WO2019175177A1 - Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique de rigidité uniforme - Google Patents

Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique de rigidité uniforme Download PDF

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WO2019175177A1
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less
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PCT/EP2019/056168
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Alice NICOLAS
Camille MIGDAL
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Centre National De La Recherche Scientifique
Universite Grenoble Alpes
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    • C08J9/0028—Use of organic additives containing nitrogen

Definitions

  • the present invention relates to a method for depositing nanoobjects on the surface of a polymeric gel of uniform rigidity, the gel that can be obtained and its applications.
  • nanoobjects proteins, nanoparticles, etc.
  • the density of a gel based on a polymer matrix is directly related to its porosity. The more porous a gel, the less rigid it is, and vice versa.
  • Controlling the surface density of nanoobjects deposited on the surface of gels is an issue in the field of cell culture, where it is desired to cultivate cells on the surface of substrates of physiological rigidity (of the order of kPa) while retaining quantitative control of surface chemistry.
  • physiological rigidity of the order of kPa
  • This need is particularly important for stem cell engineering and emerges in the field of pharmacological screening.
  • Cells adapt their biochemical responses to the rigidity of their environment in addition to adapting it to their chemical environment, so there is a need to independently control the rigidity and chemical properties of in vitro cell culture media and implantable media .
  • the processes for depositing nanoobjects on the surface of existing gels depend on the chemical structure of the gel. More precisely, three techniques are used.
  • the monomers used to prepare the polymer of the polymeric matrix are modified to include the nanoobject.
  • a control of the surface density of the polymer obtained is possible, but the surface density of nanoobjects on the gel obtained is directly related to the rigidity / porosity of the gel.
  • the other two techniques are based on a deposit and then grafting of the nanoobjects to the surface of the totally or partially solvated gel: a solution of nanoobjects is placed in the presence of the gel, the surface of which has optionally been activated beforehand (by grafting a reaction intermediate and / or by radiation); or
  • the nanoobjects are modified to render them reactive with the surface of the gel and then added in the form of a solution to the surface of the gel.
  • the surface density of grafted nanoobjects is dependent on the porosity / rigidity of the gel as soon as the process includes a partial drying step, which is generally unavoidable, for example when removing the solution of nanoobjects for perform the grafting reaction of the nanoobjects.
  • the gels are porous materials, and therefore very sensitive to dehydration: the drying characteristic times are generally of the order of a few seconds (typically for a rigidity gel of the order of 0.1 kPa ) at a few minutes (typically for a rigidity gel of the order of 25 kPa) depending on the porosity / rigidity of the gel.
  • the surface density of deposited nano-objects is independent of the stiffness / porosity of the gel.
  • the deposition efficiency of the nanoobjects is very low given the low probability that the nanoobjects approach the gel surface and interact with it, because these two techniques are limited by the diffusion of the nanoobjects towards the surface. Thus, these two techniques do not make it possible to easily control the surface density in deposited nano-objects.
  • the invention relates to a process for depositing nanoobjects on the surface of a gel comprising the steps of:
  • the method comprises a step a) of providing a gel comprising a polymeric matrix and a solvent within the polymeric matrix, the polymeric matrix forming a three-dimensional network capable of swelling in the presence of said solvent, where the solubility of the polymeric matrix to 1 bar and 25 ° C in the solvent is less than 1 g / l.
  • the gel comprises a polymer matrix and a solvent within the polymer matrix, the polymer matrix forming a three-dimensional network capable of swelling in the presence of said solvent.
  • the polymer matrix is therefore capable of retaining a proportion of solvent within its structure.
  • the maximum solvent content within the polymer matrix of the gel at 25 ° C (calculated as the ratio of the maximum solvent weight to the sum of the maximum solvent weight and the weight of the dry polymer matrix) varies. from 20 to 100%, preferably from 38 to 100%. When solvent continues to be added beyond the maximum level, the added solvent is no longer incorporated within the polymer matrix.
  • the polymer of the polymer matrix of the gel can be homopolymeric (three-dimensional network formed from a homopolymer), copolymer (three-dimensional network formed from a copolymer) or multipolymeric (interpenetrating polymeric gel network ( IPN).
  • the polymeric matrix comprises (or consists of) a polymer chosen from:
  • polyethylene glycols polypropylene glycols and copolymers of ethylene glycol or of propylene glycol, these optionally comprising units derived from the polymerization of (meth) acrylate compounds;
  • polysaccharides optionally comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds
  • polyvinyl alcohols comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds
  • dextrans comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds
  • polysiloxanes such as poly (dimethylsiloxane) (PDMS); and
  • (meth) acrylate compounds means compounds derived from acrylate or methacrylate, for example chosen from acrylic acid (AA), methacrylic acid (MA) and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA). , 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), sulfopropyl acrylate, where the acids may be in salt form, especially sodium or potassium.
  • the solvent may be any solvent in which the solubility of the polymer matrix at 1 bar and 25 ° C is less than 1 g / L and in which it is capable of swelling.
  • the solvent may be an aqueous solution or an organic solvent chosen from alcohols, alkanes (pentane, hexane for example), amines (triethylamine, diisopropylamine for example), ketones (acetone for example) and aromatic solvents (toluene, xylene for example).
  • organic solvent chosen from alcohols, alkanes (pentane, hexane for example), amines (triethylamine, diisopropylamine for example), ketones (acetone for example) and aromatic solvents (toluene, xylene for example).
  • the polymeric matrix comprises (or consists of) polysiloxanes, such as poly (dimethylsiloxane) (PDMS), and the solvent is selected from pentane, triethylamine, diisopropylamine or xylene.
  • PDMS poly(dimethylsiloxane)
  • the most usual solvent is an aqueous solution, and is preferably water, optionally deionized.
  • the gel is then a hydrogel. Hydrogel examples are included in Enas M. Ahmed's review (Journal of Advanced Research, 2015, 6, 105-121).
  • the polymeric matrix then generally comprises (or consists of) a polymer chosen from:
  • polyacrylamides for example from the polymerization of acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide;
  • polyethylene glycols polypropylene glycols and copolymers of ethylene glycol or of propylene glycol, these optionally comprising units derived from the polymerization of (meth) acrylate compounds;
  • polysaccharides optionally comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds
  • polyvinyl alcohols comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds
  • dextrans comprising repeating units resulting from the polymerization of (meth) acrylate compounds; propylene polyfumarates and poly (propylene-co-ethylene glycol fumarate); and
  • the rigidity of the gel provided in step a) is uniform.
  • the standard deviation s of the stiffness values Ri is preferably less than 20%, typically less than 15%, in particular less than 10%. , in particular less than 5%, preferably less than 1%, the rigidity values Ri being measured by atomic force microscopy on n points distributed over the entire surface of the gel provided in step a), n being greater than 50, typically greater than 100, especially greater than 1,000, preferably greater than 10,000,
  • said rigidity values Ri follow at ⁇ 10%, in particular ⁇ 5%, preferably ⁇ 1%, a symmetrical distribution, provided that the average mean and the median median of said distribution are such that the difference e defined in formula (III):
  • the standard deviation s of the stiffness values is then as defined above, or not.
  • the median is the value of "median" stiffness which allows to share the series of n stiffness values Ri ordered in two parts of the same number of elements.
  • the set of rigidity values Ri is then cut into two parts having the same number of elements: with one half of the stiffness values Ri, which are all less than or equal to "median” and the other half the other half of the rigidity values Ri, which are all greater than or equal to "median”.
  • said rigidity values Ri follow at ⁇ 10%, in particular ⁇ 5%, preferably ⁇ 1%, a normal distribution, provided that the average mean and the median median of said distribution are such that the difference e is less than 10%, especially less than 5%, preferably less than 1%.
  • the n points are randomly distributed over the entire surface of the gel.
  • the variability of its rigidity at the micrometer scale is less than 10%, preferably less than 5%.
  • the rigidity is measured on the surface of the gel on which the nanoobjects will be deposited during step b).
  • the difference in stiffness of two points of the gel 1 ⁇ m apart preferably does not exceed 10%.
  • the variability of the rigidity of the gel at the centimeter scale is less than 20%, in particular less than 15%, preferably less than 10%.
  • the variability of the stiffness of the gel is less than 20%, in particular less than 15%, preferably less than 10%.
  • the difference in stiffness of two points does not exceed 20%, especially 15%, preferably 10%.
  • the gel typically has an area greater than or equal to 1 ⁇ m 2 , preferably greater than or equal to 10 ⁇ m 2 .
  • Surfaces smaller than 1 ⁇ m 2 make it more difficult to measure a variability of rigidity.
  • Surfaces smaller than 10 pm 2 make it more difficult to measure a variability of the surface density in nanoobjects when the size of these is from 500 nm to 1000 nm.
  • the surface of the gel is generally less than or equal to 1000 mm 2 .
  • the distribution is measured on at least 50 points, preferably on at least 500 points and the difference is preferably less than 5%, or even less than 1%.
  • the distribution is preferably measured over at least 100 points, especially at least 1000 points, ideally at least 10,000 points, and the difference e is preferably less than 10%, or even less than 5%.
  • the rigidity of the gel is generally from 0.01 kPa to 500 kPa, especially from 0.05 kPa to 100 kPa, preferably from 0.1 kPa to 50 kPa.
  • the local stiffness and thus the rigidity variability can be determined by atomic force microscopy (AFM), for example by following the protocol described pages 29 and 30 of the application WO 2013/079231.
  • AFM atomic force microscopy
  • the method comprises a step b) of depositing nanoobjects on the surface of the gel.
  • the nanoobjects are preferably chosen from:
  • nanoparticles especially nanoparticles of metal, semiconductor or polymer.
  • Nanoobjects can be bacteria.
  • Nanoobjects are usually not cells. In one embodiment, the nanoobjects are not living organisms.
  • the metal is chosen in particular from alkali metals, alkaline earth metals, lanthanides, actinides, transition metals and so-called “poor” metals, and is preferably chosen from gold, silver and silver. indium.
  • the semiconductor is for example cadmium telluride (CdTe).
  • the polymer nanoparticles may for example be polystyrene or latex.
  • the proteins, peptides, polysaccharides and mixtures thereof are the preferred nanoobjects, in particular proteins and / or peptides inducing cell adhesion via integrins, such a protein possibly being fibronectin, fibrinogen, collagen or laminin. , vitronectin or peptides of the RGD type.
  • the proteins and / or the peptides and / or the polysaccharides may have been modified so that they carry a function capable of reacting with the polymer matrix of the gel.
  • nano means that the average diameter of the nanoobject is between 1 and 1000 nm, in particular from 2 to 500 nm, for example from 2 to 250 nm.
  • Gold nanoparticles typically have average diameters of 5 to 400 nm.
  • Silver or indium nanoparticles typically have mean diameters of 2 to 10 nm.
  • the nanoobjects deposited in step b) have an average diameter greater than or equal to the average pore diameter of the gel (average pore diameter when the nanoobjects are deposited, that is to say under the conditions of step b) ). This allows nanoobjects remain on the surface of the gel and do not sink or little into the polymeric matrix. Indeed, if the nanoobjects can penetrate within the gel in significant proportion, then the surface density of the nanoobjects deposited on the surface of the desolvated gel is all the more important that the pores are small. In this case, the surface density of the nanoobjects is not independent of the rigidity / porosity of the gel.
  • the nanoobjects deposited in step b) have a mean diameter at least two times greater, in particular at least three times greater, in particular at least four times greater, preferably at least five times greater, for example at least ten times greater. times greater than the average pore diameter of the gel.
  • the average pore diameter of the gel can be measured by neutron or X-ray scattering at small angles. It is typically of the order of 2 to 4 angstroms.
  • the average diameter of the proteins or peptides is typically measured by gel electrophoresis.
  • the average diameter of the polysaccharides is generally measured by high pressure liquid chromatography (HPLC), coupled with light scattering (which allows to determine the hydrodynamic radius).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the average diameter of the nanoparticles is typically measured by transmission electron microscopy or scanning (electron transmission microscope (TEM) and scanning electron microscope (SEM) in English).
  • the nanoobjects are deposited in the form of a mixture comprising the nanoobjects and a solvent.
  • the solvent of this mixture may be the same or different from the gel solvent.
  • the solvent of the mixture is soluble in the gel solvent (soluble under the conditions of step b)).
  • the solvent of the mixture is identical to the solvent of the gel.
  • the mixture can be colloidal (the nanoobjects being in suspension).
  • the method may comprise, between steps b) and c), a step b1) of leaving the nanoobjects in contact with the surface of the gel, generally for a period of 1 min to 24 hours, in particular 1 min to 12 hours, by example 5 min to 1 hour.
  • this step corresponds to an incubation.
  • the process is preferably free, between steps b) and c):
  • a step of removing a portion of the nanoobjects from the surface of the gel for example by suctioning the supernatant solution above the surface of the gel, and / or
  • the method comprises a step of c) evaporation of the solvent from the gel at least until the solvent content no longer varies with time.
  • Evaporation of the solvent from a uniform density gel comprises two regimes which are illustrated in Figures 1 and 2.
  • the evaporation rate When evaporation is continued, the evaporation rate reaches a critical evaporation rate at a critical evaporation time T c which marks the transition between the first and second periods of evaporation.
  • the diffusion forces become predominant with respect to the capillary forces and the removal of the solvent from the gel is mainly controlled by the diffusion of the solvent into the pores of the gel towards its surface.
  • the evaporation rate of the solvent is not constant over time. It decreases until an equilibrium evaporation rate is reached at a equilibrium time T eq beyond which the gel can no longer be dried, that is to say that the solvent content no longer varies with the weather.
  • step c) of the process according to the invention the evaporation of the solvent is carried out at least until this equilibrium time T eq , which is the minimum time from which the solvent content no longer varies with the time.
  • the solvent content beyond the equilibrium time T eq may be non-zero (FIG. 1) or zero (FIG. 2), depending on the gel and the solvent used.
  • the solvent content beyond the equilibrium time T eq of a hygroscopic polymer matrix will be non-zero, while the solvent content beyond equilibrium time T eq of a non-hygroscopic polymeric matrix will be zero.
  • the equilibrium time T eq is a characteristic of each gel. It depends on the nature of the solvent and the nature of the polymer matrix (ie the nature of the polymer, but also its porosity and therefore its rigidity) and the conditions of step c).
  • the evaporation is carried out by contacting the gel with a gas which is air or an inert gas (such as nitrogen or argon), preferably air, and / or
  • a gas which is air or an inert gas (such as nitrogen or argon), preferably air, and / or
  • the pressure is from 0.1 to 1 bar, preferably from 1 bar, and / or
  • the temperature of the gas brought into contact with the gel is from 4 to 90 ° C., in particular from 10 to 70 ° C., preferably from 15 to 40 ° C., in particular at room temperature (20 ° C.) or at 37 ° C. C, and / or
  • the velocity of the gas brought into contact is between 0 and 4 m / s, in particular between 0 and 1 m / s, preferably on the order of 0.45 m / s at 0.50 m / s (for example when the gel is placed under a laminar flow hood),
  • the acceleration of the evaporation does not affect the distribution of the nanoobjects on the surface of the gel, because these do not penetrate within the gel.
  • the acceleration of the evaporation makes it possible to limit the penetration of the nanoobjects within the gel. Higher temperatures and / or a higher gas velocity brought into contact (s) are then preferred.
  • the temperatures and velocity of the gas should not be too high so as not to degrade the gel and / or the nanoobjects (for example, some proteins degrade beyond certain temperatures, or a gas projected at too high a speed can damage the surface of the gel and / or lead to its fracturing / cracking).
  • the evaporation conditions are constant in time, that is to say that:
  • the gas flow rate is constant at ⁇ 10%
  • the temperature of the gas is constant at ⁇ 2 ° C
  • step c the (de) pressure is constant at ⁇ 10% in time (where (de) pressure means pressure (P> 1 bar)) or depression (P ⁇ 1 bar), for evaporation under vacuum for example).
  • step c the gel has a solvent content x a greater than the solvent content x eq of the equilibrium time gel T eq . In practice, this condition is almost always verified when the nanoobjects are deposited in the form of a mixture comprising the nanoobjects and a solvent.
  • the content of mineral salts in the solvent is less than 6 g / l, especially less than 5 g / l, typically less than 4 g / l, for example lower at 3 g / L, preferably less than 2 g / L, a content of less than 1.5 g / L, or even less than 1.0 g / L, or even less than 0.5 g / L, being particularly preferred .
  • the solvent is free of mineral salts.
  • Chloride salts (NaCl, KOI, CaCl 2 and / or MgCl 2 ), phosphate salts (Na 2 HPO 4 and / or K 2 HPO 4 ), carbonate salts (NaHCO 3 ) are examples of mineral salts. . These are used in the usual manner in physiological aqueous solutions and / or buffer used as a solvent in hydrogels and for proteins.
  • the user knows the mineral salt content at the beginning of the evaporation, because he knows the content of mineral salts in the gel provided in step a) and the mineral salts content that may be added during step b ) (these inorganic salts may in particular be derived from the solvent of the mixture comprising the nanoobjects and a solvent deposited in step b)). If the mineral salt content is unknown, it can be determined by ion chromatography.
  • the invention is based on the discovery that the total evaporation of the solvent from the gel (i.e. at least until the solvent content no longer varies with time) makes it possible to easily control the surface distribution of the nanoobjects and therefore their surface density, without degrading either the gel or the nanoobjects. Since the solvent is evaporated, it is easy to know the quantity of nanoobjects deposited on the surface of the gel, since this quantity corresponds to the quantity of nanoobjects deposited during step b) (provided that part of the nanoobjects was not removed between steps b) and c) (by aspirating the solution or rinsing)). The surface density in deposited nanoobjects is therefore known with great precision. During step c), the nanoobjects are deposited without any limit due to the diffusion of the nanoobjects towards the surface of the gel.
  • the skilled person avoids completely evaporate the solvent from the gel, because it expects to degrade, including cracking / fracturing and deposition of crystals.
  • these degradations are observed only when the content of mineral salts exceeds that mentioned above.
  • the inventors observe that the mineral salts present at higher levels crystallize during the evaporation of the solvent, which leads to the cracking of the gel, in particular during its re-inflation with a view to its use. in solvated form, and in general, leads to the presence of numerous deposits and irremovable crystals on the surface.
  • the solvent is free of compounds that can crystallize under the conditions of step c).
  • the surface density in nanoobjects on the gel obtained at the end of step c) is independent of the rigidity of the gel used.
  • the rigidity of the gel only affects the kinetics of evaporation (over time to reach equilibrium time T eq ).
  • the surface density in nanoobjects of the gel obtained in step c) is uniform.
  • the method for measuring the surface density in nanoobjects is variable according to the nature of the nanoobjects.
  • the nanoobjects are proteins
  • the nanoobjects are nanoparticles
  • the surface density can be analyzed by scanning electron microscopy.
  • the method may comprise, before step a), the steps of:
  • step aO ' evaporating the solvent from the gel to the initial solvent content x a , whereby a gel as defined in step a) is obtained.
  • the evaporation of step a0 ') is therefore carried out before the deposition of the nanoobjects. This prior evaporation makes it possible to reduce the thickness of the solvent layer on the surface of the gel and thus to promote the convective migration of the nanoobjects towards the surface of the gel during the following step b).
  • the method may comprise, before step b), a step bO) of grafting on the surface of the gel functional groups capable of reacting with the nanoobjects which will be deposited in step b).
  • the nanoobjects deposited during step b) may have been modified before step b) so that they carry a function capable of reacting with the polymer matrix of the gel.
  • the method may comprise, before step b), a step bO ') consisting of grafting on the nanoobjects (in particular the proteins and / or the peptides and / or the polysaccharides) at least one functional group capable of reacting with the gel .
  • the functional groups are preferably reactive to form a covalent bond.
  • the method may comprise a step d) covalently grafting the proteins and / or peptides and / or polysaccharides onto the gel, which makes it possible to immobilize them definitively. and to prevent the peptides and / or proteins and / or polysaccharides from moving again to the surface of the gel, during a rinsing of the gel after step c) for example.
  • This step d) can be simultaneous with step c) (during evaporation), or be carried out after step c) (on the desolvated gel).
  • the method does not include a rinsing step between steps a) and d).
  • the process may comprise, after step c), a step e) of rinsing with a solvent.
  • This solvent may be identical or different from the solvent of the gel.
  • the rinsing step can be repeated.
  • the method may comprise, after step c), or, if present, after step e), a step f) of recovering the gel.
  • the gel is in desolvated form (solvent content beyond the equilibrium time of the gel) if it is recovered at the end of step c). If a step e) of rinsing was carried out after step c) and before step f), the gel may be in solvated form (the solvent being the solvent of the rinsing solution).
  • the gel in solvated or desolvated form may advantageously be stored for several months, generally at least one month, in particular at least three months, or even at least nine months at room temperature (20 ° C.), generally without any degradation neither of the gel nor of nanoobjects (including no denaturation of proteins) are observed.
  • the method according to the invention is easy to implement. It does not require complex equipment. It is inexpensive.
  • the invention relates to the gel obtainable by the process defined above, the surface of the gel being at least partially coated with nanoobjects, where the standard deviation s' of the quantities Qj (j varying from 1 to p) of nanoobjects per pm 2 of area is less than 40%, typically less than 30%, especially less than 20%, preferably less than 10%, the quantities Q i of nanoobjects being measured by microscopy on p pm 2 of surface distributed over the entire surface of the gel, p being greater than 10, especially greater than 100, typically greater than 10000 (100 ⁇ 100), preferably greater than 1,000,000 (1000 ⁇ 1000),
  • said amounts Q i of nanoobjects per pm 2 of surface follow to a ⁇ 10%, in particular ⁇ 5%, preferably ⁇ 1%, a symmetrical distribution, provided that the arithmetic average and the median median Of said distribution are such that the difference e 'as defined in formula (VI):
  • the standard deviation s' of the quantities Qj (j varying from 1 to p) of nanoobjects per pm 2 of surface is then as defined above, or not.
  • the median is the "median" quantity of nanoobjects per pm 2 of area which allows the series of p quantities of nanoobjects to be divided by the pm 2 of the ordered surface into two parts of the same number of elements.
  • the set of quantities Qj of nanoobjects per pm 2 of surface is then cut into two parts having the same number of elements: with on one side a half of the quantities Qj of nanoobjects per pm 2 of surface, which are all lower or equal to "median" and on the other side the other half of the quantity values Qj of nanoobjects per pm 2 of surface, all of which are greater than or equal to "median".
  • a perfectly symmetric nanoobject surface distribution has a gap e 'of 0.
  • said quantities Q i of nanoobjects per pm 2 of surface follow at ⁇ 10%, in particular ⁇ 5%, preferably ⁇ 1%, a normal distribution, provided that the average mean and the median median Of said distribution are such that the distance e 'is less than 25%, especially less than 20%, typically less than 10%, preferably less than 5%.
  • the surface p pm 2 are randomly distributed over the entire surface of the gel.
  • the variability of the surface density in nanoobjects at the surface of the gel is less than 60%, especially less than 50%, typically less than 40%, preferably less than 30%.
  • the gel, solvated or unsolvated is not cracked, which can be characterized:
  • the invention relates to the use of this gel for cell culture, for the screening of pharmaceutical active principles, as a photonic sensor (typically when the nanoobjects are semiconductors) or physico-chemical, for example as a pH sensor. (typically when the nanoobjects are gold particles) or temperature (typically when the nanoobjects are CdTe particles), as a sensor for analyte detection, as a protein or peptide chip (typically when the nanoobjects are proteins and / or peptides), as cell chips or as a biomolecule capture chip.
  • a photonic sensor typically when the nanoobjects are semiconductors
  • physico-chemical for example as a pH sensor.
  • temperature typically when the nanoobjects are CdTe particles
  • analyte detection typically when the nanoobjects are CdTe particles
  • a protein or peptide chip typically when the nanoobjects are proteins and / or peptides
  • cell chips or as a biomolecule capture chip typically when the nanoobjects are proteins and / or
  • the invention also relates to:
  • a method for positioning cells for screening pharmaceutical active principles comprising contacting pharmaceutical active ingredients with the gel according to the invention in which the nanoobjects are peptides, proteins and / or polysaccharides,
  • a method for capturing biomolecules comprising contacting a medium comprising biomolecules to be captured with the gel according to the invention in which the nanoobjects are peptides, proteins and / or polysaccharides, a method of analysis comprising contacting a medium comprising an analyte to be detected with the gel according to the invention.
  • Examples were made with polyacrylamide hydrogels and proteins (fibronectin or fibrinogen) as nanoobjects.
  • the polyacrylamide hydrogels used had a rigidity variability of 10% on a centimetric scale and 5% on a scale of 100 ⁇ m (a measurement of rigidity having been made every 10 ⁇ m).
  • a photosensitive crosslinking agent has been grafted to the fibronectin used as a protein, to make it reactive with the surface of the hydrogel under UV-A exposure.
  • the grafting of the fibronectin previously activated on the surface of the gel is a photoactivated reaction. . a) Silanization of the basal lamellae
  • the basal lamella serves as a basal anchor for the hydrogel.
  • the basal glass slide 30 mm in diameter, was cleaned in a solution of 0.1 mol / l sodium hydroxide for 10 min. It was then rinsed intensively with water, then with ethanol, and air dried.
  • the hydrogel was cross-linked by UV, the transparent mask making it possible to flatten the surface of the hydrogel.
  • the mask consisted of a microscope slide treated with a fluorinated silane to limit its adhesion to the hydrogel.
  • the hydrogel was prepared according to the method described in application WO 2013/079231 from a composition consisting of:
  • Irgacure 819 was weighed in a UV-opaque bottle. Propylamine was added. The whole was heated at 50 ° C for 2 minutes. After heating, a homogeneous and transparent solution was obtained. Water, acrylamide, and bis-acrylamide were added quickly. The whole was homogenized gently with the pipette, to limit the incorporation of oxygen. 30 .mu.l were deposited on the 30 mm glass slide pretreated according to the protocol above. The coverslip was placed on a sample holder having shims which maintain a spacing of 40 ⁇ m between the coverslip and the transparent mask, deposited on the shims.
  • the assembly (mask, solution, coverslip) was illuminated with an Eleco UVP281 fiberglass lamp (2W / cm 2 ) for 7.8 s, 15 s or 20 s to obtain three hydrogels. Each set was then immersed in water to detach the mask from the hydrogel with a forceps. Each hydrogel was rinsed 3 times with deionized water and stored in deionized water.
  • the variability of porosity of each hydrogel was estimated by measuring the local rigidity of the hydrogel. Local rigidity was measured by AFM in an aqueous medium (JPK mark). The resistance of the gel to the penetration of the tip has been recorded. Four 100 ⁇ m x 100 ⁇ m regions spaced several millimeters apart were scanned. The scans were made with a 10 ⁇ m pitch to obtain a series of indentation curves. Each curve was processed according to the manufacturer's protocol with an elastic indentation model.
  • the rigidities obtained are dependent on the illumination time to prepare the gel. They are of the order:
  • the fibronectin has previously been coupled to the hetero-bifunctional sulfo-NHS-LC-diazirine crosslinker (Sulfosuccinimidyl-6- (4,4'-azipentanamido) hexanoate,
  • ThermoScientific Pierce trade name: sulfo-LC-SDA
  • sulfo-LC-SDA ThermoScientific Pierce; trade name: sulfo-LC-SDA
  • 5 mg of fibronectin (Roche) were dissolved in 2 mL of ultrapure deionized water at 37 ° C for 30 min.
  • 1 mg of sulfo-LC-SDA were weighed in the dark and dissolved in the fibronectin solution for 30 min at room temperature. This operation was repeated a second time, leading to the molar ratio of 1/480.
  • This protocol made it possible to react the sulfo-NHS function of sulfo-LC-SDA with the amine groups of fibronectin by limiting the hydrolysis of sulfo-LC-SDA.
  • the compound formed is a fibronectin molecule coupled to a photosensitive diazirine function.
  • the formed compound was dialyzed through a 6-8000 membrane in a dark chamber and at 4 ° C against 2L PBS + / + 1x for 48h with a change in PBS after 24 hours. It was then aliquoted in small volumes (25 and 50 ⁇ L) and stored frozen at -20 ° C.
  • the hydrogel prepared according to the above protocol was dehydrated under a vertical laminar flow hood (Aura) at 26 ° C for one hour (step a0 ')).
  • the hydrogel + fibronectin solution assembly was deposited on a hot plate at 37 ° C. under a laminar flow hood (convective flow of 0.5 m / s) until the solution was completely evaporated on the surface of the hydrogel (step c)).
  • the PBS + / + solution was aspirated from the gel, and replaced with a saturation solution consisting of a solution of PBS + / + 1 x - 0.1% Tween20 - 2% BSA, for 30 min with gentle stirring at room temperature.
  • the saturation solution was aspirated using a pipette and replaced with a solution of 3 ⁇ l of anti-fibronectin primary polyclonal antibody produced in the rabbit (Sigma-Aldrich, F3648) diluted in 1.2 mL of PBS + / + 1 x - Tween20 0.1% - BSA 2%.
  • the antibody was incubated for 1 h with gentle stirring at room temperature.
  • Characterization of grafted protein distribution was performed by confocal fluorescence microscopy (Leica SP microscope). A stack of images was acquired for each hydrogel at 488 nm wavelength with an image spacing of 0.28 ⁇ m. The different acquisitions were made at constant gain and constant laser intensity level. Each stack of images was then assembled with ImageJ software and sections were extracted. The maximum intensity image was computed from the image stack, providing a two-dimensional projection of the fluorescent surface for windows of 375 to 375 ⁇ m. The antibody markings lead to obtaining pixelated images. To remedy this, the pixelation was limited by a Gaussian filter of radius 10 pixels. Then the mean value of the intensity was calculated on this projection (Table 1).
  • Table 1 Average fluorescence intensity on a surface of 375x375 pm 2 and variability of the surface density in proteins for each hydrogel.
  • Example 2 Protein grafting (fibrinogen) on the previously activated surface of a polyacrylamide hydrogel.
  • Example 1c Same as Example 1c.
  • the illumination times were 7.5, 9 and 10 s.
  • each hydrogel prepared according to the above protocol was dehydrated under a vertical laminar flow hood (Aura) at 26 ° C for one hour.
  • a solution of the hetero-bifunctional sulfo-NHSLC-diazirine crosslinker (Sulfosuccinimidyl 6- (4,4'-azipentanamido) hexanoate, ThermoScientific Pierce, trade name: Sulfo-LC-SDA) was prepared in sterile deionized water at a temperature of concentration of 0.44 mg / ml. 800 ml of this solution were deposited on the gel using a pipette.
  • the gel was then illuminated by the ElecoUVP281 UV lamp for 5 min.
  • a fibrinogen solution coupled to an Alexa Fluor 488 fluorescent probe (F13191, Invitrogen) was prepared at a concentration of 8.75 ⁇ g / ml. 800 ⁇ l of this solution was deposited on the activated surface of the gel using a pipette (step b)).
  • the hydrogel + fibrinogen solution assembly was deposited on a hot plate at 37 ° C. under a laminar flow hood (convective flow of 0.5 m / s) until complete evaporation of the solution on the surface of the hydrogel (steps c) and d)).
  • the functionalized gel was kept hydrated in PBS + / + solution at 4 ° C and protected from light.
  • Table 2 Average fluorescence intensity on a surface of 375x375 pm 2 and variability of the surface density in proteins for each hydrogel.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets sur la surface d'un gel comprenant les étapes de : a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L, où le gel a un gradient de rigidité à l'échelle du micromètre inférieur à 10%, puis b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, lesdits nanoobjets ayant un diamètre moyen supérieur ou égal au diamètre moyen des pores du gel, puis c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu'à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps, sous réserve qu'au début de l'évaporation, la teneur en sels minéraux dans le solvant soit inférieure à 6 g/L, le gel susceptible d'être obtenu et ses utilisations.

Description

Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d’un gel polymérique
de rigidité uniforme
La présente invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d’un gel polymérique de rigidité uniforme, le gel susceptible d’être obtenu et ses applications.
Dans de nombreux domaines, en particulier en biologie, en pharmaceutique, ou en diagnostic, des dispositifs comprenant un substrat dont la surface comprend des nanoobjets (protéines, nanoparticules...) sont recherchés.
Il est relativement aisé de déposer des nanoobjets à la surface d’un substrat "dur" comme le verre ou le silicium. Toutefois, afin de renforcer les forces de liaison entre la surface et les nanoobjets et ainsi de prolonger la durée de vie du dispositif, on cherche à remplacer le verre ou le silicium par des substrats plus mous, comme des gels à base de matrice polymériques, tels que les hydrogels.
La densité d’un gel à base d’une matrice polymérique est directement liée à sa porosité. Plus un gel est poreux, moins il est rigide, et réciproquement.
Contrôler la densité surfacique de nanoobjets déposés à la surface de gels est un enjeu dans le domaine de la culture cellulaire, où l’on souhaite cultiver les cellules à la surface de substrats de rigidité physiologique (de l'ordre du kPa) tout en conservant le contrôle quantitatif de la chimie de surface. Ce besoin est particulièrement prégnant pour l’ingénierie des cellules souches et émerge dans le domaine du criblage pharmacologique. Les cellules adaptent leurs réponses biochimiques à la rigidité de leur environnement en sus de l’adapter à leur environnement chimique, il existe donc un besoin de contrôler de façon indépendante les propriétés de rigidité et chimiques des supports de culture cellulaire in vitro et des supports implantables.
Les procédés de dépôts de nanoobjets à la surface des gels existants dépendent de la structure chimique du gel. Plus précisément, trois techniques sont utilisées.
Selon une première technique, les monomères utilisés pour préparer le polymère de la matrice polymérique sont modifiés pour inclure le nanoobjet. Dans ce cas, un contrôle de la densité surfacique du polymère obtenu est possible, mais la densité surfacique de nanoobjets sur le gel obtenu est directement liée à la rigidité/à la porosité du gel.
Les deux autres techniques sont basées sur un dépôt puis greffage des nanoobjets à la surface du gel totalement ou partiellement solvaté : - une solution de nanoobjets est mise en présence du gel dont la surface a éventuellement été préalablement activée (par greffage d’un intermédiaire réactionnel et/ou par rayonnement) ; ou
- les nanoobjets sont modifiés pour les rendre réactifs avec la surface du gel puis ajoutés sous forme de solution à la surface du gel.
Dans ces deux cas, la densité surfacique de nanoobjets greffés est dépendante de la porosité/de la rigidité du gel dès que le procédé inclut une étape de séchage partiel, ce qui est généralement inévitable, par exemple lorsqu’on retire la solution de nanoobjets pour réaliser la réaction de greffage des nanoobjets. En effet, les gels sont des matériaux poreux, et de ce fait très sensibles à la déshydratation : les temps caractéristique de séchage sont généralement de l’ordre de quelques secondes (typiquement pour un gel de rigidité de l’ordre de 0,1 kPa) à quelques minutes (typiquement pour un gel de rigidité de l’ordre de 25 kPa) suivant la porosité/la rigidité du gel. En revanche, si le gel est maintenu totalement solvaté au cours du procédé, la densité surfacique de nanoobjets déposés est indépendante de la rigidité/porosité du gel. Toutefois, le rendement de dépôt des nanoobjets est très faible étant donné la faible probabilité que les nanoobjets s’approchent de la surface du gel et interagissent avec celle-ci, car ces deux techniques sont limitées par la diffusion des nanoobjets vers la surface. Ainsi, ces deux techniques ne permettent pas de contrôler facilement la densité surfacique en nanoobjets déposés.
Il existe donc un besoin de développer un procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d’un gel qui permettent de contrôler la densité surfacique en nanoobjets déposés, sans qu’elle ne dépende de la rigidité du gel.
A cet effet, selon un premier objet, l’invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets sur la surface d’un gel comprenant les étapes de :
a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L,
où le gel présente une variabilité de la rigidité à l’échelle du micromètre inférieure à 10%, puis
b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, lesdits nanoobjets ayant un diamètre moyen supérieur ou égal au diamètre moyen des pores du gel, puis
c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu’à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps, sous réserve qu’au début de l’évaporation, la teneur en sels minéraux dans le solvant soit inférieure à 6 g/L. Le procédé comprend une étape a) de fourniture d’un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L.
Le gel comprend une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant. La matrice polymérique est donc capable de retenir une proportion de solvant au sein de sa structure. Généralement, la teneur maximale en solvant au sein de la matrice polymérique du gel à 25°C (calculée comme le ratio entre le poids de solvant maximal par rapport à la somme du poids de solvant maximal et du poids de la matrice polymérique sèche) varie de 20 à 100%, de préférence de 38 à 100%. Quand on continue à ajouter du solvant au-delà de la teneur maximale, le solvant ajouté n’est plus incorporé au sein de la matrice polymérique.
Le polymère de la matrice polymérique du gel peut être homopolymérique (réseau tridimensionnel formé à partir d’un homopolymère), copolymérique (réseau tridimensionnel formé à partir d’un copolymère) ou multipolymérique (réseau tridimensionnel de polymères interpénétrant (« interpenetrating polymeric gel » (IPN) en anglais).
Généralement, la matrice polymérique comprend (voire est constituée de) un polymère choisi parmi :
- les polyacrylamides ;
- les polyéthylènes glycols, polypropylènes glycols et copolymères d’éthylène glycol ou de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ;
- les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou (méth)acrylates ;
- les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ;
- les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol);
- les polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ; et
les combinaisons de ceux-ci. Les matrices polymériques à base de polyacrylamides, et en particulier issus de la polymérisation de l'acrylamide et du N,N’-méthylènebisacrylamide, sont particulièrement préférées.
Par « composés (meth)acrylates », on entend des composés dérivés d’acrylate ou de méthacrylate, par exemple choisis parmi l’acide acrylique (AA), l’acide méthacrylique (MA), le diméthacrylate d’éthylène glycol (EGDMA), le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA), l’acrylate de sulfopropyle, où les acides peuvent être sous forme de sel, notamment de sodium ou de potassium.
Le solvant peut être tout solvant dans lequel la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C est inférieure à 1 g/L et dans lequel elle est susceptible de gonfler.
Par exemple, le solvant peut être une solution aqueuse ou un solvant organique choisi parmi les alcools, les alcanes (pentane, hexane par exemple), les amines (triéthylamine, diisopropylamine par exemple), les cétones (l’acétone par exemple) et les solvants aromatiques (toluène, xylène par exemple).
Dans un mode de réalisation, la matrice polymérique comprend (voire est constituée de) polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS), et le solvant est choisi parmi le pentane, la triéthylamine, la diisopropylamine ou le xylène.
Le solvant le plus usuel est une solution aqueuse, et est de préférence de l’eau, éventuellement déionisée. Le gel est alors un hydrogel. Des exemples d’hydrogel sont fourmis dans la revue de Enas M. Ahmed (Journal of Advanced Research, 2015, 6, 105- 121 ). La matrice polymérique comprend alors généralement (voire est constituée de) un polymère choisi parmi :
- les polyacrylamides, par exemple issues de la polymérisation de l'acrylamide et du N,N’-méthylènebisacrylamide ;
- les polyéthylène glycols, polypropylène glycols et copolymères d’éthylène glycol ou de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ;
- les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou (méth)acrylates ;
- les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ; - les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol) ; et
les combinaisons de ceux-ci.
La rigidité du gel fourni à l’étape a) est uniforme. Dans le gel fourni à l’étape a), l’écart type s des valeurs de rigidité Ri (où i varie de 1 à n) est de préférence inférieure à 20%, typiquement inférieure à 15%, en particulier inférieure à 10%, notamment inférieur à 5%, de préférence inférieur à 1 %, les valeurs de rigidité Ri étant mesurées par microscopie à force atomique sur n points répartis sur toute la surface du gel fourni à l’étape a), n étant supérieur à 50, typiquement supérieur à 100, notamment supérieur à 1 000, de préférence supérieur à 10 000,
l’écart type s étant tel que défini à la formule (I) :
Figure imgf000006_0001
où « mean » est la moyenne arithmétique des valeurs de rigidité Ri et est telle que définie à la formule (II) :
Figure imgf000006_0002
De préférence, lesdites valeurs de rigidité Ri suivent à ±10%, notamment à ± 5%, de préférence à ±1%, une distribution symétrique, sous réserve que la moyenne « mean » et la médiane « médian » de ladite distribution sont telles que l’écart e défini à la formule (III) :
„ me an-median , , , ,,
e = 2 - mean+median (III)
est inférieur à 10%, notamment inférieur à 5%, de préférence inférieur à 1%. L’écart type s des valeurs de rigidité est alors telle que définie ci-dessus, ou non.
La médiane est la valeur de rigidité « médian » qui permet de partager la série de n valeurs de rigidité Ri ordonnée en deux parties de même nombre d'éléments. L'ensemble des valeurs de rigidité Ri est alors coupé en deux parties ayant le même nombre d’éléments : avec d'un côté une moitié des valeurs de rigidité Ri, qui sont toutes inférieures ou égales à « médian » et de l'autre côté l'autre moitié des valeurs de rigidité Ri, qui sont toutes supérieures ou égales à « médian ».
Plus la valeur e est faible, plus les valeurs de rigidité Ri suivent une distribution symétrique. Une distribution de rigidités parfaitement symétrique a un écart e de 0.
De préférence, lesdites valeurs de rigidité Ri suivent à ±10%, notamment à ± 5%, de préférence à ±1%, une distribution normale, sous réserve que la moyenne « mean » et la médiane « médian » de ladite distribution sont telles que l’écart e est inférieur à 10%, notamment inférieur à 5%, de préférence inférieur à 1%. De préférence, les n points sont répartis aléatoirement sur toute la surface du gel.
De préférence, la variabilité de sa rigidité à l’échelle du micromètre est inférieure à 10%, de préférence inférieure à 5%. La rigidité est mesurée à la surface du gel sur laquelle seront déposés les nanoobjets lors de l’étape b). Autrement dit, la différence de rigidité de deux points du gel distants de 1 pm n’excède de préférence pas 10%.
De préférence, la variabilité de la rigidité du gel à l’échelle du centimètre est inférieure à 20%, notamment inférieure à 15% de préférence inférieure à 10%.
De manière particulièrement préférée, la variabilité de la rigidité du gel est inférieure à 20%, notamment inférieure à 15% de préférence inférieure à 10%. Autrement dit, la différence de rigidité de deux points (où qu’ils soient à la surface du gel sur laquelle seront déposés les nanoobjets lors de l’étape b)) n’excède pas 20%, notamment 15%, de préférence 10%.
Le gel a typiquement une surface supérieure ou égale à 1 pm2, de préférence supérieure ou égale à 10 pm2. Des surfaces inférieures à 1 pm2 permettent plus difficilement de mesurer une variabilité de la rigidité. Des surfaces inférieures à 10 pm2 permettent plus difficilement de mesurer une variabilité de la densité surfacique en nanoobjets lorsque la taille de ceux-ci est de 500 nm à 1000 nm. De plus, la surface du gel est généralement inférieure ou égale à 1000 mm2. Pour que la distribution surfacique des nanoobjets soit uniforme, il est en effet préférable de limiter l’impact des forces capillaires à l’interface entre le gel, la goutte de solvant entrain de s’évaporer et le gaz utilisé pour évaporer. Ces forces capillaires tendent en effet à tirer les nanoobjets vers le centre de la goutte et induisent un gradient de concentration des bords vers le centre. Cet effet peut être observé lorsque la surface du gel excède 1000 mm2.
Plus la surface du gel est importante, plus il est facile de mesurer la rigidité sur un nombre de points important. Généralement, plus la surface du gel est faible, plus l’écart e est faible.
Lorsque la surface du gel est inférieure à 80 mm2 (si la surface est circulaire, son diamètre est alors inférieur à 10 mm), la distribution est mesurée sur au moins 50 points, de préférence sur au moins 500 points et l’écart e est de préférence inférieur à 5%, voire même inférieure à 1%.
Lorsque la surface du gel est comprise de 80 mm2 à 1000 mm2 (si la surface est circulaire, son diamètre est alors compris de 10 mm à 35 mm), la distribution est de préférence mesurée sur au moins 100 points, notamment au moins 1000 points, idéalement au moins 10 000 points, et l’écart e est de préférence inférieur à 10%, voire même inférieure à 5%. La rigidité du gel est généralement de 0,01 kPa à 500 kPa, notamment de 0,05 kPa à 100 kPa, de préférence de 0,1 kPa à 50 kPa.
La rigidité locale et donc la variabilité de rigidité peuvent être déterminées par microscopie à force atomique (AFM), par exemple en suivant le protocole décrit pages 29 et 30 de la demande WO 2013/079231.
Le procédé comprend une étape b) de dépôt de nanoobjets à la surface du gel.
Les nanoobjets sont de préférence choisis parmi :
- les protéines, les peptides et leurs mélanges,
- les polysaccharides, et
les nanoparticules, notamment les nanoparticules de métal, de semi-conducteur ou de polymère.
Les nanoobjets peuvent être des bactéries.
Les nanoobjets ne sont généralement pas des cellules. Dans un mode de réalisation, les nanoobjets ne sont pas des organismes vivants.
Le métal est notamment choisi parmi les métaux alcalins, les métaux alcalino- terreux, les lanthanides, les actinides, les métaux de transition et les métaux dits « pauvres », et est de préférence choisi parmi l’or, l’argent et l’indium.
Le semi-conducteur est par exemple de tellurure de cadmium (CdTe).
Les nanoparticules de polymère peuvent par exemple être en polystyrène ou en latex.
Les protéines, peptides, polysaccharides et mélanges de ceux-ci sont les nanoobjets préférés, notamment des protéines et/ou peptides induisant une adhésion cellulaire via les intégrines, une telle protéine pouvant être de la fibronectine, du fibrinogène, du collagène, de la laminine, de la vitronectine ou des peptides du type RGD. Les protéines et/ou les peptides et/ou les polysaccharides peuvent avoir été modifiés pour qu’ils soient porteurs d’une fonction susceptible de réagir avec la matrice polymérique du gel.
Le préfixe « nano » signifie que le diamètre moyen du nanoobjet est compris de 1 à 1000 nm, notamment de 2 à 500 nm, par exemple de 2 à 250 nm. Les nanoparticules d’or ont typiquement des diamètres moyens de 5 à 400 nm. Les nanoparticules d’argent ou d’indium ont typiquement des diamètres moyens de 2 à 10 nm.
Les nanoobjets déposés à l’étape b) ont un diamètre moyen supérieur ou égal au diamètre moyen des pores du gel (diamètre moyen des pores lorsque les nanoobjets sont déposés, c’est-à-dire dans les conditions de l’étape b)). Ceci permet que les nanoobjets restent à la surface du gel et ne s’enfoncent pas ou peu dans la matrice polymérique. En effet, si les nanoobjets peuvent pénétrer au sein du gel en proportion significative, alors la densité surfacique des nanoobjets déposés à la surface du gel désolvaté est d’autant plus importante que les pores sont petits. Dans ce cas, la densité surfacique des nanoobjets n’est pas indépendante de la rigidité/porosité du gel.
De préférence, les nanoobjets déposés à l’étape b) ont un diamètre moyen au moins deux fois supérieur, notamment au moins trois fois supérieur, en particulier au moins quatre fois supérieur, de préférence au moins cinq fois supérieur, par exemple au moins dix fois supérieur au diamètre moyen des pores du gel.
Le diamètre moyen des pores du gel peut être mesuré par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Il est typiquement de l’ordre de 2 à 4 angstrôms.
Le diamètre moyen des protéines ou peptides est typiquement mesuré par électrophorèse par gel. Le diamètre moyen des polysaccharides est généralement mesuré par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC), couplée à la diffusion de lumière (ce qui permet de déterminer le rayon hydrodynamique). Le diamètre moyen des nanoparticules est typiquement mesuré par microscopie électronique à transmission ou à balayage (« transmission électron microscope » (TEM) et « scanning électron microscope » (SEM) en anglais).
Généralement, lors de l’étape b), les nanoobjets sont déposés sous forme d’un mélange comprenant les nanoobjets et un solvant. Le solvant de ce mélange peut être identique ou différent du solvant du gel. De préférence, le solvant du mélange est soluble dans le solvant du gel (soluble dans les conditions de l’étape b)). De manière préférée, le solvant du mélange est identique au solvant du gel.
Le mélange peut être colloïdal (les nanoobjets étant en suspension).
Le procédé peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape b1 ) consistant à laisser en contact les nanoobjets à la surface du gel, généralement pendant une durée de 1 min à 24 heures, notamment 1 min à 12 heures, par exemple 5 min à 1 heure. Lorsque les nanoobjets sont des protéines, cette étape correspond à une incubation.
Le procédé est de préférence exempt, entre les étapes b) et c) :
- d’étape consistant à éliminer une partie des nanoobjets de la surface du gel, par exemple réalisée en aspirant la solution surnageante au-dessus de la surface du gel, et/ou
- d’étape de rinçage.
En effet, il est plus difficile de contrôler la quantité de nanoobjets restants, et donc la densité surfacique en nanoobjets du gel obtenu, lorsque de telles étapes sont effectuées. Le procédé comprend une étape c) d’évaporation du solvant du gel au moins jusqu’à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps.
L’évaporation du solvant d’un gel de densité uniforme comprend deux régimes qui sont illustrés sur les figures 1 et 2.
Pendant la première période d’évaporation (« A » sur les figures 1 et 2), du solvant est éliminé en continu de la surface du gel par des forces capillaires et la teneur en solvant diminue à taux constant, ce qui s’explique par le fait que la surface du gel est suffisamment mouillée par le solvant et se comporte comme la surface d’un liquide. Son taux d’évaporation est égal à celui d’une surface liquide, qui dépend uniquement du gaz utilisé pour le séchage et du coefficient de transfert de la couche limite de la surface du gel.
Lorsque l’évaporation est poursuivie, le taux d’évaporation atteint un taux d’évaporation critique à un temps critique d’évaporation Tc qui marque la transition entre les première et deuxième périodes d’évaporation.
Pendant la deuxième période d’évaporation (« B » sur les figure 1 et 2), les forces de diffusion deviennent prédominantes par rapport aux forces de capillarité et l’élimination du solvant hors du gel est principalement contrôlée par la diffusion du solvant dans les pores du gel vers sa surface. Le taux d’évaporation du solvant n’est pas constant dans le temps. Il diminue jusqu’à atteindre un taux d’évaporation d’équilibre à un temps d’équilibre Teq au-delà duquel le gel ne peut plus être séché, c’est-à-dire que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps.
Dans l’étape c) du procédé selon l’invention, l’évaporation du solvant est effectuée au moins jusqu’à ce temps d’équilibre Teq, qui est le temps minimal à partir duquel la teneur en solvant ne varie plus avec le temps.
La teneur en solvant au-delà du temps d’équilibre Teq peut être non nulle (figure 1 ) ou nulle (figure 2), et ce en fonction du gel et du solvant utilisé. Par exemple, pour un hydrogel (pour lequel le solvant est une solution aqueuse), la teneur en solvant au-delà du temps d’équilibre Teq d’une matrice polymérique hygroscopique sera non nulle, alors que la teneur en solvant au-delà du temps d’équilibre Teq d’une matrice polymérique non hygroscopique sera nulle.
Le temps d’équilibre Teq est une caractéristique de chaque gel. Il dépend de la nature du solvant et de la nature de la matrice polymérique (à savoir de la nature du polymère, mais aussi de sa porosité et donc de sa rigidité) et des conditions de l’étape c).
Lorsque le solvant est une solution aqueuse (le gel étant alors un hydrogel), l’évaporation du solvant est une déshydratation. Généralement, lors de l’étape c) :
- l’évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec un gaz qui est de l’air ou un gaz inerte (tel que l’azote ou l’argon), de préférence de l’air, et/ou
- la pression est de 0,1 à 1 bar, de préférence à 1 bar, et/ou
- la température du gaz mis en contact avec le gel est de 4 à 90°C, notamment de 10 à 70°C, de préférence de 15 à 40°C, en particulier à température ambiante (20°C) ou à 37°C, et/ou
- la vitesse du gaz mis en contact est compris de 0 à 4 m/s, notamment de 0 à 1 m/s, de préférence de l’ordre de 0,45m/s à 0,50m/s (par exemple lorsque le gel est placé sous une hotte à flux laminaire),
ces conditions étant indépendamment constantes dans le temps ou variables dans le temps au cours de l’étape c).
Bien sûr, plus la température est élevée et/ou plus la vitesse du gaz mis en contact est élevée, et plus l’évaporation du solvant, et donc l’étape c), est rapide. Lorsque les nanoobjets ont un diamètre moyen au moins dix fois supérieur à celui du diamètre moyen des pores du gel, l’accélération de l’évaporation n’impacte pas la distribution des nanoobjets à la surface du gel, car ceux-ci ne pénètrent pas au sein du gel. Toutefois, lorsque les nanoobjets ont un diamètre moyen du même ordre de grandeur que celui du diamètre moyen des pores du gel, l’accélération de l’évaporation permet de limiter la pénétration des nanoobjets au sein du gel. Des températures plus élevées et/ou une vitesse du gaz mis en contact plus élevée(s) sont alors à privilégier. Les températures et vitesse du gaz ne doivent toutefois pas être trop élevées afin de ne pas dégrader le gel et/ou les nanoobjets (par exemple, certaines protéines se dégradent au-delà de certaines températures, ou un gaz projeté à trop grande vitesse peut endommager la surface du gel et/ou conduire à sa fracturation/fissuration).
De préférence, au moins jusqu’au temps d’équilibre Teq, voire même pendant la durée de l’étape c), les conditions d’évaporation sont constantes dans le temps, c’est-à- dire que :
- lorsque l’évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec un gaz :
- la nature du gaz reste identique dans le temps,
- le débit de gaz est constant à ±10%, et
- la température du gaz est constante à ± 2°C, et
- la (dé)pression est constante à ±10% dans le temps (où (dé)pression signifie pression (P > 1 bar)) ou dépression (P < 1 bar), pour une évaporation sous vide par exemple). Généralement, afin de permettre une évaporation du solvant lors de l’étape c), au début de l’étape c) (lorsque l’évaporation est débutée), le gel a une teneur en solvant xa supérieure à la teneur en solvant xeq du gel au temps d’équilibre Teq. En pratique, cette condition est presque toujours vérifiée lorsque les nanoobjets sont déposés sous forme d’un mélange comprenant les nanoobjets et un solvant.
Lors de l’étape c), au début de l’évaporation, la teneur en sels minéraux dans le solvant est inférieure à 6 g/L, notamment inférieure à 5 g/L, typiquement inférieure à 4 g/L, par exemple inférieure à 3 g/L, de préférence inférieure à 2 g/L, une teneur inférieure à 1 ,5 g/L, voire inférieure à 1 ,0 g/L, voire même inférieure à 0,5 g/L, étant particulièrement préférée. De préférence, lors de l’étape c), le solvant est exempt de sels minéraux.
Des sels de chlorure (NaCI, KOI, CaCI2 et/ou MgCI2), des sels de phosphate (Na2HP04 et/ou K2HP04), des sels de carbonate (NaHC03) sont des exemples de sels minéraux. Ceux-ci sont utilisés de façon usuelle dans des solutions aqueuses physiologiques et/ou tampon utilisées à titre de solvant dans des hydrogels et pour les protéines.
Généralement, l’utilisateur connaît la teneur en sels minéraux au début de l’évaporation, car il connaît la teneur en sels minéraux dans le gel fourni à l’étape a) et la teneur en sels minéraux éventuellement ajoutés lors de l’étape b) (ces sels minéraux pouvant notamment provenir du solvant du mélange comprenant les nanoobjets et un solvant déposé lors de l’étape b)). Si la teneur en sels minéraux est inconnue, elle peut être déterminée par chromatographie ionique.
L’invention repose sur la découverte que l’évaporation totale du solvant du gel (c’est-à-dire au moins jusqu’à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps) permet de contrôler facilement la distribution surfacique des nanoobjets et donc leur densité surfacique, et ce sans dégrader ni le gel, ni les nanoobjets. Comme le solvant est évaporé, il est facile de connaître la quantité de nanoobjets déposés à la surface du gel, puisque cette quantité correspond à la quantité de nanoobjets déposés lors de l’étape b) (sous réserve qu’un partie des nanoobjets n’ait pas été éliminée entre les étapes b) et c) (par aspiration de la solution ou par rinçage)). La densité surfacique en nanoobjets déposés est donc connue avec une grande précision. Lors de l’étape c), les nanoobjets sont déposés sans limite due à la diffusion des nanoobjets vers la surface du gel.
Il y avait un préjugé technique à surmonter pour parvenir au procédé selon l’invention. En effet, l’homme du métier évite d’évaporer totalement le solvant du gel, car il s’attend à le dégrader, notamment par fissuration/fracturation et dépôt de cristaux. Or, ces dégradations ne sont observées que lorsque la teneur en sels minéraux excède celle mentionnée ci-dessus. Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs observent que les sels minéraux, présents à des teneurs supérieures cristallisent lors de l’évaporation du solvant, ce qui conduit à la fissuration du gel, notamment lors de son regonflement en vue de son utilisation sous forme solvatée, et de manière générale, conduit à la présence de nombreux dépôts et cristaux inamovibles sur la surface. De préférence, lors de l’étape c), le solvant est exempt de composé susceptible de cristalliser dans les conditions de l’étape c).
Des préjugés techniques supplémentaires existaient lorsque les nanoobjets sont des protéines. En effet, l’homme du métier évite généralement d’évaporer totalement le solvant du gel, car il s’attend à dégrader les protéines si elles se retrouvent à sec. En effet, la plupart des fournisseurs de protéines recommandent d’éviter de sécher une protéine qui a été mise en solution afin d’éviter de la dénaturer. Or, de manière surprenante, une telle dénaturation n’est généralement pas observée dans le procédé selon l’invention. De plus, l’homme du métier est habitué à utiliser des protéines dans des milieux physiologiques, qui sont des solutions aqueuses, généralement tamponnées, et dont la teneur en sels minéraux excède celle mentionnée ci-dessus. Utiliser un solvant donc le teneur en sel est telle que définie à l’étape c) est très inhabituel pour l’homme du métier.
Avantageusement, la densité surfacique en nanoobjets sur le gel obtenu à la fin de l’étape c) est indépendante de la rigidité du gel utilisé. La rigidité du gel intervient uniquement sur la cinétique de l’évaporation (sur la durée pour atteindre le temps d’équilibre Teq).
Avantageusement, la densité surfacique en nanoobjets du gel obtenu à l’étape c) est uniforme.
La méthode pour mesurer la densité surfacique en nanoobjets est variable selon la nature des nanoobjets. Par exemple, lorsque les nanoobjets sont des protéines, on peut utiliser un anticorps primaire susceptible de reconnaître ladite protéine, puis un anticorps secondaire susceptible de reconnaître ledit anticorps primaire, cet anticorps secondaire étant lié à un fluorophore, puis analyser la densité surfacique par microscopie confocale de fluorescence. Lorsque les nanoobjets sont des nanoparticules, la densité surfacique peut être analysée par microscopie électronique à balayage.
Le procédé peut comprendre, avant l’étape a), les étapes consistant à :
aO) fournir un gel ayant une teneur en solvant initiale t, supérieure à la teneur en solvant a, puis
aO’) évaporer le solvant du gel jusqu’à la teneur en solvant initiale xa, ce par quoi un gel tel que défini à l’étape a) est obtenu. L’évaporation de l’étape a0’) est donc réalisée avant le dépôt des nanoobjets. Cette évaporation préalable permet de diminuer l’épaisseur de la couche de solvant à la surface du gel et ainsi de favoriser la migration par convection des nanoobjets vers la surface du gel lors de l’étape b) qui suit.
Le procédé peut comprendre, avant l’étape b), une étape bO) consistant à greffer à la surface du gel des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec les nanoobjets qui seront déposés à l’étape b).
Les nanoobjets déposés lors de l’étape b) peuvent avoir été modifiés avant l’étape b) pour qu’ils soient porteurs d’une fonction susceptible de réagir avec la matrice polymérique du gel. Le procédé peut comprendre, avant l’étape b), une étape bO’) consistant à greffer sur les nanoobjets (en particulier les protéines et/ou les peptides et/ou les polysaccharides) au moins un groupe fonctionnel susceptibles de réagir avec le gel.
Dans les étapes bO) et bO’), les groupes fonctionnels sont de préférence susceptibles de réagir pour former une liaison covalente.
Lorsque les nanoobjets sont des protéines et/ou des peptides et/ou des polysaccharides, le procédé peut comprendre, une étape d) de greffage covalent des protéines et/ou peptides et/ou polysaccharides sur le gel, ce qui permet de les immobiliser définitivement et d’éviter que les peptides et/ou protéines et/ou polysaccharides ne se déplacent à nouveau à la surface du gel, lors d’un rinçage du gel après l’étape c) par exemple. Cette étape d) peut être simultanée à l’étape c) (pendant l’évaporation), ou être réalisée après l’étape c) (sur le gel désolvaté). De préférence, lorsque l’étape d) est mise en oeuvre, le procédé ne comprend pas d’étape de rinçage entre les étapes a) et d).
Le procédé peut comprendre, après l’étape c), une étape e) de rinçage avec un solvant. Ce solvant peut être identique ou différent du solvant du gel. L’étape de rinçage peut être répétée.
Le procédé peut comprendre, après l’étape c), ou, si elle est présente, après l’étape e), une étape f) de récupération du gel. Le gel est sous forme désolvaté (teneur en solvant au-delà du temps d’équilibre du gel) s’il est récupéré à la fin de l’étape c). Si une étape e) de rinçage a été effectuée après l’étape c) et avant l’étape f), le gel peut être sous forme solvatée (le solvant étant le solvant de la solution de rinçage). Le gel sous forme solvatée ou désolvatée peut avantageusement être conservé plusieurs mois, généralement au moins un mois, notamment au moins trois mois, voire au moins neuf mois à température ambiante (20°C), généralement sans qu’aucune dégradation ni du gel ni des nanoobjets (y compris aucune dénaturation des protéines) ne soit observée. Le procédé selon l’invention est facile à mettre en oeuvre. Il ne nécessite pas d’équipement complexe. Il est peu coûteux.
Selon un deuxième objet, l’invention concerne le gel susceptible d’être obtenu par le procédé défini ci-dessus, la surface du gel étant au moins partiellement revêtue de nanoobjets, où l’écart type s’ des quantités Qj (j variant de 1 à p) de nanoobjets par pm2 de surface est inférieure à 40%, typiquement inférieure à 30%, notamment inférieure à 20%, de préférence inférieure à 10%, les quantités Qj de nanoobjets étant mesurées par microscopie sur p pm2 de surface répartis sur toute la surface du gel, p étant supérieur à 10, notamment supérieur à 100, typiquement supérieur à 10000 (100 x 100), de préférence supérieur à 1 000 000 (1000 x 1000),
l’écart type s’ étant tel que défini à la formule (IV) :
Figure imgf000015_0001
où « mean’ » est la moyenne arithmétique des quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface et est telle que définie à la formule (V) :
Figure imgf000015_0002
De préférence, lesdites quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface suivent à ±10%, notamment à ± 5%, de préférence à ±1%, une distribution symétrique, sous réserve que la moyenne arithmétique « mean » et la médiane « médian » de ladite distribution sont telles que l’écart e’ tel que défini à la formule (VI) :
„ mearv-mediarv ,,,
e = 2 - (VI)
meanr+medianr
est inférieur à 25%, notamment inférieure à 20%, typiquement inférieure à 10%, de préférence inférieure à 5%. L’écart type s’ des quantités Qj (j variant de 1 à p) de nanoobjets par pm2 de surface est alors tel que défini ci-dessus, ou non.
La médiane est la quantité « médian’ » de nanoobjets par pm2 de surface qui permet de partager la série de p quantités de nanoobjets par pm2 de surface ordonnée en deux parties de même nombre d’éléments. L’ensemble des quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface est alors coupé en deux parties ayant le même nombre d’éléments : avec d’un côté une moitié des quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface, qui sont toutes inférieures ou égales à « médian’ » et de l’autre côté l’autre moitié des valeurs de quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface, qui sont toutes supérieures ou égales à « médian’ ».
Plus la valeur e’ est faible, plus les quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface suivent une distribution symétrique. Une distribution surfacique en nanoobjets parfaitement symétrique a un écart e’ de 0. De préférence, lesdites quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface suivent à ±10%, notamment à ± 5%, de préférence à ±1%, une distribution normale, sous réserve que la moyenne « mean’ » et la médiane « médian’ » de ladite distribution sont telles que l’écart e’ est inférieur à 25%, notamment inférieure à 20%, typiquement inférieure à 10%, de préférence inférieure à 5%.
De préférence, les p pm2 de surface sont répartis aléatoirement sur toute la surface du gel.
De préférence, la variabilité de la densité surfacique en nanoobjets à la surface du gel est inférieure à 60%, notamment inférieure à 50%, typiquement inférieure à 40%, de préférence inférieure à 30%.
Généralement, le gel, solvaté ou non solvaté, n’est pas fissuré, ce qui peut être caractérisé :
- optiquement, en microscopie à contraste de phase,
- par une mesure de la rigidité : en scannant une surface, on observe des courbes force/indentation qui ne sont pas élastiques au niveau des fractures (présence de cassures dans la courbe pour des indentations de faibles amplitudes).
- ou en microscopie électronique, si l’échantillon n’est pas transparent.
Ce gel a des applications très variables selon la nature des nanoobjets déposés en surface. Selon un troisième objet, l’invention concerne l’utilisation de ce gel pour la culture cellulaire, pour le criblage de principes actifs pharmaceutiques, comme capteur photonique (typiquement lorsque les nanoobjets sont des semiconducteurs) ou physico chimique, par exemple comme capteur de pH (typiquement lorsque les nanoobjets sont des particules d’or) ou de température (typiquement lorsque les nanoobjets sont des particules de CdTe), comme capteur pour la détection d’analyte, comme puce à protéines ou à peptides (typiquement lorsque les nanoobjets sont des protéines et/ou des peptides), comme puces à cellules ou comme puce de capture à biomolécules.
L’invention concerne également :
- une méthode de positionnement de cellules pour le criblage de principes actifs pharmaceutiques comprenant la mise en contact de principes actifs pharmaceutiques avec le gel selon l’invention dans lequel les nanoobjets sont des peptides, des protéines et/ou des polysaccharides,
- une méthode de capture de biomolécules comprenant la mise en contact d’un milieu comprenant des biomolécules à capturer avec le gel selon l’invention dans lequel les nanoobjets sont des peptides, des protéines et/ou des polysaccharides, - une méthode d’analyse comprenant la mise en contact d’un milieu comprenant un analyte à détecter avec le gel selon l’invention.
Les figures et exemples ci-dessous illustrent l’invention.
Les exemples ont été réalisés avec des hydrogels de polyacrylamide et des protéines (fibronectine ou fibrinogène) comme nanoobjets.
Les hydrogels de polyacrylamide utilisés avaient une variabilité de rigidité de 10 % à l’échelle centimétrique et de 5 % à l’échelle de 100 pm (une mesure de rigidité ayant été faite tous les 10pm).
Exemple 1 : Greffage de protéines (fibronectine) préalablement activées à la surface d’hydrogels de polyacrylamide.
A cet exemple, un réticulant photosensible a été greffé à la fibronectine utilisée comme protéine, pour la rendre réactive avec la surface de l’hydrogel sous exposition aux UV A. Le greffage de la fibronectine préalablement activée à la surface du gel est une réaction photoactivée. a) Silanisation des lamelles de verre basales
La lamelle basale sert d’ancrage basal à l’hydrogel.
La lamelle de verre basale, de diamètre 30 mm, a été nettoyée dans une solution de 0,1 mol/L de soude pendant 10 min. Elle a ensuite été rincée intensivement à l'eau, puis à l'éthanol, et séchée à l'air.
500 pL d'une solution de silane comprenant 56 pL de Bind-Silane (GE Healthcare), 484 pL d'acide acétique à 10%, et 14,46 mL d'éthanol ultra pur ont été déposés sur la lamelle et frottés avec un chiffon tricoté de polyester jusqu'à disparition des traces de solution. On a ainsi obtenu une lamelle de verre présentant des fonctions aldéhyde à sa surface, qui permettent le greffage covalent du gel de polyacrylamide.
b) Silanisation du masque transparent
L’hydrogel a été réticulé par UV, le masque transparent permettant de rendre plane la surface de l’hydrogel. Le masque consistait en une lame de microscope traitée par un silane fluoré pour limiter son accroche à l’hydrogel.
Une lame de microscopie optique (26 mm x 76 mm) a été lavée dans une solution d'eau oxygénée/acide sulfurique concentré en proportions 1 :2 pendant 10 minutes. Elle a ensuite été rendue hydrophobe par un traitement Optool (Daikin DSX) : immersion pendant 1 minute dans l'Optool dilué à 1/1000 dans du perfluorohexane. Puis la lame a été laissée 1 heure dans de la vapeur d'eau à 80°C. Enfin, elle a été immergée sous agitation lente pendant 10 minutes dans du perfluorohexane.
c) Préparation de trois hydrogels de polyacrylamide
L’hydrogel a été préparé selon le procédé décrit dans la demande WO 2013/079231 à partir d’une composition constituée de :
- 10% d’acrylamide (250 pL de solution initialement à 40%)
- 0,5% de N, N’— méthylènebisacrylamide (Bis) (250 pL de solution initialement à 2%)
- 0,2% de Irgacure 819 w/v (Ciba, photoinitiateur)
- 1% de propylamine (amorceur)
- eau déionisée (490 pL) L'Irgacure 819 a été pesé dans un flacon opaque aux UV. On y a ajouté la propylamine. L'ensemble a été chauffé à 50°C pendant 2 minutes. Apres chauffage, on a obtenu une solution homogène et transparente. L'eau, l'acrylamide, et le bis acrylamide ont été ajoutés rapidement. L'ensemble a été homogénéisé doucement à la pipette, pour limiter l'incorporation d'oxygène. 30 pL ont été déposés sur la lamelle de verre de 30 mm prétraitée selon le protocole ci-dessus. La lamelle a été placée sur un porte-échantillon possédant des cales d'épaisseur qui maintiennent un espacement de 40 pm entre la lamelle et le masque transparent, déposé sur les cales d'épaisseur. L'ensemble (masque, solution, lamelle) a été illuminé à l'aide d'une lampe fibrée Eleco UVP281 (2W/cm2) pendant 7,8 s, 15 s ou 20 s, afin d’obtenir trois hydrogels. Chaque ensemble a ensuite été plongé dans l'eau pour détacher le masque de l'hydrogel à l'aide d'une pince. Chaque hydrogel a été rincé 3 fois avec de l'eau déionisée et conservé dans l'eau déionisée.
d) Caractérisation de la rigidité des hydrogels
La variabilité de porosité de chaque hydrogel a été estimée par le biais de la mesure de la rigidité locale de l'hydrogel. La rigidité locale a été mesurée par un AFM en milieu aqueux (marque JPK). La résistance du gel à l'enfoncement de la pointe a été enregistrée. Quatre régions de 100 pm x 100 pm espacées de plusieurs millimètres ont été scannées. Les scans ont été réalisés avec un pas de 10 pm afin d’obtenir une série de courbes d’indentation. Chaque courbe a été traitée selon le protocole du fabricant avec un modèle d'indentation élastique.
Les rigidités obtenues sont dépendantes du temps d'illumination pour préparer le gel. Elles sont de l'ordre :
- de 0,6 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 1 1 ,7% pour un hydrogel préparé avec une durée d’illumination de 7,8 s,
- de 1 1 ,8 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 1 1 ,8% pour un hydrogel préparé avec une durée d’illumination de 15 s et
- de 24.7 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 9,2% pour un hydrogel préparé avec une durée d’illumination de 20 s.
e) Dépôt de fibronectine activée sur l'hydrogel puis greffage covalent
La fibronectine a préalablement été couplée au réticulant hétéro-bifonctionnel sulfo-NHS-LC-Diazirine (Sulfosuccinimidyl-6-(4,4'-azipentanamido)hexanoate,
ThermoScientific Pierce; nom commercial: sulfo-LC-SDA), avec un ratio molaire de 1/480. 5 mg de fibronectine (Roche) ont été dissous dans 2 mL d'eau déionisée ultrapure, à 37°C pendant 30 min. 1 ,2 mg de sulfo-LC-SDA ont été pesés à l'abri de la lumière et dissous dans la solution de fibronectine pendant 30 min à température ambiante. Cette opération a été répétée une seconde fois, conduisant au rapport molaire de 1/480. Ce protocole a permis de faire réagir la fonction sulfo-NHS du sulfo-LC-SDA avec les groupements amine de la fibronectine en limitant l'hydrolyse du sulfo-LC-SDA. Le composé formé est une molécule de fibronectine couplée à une fonction photosensible diazirine. Le compose formé a été dialysé à travers une membrane 6-8000 en chambre noire et à 4°C contre 2L de PBS+/+ 1x pendant 48h avec un changement du PBS au bout de 24h. Il a ensuite été aliquoté en petits volumes (25 et 50 pL) et conservé congelé à -20°C.
L'hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus a été déshydraté sous une hotte à flux laminaire vertical (Aura) à 26°C pendant une heure (étape a0’)).
Dans une pièce à éclairage sans UV, 800 pL de solution de fibronectine conjuguée selon le protocole ci-dessus a été préparée à une concentration de 3,5 pg/mL dans de l'eau stérile déionisée, et a été déposée à l'aide d'une pipette sur le gel (étape b)).
L’ensemble hydrogel + solution de fibronectine a été déposé sur une plaque chauffante à 37°C sous une hotte à flux laminaire (flux convectif de 0,5 m/s) jusqu’à évaporation complète de la solution à la surface de l’hydrogel (étape c)).
Le gel a immédiatement été illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5 min (étape d)). Il a ensuite été rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+ (étapes e)). Le gel fonctionnalisé a été conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C. f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées
La solution de PBS+/+ a été aspirée du gel, et remplacée par une solution de saturation consistant en une solution de PBS+/+ 1 x - Tween20 0,1% - BSA 2%, pendant 30 min sous agitation lente à température ambiante.
La solution de saturation a été aspirée à l'aide d'une pipette et remplacée par une solution de 3 pL d'anticorps polyclonal primaire anti fibronectine produit chez le lapin (Sigma-Aldrich, F3648) dilué dans 1 ,2 mL de PBS+/+ 1 x - Tween20 0,1 % - BSA 2%. L'anticorps a été incubé pendant 1 h sous agitation lente à température ambiante. Il a ensuite été révélé avec 1 , 2 mL d'une solution contenant 0,6 pL d'un anticorps secondaire couplé à l'Alexa 488 produit chez l'âne et dirigé contre le lapin (Molecular Probes, A21206), complété par une solution de PBS+/+ 1x - Tween20 0,1 % - BSA 2% pendant 1 h sous agitation lente à température ambiante et à l'abri de la lumière. La solution a ensuite retirée par aspiration et le gel a été rincé 3 fois par 1 ,2mL de PBS+/+ 1x - Tween20 0,1% - BSA 2%. Le gel a ensuite été conservé dans une solution de PBS+/+ 1 x à 4°C et à l'abri de la lumière. La caractérisation de la distribution des protéines greffées a été effectuée par microscopie confocale de fluorescence (microscope Leica SP). Une pile d'images a été acquise pour chaque hydrogel à la longueur d'onde 488 nm avec un espacement entre les images de 0,28 pm. Les différentes acquisitions ont été faites à gain constant et à niveau de l’intensité laser constante. Chaque pile d'images a ensuite été assemblée avec le logiciel ImageJ et des coupes ont été extraites. L’image d’intensité maximale a été calculée à partir de la pile d’image, permettant d’obtenir une projection bidimensionnelle de la surface fluorescente pour des fenêtres de 375 c 375 pm. Les marquages anticorps conduisent à l’obtention d’images pixellisées. Pour y remédier, la pixellisation a été limitée par un filtre gaussien de rayon 10 pixels. Puis la valeur moyenne de l’intensité a été calculée sur cette projection (Tableau 1 ).
Figure imgf000021_0001
Tableau 1 : Intensité de fluorescence moyenne sur une surface de 375x375 pm2 et variabilité de la densité surfacique en protéines pour chaque hydrogel.
L’absence de variation significative d’intensité entre chacun des trois hydrogels démontre que la quantité de protéines greffées est indépendante de la rigidité/porosité de l’hydrogel.
Exemple 2 : Greffage de protéines (fibrinogène) sur la surface préalablement activée d’un hydrogel de polyacrylamide.
Dans cet exemple, le même réticulant que celui de l’exemple 1 a été fixé en excès à la surface de l’hydrogel par réaction photochimique pour obtenir une surface activée, et les protéines (fibrinogène) ont réagi avec la surface activée de l’hydrogel par une réaction de couplage avec les fonctions amine primaire des protéines. a) Silanisation des lamelles de verre basales
Idem que Exemple 1 a.
b) Silanisation du masque transparent
Idem que Exemple 1 b.
c) Préparation de trois hydrogels
Idem que Exemple 1c. Les temps d’illumination étaient de 7,5, 9 et 10 s.
d) Caractérisation de la rigidité de chaque hydrogel
Idem que Exemple 1d. Les rigidités obtenues étaient respectivement de :
- 2,9 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 10,3%,
- 4,6 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 4,3% et
- 9,5 kPa avec un écart type s des valeurs de rigidité Ri de 9,5%.
e) Activation de la surface des hydrogels (étape b0))
Dans une pièce à éclairage sans UV, chaque hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus a été déshydraté sous une hotte à flux laminaire vertical (Aura) à 26°C pendant une heure. Une solution du réticulant hétéro-bifonctionnel sulfo-NHSLC-Diazirine (Sulfosuccinimidyl 6-(4,4‘-azipentanamido)hexanoate, ThermoScientific Pierce; nom commercial: sulfo-LC-SDA) a été préparée dans de l'eau stérile déionisée à une concentration de 0,44 mg/ml. 800 mI de cette solution ont été déposés sur le gel à l'aide d'une pipette. Cette solution a été laissée incuber pendant 60 min à 26°C sous la hotte à flux laminaire. La solution résiduelle a ensuite été aspirée délicatement à l'aide d'une pipette, et le gel a été à nouveau laissé sécher pendant 40 min, toujours sous la hotte a flux laminaire.
Le gel a alors été illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5 min.
f) Greffage covalent du fibrinogène
Une solution de fibrinogène couplé à une sonde fluorescente Alexa Fluor 488 (F13191 , Invitrogen) a été préparée à la concentration de 8,75 pg/ml. 800 pL de cette solution ont été déposés sur la surface activée du gel à l'aide d'une pipette (étape b)).
L’ensemble hydrogel + solution de fibrinogène a été déposé sur une plaque chauffante à 37°C sous une hotte à flux laminaire (flux convectif de 0,5 m/s) jusqu’à évaporation complète de la solution à la surface de l’hydrogel (étapes c) et d)).
Le gel a ensuite été rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+ (étapes e)).
Le gel fonctionnalisé a été conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4°C et à l'abri de la lumière.
g) Caractérisation de la distribution des protéines greffées Les protéines greffées ont été couplées à un fluorophore. La caractérisation de la distribution des protéines greffées a été effectuée par microscopie confocale de fluorescence (microscope Leica SP). Une pile d'images a été acquise pour chaque marche de rigidité à la longueur d'onde 488 nm avec un espacement entre les images de 0,28 pm. Les différentes acquisitions ont été faites à gain constant et à niveau de l'intensité laser constante. Chaque pile d'images a ensuite été assemblée avec le logiciel ImageJ. L'image d'intensité maximale a été calculée à partir de la pile d'image, permettant d'obtenir une projection bidimensionnelle de la surface fluorescente. Les marquages anticorps conduisent à l’obtention d’images pixellisées. Pour y remédier, la pixellisation a été limitée par un filtre gaussien de rayon 10 pixels. Puis la valeur moyenne de l'intensité a été calculée sur cette projection (Tableau 2).
Figure imgf000023_0001
Tableau 2 : Intensité de fluorescence moyenne sur une surface de 375x375 pm2 et variabilité de la densité surfacique en protéines pour chaque hydrogel.
L’absence de variation significative d’intensité entre chacun des trois hydrogels démontre que la quantité de protéines greffées est indépendante de la rigidité/porosité de l’hydrogel.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dépôt de nanoobjets sur la surface d’un gel comprenant les étapes de :
a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25°C dans le solvant est inférieure à 1 g/L,
où l’écart type s des valeurs de rigidité Ri est inférieure à 20%, les valeurs de rigidité Ri étant mesurées par microscopie à force atomique sur n points répartis sur toute la surface du gel fourni à l’étape a), n étant supérieur à 50,
l’écart type s étant tel que défini à la formule (I) :
Figure imgf000024_0001
où « mean » est la moyenne arithmétique des valeurs de rigidité Ri et est telle que définie à la formule (II) :
Figure imgf000024_0002
puis
b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, lesdits nanoobjets ayant un diamètre moyen supérieur ou égal au diamètre moyen des pores du gel, puis
c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu’à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps, sous réserve qu’au début de l’évaporation, la teneur en sels minéraux dans le solvant soit inférieure à 6 g/L.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel lesdites valeurs de rigidité suivent à ±10% une distribution symétrique, sous réserve que la moyenne arithmétique « mean » et la médiane « médian » de ladite distribution sont telles que l’écart e tel que défini à la formule (III) :
„ me an-median , , , ,,
e = 2 - mean+median (III)
est inférieur à 10%.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la matrice polymérique du gel comprend un polymère choisi parmi :
- les polyacrylamides ; - les polyéthylènes glycols, polypropylènes glycols et copolymères d’éthylène glycol ou de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates) ;
- les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou (méth)acrylates ;
- les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de composés (méth)acrylates ;
- les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-éthylène glycol) ;
- les polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) ; et
- les combinaisons de ceux-ci,
de préférence les polyacrylamides, par exemple issus de la polymérisation de l'acrylamide et du N,N’-méthylènebisacrylamide.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le solvant présent au sein de la matrice polymérique du gel est une solution aqueuse.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la solution aqueuse est de l’eau.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le solvant présent au sein de la matrice polymérique du gel est choisi parmi le pentane, la triéthylamine, la diisopropylamine et le xylène et la matrice polymérique comprend du poly(dimethylsiloxane).
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les nanoobjets sont choisis parmi :
- les protéines, peptides et mélanges de ceux-ci,
- les polysaccharides, et
- les nanoparticules, notamment les nanoparticules de métal, de semi-conducteur ou de polymère.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les nanoobjets sont choisis parmi les polysaccharides, les protéines, les peptides et les mélanges de ceux-ci, notamment les protéines et/ou peptides induisant une adhésion cellulaire via les intégrines, de préférence la fibronectine, le collagène, la laminine, la vitronectine ou les peptides du type RGD.
9. Procédé selon la revendication 8, comprenant, une étape d) de greffage covalent des protéines et/ou peptides et/ou polysaccharides sur le gel.
10. Gel susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, la surface du gel étant au moins partiellement revêtue de nanoobjets, où l’écart type s’ des quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface est inférieure à 40%, typiquement inférieure à 30%, notamment inférieure à 20%, de préférence inférieure à 10%, les quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface étant mesurées par microscopie sur p pm2 de surface répartis sur toute la surface du gel, p étant supérieur à 10, l’écart type s’ étant tel que défini à la formule (IV) :
Figure imgf000026_0001
où « mean’ » est la moyenne arithmétique des quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface et est telle que définie à la formule (V) :
Figure imgf000026_0002
1 1. Gel selon la revendication 10, dans lequel lesdites quantités Qj de nanoobjets par pm2 de surface suivent à ±10% une distribution symétrique, sous réserve que la moyenne arithmétique « mean » et la médiane « médian » de ladite distribution sont telles que l’écart e’ tel que défini à la formule (VI) :
„ mearv-mediarv ,,,
e = 2 - (VI)
meanr+medianr
est inférieur à 25%, notamment inférieure à 20%, typiquement inférieure à 10%, de préférence inférieure à 5%.
12. Utilisation du gel selon la revendication 10 ou 1 1 pour la culture cellulaire, pour le criblage de principes actifs pharmaceutiques ou comme capteur photonique ou physico-chimique, comme capteur pour la détection d’analyte, comme puce à protéines ou à peptides, comme puces à cellules ou comme puce de capture à biomolécules.
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