Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease is one of the leading causes of dementia in the elderly.
  • the cause of Alzheimer's disease has been shown to be highly related to beta-amyloid protein.
  • beta amyloid When beta amyloid is made excessively in the body and accumulated in brain cells, brain neurons lose their function, causing Alzheimer's disease.
  • Beta amyloid paralyzes or distorts the function of mitochondria in neurons, increasing the free radicals released from mitochondria. This increased free radicals can cause fatal damage to intracellular proteins or DNA, resulting in brain cell damage or apoptosis.
  • the biomarker includes genes involved in immune activity response, genes involved in neuronal regeneration, genes involved in motility function, and representative genes responding to immune activity are PGRP-SC1a and PGRP-SC1b.
  • Representative genes involved in cell regeneration are en, Oseg4, PCNA, scra, and representative genes involved in motility function are Gas8, TrpA1.
  • CG9272, ECSIT, and the like may also be included in the biomarker.
  • Phenotype of overexpression of A ⁇ 42 in Drosophila eyes decreased in eye size.
  • the dose rates were different for Drosophila eggs (embryo) between 0-6 hours when DMR overexpressed A ⁇ 42 by GMR-GAL4 ( 137 Cs, 15.936 mGy / s, 3.147 mGy / s, 5, respectively).
  • mGy / s A total of 0.01-0.2 Gy of low-dose radiation was investigated and cultured in an incubator at 25 ° C until adulthood to compare how the Alzheimer's phenotype of the Drosophila eyes changed. Improvement effects according to the dose and the dose rate of the radiation are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • Alzheimer's model (elav> A ⁇ 42) Drosophila eggs irradiated with 0.05 Gy (15.936 mGy / s), which showed the best improvement among the results of Example 1, were cultured in an incubator at 25 ° C until incubation and hatched. The head tissues of Drosophila adult were isolated, and the expression patterns of whole genes were examined by RNA sequencing method. More specifically, in the Alzheimer's model Drosophila, when a dose of 0.05 Gy radiation at a dose rate of 15.936 mGy / s was selected, genes with more than two-fold changes in expression (increased expression, 82; decreased expression, 345-total 427) were selected. It was. Gene ontology analysis and KEGG pathway analysis were performed on 427 genes thus obtained, and the genes were classified according to their functions.
  • Example 3 Expression of genes that alleviate Alzheimer's symptoms by the low dose radiation shown in Example 3 was verified again by changing the mRNA level through real-time RT-PCR to verify the expression change of the gene by low dose radiation. The result is shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 저선량 방사선에 감응성 있는 면역 활성 유전자, 신경세포 재생에 관여하는 유전자 및 운동성 기능에 관여하는 유전자를 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초파리의 퇴행성 질환을 저선량 방사선으로 치료할 때 반응하는 유전자를 분류하여 선정한 것에 관한 것이다. 상기와 같은 본 발명에 따르면 저선량 방사선에 의해 발현 변화를 나타낸 유전자들을 기능별 분류하고, 저선량 방사선에 의한 반응 지표 유전자를 제시함으로써, 퇴행성 질환에 저선량 방사선 조사 시 치료 마커 개발에 대한 기초자료로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

저선량 방사선을 이용한 초파리의 퇴행성 질환 치료를 확인하는 바이오마커
본 발명은 저선량 방사선을 이용한 알츠하이머 질환 치료의 유효성 및 안전성 검증을 위한 in vivo 모델과 지표를 제시하고, 퇴행성 질환에 저선량 방사선 조사 시 치료 마커 개발에 대한 기초자료로 활용 가능하게 하는 기술에 관한 것이다.
최근 저선량 방사선은 퇴행성 질환의 치료 수단으로 대두되고 있으며, 초파리에는 다양한 연구에서 유용하게 사용되고 있는 퇴행성 질환의 일종으로서 알츠하이머 모델 초파리(elav>Aβ42)가 존재하여, 알츠하이머의 발병과 치료 기작 연구 및 치료제 테스트에 활용되고 있다.
현재, 임상 전 저선량 방사선의 치료 효과 테스트가 가능한 in vivo 모델로서 초파리 퇴행성질환 모델이 구축되었으나, 퇴행성 질환 증상을 개선시키는 과정에 관여하는 저선량 방사선 특이적 반응유전자 지표들에 대한 연구는 전무한 실정이다.
따라서 알츠하이머 모델 초파리로부터 저선량 방사선에 대한 반응 지표 유전자를 발굴하여, 추후 방사선 치료의 임상 테스트 등을 위한 in vivo 모델에서의 관련 기초 자료에 대한 구축이 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국공개특허 제10-2017-0083704호
본 발명의 목적은, 누적 선량률을 서로 다르게 조사해 부화한 초파리 성체의 머리 조직을 분리하여 RNA sequencing method을 통해 전체 유전자의 발현 변화 패턴을 분석함으로써, 저선량 방사선을 이용한 알츠하이머 질환 치료의 유효성 및 안전성 검증을 위한 in vivo 모델과 지표개발 방법으로 활용이 가능하게 하는데 있다.
또한 저선량 방사선에 의해 발현 변화를 나타낸 유전자들을 기능별 분류하고, 저선량 방사선에 의한 반응 지표 유전자를 제시함으로써, 퇴행성 질환에 저선량 방사선 조사 시 치료 마커 개발에 대한 기초자료로 활용이 가능하게 하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 저선량 방사선을 이용한 초파리의 퇴행성 질환 치료에 반응하는 바이오마커를 제공한다.
상기 저선량 방사선은 누적선량이고, 바람직하게는 0.01 내지 0.2 Gy를 조사할 수 있다.
상기 초파리는 알츠하이머 질환 모델 초파리인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 알츠하이머 질환 모델 초파리는 GMR>Aβ42 또는 elav>Aβ42인 것을 특징으로 한다.
상기 퇴행성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 한다.
상기 바이오마커는 면역 활성 반응에 관여하는 유전자, 신경세포 재생에 관여하는 유전자, 운동성 기능에 관여하는 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 면역 활성에 반응하는 대표 유전자는 PGRP-SC1a, PGRP-SC1b이고, 신경세포 재생에 관여하는 대표 유전자는 en, Oseg4, PCNA, scra이며, 운동성 기능에 관여하는 대표 유전자는 Gas8, TrpA1이다. 그 외에 CG9272, ECSIT 등도 바이오 마커에 포함할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 선량률을 서로 다르게 조사해 부화한 초파리 성체의 머리 조직을 분리하여 RNA sequencing method을 통해 전체 유전자의 발현 변화 패턴을 분석함으로써, 저선량 방사선 이용한 알츠하이머 질환 치료의 유효성 및 안전성 검증을 위한 in vivo 모델과 지표개발 방법으로 활용이 가능하게 하는 효과가 있다.
또한 저선량 방사선에 의해 발현 변화를 나타낸 유전자들을 기능별 분류하고, 저선량 방사선에 의한 반응 지표 유전자를 제시함으로써, 퇴행성 질환에 저선량 방사선 조사 시 치료 마커 개발에 대한 기초자료로 활용이 가능하게 하는 효과가 있다.
도 1a는 초파리 알츠하이머 모델에서 저선량 방사선의 선량에 따른 개선효과를 비교하여 나타낸 것이며, 도 1b는 초파리 알츠하이머 모델에서 저선량 방사선의 선량률에 따른 개선효과를 비교하여 도시하였다.
도 2는 알츠하이머 모델 초파리에서 저선량 방사선 특이적으로 반응하는 기능별 유전자군을 도시하였다.
도 3은 알츠하이머 완화 방향의 발현 변화를 나타낸 저선량 방사선 특이적 반응 유전자 목록을 도시하였다.
도 4는 상기 도 3에 제시된 유전자들에 대하여 Real-time PCR을 통한 발현 변화를 도시하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따른 저선량 방사선에 감응성 있는 면역 활성 유전자, 신경제포 재생에 관여하는 유전자 및 운동성 기능에 관여하는 유전자를 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커를 제공한다.
상기 저선량 방사선은 누적선량 0.01 내지 0.2 Gy가 되도록 조사하는 것이 바람직하며, 각각 선량률을 다르게하여(137Cs, 15.936 mGy/s, 3.147 mGy/s, 5 mGy/h), 누적선량이 0.01 내지 0.2 Gy가 되도록 조사하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 누적선량이 0.05 Gy가 되도록 조사하는 것이 더욱 바람직하다. UN산하기구 UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation)에 따르면, 누적선량 100 mGy이하를 저선량으로 규정하고 있다. 따라서 본 발명의 저선량의 기준도 상기 UNSCEAR의 기준을 따랐다.
상기 초파리는 알츠하이머 질환 모델 초파리인 것을 특징으로 한다. 상기 알츠하이머 질환 모델 초파리는 GMR>Aβ42 또는 elav>Aβ42인 것을 특징으로 한다. 상기 GMR>Aβ42와 elav>Aβ42는 알츠하이머 질환 모델 초파리이며, UAS/GAL4 시스템을 이용하여 초파리 신경 (neuron; elav-GAL4 이용) 특이적으로 알츠하이머 원인 유전자 Aβ42 (UAS- Aβ42 이용)를 과발현 시켜 알츠하이머 모델 초파리를 제작하여 실험에 사용하였다. 또한, RNA sequencing에 사용 될 선량을 결정하기 위해, 초파리 눈 (GMR-GAL4 이용) 특이적으로 Aβ42 (UAS- Aβ42 이용)를 과발현 시켜 알츠하이머 모델 초파리를 제작하였으며, 초파리 눈에 Aβ42를 과발현 시키면 눈의 크기가 작아지는 표현형이 관찰되는 특징이 있다.
상기 퇴행성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 한다. 알츠하이머병은 노인에게 주로 나타나는 치매의 주요 원인 가운데 하나이다. 알츠하이머병의 원인으로는 베타-아밀로이드(beta-amyloid) 단백질과 관련성이 높은 것으로 밝혀졌다. 베타 아밀로이드가 체내에서 과도하게 만들어져 뇌세포에 축적되면, 뇌 신경세포의 기능이 떨어져서 알츠하이머병이 발생한다. 베타 아밀로이드는 신경세포 내 미토콘드리아의 기능을 마비시키거나 왜곡시켜 미토콘드리아에서 배출되는 활성산소를 증가시키게 된다. 이렇게 증가된 활성산소는 세포 내 단백질이나 DNA에 치명적인 상처를 입히게 되고 결국 뇌세포의 손상 또는 세포사멸(apoptosis)을 초래한다.
상기 퇴행성 질환에 반응하는 유전자 분석은 방사선의 선량 및 선량률에 따른 개선효과가 다르게 나타남을 확인하기 위해, 저선량 방사선을 조사한 0-6시간 사이의 초파리 알(embryo)을 부화시켜 초파리 성체의 머리 조직을 분리하여 RNA sequencing method을 통해 전체 유전자의 발현 변화 패턴을 조사하여 저선량 방사선에 의해 발현 변화를 나타낸 유전자들을 분석하였다.
상기 바이오마커는 면역 활성 반응에 관여하는 유전자, 신경세포 재생에 관여하는 유전자, 운동성 기능에 관여하는 유전자 등이 포함하며, 상기 면역 활성에 반응하는 대표 유전자는 PGRP-SC1a, PGRP-SC1b이고, 신경세포 재생에 관여하는 대표 유전자는 en, Oseg4, PCNA, scra이며, 운동성 기능에 관여하는 대표 유전자는 Gas8, TrpA1이다. 그 외에 CG9272, ECSIT 등도 바이오 마커에 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 초파리 알츠하이머 모델에서 저선량 방사선의 선량 및 선량률에 따른 개선효과
초파리 눈에 Aβ42를 과발현 시키면 눈의 크기가 작아지는 표현형이 관찰되었다. 이를 이용하여 GMR-GAL4를 통해 초파리 눈 특이적으로 Aβ42를 과발현시킨 0-6시간 사이의 초파리 알(embryo)에 선량률을 서로 다르게하여(137Cs, 각각 15.936 mGy/s, 3.147 mGy/s, 5 mGy/s) 총 0.01~0.2 Gy의 저선량방사선을 조사한 후 25℃ 인큐베이터에서 성체가 될 때까지 배양하여 초파리 눈의 알츠하이머 표현형이 어떻게 달라지는지 비교하였다. 방사선의 선량 및 선량률에 따라 개선효과는 도 1a 및도 1b에 도시하였다.
도 1a과 도 1b를 참조하면, 정상 초파리 (GMR-GAL4)에 비해 감소하였던 알츠하이머 모델 초파리 (GMR>Aβ42)의 눈 크기가 저선량방사선 조사에 의해 변화하는 것을 확인 할 수 있었다. 15.936 mGy/s의 선량률로 0.05 Gy를 조사한 경우 눈의 크기가 가장 많이 증가하였다. 특히, 최종 선량 0.05 Gy를 조사한 경우 세가지 선량률 (a-c) 모두에서 유의미하게 눈의 크기가 증가한 것을 확인 할 수 있다. 이 외에 15.936 mGy/s로 0.1 Gy를 조사한 경우에도 눈의 크기가 증가하였다. 그러나 0.2 Gy를 조사한 경우에는 선량률에 따라 눈의 크기가 감소하거나 비슷하였다. 이 결과를 바탕으로, 0.05 Gy (15.936 mGy/s)의 저선량 방사선이 알츠하이머 질환 개선효과가 가장 크다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 알츠하이머 모델 초파리에서 저선량 방사선 특이적으로 반응하는 기능별 유전자군
상기 실시예 1에서 조사한 결과 중에서 가장 좋게 개선효과가 나타난 0.05 Gy (15.936 mGy/s)를 조사한 알츠하이머 모델 (elav>Aβ42) 초파리 알을 25℃ 인큐베이터에서 성체가 될 때까지 배양하여 부화시키고, 부화된 초파리 성체의 머리 조직을 분리하여 RNA sequencing method를 통해 전체 유전자의 발현 변화 패턴을 조사하였다. 좀더 자세하게는 알츠하이머 모델 초파리에 0.05 Gy의 방사선을 15.936 mGy/s의 선량률로 조사하였을 때, 발현이 2배 이상 변화하는 유전자(발현 증가, 82개; 발현 감소, 345개 - 총 427개)를 선정하였다. 이렇게 얻어진 427개의 유전자를 대상으로 gene ontology 분석과 KEGG pathway 분석을 진행하여, 유전자를 각 기능에 따라 분류하였다.
도 2를 참조하면, 알츠하이머 모델 초파리에서 저선량 방사선에 의해 변화되는 유전자들 기능적 분류 중 알츠하이머 질환과 관련 있을 것으로 생각되는 기능적 분류를 선별하고 그에 속하는 유전자들을 나타내었다. 0.05 Gy 방사선 조사에 따라 발현이 대표적으로 증가 (Up-regulated)하는 유전자와 발현이 감소 (Down-regulated)하는 유전자를 나타내었다. 이러한 저선량 방사선에 의해 발현 변화를 나타낸 유전자들을 기능별로 분류하여 도 2에 도시하였다.
실시예 3. 알츠하이머 완화 방향의 발현 변화를 나타낸 저선량 방사선 특이적 반응 유전자
상기 실시예 2에서 분류하여 제시된 유전자들 중 정상 초파리와 비교하였을 때, 저선량방사선 0.05 Gy에 의해 알츠하이머 증상을 완화시키는 방향으로 발현 변화가 일어난 유전자들을 선별하였다. 선별된 유전자들은 면역 활성 (PGRP-SC1a, PGRP-SC1b), 신경세포 재생 (en, Oseg4, PCNA, scra), 운동 기능 (Gas8, TrpA1)에 관여 한다고 이미 보고된 바 있었다. 그러나 본 연구에서는 저선량 방사선에 의해 특이적으로 변화되어 알츠하이머 질환을 개선하는 효과와 관련 있을 것이라는 것을 처음 제시하였다. 선별 결과는 도 3에 도시하였다.
실시예 4. 저선량방사선에 의해 알츠하이머 완화 방향으로 발현 변화가 나타난 대표적인 유전자들에 대한 Real-time PCR을 통한 발현 변화
상기 실시예 3에서 제시된 저선량 방사선에 의해 알츠하이머 증상을 완화시키는 유전자들의 발현을 real-time RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서의 변화를 다시 한번 확인함으로써 저선량 방사선에 의한 유전자의 발현 변화를 검증하였다. 그 결과는 도 4에 도시하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부함.

Claims (9)

  1. 저선량 방사선에 감응성 있는 면역 활성 유전자, 신경제포 재생에 관여하는 유전자 및 운동성 기능에 관여하는 유전자를 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 저선량 방사선은 누적선량 0.01 내지 0.2 Gy가 되도록 조사하는 것을 특징으로 하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 활성 유전자는 PGRP-SC1a, PGRP-SC1b 으로 이루어진 군에서 1 이상 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 신경제포 재생에 관여하는 유전자는 en, Oseg4, PCNA, scra 으로 이루어진 군에서 1 이상 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 운동성 기능에 관여하는 유전자는 Gas8, TrpA1 으로 이루어진 군에서 1 이상 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 초파리는 알츠하이머 질환 모델 초파리인 것을 특징으로 하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 알츠하이머 질환 모델 초파리는 GMR>Aβ42 또는 elav>Aβ42인 것을 특징으로 하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 퇴행성 질환은 알츠하이머병(Alzheimer'sdisease)인 것을 특징으로 하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커는 유전자 CG9272, ECSIT 로 이루어진 군에서 1 이상을 더 포함하는 초파리 퇴행성 질환 치료확인 바이오마커.
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