WO2019141744A1 - Utilisation d'hémoglobine d'annélides comme bactéricide, notamment pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale - Google Patents

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Definitions

  • Annelides hemoglobin as a bactericide, in particular for preventing and / or treating periodontal disease
  • the present invention relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, as a bactericidal agent.
  • the present invention also relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, for preventing and / or treating periodontal disease.
  • Periodontal diseases are diseases of infectious origin (bacteria), which affect and destroy the supporting tissues of the teeth forming the periodontium.
  • the periodontium consists of four tissues: the gingiva, the alveolar bone, the alveolo-dental ligament and the cementum.
  • gingivitis When periodontal disease is limited to the gum, it is called gingivitis.
  • gingivitis When periodontal disease is limited to the gum, it is called gingivitis.
  • Periodontitis When it affects the entire periodontium, it is called periodontitis.
  • Periodontal diseases are quite slow and evolve over several decades. They are mainly due to dental plaque (i.e. accumulation of food debris and bacteria) that adheres to the surface of the tooth located under the rim of the gingiva. Tartar is the calcification of this dental plaque. It is colonized by pathogenic bacteria. The stagnation of the bacteria in the dental plaque is at the origin of an inflammatory reaction on the gums and the bone, inducing as and when months and years their destruction.
  • a biofilm is an essential step in the onset of periodontal diseases. It is hierarchical, first colonization of the mouth surfaces by primary colonizers with ligands and nutrients present in the environment, then by secondary or late colonizers such as Porphymonas gingivalis (P. gingivalis) and Treponema denticola (T. denticola) whose installation in the biofilm is favored by the primary colonizers.
  • Some periodontopathogenic species have been identified as being mainly associated with periodontal diseases, and form what is known as the "red complex": they are P. gingivalis, T. denticola and T. forsythia.
  • Primary colonizers include Streptococcus gordonii. This bacterium is part of the commensal bacteria of the oral environment. It is a Gram-positive shell belonging to the phylum Firmicutes, facultative aerobic-anaerobic.
  • P. gingivalis belongs to the phylum Bacteroidetes; it is a coccobacillus gram-negative, strict anaerobic, aerotolerant, proteolytic, and encapsulated. P. gingivalis is mainly found in the oral environment at subgingival sites, but can be isolated in low numbers in saliva and oral mucosa.
  • T. denticola like P. gingivalis, is a bacterium belonging to the "red complex" and therefore responsible for periodontitis. It belongs to the phylum Spirochaetaceae; it is a Gram-negative spirochete, anaerobic strict, motile.
  • Gingivitis can regress completely. Periodontitis can be stabilized. But only strict dental hygiene will prevent recurrence.
  • Annelides extracellular hemoglobin in particular Arenicola marina, has anti-biofilm activity.
  • the extracellular hemoglobin of Arenicola marina has a bactericidal effect on planktonic cultures of P. gingivalis and T. denticola.
  • S. gordonii is able to further inhibit the growth of P. gingivalis in the presence of this hemoglobin.
  • this hemoglobin seems to favor detachment of P. gingivalis and T. denticola cells.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, in particular Arenicola marina seems to exhibit bactericidal activity with respect to Gram-negative bacteria and pathogens, especially for humans.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides in particular Arenicola marina, has a bactericidal activity with respect to strict anaerobic bacteria, in particular by the supply of oxygen.
  • the present invention thus relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular hemoglobin from Annelides, as a bactericidal agent vis-à-vis -vis Gram-negative bacteria and pathogenic for humans.
  • Pathogenic bacteria are bacteria that cause disease even in healthy people.
  • Gram-negative bacteria are identified by the Gram staining technique: the thick-walled bacteria are stained purple and called “Gram-positive”, while the thin-walled bacteria are stained red and called “Gram-positive” negative".
  • the molecule chosen from the oxygen carriers of marine invertebrate animals preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, according to the invention, can thus be used as an antibiotic vis-à- Gram-negative bacteria and pathogens for humans.
  • the gram-negative bacteria are chosen in particular from P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, G. meningitidis, E. coli, H. influenzae, P. aeruginosa, B. pertussis, L. pneumoniae and H. pylori.
  • Gram-negative bacteria and pathogens for humans are strict anaerobes. More preferably, it is P. gingivalis and / or T. denticola. Such bacteria are especially present in the periodontal pockets. These bags are hypoxic, and therefore have favorable conditions for the proliferation of these strict anaerobic bacteria.
  • the molecule chosen from the oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably selected from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, according to the invention, may also be used to treat various disorders induced by such bacteria.
  • it can be used to prevent and / or treat bad breath (or halitosis), and / or to whiten teeth.
  • the present invention also relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, for preventing and / or treating periodontal disease.
  • the present invention thus also relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, to prevent and / or treat halitosis.
  • the present invention also relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, for whitening teeth.
  • the present invention also relates to the use of a molecule chosen from oxygen carriers of marine invertebrate animals, preferably chosen from a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, for treating wounds caused by Gram-negative bacteria and pathogens for humans.
  • the periodontal disease is selected from gingivitis, periodontitis, periodontal recessions and periodontal abscess.
  • the molecule according to the invention is chosen from the oxygen carriers of marine invertebrate animals.
  • an Annelides globin is selected from an Annelides globin, an Annelides globin protomer and an Annelides extracellular hemoglobin.
  • oxygen carrier is meant any molecule capable of reversibly transporting oxygen from the environment to the target cells, tissues or organs.
  • the oxygen carrier according to the invention is derived from marine invertebrate animals.
  • Marine invertebrate animals include Annelids, molluscs, brachiopods and crustaceans.
  • the oxygen carrier of marine invertebrate animals is a metalloprotein.
  • the oxygen carrier of marine invertebrate animals is selected from hemoglobins, globin protomers, globins, hemerythrins, myohemerythrins, chlorocruorines, erythrocruorines and hemocyanines.
  • Hemoglobins, globin protomers and globins are preferably from Annelids.
  • Hemi-myrithrins and myo-myrithrins are preferably brachiopods or Annelids (Polychaetes).
  • Chlorocruorines and erythrocruorines are preferably from Polychaeta Annelidae.
  • haemocyanins preferably come from molluscs or crustaceans.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is present in the three classes of Annelids: Polychaetes, Oligochaetes and Achetes. We speak of extracellular hemoglobin because it is naturally not contained in a cell, and can therefore circulate freely in the blood system without chemical modification to stabilize or make it functional.
  • Annelides extracellular hemoglobin is a giant biopolymer of molecular weight between 2000 and 4000 kDa, consisting of about 200 polypeptide chains between 4 and 12 different types that are generally grouped into two categories.
  • the first category comprising 144 to 192 elements, groups together so-called "functional" polypeptide chains which carry an active heme-type site and are capable of reversibly binding oxygen; they are globin chains (eight types in total for Arenicola marina hemoglobin: a1, a2, b1, b2, b3, c, d1 and d2), whose masses are between 15 and 18 kDa. They are very similar to type a and b chains of vertebrates.
  • the second category containing between 36 and 42 elements, groups polypeptide chains called “structure” or “linkers” with little or no active site but allowing the assembly of subunits called twelfths or protomers.
  • linkers There are two types of linkers, L1 and L2.
  • Each molecule of hemoglobin consists of two superimposed hexagons which are called hexagonal bilayer and each hexagon is itself formed by the assembly of six subunits (dodecamer or protomer) in the form of 'water.
  • the native molecule consists of twelve of these subunits (dodecamer or protomer).
  • Each subunit has a molecular weight of about 250 kDa and is the functional unit of the native molecule.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is selected from the extracellular hemoglobins of polychaete annelids and the extracellular hemoglobins of Oligochaete annelids.
  • the extracellular hemoglobin of Annelids is selected from extracellular hemoglobins of the family Lumbricidae, extracellular hemoglobins of the Arenicolidae family and extracellular hemoglobins of the family Nereididae.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides is chosen from the extracellular hemoglobin of Lumbricus terrestris, the extracellular hemoglobin of Arenicola sp and the extracellular hemoglobin of Nereis sp, more preferably the extracellular hemoglobin of Arenicola marina or from Nereis virens.
  • the arenicola Arenicola marina is a polychaete annelid worm living mainly in the sand.
  • the globin protomer of Annelides extracellular hemoglobin constitutes the functional unit of native hemoglobin, as indicated above.
  • the globin chain of Annelides extracellular hemoglobin can be chosen in particular from the Ax and / or Bx globin chains of Annelides extracellular hemoglobin.
  • Annelides extracellular hemoglobin, its globin protomers and / or globins do not require a cofactor to function, unlike mammalian hemoglobin, especially human hemoglobin.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, its protomers of globin and / or its globins not having a blood typing, they make it possible to avoid any problem of immunological reaction.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and / or globins have intrinsic superoxide dismutase (SOD) activity. Therefore, this intrinsic antioxidant activity does not require any antioxidant to function, unlike the use of a mammalian hemoglobin for which the antioxidant molecules are contained inside the red blood cell and are not related to hemoglobin. This SOD activity makes the molecule particularly effective in the treatment of halitosis.
  • the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and / or globins may be native or recombinant.
  • the oxygen carrier of marine invertebrate animals preferably globin, the globin protomer or the extracellular hemoglobin of Annelides
  • a composition comprising a buffer solution.
  • the oxygen carrier of marine invertebrate animals preferably globin, the globin protomer or the extracellular hemoglobin of Annelides
  • such a composition consists solely of the oxygen carrier of marine invertebrate animals, preferably a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, and a buffer solution.
  • the formulation of the oxygen carrier of marine invertebrate animals preferably globin, globin protomer or Annelides extracellular hemoglobin, in liquid form indeed has the advantage of being more easily administered.
  • Said buffer solution creates a saline environment suitable for the transporter and in particular hemoglobin, its protomers and globins, and thus allows the maintenance of the quaternary structure, and therefore the functionality of this molecule. Thanks to the buffer solution, the transporter and in particular hemoglobin, its protomers and globins are capable of performing their oxygenation function.
  • the buffer solution according to the invention is preferably an aqueous solution comprising salts, preferably chloride, sodium, calcium, magnesium and potassium ions, and gives the composition according to the invention a pH of between 6.5 and 7.6; its formulation is similar to that of a physiologically injectable liquid. Under these conditions, the extracellular hemoglobin of Annelides, its globin protomers and globins remain functional.
  • the pH is understood to ambient temperature (25 ° C) unless otherwise specified.
  • the buffer solution is an aqueous solution comprising sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, potassium chloride, as well as sodium gluconate and sodium acetate, and has a pH of between 6.5 and 7.6. preferably equal to 7.1 ⁇ 0.5, preferably about 7.35.
  • the buffer solution is an aqueous solution comprising 90 mM NaCl, 23 Mm Na-gluconate, 2.5 mM CaCl 2 , 27 mM Na-acetate, 1.5 mM MgCl 2 , 5 mM KOI and has a pH of 7.1 ⁇ 0.5, which may contain between 0 and 100 mM of ascorbic acid antioxidant and / or reduced glutathione.
  • the composition is administered to the subject parenterally, preferably by injection or infusion; or topically on the gums and / or teeth.
  • the composition may be administered to the subject in gel form.
  • This gel may for example be present in a gutter that will be applied to all the teeth of the upper jaw or the lower jaw. It can also be applied as it is to the teeth and / or gums.
  • a gel thus comprises at least one oxygen carrier of marine invertebrate animals, preferably a globin, a globin protomer or an extracellular Annelides hemoglobin, and a hydrophilic matrix.
  • the hydrophilic matrix comprises in particular at least one gelling agent.
  • Such a gel preferably comprises at least one oxygen carrier of marine invertebrate animals, preferably a globin, a globin protomer or an extracellular hemoglobin from Annelides, a buffer solution and a gelling agent that is not a hydrocolloid .
  • the gelling agent is chosen from xanthan gum, guar gum and its derivatives (hydroxypropyl guar for example).
  • the composition comprising the oxygen carrier of marine invertebrate animals, preferably hemoglobin, its protomers or globins, and the buffer solution is administered as such.
  • the hemoglobin, its protomers or globins is present in a composition comprising a buffer solution, preferably an aqueous solution comprising salts, and conferring on the composition a pH of between 6.5 and 7.6.
  • the composition contains only the oxygen carrier of marine invertebrate animals, preferably hemoglobin, its protomers or globins, and a buffer solution consisting of aqueous solution comprising salts, and conferring on the composition a pH of between 6.5 and 7.6.
  • the galenic administration is therefore quite simple and effective.
  • TDC60 Porphyromonas gingivalis strain TDC60 (JCM19600) from RIKEN BioResource Center, Japan, Treponema denticola strain ATCC® 35405 and Streptococcus gordonii strain Challis CH1 ATCC®35105 (Lunsford and London, 1996).
  • Strains of T. denticola and P. gingivalis were cultured in liquid medium defined for their growth, MMBC-S medium, the composition of which is shown in Table 1.
  • Table 1 Composition of the medium defined for the growth of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola (MMBC-S)
  • the S. gordonii strain was cultured in liquid medium defined for growth, MMBC-4 medium, composed of all elements of the MMBC-S medium shown in Table 1 and the various additions shown in Table 2.
  • HbAm hemoglobin of Arenicola marina
  • the experiment was carried out anaerobically in vials set with a cap allowing the injection of HbAm via a syringe through a sealed septum, this in order to maintain the bacteria anaerobically in the thermostated chamber, while retaining the maximum Oxygenation of HbAm inside the syringe prepared under aerobic conditions.
  • the solution containing the molecule was injected directly into the bacterial culture.
  • the MMBC-S or MMBC-4 media are inoculated at an initial OD600nm of 0.1 in a final volume of 2 mL.
  • the cultures were previously incubated anaerobically for 1 h 30 or 24h respectively for P. gingivalis or T.
  • the fluorescences of the two different markers were measured by spectrofluorometry at excitation and emission wavelengths of 380 nm and 440 nm respectively for the Syto 40 and the excitation and emission wavelengths of 480. nm and 650 nm respectively for propidium iodide using the POLARstar OMEGA plate reader (BMG LABTECH). The ratios of fluorescence intensities of Syto 40 to those of propidium iodide were then calculated to analyze bacterial survival in the presence of HbAm.
  • RNA stabilizing agent RNA protect Bacteria Reagent, Quiagen
  • the bacterial pellets were resuspended in TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) containing 20 mg / mL of lysozyme and 2 mg / mL of proteinase K in order to proceed with their enzymatic lysis. After incubation for 30 minutes at 37 ° C., the mixtures were deposited on acid-treated glass beads (Sigma-Aldrich) and subjected to 3 cycles of 45 seconds at a speed of 6.5 m / s (Fastprep®). FP120 Cell Disrupter, BIO 101 ThermoSavant) to mechanically lyse bacterial cells.
  • RNA samples were extracted from the lysates obtained using the NucleoSpin® RNA kit (Macherey-Nagel) according to the supplier's recommendations. DNA was removed from the samples by digestion with RQ1 DNase (Promega) following the supplier's recommendations. The RNA was then column purified by the RNA Clean & Concentrator TM Kit (Zymo Research) according to the supplier's recommendations and was spectrophotometrically assayed at 260 nm (Nanodrop MD-1000® ThermoScientific). In order to verify the absence of DNA in the purified extracts, a PCR (cf below) was carried out using primers specific for the 16S DNA of each bacterial species (Table 4). c) Polymerase Chain Reaction Amplification (PCR)
  • PCR reactions were performed following the protocol of the supplier of the polymerase One-Taq® 25 U / pL (NEB) with a thermal cycler C1000 (BioRad). The reaction was carried out on a final volume of 25 ⁇ L, each tube containing 12.5 ⁇ L of the Mix One-Taq 2X, 0.5 ⁇ L of each of primers R and L (Table 4) concentrated at 5 ⁇ M, as well as 0.5 ⁇ l of the sample to be analyzed, all supplemented to 25 ⁇ l with sterile RNase free water.
  • the PCR was performed as follows:
  • PCR products were then demonstrated on a 2% (w / v) agarose gel (Eurobio) carried out with TAE buffer 50X migration buffer (Biosolve) in the presence of an intercalator with DNA, the DNA Dye NonTox (AppliChem). Size markers, DNA ladder 2log (New England Biolabs), from 1 kB to 50 bp, were used to check the size of the amplified sequence. The revelation and the photograph of the gels were carried out after exposure to UV (365 nm) on a UVIDOC transilluminator (UVITEC Cambridge). d) Reverse transcription (RT)
  • RNA was transformed into cDNA by reverse transcription with the ProtoScript TM II Reverse Transcriptase Kit (New England Biolabs) following the provider's protocol. The Reaction was carried out with an RNA template of greater than 40 ng concentration, in a mixture of 20 mI containing 1 mI of dNTPs concentrated at 10 mM, 2 mI of Random Primer Mix primers (New England Biolabs) concentrated at 60 mM.
  • the list of primers used in this study is presented in Table 4.
  • the qPCRs were carried out with the SYBR GREEN / ROX kit (Eurogentec), according to the supplier's recommendations in a final volume of 12.5 ⁇ L, each tube containing 6.25 ⁇ l of the SYBR GREEN 2X Mix, 1 ⁇ l of each of the R and L primers concentrated at 5 mM, and 1 ⁇ l of the sample to be analyzed between 0.001 ng / ⁇ L and 10 ng / ⁇ L, all supplemented. 6.25 ⁇ l with sterile RNase free water.
  • the amplification reactions were carried out on a StepOne Plus (Applied Biosystems) apparatus, according to the following program: 2 minutes at 50 ° C., 10 minutes at 95 ° C., 40 cycles composed of a denaturation step of 15 seconds at 95 ° C, a 60 s hybridization and elongation step at 60 ° C.
  • a melting curve was performed after each amplification (15 seconds at 95 ° C, one minute at 60 ° C followed by a temperature gradient of 60 to 95 ° C and 15 seconds at 95 ° C).
  • the efficiencies of the RTSgo and spxB primers were determined by qPCR over a 16S DNA calibration range of Sg using the formula -
  • spxB primary spxB, Zheng et al., 201 1
  • the evaluation of the growth inhibition of P. gingivalis by S. gordonii was carried out on a solid medium following an adaptation of the method of Herrero et al., (2016).
  • the rich BHI medium was replaced by the medium MMBC-4, controlled medium defined for the growth of S. gordonii, so that the elements present in the rich medium do not interfere with the experiment.
  • This test is carried out by inoculation of 7 ⁇ l of concentrated S. gordonii at 10 9 CFU / ml on agar medium and its anaerobic incubation for 24 h, followed by inoculation of 7 ⁇ l of P. gingivalis concentrate at 10 9 CFU / mL at 5 mm from the edge of the S. gordonii deposit.
  • the agar plates were incubated anaerobically for 3 days before observation.
  • the evaluation of the inhibition is carried out by measuring the distance between the edge of the deposit formed by the inhibitory bacteria (S. gordonii) and the edge of the deposit formed by the target bacteria (P. gingivalis).
  • This experiment was done in two different ways.
  • S. gordonii was inoculated on 3 types of agar medium, MMBC-4 medium alone, MMBC-4 medium in the presence of 2 g / L HbAm and MMBC-4 medium in the presence of an equivalent quatity of stabilization buffer tsHbAm.
  • S. gordonii was incubated in liquid MMBC-4 alone, MMBC-4 containing 2 g / L HbAm or MMBC-4 containing an equivalent amount of tsHbAm before inoculation on MMBC-4 agar medium as described. previously.
  • the culture supernatants of the biofilms were removed and the biofilms were washed with PBS.
  • the labeling was made using a solution composed of a mixture of Syto 40 (5 mM) and propidium iodide (40 mM).
  • the observation of biofilms was carried out after 24 hours of growth on the "microscopy photonic" platform of the "Microscopy Rennes Imaging Center” (SFR BIOSIT, Rennes) using a Leica TCS-SP8 confocal microscope (Leica Microsystems, Wezlar, Germany).
  • a 63x immersion lens was used for image capture and a 1.5 zoom was applied.
  • the detection of the fluorescence emitted by the Syto 40 marker of all the cells was carried out by excitation at 405 nm and collection of the fluorescence emitted between 420 and 475 nm. 514 nm excitation allows detection of propidium iodide staining of dead cells between 620 and 650 nm.
  • the biofilm images were acquired at 0.5 pm intervals and were scanned at a frequency of 400 Hz.
  • the Leica software (LAS AF V.2.2.1) was used for microscope control and image acquisition. .
  • the qualitative analysis of the images was performed using the ImageJ software V1 .43m, COMSTAT2 (Heydorn et al., 2000). Biomass was determined by sum of biomasses evaluated by Syto 40 labeling and by propidium iodide labeling.
  • the bacteria in the starting inoculum and bacteria detached from the biofilm were centrifuged at 7000g, 20 ° C for 10 minutes with resuspension of the bacterial pellet in PBS to remove the MMBC-4 medium and treatments.
  • the sessile bacteria composing the biofilm were resuspended in PBS.
  • the bacteria were then heated to 95 ° C and quantified by qPCR using 16S primers specific for each species as described above.
  • the stabilization buffer of the HbAm molecule does not significantly affect the growth and survival of P. gingivalis. Indeed, the counts expressed in log (CFU / mL) are similar with or without stabilization buffer, from 10 9 CFU / mL at the beginning of the experiment to 4.10 9 CFU / mL after 2 hours of exposure. There is no significant difference after 4h exposure with 6.3.10 9 CFU / mL in MMBC-S alone and 5.10 9 CFU / mL in the presence of tsHbAm. The stabilization buffer was therefore used as the only negative control in the three experiments carried out thereafter.
  • a decrease in the concentration of CFU was observed by 2 hours of exposure to the bacteria exposed to HbAm to 2 g / L (2.5x10 9 CFU / mL) compared to control samples containing only the stabilizing buffer tsHbAm (4.10 9 CFU / mL), or 35% mortality with HbAm.
  • the effect is amplified after 4h post-exposure with 49% mortality in the exposure condition with HbAm.
  • the HbAm molecule therefore has an effect on survival or division of bacteria from 2h and this effect is increased with the incubation time.
  • HbAm has a bactericidal effect on P. gingivalis. c) Effect of HbAm on the survival of T. denticola
  • the colony counting method and the fluorimetric method with LIVE / DEAD probes make it possible to obtain consistent results for P. gingivalis.
  • the LIVE / DEAD method was therefore used for T. denticola.
  • the HbAm molecule significantly reduces the level of living cells to 70% in cultures 4 h after injection of the molecule.
  • HbAm therefore has a bactericidal effect on T. denticola.
  • S. gordonii is known to produce I ⁇ 202 by pyruvate oxidase SpxB in the presence of oxygen and pyuvate.
  • H202 is toxic to P. gingivalis.
  • inhibition experiments on agar medium were performed. The results show that in MMBC-4 agar media alone or containing 2 g / L of HbAm or with an equivalent volume of tsHbAm stabilization buffer, inocula of P. gingivalis incubated in the vicinity of S. gordonii appear to have a cell density lower than inocula of P. gingivalis incubated alone for the same media.
  • S. gordonii therefore appears to produce more growth inhibitors of P. gingivalis when exposed to HbAm at 2 g / L. b) Effect of HbAm on spxB gene expression in S. gordonii
  • the gene encoding pyruvate oxidase is spxB.
  • a quantification of the relative expression of this gene with respect to the rpoB household gene was carried out using a RT-qPCR .
  • the value of 2 DDa is 14.2 on average, meaning a 14-fold greater expression of spxB with HbAm. HbAm would therefore provide a sufficient amount of oxygen to significantly increase the expression of spxB in S. gordonii grown under anaerobic conditions.
  • the LIVE / DEAD superimpositions established by confocal microscopy show a stronger red staining of MMBC-4 bacteria exposed to HbAm (1% alive / 99% dead) than for bacteria exposed to buffer only stabilizing tsHbAm (8% alive / 92% dead) which would suggest that the cells of the biofilm exposed to HbAm have suffered damage to their membrane permitting the penetration of propidium iodide in their cytoplasm. Nevertheless, it should be noted that the percentage of dead cells without HbAm is high.
  • the biomass as well as the average thickness of the biofilm is lower after treatment of the biofilm with HbAm than for treatments with solubilization buffer alone (tsHbAm) or with ethanol 70 %.
  • the proportion of cells detached from the biofilm after treatment is higher after treatment with HbAm (44%) compared to tsHbAm alone (2%).
  • the 70% ethanol treatment also induces a large detachment of bacteria with 51% of cells detached under this condition.
  • the bacterial quantifications show that with tsHbAm and especially HbAm, the species found in detached cells of the biofilm are mainly T. denticola and P. gingivalis whereas for the biofilms treated with ethanol 70% it is S. gordonii which is found in high percentage in detached cells. HbAm would therefore cause the detachment of cells from the biofilm, and would have an effect mainly on P. gingivalis and T. denticola.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une molécule choisie parmi les transporteurs d'oxygène d'animaux invertébrés marins, de préférence parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d'Annélides, comme bactéricide, notamment pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale.

Description

Utilisation d’hémoglobine d’Annélides comme bactéricide, notamment pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale
La présente invention concerne l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, comme agent bactéricide. La présente invention concerne également l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale.
Les maladies parodontales sont des maladies d’origine infectieuse (bactéries), qui touchent et détruisent les tissus de soutien des dents formant le parodonte. Le parodonte est constitué de quatre tissus : la gencive, l’os alvéolaire, le ligament alvéolo-dentaire et le cément. Lorsque la maladie parodontale se limite à la gencive, on parle de gingivite. Lorsqu’elle touche l’ensemble du parodonte, on parle de parodontite.
Les maladies parodontales sont assez lentes et évoluent sur plusieurs dizaines d’années. Elles sont essentiellement dues à la plaque dentaire (i.e. accumulation de débris alimentaires et de bactéries) qui adhère à la surface de la dent située sous le rebord de la gencive. Le tartre est la calcification de cette plaque dentaire. Il est colonisé par des bactéries pathogènes. La stagnation des bactéries dans la plaque dentaire est à l’origine d’une réaction inflammatoire sur les gencives et l’os, induisant au fur et à mesure des mois et des années leur destruction.
Comme indiqué précédemment, la formation d’un biofilm est une étape essentielle dans l’apparition des maladies parodontales. Elle se fait de manière hiérarchique, avec d’abord la colonisation des surfaces buccales par des colonisateurs primaires grâce à des ligands et des éléments nutritifs présents dans l’environnement, puis par des colonisateurs secondaires ou tardifs comme Porphymonas gingivalis (P. gingivalis) et Treponema denticola (T. denticola) dont l’installation dans le biofilm est favorisée par les colonisateurs primaires. Certaines espèces parodontopathogènes ont été identifiées comme étant principalement associées aux maladies parodontales, et forment ce que l’on appelle le « complexe rouge » : il s’agit de P. gingivalis, T. denticola et T. forsythia. Parmi les colonisateurs primaires, on retrouve Streptococcus gordonii. Cette bactérie fait partie des bactéries commensales de l’environnement buccal. C’est un coque à Gram positif appartenant au phylum des Firmicutes, aérobie-anaérobie facultatif.
P. gingivalis appartient au phylum Bacteroidetes ; c’est un coccobacille à Gram-négatif, anaérobie strict, aérotolérant, protéolytique, et encapsulé. P. gingivalis est principalement retrouvé dans l’environnement buccal au niveau des sites sous-gingivaux, mais peut être isolé en faible nombre dans la salive et sur les muqueuses buccales.
T. denticola, au même titre que P. gingivalis, est une bactérie appartenant au « complexe rouge » et de ce fait, responsable de parodontites. Elle appartient au phylum Spirochaetaceae ; c’est un spirochète à Gram négatif, anaérobie strict, motile.
Une coopération métabolique entre P. gingivalis et T. denticola a également été démontrée (Meuric et al., 2013; Yamada et al., 2005) mettant en jeu des protéases qui permettent la libération par une espèce de substrats utilisables par l’autre espèce.
Les traitements des maladies parodontales sont distincts et plus ou moins complexes selon le stade de la maladie : en cas de gingivite, un détartrage et une bonne hygiène dentaire, éventuellement complétés par une antibiothérapie, généralement suffisent.
En revanche, quand la maladie parodontale évolue vers la parodontite, l’accumulation de la plaque dentaire entre la gencive et la dent entraîne une perte d’attache de la gencive et une résorption de l’os qui entoure la dent. Ce phénomène est à l’origine de la formation de poches parodontales entre la gencive, la dent et l’os. On observe un début de destruction de l’os sous-jacent. En outre, la formation de ces poches favorise l’accumulation de la plaque dentaire qui aggrave la résorption de l’os. On entre alors dans un cercle vicieux. Le traitement consiste dans ce cas à effectuer un surfaçage radiculaire (au besoin sous anesthésie locale) qui vise à éliminer la plaque dentaire et le tartre situés sous la gencive. L'objectif de ce traitement est de provoquer une ré-attache entre la gencive et les surfaces des racines précédemment exposées. Des chirurgies parodontales peuvent également être envisagées.
La gingivite peut régresser complètement. La parodontite pourra être stabilisée. Mais seule une hygiène dentaire rigoureuse permettra d’éviter la récidive.
Il existe donc un besoin pour un traitement efficace des maladies bactériennes, et notamment parodontales, et notamment des parodontites.
Les inventeurs ont maintenant découvert que, de façon surprenante, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, en particulier d’Arenicola marina, a une activité anti-biofilm. En effet, comme démontré en exemple, il apparaît que l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina a un effet bactéricide sur des cultures planctoniques de P. gingivalis et T. denticola. En outre, S. gordonii est capable d’inhiber de manière plus importante la croissance de P. gingivalis en présence de cette hémoglobine. Enfin, dans un modèle in vitro de biofilm buccal composé de S. gordonii (colonisateur primaire), P. gingivalis et T. denticola (parodontopathogènes), cette hémoglobine semble favoriser le détachement des cellules de P. gingivalis et T. denticola. En conclusion, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, en particulier d’Arenicola marina, semble présenter une activité bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes notamment pour l’homme.
En outre, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, en particulier d’Arenicola marina, présente une activité bactéricide vis-à-vis de bactéries anaérobies strictes, notamment par l’apport d’oxygène.
La présente invention concerne ainsi l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, comme agent bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme. Les bactéries pathogènes sont des bactéries responsables d’une maladie même chez le sujet sain.
Les bactéries à Gram négatif sont identifiées d’après la technique de coloration de Gram : les bactéries à paroi épaisses sont colorées en violet et dites "à Gram positif", alors que les bactéries à paroi fine sont colorées en rouge et dites "à Gram négatif".
La molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, selon l’invention, peut ainsi être utilisée comme un antibiotique vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme.
Les bactéries à Gram négatif sont notamment choisies parmi P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, G.meningitidis, E.coli, H.influenzae, P.aeruginosa, B.pertussis, L.pneumoniae et H.pylori.
De préférence, les bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme sont anaérobies strictes. Plus préférentiellement, il s’agit de P. gingivalis et/ou T. denticola. De telles bactéries sont notamment présentes dans les poches parondontales. Ces poches sont hypoxiques, et présentent donc des conditions favorables à la prolifération de ces bactéries anaérobies strictes. La molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, selon l’invention, peut en outre être utilisée pour traiter différents désordres induits par de telles bactéries.
En particulier, elle peut être utilisée pour prévenir et/ou traiter la mauvaise haleine (ou halitose), et/ou pour blanchir les dents.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale.
La présente invention concerne ainsi également l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour prévenir et/ou traiter l’halitose.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour blanchir les dents.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence choisie parmi une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, pour traiter des plaies causées par des bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme.
De préférence, la maladie parodontale est choisie parmi les gingivites, les parodontites, les récessions parodontales et l’abcès parodontal.
La molécule selon l’invention est choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins.
De préférence, elle est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides et une hémoglobine extracellulaire d’Annélides. Par « transporteur d’oxygène », on entend toute molécule capable de transporter l’oxygène, de façon réversible, depuis l’environnement jusqu’aux cellules, tissus ou organes cibles.
Le transporteur d’oxygène selon l’invention est issu d’animaux invertébrés marins.
Parmi les animaux invertébrés marins, on peut notamment citer les Annélides, les mollusques, les brachiopodes et les crustacés.
De préférence, le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins est une métalloprotéine.
Plus préférentiellement, le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins est choisi parmi les hémoglobines, les protomères de globine, les globines, les hémérythrines, les myohémérythrines, les chlorocruorines, les érythrocruorines et les hémocyanines.
Les hémoglobines, les protomères de globine et les globines proviennent de préférence d’Annélides.
Les hémérythrines et myohémérythrines proviennent de préférence de brachiopodes ou d’Annélides (Polychètes).
Les chlorocruorines et érythrocruorines proviennent de préférence d’Annélides Polychètes.
Enfin, les hémocyanines proviennent de préférence de mollusques ou de crustacés.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est présente chez les trois classes d'Annélides : les Polychètes, les Oligochètes et les Achètes. On parle d’hémoglobine extracellulaire car elle est naturellement non contenue dans une cellule, et peut donc circuler librement dans le système sanguin sans modification chimique pour la stabiliser ou la rendre fonctionnelle.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est un biopolymère géant de poids moléculaire compris entre 2000 et 4000 kDa, constitué d'environ 200 chaînes polypeptidiques comprises entre 4 et 12 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories.
La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" qui portent un site actif de type hème, et sont capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine (huit types au total pour l’hémoglobine d’Arenicola marina : a1 , a2, b1 , b2, b3, c, d1 et d2), dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa. Elles sont très similaires aux chaînes de type a et b de vertébrés.
La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de « structure » ou « linkers » possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des sous-unités appelées douzièmes ou protomères. On compte deux types de linkers, L1 et L2.
Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six sous-unités (dodécamère ou protomère) en forme de goutte d'eau. La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère ou protomère). Chaque sous-unité a une masse moléculaire d’environ 250 kDa, et constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native.
De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes et les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Oligochètes. De préférence, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae. Encore plus préférentiellement, l'hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola sp et l’hémoglobine extracellulaire de Nereis sp, plus préférentiellement l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina ou de Nereis virens. L’arénicole Arenicola marina est un ver annélide polychète vivant essentiellement dans le sable.
Selon l’invention, le protomère de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides constitue l’unité fonctionnelle de l’hémoglobine native, comme indiqué ci-dessus.
Enfin, la chaîne de globine de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides peut notamment être choisie parmi les chaînes de globine de type Ax et/ou Bx d’hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner, contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Enfin, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines ne possédant pas de typage sanguin, ils permettent d'éviter tout problème de réaction immunologique. L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines présentent une activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque. Par conséquent, cette activité anti oxydante intrinsèque ne nécessite aucun antioxydant pour fonctionner, contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle les molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne sont pas liées à l'hémoglobine. Cette activité SOD rend la molécule particulièrement efficace dans le traitement de l’halitose. L’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et/ou ses globines peuvent être natifs ou recombinants.
Selon l’invention, de préférence, le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, est présent dans une composition comprenant une solution tampon. Selon l’invention, de préférence et comme indiqué dans les exemples, le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, est présent dans une composition dépourvue d’hydrocolloïde, de préférence dans une composition liquide dépourvue d’hydrocolloïde (solution tampon dépourvue d’hydrocolloïde). De préférence, une telle composition consiste uniquement en le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, et une solution tampon.
La formulation du transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence de la globine, du protomère de globine ou de l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, sous forme liquide présente en effet l’avantage d’être plus facilement administrée.
Ladite solution tampon créée un environnement salin adéquat pour le transporteur et notamment l’hémoglobine, ses protomères et ses globines, et permet ainsi le maintien de la structure quaternaire, et donc de la fonctionnalité de cette molécule. Grâce à la solution tampon, le transporteur et notamment l’hémoglobine, ses protomères et ses globines sont capables d’assurer leur fonction d’oxygénation.
La solution tampon selon l’invention est de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, de préférence des ions chlorure, sodium, calcium, magnésium et potassium, et confère à la composition selon l’invention un pH compris entre 6.5 et 7.6 ; sa formulation est similaire à celle d’un liquide physiologiquement injectable. Dans ces conditions, l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides, ses protomères de globine et ses globines restent fonctionnels.
Dans la présente description, le pH s’entend à température ambiante (25°C), sauf mention contraire. De préférence, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du chlorure de potassium, ainsi que du sodium gluconate et du sodium acétate, et a un pH compris entre 6.5 et 7.6, de préférence égal à 7,1 ± 0,5, de préférence d’environ 7.35. Plus préférentiellement, la solution tampon est une solution aqueuse comprenant 90 mM de NaCI, 23 Mm de Na- gluconate, 2,5 mM de CaCI2, 27 mM de Na-acétate, 1 ,5 mM de MgCI2, 5 mM de KOI, et a un pH de 7,1 ± 0,5, pouvant contenir entre 0 et 100 mM d’antioxydant de type acide ascorbique et/ou glutathion réduit.
De préférence, la composition est administrée au sujet par voie parentérale, de préférence par injection ou perfusion ; ou bien par voie topique sur les gencives et/ou les dents.
La composition peut être administrée au sujet sous forme de gel. Ce gel peut par exemple être présent dans une gouttière qui sera appliquée sur l’ensemble des dents de la mâchoire supérieure ou de la mâchoire inférieure. Il peut également être appliqué tel quel sur les dents et/ou les gencives. Un tel gel comprend ainsi au moins un transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, et une matrice hydrophile. La matrice hydrophile comprend notamment au moins un agent gélifiant. Un tel gel comprend de préférence au moins un transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence une globine, un protomère de globine ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides, une solution tampon et un agent gélifiant qui n’est pas un hydrocolloïde. De préférence l’agent gélifiant est choisi parmi la gomme xanthane, la gomme de guar et ses dérivés (hydroxypropylguar par exemple).
Enfin, il peut être appliqué par le biais d’une seringue, par exemple dans le cas de poches parodontales.
De préférence, la composition comprenant le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et la solution tampon est administrée en tant que telle. En effet, dans ce cas, l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines, est présente dans une composition comprenant une solution tampon, de préférence une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. De préférence, la composition contient uniquement le transporteur d’oxygène d’animaux invertébrés marins, de préférence l’hémoglobine, ses protomères ou ses globines, et une solution tampon consistant en une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6. La galénique d’administration est donc assez simple et efficace.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples suivants. Ces exemples sont fournis à des fins d’illustration uniquement, et ne sont pas limitatifs.
Exemples
Matériels et méthodes
1 ) Souches bactériennes et conditions de culture
Les souches utilisées lors de cette étude sont la souche de Porphyromonas gingivalis TDC60 (JCM19600) provenant du RIKEN BioResource Center, Japon, la souche de Treponema denticola ATCC® 35405 et la souche Streptococcus gordonii Challis CH1 ATCC®35105 (Lunsford and London, 1996). Les souches de T. denticola et de P. gingivalis ont été cultivées dans du milieu liquide défini pour leur croissance, le milieu MMBC-S, dont la composition est présentée dans le Tableau 1 .
Tableau 1 : Composition du milieu défini pour la croissance de Porphyromonas gingivalis et Treponema denticola (MMBC-S)
Figure imgf000010_0001
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)
Figure imgf000011_0001
La souche de S. gordonii a été cultivée dans du milieu liquide défini pour sa croissance, le milieu MMBC-4, composés de tous les éléments du milieu MMBC-S présentés dans le Tableau 1 et des différents ajouts présentés dans le Tableau 2.
Tableau 2 : Ajouts pour le milieu MMBC-4 défini pour la croissance de Streptococcus gordonii
Figure imgf000011_0002
Toutes les souches utilisées lors de l’étude ont été cultivées en conditions anaérobies dans une enceinte thermostatée à 37°C (Modular Atmosphère Controlled System 5000, Don Whitley Scientific, Shipley, UK) contenant un mélange gazeux de 10% d’hydrogène, 10% de dioxyde de carbone et 80% d’azote, ou bien dans des conteneurs hermétiques contenant des sachets générateurs d’atmosphère anaérobie (Anaerogen Oxoid).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) L’hémoglobine d’Arenicola marina (HbAm) est fournie à une concentration de 24 g/L et diluée dans un tampon de stabilisation dont la composition est présentée en Tableau 3.
Tableau 3 : Composition du tampon de stabilisation de HbAm
Figure imgf000012_0001
2) Evaluation de l’effet de HbAm sur la survie bactérienne
L’expérience a été réalisée en anaérobie dans des fioles serties d’un bouchon permettant l’injection de HbAm via une seringue à travers un septum étanche, ceci afin de maintenir les bactéries en anaérobie dans l’enceinte thermostatée, tout en conservant au maximum l’oxygénation de l’HbAm à l’intérieur de la seringue préparée en condition aérobie. La solution contenant la molécule a été injectée directement dans la culture bactérienne. Les milieux MMBC-S ou MMBC-4 sont inoculés à une DO600nm initiale de 0.1 dans un volume final de 2 mL. Les cultures ont été préalablement incubées en anaérobie pendant 1 h30 ou 24h respectivement pour P. gingivalis ou T. denticola, afin qu’elles soient dans des conditions optimales pour la suite du test de survie. Par la suite, 2 g/L dHbAm (chargée en oxygène) dilués dans le tampon de stabilisation ont été injectées à travers le septum des fioles ; un volume équivalent de tampon de stabilisation (tsHbAm) ou de milieu MMBC-S/MMBC-4 non réduit (gardé en condition aérobie) a été utilisé pour les contrôles. Les expériences ont été réalisées en triplicate. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour quantifier les cellules viables : a) Dénombrement sur gélose Columbia au sang (S. gordonii et P. gingivalis)
Après différentes durées de culture à 37°C en anaérobie (0 minutes, 30 minutes, 2 heures et 4 heures après injection d’Hbam), le dénombrement des UFC a été effectué par dépôt de gouttes d’échantillon dilué sur gélose Columbia au sang (2 dilutions en séries par échantillon, trois dépôts par dilution), et comptage des colonies au niveau des dépôts
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) après 24h d’incubation à 37°C en anaérobie. Trois expériences indépendantes ont été réalisées. b) Marquage UVE/DEAD et analyse par fluorimétrie (P. gingivalis et T. denticola)
Afin de vérifier l’effet d’HbAm sur la survie des bactéries, des expériences de marquage LIVE/DEAD permettant de déterminer la viabilité cellulaire ont été réalisées après 4h d’incubation en anaérobie des cultures bactériennes traitées ou non avec HbAm. Ce test est basé sur les caractéristiques suivantes : le marqueur fluorescent Syto 40 (5 mM) marque la totalité des cellules, tandis que l’iodure de propidium (30mM) marque uniquement les cellules mortes. Ce marquage a été réalisé dans les échantillons après élimination du milieu de culture par centrifugation à 7000 g pendant 10 minutes à 20°C, puis lavage des bactéries dans du PBS. Des témoins de bactéries 100% vivantes (sans injection de traitement) ou 100% mortes (par utilisation d’un traitement à l’éthanol 70%) ont été effectués en parallèle des échantillons afin de réaliser des gammes d’étalonnage du pourcentage de cellules vivantes. Les fluorescences des deux différents marqueurs ont été mesurées en spectrofluorométrie aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 380 nm et de 440 nm respectivement pour le Syto 40 et aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 480 nm et 650 nm respectivement pour l’iodure de propidium à l’aide du lecteur de plaques POLARstar OMEGA (BMG LABTECH). Les ratios des intensités de fluorescence du Syto 40 sur celles de l’iodure de propidium ont été ensuite calculés afin d’analyser la survie bactérienne en présence d’HbAm.
3) Etude de l'expression de spxB chez S. qordonii a) Culture bactérienne
Des cultures de S. gordonii ont été prélevées en phase exponentielle de croissance et diluées au tiers dans un agent stabilisateur d’ARN (RNA protect Bacteria Reagent, Quiagen), incubées 5 minutes à température ambiante puis centrifugées pendant 10 minutes à 5000 g avant congélation des culots à -80°C. b) Extraction d’ADN
Les culots bactériens ont été resuspendus dans du tampon TE (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) contenant 20 mg/mL de lysozyme et 2 mg/mL de protéinase K afin de procéder à leur lyse enzymatique. Après une incubation de 30 minutes à 37°C, les mélanges ont été déposés sur des billes de verre traitées à l’acide (Sigma-Aldrich) et soumis à 3 cycles de 45 secondes à vitesse 6,5 m/s (Fastprep® FP120 Cell Disrupter, BIO 101 ThermoSavant) afin de procéder à une lyse mécanique des cellules bactériennes. Une centrifugation de 10 secondes à 13000 g a ensuite été réalisée et les surnageants ont été récoltés. Les ARN bactériens ont été extraits des lysats obtenus à l’aide du kit NucleoSpin® RNA (Macherey-Nagel) selon les recommandations du fournisseur. L’ADN a été éliminé des échantillons par digestion à l’aide de la DNase RQ1 (Promega) en suivant les recommandations du fournisseur. L’ARN a ensuite été purifié sur colonne par le kit RNA Clean & Concentrator™ (Zymo Research) selon les recommandations du fournisseur et a été dosé par spectrophotométrie à 260 nm (Nanodrop MD-1000® ThermoScientific). Afin de vérifier l’absence d’ADN dans les extraits purifiés, une PCR (cf ci-dessous) a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques de l’ADN 16S de chaque espèce bactérienne (Tableau 4). c) Amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR)
Les réactions de PCR ont été réalisées en suivant le protocole du fournisseur de la polymérase One-Taq® 25 U/pL (NEB) avec un thermocycleur C1000 (BioRad). La réaction a été réalisée sur un volume final de 25 pL, chaque tube contenant 12,5 pL du Mix One-Taq 2X, 0,5 pL de chacune des amorces R et L (Tableau 4) concentrées à 5 pM, ainsi que de 0,5 pL de l’échantillon à analyser, le tout complété à 25 pL par de l’eau stérile RNase free.
La PCR a été réalisée comme suit :
- Etape initiale de dénaturation : 30 s à 94°C, puis
- 30 cycles de trois étapes successives de dénaturation de 30 s à 94°C, d’hybridation de 30 s à 55°C et d’élongation de 12 s à 68°C, puis
- Elongation finale de 5 minutes à 68°C.
Les produits de PCR ont ensuite été mis en évidence sur gel d’agarose 2% (p/v) (Eurobio) réalisée avec du tampon de migration TAE buffer 50X (Biosolve) en présence d’un intercalant à l’ADN, le DNA Dye NonTox (AppliChem). Des marqueurs de taille, DNA ladder 2log (New England Biolabs), de 1 kB à 50 pb, ont été utilisés pour vérifier la taille de la séquence amplifiée. La révélation et la photographie des gels ont été réalisées après exposition aux UV (365 nm) sur un transilluminateur UVIDOC (UVITEC Cambridge). d) Reverse transcription (RT)
L’ARN a été transformé en ADNc par transcription inverse avec le kit ProtoScriptTM II Reverse Transcriptase (New England Biolabs) suivant le protocole du fournisseur. La réaction a été réalisée avec une matrice d’ARN de concentration supérieure à 40 ng, dans un mélange de 20 mI_ contenant 1 mI_ de dNTP concentrés à 10 mM, 2 mI_ d’amorces Random Primer Mix (New England Biolabs) concentrées à 60 mM, 2 mI_ de 1 ,4- Dithiothreitol concentré à 0,1 M, 4 mI_ de tampon concentré 5 fois, 1 m d’inhibiteur de RNase (murine RNAse inhibitor 40 II/mI_), 1 mI_ de reverse transcriptase (200 II/mI_), le tout complété à 20 mI_ par de l’eau stérile RNA free (Ambion). Le mélange réactionnel a été incubé dans un thermocycleur C1000 (BioRad) suivant un programme composé d’une étape initiale de 5 minutes à 25°C, puis 1 h à 42°C, puis inactivation des enzymes à 80°C pendant 5 minutes. e) Quantification de l’ADN par qPCR
La liste des amorces utilisées lors de cette étude est présentée dans le Tableau 4. Les qPCR ont été réalisées avec le kit SYBR GREEN/ROX (Eurogentec), selon les recommandations du fournisseur dans un volume final de 12,5 pL, chaque tube contenant 6,25 pL du Mix SYBR GREEN 2X, 1 pL de chacune des amorces R et L concentrées à 5 mM, ainsi que de 1 pL de l’échantillon à analyser compris entre 0.001 ng/pL et 10 ng/pL, le tout complété à 6.25 pL par de l’eau stérile RNase free. Les réactions d’amplification ont été réalisées sur un appareil StepOne Plus (Applied Biosystems), suivant le programme suivant : 2 minutes à 50 °C, 10 minutes à 95 °C, 40 cycles composés d’une étape de dénaturation de 15 s à 95°C, une étape d’hybridation et d’élongation de 60 s à 60°C. Une courbe de fusion a été réalisée après chaque amplification (15 secondes à 95°C, une minute à 60°C suivie d’un gradient de température de 60 à 95°C et de 15 secondes à 95°C). Les efficacités des amorces RTSgo et spxB ont été déterminées par qPCR sur une gamme d’étalonnage d’ADN 16S de Sg à l’aide de la formule -| 0 1/pente-1. Les différences d’expression du gène étudié, spxB (amorces spxB, Zheng et al., 201 1 ) ont été calculées de façon relative par la méthode 2 DDa en normalisant avec l’expression du gène de ménage de S. gordonii, rpoB, gène codant la sous-unité béta de l’ARN polymérase (amorces RTSgo, Park S. N. & Kook, J. K, 2013).
Tableau 4 : Amorces utilisées
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4) Evaluation de l’effet d’HbAm sur l’inhibition de la croissance de P. qinqivalis par S. qordonii
L’évaluation de l’inhibition de la croissance de P. gingivalis par S. gordonii, a été réalisée sur milieu solide d’parès une adaptation de la méthode de Herrero et al., (2016). Le milieu riche BHI a été remplacé par le milieu MMBC-4, milieu contrôlé défini pour la croissance de S. gordonii, afin que les éléments présents dans le milieu riche n’interfèrent pas avec l’expérience.
Ce test est réalisé par inoculation de 7 pL de S. gordonii concentré à 109 UFC/mL sur milieu gélosé et son incubation en anaérobie pendant 24 h, suivies d’une inoculation de 7 pL de P. gingivalis concentré à 109 UFC/mL à 5 mm du bord du dépôt de S. gordonii. Les géloses ont été incubées en anaérobie pendant 3 jours avant observation. L’évaluation de l’inhibition est effectuée par la mesure de la distance entre le bord du dépôt formé par les bactéries inhibitrices (S. gordonii) et le bord du dépôt formé par les bactéries cibles (P. gingivalis).
Cette expérience a été effectuée de deux manières différentes. Pour la première expérience, S. gordonii a été inoculé sur 3 types de milieu gélosé, le milieu MMBC-4 seul, le milieu MMBC-4 en présence de 2 g/L d’HbAm et le milieu MMBC-4 en présence d’une quatité équivalente de tampon de stabilisation tsHbAm. Pour la deuxième expérience, S. gordonii a été incubé en milieu liquide MMBC-4 seul, MMBC-4 contenant 2 g/L d’HbAm ou MMBC-4 contenant une quantité équivalente de tsHbAm avant inoculation sur milieu gélosé MMBC-4 comme décrit précédemment.
5) Evaluation de l’effet d’HbAm sur des biofilms de S. gordonii. P. gingivalis et T. denticola
a) Formation des biofilms statiques
La formation de biofilms statiques a été réalisée dans des chambres de culture montées sur lamelle pSIide, ibiTreat: #1.5 polymer coverslip (Ibidi). De la salive stérile (provenant de plusieurs volontaires sains), traitée avec 2,5 mM de dithiothréitol, centrifugée pendant 5 minutes à 2500 rpm à température ambiante, puis filtrée sur membrane 0,22 pm et diluée au ¼, a été appliquée dans les chambres de culture pendant 30 minutes. Après ces 30 minutes, le surplus a été éliminé afin de retirer les éléments de la salive non adsorbés à la surface de la chambre.
Un mélange bactérien composé de cultures de S. gordonii (D0600nm = 0,05), de P. gingivalis (D0600nm = 0,1 ) et de T. denticola (D0600nm = 0,1 ) en milieu MMBC-4, a ensuite été inoculé dans les chambres de cultures et incubé pendant 24h en anaérobie à 37°C. Un traitement d’HbAm à 2 g/L de 1 h ou son équivalent en tsHbAm ont ensuite été appliqués sur les biofilms par injection des solutions à l’aide d’une seringue afin de conserver l’oxygénation de la molécule au sein de l’enceinte anaérobie. b) Marquage et observation
Les surnageants de culture des biofilms ont été retirés et les biofilms ont été lavés au PBS. Le marquage a enseuite été fait à l’aide d’une solution composée d’un mélange de Syto 40 (5 mM) et d’iodure de propidium (40 mM). L’observation des biofilms a été réalisée après 24h de croissance sur la plateforme « microscopie photonique » du centre « Microscopy Rennes Imaging Center » (SFR BIOSIT, Rennes) au moyen d’un microscope confocal Leica TCS-SP8 (Leica Microsystems, Wezlar, Germany). Un objectif à immersion 63x a été utilisé pour la capture d’image et un zoom de 1.5 a été appliqué. La détection de la fluorescence émise par le marqueur Syto 40 de la totalité des cellules a été réalisée par excitation à 405 nm et recueil de la fluorescence émise entre 420 et 475 nm. Une excitation à 514 nm permet la détection du marquage à l’iodure de propidium des cellules mortes entre 620 et 650 nm. Les images du biofilm ont été acquises à des intervalles de 0.5 pm et ont été scannées à une fréquence de 400 Hz. Le logiciel Leica (LAS AF V.2.2.1 ) a été utilisé pour le pilotage du microscope et l’acquisition des images. L’analyse qualitative des images a été réalisée grâce au logiciel ImageJ V1 .43m, COMSTAT2 (Heydorn et al., 2000). La biomasse a été déterminée par somme des biomasses évaluée par marquage au Syto 40 et par marquage à l’iodure de propidium. c) Quantification par qPCR
Les bactéries de l'inoculum de départ et les bactéries détachées du biofilm ont été centrifugées à 7000g, 20°C pendant 10 minutes avec resuspension du culot bactérien dans du PBS afin d’éliminer le milieu MMBC-4 et les traitements. Les bactéries sessiles composant le biofilm ont été resuspendues dans du PBS. Les bactéries ont ensuite été chauffées à 95°C puis quantifiées par qPCR à l’aide d’amorces 16S spécifiques de chaque espèce, comme décrit ci-dessus.
Résultats et Discussion 1 ) Evaluation de l’effet de HbAm sur la survie de S. qordonii, P. qinqivalis et T. denticola en cultures planctoniques a) Effet de HbAm sur la survie de S. gordonii
Afin d’évaluer l’effet d’HbAm sur la croissance et la survie de S. gordonii, des cultures de cette bactérie ont été incubées pendant 4h en conditions anaérobie, après injection ou non de HbAm au temps 0. A chaque temps les colonies formées sur gélose Columbia au sang, provenant des différentes conditions de test, ont été dénombrées.
Les résultats montrent qu’il n’y a pas de différence significative de survie ou croissance de S. gordonii en présence ou absence de 2 g/L d’HbAm de 0 minute à 4h. En effet, les courbes de log de concentrations bactériennes en fonction du temps d’exposition sont équivalentes entre les conditions de culture en milieu MMBC-4 seul, en présence de tampon de stabilisation tsHbAm et en présence d’HbAm. Les comparaisons relatives de la survie de S. gordonii en présence d’HbAm par rapport à l’exposition en tsHbAm le confirment.
De ce fait, la croissance et la survie de S. gordonii en culture planctonique ne semblent pas être affectées par HbAm ni par tsHbAm. b) Effet de HbAm sur la survie de P. gingivalis
Afin d’évaluer l’effet d’HbAm sur la survie de P. gingivalis, des cultures de cette bactérie ont été exposées à la molécule pendant 4h en conditions anaérobies. A chaque temps les colonies formées sur gélose Columbia au sang, provenant des différentes conditions de test, ont été dénombrées.
Les résultats montrent que le tampon de stabilisation de la molécule HbAm n’affecte pas significativement la croissance et la survie de P. gingivalis. En effet, les dénombrements exprimés en log(UFC/mL) sont similaires avec ou sans tampon de stabilisation, de 109 UFC/mL au début de l’expérimentation à 4.109 UFC/mL après 2h d’exposition. Il n’y a pas de différence significative après 4h d’exposition avec 6,3.109 UFC/mL en milieu MMBC-S seul et 5.109 UFC/mL en présence de tsHbAm. Le tampon de stabilisation a donc été utilisé comme seul contrôle négatif dans les trois expériences réalisées ensuite.
Une diminution de la concentration en UFC a été observée dès 2h d’exposition pour les bactéries exposées à HbAm à 2 g/L (2,5.109 UFC/mL) par rapport aux échantillons témoins contenant uniquement le tampon de stabilisation tsHbAm (4.109 UFC/mL), soit 35% de mortalité avec HbAm. L’effet est amplifié après 4h post-exposition avec 49% de mortalité dans la condition d’exposition avec HbAm. La molécule HbAm a donc un effet sur la survie ou la division des bactéries à partir de 2h et cet effet est augmenté avec le temps d’incubation.
Afin de confirmer l’effet d’HbAm sur la viabilité de P. gingivalis, une méthode complémentaire a été utilisée, basée sur l’utilisation de fluorophores (kit « LIVE/DEAD ») capables (Syto 40) ou non (iodure de propidium) de pénétrer à travers la membrane cytoplasmique polarisée (cellules vivantes) pour se fixer sur l’ADN. La fluorescence spécifique liée au Syto 40 et à l’iodure de propidium des cellules de P. gingivalis, traitées ou non avec la molécule HbAm a été mesurée par spectrofluorimétrie après incubation en présence des fluorophores.
Les résultats montrent que l’injection dans la culture anaérobie de milieu MMBC-S non réduit ou de tampon de stabilisation ne semble pas affecter significativement la survie de P. gingivalis (MMBC-S : 96 % de cellules vivantes ; MMBC-S plus tsHbAm : 93,9 % de cellules vivantes). Cependant, HbAm semble avoir un effet sur la viabilité cellulaire de P. gingivalis puisque 4h après l’injection de la molécule le taux de cellules vivantes est de seulement 60%. Ces résultats confirment les données obtenues par dénombrement des colonies.
HbAm a donc un effet bactéricide sur P. gingivalis. c) Effet de HbAm sur la survie de T. denticola
L’obtention de colonies de T. denticola est fastidieuse, non reproductible et demande l’utilisation de milieux complexes. De ce fait, la méthode de dénombrement n’est pas adaptée pour évaluer la survie de T. denticola en présence d’HbAm.
La méthode de dénombrement de colonie et la méthode fluorimétrique avec les sondes LIVE/DEAD permettent l’obtention de résultats concordants pour P. gingivalis. La méthode LIVE/DEAD a donc été utilisée pour T. denticola.
Ni le tampon de stabilisation (92 % de cellules vivantes), ni le milieu MMBC-S non réduit (94 % de cellules vivantes) ne semblent affecter la viabilité de T. denticola. Par contre, la molécule HbAm diminue significativement le taux de cellules vivantes à 70 % dans les cultures 4 h après injection de la molécule.
HbAm a donc un effet bactéricide sur T. denticola.
2) Evaluation de l’effet de HbAm sur la production d’H202 par S. qordonii a) Effet de HbAm sur l'inhibition de la croissance de P. gingivalis par S. gordonii
S. gordonii est connue pour produire de IΉ202 par la pyruvate oxydase SpxB en présence d’oxygène et de pyuvate. Par ailleurs H202 est toxique pour P. gingivalis. Afin de déterminer si l'apport oxygène par HbAm permet une augmentation des propriétés inhibitrices de S. gordonii, des expériences d’inhibition sur milieu gélosé ont été réalisées. Les résultats montrent qu’en milieux gélosés MMBC-4 seul ou contenant 2 g/L d’HbAm ou avec un volume équivalent de tampon de stabilisation tsHbAm, les inocula de P. gingivalis incubés à proximité de S. gordonii semblent avoir une densité cellulaire plus faible que les inocula de P. gingivalis incubés seuls pour les mêmes milieux. De plus, l’ajout de 2 g/L d’HbAm dans les géloses amplifie l’effet inhibiteur de S. gordonii sur P. gingivalis puisqu’aucune colonie de P. gingivalis n’est observable dans cette condition. Les mêmes observations peuvent être faites pour l’expérience réalisée sur milieu gélosé MMBC-4 non supplémenté, mais avec addition ou non de HbAm ou tsHbAm dans la culture de S. gordonii avant dépôt sur la gélose.
S. gordonii semble donc produire des inhibiteurs de la croissance de P. gingivalis en plus grande quantité lorsqu’exposée à HbAm concentrée à 2 g/L. b) Effet de HbAm sur l’expression du gène spxB chez S. gordonii
Le gène codant la pyruvate oxydase est spxB. Afin de vérifier si l’apport en oxygène par HbAm est suffisant pour permettre une augmentation de l’expression du gène, une quantification de l’expression relative de ce gène par rapport au gène de ménage rpoB a été effectuée grâce à une RT-qPCR.
L’efficacité des amorces utilisées pour rpoB était faible (89%).
Cependant, la différence d’expression de spxB avec ou sans HbAm était supérieure à 10 fois et donc probablement significative.
Selon les premiers résultats, la valeur de 2 DDa est de 14,2 en moyenne, signifiant une expression de spxB 14 fois supérieure avec HbAm. HbAm apporterait donc une quantité d’oxygène suffisante pour permettre d’augmenter significativement l’expression de spxB chez S. gordonii cultivé en condition anaérobie.
Ces résultats, couplés à ceux présentés sur la production d’inhibiteurs de croissance de P. gingivalis, suggèrent qu’HbAm pourrait augmenter la production de H202 au sein d’une culture préalablement incubée en condition anaérobie.
3) Evaluation de l’effet de HbAm sur un biofilm mixte composé de S. gordonii, de P. gingivalis et de T. denticola
Afin d’évaluer le potentiel inhibiteur d’HbAm sur un biofilm mixte déjà établi, comprenant S. gordonii, P. gingivalis et T. denticola, des biofilms de 24 h ont été incubés pendant 1 h dans du milieu MMBC-4 seul, ou en présence de tampon de stabilisation ou d’HbAm, avant d’être analysés : - par microscopie confocale permettant d’étudier l’épaisseur du film, la biomasse et la proportion en cellules mortes,
- par qPCR pour quantifier les espèces bactériennes dans les biofilms. Afin d’évaluer l’effet d’HbAm sur le détachement des cellules du biofilm, la quantification bactérienne par qPCR a également été réalisée sur les surnageants obtenus après un temps d’exposition de 1 h à Hbam ou au tampon de stabilisation tsHbAm, ou bien après traitement à l’éthanol 70%.
D’après les premiers résultats, les superpositions de LIVE/DEAD établies en microscopie confocale montrent une plus forte coloration rouge des bactéries en milieu MMBC-4 exposées à HbAm (1% vivantes / 99% mortes) que pour les bactéries exposées seulement au tampon de stabilisation tsHbAm (8% vivantes / 92% mortes) ce qui laisserait penser que les cellules du biofilm exposées à HbAm auraient subi des dommages au niveau de leur membrane laissant pénétrer l’iodure de propidium dans leur cytoplasme. Néanmoins, il faut noter que le pourcentage de cellules mortes sans HbAm est élevé.
Dans nos conditions expérimentales, le test de LIVE/DEAD ne permet donc pas d’établir de conclusion définitive quant à la mortalité cellulaire des bactéries du biofilm spécifiquement due à HbAm.
D’après l’analyse des images obtenues en microscopie confocale, la biomasse ainsi que l’épaisseur moyenne du biofilm est plus faible après traitement du biofilm par HbAm que pour les traitements avec le tampon de solubilisation seul (tsHbAm) ou bien avec éthanol 70%.
De plus, la proportion de cellules détachées du biofilm après traitement est plus élevée après traitement avec HbAm (44%) par rapport à tsHbAm seul (2%). Le traitement à l’éthanol 70% induit également un détachement important des bactéries avec 51 % de cellules détachées dans cette condition. Par ailleurs, les quantifications bactériennes montrent qu’avec tsHbAm et surtout HbAm, les espèces retrouvées dans les cellules détachées du biofilm sont majoritairement T. denticola et P. gingivalis alors que pour les biofilms traités avec éthanol 70% c’est S. gordonii qui est retrouvé en pourcentage élevé dans les cellules détachées. HbAm provoquerait donc le détachement des cellules du biofilm, et aurait un effet principalement sur P. gingivalis et T. denticola. Ces résultats sont à confirmer.
En ce qui concerne la composition bactérienne des différents biofilms, dans les conditions étudiées, une proportion élevée de S. gordonii est retrouvée par rapport à P. gingivalis et T. denticola, que ce soit en présence de tampon de stabilisation tsHbAm (98.5%), d’HbAm (99.8%) ou bien d’éthanol 70% (81 .7%). Les espèces bactériennes de l’inoculum de départ ont été quantifiées par qPCR : 9,26.107 UFC/mL de S. gordonii (42,9 %), 5, 1 1 .107 UFC/mL de P. gingivalis (23,2 %) et 7,34.107 UFC/mL de T. denticola (33,9 %). S. gordonii est majoritaire dans le biofilm malgré un innoculum composé à plus de 60% de P. gingivalis et T. denticola.
En outre, il peut être noté qu’en présence d’HbAm, une concentration plus faible en T. denticola et en P. gingivalis est retrouvée au sein du biofilm par rapport au contrôle exposé au tsHbAm ainsi qu’à l’éthanol 70%.
En effet, une réduction de 10 UFC/mL de concentration en P. gingivalis et de T. denticola a été observée pour les biofilms exposés à HbAm par rapport au contrôle tsHbAm. Il y aurait donc un détachement de ces bactéries après exposition à HbAm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, pour son utilisation comme agent bactéricide vis-à-vis de bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme.
2. Molécule pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
3. Molécule pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les bactéries à Gram négatif et pathogènes pour l’homme sont des bactéries anaérobies strictes, plus préférentiellement il s’agit de P. gingivalis et/ou T. denticola.
4. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, pour prévenir et/ou traiter une maladie parodontale.
5. Molécule pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que la maladie parodontale est choisie parmi les gingivites, les parodontites, les récessions parodontales et l’abcès parodontal.
6. Molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, pour son utilisation pour prévenir et/ou traiter l’halitose.
7. Molécule pour son utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
8. Molécule choisie parmi les transporteurs d’oxygène d’animaux invertébrés marins, pour son utilisation pour blanchir les dents.
9. Molécule pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi une globine d’Annélides, un protomère de globine d’Annélides ou une hémoglobine extracellulaire d’Annélides.
10. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 5, 7 ou 9, caractérisée en ce que l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires d’Annélides Polychètes.
1 1. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 5, 7, 9 ou 10, caractérisée en ce que l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi les hémoglobines extracellulaires de la famille des Lumbricidae, les hémoglobines extracellulaires de la famille des Arenicolidae et les hémoglobines extracellulaires de la famille des Nereididae.
12. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 5, 7 ou 9 à 1 1 , caractérisée en ce que l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire de Lumbricus terrestris, l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola sp et l’hémoglobine extracellulaire de Nereis sp.
13. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 5, 7 ou 9 à 12, caractérisée en ce que l’hémoglobine extracellulaire d’Annélides est choisie parmi l’hémoglobine extracellulaire d’Arenicola marina et l’hémoglobine extracellulaire de Nereis virens.
14. Molécule pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 5, 7 ou 9 à 13, caractérisée en ce que la globine, le protomère de globine ou l’hémoglobine est présent dans une composition comprenant une solution tampon et dépourvue d’hydrocolloïde, de préférence dans une solution aqueuse comprenant des sels, et conférant à la composition un pH compris entre 6.5 et 7.6, ou dans une composition sous forme de gel.
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