본 발명에서는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 열충격단백질 90(heat shock protein 90: Hsp90)의 에피토프 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물이 Th1 면역반응을 유도하며, 항종양 효과가 우수하다는 것을 확인하였다. In the present invention, the vaccine composition comprising an epitope polypeptide of heat shock protein 90 (Hsp90) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 induces a Th1 immune response, and confirmed that the antitumor effect is excellent. It was.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 열충격단백질 90의 에피토프인 폴리펩타이드에 관한 것이다.Accordingly, the present invention relates to a polypeptide which, in one aspect, is an epitope of heat shock protein 90 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
본 발명에서 용어, "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합부위의 아미노산 잔기 세트, 또는 T 세포에서는 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC)수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하를 의미한다.As used herein, the term "epitope" refers to a set of amino acid residues at the antigen-binding site recognized by a particular antibody, or to T cell receptor proteins and / or major histocompatibility complex (MHC) receptors in T cells. Residues. Epitopes are molecules that form a site recognized by an antibody, T cell receptor, or HLA molecule and refer to primary, secondary, and tertiary peptide structures, or charges.
발명의 일 실시예에서는, Hsp 90 풀 시퀀스를 5개의 알고리즘 프로그램을 이용하여 가장 흔한 MHC class II 대립유전자(allele)에 결합 친화도(binding affinity)가 좋을 것으로 예상되는 15-mer 펩타이드 시퀀스 12개를 선정한 후, MHC class II 대립형질에 결합친화성이 좋고, 항종양 효과가 우수한 2종류의 에피토프를 획득하였다.In one embodiment of the invention, the Hsp 90 full sequence was used to generate 12 15-mer peptide sequences that are expected to have good binding affinity to the most common MHC class II alleles using five algorithm programs. After selection, two kinds of epitopes having good binding affinity to MHC class II alleles and excellent antitumor effect were obtained.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a gene encoding the polypeptide.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the gene may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a recombinant vector comprising the gene and a recombinant microorganism into which the gene or the recombinant vector is introduced.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는 상기 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising: (a) culturing the recombinant microorganism to produce the polypeptide; And (b) relates to a method for producing the polypeptide comprising the step of obtaining the polypeptide.
본 발명에서, 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.In the present invention, the vector refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable control sequence to express the target protein in a suitable host cell. The regulatory sequence may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation, as desired It can be manufactured in various ways. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. After being transformed into a suitable host, the vector can replicate or function independently of the host genome and integrate into the genome itself.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and any vector known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, phagemids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, and Charon21A can be used as a phage vector or cosmid vector, and pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM system, pTZ system, pCL system and pET system can be used. The vector usable in the present invention is not particularly limited and known expression vectors can be used.
“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.The expression “expression control sequence” refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism. Such regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation. For example, suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites. Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter. As the promoter for high expression, an SRα promoter, a cytomegalovirus-derived promoter, or the like is preferably used.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 대장균에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.To express the DNA sequences of the invention, any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector. Examples of useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter region of phage lambda, fd Regulatory regions of the code protein, promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase such as Pho5, promoters of the yeast alpha-crossing system and prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof And other sequences of constitution and induction known to modulate the expression of the genes, and various combinations thereof. The T7 RNA polymerase promoter Φ 10 may be usefully used to express protein NSP in E. coli.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결(operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.Nucleic acids are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s). For example, DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide; A promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation. In general, “operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are in contact and present within the reading frame. However, enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.As used herein, the term “expression vector” generally refers to a fragment of DNA that is generally double stranded as a recombinant carrier into which fragments of heterologous DNA have been inserted. Here, heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells. Once expression vectors are within a host cell, they can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and their inserted (heterologous) DNA can be produced.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.As is well known in the art, to raise the expression level of a transfected gene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host. Preferably, the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.A wide variety of expression host / vector combinations can be used to express the genes encoding the polypeptides of the invention. Suitable expression vectors for eukaryotic hosts include, for example, expression control sequences derived from SV40, bovine papilloma virus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus. Expression vectors that can be used in bacterial hosts include a broader host range, such as bacterial plasmids, RP4, which can be exemplified in E. coli such as pBluescript, pGEX2T, pUC vectors, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof. Phage plasmids, phage DNA that can be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as λgt10 and λgt11, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentary single-stranded DNA phages. Useful expression vectors for yeast cells are 2μ plasmids and derivatives thereof. A useful vector for insect cells is pVL 941.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.Host cells transformed or transfected with the expression vectors described above constitute another aspect of the present invention. As used herein, the term “transformation” means that DNA is introduced into a host such that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration. The term “transfection” as used herein means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
본 발명의 숙주 세포는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 도입된 재조합 미생물이거나, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 미생물에 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 염색체에 통합되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 재조합 미생물을 의미한다. 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.The host cell of the present invention is a recombinant microorganism into which a vector having a polynucleotide encoding at least one target protein has been introduced, or a polynucleotide encoding at least one target protein is introduced into the microorganism so that the polynucleotide is integrated into a chromosome to express the target protein. Refers to a recombinant microorganism infected with a trait. It may be a prokaryotic or eukaryotic cell. In addition, a host having a high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA is usually used. Known eukaryotic and prokaryotic hosts such as Escherichia coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, yeast, insect cells such as Spodoptera pruperferda (SF9), animal cells such as CHO and mouse cells, COS 1, COS African green monkey cells such as 7, BSC 1, BSC 40 and BMT 10, and tissue cultured human cells are examples of host cells that can be used. In the case of using COS cells, since SV40 large T antigen is expressed in COS cells, the plasmid having the origin of replication of SV40 is present as a large number of copies of the episome in the cells. And expression can be expected. The introduced DNA sequence may be obtained from the same species as the host cell, may be of a different species than the host cell, or it may be a hybrid DNA sequence comprising any heterologous or homologous DNA.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.Of course, it should be understood that not all vectors and expression control sequences function equally in expressing the DNA sequences of the present invention. Likewise not all hosts function equally for the same expression system. However, those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered. In selecting expression control sequences, several factors must be considered. For example, the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures. Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the secretory properties, the ability to accurately fold the protein, the culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host. It should be selected in consideration of factors such as the ease of purification. Within the scope of these variables, one skilled in the art can select a variety of vector / expression control sequence / host combinations capable of expressing the DNA sequences of the invention in fermentation or large scale animal culture. As a screening method when cloning the cDNA of the NSP protein by expression cloning, a binding method (binding method), a panning method (panning method), a film emulsion method (film emulsion method) and the like can be applied.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 비바이러스 전달 방법은 전지천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TransfectamTM 및 LipofectinTM이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며(WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다(Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).In the present invention, as a method of inserting the gene on the chromosome of the host cell, a conventionally known genetic manipulation method may be used, and the non-viral delivery method may be cell perforation, lipofection, microinjection, ballistic method, virosome, liposome. , Immunoliposomes, polyvalent cations or lipid: nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virons, and chemical promoted DNA influx. Sonoporation, for example methods using the Sonitron 2000 system (Rich-Mar), can also be used for the delivery of nucleic acids. Other representative nucleic acid delivery systems are Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland). And BTX Molesular Syetem (Holliston, Mass.). Lipofection methods are specified in US Pat. No. 5,049,386, US Pat. No. 4,946,787 and US Pat. No. 4,897,355 and lipofection reagents are commercially available, for example Transfectam ™ and Lipofectin ™. Suitable cations or neutral lipids for effective receptor-recognition lipofection of polynucleotides include lipids from Felgner (WO91 / 17424 and WO91 / 16024) and can be delivered to cells via in vitro introduction and to target tissues via in vivo introduction. have. Methods of preparing lipid: nucleic acid complexes, including target liposomes, such as immunolipid complexes, are well known in the art (Crystal, Science., 270: 404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2: 291). 297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5: 382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5: 647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2: 710- 722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52: 4817-4820, 1992; US Patent 4,186,183; US Patent 4,217,344; US Patent 4,235,871; US Patent 4,261,975; US Patent 4,485,054 US Patent 4,501,728 US Patent 4,774,085 US Patent 4,837,028 US Patent 4,946,787.
레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 잔달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그들의 조합 바이러스를 포함한다(Buchscher et al., J. Virol., 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol., 66:1635-1640 1992; Sommerfelt et al., Virol., 176:58-59, 1990; Wilson et al., J. Virol., 63:2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol., 65:2220-2224, 1991; PCT/US94/05700). The affinity of retroviruses can be altered by integrating with outer envelope proteins, thereby expanding the type of target cell. Lentiviral vectors are retroviral vectors that generate high viral titers by transducing or infecting non-dividing cells. The target tissue determines the retroviral gene persistence system. Retroviral vectors contain cis acting long terminal repeats that can pack 6-10 kb outer sequences. Minimal cis acting LTRs sufficient for replication and packaging of the vector can be used to integrate the therapeutic gene into target cells for permanent transgene expression. Widely used retroviral vectors include murine leukemia virus (MuLV), gibbon leukemia virus (GaLV), monkey immunodeficiency virus (SIV), human immunodeficiency virus (HIV), and combination viruses thereof (Buchscher et al. , J. Virol., 66: 2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol., 66: 1635-1640 1992; Sommerfelt et al., Virol., 176: 58-59, 1990; Wilson et al. , J. Virol., 63: 2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol., 65: 2220-2224, 1991; PCT / US94 / 05700.
수크로오스 포스포릴라아제 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에는 아데노바이러스 기반 시스템을 더욱 많이 이용하며, 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포들에서 고효율로 형질도입을 일으키지만 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터를 이용하면 높은 역가와 높은 수준의 발현을 얻을 수 있고, 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 또한 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 표적 핵산을 가진 세포로 형질도입하는데 이용되는데, 예를 들면 생체 외 상에서 핵산과 펩티드의 생산 및 생체 내 및 생체 외 상에서 유전자 치료에 이용되며(West et al., Virology., 160:38-47, 1987; 미국특허 제4,797,368호; WO93/24641; Kotin, HumanGene Therapy., 5:793-801, 1994; Muzyczka,J. Clin. Invest., 94:1351, 1994), 재조합 AAV 벡터의 구성은 이미 알려져 있다(미국특허 제 5,173,414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251-3260, 1985; Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol., 4:20722081, 1984; Hermonat & Muzyczka,PNAS., 81:6466-6470, 1984; Samulski et al., J Virol., 63:038223828, 1989). 임상 실험에서는 적어도 6개의 바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 방법이 이용되고 있는데 형질도입제를 생성하는 도움 세포 라인에 유전자를 삽입함으로써 결함이 있는 벡터를 보완하는 접근법이다. pLASN과 MFG-S는 임상 실험에서 사용되고 있는 레트로바이러스의 예이고(Dunbar et al., Blood., 85:3048-305, 1995; Kohn et al., Nat. Med., 1:1017-102, 1995; Malech et al., PNAS., 94:(22)12133-12138, 1997), PA317/pLASN는 유전자 치료에 사용된 최초의 치료 벡터로(Blaese et al., Science., 270:475-480, 1995) MFG-S 포장 벡터의 형질도입 효율은 50% 또는 그 이상을 보였다(Ellem et al., Immunol Immunother., 44(1):10-20, 1997; Dranoff et al., Hum.Gene Ther., 1:111-2, 1997).Transient expression of sucrose phosphorylase proteins is more common with adenovirus-based systems, and adenovirus-based vectors cause high efficiency transduction in many cells but do not require cell division. The vector allows for high titers and high levels of expression and can be produced in large quantities in a simple system. Adeno accessory virus (AAV) vectors are also used to transduce into cells with target nucleic acids, for example for the production of nucleic acids and peptides in vitro and for gene therapy in vivo and in vitro (West et al., Virology., 160: 38-47, 1987; US Pat. No. 4,797,368; WO93 / 24641; Kotin, Human Gene Therapy., 5: 793-801, 1994; Muzyczka, J. Clin. Invest., 94: 1351, 1994) The construction of recombinant AAV vectors is already known (US Pat. No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3251-3260, 1985; Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol., 4: 20722081, 1984; Hermonat & Muzyczka, PNAS., 81: 6466-6470, 1984; Samulski et al., J Virol., 63: 038223828, 1989). In clinical trials, gene transfer methods using at least six viral vectors are used, which complement the defective vector by inserting the gene into a helper cell line that generates transgenes. pLASN and MFG-S are examples of retroviruses used in clinical trials (Dunbar et al., Blood., 85: 3048-305, 1995; Kohn et al., Nat. Med., 1: 1017-102, 1995 Malech et al., PNAS., 94: (22) 12133-12138, 1997), PA317 / pLASN was the first therapeutic vector used in gene therapy (Blaese et al., Science., 270: 475-480, 1995) Transduction efficiency of MFG-S packaging vector was 50% or more (Ellem et al., Immunol Immunother., 44 (1): 10-20, 1997; Dranoff et al., Hum. Gene Ther. , 1: 111-2, 1997).
재조합 아데노 연관 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 있고 비병원성인 제2형 파르보바이러스 아데노 연관 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트 측면에 위치하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복을 보유한 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스젠 전달은 상기 벡터 시스템의 큰 장점이다(Wagner et al., Lancet., 351:9117-17023, 1998; Kearns et al., Gene Ther., 9:748-55, 1996). Recombinant adeno-associated virus vectors (rAAV) are promising alternative gene delivery systems based on defective and nonpathogenic type 2 parvovirus adeno-associated viruses. All vectors are derived from plasmids with AAV 145 bp inverted terminal repeats flanking the transgene expression cassette. Efficient gene delivery and stable transgene delivery due to integration into the genome of transduced cells is a great advantage of the vector system (Wagner et al., Lancet., 351: 9117-17023, 1998; Kearns et al., Gene Ther., 9: 748-55, 1996).
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a vaccine composition for the treatment or prevention of cancer comprising the polypeptide as an active ingredient.
본 발명에서, 상기 백신 조성물은 Th1 면역반응을 유도한다. In the present invention, the vaccine composition induces a Th1 immune response.
본 발명에서, 용어 “Th1 세포”는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th1 세포는 IL-2 및 IFN-γ를 합성하지만 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13는 합성하지 않는 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th1 세포는 다양한 세포내 병원균에 대한 세포-매개 면역반응, 기관-특이적 자가면역 질환 및 지연성 과민반응에 관여한다.In the present invention, the term “Th1 cells” refers to a subset of helper T cell lymphocytes that are specified in terms of gene expression, protein secretion and functional activity. For example, Th1 cells exhibit cytokine expression patterns that synthesize IL-2 and IFN-γ but not IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13. Th1 cells are involved in cell-mediated immune responses, organ-specific autoimmune diseases and delayed hypersensitivity to various intracellular pathogens.
본 발명에서 “CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)”는 면역조절 억제제로서 CD152(Cluster of Differentiation 152)로도 알려져 있고, 면역 관문으로 작용하는 단백질 수용체로서 면역 반응을 감소시킨다. In the present invention, "CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)", also known as CD152 (Cluster of Differentiation 152) as an immunomodulatory inhibitor, reduces the immune response as a protein receptor acting as an immune gateway.
본 발명에서 “STING(STimulator of InterferoN Gene, 인터페론 유전자의 촉진제)”은 STING에 관련된 신호전달 경로를 활성화하여 인터페론을 포함하는 염증성 사이토카인의 생산을 유도하여 항암 효과를 나타내는 물질을 의미한다. In the present invention, "STING (Simulator of InterferoN Gene)" means a substance that exhibits anti-cancer effects by activating the signaling pathway related to STING to induce the production of inflammatory cytokines including interferon.
본 발명에 있어서, 상기 암은 예컨대 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the cancer is for example squamous cell cancer (e.g. squamous cell cancer of the epithelium), small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung cancer, peritoneal cancer, colon cancer, biliary tumor, nasopharyngeal cancer , Laryngeal cancer, Bronchial cancer, Oral cancer, Osteosarcoma, Gallbladder cancer, Kidney cancer, Leukemia, Bladder cancer, Melanoma, Brain cancer, Glioma, Brain tumor, Skin cancer, Pancreatic cancer, Breast cancer, Liver cancer, Bone marrow cancer, Esophageal cancer, Colon cancer, Stomach cancer, Cervical cancer, Prostate Cancer, ovarian cancer, head and neck cancer and rectal cancer may be characterized in that at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명의 백신 조성물은 초기 암에 적용가능하다.The vaccine composition of the present invention is applicable to early cancer.
본 발명에서 용어, “항암 보조제”는 항암제의 항암효과를 증대시키고, 항암제의 부작용을 억제하거나 개선시키기 위하여 사용될 수 있으며, 항암제와 병용하여 환자에게 투여될 수 있다.In the present invention, the term "anticancer adjuvant" may be used to increase the anticancer effect of the anticancer agent, to suppress or improve the side effects of the anticancer agent, and may be administered to the patient in combination with the anticancer agent.
본 발명에서 용어, “예방”은 본 발명의 Hsp 90 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.As used herein, the term "prevention" refers to any action of inhibiting or delaying the cancer by administration of a transformant expressing the Hsp 90 epitope protein of the present invention or a composition comprising the transformant as an active ingredient.
본 발명에서 용어, “치료”는 본 발명의 Hsp 90 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 암 또는 종양이 불사화되지 않고, 분열을 멈추거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.As used herein, the term “treatment” refers to administration of a transformant expressing the Hsp 90 epitope protein of the present invention or a composition comprising the transformant as an active ingredient, and thus the cancer or tumor is not immortalized, All actions that benefit.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 및/또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 열충격단백질 90의 에피토프를 모두 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the composition may include all of the epitopes of the heat shock protein 90 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and / or 2.
본 발명에서, 용어 “다중 펩타이드 백신”은 상술한 폴리펩타이드 에피토프가 2개 이상 포함되어 있는 백신을 나타내기 위하여 정의된 용어이다.In the present invention, the term “multiple peptide vaccine” is a term defined to denote a vaccine containing two or more polypeptide epitopes described above.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 면역 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the composition may be characterized in that it further comprises an immune anticancer agent.
본 발명에 있어서, 상기 면역 항암제는 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1(Programmed cell death protein 1), LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3), TIM-3(T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing-3), TIGIT(T-cell Immunoreptor with IG and ITIM domain) 및 VISTA(V-domain Ig Suppressor of T cell Activation)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 면역관문 억제제이고, 보다 바람직하게는 CTLA-4 억제제이지만 이에 제한되지는 않는다. In the present invention, the immune anticancer agent CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1 (Programmed cell death protein 1), LAG-3 (Lymphocyte Activation Gene-3), TIM-3 (T is an immune gateway inhibitor to any one selected from the group consisting of -cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing-3), T-cell Immunoreptor with IG and ITIM domain (TIGIT) and V-domain Ig Suppressor of T cell Activation (VISTA) , More preferably CTLA-4 inhibitor.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항암 보조제를 추가로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 항암 보조제는 STING(STimulator of InterferoN Gene) 아고니스트일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, the composition may further include an anticancer adjuvant, and more preferably, the anticancer adjuvant may be, but is not limited to, a STING (STimulator of InterferoN Gene) agonist.
본 발명에서, 용어 “면역 항암제”는 암 자체를 공격하는 기존 항암제와는 달리 인공면역 단백질을 체내에 주입하여 면역체계를 자극함으로써 면역세포가 선택적으로 암세포만을 공격하도록 유도하는 치료약제로서, 암세포가 획득한 면역억제 또는 면역회피 기전을 극복하기 위하여 면역체계의 종양 인지능력 또는 파괴능력을 회복 또는 강화시키는 기전의 항암제이다. 상기 면역항암제는 면역관문 억제제, 면역세포 치료제 및 면역바이러스 치료제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. In the present invention, the term "immune anticancer agent" is a therapeutic agent that induces immune cells to selectively attack only cancer cells by stimulating the immune system by injecting artificial immune proteins into the body, unlike conventional anticancer drugs that attack cancer itself. It is an anticancer agent that restores or enhances the tumor recognition ability or destruction ability of the immune system in order to overcome the acquired immunosuppression or immune evasion mechanism. Such immune anticancer agents include, but are not limited to, immune gateway inhibitors, immune cell therapeutics and immunoviral therapeutics.
본 발명에서, 용어 “면역관문 억제제”는 일부 암세포가 체내 면역세포인 T 세포의 면역체크포인트를 활용하면서 면역을 회피하는 경우에, T 세포 억제에 관여하는 면역체크포인트 단백질(Immune Checkpoint Protein)의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 작용을 하는 면역항암제의 일종으로서, CTLA-4 억제제, PD-1 억제제, PD-1 억제제, LAG-3 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제 및 VISTA 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. In the present invention, the term "immunity check inhibitor" refers to the immune checkpoint protein (Immune Checkpoint Protein) involved in T cell inhibition when some cancer cells evade immunity while utilizing the immune checkpoint of T cells which are immune cells in the body. A kind of immune anticancer agent that acts to block the activation of T cells to attack cancer cells, including CTLA-4 inhibitors, PD-1 inhibitors, PD-1 inhibitors, LAG-3 inhibitors, TIM-3 inhibitors, TIGIT inhibitors, Including but not limited to VISTA inhibitors.
에피토프 펩타이드를 백신 조성물로 이용하는 경우, 상기 유효성분은 단독으로 이용되기 보다는 약학으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다. 여기서, 약학으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다.When the epitope peptide is used as a vaccine composition, the active ingredient is suitably used in the form of a pharmaceutically acceptable carrier, rather than being used alone. Here, pharmaceutically acceptable carriers include carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical art.
본 발명의 백신 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers for use in the vaccine compositions of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, Calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.Vaccine compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, oral formulations, such as emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. . When formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations contain at least one excipient in the active ingredient, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin It can be prepared by mixing. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used. Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, water-insoluble solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used. In particular, in the case of a liquid formulation, it is preferable to mix and sterilize a bactericide by filtration through a bacterial capture filter or the like. The so sterilized composition may be solidified, for example, by lyophilization, which, in use, is dissolved in sterile water or sterile diluent.
본 발명에 따른 백신 조성물은 소, 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.The vaccine composition according to the present invention can be administered to mammals such as cattle, rats, mice, livestock, dogs, humans and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 에피토프 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 폴리페타이드의 면역원량의 멸균 용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원 자극을 수행할 수 있다.The dosage of the vaccine composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, physical condition and the like of the animal. The amount required to induce an immunoprotective response in an animal without any adverse side effects may vary depending on the presence of epitopes and excipients used as immunogens. In general, each dose contains 0.1 to 1000 μg of protein, preferably 0.1 to 100 μg, per ml of sterile solution of the immunogenic amount of the polypetide of the present invention. In the case of vaccine compositions, initial doses may optionally be followed by optionally repeated antigenic stimulation.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물을 암 환자에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method of treating or preventing cancer comprising administering the vaccine composition to a cancer patient.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역항암제와 병용하여 투여하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 항체치료제와 병용하여 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the vaccine composition may be characterized in that it is administered in combination with an immune anticancer agent, it may be characterized in that it is administered in combination with an antibody therapeutic agent.
발명의 백신 조성물과 병용하여 사용되는 면역항암제 또는 항체치료제는 상호 동시에 또는 시간 차를 두고 순차적으로 투여될 수 있으며, 적절한 시간 및 주기에 따라 선택될 수 있다.An immunocancer or antibody therapeutic agent used in combination with the vaccine composition of the present invention may be administered simultaneously or sequentially with each other, and may be selected according to an appropriate time and cycle.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역항암제와 병용하여 투여할 수 있다. 상기 면역 항암제는 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1(Programmed cell death protein 1), LAG-3(Lymphocyte Activation Gene-3), TIM-3(T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing-3), TIGIT(T-cell Immunoreptor with IG and ITIM domain) 및 VISTA(V-domain Ig Suppressor of T cell Activation)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나에 대한 면역관문 억제제이고, 보다 바람직하게는 CTLA-4 억제제이지만 이에 제한되지는 않는다. In the present invention, the vaccine composition can be administered in combination with an anticancer agent. The immune anticancer agents are cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), Programmed cell death protein 1 (PD-1), Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3), and T-cell Immunoglobulin and Mucin. immuno-gateway inhibitor for any one selected from the group consisting of -domain containing-3), T-cell Immunoreptor with IG and ITIM domain (TIGIT), and V-domain Ig Suppressor of T cell Activation (VISTA), more preferably CTLA-4 inhibitors, but are not limited to these.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 항암 보조제를 추가로 병용 투여할 수 있고, 상기 항암 보조제는 STING(STimulator of InterferoN Gene) 아고니스트일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.In the present invention, the vaccine composition may further be administered in combination with an anticancer adjuvant, and the anticancer adjuvant may be, but is not limited to, a STING (STimulator of InterferoN Gene) agonist.
본 발명에 있어서, 상기 암은 예컨대 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cancer is for example squamous cell cancer (e.g. squamous cell cancer of the epithelium), small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung cancer, peritoneal cancer, colon cancer, biliary tumor, nasopharyngeal cancer , Laryngeal cancer, Bronchial cancer, Oral cancer, Osteosarcoma, Gallbladder cancer, Kidney cancer, Leukemia, Bladder cancer, Melanoma, Brain cancer, Glioma, Brain tumor, Skin cancer, Pancreatic cancer, Breast cancer, Liver cancer, Bone marrow cancer, Esophageal cancer, Colon cancer, Stomach cancer, Cervical cancer, Prostate Cancer, ovarian cancer, head and neck cancer and rectal cancer may be characterized in that at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 서열번호 1 및/또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 열충격단백질 90의 에피토프를 포함하는 항암 조성물을 제공한다.The present invention also provides an anticancer composition comprising an epitope of heat shock protein 90 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and / or 2.
상기 조성물은 상기 에피토프 이외에 유효성분의 안정화를 위한 다른 성분이 더 포함될 수 있다. The composition may further include other components for stabilization of the active ingredient in addition to the epitope.
본 발명에서 용어, "주사" 또는 "투여"는 투여대상의 나이, 성별, 체중 등에 따라 투여량이 달라질 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서도 백신의 투여량이 달라질 수 있다.In the present invention, the term "injection" or "administration" may vary depending on the age, sex, weight, etc. of the subject to be administered, and the dosage of the vaccine may also vary depending on the route of administration, degree of disease, sex, weight, age, and the like. have.
본 발명에서, 콘카나발린 A(concanavalin A; 양성대조군, Positive control)는 T세포를 활성화시키지만 B세포는 활성화시키지 않는다(불용화하면 B세포도 활성화된다). 또 여러 암세포에서 정상세포에 비하여 Con A에 대한 높은 응집성을 나타내기 때문에 암세포막 구조의 특이성을 연구하는 수단으로 이용되고 있다. In the present invention, concanavalin A (positive control) activates T cells but does not activate B cells (inactivating B cells also activates). In addition, since several cancer cells show higher cohesiveness to Con A than normal cells, it is used as a means of studying the specificity of cancer cell membrane structure.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 열충격단백질 90의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an antibody that specifically recognizes an epitope of heat shock protein 90 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the antibody may be characterized in that the monoclonal or polyclonal antibody.
본 발명에서, 용어 “항체”는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 면역글로불린이라고도 하며, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으킨다. 항체가 특이적 항원에 대한 특이성을 나타내는 반면에, 면역글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 결여된 항체 유사 물질 모두를 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예컨대 림프계에서는 낮은 수준으로 생산되며 골수종에 의해서 증가된 수준으로 생산된다. 본 발명에서는 Hsp 90 에피토프 단백질의 일부를 포함하는 유전자 서열의 항원에 대한 항체일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열이 융합된 형태의 항원에 대한 항체일 수 있다.In the present invention, the term "antibody" is a substance produced by the stimulation of the antigen in the immune system, also known as immunoglobulin, and specifically binds to a specific antigen to float the lymph and blood, causing an antigen-antibody reaction. While antibodies exhibit specificity for specific antigens, immunoglobulins include both antibodies and antibody-like substances lacking antigen specificity. The latter polypeptide is produced at low levels, for example in the lymphatic system, and at elevated levels by myeloma. In the present invention, the antibody may be an antibody against an antigen of a gene sequence including a portion of an Hsp 90 epitope protein, preferably an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 It may be an antibody against the fused form of the antigen.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다.The term "therapeutically effective amount" as used in combination with an active ingredient in the present invention means an amount effective for preventing or treating a target disease, and the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may be various factors, for example, a method of administration. It may vary depending on the purpose, location of the patient and the condition of the patient. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: in silico 알고리즘을 이용한 Hsp 90 MHC class II 항원결정기 발굴Example 1: Discovery of Hsp 90 MHC class II epitope using in silico algorithm
열충격단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp 90)에서 사람에서 가장 흔한 MHC class II 대립형질(allele)에 결합친화성이 좋을 것으로 예상되는 15-mer 펩타이드 시퀀스를 선정하기 위하여, SYFPEITHI(Institute for Cell Biology, Heidelberg, Germany), Propred(Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India), MHC-Thread(University of Aberdeen, AFPberdeen, United Kingdom), Average Binding matrix method, Rankpep(Harvard, Boston, MA, USA)의 컴퓨터 알고리즘을 이용하였다(도 1).In order to select a 15-mer peptide sequence that is expected to have good binding affinity to the most common MHC class II allele in humans in heat shock protein 90 (Hsp 90), SYFPEITHI (Institute for Cell Biology) , Heidelberg, Germany), Propred (Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India), MHC-Thread (University of Aberdeen, AFPberdeen, United Kingdom), Average Binding matrix method, Rankpep (Harvard, Boston, MA, USA) Was used (FIG. 1).
사람에서 가장 흔한 MHC class II 대립형질은 DRB1*0101, DRB1*1501, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0701, DRB1*0802, DRB1*0901, DRB1*1101, DRB1*1201, DRB1*1302, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101이다. The most common MHC class II alleles in humans are DRB1 * 0101, DRB1 * 1501, DRB1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB1 * 0404, DRB1 * 0405, DRB1 * 0701, DRB1 * 0802, DRB1 * 0901, DRB1 * 1101, DRB1 * 1201, DRB1 * 1302, DRB3 * 0101, DRB4 * 0101 and DRB5 * 0101.
그 결과, Hsp 90 15-mer 펩타이드 시퀀스를 12개를 획득하였다(표 1). 상기 획득한 15개의 펩타이드 시퀀스는 펩타이드 합성회사에 의뢰하여 펩타이드로 합성하였다.As a result, 12 Hsp 90 15-mer peptide sequences were obtained (Table 1). The 15 peptide sequences obtained were synthesized into peptides by a peptide synthesis company.
이 후, 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 표시되는 2가지(p485, p527)의 다중 펩타이드 시퀀스를 선정하였다.Thereafter, two peptide sequences (p485 and p527) represented by the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 were selected.
하기 표 1은 선정한 Hsp 90 15-mer 펩타이드 시퀀스를 나타낸 것이다.Table 1 below shows the selected Hsp 90 15-mer peptide sequences.
HSP90 15-mer 펩타이드HSP90 15-mer Peptide
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아미노산 서열Amino acid sequence
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p485-499p485-499
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LYVRRVFIMDNCEEL(서열번호 1)LYVRRVFIMDNCEEL (SEQ ID NO: 1)
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p527-541p527-541
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QSKILKVIRKNLVKK(서열번호 2)QSKILKVIRKNLVKK (SEQ ID NO: 2)
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p109-123p109-123
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LYKDLQPFILLRLLM(서열번호 5)LYKDLQPFILLRLLM (SEQ ID NO: 5)
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p145-159p145-159
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QAEIAQLMSLIINTF(서열번호 6)QAEIAQLMSLIINTF (SEQ ID NO: 6)
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p160-174p160-174
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YSNKEIFLRELISNS(서열번호 7)YSNKEIFLRELISNS (SEQ ID NO: 7)
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p220-234p220-234
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MTKADLINNLGTIAK(서열번호 8)MTKADLINNLGTIAK (SEQ ID NO: 8)
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p255-269p255-269
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QFGVGFYSAYLVAEK(서열번호 9)QFGVGFYSAYLVAEK (SEQ ID NO: 9)
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p296-310p296-310
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TDTGEPMGRGTKVIL(서열번호 10)TDTGEPMGRGTKVIL (SEQ ID NO: 10)
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p328-342 p328-342
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IVKKHSQFIGYPITL(서열번호 11)IVKKHSQFIGYPITL (SEQ ID NO: 11)
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p457-471p457-471
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LEFRALLFVPRRAPF(서열번호 12)LEFRALLFVPRRAPF (SEQ ID NO: 12)
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p582-596p582-596
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SELLRYYTSASGDEM(서열번호 13)SELLRYYTSASGDEM (SEQ ID NO: 13)
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p780-794p780-794
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SVKDLVILLYETALL(서열번호 14)SVKDLVILLYETALL (SEQ ID NO: 14)
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실시예 2: 마우스 모델에서 Hsp 90 다중 펩타이드 백신의 면역원성 확인Example 2: Confirmation of immunogenicity of Hsp 90 multiple peptide vaccine in mouse model
마우스모델에서 Hsp 90 다중 펩타이드 백신의 면역원성을 확인하기 위하여, FVB 마우스 (6~8주령)를 각 군당 5마리씩으로 생리식염수(PBS)와 면역 보조제(immune adjuvant, CFA/IFA) 군 또는 Hsp 90 펩타이드와 면역보조제 군으로 나누고, 10일 마다 3회씩 마우스 등에 피하주사로 투여하고 마지막 투여로부터 10일 후 마우스의 비장을 적출하여 비장세포를 분리하고 인터페론감마(IFNγ)-고착화효소항체법(EezymeLinked Immuno-SPOT assay, ELISPOT)을 이용하여 Hsp 90 다중 펩타이드 특이 T 세포반응을 관찰하였다.In order to confirm the immunogenicity of the Hsp 90 multi-peptide vaccine in mouse models, FVB mice (6-8 weeks old) were placed in each group of physiological saline (PBS) and immune adjuvant (CFA / IFA) or Hsp 90 groups. Divided into peptide and immunoadjuvant groups, administered three times every 10 days by subcutaneous injection, etc., 10 days after the last administration, spleen cells of mice were isolated to separate splenocytes, and interferon gamma (IFNγ) -fixed enzyme antibody method (EezymeLinked Immuno). -SPOT assay, ELISPOT) was used to observe Hsp 90 multiple peptide specific T cell responses.
마우스 비장 세포 준비 및 동결 시, 기계장치 및 물질은 표 2에 나타난 바와 같다.In mouse spleen cell preparation and freezing, the mechanisms and materials are shown in Table 2.
15ml and 50ml Falcon tubes,Sterile15ml and 50ml Falcon tubes, Sterile
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VariesVaries
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RTRT
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500ml glass bottles, Sterile500ml glass bottles, Sterile
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In-houseIn-house
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RTRT
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Bottle top filters, 0.22 micronBottle top filters, 0.22 micron
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MilliporeMillipore
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SCGPS05RESCGPS05RE
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RTRT
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Cell StrainerCell strainer
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BDBD
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352350352350
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RTRT
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Serological pipettes, SterileSerological pipettes, Sterile
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VariesVaries
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RTRT
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Pipetmen and sterile pipetman tipsPipetmen and sterile pipetman tips
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VariesVaries
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RTRT
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3ml Transfer pipet3ml Transfer pipet
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BDBD
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357575357575
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RTRT
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18G 1.5” hypodermic needle18G 1.5 ”hypodermic needle
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BDBD
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RTRT
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Sterile square petri dishesSterile square petri dishes
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VariesVaries
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RTRT
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CentrifugeCentrifuge
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VariesVaries
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RTRT
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Mr. Frosty containers w/isopropanolMr. Frosty containers w / isopropanol
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NalgeneNalgene
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RT to -80°CRT to -80 ° C
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-80C Freezer-80C Freezer
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VariesVaries
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-80°C-80 ° C
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Water BathWater bath
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VariesVaries
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37°C37 ° C
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Liquid Nitrogen storage tankLiquid Nitrogen storage tank
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VariesVaries
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Mouse T Cell MediaMouse T Cell Media
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In-houseIn-house
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**
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4°C4 ° C
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Freezing MediaFreezing media
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In-houseIn-house
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****
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4°C4 ° C
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ACK Lysis BufferACK Lysis Buffer
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In-houseIn-house
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******
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RTRT
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마우스 T 세포 배지(Mouse T Cell Media)는 500mL RPMI-1640(L-Glut + Hepes) [Mediatech Cellgro], 5mL 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액(penicillin-streptomycin solution)[Mediatech Cellgro, #30-002-CI], 50mL 열에 의해 불활성화된 태아 소 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum)[SAFC Biosciences, 확인된 경우, 다른 것도 사용가능], 0.5mL 1000X 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)[GIBCO, #21985]를 이용하였고, 플라스틱웨어(plasticware)로 필터링(Filtering)하였다. 동결 배지(Freezing Media)는 45ml heat-inactivated FBS 및 5ml DMSO를 포함하며, 필터링 후 4℃조건에서 보관하였다. ACK 용해 버퍼(Lysis Buffer)(RBC solution)는 1L ddH2O, 8.29g NH4Cl (final 150mM) 및 1g KHCO3 (최종 농도 10mM)를 포함하고, pH 7.2-7.4이며, 필터링하였다.Mouse T Cell Media is 500 mL RPMI-1640 (L-Glut + Hepes) [Mediatech Cellgro], 5 mL penicillin-streptomycin solution [Mediatech Cellgro, # 30-002-CI] , 50 mL heat-inactivated fetal bovine serum [SAFC Biosciences, if available, others available], 0.5 mL 1000X 2-mercaptoethanol [GIBCO, # 21985 ] Was filtered with plasticware. Freezing Media contains 45ml heat-inactivated FBS and 5ml DMSO and stored at 4 ° C after filtering. ACK Lysis Buffer (RBC solution) contained 1 L ddH 2 O, 8.29 g NH 4 Cl (final 150 mM) and 1 g KHCO 3 (final concentration 10 mM), pH 7.2-7.4, filtered.
멸균 기술(sterile technique)은 어세이(assay)의 각 단계(step)마다 사용하였다. 모든 실험자들은 조직 배양 후드(tissue culturehood)에서 시행하였다.Sterilization techniques were used for each step of the assay. All experimenters were conducted in a tissue culture hood.
적출한 비장에서 비장세포를 분리하는 방법은, Mouse T cell 배지를 50ml 튜브에 적당량 덜어서 37℃ 항온수조(water bath)에서 가열한 후, p100 dish에 3ml 배지와 신선한 비장(fresh spleen)만 남기고 버렸다. 이후, 비장을 칼날을 이용하여 잘게 자른다. 50ml tube에 셀 스트레이너(cell strainer)를 끼고 잘게 잘린 비장과 배지를 넣어주었다. 1.5ml tube끝으로 비장을 셀 스트레이너 위에서 갈아준 후 10ml warm T cell media로 셀 스트레이너에 분주하여 세포들을 걸러내었다. 또한, p100 dish의 세포도 수득하였다. 이후, 원심분리기를 이용하여 1,200rpm조건에서 8분 동안 원심분리하였다. 상층액은 조심스럽게 제거한 후, 10ml warm Mouse T cell media 첨가하여 펠렛(pellet)을 리서스펜딩(resuspend)한다. 이후, 원심분리기를 이용하여 1,200rpm조건에서 8분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. ACK Lysis Buffer5ml로 서스펜딩(suspend)한 후에 5분 동안 배양(incubation)하였다. 이후, Mouse T cell media 10ml을 첨가하고, 원심분리기를 이용하여 1,200rpm조건에서 8분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 최대한 완전히 제거하였다. 그 후, warm mouse matis media 10ml을 첨가하고, 15ul를 새로운 튜브로 옮겨 세포 카운팅(cell counting)하였다. 원심분리기를 이용하여 1,200rpm조건에서 8분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거하였다.In order to separate splenocytes from the spleen, the mouse T cell medium was poured into a 50 ml tube, heated in a 37 ° C. water bath, and left in a p100 dish with only 3 ml of medium and fresh spleen. . Afterwards, the spleen is chopped using a blade. Cell strainer (cell strainer) was put in a 50ml tube and chopped spleen and medium were added. The spleen was transferred to a cell strainer using a 1.5 ml tube, and the cells were filtered by dispensing the cell strainer with 10 ml warm T cell media. In addition, cells of a p100 dish were also obtained. Thereafter, the resultant was centrifuged at 1,200 rpm for 8 minutes using a centrifuge. The supernatant is carefully removed, and then the pellet is resuspended by adding 10 ml warm Mouse T cell media. Then, after centrifugation for 8 minutes at 1,200rpm using a centrifuge, the supernatant was carefully removed. After 5 minutes of incubation with the ACK Lysis Buffer 5ml (suspend). Then, 10 ml of Mouse T cell media was added, and centrifuged at 1,200 rpm for 8 minutes using a centrifuge, and the supernatant was carefully removed as completely as possible. Then, 10 ml of warm mouse matis media was added, and 15 ul was transferred to a new tube for cell counting. The centrifuge was centrifuged at 1,200 rpm for 8 minutes and the supernatant was carefully removed.
같은 날에 비장세포(splenocyte)를 사용할 경우, 세포에 원하는 농도를 맞춰서 배지를 넣어준 후 suspension하였다. 비장세포를 동결할 경우, 2ml의 freeze media를 넣고 resuspend한 후 2개의 tube에 1ml씩 할당(aliquot)하였다. 그 후에 -80도 냉동고(freezer)에 overnight으로 보관한 뒤 그 다음날 LN2로 옮겨주었다.When using splenocytes on the same day, the cells were put in suspension after adjusting the desired concentration. When freezing splenocytes, 2ml of freeze media was added and resuspended, and then aliquots were added to the two tubes. It was then stored overnight in a -80 degree freezer and transferred to LN2 the next day.
인터페론감마(IFNγ)-고착화효소항체법(EezymeLinked Immuno-SPOT assay, ELISPOT)을 수행 시, 기계장치 및 물질은 표 3에 나타난 바와 같다.When performing the interferon gamma (IFNγ) -fixed enzyme antibody (EezymeLinked Immuno-SPOT assay, ELISPOT), the mechanism and materials are shown in Table 3.
15ml and 50ml Falcon tubes,Sterile15ml and 50ml Falcon tubes, Sterile
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VariesVaries
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500ml glass bottles, Sterile500ml glass bottles, Sterile
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In-houseIn-house
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Bottle top filters, 0.22 micronBottle top filters, 0.22 micron
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MilliporeMillipore
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SCGPS05RESCGPS05RE
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Plastic WrapPlastic wrap
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VariesVaries
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Serological pipettes, SterileSerological pipettes, Sterile
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VariesVaries
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Pipetmen and sterile pipetman tipsPipetmen and sterile pipetman tips
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VariesVaries
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AID Plate Reader and softwareAID Plate Reader and software
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AIDAID
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Plate washerPlate washer
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VariesVaries
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37°C + 5% CO2 incubator37 ° C + 5% CO 2 incubator
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NuaireNuaire
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Multichannelaspirator (ethanol sterilized)Multichannelaspirator (ethanol sterilized)
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VariesVaries
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Mouse T cell MediaMouse T cell Media
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In-houseIn-house
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**
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4°C4 ° C
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96-well MAIPS plate, Sterile96-well MAIPS plate, Sterile
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MilliPoreMillipore
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MAIPS4510MAIPS4510
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1X PBS, 0.22 ㎛ filtered1X PBS, 0.22 μm filtered
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In-houseIn-house
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35% EtOH (v/v) in deionized water, filter sterilized35% EtOH (v / v) in deionized water, filter sterilized
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In-houseIn-house
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1X PBS + 0.05% Tween-20, 0.22 ㎛ filtered1X PBS + 0.05% Tween-20, 0.22 μm filtered
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In-houseIn-house
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Streptavidin-HRPStreptavidin-HRP
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MabTechMabtech
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3310-93310-9
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4°C4 ° C
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AEC Staining Kit --OR-- AEC SubstrateKitAEC Staining Kit --OR-- AEC SubstrateKit
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Sigma OR BD PharmingenSigma OR BD Pharmingen
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AEC101-KT OR 551015AEC101-KT OR 551015
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-20°C-20 ° C
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Anti-mouse IFNγ coating antibody, 1 mg/mlAnti-mouse IFNγ coating antibody, 1 mg / ml
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MabTechMabtech
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| AN18AN18
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4°C4 ° C
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Anti-mouse IFNγ biotinylated antibody, 1 mg/mlAnti-mouse IFNγ biotinylated antibody, 1 mg / ml
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MabTechMabtech
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| R46A2R46A2
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4°C4 ° C
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Antigens (TT peptide, HSP90 peptide, Concanavalin A)Antigens (TT peptide, HSP90 peptide, Concanavalin A)
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VariesVaries
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4°C4 ° C
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Conclavin AConclavin a
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SigmaSigma
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C5275C5275
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-80°C-80 ° C
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Mouse T Cell Media는 상기와 동일한 것을 사용하였다.Mouse T Cell Media used the same thing as above.
(Day 0)에 Prewet MAIPS 96-웰 플레이트(well plate)에 35% 에탄올 30ul 1분 배양(incubation) 후, 1xPBS 200ul 씩 분주하여 3회 세척하였다(Ultra purewater과 에탄올은 Merck를 사용하여 35% 에탄올을 제조하였고, PBS는 1xPBS를 구입하여 사용하였다). 항 마우스 IFNγ 항체(anti-mouse IFNγ antibody)(1mg/ml, stored at 4℃, green cap)를 1xPBS를 이용하여 10ug/ml로 희석하였다(10ul/ml). 제조한 solution을 각각의 well에 50ul씩 분주하였다. 96-웰 플레이트 당 5ml의 양이 필요하다. 플레이트 뚜껑을 닫고 랩으로 감싼 후 4℃조건에서 16~24시간 동안 배양하였다(이 때, 반드시 랩을 씌워야한다). (Day 0) 35 minutes ethanol 30ul 1 minute incubation in Prewet MAIPS 96-well plate, and then washed three times by dispensing 200ul of 1xPBS (Ultra purewater and ethanol 35% ethanol using Merck) Was prepared and PBS was used by purchasing 1 × PBS). Anti-mouse IFNγ antibody (anti-mouse IFNγ antibody) (1mg / ml, stored at 4 ℃, green cap) was diluted to 10ug / ml using 1xPBS (10ul / ml). 50 ul was dispensed into each well of the prepared solution. An amount of 5 ml per 96-well plate is required. The plate lid was closed and wrapped and then incubated at 4 ° C. for 16-24 hours (when this was done, it must be covered).
(Day 1)에 플레이트를 꺼내온 후 멀티채널 피펫(multichannel pipette)을 이용하여 항체(antibody)를 제거하였다. 1xPBS 200ul 씩 분주하여 3회 세척하였다. 마지막 세척에서 plate에 막(membrane) 손상 없이 PBS를 완전히 제거하였다. Mouse T cell media 200ul씩 각각의 well에 분주하여 blocking 한다. 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 2시간 동안 배양하였다. plate 뚜껑과 안쪽에 라벨링하였다.After removing the plate in (Day 1), the antibody was removed by using a multichannel pipette. Dispense 200 ul of 1 × PBS and wash three times. In the last wash, PBS was completely removed without damaging the plate. 200ul of mouse T cell media is dispensed to each well and blocked. Incubated for 2 hours in a 37 ℃ incubator (incubator). Labeled on the plate lid and inside.
샘플 플레이트 레이아웃(Sample Plate Layout):Sample Plate Layout:
웰 A1-A6 (No Antigen) = 100uL cells + 100uL Mouse T-cell MediaWell A1-A6 (No Antigen) = 100uL cells + 100uL Mouse T-cell Media
웰 A7-A12 (Nonspecific peptide) = 100uL cells + 100uL 2X HIV p17Well A7-A12 (Nonspecific peptide) = 100 uL cells + 100 uL 2X HIV p17
웰 B1-B6 (Positive Control) = 100uL cells + 100uL 2X Conclavin AWell B1-B6 (Positive Control) = 100 uL cells + 100 uL 2X Conclavin A
웰 B7-B12 (Vaccine Peptide) = 100uL cells + 100uL 2X Peptide Well B7-B12 (Vaccine Peptide) = 100 uL cells + 100 uL 2X Peptide
(Continuing for each mouse or pool of cells)(Continuing for each mouse or pool of cells)
펩타이드의 농도를 mouse T cell media에 2배로 만든 후, 웰 당 100ul씩 분주 할 수 있게 만들고 +1개로 만들었다(표 4).Peptide concentrations were doubled in mouse T cell media, allowed to dispense 100 ul per well and made to +1 (Table 4).
항원antigen
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스톡(Stock) 농도Stock concentration
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작용 (2X) 농도(Working concentration)Working concentration
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최종 농도Final concentration
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no agno ag
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--
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--
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--
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Conclavin AConclavin a
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1 mg/ml1 mg / ml
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5 ㎍/ml5 μg / ml
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2.5 ㎍/ml2.5 μg / ml
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peptidespeptides
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10 mg/ml10 mg / ml
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20 ㎍/ml20 μg / ml
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10 ㎍/ml10 μg / ml
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peptidespeptides
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5mg/ml5mg / ml
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20 ㎍/ml20 μg / ml
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10 ㎍/ml10 μg / ml
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이후, 블랏킹 배지(blocking media)를 제거하고, 상기 제조한 항원 샘플(antigen sample)을 서로 적절한 웰에 100ul씩 분주하였다. 동결 또는 신선한 비장세포를 어세이(assay)에 사용하였다. 비장세포의 분리방법은 상기 SOP IV-101(Mouse Splenocyte Preparation and Freezing protocol)를 참고하여 실험을 진행하였다. Mouse T cell media에 ml당 3.0x106~3.5x106의 최종농도로 resuspend 하였다. 멀티채널 피펫을 이용하여 카운팅한 세포를 웰 당 100ul (3.0x105~3.5x105)씩 분주하였다. 단, no antigen 웰은 mouse T-cell media 100ul씩 분주하였다. 37℃ 인큐베이터에 넣고 70~72 시간 동안 배양하였다. 세포가 반응하면 배지 색이 진한 노란색으로 바뀌는 것을 확인하였다(Day 1 end).Thereafter, the blocking medium was removed, and the prepared antigen samples were dispensed 100 ul into appropriate wells. Frozen or fresh splenocytes were used for the assay. The separation of splenocytes was carried out with reference to the SOP IV-101 (Mouse Splenocyte Preparation and Freezing protocol). Mouse T cell media was resuspended at a final concentration of 3.0x10 6 to 3.5x10 6 per ml. Cells counted using a multichannel pipette were dispensed at 100 ul (3.0 × 10 5 ˜3.5 × 10 5 ) per well. However, no antigen wells were divided into 100ul of mouse T-cell media. Incubated in 37 ℃ incubator for 70-72 hours. When the cells reacted, it was confirmed that the medium color changed to dark yellow (Day 1 end).
(Day 4)에는 70-72 시간 동안 배양한 후 37℃ 인큐베이터에서 꺼내어 플레이트의 배지를 멀티채널 피펫으로 조심스럽게 제거하였다. 1x PBS 200ul씩 2회 세척하고, 1x PBS+0.05% tween-20 200ul씩 3회 세척하였다. 단, 마지막 세척은 조심스럽게 1x PBS+0.05% tween-20을 완전히 제거하였다.(Day 4) was incubated for 70-72 hours and then taken out of the 37 ° C. incubator to carefully remove the medium from the plate with a multichannel pipette. Wash twice with 200ul of 1x PBS, wash three times with 200ul of 1x PBS + 0.05% tween-20. However, the last wash carefully removed 1x PBS + 0.05% tween-20 completely.
바이오티닐화된 항-마우스 IFNγ 항체(biotinylated anti-mouse IFNγ antibody)(1mg/ml, stored at 4℃, yellow cap)를 1x PBS+0.05% tween-20을 이용하여 5ug/ml로 희석하였다(5ul/ml). 제조한 용액을 각 웰에 50ul씩 분주하였다. 96-웰 플레이트 당 5ml의 양이 필요하다. 플레이트 뚜껑을 닫고 랩으로 감싼 후 4℃조건에서 16~24시간 동안 배양하였다(반드시, 랩을 씌어야 함) (Day 4 end).Biotinylated anti-mouse IFNγ antibody (1 mg / ml, stored at 4 ° C., yellow cap) was diluted to 5 ug / ml using 1 × PBS + 0.05% tween-20 (5ul). / ml). 50 ul was dispensed into each well. An amount of 5 ml per 96-well plate is required. The plate was capped and wrapped in a wrap and incubated for 16-24 hours at 4 ° C. (must be covered) (Day 4 end).
(Day 5)에는 배양 후 플레이트의 배지를 멀티채널 피펫으로 조심스럽게 제거하였다. 1x PBS 200ul 씩 분주하여 4회 세척하였다. 마지막 세척 시, 플레이트에 막(membrane) 손상없이 PBS를 완전히 제거하였다. 1x PBS에 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP)을 1:250으로 희석(4ul/ml)하였다. 제조한 용액을 각각의 웰에 50ul씩 분주하였다. 96-웰 플레이트 당 5ml의 양이 필요하다. 플레이트 뚜껑을 닫고 랩으로 감싼 후 상온(room temperature)에서 60분 동안 배양하였다(HRP 반응시키는 동안에 ABC kit를 상온에 꺼내 놓는다).In (Day 5), the culture of the plate after the culture was carefully removed with a multichannel pipette. Wash 4 times by dispensing 200ul each of 1x PBS. At the last wash, PBS was completely removed without damaging the plate. Streptavidin-HRP was diluted 1: 250 in 4 × PBS (4 ul / ml). The prepared solution was dispensed 50 ul into each well. An amount of 5 ml per 96-well plate is required. The plate lid was closed, wrapped in a wrap, and incubated at room temperature for 60 minutes (the ABC kit was taken out at room temperature during the HRP reaction).
배양 후 플레이트의 배지를 멀티채널 피펫으로 조심스럽게 제거하였다. 1x PBS 200ul 씩 분주하여 4회 세척하였다. 마지막 세척 시, 플레이트에 막(membrane) 손상없이 PBS를 완전히 제거하였다. 플레이트의 밑부분을 분리하여 PBS의 물기를 휴지로 제거하였다.After incubation, the medium of the plate was carefully removed with a multichannel pipette. Wash 4 times by dispensing 200ul each of 1x PBS. At the last wash, PBS was completely removed without damaging the plate. The bottom of the plate was separated to dry the PBS with a tissue.
ABC kit development solution(큰 bottle 1ml에 작은 것 한방울 mix) 50ul 씩 각 웰에 분주하였다. 96-웰 플레이트 당 5ml의 양이 필요하다. positive control wells의 color를 확인하였다. Development 시간을 길게는 45분을 넘기지 않는다. 보통은 5~10분 사이에 spot이 보이나, stop이 보이지 않으면 20~30분까지 늘린다. stop reaction은 흐르는 차가운 수돗물 조심스럽게 세척하였다. 어두운 곳 상온에 자연 건조시켰다(이때, Stop이 light-sensitive 하여서 빛에 노출되지 않도록 한다).50 ul of ABC kit development solution (mix 1 drop small to 1 ml large bottle) was dispensed into each well. An amount of 5 ml per 96-well plate is required. The color of the positive control wells was confirmed. Development time should not exceed 45 minutes. Normally you will see spots between 5-10 minutes, but if you do not see a stop, increase it to 20-30 minutes. The stop reaction was carefully washed with running cold tap water. Allow to dry naturally at room temperature in the dark (Stop is light-sensitive so that it is not exposed to light).
그 결과, FVB 마우스 모델의 HSP90 펩타이드 반응에서 Hsp 90 다중 펩타이드 백신군이 대조군에 비해 인터페론감마(IFN-γ) 분비에 의한 특이(specific) 반응성이 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 2).As a result, in the HSP90 peptide reaction of the FVB mouse model, it was confirmed that the Hsp 90 multiple peptide vaccine group exhibited higher specific reactivity by interferon gamma (IFN-γ) secretion than the control group (FIG. 2).
실시예 3: 마우스 모델에서 HSP90 다중 펩타이드 백신의 항종양 효과 확인Example 3: Confirmation of antitumor effect of HSP90 multiple peptide vaccine in mouse model
항종양 효과를 확인하기 위하여, 마우스 유방암 세포주(mouse mamary cancer cell-FVB/N-Tg(MMTVneu)-202Mul 마우스 유래 HER-2 과발현 유방암 세포주)를 이용하였다. MMTVneu 형질전환 마우스 암컷 6주령을 각 군당 10마리씩으로 생리식염수와 면역 보조제 군과 HSP90 펩타이드와 면역 보조제 군으로 나누고, 10일 마다 3회씩 피하주사를 투여하고 마지막 투여로부터 10일 후 마우스 유방암 세포주를 마우스 옆구리에 피하 주사하여 접송하고 종양의 성장을 3~4일 간격으로 관찰하며 종양크기를 측정하여 HSP90 다중 펩타이드 백신의 항종양 효과 확인하였다. 실험방법은 실시예 2와 동일하다.In order to confirm the anti-tumor effect, a mouse breast cancer cell line (mouse mamary cancer cell-FVB / N-Tg (MMTVneu) -202Mul mouse-derived HER-2 overexpressing breast cancer cell line) was used. MMTVneu transgenic mouse females were divided into 6 groups of 10 males each in physiological saline, immunosuppressive group, HSP90 peptide and immunosuppressive group, subcutaneous injection three times every 10 days and mouse breast cancer cell line 10 days after the last administration. Subcutaneous injection was applied to the flank and tumor growth was observed at 3-4 day intervals and tumor size was measured to determine the antitumor effect of the HSP90 multiple peptide vaccine. The experimental method is the same as in Example 2.
실험 결과, 마우스 모델에서 대조군에 비해 Hsp90 다중 펩타이드 백신군의 종양크기가 현저하게 작아지는 것을 확인하였다(도 3a). 또한, HSP90 펩타이드 반응에서 HSP90 다중 펩타이드 백신군이 대조군에 비해 인터페론감마(IFN-γ) 분비에 의한 특이(specific) 반응성이 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3b).As a result, it was confirmed that the tumor size of the Hsp90 multiple peptide vaccine group was significantly smaller than that of the control group in the mouse model (FIG. 3A). In addition, it was confirmed that the HSP90 multi-peptide vaccine group showed higher specific reactivity due to the secretion of interferon gamma (IFN-γ) in the HSP90 peptide response than in the control group (FIG. 3B).
따라서, 본 발명의 Hsp90 다중 펩타이드 백신 조성물은 면역원성을 나타내며, 항종양 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the Hsp90 multiple peptide vaccine composition of the present invention exhibits immunogenicity and is excellent in antitumor effect.
실시예 4: 마우스 모델에서 HSP90 다중 펩타이드 백신 / STING agonist / 면역조절 억제제(CTLA-4) 병용 투여의 항종양 효과 확인Example 4: Confirmation of antitumor effect of HSP90 multiple peptide vaccine / STING agonist / immunomodulatory inhibitor (CTLA-4) combination in mouse model
4.1 종양 형성 및 항종양 측정4.1 Tumor Formation and Antitumor Measurement
6주령의 암컷 MMTVneu 형질전환 마우스 옆구리에 마우스 유래 유방암 세포 5 X 105개를 피하 주사하였다. 10일 후에 1개 대조군(PBS+면역보조제; immune adjuvant; Complete Freund’s Adjuvant, Incomplete Freund’s Adjuvant), 4개의 실험군으로서 1군 HSP90 다중펩타이드 백신군(HSP90 백신+immune adjuvant), 2군(HSP90 백신+CTLA-4 억제제; HSP90백신+CTLA-4 억제제+immune adjuvant), 3군(STING Agonist+CTLA-4 억제제; STING agonist+CTLA-4 억제제+immune adjuvant), 4군(HSP90 백신+STING agonist+CTLA-4 억제제)을 10일 간격으로 주사하였다. HSP90 백신 및 STING agonist (DMXAA, 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid, Invivogen제품)는 3회 피하 주사 및 복강 주사하였고, anti-mouse CTLA-4 (CD152, Bioxcell 제품)는 주 2회씩 실험이 끝날 때까지 복강주사를 실시하였다. 실험 기간 동안, 종양의 성장을 3~4일 간격으로 측정하였다. 마지막 투여 10일 후 마우스의 비장을 적출하여 비장세포를 분리하고 인터페론감마(IFNγ)-고착화효소항체법(EezymeLinked Immuno-SPOT assay, ELISPOT)을 이용하여 HSP90 다중 펩타이드 특이적인 T 세포 반응을 확인하였다. 마우스 비장 세포 준비 및 동결, ELISPOT 실험방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.Six-week-old female MMTVneu transgenic mouse flanks were injected subcutaneously with 5 × 10 5 mouse-derived breast cancer cells. After 10 days, 1 control group (PBS + immunoadjuvant; immune adjuvant; Complete Freund's Adjuvant, Incomplete Freund's Adjuvant), 4 experimental groups, group 1 HSP90 multipeptide vaccine group (HSP90 vaccine + immune adjuvant), group 2 (HSP90 vaccine + CTLA- 4 inhibitor; HSP90 vaccine + CTLA-4 inhibitor + immune adjuvant), group 3 (STING Agonist + CTLA-4 inhibitor; STING agonist + CTLA-4 inhibitor + immune adjuvant), group 4 (HSP90 vaccine + STING agonist + CTLA-4 Inhibitor) was injected at 10 day intervals. HSP90 vaccine and STING agonist (DMXAA, 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid, Invivogen) were administered three times subcutaneously and intraperitoneally, and anti-mouse CTLA-4 (CD152, Bioxcell) was tested twice a week. Intraperitoneal injection was performed until the end. During the experiment, tumor growth was measured at 3-4 day intervals. After 10 days of the last administration, the spleens of the mice were extracted to separate splenocytes, and HSP90 multi-peptide-specific T cell responses were confirmed by using an interferon-gamma (IFNγ) -fixed enzyme antibody (EISymeLinked Immuno-SPOT assay). Mouse spleen cell preparation and freezing, ELISPOT test method was carried out in the same manner as in Example 2.
4.2 HSP90 다중 펩타이드 백신 효과의 생물학적 표지자 측정4.2 Determination of Biological Markers of HSP90 Multiple Peptide Vaccine Effect
HSP90 다중 펩타이드 백신 효과의 생물학적 표지자로서 혈중 HER2 ECD(Human Epidermal growth factor Receptor type2 ExtraCellular Domain) 변화를 효소면역측정법 (EezymeLinked Immunosorbent assay, ELISA)에 의해 분석하였다. 구체적인 분석 방법은 다음과 같다. Human epidermal growth factor receptor type2 ExtraCellular Domain (HER2 ECD) changes in blood as biological markers of HSP90 multi-peptide vaccine effect were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The specific analysis method is as follows.
가. 실험 재료 end. Experimental material
a. 탄산염 완충액 (Carbonate buffer) : 1 리터 비커에 0.8g Na2CO3과 1.47g NAHCO3를 넣고 1차 증류수 400ml을 넣고 용해시킨 후, pH 9.6을 맞추고 1차 증류수를 500ml까지 채운다. 필터링 후 4℃에서 보관하였다.a. Carbonate Buffer (Carbonate buffer): 0.8g Na 2 CO 3 and 1.47g NAHCO 3 in a 1-liter beaker, add 400ml of first distilled water, dissolve, adjust the pH 9.6 and fill the first distilled water up to 500ml. After filtration it was stored at 4 ℃.
b. 희석 완충액 (Diluent buffer; 1X PBS / 1% BSA) : 10g BSA를 10x PBS에 100ml에 넣고 녹으면 1리터의 볼륨까지 1차 증류수를 추가하였다. filtering 후에 4℃에서 보관하였다. b. Diluent buffer (Diluent buffer; 1X PBS / 1% BSA): When 10g BSA was dissolved in 100ml in 10x PBS, the first distilled water was added to the volume of 1 liter. After filtering it was stored at 4 ℃.
c. 블랏킹 완충액 (Blocking Buffer ; 1X PBS / 5% BSA): 50g BSA를 10xPBS에 100ml에 넣고 녹으면 1리터의 볼륨까지 1차 증류수를 추가하였다. filtering 후에 4℃에서 보관하였다. c. Blocking Buffer (1 × PBS / 5% BSA): 50 g BSA was added to 10 ml of 10 × PBS and dissolved in primary distilled water up to a volume of 1 liter. After filtering it was stored at 4 ℃.
d. 세척 완충액 (Wash Buffer; 1xPBS / 0.1% Tween-20): 100ml 10xPBS, 1ml Tween-20 및 1차 증류수 899ml를 혼합하여 제조하였다. d. Wash Buffer (1 × PBS / 0.1% Tween-20): Prepared by mixing 100ml 10 × PBS, 1ml Tween-20 and 899ml primary distilled water.
e. 2차 항체 : Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP 2차 항체는 ThermoFisher scientific사(cat# 62-6520, 용량 1ml)로부터 구입하였다. 4℃에서 보관하였고, 사용 시에 세척 완충액을 사용하여 1:10,000으로 희석하였다. e. Secondary antibody: Goat anti-mouse IgG (H + L) HRP secondary antibody was purchased from ThermoFisher scientific (cat # 62-6520, dose 1ml). It was stored at 4 ° C. and diluted 1: 10,000 with wash buffer at the time of use.
f. 마우스 IgG 표준 항체: 마우스 IgG 표준 항체는 Sigma 사(cat# I-4506)로부터 구입하였다. 구입 후에, 항체는 150 mM NaCl를 희석 완충액으로 사용하여 최종 농도 2 mg/ml로 만들어서 -20℃에 보관하였다. f. Mouse IgG Standard Antibodies: Mouse IgG standard antibodies were purchased from Sigma (cat # I-4506). After purchase, the antibody was stored at −20 ° C. in a final concentration of 2 mg / ml using 150 mM NaCl as the dilution buffer.
g. TMB 용액: TMB 용액 Sigma사(cat# T0440)에서 구입한 후, 4℃에서 보관하였다. g. TMB solution: TMB solution purchased from Sigma (cat # T0440), and stored at 4 ℃.
h. 1N HCl 반응정지액(stop solution) : 1차 증류수 481.8 ml에 38% HCl 18.2 ml를 조심스럽게 천천히 조금씩 첨가하여 스톡 용액(stock solution)을 제조하여 상온에 보관하였다. h. 1N HCl stop solution: 38. HCl 18.2 ml carefully and slowly added to 481.8 ml of first distilled water to prepare a stock solution (stock solution) and stored at room temperature.
나. 실험 방법 및 결과 I. Experiment method and result
하기의 단계를 거쳐 ELISA 실험을 진행하였다. 단계 1 및 단계 2는 얼음 조건에서 실시하였다. The ELISA experiment was carried out through the following steps. Steps 1 and 2 were carried out under ice conditions.
탄산염 완충액을 A 튜브에는 2.5ml, 나머지 튜브에는 1ml씩 분주한다. 그리고 A 튜브에 마우스 IgG 스톡 용액 (2mg/ml) 10ul를 첨가한다. 보텍싱을 실시하고 A 튜브에서 1ml을 B 튜브로 옮겨서(1:1 dilution) B->C, C->D 순서로 L까지 1:1로 희석을 실시하였다(단계 1) . Dispense carbonate buffer 2.5 ml into the A tube and 1 ml into the remaining tube. And 10ul of mouse IgG stock solution (2mg / ml) is added to the A tube. After vortexing, 1 ml of the A tube was transferred to the B tube (1: 1 dilution) and diluted 1: 1 to L in the order of B-> C and C-> D (step 1).
신선한 탄산염 완충액을 이용하여 1ug/ml 농도의 HSP90 재조합 단백질을 제조하였다. 상기 HSP90 재조합 단백질은 Coat column #1 ~ #10에 well 당 50ul씩 분주하였다. column #11에는 carbonate buffer만을 분주하였고, Microseal로 plates를 덮어준 후 4℃에서 하룻밤 동안 항원-항체 반응을 실시하였다(단계 2). 200ul 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였고, 3회 세척시에는플레이트를 페이퍼 타올에 조심히 털어서 세척 버퍼를 완전히 제거하였다(단계 3). 그 다음 블랏킹 용액을 웰당 100ul씩 분주하고 상온에서 1~2 시간 동안 반응시켰다(단계 4). 상기 단계 3과 같은 세척을 실시하였다(단계 5). 새로운 1.5ml 튜브에 희석 버퍼: 세럼을 1:1 비율로 혼합하여 보텍싱 후 각각의 웰에 50ul씩 분주하였다(단계 6). 플레이트 컬럼 #11 및 #12에 희석 버퍼 50ul를 분주하였다(단계 7). 마이크로실( microseal)을 사용하여 플레이트를 덮어준 후, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다(단계 8). 상기 단계 3과 같은 세척을 실시하였다(단계 9). HRP 컨쥬게이트 항체를 희석 버퍼를 사용하여 1:10,000로 희석하였고, 웰당 50ul씩 분주한 다음 상온에서 45 분 동안 교반하면서 반응시켰다(단계 10). 상기 단계 3과 같은 세척을 실시하였다(단계 11). TMB 용액을 상온으로 꺼내어 준비해 둔 다음, TMB 용액을 각각의 웰당 100ul씩 분주하였고, 빛이 없는 상온에서 20분 동안 반응시켰다.(단계 12). 반응정지액을 각각 웰당 50ul씩 분주하였다(단계 13). 마이크로플레이트 리더 기기를 사용하여 450nm에서 형광세기를 측정하였다(단계 14).HSP90 recombinant protein was prepared at a concentration of 1 ug / ml using fresh carbonate buffer. The HSP90 recombinant protein was dispensed by 50ul per well in Coat columns # 1 ~ # 10. In column # 11, only carbonate buffer was dispensed, and the plates were covered with microseal and the antigen-antibody reaction was performed overnight at 4 ° C (step 2). Wash three times with 200ul wash buffer and wash wash plate thoroughly with paper towels to remove wash buffer completely (step 3). The blocking solution was then dispensed by 100ul per well and reacted for 1 to 2 hours at room temperature (step 4). The same washing as in step 3 was performed (step 5). Dilution Buffer: Serum was mixed in a fresh 1.5 ml tube in a 1: 1 ratio and vortexed to 50 ul in each well (step 6). 50ul of dilution buffer was dispensed into plate columns # 11 and # 12 (step 7). The plate was covered with a microseal and then reacted overnight at 4 ° C. (step 8). The same washing as in step 3 was performed (step 9). HRP conjugated antibody was diluted 1: 10,000 using dilution buffer, 50ul per well was dispensed and reacted with stirring for 45 minutes at room temperature (step 10). The same washing as in step 3 was performed (step 11). The TMB solution was taken out to room temperature, prepared, and then 100 μl of each TMB solution was dispensed and reacted for 20 minutes at room temperature without light (step 12). Each reaction stop solution was dispensed 50ul per well (step 13). Fluorescence intensity was measured at 450 nm using a microplate reader instrument (step 14).
HSP90 다중 펩타이드 백신 투여 후 HER2 ECD 혈중 농도 변화를 효소면역측정법(EezymeLinked Immunosorbent assay, ELISA)으로 측정한 결과, 본 발명에 따른 HSP90 백신을 사용한 결과 HER2 ECD가 낮게 측정되었다. After administration of the HSP90 multi-peptide vaccine, the HER2 ECD blood concentration change was measured by an enzyme immunoassay (EezymeLinked Immunosorbent assay, ELISA). As a result of using the HSP90 vaccine according to the present invention, the HER2 ECD was low.
4.3 HSP90 다중 펩타이드 백신의 병용 투여에 의한 효과4.3 Effect by Concomitant Administration of HSP90 Multiple Peptide Vaccines
실험 결과, 마우스 모델에서 대조군, 1군(HSP90 다중 펩타이드 백신군), 2군(HPS90 다중 펩타이드 백신+CTLA-4 억제제) 및 3군(STING agonist+CTLA-4 억제제)에 비해 4군(HSP90 다중 펩타이드 백신+STING agonist+CTLA-4 억제제)을 병합 치료하는 경우 종양크기가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4a). 또한, 대조군에 비해 모든 실험군에서 HER2-ECD 반응성이 감소하는 것을 확인하였다(도 4b). HSP90 펩타이드 반응은 4군(HSP90 다중 펩타이드 백신+STING agonist+CTLA-4 억제제)에서 인터페론감마(IFN-γ) 분비에 의해 더 많은 특이(specific) 반응성을 나타내었다(도 4c). 이를 통해, 본 발명의 HSP90 펩타이드 백신을 STING agonist / CTLA-4 엑제제를 병합 치료함으로써 HSP90 펩타이드 백신의 효과가 증감하므로 HSP90 펩타이드를 백신으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.Experimental results showed that in the mouse model, group 4 (HSP90 multiple) compared to control group 1 (HSP90 multiple peptide vaccine group), group 2 (HPS90 multiple peptide vaccine + CTLA-4 inhibitor) and group 3 (STING agonist + CTLA-4 inhibitor) Peptide vaccine + STING agonist + CTLA-4 inhibitor) was confirmed that the tumor size is significantly reduced (Fig. 4a). In addition, it was confirmed that the HER2-ECD reactivity is reduced in all experimental groups compared to the control group (Fig. 4b). The HSP90 peptide response showed more specific reactivity by interferongamma (IFN-γ) secretion in group 4 (HSP90 multiple peptide vaccine + STING agonist + CTLA-4 inhibitor) (FIG. 4C). Through this, it can be seen that the HSP90 peptide vaccine can be used as a vaccine since the effect of the HSP90 peptide vaccine is increased and decreased by combining and treating the HSP90 peptide vaccine of the present invention with a STING agonist / CTLA-4 exogenous agent.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that these specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. will be. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.