WO2019212379A1 - Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом - Google Patents

Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом Download PDF

Info

Publication number
WO2019212379A1
WO2019212379A1 PCT/RU2018/000292 RU2018000292W WO2019212379A1 WO 2019212379 A1 WO2019212379 A1 WO 2019212379A1 RU 2018000292 W RU2018000292 W RU 2018000292W WO 2019212379 A1 WO2019212379 A1 WO 2019212379A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composition according
spores
composition
probiotic
amount
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000292
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Farber Boris Slavinovich
FARBER Sofya Borisovna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farber Boris Slavinovich, FARBER Sofya Borisovna filed Critical Farber Boris Slavinovich
Priority to EA202090769A priority Critical patent/EA202090769A1/ru
Priority to US16/954,854 priority patent/US11446338B2/en
Priority to PCT/RU2018/000292 priority patent/WO2019212379A1/ru
Publication of WO2019212379A1 publication Critical patent/WO2019212379A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/525—Isoalloxazines, e.g. riboflavins, vitamin B2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/15—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/175—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid, pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-aminoacids, e.g. alanine, edetic acids [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/205—Amine addition salts of organic acids; Inner quaternary ammonium salts, e.g. betaine, carnitine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A61K31/51—Thiamines, e.g. vitamin B1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/714—Cobalamins, e.g. cyanocobalamin, i.e. vitamin B12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/748—Cyanobacteria, i.e. blue-green bacteria or blue-green algae, e.g. spirulina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/484—Glycyrrhiza (licorice)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/66—Papaveraceae (Poppy family), e.g. bloodroot
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
    • A61K8/445—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof aromatic, i.e. the carboxylic acid directly linked to the aromatic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/46—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur
    • A61K8/466—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur containing sulfonic acid derivatives; Salts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
    • A61K8/4926—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom having six membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/602—Glycosides, e.g. rutin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/67—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/67—Vitamins
    • A61K8/673—Vitamin B group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9728—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q90/00—Cosmetics or similar toiletry preparations for specific uses not provided for in other groups of this subclass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Definitions

  • the invention relates to biotechnology, can be used in the food industry, medicine and cosmetology in the prevention and / or treatment of diseases associated with immunodeficiencies and respiratory viral infections.
  • probiotics The main area of application of probiotics is diseases of the gastrointestinal tract, since these microorganisms have antagonistic activity against pathogenic and conditionally pathogenic intestinal bacteria, ensure the restoration of normal intestinal microflora, promote the digestion of food components, produce substances necessary for the body (carboxylic acids, vitamins), stimulate local immunity. In addition, they can be used in the treatment of other diseases - gynecological, allergic, cardiovascular, etc.
  • Microorganisms included in the group of probiotics should have:
  • these requirements correspond to microorganisms capable of forming spores.
  • Bacillus coagulans One of the most promising spore-forming microorganisms is the spore-forming lactobacillus Bacillus coagulans. In the form of spores, it tolerates technological processes and storage well, it is not destroyed under the influence of gastric juice and bile. Once in the duodenum, Bacillus coagulans spores can germinate in vegetative bacteria in the lumen of the human intestine and exert their probiotic effects.
  • Bacillus coagulans is not only a part of dietary supplements. Recently, based on this bacterium, a number of drugs with proven clinical efficacy have appeared on the global pharmaceutical market.
  • Bacillus coagulans Hammer NRS 727 ATCC No. 1 1014
  • Bacillus coagulans Hammer strain C ATCC No. 11369
  • Bacillus coagulans Hammer ATCC No. 31284
  • Bacillus coagulans Hammer NCA 4259 ATCC No. 15949
  • Bacillus coagulans strain ATCC 7050 Purified bacteria Bacillus coagulans are also available in the Deutsche Sarumlung von Mikroorganismen und Zellunckell, Germany class numbers, Germany : Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM No. 2356), Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM No. 2383, consistent with ATCC No.
  • Bacillus coagulans Hammer (DSM No. 2384, consistent with ATCC No. 11369), and Bacillus coagulans Hammer (DSM No 2385, consistent with ATCC No. 15949). Bacillus coagulans is also produced commercially by manufacturers such as Sabinsa Corporation (Piscataway, NJ) or K Fermentation Co. (Kyoto, Japan).
  • the spore of B. coagulans is located at one of the poles of the cell and has the shape of an ellipse, is resistant to heat and other adverse environmental conditions and can grow from dilute solutions of hydrochloric acid and sodium hydroxide. It forms colonies of about 2.5 mm in diameter, which have a convex shape, shiny, not emitting any pigments. By biological properties, it occupies an intermediate position between two genera - Bacillus and Lactobacillus. Being a spore-forming bacterium, it simultaneously produces lactic acid, is not able to reduce nitrates and does not contain oxidase.
  • a number of properties combine Bacillus coagulans with representatives of the genus Bacillus. This is, above all, the ability to form spores and colonies.
  • the microorganism uses such substances as carbohydrates, peptones, meat and yeast extract. It produces acids from substrates such as arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose and trehalose. Does not hydrolyze starch, casein, gelatin. Does not produce hydrogen sulfide and indole.
  • Bacillus coagulans there are characteristics that distinguish Bacillus coagulans from the genus Bacillus. So, the bacterium Bacillus coagulans has a predominantly curved shape, and lactic acid bacteria - curved. Like Bacillus coagulans, lactic acid bacteria exhibit very low motility. In Bacillus coagulans and in lactic acid bacteria, spores are located in the terminal portion of the cell, and not in the center, as in Bacillus. They give a negative oxidase test. It produces dextrorotatory lactic acid from glucose, fructose, sucrose and trehalose. Unlike most Bacillus, it does not reduce nitrates to nitrites. In Bacillus DNA, the molar percentage of the guanine-cytosine pair reaches 69%, while in Lactobacillus it does not exceed 53%.
  • Bacillus coagulans spores are resistant to antibiotics. Due to this, the probiotic can be used together with standard chemotherapy, without the risk of suppressing its activity.
  • the main bactericidal effect in the human gastrointestinal tract is carried out by three factors - gastric secretion, hydrochloric acid and bile.
  • the acidic environment of the stomach (pH 3) and proteases (pepsin) destroy most of the bacteria that enter the food.
  • pepsin proteases
  • Experimental and clinical studies have shown that under the influence of gastric juice and bile, probiotics lose up to 90% of their activity until they enter the intestine.
  • Bacillus coagulans in a vegetative form cannot withstand exposure to pH ⁇ 3, although it was shown that the CNCMI-1061 Bacillus coagulans strain, used as a probiotic in chickens, retains up to 50% of its living forms in the acidic environment of the stomach .
  • all bacteria of the genus Bacillus, including Bacillus coagulans are resistant to acidic pH values.
  • Bacillus coagulans is used in the form of spores ensures its resistance to the acidic contents of the stomach. It is noted that when it enters the stomach, the spores of this microorganism can withstand a long stay in the acidic environment of the stomach and are not digested by gastric juice.
  • Bile serves as a second barrier for microorganisms, since it contains toxic salts of bile acids for microorganisms, which make up about 50% of its composition. Resistance to the action of bile acids is one of the main criteria for the selection of microorganisms for use as probiotics.
  • a bile concentration of 0.3% is critical and is used to test the sensitivity of various probiotic microorganisms to it.
  • Bacillus coagulans is sufficiently resistant to the first two factors (acid and bile), then the occurrence of anaerobic conditions (despite the fact that it is not an obligate anaerobic) or, possibly, any other unfavorable factors, lead to the fact that this microorganism the distal intestine undergoes respiration, and largely in this form, leaves the human body.
  • Bacillus coagulans is excreted slowly from the body - after the last administration of the probiotic, spores in the feces are detected within 7 days. This phenomenon is regarded as a great clinical advantage, because after the last dose of the drug, its effect lasts another whole week, which allows you to quickly, fully, without the risk of complications and relapses, restore the function of the gastrointestinal tract after the disease. At the same time, the fact that Bacillus coagulans, in the end, leave the human body is of great importance - this helps to restore their own microflora, which is native to humans, without the risk of introducing genetically foreign strains into it
  • Bacillus coagulans belongs to semi-resident lactobacilli - having performed the function of a probiotic in the human body, it leaves the body. This is also an advantage of this microorganism, as it helps to restore its own microflora, individual for each person, without the risk of introducing genetically foreign strains into it
  • Bacillus coagulans have advantages over most other bacteria used as probiotics. It occupies an intermediate position between the genera Bacillus and Lactobacillus, being a spore-forming bacterium producing lactic acid.
  • This bacterium in the form of spores tolerates technological processes, is well stored, resistant to antibiotics and does not break down under the influence of gastric juice and bile. Once in the duodenum, spores mature and begin to multiply, providing probiotic effects.
  • Bacillus coagulans refers to semi-resident bacteria - having performed the function of a probiotic in the human body, it goes through the sporulation phase and slowly leaves the body, excreting itself with feces in the form of spores. Thus, it does not violate the individual composition of the intestinal mycoflora. Bacillus coagulans improves the microbiological composition of the intestine, increasing the number of obligate microorganisms and displacing the pathogenic flora.
  • probiotics in general can have the following effects:
  • Bacillus coagulans produces coagulin - a bacteriocin belonging to the pediocin family. It is a peptide consisting of 44 amino acid residues, the sequence of which is similar with such pediocins. Coagulin and pediocin differ only in one amino acid in the C-terminal region. Its molecular weight is in the range of 3-4 kDa. This bacteriocin is encoded by an approximately 14 kB fragment in plasmid p14. The latter expresses this bacteriocin rather stably and independently.
  • the inhibitory effect of coagulin against intestinal bacteria of the genera Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria and Pediococcus has been established.
  • the probiotic can exhibit both bacteriostatic and bactericidal effects.
  • Coagulin is stable at temperatures up to 60 ° C, pH in the range of 4-8, does not break down under the influence of a-amylase, lipase or organic solvents. Being a peptide, it is inactivated by proteases.
  • lactosporin Another well-studied bacteriocin from this microorganism, lactosporin, is secreted by the bacterium in a lower concentration and only in the presence of a pathogenic target bacterium in the nutrient medium or intestine.
  • the antimicrobial activity of lactosporin was also confirmed against the target - Micrococcus luteus ATCC 10420 by agar diffusion.
  • the protein nature of lactosporin is confirmed by its inactivation by proteolytic enzymes. Although the activity of lactosporin was pH dependent, it was stable to heat. The isoelectric point of lactosporin was in the range of 3.5-4.0.
  • Bacillus coagulans bacteriocins inhibit both gram-positive and gram-negative flora, and some putrefactive fungi of the genus Fusarium.
  • Normoflora present in the intestine also protects the body from invasion of pathogenic microbes. She herself acquired various mechanisms of resistance to the action of destructive factors of the intestine, for example, by the formation of capsular polysaccharides on the surface of the cell wall. Normal microflora colonizes the intestine, occupying its entire free surface and, thereby, making pathogens physically impossible to attach. Membrane flora through glycoconjugated receptors binds to the surface structures of the epithelium and enhances the production of mucus, thereby compacting the cytoskeleton of epithelial cells. The dominant flora competitively consumes all the necessary nutrients, and also releases bacteriocins - substances that inhibit the growth of microorganisms received from the outside.
  • Bacillus coagulans does not remain in the human body forever, but leaves it 7 days after the last dose. Consequently, he does not violate natural intestinal microbiocenosis, which was formed throughout the life of a particular person.
  • the stimulating effect of the probiotic on cellular immunity has been established in rats and mice in response to exposure to a T-dependent antigen. Preliminary administration of the probiotic caused a decrease in the foot thickness of rats over time after administration of the BCG vaccine.
  • the data obtained indicate that Bacillus coagulans has a stimulating effect against both cellular and humoral immunity.
  • the supernatant of live bacteria was obtained by centrifugation, and to obtain fragments of the cell wall, the bacteria were destroyed by freezing-thawing, then the sediment was centrifuged and resuspended.
  • the effect of bacteria on peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells has been studied.
  • the supernatant had a pronounced dose-dependent effect on the migration of polymorphonuclear leukocytes, and on both types of migration - spontaneous and directed (caused by chemotaxis).
  • Directional migration was induced by three agents — the bacterial peptide f-MLP, the pro-inflammatory interleukin IL-8, and leukotriene LTB-4.
  • the supernatant was diluted 1: 10, spontaneous migration increased by 300%, the cell walls caused a weaker increase - by 25%.
  • Peptide-induced migration was increased by 200% in a 1: 10 dilution, and cell walls by 25%.
  • Migration caused by interleukin-8 was suppressed by cell walls by 60%, and by supernatan to a slightly lesser extent.
  • Bacillus coagulans has a pronounced anti-inflammatory effect, supports the basic mechanisms of natural immunity.
  • Activity in In vitro experiments show both the cell wall of the bacterium and its metabolites. The manifestation of the identified types of activity is useful not only from the point of view of protecting the intestines from pathogens, but also in terms of anti-inflammatory effects, maintaining the integrity of the epithelium and normal digestion.
  • spores of bacteria of this genus having sizes of about 2 ⁇ m, can be captured by M-cells of the intestinal mucosa, which transfer them to Peyer's plaques and further to the lymph nodes.
  • spores When administered orally to mice, spores elicit a systemic immune response in the form of an IgG subclass of IgG2a and a local response, the release of slgA.
  • Analysis of the mucosal cytokines of the lymphocytes of the intestinal immune system indicates an early induction of interferon-g, cytokine YOU, the pro-inflammatory cytokine TNF-a.
  • macrophages of mice efficiently phagocytosed B.
  • subtilis spores from the culture medium. Spores can germinate inside the phagocyte and initiate the expression of genes responsible for the vegetation of the microorganism and protein synthesis. Meanwhile, such sprouted spores ceased to grow and after about 5 hours were destroyed by lysis in the phagosomes of phagocytes. These studies are very important because they show that spores can interact with the intestinal lymphoid system, and this serves as a mechanism for stimulating the immune system and determines one of the mechanisms of action of probiotics.
  • C. difficile secretes toxins (primarily toxin A), which trigger the activation of three transcription factors.
  • Nuclear factor kappa-B NF-kV
  • NF-kV Nuclear factor kappa-B
  • AP-1 Activator protein-1
  • IL-8 interleukin-8
  • An important point is the cAMP binding protein, which is necessary for the synthesis of prostaglandin E2, which determines increased secretion of fluid and the occurrence of diarrhea, as well as stimulation of the production of Fas ligand and apoptosis of intestinal epithelial cells.
  • Bacillus coagulans has been shown to be effective in a mouse colitis model induced by Clostridium difficile.
  • Bacillus coagulans (or saline) was administered to mice orally at 2 s 10 9 CFU for 15 days.
  • the pathology was caused by the introduction of a mixture of antibiotics from 5 to 8 days, clindamycin on day 10 and C. difficile culture of 10 4 CFU on day 11 of the experiment.
  • the study showed that under the conditions of administration of Bacillus coagulans, no death of mice occurred, and 2 animals died in the control group.
  • the subjects took a probiotic in the form of capsules 1 time per day at a dose of 2 x 10 6 CFU for 30 days.
  • blood samples of volunteers were taken and the cytokines were determined in vitro after exposure of T cells with adenovirus and influenza A.
  • a significant increase in the production of tumor necrosis factor TNF-a was detected in response to exposure to adenovirus and influenza virus And - by 250% and 1709%, respectively, in comparison with the initial indicators. This indicates the immunomodulating properties of Bacillus coagulans - an increase in the T-cell response in viral infections.
  • Bacillus coagulans has an immunomodulatory effect, stimulating cellular and humoral immunity.
  • the metabolites secreted by the bacterium, its cell wall and spores have an immunomodulatory effect.
  • Such structures are combinatorial derivatives.
  • Bacillus coagulans For the antiviral and probiotic properties of Bacillus coagulans to appear due to antagonism to pathogenic bacteria through the bacteriocin system, the bacterium must also be present in the intestine in a vegetative form.
  • plant growth activators such as gibberellin.
  • gibberellin Such compounds were not previously used to stimulate spore termination, and we studied for the first time: a more than 10-fold increase in the percentage and rate of spore germination was shown when these activators were added to the nutrient medium.
  • the covalent modification of the surface of the spores did not affect their viability in any way.
  • the term “drug” encompasses drugs for use in both humans and animals in medicine and veterinary medicine.
  • the term “drug,” as used herein, means any substance that provides a therapeutic and / or beneficial effect.
  • the term “medicine”, as used here, is not necessarily limited to substances for which permission to sell on the country's market is required, but may include substances that can be used in cosmetics, dietary supplements, food products (including food and drinks, for example), probiotic cultures, food additives and natural medicines.
  • the term “drug”, as used here encompasses a product intended for inclusion in animal feed, for example, livestock feed and / or pet food.
  • the improvement of the intestinal microbiota refers to an increase in the number and / or type of microorganisms present in the intestines of the host, and / or an increase in the activity of these microorganisms in terms of their metabolic, structural, protective and other useful functions.
  • the term “innate immune system”, also known as a non-specific immune system includes cells and mechanisms that provide the host with immediate protection against infection by other organisms in a non-specific way. This means that the cells of the innate system recognize pathogens and respond to them genetically, but unlike the adaptive immune system, it does not provide the owner with a long-term or protective immunity.
  • the term “regulation of the innate immune system” means inducing the activity of the innate immune system and / or increasing the level of activity relative to the initial level of activity, so that it promotes
  • An adaptive immune response gives the vertebral immune system the ability to recognize and recall specific pathogens (for the formation of immunity), and raise it in stronger attacks every time it encounters a pathogen.
  • the term "regulation of the adaptive immune system” means the induction of activity of the adaptive immune system and / or stimulation relative to the initial level of activity.
  • the adaptive immune system undergoes modulation in the direction of immunoregulation (rather than activation of the immune system, hence reducing inflammation).
  • T cell reactions associated with THY, Th2, and THY 7 are associated with topical, inflammatory, and autoimmune diseases.
  • Therapies that improve or increase regulatory T cell populations are important in controlling diseases triggered by excessive T cell responses associated with TB, Th2, and TB 7.
  • Forms of diarrhea that can be treated prophylactically and / or therapeutically in accordance with the invention include acute diarrhea and chronic diarrhea.
  • the diarrhea that is treated in accordance with the invention is diarrhea of an infectious nature that is caused by a viral, bacterial or parasitic pathogen.
  • diarrhea that is treated according to the invention is non-infectious diarrhea.
  • Non-infectious diarrhea can be, for example, diarrhea caused by food intolerance, diarrhea caused by a fatty diet, diarrhea caused by alcohol, diarrhea caused by a psychological factor, diarrhea caused by the administration of a drug, diarrhea caused by the use of a therapeutic procedure, diarrhea associated with a disease or with a clinical condition, or diarrhea associated with drug withdrawal.
  • the term "probiotic strain” in this description is intended to refer to a strain of a living microorganism that has a beneficial effect on the health of the host.
  • the owner is a person, but it can be assumed that the owner may be another mammal, for example a dog, cat, ruminant, namely a sheep, goat, calf, cow, deer, camel, horse, wild boar, in particular pigs and piglets , leporids (hare), murid (mouse) and rodents of the Caviidae family (mumps).
  • the strain tested using the method according to the invention can be any strain of the microorganism.
  • the test strain is a yeast strain.
  • the test strain is a bacterial strain.
  • the test strain is preferably selected from bacteria recognized as safe for humans and / or animals.
  • bacteria of the genus Bifidobacterium in particular the species Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum and Bifidobacterium breve; bacteria of the genus Lactobacillus, in particular kinds of Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosu and Lactobacillus salivarius; bacteria of the genus Weisella, in particular species Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thail
  • a "sporulating form" of a bacterium means a form bacteria placed in adverse conditions.
  • the spores of each of the probiotic bacteria according to this invention can be covalently chemically modified at surface antigens to increase adhesive properties.
  • the sporulating form is a stable form that allows bacteria to withstand adverse environmental conditions, such as, for example, lack of nutrients, i.e., limiting nutrient medium, lack of water, wide fluctuations in pH or temperature, or passage through the digestive tract .
  • Unfavorable conditions for bacterial cells are created, for example, by not updating the culture medium of bacteria, stopping the supply of nutrients to the culture medium, using a limiting nutrient medium, changing the temperature, changing the pH value or their combination.
  • the method for producing Bacillus coagulans cells may also comprise an additional step of drying the cells to obtain Bacillus coagulans cells in dry form.
  • Bacillus coagulans cells in dry form means that the biomass obtained at the end of this method for producing Bacillus coagulans cells contains more than 90% dry matter, preferably more than 95% dry matter. Drying is, for example, lyophilization drying, vortex spray drying or spray drying.
  • Acute diarrhea means diarrhea whose symptoms last for less than two weeks, and "chronic diarrhea” means diarrhea whose symptoms last for at least two weeks, preferably at least one month.
  • Acute diarrhea includes, for example, viral gastroenteritis, bacterial gastroenteritis and food intoxication (e.g. salmonellosis, shigellosis, Staphylococcus aureus infections, Bacillus cereus infections, Escherichia coli infections).
  • Chronic diarrhea includes, for example, reduced absorption syndrome, gastroenteropathy (celiac enteropathy, Whipple's disease, Crohn's disease, etc.), motor diarrhea (i.e. diarrhea as a result of the passage of contents through the intestines), secretory diarrhea (i.e.
  • Other types of diarrhea that can be treated with a probiotic strain according to the invention or cells obtained by culturing a probiotic strain according to the invention include diarrhea resulting from anxiety or strong emotions, diarrhea resulting from food intolerance (e.g.
  • diarrhea resulting from certain treatments such as treatment for magnesia, radiotherapy or chemotherapy, or certain types of surgery, for example, gastrectomy or ileum resection, diarrhea resulting from overflow or irritation of the stomach, intestines, colon, etc., diarrhea resulting from withdrawal ome substances such as heroin, diarrhea resulting from use of certain drugs such as antibiotics.
  • Other examples of diarrhea that can be treated with a probiotic strain according to the invention or cells obtained by culturing a probiotic strain according to the invention include diarrhea accompanying an attack of spillage of bile or indigestion, diarrhea resulting from excessive consumption of certain laxative foods, and diarrhea of runners.
  • the diarrhea that is treated with the probiotic strain of the invention or cells obtained by ultiating the probiotic strain of the invention is not diarrhea caused by the administration of an antibiotic or, more generally, the administration of a drug.
  • diarrhea that is treated with a probiotic strain of the invention or cells obtained by culturing a probiotic strain of the invention is not infectious diarrhea.
  • the closest prototype of the invention are sweet and healing compositions containing at least one prebiotic and one probiotic (US Patent US 9,114,169 B2).
  • B. coagulans and S. boulardii are also considered probiotics.
  • the disadvantage of the invention is the lack of a significant prophylactic effect of the composition against respiratory viruses, in particular influenza, due to the absence of covalent chemically modified spores of B. coagulans. While in our application it was shown that covalent modification of spores can increase their immunomodulatory effect by several times due to an increase in their adhesion to phagocyte receptors and intestinal epithelium, which increases the percentage of spores subjected to termination.
  • activators of spore germination gibberellin, para-aminobenzoic acid; carnitine; auxin or his derivative.
  • gibberellin para-aminobenzoic acid
  • carnitine carnitine
  • auxin or his derivative activators of spore germination
  • these substances were known as activators - stimulants of plant growth, seed germination, but were not known as activators of bacterial spore hatching, especially in food / cosmetic compositions.
  • the combined use of modified spores with germination activators significantly enhances the immunomodulatory and antiviral effects of the composition.
  • the thermal stability of all components allows you to include them both hot and cold drinks, toothpastes and food additives.
  • benzylisoquinoline derivatives (papaverine) or the raw materials containing them (poppy seeds) are included in the composition. These substances have the ability to accelerate the growth of probiotics, increase the degree of colonization of the intestine, which reduces the time of onset of
  • the basis of the invention is the task to develop a food, cosmetic and pharmaceutical composition with a powerful immunomodulating and protective antiviral effect.
  • this composition may further include compounds of the benzylisoquinoline group or raw materials, their containing plant extracts with glycosides, and also include at least two of the following components: gibberellin, para-aminobenzoic acid; carnitine; auxin or its derivative.
  • the degree of surface modification of the spores of the saprophytic probiotic bacterium B. coagulans is in an amount up to 300% in terms of the mass of spores after drying.
  • the covalent chemical modification of spores of the saprophytic probiotic bacterium B. coagulans is represented by acylation of dicarboxylic and polycarboxylic acids anhydrides or halides.
  • the modification of spores can be carried out through the alkylation process with halogen derivatives of carboxylic and polycarboxylic acids.
  • the composition may contain saprophytic probiotic fungus S.
  • the composition may also include as a plant extract with glycosides licorice extract in an amount of from 0.05% to 0.5% by weight of the product.
  • the composition may also include, as a plant extract with glycosides, stevia extract in an amount of from 0.05% to 0.5%.
  • the composition may also include, as a plant extract with glycosides, spirulina extract in an amount of from 0.05% to 5% by weight of the product and / or alfalfa extract in an amount of from 0.05% to 5% by weight of the product.
  • the composition is characterized in that the amount of the probiotic bacterium B. coagulans is from 1 to 10 lg KUO / ml per dose of the product.
  • the composition may also be characterized in that the raw material containing the compounds of the benzylisoquinoline group is crushed ripe poppy seeds or an extract of ripe poppy seeds or papaverine.
  • the composition may also contain gibberellin spore germination activators in an amount of 0.01-0.05% by weight of the product.
  • the composition of another implementation of the invention may contain para-aminobenzoic acid in an amount of 0.01-0.5% by weight of the product.
  • the composition of another implementation of the invention may contain carnitine in an amount of 0.1 to 1.0% by weight of the product.
  • the composition may also contain auxin or its derivative in an amount of 0.01-0.05% by weight of the product.
  • Any probiotic strain of B. coagulans 1 can be used to obtain spores.
  • the culture is inoculated, for example, strains of Bacillus coagulans MTCC 5856, Bacillus coagulans ATCC 31284, Bacillus coagulans NBRC 3887, Bacillus coagulans ATCC 7050 or any other in 1.0 liter of broth nutrient medium glucose and acetate extract (HiMedia, Mumbai, India) or MRS broth, containing 0.5% Tween-80, or in an environment based on corn extract powder and incubated at 37 ° C for 24-48 hours;
  • the nutrient medium is centrifuged at 20g for 2 hours, the spore precipitate is washed twice with distilled water. A spore suspension is obtained in a ratio of dry sediment to water of 1: 100. In the resulting suspension containing purified spores, residual nitrogen is determined and converted to protein by any classical method known to a person skilled in the art.
  • Dry succinic anhydride is added to the spore suspension in an amount up to 300% by weight of dry spores (for example, 300 mg of succinic anhydride is added per 100 mg of dried spores) and the solution is stirred until the precipitate of succinic anhydride is completely dissolved. Modification of more than 300% of the dry mass of spores leads to a loss in spores of viability and germination ability, they completely die.
  • succinic anhydride other carboxylic and polycarboxylic acid anhydrides and halides may be used.
  • an alkylation process using haloalkanes or halogen derivatives of carboxylic and polycarboxylic acids can be used. Modification should lead to an increase in the total negative charge of the spore surface. This enhances the adhesion of spores to the intestinal walls, enhances the phagocytosis of such spores by macrophages and causes a more active immune response in shorter terms.
  • the modified spore solution is lyophilized or dried on a tray at a temperature of up to 40 ° C and then used to obtain the composition according to the claimed invention.
  • Example 2 Obtaining a composition based on covalently chemically
  • KHMSB modified B. coagulans spores
  • any mixer for solids carry out the manufacture of the composition according to the invention.
  • Dry KHMSB with an activity of 1-50 lg KUO is introduced into the mixer / g, add dry lyophilized powder of S. boulardii in an amount of from 1 to 50 lg KUO / g, add licorice extract in an amount of from 0.05% to 0.5% of the total weight of the composition, add stevia extract in an amount of from 0.05 % to 0.5% of the total weight of the composition, add spirulina extract in an amount of from 0.05% to 5% of the total weight of the composition, add alfalfa extract in an amount of from 0.05% to 5% by weight of the product, add crushed mature poppy seeds grain or poppy extract or papaverine in an amount of from 0.05% to 5% by weight of the composition, add gibberellin in an amount e 0.01-0.05% by weight of the composition, carnitine is added in an amount of 0.1 -1.0% by weight of the
  • the composition may include para-aminobenzoic acids in an amount of 0.01-0.5% by weight of the composition and auxin or its derivative in an amount of 0.01-0.05% by weight of the composition.
  • the mixture is mixed in a mixer until smooth and used in the future to obtain food and pharmaceutical compositions, toothpastes and cosmetic creams.
  • KHMSB in the form of a suspension in the amount of 0.1 g / 1 ml of distilled water is applied to the surface of six Petri dishes with Lacto medium.
  • a similar procedure is carried out with different compositions KHMSB (presented in table 1) 6 Petri dishes per sample. Unmodified spores are applied to the last group of Petri dishes. Every 3 hours, a smear sample is taken, stained according to Gram and the presence and quantity of colony forming units — vegetative sprouted forms of Bacillus coagulans (BC) —are determined. The results are presented in table 2.
  • Example 3 Obtaining food, cosmetic and pharmaceutical products based on the composition of example 2.
  • the core of the product is the composition of Example 2.
  • the amount of which varies in the product from 0.1% to 30% by weight of the product.
  • the introduction of less than 0.1% does not allow the composition to show its antiviral and immunomodulating properties, more than 30% of the activity of the product does not increase, which is not rational.
  • the composition of the invention may be a food composition, a bioactive food supplement, or a pharmaceutical composition.
  • Food composition means any type of product, drink or confectionery.
  • the food composition for example, may be a beverage, briquetted cereal concentrate, chewing gum, chocolate, a dairy product such as a dairy product made by fermentation of a plant product.
  • the proposed composition can be introduced into cold and hot drinks, sweet foam in aerosol cans, ice cream, cookies, yogurts, cakes, sweets, sausages, sausages, dry mixes for feeding children, beer drinks and low alcohol drinks, toothpastes, creams.
  • "Bioactive food supplement” means a food product whose purpose is to supplement a normal diet.
  • a bioactive food supplement is a concentrated source of nutrients or other substances that have a nutritional or physiological effect, alone or in combination.
  • the bioactive food supplement is marketed in a dosage form, namely in such dosage forms as a capsule, lozenge, tablet, pill, and other similar forms, powder sachets, liquid ampoules, dropper vials, and other similar liquid or powder forms drugs that are intended to be taken in measured units of a small amount.
  • the composition may also include amino acids: glycine, arginine, lysine, taurine, phenylalanine or mixtures thereof and any other amino acids.
  • the composition may also include vitamins: ascorbic acid, thiamine, riboflavin, rutin, folic acid, cyanocobalamin or a mixture thereof, as well as any other vitamin.
  • the composition may also contain extracts of green or black tea, or any other plant extract used in the food industry.
  • the composition according to the invention is suitable for daily consumption of cells obtained by culturing a probiotic strain in an amount of from 1-10 8 CFU to 1 ⁇ 10 * 1 CFU, preferably in an amount of from 1-10 9 CFU to 10 10 CFU, in that case when it is intended for human consumption.
  • composition according to the invention is suitable for daily use of cells obtained by culturing a probiotic strain in an amount of from 1 to 10 5 CFU to 10 11 CFU, preferably in an amount of from 1 to 10 6 CFU to 1 to 10 CFU, when It is intended for use in veterinary medicine.
  • CFU refers to a colony forming unit.
  • Probiotics are preferably administered as an oral composition containing metabolically active, i.e. probiotic organisms, living and / or lyophilized or non-viable, heat-killed, irradiated or lysed, in the form of spores or covalently chemically modified spores.
  • the probiotic composition described herein can be administered orally as such, i.e.
  • the probiotic composition may be administered orally as a food or nutritional product, such as milk or whey-based fermented milk product or as a pharmaceutical product.
  • the composition is an edible product, such as a dairy product, a drink, juice, soup or baby food.
  • a probiotic may optionally be combined with at least one suitable prebiotic compound.
  • a “prebiotic” is usually an non-digestible carbohydrate, such as an oligo- or polysaccharide or alcohol sugar, which is not destroyed or absorbed in the upper part of the digestive tract.
  • Known commercially available prebiotics include inulin, fructo-oligosaccharides, oligofructose or galacto-oligosaccharides.
  • the term “edible product” is intended to encompass all consumed products, especially food products, and may be solid, jelly-like, or liquid. This term covers both finished products and products that are produced by using the probiotic composition as a starter only or in combination with conventional starter cultures or other probiotics.
  • Food products may, for example, be products of the dairy industry or the beverage industry. Alternatively, it may be a natural product.
  • the core of the product is the composition of Example 2.
  • the amount of which varies in the product from 0.1% to 30% by weight of the product.
  • the introduction of less than 0.1% does not allow the composition to show its antiviral and immunomodulating properties, more than 30% of the activity of the product does not increase, which is not rational.
  • physiologically acceptable diluent or excipient means any medium or additive that does not affect the biological activity of the active component (in this case, yeast or bacterial cells), and which is not too toxic to the patient or subject at the administered concentrations.
  • a physiologically acceptable diluent or excipient may be a diluent or excipient suitable for administration to humans and / or animals (in particular mammals).
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered using any effective combination of dosage and route of administration in order to obtain the desired therapeutic effect.
  • the exact amount intended for administration may vary from patient to patient, depending on the age, weight and general health of the patient, the origin and severity of diarrhea, etc.
  • the route of administration (oral or parenteral) can be selected depending on the origin of diarrhea and / or depending on the age and / or health of the patient.
  • the invention relates to the pharmaceutical composition as defined above, intended for daily use of cells obtained by culturing said probiotic strain in an amount of from 1 to 10 8 CFU to 1 ⁇ 10 * 1 CFU, preferably in an amount of from 1 to 10 9 CFU to 10 SKU, in the case when it is intended for human consumption.
  • the present invention also relates to the above pharmaceutical composition for daily use cells obtained by culturing said probiotic strain in an amount of 1 - 10 5 cfu to 1 - 10 1 1 CFU, preferably in an amount of 1 - 10 June cfu to 1 ⁇ 10 10 CFU, when it is intended for use in veterinary medicine.
  • the composition of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the route of administration and dosage in which the composition will be used.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be in any form suitable for administration to a mammal, in particular humans, for example, in the form of lozenges, tablets, sugar coated tablets, capsules, syrup, ointments, injectable solutions, suppositories, etc.
  • a person skilled in the art knows how to select the most suitable diluents and excipients for preparing this type of composition.
  • excipients such as water, 2,3-butanediol, Ringer's solution, isotonic sodium chloride solutions, synthetic mono- or diglycerides and oleic acid are often used in the preparation of injectable forms.
  • Liquid compositions including emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., can be formulated in the presence of solvents, solubilizers, emulsifying agents, oils, fatty acids and other additives such as suspending agents, preservatives, sweeteners, flavoring agents, viscosity-modifying agents, coloring agents, etc.
  • Solid compositions intended for administration by oral route can be formulated in the presence of an inert excipient such as sodium citrate, and optionally such additives as binders, wetting agents, disintegrants, absorption enhancers, lubricants, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated to immediately release the active (active) component or active components, in particular yeast cells or bacterial cells, obtained by culturing a probiotic strain.
  • the pharmaceutical composition may be formulated for the purpose of sustained or targeted release of the active ingredient or active components or to protect the active component or active components, for example, from intragastric acidity and enzymes.
  • coatings that are resistant to pH and / or gastric enzymes, coatings that are sensitive to pH and / or enzyme activity, or bioadhesive coatings that adhere to the walls of the stomach or intestines, or encapsulation systems can be used.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may contain at least one additional active pharmaceutical ingredient (i.e., in addition to yeast or bacterial cells obtained by culturing a probiotic strain).
  • active pharmaceutical ingredient means any compound or substance whose administration has a therapeutic or beneficial effect on the health condition or general condition of the patient or subject to which it is administered.
  • the active pharmaceutical ingredient may be active in preventing or treating diarrhea by administering a pharmaceutical composition; may be active against a condition or symptom associated with diarrhea (e.g., fever, vomiting, or abdominal cramps); or may increase the availability and / or activity of the active component or active components of the pharmaceutical composition.
  • active pharmaceutical ingredients examples include, without limitation, anti-inflammatory drugs, antibiotics, antipyretics, anti-emetics, antihistamines, vitamins, antispasmodics, etc.
  • the other active pharmaceutical ingredient is not a Bacillus coagulans strain or cells obtained by culturing such a strain, preferably it is not a bacterial strain or cells obtained by culturing such a strain, more preferably it is not a probiotic strain or cells obtained by culturing such a strain.
  • An example of a pharmaceutical composition according to the present invention is a composition containing yeast or bacterial cells obtained by culturing a probiotic strain as the sole active pharmaceutical ingredient.
  • the core of the product is the composition of Example 2.
  • the amount of which varies in the product from 0.1% to 30% by weight of the product.
  • the introduction of less than 0.1% does not allow the composition to show its antiviral and immunomodulating properties, more than 30% of the activity of the product does not increase, which is not rational.
  • probiotic release profiles for microorganisms can be controlled, such as, but not limited to, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Sporolactobacillus inulinus, Lactobacus lactobacillus bacillus acidophilus, Lactobacus bacillus bacillus acidophilus Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Pedioccocus acidilacti, Pedioccocus pentosaceus, Pedioccocus urinae, Leuconostoc mesenieroides, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticacus, Spor.
  • Bacillus coagulans Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticacus, Spor.
  • Breath fresheners are also known under the following trademarks: Retsyn (TM), Actizol (TM) and Nutrazin (TM).
  • TM Retsyn
  • TM Actizol
  • TM Nutrazin
  • Examples of odor control compositions are also described in US Pat. No. 5,300,305 to Stapler et al. And in Patent Application Publications N ° N ° US 2003/0215417 and 2004/0081713, which are hereby incorporated by reference for all purposes.
  • Dental care ingredients also known as oral care ingredients may include, but are not limited to, tooth whiteners, stain removers, stain removers oral cleaning, whitening agents, desensitizing agents, agents for remineralizing teeth, antibacterial agents, anticariotic agents, buffering agents to neutralize plaque acids, surfactants and anti-tartar agents.
  • Non-limiting examples of such ingredients may include hydrolytic agents, including proteolytic enzymes, abrasives such as hydrated silicon dioxide, calcium carbonate, sodium bicarbonate and alumina, other stain removing active ingredients, such as surfactants containing but not limited to anionic surfactants such as sodium stearate, sodium palmitate, sulfonated butyl oleate, sodium oleate, fumaric acid salts, glycerin, hydroxylated lecithin, sodium lauryl sulfate, and chelating agents such as polyphosphates, which are commonly used as anti-calculus ingredients.
  • hydrolytic agents including proteolytic enzymes, abrasives such as hydrated silicon dioxide, calcium carbonate, sodium bicarbonate and alumina, other stain removing active ingredients, such as surfactants containing but not limited to anionic surfactants such as sodium stearate, sodium palmitate, sulfonated butyl oleate, sodium oleate, fumaric acid
  • dentifrice ingredients may also include tetrasodium pyrophosphate and sodium tripolyphosphate, sodium bicarbonate, sodium acid pyrophosphate, sodium tripolyphosphate, xylitol, sodium hexametaphosphate.
  • peroxides are provided, such as carbamide peroxide, calcium peroxide, magnesium peroxide, sodium peroxide, hydrogen peroxide and peroxydisphosphate.
  • potassium nitrate and potassium citrate are provided.
  • casein-glycomacropeptide calcium casein peptone derivative — calcium phosphate, casein phosphopeptides, casein phosphopeptide — amorphous calcium phosphate (CPP-ACP), and amorphous calcium phosphate.
  • CPP-ACP amorphous calcium phosphate
  • Other further examples may include papain, krillase, pepsin, trypsin, lysozyme, dextranase, mutanase, glycoamylase, amylase, glucose oxidase, and combinations thereof.
  • Additional examples may include surfactants, such as sodium stearate, sodium ricinoleate and sodium lauryl sulfate, as surfactants for use in some embodiments to achieve enhanced prophylactic action, and to make dentifrice ingredients more acceptable.
  • surfactants can preferably be detergents that impart detergent and foaming properties to the composition.
  • Suitable examples of surfactants are water-soluble salts of higher aliphatic acid monoglycerides monosulfates, such as the sodium salt of monosulfonated fatty acid monoglyceride hydrogenated coconut oil, higher alkyl sulfates, such as sodium lauryl sulfate, alkylaryl sulfonates, such as sodium dodecylbenzenesulfonate, higher alkyl sulfoacetates, sodium lauryl sulfoacetate, higher esters of higher aliphatic acids, significant dihydroxypropyl sulfonates, such as having from 12 to 16 carbon atoms in fragments of an aliphatic acid, alkyl or acyl radicals, and the like.
  • higher alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate, alkylaryl sulfonates, such as sodium dodecylbenzenesulfonate, higher alkyl sulfoacetates
  • dentifrice ingredients may include antibacterial agents, such but not limited to triclosan, chlorhexidine, zinc citrate, silver nitrate, copper, limonene, and cetylpyridinium chloride.
  • additional anticariotic agents may include fluoride ions or fluorine-containing components, such as inorganic fluoride salts.
  • soluble alkali metal salts may be provided, for example, sodium fluoride, potassium fluoride, sodium fluorosilicate, ammonium fluorosilicate, sodium monofluorophosphate, and also tin fluorides such as stannous fluoride and stannous chloride.
  • a fluorine-containing compound can also be included as an ingredient, which has a beneficial effect on oral care and hygiene, for example, to reduce the solubility of enamel in acid and protect teeth from decay.
  • urea is included.
  • the PFC composition can be given orally or can be administered by intravascular, subcutaneous, intraperitoneal injection, in the form of an aerosol, by ocular route of administration, into the bladder, topically, and so on.
  • intravascular, subcutaneous, intraperitoneal injection in the form of an aerosol, by ocular route of administration, into the bladder, topically, and so on.
  • inhalation methods well known in the art.
  • the dose of the therapeutic composition will vary widely depending on the particular antimicrobial PFC administered, the nature of the disease, frequency of administration, route of administration, clearance of the agent used from the host, and the like.
  • the initial dose may be higher with subsequent lower maintenance doses.
  • the dose can be administered once a week or once every two weeks, or divided into smaller doses and administered once or several times a day, twice a week, and so on to maintain an effective dose level.
  • PFCs can be included in many therapeutic compositions. More specifically, the PFCs of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions in combination with suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and can be incorporated into preparations in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as capsules, powders, granules, ointments, creams, foams, solutions, suppositories, injections, forms for inhalation use, gels, microspheres, lotions and aerosols.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents such as capsules, powders, granules, ointments, creams, foams, solutions, suppositories, injections, forms for inhalation use, gels, microspheres, lotions and aerosols.
  • the administration of the compounds can be carried out in various ways, including oral, buccal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, transdermal, intratracheal administration and so on.
  • the PFCs of the invention can be distributed systemically after administration or can be localized using an implant or other composition that holds the active dose at the site of implantation.
  • the PFCs of the present invention can be administered alone, in combination with each other, or they can be used in combination with other known compounds (e.g. clopidogrel, anti-inflammatory agents, and so on).
  • the compounds may be administered in the form of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the following methods and excipients are given as examples only and are in no way limiting.
  • compositions can be used alone or in combination with suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example, with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato sodium starch or carboxymethyl cellulose; with lubricants such as talc or magnesium stearate; and, if desired, with diluents, buffering agents, moisturizing agents, preservatives and flavoring agents.
  • suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example, with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato sodium starch or carboxymethyl cellulose
  • PFCs should be included in injectable compositions by dissolving, suspending or emulsifying them in an aqueous or non-aqueous solvent such as vegetable or other similar oils, synthetic aliphatic acid glycerides, higher aliphatic acid esters or propylene glycol esters; and, if desired, with conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • PFCs can be used in an aerosol composition for inhalation administration.
  • the compounds of the present invention can be incorporated into suitable pressure propellants such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.
  • PFCs can be incorporated into suppositories by mixing with a variety of bases, such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • bases such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • the compounds of the present invention can be administered rectally using a suppository.
  • a suppository may contain excipients, such as cocoa butter, carboax, and polyethylene glycols, which melt at body temperature but are solid at room temperature.
  • Standard dosage forms for oral or rectal administration such as syrups, elixirs and suspensions, where each unit dose, for example, a teaspoon, tablespoon, tablet or suppository, can contain a predetermined amount of a composition containing one or more components of the composition of the present invention.
  • unit dosage forms for injection or intravenous administration may contain mixtures of the components of the present invention in a composition in the form of a solution in sterile water, normal saline, or another pharmaceutically acceptable carrier.
  • Implants for the sustained release of compositions are well known in the art. Implants are made in the form of microspheres, plates, and so on with biodegradable or non-biodegradable polymers. For example, lactic and / or glycolic acid polymers form a degradable polymer that is well tolerated by the host.
  • An implant containing the PFC according to the invention is positioned close to the focus of the pathology, so that the local concentration of the active agent is increased compared to other areas of the body.
  • unit dosage form refers to physically discrete units suitable for use as single doses for subjects of humans and animals, each unit containing a predetermined number of compounds of the present invention, which, according to calculations, is sufficient to provide the desired effect, together with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.
  • diluent carrier or excipient.
  • the descriptions of the unit dosage forms of the present invention depend on the particular composition-mixture used, and the effect to be achieved, and the pharmacodynamics of the mixture used in the host.
  • Pharmaceutically acceptable excipients such as excipients, adjuvants, carriers or diluents, are generally available.
  • Typical doses for systemic administration range from 0.1 pg to 1000 milligrams per kg of subject body weight per administration.
  • a typical dose may be one tablet for administration from two to six times a day, or one capsule or sustained-release tablet for administration once a day with a proportionally higher content of the active ingredient.
  • the effect of prolonged release may be due to the materials of which the capsule is made, which dissolve at different pH values, capsules that provide slow release under the influence of osmotic pressure or by any other known controlled release method, including based on covalent modification of bacterial spores.
  • dose levels may vary depending on the particular structure or mixture, the severity of the symptoms, and the subject's predisposition to side effects. Some of the specific structures / compositions are more potent than others. Preferred doses of this composition can be readily determined by those skilled in the art in a variety of ways. The preferred method is to measure the physiological activity of PFC.
  • One of the methods of interest is the use of liposomes as a vehicle for delivery. Liposomes fuse with the cells of the target region and ensure the delivery of liposome contents into the cells. The contact of the liposomes with the cells is maintained for a time sufficient for fusion using various methods of maintaining contact, such as isolation, binding agents and the like.
  • liposomes are designed to produce an aerosol for pulmonary administration.
  • Liposomes can be made with purified proteins or peptides that mediate fusion membranes such as Sendai virus or influenza virus and so on.
  • Lipids can be any useful combination of known liposome forming lipids, including cationic or zwitterionic lipids, such as phosphatidylcholine. The remaining lipids will usually be neutral or acidic lipids, such as cholesterol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and the like.
  • To obtain liposomes the method described by Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361.
  • lipids and a composition for incorporation into liposomes containing peptides are mixed in a suitable aqueous medium, suitably in a salt medium, where the total solids content will be in the range of about 110 wt.%.
  • a suitable aqueous medium suitably in a salt medium
  • the tube is placed in a warm water bath at approximately 25-40 ° C and this cycle is repeated approximately 5-10 times.
  • the composition is then sonicated for a suitable period of time, typically approximately 1-10 seconds, and optionally further mixed with a vortex mixer.
  • the volume is increased by adding an aqueous medium, usually increasing the volume by about 1-2 times, followed by agitation and cooling.
  • the method allows to include supramolecular structures with high total molecular weight, such as modified microbial spores, in liposomes.
  • compositions with other active agents are provided.
  • the PFCs of the invention can be formulated with other pharmaceutically active agents, in particular other antimicrobial and antiviral agents.
  • Other agents of interest also include a wide range of antianginal, antihypertensive, thrombolytic, anti-inflammatory agents known in the art.
  • Classes of drugs for the treatment of viral and microbial diarrhea, influenza and its complications are presented in standardized treatment protocols for this pathology and can be combined with patented PFC.
  • Cytokines for example interferon gamma, tumor necrosis factor alpha, interleukin 12, and so on, may also be included in the PFC composition of the invention.
  • the present invention is further described by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the invention.
  • Example 4 Protective antiviral activity of the composition obtained in Example 2, for example, the prevention of mortality in mice,
  • Tests were performed on 10 groups of young white laboratory mice, 10 in a group. To create immunodeficiency, all animals were injected intraperitoneally with cyclophosphamide once at a dose of 100 mg / kg 2 times a week: in group A, animals were orally given 0.2 ml of water instead of the CMSB composition daily 1 time per day for 10 days. This group acted as a positive control. The second group was administered KHMSB (option with S. boulardii) at a dose of 0.2 ml per animal orally. The third to sixth groups introduced different variants of the KHMSB. The seventh group was injected with Lactovit forte (BK with vitamins), the eighth group was administered Enterol (S.
  • the ninth group took KHMSB without S. boulardii, without benzyl isoquinolines and without termination activators (gibberellin, etc.).
  • the tenth group received orally the standard antiviral drug remantadine orally at a dose of 75 mg / kg daily 1 time per day. After a week of taking cyclophosphamide, the animals developed immunodeficiency at the cellular link. After that, all animals were infected by inoculation of the H1N1 influenza virus (California_2011) at a dose of 10 ED90 / mouse intranasally in 0.1 ml.
  • the main criterion for the effectiveness of a particular anti-influenza drug is the mortality rate of animals after inoculation of the virus. In the control group —Nb 9, the mortality rate was 90%.
  • Table 4 The research results are presented in table 4.
  • compositions were variants of the invention containing in one case papaverine and in another papaverine and S. boulardii. In both cases, all infected animals survived. Close results with 90% survival were observed in groups of 4-5 different embodiments of the compositions.
  • the pure spores of S. boulardii from the Lactovit-Forte preparation had significantly less prophylactic antiviral activity (30% of the animals only survived). The same pattern was observed with Enterol containing S. boulardii.
  • the anti-influenza drug Remantadin was able to protect only 50% of the animals.
  • the composition loses its antiviral preventive activity.
  • the presence of S. boulardii in the composition also prevented the death of animals in general. The mechanisms of this prophylactic effect are still not clear.
  • Rotavirus infection is an infectious disease caused by rotaviruses. It is the most common cause of diarrhea in children. This disease is characterized by an acute onset, mild symptoms of gastroenteritis or enteritis, a frequent combination of intestinal and respiratory syndromes in the initial period of the disease. Rotavirus infection is often incorrectly called “intestinal flu,” although rotavirus has nothing to do with influenza viruses.
  • the rotavirus subserotype B strain IMI B1 17 was used (Kharkov, Ukraine). This strain causes typical diarrhea in rats with loose stools, an increase in body temperature, a change in behavior (decreased mobility), a drop in appetite, and a deterioration in the appearance of hair (they become ruffled).
  • each rat was placed in a small cage, the bottom of which was covered with white paper.
  • the degree of diarrhea was fixed by the degree of contamination of the paper (in points from 1 to 10).
  • the time of onset of signs of viral diarrhea was also recorded.
  • the first stage of the experiment was the creation of an immuno-deficient background to increase the percentage of animals with viral diarrhea.
  • each animal was injected twice a week with 100 mg / kg of cyclospamide intravenously. Such a dose is able to suppress the cellular component of immunity and block the initial antiviral response of the body.
  • the animals were given orally different KHMSB compositions once a week, once a day, at a dose of 0.5 ml (0.2 g dry composition). Each composition was given to one group of rats, in each group of rats there were 6 animals. There were 10 groups in total.
  • Table 5 presents the distribution of groups and the results of a study of the prophylactic antidiarrheal effect caused by rotavirus B.
  • Respiratory coronavirus is represented by strains OS38, OS43, and the most common cause of enteritis is strain 229 E.
  • the name is explained by the presence of a special ring on the surface of the viral particle: peplomers in the form of club-shaped spike-like outgrowths resembling a corona are present on the lipid membrane or supercapsid.
  • Coronavirus can provoke damage to: the respiratory system; gastrointestinal tract; nervous system. Primary reproduction in the mucous membrane of the nasopharynx and respiratory tract, as a result there is a profuse runny nose, and in children bronchitis and pneumonia. In most cases, people encounter diarrhea and enteritis caused by coronaviruses
  • Alphacoronavirus 1 strain IMI K 105 (Kharkov, Ukraine) was used in the experiment. This strain causes typical diarrhea in rats with loose stools, fever, behavior changes (decreased mobility), a drop in appetite, a deterioration in the appearance of the coat (becoming tousled). To fix these characteristics, each rat was placed in a small cage, the bottom of which was covered with white paper. The degree of diarrhea was fixed by the degree of contamination of the paper (in points from 1 to 10). The time of onset of signs of viral diarrhea was also recorded. The first stage of the experiment was the creation of an immunodeficiency background to increase the percentage of animals with viral diarrhea.
  • each animal was injected twice a week with 100 mg / kg of weight cytlovosfamide intravenously. Such a dose is able to suppress the cellular component of immunity and block the initial antiviral response of the body.
  • the animals were given orally different KHMSB compositions once a week, once a day, at a dose of 0.5 ml (0.2 g dry composition).
  • Each composition was given to one group of rats, in each group of rats there were 6 animals. There were 10 groups in total.
  • Table 6 presents the distribution of groups and the results of a study of the prophylactic antidiarrheal effect caused by coronavirus.
  • Each animal was administered 1 ED90 of the virus in the culture medium orally.
  • mice were grouped according to the scheme described in example 3, except for the group with remantadine. There were 9 groups in total. Cyclophosphamide (CFA) was administered to all animals once at a dose of 250 mg / kg to induce immunodeficiency as shown in Example 3. After a week, they began to give HCMS samples orally at a dose of 0.2 ml orally (the dose contained 0.1 dry composition of HCMS).
  • CFA Cyclophosphamide
  • Hsp70, NO, and cytokine synthesis assay Isolation of murine peritoneal macrophages and spleen T-lymphocytes, measurement of TNF production was carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit (Mouse TNF-a ELISA Kit, PharMingen, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • NO Macrophages 10 6 cells / ml were cultured in 24-well plates (BioRad, Hannover, EU) in medium 199 with methylene red pH indicator at 37 0 C in a humidified atmosphere containing 5% C0 2. The medium was enriched with 25 mM HEPES, 3% fetal bovine serum.
  • the Griss reagent (containing 1% sulfanilamide / 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride and 2.5% H 3 P0 4 (1: 1)) was used to evaluate N0 2 , which served as an indicator of NO formation. After cultivation, 100 ml of each sample was placed in a 96-well plate with 100 ml of Griss reagent. Ten minutes later, the optical density was measured on a tablet spectrophotometer (Stat Fax 303 plus, Awareness technology inc., USA) at 590 nm.
  • Spleen lymphocytes 1.5 s 10 6 cells / ml, were cultured for 72 hours in 24-well plates in 199 medium at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% C0 2 .
  • the medium was supplemented with 25 mM HEPES, 5% fetal bovine serum and 5 mg / ml phytohemagglutinin (PHA).
  • PHA phytohemagglutinin
  • the concentration of IL-2 in the supernatant of PHA-stimulated cells was measured by ELISA using rabbit polyclonal antibodies against mouse IL-2 (BioRad, AbD Serotec, Raleigh, NC, USA) and goat anti-rabbit IgG conjugated with Biotin (Agrisera Antibodies , Vannas, SWEDEN). After ABTS staining, the optical density was measured on a tablet spectrophotometer (Stat Fax 303 plus, Awareness technology inc., USA) at 405 nm.

Abstract

Отрасль применения: изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой промышленности, медицине и косметологии при профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с иммунодефицитами и респираторными вирусными инфекциями. Суть изобретения: в основу изобретения поставленная задача разработать пищевую, косметическую и фармацевтическую композицию с мощным иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом. Поставленная задача решается путем получения пищевой, косметической и фармацевтической композиции, включающей смесь пробиотиков с иммуномодулирующим эффектом, отличающейся тем, что среди пробиотиков содержит в том числе модифицированные споры сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans, поверхность которых ковалентно химически модифицирована с разными степенями модификации, а композиция также дополнительно содержит соединения группы бензилизохинолина или сырье, их содержащее, растительные экстракты с гликозидами, а также содержит как минимум два из следующих компонентов: гиббереллин, пара-аминобензойную кислоту; карнитин; ауксин или его производное. При этом степени модификации белково-полисахаридных антигенов спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans находятся в диапазоне от 0,1 до 15% в пересчете на белок. Предлагаемая пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом дополнительно обладает способностью полностью предотвращать инфицирование рядом вирусов, в том числе гриппа, ротавирусом и коронавирусом, а также стимулировать иммунитет сильнее, чем отдельно взятые пробиотики.

Description

Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой промышленности, медицине и косметологии при профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с иммунодефицитами и респираторными вирусными инфекциями.
Предшествующий уровень техники
Основная область применения пробиотиков - заболевания желудочно-кишечного тракта, поскольку эти микроорганизмы обладают антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных кишечных бактерий, обеспечивают восстановление нормальной микрофлоры кишечника, способствуют перевариванию компонентов пищи, продуцируют необходимые для организма вещества (карбоновые кислоты, витамины), стимулируют местный иммунитет. Кроме того, их можно применять при лечении других заболеваний — гинекологических, аллергических, сердечно- сосудистых и др.
Микроорганизмы, включаемые в группу пробиотиков, должны обладать:
резистентностью к хлористоводородной кислоте и желчи, что обеспечивает им возможность выжить при прохождении через верхние отделы пищеварительного канала; способностью к адгезии на эпителиальных клетках кишечника;
способностью быстро размножаться, колонизируя кишечник;
способностью нормализовать состав кишечной микрофлоры;
способностью персистировать в кишечнике после проявления своих эффектов;
не иметь признаков патогенности;
сохранять жизнеспособность в фармацевтических препаратах, т.е. обладать устойчивостью к технологическим процессам при производстве препаратов и к хранению при комнатной температуре.
В наибольшей степени этим требованиям соответствуют микроорганизмы, способные образовывать споры.
Эффективность спорообразующих бактерий доказана в клинических исследованиях, причем, в связи с высокой устойчивостью этих бактерий она проявляется даже в большей степени, чем традиционных, неспоровых, форм пробиотиков. Так, указывается на то, что представители таких родов спорообразующих бактерии как Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Sporolactobacillus подавляют кишечные расстройства более эффективно, чем классические пробиотики на основе лакто- и бифидобактерий. При этом продолжаются дебаты относительно того, споры или вегетирующие формы ответственны за пробиотическую активность.
Одним из наиболее перспективных спорообразующих микроорганизмов является спорообразующая лактобактерия Bacillus coagulans. В форме спор она хорошо переносит технологические процессы и хранение, не разрушается под влиянием желудочного сока и желчи. Попадая в двенадцатиперстную кишку, споры Bacillus coagulans могут прорастать в вегетирующие бактерии в просвете кишечника человека и оказывать свои пробиотические эффекты.
Bacillus coagulans входит не только в состав биодобавок. В последнее время на основе этой бактерии на мировом фармацевтическом рынке появился ряд препаратов с доказанной клинической эффективностью.
Эта бактерия задепонирована в американской коллекции клеточных культур (АТСС, Rockville, MD): Bacillus coagulans Hammer NRS 727 (ATCC No. 1 1014), Bacillus coagulans Hammer strain C (ATCC No 11369); Bacillus coagulans Hammer (ATCC No 31284), Bacillus coagulans Hammer NCA 4259 (ATCC No 15949), Bacillus coagulans штамм ATCC 7050. Очищенные бактерии Bacillus coagulans также доступны в коллекциях Deutsche Sarumlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH (Braunschweig, Germany) используя следующие номера классификатора: Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM No 2356), Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM No 2383, согласуется c ATCC No 1 1014), Bacillus coagulans Hammer (DSM No 2384, согласуется c ATCC No 11369), and Bacillus coagulans Hammer (DSM No 2385, согласуется c ATCC No 15949). Bacillus coagulans также производится в промышленных масштабах такими производителями как Sabinsa Corporation (Piscataway, NJ) или К К Fermentation (Kyoto, Japan).
Спора В. coagulans располагается на одном из полюсов клетки и имеет форму эллипса, устойчива к нагреванию и другим неблагоприятным условиям внешней среды и способна прорастать из разбавленных растворов соляной кислоты и гидроксида натрия. Образует колонии около 2,5 мм в диаметре, которые имеют выпуклую форму, блестящие, не выделяющие каких-либо пигментов. По биологическим свойствам она занимает промежуточное положение между двумя родами - Bacillus и Lactobacillus. Являясь спорообразующей бактерией, она одновременно производит молочную кислоту, не способна восстанавливать нитраты и не содержит оксидазы.
Ряд свойств объединяют Bacillus coagulans с представителями рода Bacillus. Это, прежде всего, способность образовывать споры и колонии. Для своего роста микроорганизм использует такие вещества как углеводы, пептоны, мясо и дрожжевой экстракт. Продуцирует кислоты из таких субстратов как арабиноза, ксилоза, глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, мальтоза, сахароза и трегалоза. Не гидролизует крахмал, казеин, желатин. Не продуцирует сероводород и индол.
Однако имеются и характеристики, отличающие Bacillus coagulans от рода Bacillus. Так, бактерия Bacillus coagulans имеет преимущественно изогнутую форму, и молочнокислые бактерии - изогнутые. Как и Bacillus coagulans , молочнокислые бактерии проявляют очень слабую подвижность. У Bacillus coagulans и у молочнокислых бактерий споры расположены в терминальном участке клетки, а не в центре, как у Bacillus. Они дают отрицательный оксидазный тест. Продуцирует правовращающую молочную кислоту из глюкозы, фруктозы, сахарозы и трегалозы. В отличие от большинства Bacillus , не восстанавливает нитраты до нитритов. В ДНК Bacillus молярный процент пары гуанин- цитозин достигает 69%, а у Lactobacillus - не превышает 53%.
В то же время споры Bacillus coagulans устойчивы к действию антибиотиков. Благодаря этому пробиотик можно применять вместе со стандартной химиотерапией, без риска подавления его активности.
В желудочно-кишечном тракте существуют защитные механизмы, препятствующие избыточному размножению и внедрению не свойственной ему микрофлоры. К их числу относят: кислое содержимое желудка, желчные кислоты, целостность эпителия и щеточная каемка, иммунная защита.
Основное бактерицидное действие в желудочно-кишечном тракте человека осуществляют три фактора - желудочная секреция, соляная кислота и желчь. Кислая среда желудка (pH 3) и протеазы (пепсин) разрушают большую часть бактерий, попадающих с пищей. Экспериментальные и клинические исследования показали, что под действием желудочного сока и желчи пробиотики теряют до 90% своей активности до момента попадания в кишечник. Bacillus coagulans в вегетирующей форме, по данным опытов in vitro, не выдерживает пребывание в среде с pH < 3 , хотя показано, что штамм Bacillus coagulans CNCMI-1061, используемый в качестве пробиотика у цыплят, сохраняет до 50% живых форм в кислой среде желудка. Однако в форме спор все бактерии рода Bacillus, в том числе и Bacillus coagulans, устойчивы к кислым значениям pH .
Для спор Bacillus coagulans кислотная активация не описана. Отмечается, что споры минуют желудок и прорастают только в двенадцатиперстной кишке.
Таким образом, тот факт, что Bacillus coagulans применяется в форме спор, обеспечивает его устойчивость к кислому содержимому желудка. Отмечается, что при попадании в желудок споры этого микроорганизма выдерживают длительное нахождение в кислотной среде желудка и не перевариваются желудочным соком.
Желчь служит вторым барьером для микроорганизмов, поскольку содержит токсичные для микроорганизмов соли желчных кислот, которые составляют около 50% от ее состава. Устойчивость к действию желчных кислот является одним из основных критериев отбора микроорганизмов для применения в качестве пробиотиков.
концентрация желчи 0,3% является критической и применяется для тестирования чувствительности к ней различных микроорганизмов-пробиотиков.
Другие негативные воздействия желчи - нарушения в ДНК за счет подавления процессов ее репарации, оксидативный стресс, снижение внутриклеточного pH, снижение внутриклеточного уровня кальция и железа (за счет их хелатирования).
Для Bacillus coagulans, даже не в споровой форме, показана достаточно высокая устойчивость к действию желчи.
Если Bacillus coagulans достаточно устойчив к действию первых двух факторов (кислоты и желчи), то возникновение анаэробных условий (при том, что он не является облигатным анаэробом) или, возможно, какие-либо другие неблагоприятные факторы, приводят к тому, что этот микроорганизм в дистальных отделах кишечника подвергается респоруляции, и в значительной степени именно в этой форме покидает организм человека.
Клинический опыт применения пробиотиков на основе Bacillus coagulans также указывает на то, что они безопасны, и их фармакологическая активность определяется только местным действием в просвете кишечника или иммунологическими механизмами, в том числе опосредованными попаданием бактерий или их спор в лимфатическую систему.
Важными аспектами в действии пробиотиков на основе спор микроорганизмов является установление факта прорастания спор и формирования вегетирующих форм, относительное количество вегетирующих форм, степень пролиферации, а также вопрос, какие формы проявляют биологическую активность - споры, вегетирующие микроорганизмы или их элементы (метаболиты, клеточная стенка).
Приведем выявленные в открытой печати данные о кинетике Bacillus coagulans в кишечнике человека. Данные литературы свидетельствуют о том, что в среднем время между приемом Bacillus coagulans и прорастанием спор составляет 4 часа. Пик накопления бактериальной массы наблюдается через 18 часов.
Bacillus coagulans выделяется из организма медленно— после последнего приема пробиотика споры в фекалиях обнаруживают в течение 7 дней. Этот феномен расценивают как большое клиническое преимущество, поскольку после последнего приема препарата его действие продолжается еще целую неделю, что позволяет быстро, в полном объеме, без риска осложнений и рецидивов, восстановить функцию желудочного-кишечного тракта после перенесенного заболевания. Вместе с тем большое значение имеет тот факт, что Bacillus coagulans , в конце концов, покидают организм человека— это способствует восстановлению собственной, родной для человека микрофлоры, без риска внедрения в нее генетически чужеродных штаммов
Таким образом, Bacillus coagulans относится к полурезидентным лактобактериям - выполнив в организме человека функцию пробиотика, она покидает организм. Это также является преимуществом данного микроорганизма, поскольку способствует восстановлению собственной, индивидуальной для каждого человека, микрофлоры, без риска внедрения в нее генетически чужеродных штаммов
Bacillus coagulans обладают преимуществами по отношению к большинству других бактерий, применяемых в качестве пробиотиков. Он занимает промежуточное положение между родами Bacillus и Lactobacillus, являясь спорообразующей бактерией, продуцирующей молочную кислоту.
Эта бактерия в виде спор хорошо переносит технологические процессы, хорошо хранится, устойчива к действию антибиотиков и не разрушается под влиянием желудочного сока и желчи. Попадая в двенадцатиперстную кишку, споры созревают и начинают размножаться, оказывая пробиотические эффекты.
Bacillus coagulans относится к полурезидентным бактериям - выполнив в организме человека функцию пробиотика, он проходит фазу споруляции и медленно покидает организм, выделяясь с фекалиями в виде спор. Таким образом, он не нарушает индивидуальный состав микоофлоры кишечника. Bacillus coagulans улучшает микробиологический состав кишечника, увеличивая количество облигатных микроорганизмов и вытесняя патогенную флору. Так, в исследованиях на лабораторных животных с экспериментальным бактериальным дисбиозбм после введения Bacillus coagulans наблюдался эффект подавления роста патогенных микроорганизмов и возобновление функционирования, в т.ч. за счет восстановления ферментообразования, а также нормализация количества микробных клеток нормальной микрофлоры кишечника. Искусственно вызванные у животных патогенными микроорганизмами острые патологии кишечника также быстро устранялись применением Bacillus coagulans.
Исследование на мышах с ванкомицин-рецистентными энтерококками показало, что применение Bacillus coagulans приводит к статистически достоверному уменьшению количества этих энтерококков в сравнении с нелеченными мышами. В этом опыте бактерии вводили в дозе 107 КОЕ на животное (или солевой раствор в контроле) один раз в день в течение 4 дней. В опытной группе количество ванкомицин-резистентных энтерококков после терапии Bacillus coagulans уменьшилось на 35% против 0% в контроле (Р=0,03). Опыт показал перспективность Bacillus coagulans для подавления колонизации кишечника мультирезистентными бактериями, и в перспективе - как средства терапии мультирезистентных колитов.
В отношении патогенной микрофлоры пробиотики в целом могут оказывать следующие эффекты:
1. Прямое антагонистическое, подавляющее, действие на определенные группы микроорганизмов. Механизмы - продукция веществ с антибактериальным действием; конкуренция за пищевые субстраты; конкуренция за места связывания.
2. Изменение метаболизма микроорганизмов - повышение или подавление ферментативных активностей.
3. Стимуляция иммунитета - повышение уровня антител, активности макрофагов.
Рассмотрим, какие из этих механизмов действия свойственны Bacillus coagulans и какие, возможно, являются наиболее важными в осуществлении его пробиотических эффектов.
Считают, что ингибиторная активность Bacillus coagulans в отношении гнилостных бактерий частично определяется выделяемыми им бактериоцинами. Bacillus coagulans продуцирует коагулин - бактериоцин, относящийся к семейству педиоцинов. Он является пептидом, состоящим из 44 аминокислотных остатков, последовательность которых сходна с таковой педиоцинов. Коагулин и педиоцин различаются только по одной аминокислоте в С-терминальном участке. Его молекулярная масса находится в пределах 3-4 кДа. Этот бактериоцин кодируется приблизительно 14 кБ фрагментом в плазмиде р14. Последяя довольно стабильно и независимо экспрессирует данный бактериоцин. Установлено подавляющее действие коагулина в отношении кишечных бактерий родов Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria и Pediococcus. При этом пробиотик может проявлять как бактериостатическое, так и бактерицидное действие. Коагулин стабилен при температуре до 60°С, pH в интервале 4-8, не расщепляется под действием a-амилазы, липазы или органических растворителей. Будучи пептидом, инактивируется протеазами.
Другой хорошо изученный бактериоцин из этого микроорганизма - лактоспорин- выделяется бактерией в меньшей концентрации и только при наличии в питательной среде или кишечнике болезнетворной бактерии-мишени. Антимикробная активность лактоспорина была также подтверждена в отношении мишени - Micrococcus luteus АТСС 10420 методом диффузии в агаре. Протеиновая природа лактоспорина подтверждена путем его инактивации протеолитическими ферментами. Хотя активность лактоспорина зависила от pH, он был стабилен к нагреванию. Изоэлектрическая точка лактоспорина находилась в пределах 3.5 -4.0.
В целом отмечается, что бактериоцины Bacillus coagulans ингибируют как грам- положительную, так и грам-отрицательную флору, и некоторые гнилостные грибы рода Fusarium.
Присутствующая в кишечнике нормофлора также защищает организм от инвазии патогенных микробов. Сама она приобрела различные механизмы устойчивости к действию разрушающих факторов кишечника, например, путем образования капсулярных полисахаридов на поверхности клеточной стенки. Нормальная микрофлора колонизирует кишечник, занимая всю его свободную поверхность и, тем самым, делая физически невозможным присоединение патогенов. Мембранная флора посредством гликоконъюгированных рецепторов соединяется с поверхностными структурами эпителия и усиливает выработку слизи, таким образом уплотняя цитоскелет эпителиоцитов. Доминантная флора конкурентно потребляет все необходимые питательные вещества, а также выделяет бактериоцины - вещества, подавляющие рост поступивших извне микроорганизмов.
Как отмечалось выше, Bacillus coagulans не остается в организме человека навсегда, а покидает его через 7 дней после последнего приема. Следовательно, он не нарушает природный микробиоценоз кишечника, который формировался в течение всей жизни конкретного человека.
В ряде клинических исследований показано, что пробиотики на основе Bacillus coagulans не только не подавляют нормальную флору кишечника, но и способствуют ее восстановлению при подавлении антибиотиками или в пожилом возрасте. Так, в исследовании с участием пожилых пациентов со сниженным содержанием бифидобактерий и ослабленной иммунной защитой применение Bacillus coagulans достоверно увеличились сравнении с исходными показателями популяции Faecalibacterium prausnitzii и бактерий рода Bacillus. Следует отметить, что этот вид действия сопровождался иммунотропным и противовоспалительным действием пробиотика, что, по-видимому, и определяло его позитивное влияние на нормоценоз.
Для Bacillus coagulans установлено иммуномодулирующее действие. Оно было доказано в ряде экспериментальных и клинических исследований.
Иммуномодулирующие свойства Bacillus coagulans были изучены в экспериментах на мышах и крысах. Так, было установлено, что введение в течение 14 дней порошка бактерий крысам массой тела около 200 г в дозе 1 г на животное вызывало достоверное повышение уровня лейкоцитов в крови в сравнении с группой контроля. При этом повышался процент нейтрофилов и лимфоцитов (табл.1). После введения пробиотика у крыс также повышалась адгезия нейтрофилов к нейлоновым волокнам, что коррелировало с повышением числа нейтрофилов.
Таблица 1. Влияние введения Bacillus coagulans на состав лейкоцитов крови крыс
Figure imgf000010_0001
* -достоверность различия по отношению к показателям интактного контроля (Р< 0.05) Была выявлена способность Bacillus coagulans влиять на гуморальный иммунитет - вызывать повышение уровня антител в крови.
Стимулирующее действие пробиотика на клеточный иммунитет установлено у крыс и у мышей в ответ на воздействие Т-зависимого антигена. Предварительное введение пробиотика вызывало уменьшение толщины стопы крыс в динамике после введения вакцины BCG.
Выявлено достоверное повышение индекса фагоцитарной активности у мышей, что указывает на стимулирующее влияние Bacillus coagulans на неспецифическую иммунную реакцию.
Полученные данные указывают на то, что Bacillus coagulans обладает стимулирующим действием в отношении как клеточного, так и гуморального иммунитета.
В научной литературе обсуждается вопрос о том, за счет чего в большей степени пробиотики оказывают свое действие - благодаря активным компонентам клеточной стенки или метаболитам, выделяемым живыми бактериями. И тот, и другой механизмы в настоящее время экспериментально подтверждены. Приводятся данные исследования воздействия Bacillus coagulans на иммунную систему и на свободнорадикальные процессы в опытах in vitro, причем было оценено влияние, как метаболитов живых бактерий (супернатанта), так и изолированной клеточной стенки. Споры Bacillus Coagulans активировали нагреванием до 70°С в течение 30 минут и инкубировали в течение 2 суток при 37°С в питательной среде RPMI-1640. Путем центрифугирования получали супернатант живых бактерий, а для получения фрагментов клеточной стенки бактерии разрушали путем замораживания-оттаивания, затем центрифугировали и ресуспендировали осадок. Проведено изучение влияния бактерии на периферические кровяные мононуклеарные и на полиморфноядерные клетки.
Было установлено, что супернатант и клеточная стенка бактерий ингибировали спонтанное образование реактивных метаболитов кислорода в полиморфноядерных лейкоцитах человека. Клеточная стенка оказывала дозозависимое действие, а супернатант проявлял выраженное противовоспалительное действие в низких концентрациях. Присутствие супернатанта в соотношении 1 :1000 уменьшало образование реактивных метаболитов кислорода на 20% (р < 0.004), а клеточная стенка вызывала подобный эффект (уменьшение на 30%) при соотношении 1 : 10. Предварительная инкубация полиморфноядерных клеток с супернатантом и клеточными стенками до воспроизведения оксидативного стресса ингибировала образование Н202-индуцированного реактивного кислорода. Эффективными были разведения 1 :10 и 1 :100.
Изучение влияния на фагоцитоз проводилось иммунофлуоресцентным методом. Экспозиция полиморфнояденых лейкоцитов с супернатантом в разведении 1 :10 достоверно увеличивала фагоцитоз на 40%, а с клеточными стенками в том же разведении - на 25%. Инкубация с супернатантом и клеточными стенками в этой концентрации увеличивала популяцию полиморфноядерных лейкоцитов в целом, причем ряд клеток в ней были фагоцитирующими, остальные - нет. Дальнейшее разведение приводило к снижению числа фагоцитирующих клеток.
Супернатант оказывал выраженное дозозависимое влияние на миграцию полиморфноядерных лейкоцитов, причем на оба типа миграции - спонтанную и направленную (вызванную хемотаксисом). Направленная миграция вызывалась тремя агентами - бактериальным пептидом f-MLP, провоспалительным интерлейкином IL-8 и лейкотриеном LTB-4. При разведении супернатанта 1 :10 спонтанная миграция повышалась на 300%, клеточные стенки вызывали более слабое повышение - на 25%. Миграцию, вызванную пептидом, супернатант в разведении 1 : 10 повышал на 200%, клеточные стенки - на 25%. Миграция, вызванная интерлейкином-8, подавлялась клеточными стенками на 60%, а супернатаном - в несколько меньшей степени. Выраженной дозозависимости эффекта не наблюдалось. Миграция лейкоцитов под действием лейкотриена В-4 также достоверно, на 60%, подавлялась клеточными стенками бактерий при разведении 1 : 1000, а супернатант оказывал менее выраженное действие.
Отмечалось выраженное дозозависимое индуцирующее действие супренатанта и клеточных стенок на экспрессию клеток-киллеров. Достоверное увеличение отмечено при разведениях 1 :400, 1 :1600 и 1 :6400. Повышение содержания маркера CD69 на 32% отмечалось при разведении супернатанта 1 :400, и на 36% - при том же разведении клеточных стенок.
Влияния на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов не было установлено при 5 -дневной инкубации. Это указывает на отсутствие у бактерии митогенного потенциала.
Изучение влияния Bacillus coagulans на продукцию цитокинов показало, что оба продукта вызывали подавление выработки IL-2, усиление продукции IL-4, IL-10 и особенно IL-6, незначительное увеличение продукции TNF-a, достоверное увеличение - INF-g.
Следовательно, Bacillus coagulans оказывает выраженное противовоспалительное действие, поддерживает основные механизмы природного иммунитета. Активность в опытах in vitro проявляют, как клеточная стенка бактерии, так и ее метаболиты. Проявление выявленных видов активности полезно не только с точки зрения защиты кишечника от болезнетворных микроорганизмов, но и в плане противовоспалительного действия, поддержания целостности эпителия и нормального пищеварения.
Однако, с учетом того, что часть поступившего в кишечник Bacillus coagulans присутствует в виде спор, важным аспектом является его взаимодействие с элементами иммунной системы именно в этой форме. Данных о прямых экспериментах, указывающих на иммуномодулирующее действие спор Bacillus coagulans, не выявлено. Однако для наиболее тщательно изученных бактерий Bacillus subtilis (в ряду бактерий рода Bacillus) было показано, что их споры способны проникать в лимфоток. Так, указывается на то, что после 5-дневного введения мышам спор, их обнаруживали в пейеровых бляшках и лимфатических узлах . Считается, что споры бактерий этого рода, имея размеры около 2 мкм, могут быть захвачены М-клетками слизистой кишечника, которые осуществляют их передачу в пейеровы бляшки и далее в лимфатические узлы. При пероральном введении мышам споры вызывали системный иммунный ответ в виде IgG подкласса IgG2a и местную реакцию - высвобождение slgA. Анализ мРНК цитокинов лимфоцитов иммунной системы кишечника указывает на раннюю индукцию интерферона-g, цитокина ТЫ, провоспалительного цитокина TNF-a. В опытах in vitro макрофаги мышей эффективно фагоцитировали споры В. subtilis из среды культивирования. Споры могут прорастать внутри фагоцита и инициировать экспрессию генов, ответственных за вегетацию микроорганизма и синтез белка. Между тем, такие проросшие споры прекращали свой рост и примерно через 5 часов разрушались путем лизиса в фагосомах фагоцитов. Эти исследования весьма важны, поскольку они показывают, что споры могут взаимодействовать с лимфоидной системой кишечника, а это служит механизмом стимуляции иммунной системы и определяет один из механизмов действия пробиотиков.
Еще одним доказательством иммуномодулирующего действия Bacillus coagulans является его клинически выраженный эффект при артритах у животных и людей. Детально результаты контролируемого клинического исследования эффективности данного пробиотика при артритах представлены ниже (в разделе клинических исследований). Однако, учитывая ведущую роль иммунных механизмов в развитии артрита, можно сделать вывод о проявлении Bacillus coagulans системных противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств. В последние годы) был установлен иммуномодулирующий эффект Bacillus coagulans в условиях анитибиотикоассоциированной диареи, связанной с Clostridium difficile. Данное заболевание - одно из осложнений, встречающееся у пациентов, принимающих антибиотики. В литературе имеется ряд доказательств эффективности при этом заболевании применения пробиотиков Lactobacillus spp. и Saccharomyces boulardii.
Молекулярный и иммунный механизм развития этого заболевания в настоящее время представляется следующим образом. С. difficile выделяет токсины (преимущественно токсин А), которые вызывают активацию трех факторов транскрипции. Ядерный фактор каппа-В (NF-кВ) способствует продукции хемокинов и играет роль в апоптозе колоноцитов. Активаторный протеин- 1 (АР- 1) участвует в продукции интерлейкина-8 (IL-8), что вызвано стимуляцией токсином А колоноцитов. Важным моментом является цАМФ-связывающий белок, который необходим для синтеза простагландина Е2, определяющего усиление секреции жидкости и возникновение диареи, а также стимуляцию продукции Fas-лиганда и апоптоза эпителиальных клеток кишечника.
Bacillus coagulans в экспериментальных исследованиях проявлял эффективность на модели колита у мышей, вызванного Clostridium difficile. Bacillus coagulans (или физиологический раствор) вводили мышам внутрь по 2 c 109 КОЕ в течение 15 дней. Патологию вызывали путем введения смеси антибиотиков с 5 по 8 дни, клиндамицина на 10 день и культуры С. difficile по 104 КОЕ на 11 день эксперимента. Исследование показало, что в условиях введения Bacillus coagulans не происходило гибели мышей, а в группе контроля погибло 2 животных. На 12 день было выявлено достоверное (р = 0.0002) различие между группами по числу мышей с нормальным стулом - 66,7% против 13,0% в контроле. На 16 день этот показатель составил соответственно 23% и 0%. Микроскопия кишечника показала, что введение мышам Bacillus coagulans существенно снижало выраженность патологических изменений в толстом кишечнике - повреждения крипт, отека, лейкоцитарной инфильтрации. Отмечено также уменьшение связывания ядерного фактора NF-кВ И снижение содержания хемокина MIP-2 до 16,3 против 24,6 пг/2 см).
Подобные результаты были получены и в аналогичной постановке эксперимента при введении на 6-10 дни ванкомицина в дозе 50 мг/кг. Под действием Bacillus coagulans значительно лучшей была консистенция стула мышей. На 17 день он был нормальным у 88,9% животных опытной группы и ни у одного в контроле патологии. Значительно снижалась активность миелопероксидазы (маркера воспалительного процесса в кишечнике) - с 4,3 до 2,6 ЕД/2 см. Значительно лучшими были и показатели гистологических исследований, а также уровень хемокина кератиноцитов. Эффекты Bacillus coagulans на иммунную систему при воздействии на Т-клетки аденовирусом и вирусом гриппа А были изучены на 10 здоровых добровольцах (средний возраст 44 года). Испытуемые принимали пробиотик в виде капсул 1 раз в сутки в дозе 2 х 106 КОЕ в течение 30 дней. До приема пробиотика и по его окончании отбирали пробы крови добровольцев и в условиях in vitro определяли уровень цитокинов после экспозиции Т-клеток с аденовирусом и вирусом гриппа А. Было выявлено существенное увеличение выработки фактора некроза опухоли TNF-a в ответ на воздействие аденовируса и вируса гриппа А - на 250% и 1709% соответственно в сравнении с исходными показателями. Это указывает на иммуномодулирующие свойства Bacillus coagulans - повышение Т- клеточного ответа при вирусных инфекциях.
В ряде клинических исследований показано, что пробиотики на основе Bacillus coagulans не только не подавляют нормальную флору кишечника, но и способствуют ее восстановлению при подавлении антибиотиками или в пожилом возрасте. Так, в исследовании (см. разд. Клиничпеский опыт) с участием пожилых пациентов со сниженным содержанием бифидобактерий и ослабленной иммунной защитой применение Bacillus coagulans достоверно увеличились сравнении с исходными показателями популяции Faecalibacterium prausnitzii и бактерий рода Bacillus. Следует отметить, что этот вид действия сопровождался иммунотропным и противовоспалительным действием пробиотика, что, по-видимому, и определяло его позитивное влияние на нормоценоз.
Bacillus coagulans оказывает иммуномодулирующее действие, стимулируя клеточный и гуморальный иммунитет.
Иммуномодулирующим действием обладают метаболиты, выделяемые бактерией, ее клеточная стенка и споры.
На основании имеющихся в литературе данных можно сделать вывод о том, что, по- видимому, именно иммуномодулирующие свойства Bacillus coagulans играют решающую роль в его фармакологических эффектах. На это указывают: важность иммунной системы в патогенезе многих заболеваний, достаточность даже небольших количеств стимулятора для оказания эффекта (без необходимости интенсивного размножения бактерии и колонизации кишечника), наличие экспериментальных доказательств проникновения бактерий и их спор в лимфатическую систему и взаимодействия с иммунокомпетентными клетками, а также местные и системные иммунотропные эффекты пробиотика.
Одним из путей повышения скорости наступления иммуномодулирующего и антивирусного действия спор Bacillus coagulans является усиление их адгезивных свойств к стенкам кишечника и активация их терминации (прорастания). С целью усиления адгезивных свойств и усиления фагоцитоза спор нами предложено ковалентно химически модифицировать их поверхность с приданием им избыточного негативного заряда. В результате такой модификации треть введенных спор будет поглощена макрофагами с соответствующими реакциями иммунитета. Кроме того, нерегулярная модификация поверхностых структур приводит к увеличению разнообразия поверхностных зарядов, являясь одновременно методом комбинаторного биоорганического синтеза, что значительно увеличит биодоступность спор для разных клеток иммунной системы. Такие структуры являются комбинаторными производными. Для проявления антивирусных и пробиотических свойств Bacillus coagulans за счет антагонизма к болезнетворным бактериями через систему бактериоцинов бактерия должна также присутствовать в кишечнике в вегетативной форме. Чтобы увеличить процент терминации спор нами предложено использовать активаторы роста растений типа гиббереллина. Подобные соединения ранее не использовались для стимуляции терминации спор и нами исследованы впервые: показано более, чем 10-кратное возрастание процента и скорости прорастания спор при добавлении в питательную среду указанных активаторов. Ковалентная модификация же поверхности спор никак не повлияла на их жизнеспособность.
Терминология
Используемый здесь термин «лекарственное средство» охватывает лекарственные средства для применения и для людей, и для животных в медицине и ветеринарии. Кроме того, термин «лекарственное средство», как здесь используется, означает любое вещество, которое обеспечивает терапевтический и/или благотворный эффект. Термин «лекарственное средство», как здесь используется, необязательно ограничивается веществами, для которых требуется разрешение продажи на рынке страны, а могут включать вещества, которые могут использоваться в косметических средствах, БАД, продуктах питания (в том числе пище и напитках, например), культурах пробиотиков, пищевых добавках и лекарственных средствах природного происхождения. Кроме того, термин «лекарственное средство», как здесь используется, охватывает продукт, предназначенный для включения в корм для животных, например, корм для домашнего скота и/или корм для любимых домашних животных. Как здесь используется, улучшение микробиоты кишечника» относится к увеличению количества и/или типа микроорганизмов, присутствующих в кишечнике хозяина, и/или увеличению активности указанных микроорганизмов в плане их метаболических, структурных, защитных и других полезных функций. Используемый здесь термин «врожденная иммунная система», также известный как неспецифическая иммунная система, включает клетки и механизмы, которые обеспечивают хозяину незамедлительную защиту от инфицирования другими организмами неспецифическим образом. Это означает, что клетки врожденной системы распознают патогены и отвечают на них генетически, но в отличие от адаптивной иммунной системы она не обеспечивает хозяину длительный или протективный иммунитет. Используемый здесь термин «регуляция врожденной иммунной системы» означает индуцирование активности врожденной иммунной системы и/или увеличение уровня активности относительно исходного уровня активности, так что она содействует
иммунному гомеостазу. Используемый здесь термин «адаптивная иммунная система», иначе известный как «специфическая иммунная система», относится к высокоспециализированным системным клеткам и процессам, которые устраняют или предотвращают рост патогенов. Адаптивный иммунный ответ дает иммунной системе позвоночного возможность распознавать и вспоминать конкретные патогены (для формирования иммунитета), и поднимать в более сильные атаки каждый раз при встрече с патогеном. Используемый здесь термин «регуляция адаптивной иммунной системы» означает индуцирование активности адаптивной иммунной системы и/или стимулирование относительно исходного уровня активности. Предпочтительно адаптивная иммунная система подвергается модуляции в направлении иммунорегуляции (а не активации иммунной системы, следовательно, уменьшения воспаления). Дефекты и нарушения, связанные с адаптивной иммунной системой, в особенности, связанные с функционированием Т-клеток, связаны со многими воспалительными и аутоиммунными заболеваниями. Т-клеточные реакции, связанные с ТЫ, Th2 и ТЫ 7, связаны с топическими, воспалительными и аутоиммунными заболеваниями. Терапии, которые улучшают или увеличивают популяции регуляторных Т-клеток, важны для борьбы с заболеваниями, запускаемыми чрезмерными Т-клеточными реакциями, связанными с ТЫ, Th2 и ТЫ 7. Формы диареи, которые можно лечить профилактически и/или терапевтически в соответствии с изобретением, включают острую диарею и хроническую диарею. В определенных вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей инфекционной природы, которая вызвана вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном. В других вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей неинфекционной природы. Диарея неинфекционной природы может быть, например, диареей, вызванной пищевой непереносимостью, диареей, вызванной жирной диетой, диареей, вызванной алкоголем, диареей, вызванной психологическим фактором, диареей, вызванной введением лекарственного препарата, диареей, вызванной применением терапевтической процедуры, диареей, связанной с болезнью или с клиническим состоянием, или диареей, связанной с отменой лекарственного средства. Термин "пробиотический штамм" в данном описании предназначен для обозначения штамма живого микроорганизма, который оказывает благоприятное воздействие на здоровье хозяина. Как правило, хозяином является человек, однако можно допустить, что хозяином может быть другое млекопитающее, например собака, кошка, жвачное животное, а именно, овца, коза, теленок, корова, олень, верблюд, лошадь, кабан, в частности свиньи и поросята, leporids (заячьи), муридовые (мышиные) и грызуны семейства Caviidae (свинковые). Штаммом, тестируемым с использованием способа согласно изобретению, может быть любой штамм микроорганизма. В определенных вариантах осуществления тестируемым штаммом является дрожжевой штамм. В числе дрожжей, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, дрожжи рода Saccharomyces, в частности виды Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae, дрожжи рода Kluyveromyces, в частности вид Kluyveromyces marxianus. В других вариантах осуществления тестируемым штаммом является бактериальный штамм. Тестируемый штамм предпочтительно выбирают из бактерий, признанных безопасными для людей и/или животных. В числе бактерий, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, бактерии рода Bifidobacterium, в частности виды Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve; бактерии рода Lactobacillus, в частности виды Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosu и Lactobacillus salivarius; бактерии рода Weisella, в частности виды Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thailandensis ; бактерии рода Bacillus , в частности виды Bacillus subtilis, Bacillus coagulans , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus и Bacillus clausii; бактерии рода Lactococcus, в частности вид Lactococcus lactis; бактерии рода Enterococcus, в частности виды Enterococcus faecium, Enterococcus fecalis; бактерии рода Streptococcus, в частности вид Streptococcus thermophilus; бактерии рода Escherichia, в частности вид Escherichia coli. "Спорулирующая форма" бактерии обозначает форму бактерии, помещенной в неблагоприятные условия. Споры каждой из пробиотических бактерий согласно этому изобретению могут быть ковалентно химически модифицированы по поверхностным антигенам для увеличения адгезивных свойств. Таким образом, спорулирующая форма является устойчивой формой, которая позволяет бактерии противостоять неблагоприятным условиям среды, таким как, например, отсутствие питательных веществ, т.е., лимитирующая питательная среда, недостаток воды, широкое колебание значений pH или температуры, или прохождение через пищеварительный тракт. Неблагоприятные условия для клеток бактерий создают, например, не обновляя культуральную среду бактерий, прекращая поставку питательных веществ в культуральную среду, используя лимитирующую питательную среду, изменяя температуру, изменяя значение pH или их комбинацию. Способ получения клеток Bacillus coagulans также может содержать дополнительную стадию высушивания клеток для получения клеток Bacillus coagulans в сухой форме. Выражение "клетки Bacillus coagulans в сухой форме" означает, что биомасса, полученная в конце данного способа получения клеток Bacillus coagulans, содержит более 90% сухого вещества, предпочтительно более 95% сухого вещества. Высушивание представляет собой, например, сушку лиофилизацией, сушку способом вихревого напыления или сушку распылением.
Формы диареи.
"Острая диарея" означает диарею, симптомы которой продолжаются менее двух недель, а "хроническая диарея" означает диарею, симптомы которой продолжаются по меньшей мере две недели, предпочтительно по меньшей мере один месяц. Острая диарея включает, например, вирусный гастроэнтерит, бактериальный гастроэнтерит и пищевую интоксикацию (например, сальмонеллез, шигеллез, инфекции Staphylococcus aureus, инфекции Bacillus cereus, инфекции Escherichia coli). Хроническая диарея включает, например, синдром пониженного всасывания, гастроэнтеропатию (глютеновую энтеропатию, болезнь Уипла, болезнь Крона и т.д.), моторную диарею (т.е. диарею в результате ускорения прохождения содержимого через кишечник), секреторную диарею (т.е. диарею, являющуюся результатом ускорения водно-электролитной секреции в тонком кишечнике и/или толстой кишке), осмотическую диарею (т.е. диарею, являющуюся результатом присутствия в желудочно-кишечном тракте растворенных веществ, которые плохо абсорбируются и вызывают осмотический эффект). Другие виды диареи, которые можно лечить с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, включают диарею, являющуюся результатом беспокойства или сильных эмоций, диарею, являющуюся результатом пищевой непереносимости (например, лактозы коровьего молока, сорбитола, глютена и т.д.), диарею, являющуюся следствием некоторых видов лечения, например, лечения магнезией, радиотерапии или химиотерапии, или некоторых видов хирургического вмешательства, например, гастрэктомии или резекции подвздошной кишки, диарею, являющуюся следствием переполнения или раздражения желудка, кишечника, толстой кишки и т.д., диарею, являющуюся следствием отмены некоторых веществ, таких как героин, диарею, являющуюся результатом применения некоторых лекарственных средств, таких как антибиотики. Другие примеры диареи, которые можно лечить с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, включают диарею, сопровождающую приступ разлития желчи или несварения желудка, диарею, являющуюся результатом чрезмерного потребления некоторых послабляющих продуктов питания, и диарею бегунов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления диарея, которую лечат с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных ультивированием пробиотического штамма согласно изобретению, не является диареей, вызванной введением антибиотика, или в более общем смысле введением лекарственного средства. В других предпочтительных вариантах осуществления диарея, которую лечат с помощью пробиотического штамма согласно изобретению или клеток, полученных культивированием пробиотического штамма согласно изобретению, не является диареей инфекционного происхождения.
Ближайшим прототипом предлагаемого изобретения являются сладкие и оздоровляющие композиции, содержащие как минимум один пребиотик и один пробиотик (Патент США US 9,114,169 В2). К пробиотикам отнесены также В. coagulans и S. boulardii. Недостатком изобретения является отсутствие значительного профилактического эффекта композиции в отношении респираторных вирусов, в частности - гриппа, обусловленных отсутствием ковалентно химически модифицированных спор В. coagulans. В то время, как в нашей заявке показано, что ковалентная модификация спор позволяет увеличить их иммуномодулирующее действие в несколько раз за счет увеличения их адгезии к рецепторам фагоцитов и эпителия кишечника, что увеличивает процент спор, подвергшиеся терминации. Также в нашей композиции присутствуют активаторы прорастания спор: гиббереллин, пара-аминобензойная кислота; карнитин; ауксин или его производное. Ранее данные вещества были известны как активаторы - стимуляторы роста растений, прорастания семян, но не были известны как активаторы проклевывания спор бактерий, тем более в пищевой/ косметической композиции. Совместное применение модифицированных спор с активаторами прорастания значительно усиливают иммуномодулирующее и антивирусное действие композиции. Термостабильность всех компонентов позволяет включать их как горячие, так и в холодные напитки, зубные пасты и пищевые добавки. Кроме того, в состав композиции входят производные бензилизохинолина (папаверин) или содержащее их сырье (маковые зерна). Эти вещества обладают способностью ускорять рост пробиотиков, увеличивать степень колонизации кишечника, что позволяет сократить время наступления положительного иммунотропного и антивирусного эффектов в несколько раз.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать пищевую, косметическую и фармацевтическую композицию с мощным иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом.
Поставленная задача решается за счет того, что предлагается в пищевую, косметическую и фармацевтическую композиции, содержащие смесь пробиотиков с иммуномодулирующим эффектом, дополнительно включать среди пробиотиков в том числе модифицированные споры сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans , поверхность которых ковалентно химически модифицирована с разными степенями модификации ацилирующими и алкилируюшими модификаторами, также данная композиция может дополнительно включать соединения группы бензилизохинолина или сырье, их содержащее, растительные экстракты с гликозидами, а также включать как минимум два из следующих компонентов: гиббереллин, пара-аминобензойную кислоту; карнитин; ауксин или его производное. При этом степени модификации поверхности спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans находятся в количестве до 300 % в пересчете на массу спор после высушивания. Также ковалентная химическая модификация спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans представлена ацилированием ангидридами или галогенангидридами дикарбоновых и поликарбоновых кислот. Также модификация спор может быть проведена через процесс алкилирования галогенпроизводными карбоновых и поликарбоновых кислот. Также в другой реализации изобретения дополнительно в качестве пробиотиков композиция может содержать сапрофитный пробиотический гриб S. boulardii в количестве от 1 до 10 lg КУО /мл на одну дозу продукта. Композиция также может включать в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт солодки в количестве от 0,05% до 0,5% от массы продукта. В другой реализации изобретения композиция также может включать в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт стевии в количестве от 0,05% до 0,5%. Также композиция может включать в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт спирулины в количестве от 0,05% до 5% от массы продукта и/или экстракт люцерны в количестве от 0,05% до 5% от массы продукта. В другой реализации изобретения композиция отличающаяся тем, что количество пробиотической бактерии В. coagulans составляет от 1 до 10 lg КУО /мл на одну дозу продукта. Композиция также может отличаться тем, что сырье, содержащее соединения группы бензилизохинолина это измельченные зрелые маковые зерна либо экстракт зрелых маковых зерен либо папаверин. Также композиция может содержать в качестве активаторов прорастания спор гиббереллин в количестве 0,01- 0,05% от массы продукта. Композиция другой реализации изобретения может содержать пара-аминобензойную кислоту в количестве 0,01-0,5% от массы продукта. Композиция другой реализации изобретения может содержать карнитин в количестве 0,1 -1,0 % от массы продукта. Также композиция может содержать ауксин или его производное в количестве 0,01-0,05% от массы продукта.
Примеры
Следующие примеры описывают некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако должно быть понятно, что данные примеры предоставляются только с целью иллюстрации и не ограничивают каким-либо образом объем данного изобретения.
Пример 1. Получение ковалентно химически модифицированных спор В. coagulans (КХМС)
Для получения спор может быть использован любой пробиотический штамм В. coagulans 1. Инокулируют культуру, например штаммы Bacillus coagulans МТСС 5856, Bacillus coagulans АТСС 31284, Bacillus coagulans NBRC 3887, Bacillus coagulans ATCC 7050 или любой другой в 1 ,0 литр бульонной питательной среды дрожжевого экстракта с глюкозой и ацетатом (HiMedia, Мумбай, Индия) или бульонной питательной среды MRS, содержащей 0,5% Твина-80, или в среды на основе порошка кукурузного экстракта и инкубируют при 37 0 С в течение 24-48 часов;
2. После инкубации и накопления бактериальной биомассы в первом этапе снижают температуру культивируемой среды до 5°С и проводят инкубацию при этой температуре в течение 24-48 ч. При этом наблюдается полная споруляция всех бактерий в питательной среде за счет неблагоприятных для вегетативных форм бактерии температурных условий.
3. Питательную среду центрифугируют при 20g 2 часа, осадок спор отмывают дистиллированной водой двоекратно. Получают суспензию спор в соотношении сухого осадка к воде 1 :100. В полученной суспензии, содержащей очищенные споры, определяют остаточный азот и пересчитывают на белок любым классическим методом, известным специалисту в данной области.
4. К суспензии спор добавляют сухой янтарный ангидрид в количестве до 300 % от массы сухих спор (например, на 100 мг высушенных спор добавляют 300 мг янтарного ангидрида) и раствор перемешивают до полного растворения осадка янтарного ангидрида. Модификация более 300% сухой массы спор приводит к потере у спор жизнеспособности и способности прорастанию, они полностью гибнут. Вместо янтарного ангидрида могут быть использованы другие ангидриды и галогенангидриды карбоновых и поликарбоновых кислот. Вместо процесса ацилирования янтарным ангидридом могут быть использован процесс алкилирования с применением галогеналканов или галогенпроизводные карбоновых и поликарбоновых кислот. Модификация должна приводить к повышению общего негативного заряда споровой поверхности. Это усиливает адгезию спор к стенкам кишечника, усиливает фагоцитоз таких спор макрофагами и вызывает более активную иммунную реакцию в более короткие термины
5. Далее модифицированный раствор спор лиофилизируют либо сушат на поддоне при температуре до 40°С и используют далее для получения композиции по заявляемому изобретению.
Пример 2. Получение композиции на основе ковалентно химически
модифицированных спор В. coagulans (КХМСБ) для включения в пищевые, косметические и фармацевтические продукты
В любом смесителе для сухих веществ проводят изготовление композиции по предлагаемому изобретению. В смеситель вносят сухой КХМСБ с активностью 1-50 lg КУО /г, добавляют сухой лиофилизированный порошок S. boulardii в количестве от 1 до 50 lg КУО /г, добавляют экстракт солодки в количестве от 0,05% до 0,5% от общей массы композиции, добавляют экстракт стевии в количестве от 0,05% до 0,5% от общей массы композиции, добавляют экстракт спирулины в количестве от 0,05% до 5% от общей массы композиции, добавляют экстракт люцерны в количестве от 0,05% до 5% от массы продукта, добавляют измельченные зрелые маковые зерна или экстракт мака или папаверин в количестве от 0,05% до 5% от массы композиции, добавляют гиббереллин в количестве 0,01-0,05% от массы композиции, добавляют карнитин в количестве 0,1 -1,0 % от массы композиции. Также кроме гиббереллина и карнитина в композицию могут входить пара- аминобензойная кислот в количестве 0,01-0,5% от массы композиции и ауксин или его производное в количестве 0,01-0,05% от массы композиции. Смесь перемешивают в смесителе до однородности и используют в дальнейшем для получения пищевых и фармацевтических композиций, зубных паст и косметических кремов.
Определение скорости терминации спор В. coagulans
КХМСБ в виде суспензии количестве 0,1 г/ 1 мл дистиллированной воды наносят на поверхность шести чашек Петри со средой «Лакто». Аналогичную процедуру проводят с разными композициями КХМСБ (представлены в таблице 1) по 6 чашек Петри на один образец. В последнюю группу чашек Петри наносят немодифицированные споры. Через каждые 3 часа берут образец мазка, окрашивают по Грамму и определяют наличие и количество колониеобразующих единиц - вегетативных проросших форм Bacillus coagulans (БК). Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты определения скорости терминации КХМСБ в сравнении с немодифицированными спорами Bacillus coagulans
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
* P <0,01, разница достоверна против контроля группы 1
Как видно из таблицы 2, прорастание вегетативных форм БК из всех композиций ХКМСБ статистически достоверно более быстрое в сравнении с контролем. На 72 час инкубации в контроле наблюдается только 15 lg КУО/мл БК, тогда как в опытных группах этот показатель от 6 до 9 раз выше. Это свидетельствует о том, что компоненты композиций ХКМСБ стимулируют терминацию спор БК и стимулируют дальнейший рост проросших бактерий. Отсутствие бензилизохинолинов (папаверина) в композиции приводит к менее эффективной стимуляции роста БК, хотя и выше контроля (65±Ю lg КУО/мл)
Пример 3. Получение пищевых, косметических и фармацевтических продуктов на основе композиции из примера 2.
Пищевые композиции
Изначально ядром продукта является композиция из примера 2., количество которой варьируется в продукте от 0,1% до 30% по массе продукта. Введение менее 0,1% не позволяет композиции проявить свои антивирусные и иммуномодулирующие свойства, более 30% активность продукта не увеличивается, что не рационально.
Композиция согласно изобретению может являться пищевой композицией, биоактивной пищевой добавкой или фармацевтической композицией. Пищевая композиция означает любой тип продукта, напитка или кондитерского изделия. Пищевая композиция, например, может быть напитком, брикетированным зерновым концентратом, жевательной резинкой, шоколадом, молочным продуктом, таким как, кисломолочный продукт, изготовленный путем сбраживания продукт растительного происхождения. Также предлагаемая композиция может быть введена в холодные и горячие напитки, сладкую пену в аэрозольных баллончиках, мороженое, печенья, йогурты, торты, конфеты, колбасы, сосиски, сухие смеси для питания детей, пивные напитки и слабоалкогольные напитки, зубные пасты, кремы. "Биоактивная пищевая добавка" обозначает пищевой продукт, целью которого является дополнение нормальной диеты. Биоактивная пищевая добавка представляет собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим действием, отдельно или в комбинации. Биоактивная пищевая добавка поставляется на рынок в лекарственной форме, а именно в таких лекарственных формах, как капсула, пастилка, таблетка, пилюля и других подобных формах, пакетиках с порошком, ампулах с жидкостью, флаконах, снабженных капельницей, и других подобных формах жидких или порошкообразных препаратов, которые предназначаются для приема в измеренных единицах небольшого количества. Также в композиции могут входить аминокислоты: глицин, аргинин, лизин, таурин, фенилаланин или их смеси и любые другие аминокислоты. Также в состав композиции могут входить витамины: аскорбиновая кислота, тиамин, рибофлавин, рутин, фолиевая кислота, цианокобаламин или их смеси, а также любой другой витамин. Композиция может содержать также экстракты зеленого или черного чая, или любой другой растительный экстракт, используемый в пищевой промышленности. Композиция согласно изобретению, например, подходит для ежедневного употребления клеток, полученных культивированием пробиотического штамма, в количестве от 1 -108 КОЕ до 1 · 10* 1 КОЕ, предпочтительно в количестве от 1 -109 КОЕ до ЫО10 КОЕ, в том случае, когда она предназначена для потребления человеком. Композиция согласно изобретению, например, подходит для ежедневного употребления клеток, полученных культивированием пробиотического штамма в количестве от 1 - 105 КОЕ до ЫО11 КОЕ, предпочтительно в количестве от 1-106 КОЕ до 1 -Ю10 КОЕ, в том случае, когда она предназначена применения в ветеринарии. Термин КОЕ обозначает колониеобразующую единицу. Пробиотики предпочтительно вводят в виде композиции для перорального приема, содержащей метаболически активные, т.е. живые и/или лиофилизированные или нежизнеспособные убитые нагреванием, облученные или лизированные, в форме спор или ковалентно химически модифицированных спор, пробиотические организмы. Пробиотическая композиция , описанная здесь, может быть введена перорально как таковая, т.е. в форме таблетки, капсулы или порошка. Дополнительно, пробиотическая композиция может быть введена перорально как пища или питательный продукт, такой как молоко или ферментированный молочный продукт на основе сыворотки или в виде фармацевтического продукта. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композиция представляет собой съедобный продукт, такой как молочный продукт, напиток, сок, суп или детское питание. Пробиотик может необязательно быть объединен с по меньшей мере одним пригодным пребиотическим соединением. “Пребиотик” обычно представляет собой неусваиваемый углевод, такой как олиго- или полисахарид или спиртосахар, который не разрушается или всасывается в верхней части пищеварительного тракта. Известные промышленно применяемые пребиотики включают инулин, фрукто-олигосахариды, олигофруктозу или галакто-олигосахариды. Подразумевается, что термин “съедобный продукт” охватывает все потребляемые продукты, особенно пищевые продукты, и он может быть твердым, желеобразным или жидким. Этот термин охватывает как готовые продукты, так и продукты, которые производят посредством применения пробиотической композиции в качестве только закваски или в сочетании с общепринятыми заквасками или другими пробиотиками. Пищевые продукты могут, например, являться продуктами молочной промышленности или промышленности по производству напитков. Альтернативно, он может представлять собой природный продукт.
Изначально ядром продукта является композиция из примера 2., количество которой варьируется в продукте от 0,1% до 30% по массе продукта. Введение менее 0,1% не позволяет композиции проявить свои антивирусные и иммуномодулирующие свойства, более 30% активность продукта не увеличивается, что не рационально. В контексте настоящего изобретения "физиологически приемлемый разбавитель или эксципиент" означает любую среду или добавку, которая не влияет на эффективность биологической активности активного компонента (в данном случае дрожжевых или бактериальных клеток), и которая не является слишком токсичной для пациента или субъекта при вводимых концентрациях. Физиологически приемлемый разбавитель или эксципиент может быть разбавителем или эксципиентом, подходящим для введения людям и/или животным (в частности млекопитающим). Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться с использованием любого эффективного сочетания дозировки и способа введения с целью получения желательного терапевтического эффекта. Точное количество, предназначенное для введения, может изменяться от пациента к пациенту, в зависимости от возраста, веса и общего состояния здоровья пациента, происхождения и тяжести диареи и т.д. Способ введения (оральный или парентеральный) может быть выбран в зависимости от происхождения диареи и/или в зависимости от возраста и/или состояния здоровья пациента. В качестве примера, изобретение имеет отношение к определенной выше фармацевтической композиции, предназначенной для ежедневного использования клеток, полученных культивированием указанного пробиотического штамма в количестве от 1 - 108 КОЕ до 1 · 10* 1 КОЕ, предпочтительно в количестве от 1 - 109 КОЕ до Ю10 КОЕ, в том случае, когда она предназначена для потребления человеком. Данное изобретение также имеет отношение к описанной выше фармацевтической композиции, предназначенной для ежедневного использования клеток, полученных культивированием указанного пробиотического штамма в количестве от 1 - 105 КОЕ до 1 - 101 1 КОЕ, предпочтительно в количестве от 1 - 106 КОЕ до 1 · 1010 КОЕ, в том случае, когда она предназначена для применения в ветеринарии. Состав фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать в зависимости от способа введения и дозировки, в которой будет использоваться композиция. После заключения в состав по меньшей мере с одним физиологически приемлемым разбавителем или эксципиентом, фармацевтическая композиция изобретения может находиться в любой форме, подходящей для введения млекопитающему, в частности человеку, например, в форме леденцов, таблеток, пилюль, покрытых сахаром, капсул, сиропа, мазей, инъецируемых растворов, суппозиториев и т.д. Специалист в данной области техники знает, как подобрать наиболее подходящие разбавители и эксципиенты для приготовления данного типа композиции. Таким образом, например, такие эксципиенты, как вода, 2,3-бутандиол, раствор Рингера, изотонические растворы хлорида натрия, синтетические моно- или диглицериды и олеиновая кислота часто используются при составлении инъекционных форм. Жидкие композиции, включая эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы, эликсиры и т.д., могут заключаться в состав в присутствии растворителей, солюбилизаторов, эмульгирующих веществ, масел, жирных кислот и других добавок, таких как суспендирующие вещества, консервирующие вещества, подсластители, ароматизирующие вещества, вещества изменяющие вязкость, окрашивающие вещества и т.д. Твердые композиции, предназначенные для введения пероральным путем, могут заключаться в состав в присутствии инертного эксципиента, такого как цитрат натрия, и необязательно таких добавок как связывающие вещества, увлажняющие вещества, разрыхлители, вещества, ускоряющие абсорбцию, смазывающие вещества и т.д. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению создается с целью немедленного высвобождения активного (действующего) компонента или активных компонентов, в частности дрожжевых клеток или бактериальных клеток, полученных культивированием пробиотического штамма. Альтернативно, фармацевтическая композиция может быть создана с целью продолжительного или адресного высвобождения активного компонента или активных компонентов или с целью защиты активного компонента или активных компонентов, например, от внутрижелудочной кислотности и ферментов. Для этой цели можно использовать покрытия, устойчивые к pH и/или к действию желудочных ферментов, покрытия, чувствительные к значению pH и/или активности ферментов, или биоадгезивные покрытия, которые прилипают к стенкам желудка или кишечника, или можно использовать системы инкапсуляции. Кроме того, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один дополнительный активный фармацевтический ингредиент (т.е. в дополнение к дрожжевым или бактериальным клеткам, полученным культивированием пробиотического штамма). "Активный фармацевтический ингредиент" обозначает какое-либо соединение или вещество, введение которого оказывает терапевтическое или благоприятное воздействие на состояние здоровья или общее состояние пациента или субъекта, которому он вводится. Таким образом, активный фармацевтический ингредиент может быть активен в отношении предотвращения или лечения диареи путем введения фармацевтической композиции; может быть активен в отношении состояния или симптома, связанного с диареей (например, жара, рвоты или колик в животе); или может увеличивать доступность и/или активность активного компонента или активных компонентов фармацевтической композиции. Примеры активных фармацевтических ингредиентов, которые могут присутствовать в композиции настоящего изобретения, включают, без ограничения, противовоспалительные средства, антибиотики, жаропонижающие средства, противорвотные средства, антигистаминные средства, витамины, спазмолитические средства и т.д. В преимущественном варианте осуществления другой активный фармацевтический ингредиент не является штаммом Bacillus coagulans или клетками, полученными культивированием такого штамма, предпочтительно не является бактериальным штаммом или клетками, полученными культивированием такого штамма, более предпочтительно не является пробиотическим штаммом или клетками, полученными культивированием такого штамма. Примером фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению является композиция, содержащая дрожжевые или бактериальные клетки, полученные культивированием пробиотического штамма, в качестве единственного активного фармацевтического ингредиента. Если они не определены иначе, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют такое же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в той области техники, к которой относится изобретение. Более того, все публикации, патентные заявки, все патенты и все другие ссылки, сделанные в описании, включаются в описание путем отсылки.
Таблица 3. Продукты, в которые перспективно включение нашей композиции
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Зубные пасты и косметические кремы
Изначально ядром продукта является композиция из примера 2., количество которой варьируется в продукте от 0,1% до 30% по массе продукта. Введение менее 0,1% не позволяет композиции проявить свои антивирусные и иммуномодулирующие свойства, более 30% активность продукта не увеличивается, что не рационально. В некоторых вариантах выполнения могут регулироваться профили высвобождения пробиотиков для микроорганизмов, таких, но не ограничивающихся таковыми, как Bacillus coagulans , Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Sporolactobacillus inulinus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus jenseni, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Pedioccocus acidilacti, Pedioccocus pentosaceus, Pedioccocus urinae, Leuconostoc mesenieroides, Bacillus coagulans , Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Sporolactobacillus inulinus, и их смеси. Освежители дыхания также известны под следующими торговыми марками: Retsyn(TM), Actizol(TM) и Nutrazin(TM). Примеры композиций для борьбы с неприятным запахом также описаны в Патенте США 5300305 на имя Stapler и др., и в Публикациях Патентных Заявок N°N° США 2003/0215417 и 2004/0081713, которые во всей своей полноте включены здесь ссылкой для всех целей. Ингредиенты для ухода за зубами (также известные как ингредиенты для ухода за полостью рта) могут включать, но не ограничиваются таковыми, отбеливатели зубов, средства для удаления пятен, средства для очистки полости рта, отбеливающие агенты, десенсибилизирующие агенты, агенты для реминерализации зубов, антибактериальные агенты, антикариозные агенты, буферные агенты для нейтрализации кислот зубного налета, поверхностно-активные вещества и средства против зубного камня. Неограничивающие примеры таких ингредиентов могут включать гидролитические агенты, в том числе протеолитические ферменты, абразивы, такие как гидратированный диоксид кремния, карбонат кальция, бикарбонат натрия и оксид алюминия, другие активные компоненты для удаления пятен, такие как поверхностно- активные агенты, содержащие, но не ограничивающиеся таковыми, анионные поверхностно-активные вещества, такие как стеарат натрия, пальмитат натрия, сульфированный бутилолеат, олеат натрия, соли фумаровой кислоты, глицерин, гидроксилированный лецитин, лаурилсульфат натрия, и хелатообразующие реагенты, такие как полифосфаты, которые обычно используются в качестве ингредиентов для борьбы с зубным камнем. В некоторых вариантах выполнения ингредиенты для ухода за зубами также могут включать пирофосфат тетранатрия и триполифосфат натрия, бикарбонат натрия, кислый пирофосфат натрия, триполифосфат натрия, ксилит, гексаметафосфат натрия. В некоторых вариантах выполнения предусмотрены пероксиды, такие как пероксид карбамида, пероксид кальция, пероксид магния, пероксид натрия, пероксид водорода и пероксидифосфат. В некоторых вариантах выполнения предусмотрены нитрат калия и цитрат калия. Другие примеры могут включать казеин- гликомакропептид, кальциевое производное казеинового пептона - фосфат кальция, фосфопептиды казеина, фосфопептид казеина - аморфный фосфат кальция (СРР-АСР), и аморфный фосфат кальция. Другие дополнительные примеры могут включать папаин, криллазу, пепсин, трипсин, лизоцим, декстраназу, мутаназу, гликоамилазу, амилазу, глюкозооксидазу, и их комбинации. Дополнительные примеры могут включать поверхностно-активные вещества, такие как стеарат натрия, рицинолеат натрия и лаурилсульфат натрия, как поверхностно- активные вещества для использования в некоторых вариантах выполнения для достижения усиленного профилактического действия, и для того, чтобы сделать ингредиенты для ухода за зубами более приемлемыми в косметическом отношении. Поверхностно-активные вещества предпочтительно могут представлять собой моющие материалы, которые придают композиции моющие и вспенивающие свойства. Пригодными примерами поверхностно-активных веществ являются водорастворимые соли моносульфатов моноглицеридов высших алифатических кислот, такие как натриевая соль моносульфированного моноглицерида жирных кислот гидрированного кокосового масла, высшие алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат натрия, алкиларилсульфонаты, такие как додёцилбензолсульфонат натрия, высшие алкилсульфоацетаты, лаурилсульфоацетат натрия, сложные эфиры высших алифатических кислот и 1 ,2- дигидроксипропансульфоната, и в значительной степени насыщенные высшие алифатические ациламиды производных низших алифатических аминокарбоновых кислот, такие как имеющие от 12 до 16 атомов углерода в фрагментах алифатической кислоты, алкильных или ацильных радикалах, и тому подобные. Примерами упомянутых последними амидов являются N-лауроилсаркозин, и натриевые, калиевые и этаноламмонийные соли N-лауроил-, N-миристоил- или N-пальмитоилсаркозина. В дополнение к поверхностно-активным веществам ингредиенты для ухода за зубами могут включать антибактериальные агенты, такие, но не ограничивающиеся таковыми, как триклозан, хлоргексидин, цитрат цинка, нитрат серебра, медь, лимонен и хлорид цетилпиридиния. В некоторых вариантах выполнения дополнительные антикариозные агенты могут включать фторид-ионы или фторсодержащие компоненты, такие как неорганические фторидные соли. В некоторых вариантах выполнения могут быть предусмотрены растворимые соли щелочных металлов, например фторид натрия, фторид калия, фторсиликат натрия, фторсиликат аммония, монофторфосфат натрия, а также фториды олова, такие как фторид двухвалентного олова и хлорид двухвалентного олова. В некоторых вариантах выполнения в качестве ингредиента также может быть включено фторсодержащее соединение, оказывающее благоприятное действие для ухода и гигиены полости рта, например, для уменьшения растворимости эмали в кислоте и защиты зубов от разрушения. Его примеры включают фторид натрия, фторид двухвалентного олова, фторид калия, фторид калия-двухвалентного олова (SnF2-KF), гексафторстаннат натрия, хлорфторид двухвалентного олова, фторцирконат натрия и монофторфосфат натрия. В некоторых вариантах выполнения включена мочевина.
Фармацевтические композиции
Могут быть использованы различные способы получения патентуемой фармацевтической композиции (ПФК) помимо способов, приведенных в примерах 1 и 2.
ПФК композицию можно давать перорально или можно вводить внутрисосудистой, подкожной, внутрибрюшинной инъекцией, в форме аэрозоля, глазным способом введения, в мочевой пузырь, местно и так далее. Например, способы ингаляционного введения хорошо известны в данной области техники. Доза терапевтической композиции будет варьировать в широких пределах в зависимости от конкретного вводимого антимикробного ПФК, природы заболевания, частоты введения, способа введения, клиренса используемого агента из организма хозяина и тому подобного. Начальная доза может быть более высокой с последующими более низкими поддерживающими дозами. Дозу можно вводить с частотой один раз в неделю или один раз в две недели, или делить на меньшие дозы и вводить их один или несколько раз в сутки, два раза в неделю и так далее для поддержания эффективного уровня дозы. Во многих случаях для перорального введения будет необходима более высокая доза, чем для внутривенного введения ПФК могут быть включены во множество композиций для терапевтического введения. Более конкретно, ПФК по настоящему изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции в сочетании с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и могут быть включены в препараты в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах, таких как капсулы, порошки, гранулы, мази, кремы, пены, растворы, суппозитории, инъекции, формы для ингаляционного применения, гели, микросферы, лосьоны и аэрозоли. Как таковое, введение соединений может быть осуществлено различными способами, включая пероральное, трансбуккальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутрикожное, чрескожное, внутритрахеальное введение и так далее. ПФК по изобретению могут распределяться системно после введения или могут быть локализованы с использованием имплантата или другой композиции, удерживающей активную дозу в месте имплантации. ПФК по настоящему изобретению могут быть введены сами по себе, в комбинации друг с другом, или они могут быть использованы в комбинации с другими известными соединениями (например клопидогрелем, противовоспалительными агентами, и так далее). В фармацевтических лекарственных формах соединения могут быть введены в форме их фармацевтически приемлемых солей. Следующие способы и эксципиенты приведены лишь в качестве примеров и никоим образом не являются ограничивающими. Для препаратов для перорального введения наши композиции могут быть использованы сами по себе или в комбинации с подходящими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связывающими агентами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатины; с разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия; со смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния; и, если желательно, с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами и корригентами. ПФК быть включены в композиции для инъекций путем их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или неводном растворителе, таком как растительные или другие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоля; и, если желательно, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. ПФК могут быть использованы в аэрозольной композиции для ингаляционного введения. Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в приемлемые пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и тому подобное. Кроме того, ПФК могут быть включены в суппозитории смешиванием с множеством основ, таких как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены ректально с использованием суппозитория. Суппозиторий может содержать наполнители, такие как масло какао, карбоваксы и полиэтиленгликоли, расплавляющиеся при температуре тела, но твердые при комнатной температуре. Могут быть изготовлены стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, где каждая единица дозы, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит предопределенное количество композиции, содержащей одно или более компонентов композиции по настоящему изобретению. Сходным образом, стандартные лекарственные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать смеси компонентов по настоящему изобретению в композиции в форме раствора в стерильной воде, нормальном физиологическом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе. Имплантаты для длительного высвобождения композиций хорошо известны в данной области техники. Имплантаты изготавливают в форме микросфер, пластинок и так далее с биодеградируемыми или не являющимися биодеградируемыми полимерами. Например, полимеры молочной и/или гликолевой кислот образуют деградируемый полимер, хорошо переносимый хозяином. Имплантат, содержащий ПФК по изобретению, располагают близко к очагу патологии, так чтобы локальная концентрация активного агента была повышенной по сравнению с остальными областями тела. При использовании здесь термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования в качестве однократных доз для субъектов людей и животных, при этом каждая единица содержит предопределенное количество соединений по настоящему изобретению, которого, согласно вычислениям, достаточно для оказания желаемого эффекта, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Описания стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению зависят от конкретного используемой смеси-композиции, и эффекта, который должен быть достигнут, и фармакодинамики используемой смеси у хозяина. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, общедоступны. Кроме того, общедоступны фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты для регулирования pH и буферные агенты, агенты для регулирования тоничности, стабилизаторы, смачивающие агенты и тому подобное. Типичные дозы для системного введения варьируют от 0,1 пг до 1000 миллиграмм на кг массы тела субъекта на одно введение. Типичная доза может представлять собой одну таблетку для приема от двух до шести раз в сутки или одну капсулу или таблетку с длительным высвобождением для приема один раз в сутки с пропорционально более высоким содержанием активного ингредиента. Эффект длительного высвобождения может быть обусловлен материалами, из которых изготовлена капсула, растворяющимися при различных значениях pH, капсулами, обеспечивающими медленное высвобождение под воздействием осмотического давления или любым другим известным способом контролируемого высвобождения, в т.ч. на основе ковалентной модификации бактериальных спор. Специалистам в данной области техники будет ясно, что уровни доз могут варьировать в зависимости от конкретной структуры или смеси, тяжести симптомов и предрасположенности субъекта к побочным эффектам. Некоторые из конкретных структур/композиций обладают большей активностью, чем другие. Предпочтительные дозы данной композиции могут быть легко определены специалистами в данной области техники множеством способов. Предпочтительным способом является измерение физиологической активности ПФК. Один из интересующих способов представляет собой применение липосом в качестве наполнителя для доставки. Липосомы сливаются с клетками целевой области и обеспечивают доставку содержимого липосом внутрь клеток. Контакт липосом с клетками поддерживают в течение времени, достаточного для слияния, с использованием различных способов поддержания контакта, таких как выделение, связывающие агенты и тому подобное. В одном аспекте изобретения липосомы разработаны для получения аэрозоля для легочного введения. Липосомы могут быть изготовлены с очищенными белками или пептидами, опосредующими слияние мембран, такими как вирус Сендай или вирус гриппа и так далее. Липиды могут представлять собой любую полезную комбинацию известных липидов, образующих липосомы, включая катионные или цвиттерионные липиды, такие как фосфатидилхолин. Остальные липиды будут обычно нейтральными или кислыми липидами, такими как холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и тому подобное. Для получения липосом может быть использован способ, описанный Kato et а1.(1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Кратко, липиды и композицию для включения в липосомы, содержащую пептиды, смешивают в подходящей водной среде, подходящим образом в солевой среде, где общее содержание твердых веществ будет находиться в диапазоне приблизительно 110 масс.%. После интенсивного перемешивания в течение коротких периодов времени, приблизительно 5-60 сек, пробирку помещают в теплую водяную баню при приблизительно 25-40° С и этотцикл повторяют приблизительно 5-10 раз. Затем композицию обрабатывают ультразвуком на протяжении подходящего периода времени, обычно приблизительно 1-10 сек, и, возможно, дополнительно перемешивают на вихревой мешалке. Затем объем увеличивают добавлением водной среды, обычно увеличивая объем в приблизительно 1-2 раза, с последующим взбалтыванием и охлаждением. Способ позволяет включать в липосомы супрамолекулярные структуры с высокой суммарной молекулярной массой, такие как модифицированные микробные споры.
Композиции с другими активными агентами
Для применения в рассматриваемых способах ПФК по изобретению могут быть включены в композиции с другими фармацевтически активными агентами, в частности другими антимикробными и антивирусными агентами. Другие интересующие агенты также включают широкий спектр антиангинальных, гипотензивных, тромболитических, противовоспалительных средств, известных в данной области техники. Классы средств для терапии вирусной и микробной диареи, гриппа и его осложнений представлены в стандартизованных протоколах лечения данной патологии и могут комбинироваться с патентуемыми ПФК. В композицию ПФК по изобретению могут также быть включены цитокины, например интерферон гамма, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 12 и так далее. Далее настоящее изобретение описано следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие объем изобретения. Пример 4. Протективная антивирусная активность композиции, полученной в Примере 2, на примере предупреждения смертности у мышей,
инфицированных вирусом гриппа H1N1 (Калифорния_2011)
Испытания проводили на 10 группах молодых белых лабораторных мышей по 10 в группе. Всем животным для создания иммунодефицита вводили внутрибрюшинно циклофосфамид однократно в дозе 100 мг/кг 2 раза в неделю: в группе А животным перорально давали по 0,2 мл воды вместо композиции КХМСБ ежедневно 1 раз в день 10 дней. Эта группа выступала в качестве позитивного контроля. Второй группе вводили КХМСБ (вариант с S. boulardii ) в дозе 0,2 мл на животное перорально. С третьей по шестую группы вводили разные варианты КХМСБ. Седьмой группе вводили Лактовит форте (БК с витаминами), восьмой группе вводили Энтерол ( S . boulardii ), девятая группа принимала КХМСБ без S. boulardii , без бензилизохинолинов и без активаторов терминации (гиббереллина и др.). Десятая группа получала перорально стандартный антивирусный препарат ремантадин перорально в дозе 75 мг/кг ежедневно 1 раз в день. Через неделю приема циклофосфамида у животных развивался иммунодефицит по клеточному звену. После этого, всех животных инфицировали инокуляцией вируса гриппа H1N1 (Калифорния_2011) в дозе 10 ЕД90/мышь интраназально по 0,1 мл. Основным критерием эффективности того или иного антигриппозного препарата является уровень смертности животных после инокуляции вируса. В контрольной группе -Nb 9 уровень смертности составил 90%. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты изучения профилактического антивирусного действия в
отношении вируса гриппа H1N1 разных композиций на основе КХМСБ
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
P <0,01, разница достоверна для всех групп 2-10 против контроля группы 1
Как видно из таблицы 4, наиболее эффективными композициями были варианты изобретения, содержащие в одном случае папаверин и в другом папаверин и S. boulardii. В обоих случаях все инфицированные животные выжили. Близкие результаты с 90% выживаемости наблюдались в группах 4-5 разных вариантов реализации композиций. Композиция, не включающая пробиотики (в т.ч. модифицированные споры) обладала слабой профилактической антигриппозной активностью (Группа 6) и защищала только 30% животных от гибели. При этом чистые споры S. boulardii из препарата Лактовит-Форте обладал значительно меньшей профилактической антивирусной активностью (30% животных только выжило). Такая же картина наблюдалась и при использовании Энтерола, содержащего S. boulardii. Антигриппозный препарат Ремантадин смог защитить только 50% животных. Таким образом, для проявления максимальной профилактической антивирусной активности на фоне химического иммунодефицита необходимо применять композицию КХМСБ со всеми компонентами прописи. Без пробиотических компонентов, в частности модифицированных спор БК композиция утрачивает антивирусную профилактическую активность. Наличие в композиции также и S. boulardii позволило вообще предотвратить гибель животных. Механизмы такого профилактического эффекта пока остаются не выясненными.
Пример 5. Протективная антивирусная активность КХМСБ в отношении ротавирусов
Ротавирусная инфекция— инфекционное заболевание, вызванное ротавирусами. Является наиболее частой причиной диареи у детей. Для этого заболевания свойственно острое начало, умеренно выраженные симптомы гастроэнтерита или энтерита, частое сочетание кишечного и респираторного синдромов в начальном периоде болезни. Ротавирусную инфекцию часто неверно называют «кишечным гриппом», хотя ротавирус не имеет никакого отношения к вирусам гриппа.
В эксперименте использовали субсеротип В ротавируса штамм ИМИ В1 17 (Харьков, Украина). Данный штамм вызывает у крыс типичную диарею с жидким стулом, повышением температуры тела, изменением поведения (уменьшение подвижности), падением аппетита, ухудшением внешнего вида шерсти (становятся взъерошенными). Для фиксации указанных признаков каждую крысу помещали в малую клетку, дно которой устилали белой бумагой. Степень диареи фиксировали по степени загрязнения бумаги (в баллах от 1 до 10). Также фиксировали время проявления признаков вирусной диареи. Первым этапом эксперимента являлось создание иммуно дефицитного фона для увеличения процента животных с вирусной диареей. Для этого каждому животному вводили два раза в неделю по 100 мг/кг веса цикловосфамид внутривенно. Такая доза способна подавить клеточное звено иммунитета и блокировать начальный антивирусный ответ организма. После этого неделю животным давали перорально разные композиции КХМСБ одну неделю ежедневно 1 раз в день в дозе 0,5 мл (0,2 г сухой композиции). Каждую композицию давали одной группе крыс, в каждой группе крыс было по 6 животных. Всего было 10 групп. В таблице 5 представлено распределение групп и результаты изучения профилактического антидиарейного эффекта, вызванного ротавирусом Б.
Каждому животному вводили 5 ЕД90 вируса в культуральной среде на молоке (1 :1) перорально. Таблица 5. Результаты изучения профилактического антивирусного действия в отношении ротавируса Б разных композиций на основе КХМСБ
Figure imgf000042_0001
* 1 балл - единичные пятна на бумаге в клетках; 10 баллов - массивная диарея со сплошным загрязнением бумажной подстилки, а также комплекс клинических признаков вирусной диареи. ** процент эффективности - среднее арифметическое от суммы процентов заболевших животных и процента уменьшения сроков заболевания по отношению к контролю. Р <0,01, разница достоверна для всех групп 2-10 против контроля группы 1 (метод Хи- квадрат)
Как видно из таблицы 5, ни одно из животных, принимавших КХМСБ, содержащую ковалентно модифицированные споры БК совместно с бензохинолиновыми алкалоидами, растительными экстрактами и активаторами терминации спор не заболели вирусным энтеритом и не проявляли никаких признаков диареи или вирусной инфекции. Менее эффективными были компонент КХМСБ без пробиотиков и составили 75% эффективности, препараты же Лактовит-Форте и Энтерол проявили только по 72% эффективности. Наименее эффективным был циклоферон (30 %), применяемый перорально в дозе 30 мг/кг веса через день. Таким образом, наблюдается синергизм активности всех компонентов, входящих в композицию. Исключение из композиции либо ковалентно химически модифицированных спор БК либо остальных компонентов композиции приводит к потере эффективности. Кроме того, следует обратить внимание на более высокую степень защиты животных композициями КХМСБ против аптечных препаратов Лактовит- Форте (БК и витамины В 12, В9) и Энтерол (S. Boulardii).
Пример 6. Протективная антивирусная активность КХМСБ в отношении коронавирусов
Респираторный коронавирус представлен штаммами ОС38, ОС43, а причиной энтерита наиболее часто становится штамм 229 Е. Название объясняется наличием особого кольца на поверхности вирусной частицы: на липидной оболочке, или суперкапсиде присутствуют пепломеры в форме булавовидных шипообразных выростов, напоминающих корону. Коронавирус способен провоцировать поражение: дыхательной системы; желудочно-кишечного тракта; нервной системы. Первичная репродукция в слизистой носоглотки и дыхательных путей, в результате возникает обильный насморк, а у детей— бронхиты и пневмонии. В большинстве случаев люди встречаются с диареями и ентеритами, вызванными коронавирусами
В эксперименте использовали Alphacoronavirus 1 штамм ИМИ К 105 (Харьков, Украина). Данный штамм вызывает у крыс типичную диарею с жидким стулом, повышением температуры тела, изменением поведения (уменьшение подвижности), падением аппетита, ухудшением внешнего вида шерсти (становятся взъерошенными). Для фиксации указанных признаков каждую крысу помещали в малую клетку, дно которой устилали белой бумагой. Степень диареи фиксировали по степени загрязнения бумаги (в баллах от 1 до 10). Также фиксировали время проявления признаков вирусной диареи. Первым этапом эксперимента являлось создание иммунодефицитного фона для увеличения процента животных с вирусной диареей. Для этого каждому животному вводили два раза в неделю по 100 мг/кг веса цифловосфамид внутривенно. Такая доза способна подавить клеточное звено иммунитета и блокировать начальный антивирусный ответ организма. После этого неделю животным давали перорально разные композиции КХМСБ одну неделю ежедневно 1 раз в день в дозе 0,5 мл (0,2 г сухой композиции). Каждую композицию давали одной группе крыс, в каждой группе крыс было по 6 животных. Всего было 10 групп. В таблице 6 представлено распределение групп и результаты изучения профилактического антидиарейного эффекта, вызванного коронавирусом.
Каждому животному вводили 1 ЕД90 вируса в культуральной среде перорально.
Таблица 6 Результаты изучения профилактического антивирусного действия в
отношении коронавирусов разных композиций на основе КХМСБ
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
* 1 балл - единичные пятна на бумаге в клетках; 10 баллов - массивная диарея со сплошным загрязнением бумажной подстилки, а также комплекс клинических признаков вирусной диареи.
** процент эффективности - среднее арифметическое от суммы процентов заболевших животных и процента уменьшения сроков заболевания по отношению к контролю. Р <0, 01, разница достоверна для всех групп 2-10 против контроля группы 1 (метод Хи- квадрат)
Как видно из таблицы 6 ни одно из животных, принимавших КХМСБ, содержащую ковалентно модифицированные споры БК совместно с бензохинолиновыми алкалоидами, растительными экстрактами и активаторами терминации спор не заболели вирусным энтеритом, вызванным коронавирусом, и не проявляли никаких признаков диареи или вирусной инфекции. Менее эффективными были компонент КХМСБ без пробиотиков и составили 75% эффективности, препараты же Лактовит-Форте и Энтерол проявили только по 71% эффективности. Наименее эффективным был циклоферон (30 %), применяемый перорально в дозе 30 мг/кг веса через день. Таким образом, наблюдается синергизм активности всех компонентов, входящих в композицию. Исключение из композиции либо ковалентно химически модифицированных спор БК либо остальных компонентов композиции приводит к значительному уменьшению эффективности профилактики. Кроме того, следует обратить внимание на более высокую степень защиты животных композициями КХМСБ против аптечных препаратов Лактовит- Форте (БК и витамины В 12, В9) и Энтерол ( S . Boulardii).
Пример 7. Иммуномодулирующая активность КХМСБ в сравнении с препаратом
Лактовит-Форте.
Для определения влияния препаратов КХМСБ на иммунитет мышей, животных группировали по схеме, описанной в примере 3, кроме группы с ремантадином. Всего было 9 групп. Всем животным вводили циклофосфамид (CFA) однократно в дозе 250 мг/кг для индукции иммунодефицита как показано в примере 3. Через неделю начинали давать образцы КХМСБ перорально в дозе 0,2 мл перорально ( доза содержала 0,1 сухой композиции КХМСБ).
Hsp70, NO и проба на синтез цитокинов. Выделение мышиных перитонеальных макрофагов и Т-лимфоцитов селезенки, измерение продукции TNF проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA) с помощью ELISA Kit (Mouse TNF-a ELISA Kit, PharMingen, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). NO. Макрофаги, 106 клеток / мл, культивировали в 24-луночных планшетах (BioRad, Hannover, EU) в среде 199 с индикатором pH метиленовым красным при 37 0 С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02. Среда была обогащена 25 мМ HEPES, 3% фетальной бычьей сывороткой. Супернатанты собирали через 21 ч и анализировали на N02. Реагент Грисса (содержащий 1% сульфаниламида / 0,1% нафтилэтилендиамин дигидрохлорида и 2,5% Н3Р04 (1 : 1)) использовали для оценки N02, который служил индикатором образования NO. После культивирования 100 мл каждого образца помещали в 96-луночный планшет со 100 мл реагента Грисса. Спустя десять минут оптическая плотность измерялась на планшетном спектрофотометре (Stat Fax 303 plus, Awareness technology inc., USA) при 590 нм.
Определение способности лимфоцитов к экспрессии ИЛ-2
Селезеночные лимфоциты, 1,5 c 106 клеток / мл, культивировали в течение 72 ч в 24- луночных планшетах в среде 199 при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02. Среда была дополнена 25 мМ HEPES, 5% фетальной бычьей сыворотки и 5 мг / мл фитогемагглютинина (ФГА). Концентрацию IL-2 в супернатанте клеток, стимулированных ФГА, измеряли с помощью ELISA с использованием поликлональных антител кролей против мышиного IL-2 (BioRad, AbD Serotec, Raleigh, NC, США) и козьих анти-кроличьих IgG, конъюгированных с Биотином (Антитела Agrisera, Vannas, SWEDEN). После окрашивания ABTS, оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре (Stat Fax 303 plus, Awareness technology inc., USA) при 405 нм.
Статистическая значимость была рассчитана по t-критерию Стьюдента в модификации Бонферрони. В таблице 7 показаны результаты воздействия КХМСБ на иммунитет мышей.
Таблица 7. Влияние КХМСБ в сравнении с препаратом Лактовит-Форте на иммунитет мышей
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
* Статистически достоверно отличается от обоих контролей, Р <0,05.
Как видно из таблицы 7, наилучший результат восстановления иммунитета практически до нормальных уровней наблюдался во всех опытных группах 3-6, где применялись полноценные композиции КХМСБ на фоне CFA - иммунодефицита. При этом, уровень селезеночных Т лимфоцитов был статистически достоверно выше, чем в контроле. Единственным необъяснимым показателем, выходящим за рамки понятия иммуносупрессия выходит увеличение продукции IL-2 спленоцитами выше контроля в группе 5, где наблюдалась индуцированная иммуносупрессия. Мы связываем этот факт с неравномерным влиянием CFA на разные звенья иммунной системы и несинхронную их стимуляцию споровой формой В. coagulans. В отличие от композиции группы 3, группа 7 (без пробиотиков) хоть и стимулировала иммунитет против контрольной группы 2, но не восстанавливала его даже до уровня контрольной группы 1. Лактовит-Форте и Энтерол восстанавливали иммунитет практически до нормы аналогично как и химически модифицированные споры БК. Более высокие показатели влияния на иммунитет композиций КХМСБ N° 3-5 объясняются синергизмом действия компонентов: стимуляцией терминацией спор гиббереллином и другими активаторами, стимуляцией деления микробных клеток и грибов папаверином и/или экстрактом мака, влиянием на иммунитет растительных экстрактов солодки, стевии и спирулины.
Основные преимущества предлагаемой нами композиции:
1. Мощный профилактический эффект в отношении вирусных инфекций (грипп, коронавирус, ротавирус) сопоставимый с действием специфических вакцин
2. Сильный иммуномодулирующий эффект 3. Быстрое наступление эффекта активации иммунтитета уже через 8 часов (для ^модифицированных спор Bacillus coagulans 72 часа)
4. Возможность введения нашей композиции в состав газированных напитков, холодного чая, мороженного, сладкой пены в аэрозольных балончиках, кремов, зубных паст, косметических средств. Модификация поверхности спор приводит к повышению их устойчивости в окружающей среде и к консервантам.
5. Способность защищать продукт, содержащий споры Bacillus coagulans от прокисания и порчи длительное время, а прокисший продукт будет содержать полезные бактерии Bacillus coagulans , которые не принесут вреда организму.
6. Продукты на основе предлагаемой композиции способны стимулировать метаболизм и энергетику организма, что весьма актуально в спорте и в период реабилитации после тяжелых болезней, может быть полезным в спортивном питании. Данный эффект вызван синергезмом спор и экстрактов: спирулины, стевии, люцерны. Для люцерны доказан анаболический эффект и реальная польза при спортивных тренировках. Указанные экстракты не относятся к списку допингов.

Claims

Формула изобретения
1. Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция, включающая смесь пробиотиков с иммуномодулирующим эффектом, отличающаяся тем, что среди пробиотиков содержит в том числе модифицированные споры сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans , поверхность которых ковалентно химически модифицирована с разными степенями модификации, а композиция также дополнительно содержит соединения группы бензилизохинолина или сырье, их содержащее, растительные экстракты с гликозидами, аминокислоты и витамины, а также содержит как минимум два из следующих компонентов: гиббереллин, пара- аминобензойную кислоту; карнитин; ауксин или его производное.
2. Композиция по п1 отличающаяся тем, что степени модификации поверхности спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans находятся в количестве до 15% в пересчете на массу спор
3. Композиция по п1., отличающаяся тем, что ковалентная химическая модификация спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans это ацилирование ангидридами или галогенангидридами дикарбоновых и поликарбоновых кислот
4. Композиция по п1., отличающаяся тем, что ковалентная химическая модификация спор сапрофитной пробиотической бактерии В. coagulans это алкилирование галогенпроизводными карбоновых и поликарбоновых кислот
5. Композиция по п1., отличающаяся тем, что дополнительно в качестве пробиотиков содержит сапрофитный пробиотический гриб S. boulardii в количестве от 1 до 10 lg КУО /мл на одну дозу продукта
6. Композиция по п1., отличающаяся тем, что также включает в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт солодки в количестве от 0,05% до
0,5% от массы продукта
7. Композиция по п1., отличающаяся тем, что также включает в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт стевии в количестве от 0,05% до 0,5%
8. Композиция по п1., отличающаяся тем, что также включает в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт спирулины в количестве от 0,05% до 5% от массы продукта
9. Композиция по nl ., отличающаяся тем, что также включает в качестве растительного экстракта с гликозидами экстракт люцерны в количестве от 0,05% до 5% от массы продукта
10. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов цианокобаламин
11. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов рибофлавин
12. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов тиамин
13. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов фолиевую кислоту
14. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов рутин
15. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве витаминов смесь цианокобаламина, рибофлавина, тиамина, фолиевой кислоты, рутина
16. Композиция по nl ., отличающаяся тем, что также включает в качестве аминокислоты аргинин
17. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве аминокислоты таурин
18. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве аминокислоты лизин
19. Композиция по nl., отличающаяся тем, что также включает в качестве аминокислот смесь аргинин, таурина и лизина.
20. Композиция по nl., отличающаяся тем, что количество пробиотической бактерии В. coagulans составляет от 1 до 10 lg КУО /мл на одну дозу продукта
21. Композиция по nl., отличающаяся тем, что сырье, содержащее соединения группы бензилизохинолина это измельченные зрелые маковые зерна
22. Композиция по nl., отличающаяся тем, что сырье, содержащее соединения группы бензилизохинолина это экстракт зрелых маковых зерен
23. Композиция по nl., отличающаяся тем, что соединение группы бензилизохинолина это папаверин
24. Композиция по nl., отличающаяся тем, что количество гиббереллина составляет 0,01-0,05% от массы продукта
25. Композиция по nl., отличающаяся тем, что количество пара-аминобензойной кислоты составляет 0,01-0,5% от массы продукта
26. Композиция по nl., отличающаяся тем, что количество карнитина составляет 0,1- 1 ,0 % от массы продукта
27. Композиция по nl ., отличающаяся тем, что количество ауксина или его производного составляет 0,01-0,05% от массы продукта
PCT/RU2018/000292 2018-05-04 2018-05-04 Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом WO2019212379A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA202090769A EA202090769A1 (ru) 2018-05-04 2018-05-04 Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом
US16/954,854 US11446338B2 (en) 2018-05-04 2018-05-04 Food, cosmetic and pharmaceutical formulation with an immunomodulatory and protective anti-viral effect
PCT/RU2018/000292 WO2019212379A1 (ru) 2018-05-04 2018-05-04 Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000292 WO2019212379A1 (ru) 2018-05-04 2018-05-04 Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019212379A1 true WO2019212379A1 (ru) 2019-11-07

Family

ID=68386466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000292 WO2019212379A1 (ru) 2018-05-04 2018-05-04 Пищевая, косметическая и фармацевтическая композиция с иммуномодулирующим и протективным антивирусным эффектом

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11446338B2 (ru)
EA (1) EA202090769A1 (ru)
WO (1) WO2019212379A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021167609A1 (en) * 2020-02-18 2021-08-26 Xia Xin Rui Method for treating and preventing coronavirus (covid-19) infection by direct pulmonary administration of a selected microorganism

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3822338A4 (en) * 2018-09-30 2021-08-18 Inner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd. LACTOBACILLUS PARACASEI ET-22 AND USE OF IT
CN117202785A (zh) * 2021-03-30 2023-12-08 维沃保护公司 用于预防人类病原体在蔬菜上形成和生长的细菌菌株
WO2023275323A1 (en) * 2021-06-30 2023-01-05 Ab Mauri (Uk) Ltd Physiologically acceptable yeast compositions for use in the treatment of a gastro-intestinal disorder
WO2023046844A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Biocodex Pharmaceutical compositions useful for the prevention or treatment of viral infections

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060263344A1 (en) * 2003-04-02 2006-11-23 Mitchell Skop Novel probiotic compositions and methods of using the same
US20130251695A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-26 Ganeden Biotech, Inc. Cosmetic Compositions

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5580857A (en) * 1989-12-12 1996-12-03 Oden; Per Use of gibberellins for the treatment of prostatitis
US5455033A (en) * 1993-05-21 1995-10-03 Degree/Silverman M.D. Inc. Medicinal composition for treatment of inflammation
US6645506B1 (en) * 1997-04-18 2003-11-11 Ganeden Biotech, Inc. Topical compositions containing extracellular products of Pseudomonas lindbergii and Emu oil
FR2772609B1 (fr) * 1997-12-19 2004-05-07 Oreal Utilisation d'au moins une auxine dans une composition cosmetique
IT1317911B1 (it) * 2000-09-28 2003-07-15 Idi Irccs Formulazione cosmetica.
US20050032674A1 (en) * 2003-07-03 2005-02-10 Kelly Ciaran P. SAIF, an anti-inflammatory factor, and methods of use thereof
CN101543629B (zh) * 2008-03-27 2011-11-16 北京荣昌药物研究院有限公司 盐酸罂粟碱作为透皮吸收促进剂的应用
EP2296710B1 (en) * 2008-06-12 2015-08-12 Universite Laval Modified protein excipient for delayed-release tablet

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060263344A1 (en) * 2003-04-02 2006-11-23 Mitchell Skop Novel probiotic compositions and methods of using the same
US20130251695A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-26 Ganeden Biotech, Inc. Cosmetic Compositions

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOMKO T.V. ET AL.: "Immunotropic aspect of the Bacillus coagulans probiotic action. Royal Pharmaceutical Society", JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY, vol. 69, 2017, pages 1033 - 1040, XP055649338 *
HUANG J.M. ET AL.: "Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores", VACCINE, vol. 28, 2010, pages 1021 - 1030, XP026855270 *
LISITSKAYA T. ET AL.: "Effect of biologically active substances formed by Baccilus coagulans ti on the growth of crops", ACTA UNIVERSITATIS CIBINIENSIS SERIES E: FOOD TECHNOLOGY, vol. XVII, no. 2, 2013, pages 53 - 60 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021167609A1 (en) * 2020-02-18 2021-08-26 Xia Xin Rui Method for treating and preventing coronavirus (covid-19) infection by direct pulmonary administration of a selected microorganism

Also Published As

Publication number Publication date
EA202090769A1 (ru) 2020-06-11
US20210085729A1 (en) 2021-03-25
US11446338B2 (en) 2022-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11759486B2 (en) Lactobacillus plantarum and composition comprising same
US11446338B2 (en) Food, cosmetic and pharmaceutical formulation with an immunomodulatory and protective anti-viral effect
US11857581B2 (en) Antiviral methods and compositions comprising probiotic bacterial molecules
JP5709883B2 (ja) 新規なラクトバチルス・プランタラム及びこれを含む組成物
KR101075557B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
KR101255050B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
US20200178567A1 (en) Probiotic bacterial molecules and their use in methods to treat/prevent infection by harmful bacteria and to provide nutritional health
KR101406168B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
CA3123125A1 (en) Strains, composition and method of use
KR101075558B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
Savustyanenko Mechanisms of action of probiotics based on Bacillus subtilis
TW201902499A (zh) 用於類鐸受體２活性化之組成物
EA041872B1 (ru) Фармацевтическая композиция, включающая смесь пробиотиков с иммуномодулирующим эффектом
KR20140048911A (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
US20230330162A1 (en) Product comprising probiotics and isomaltulose and method of its production

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18917222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18917222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1