WO2019130536A1 - モノクローナル抗体の簡素化された定量方法 - Google Patents

モノクローナル抗体の簡素化された定量方法 Download PDF

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reaction
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崇史 嶋田
典子 岩本
めぐみ ▲高▼梨
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株式会社島津製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a simplified method for the quantification of monoclonal antibodies, in particular to a method adapted by mass spectrometry-based automated quantification systems. More specifically, the present invention relates to an improvement of already established protocols for the quantification of monoclonal antibodies.
  • the present inventors' group has immobilized monoclonal antibodies to be measured on a solid phase by immobilizing both the monoclonal antibodies to be measured and proteases that can be digested with the same as a substrate, thereby producing proteases of monoclonal antibodies by regioselective solid phase-solid reaction. They have found that they can be digested, and have succeeded in obtaining peptides unique to individual monoclonal antibodies (Patent Documents 1 to 6 and Non-patent Documents 1 to 8).
  • mass spectrometry pretreatment is carried out in which a porous body in which a monoclonal antibody is immobilized in a pore and a nanoparticle on which a protease is immobilized are brought into contact in a liquid to perform Fab region selective protease digestion of the monoclonal antibody.
  • LC-MS liquid chromatography mass spectrometry
  • Quantification of antibody drug in blood by nSMOL method limits protease digestion of only the Fab region having a specific sequence of antibody drug, and suppresses the ion suppression effect which is regarded as the most problematic in LC-MS / MS analysis, It is a method that can provide more stable and reliable quantitative values.
  • the present inventors have already demonstrated that the method of quantifying monoclonal antibodies using a combination of nSMOL method and LC-MS / MS method is a biological method in Japan, the United States and Europe in the measurement of blood concentration of antibody drugs over 15 types. It has been confirmed that it meets the criteria of guidelines for validation of analysis methods.
  • nSMOL nSMOL-maleic anhydride-semiconductor
  • a protease immobilized on the surface of a nanoparticle with a diameter of about 200 nm contacts an antibody molecule immobilized on a porous body with a pore diameter of about 100 nm, whereby the Fab of the antibody molecule is confined in a restricted reaction field.
  • nSMOL Antibody BA Kit for the implementation of the nSMOL method, a pretreatment kit for LC / MS / MS "nSMOL Antibody BA Kit” (Shimadzu Corporation) is commercially available, and in the protocol provided with the kit, nanoparticles and pores are provided. Stirring with a vortex mixer or the like at the time of contact with a matrix is described. A highly reproducible reaction could be realized by placing a microliter-order micro sample on a vortex mixer and proceeding the reaction while stirring.
  • the yield after the reaction largely depends on the influence of the container shape and in particular the shape of the incubator, and some model dependence occurs. Therefore, the implementation of the nSMOL method may be difficult in the initial introduction or in the clinical laboratory established in the hospital, although it is possible in a general laboratory.
  • the container used in the nSMOL method is in the form of a microtube, which is considered to be difficult to implement with a specially shaped tube or a low volume tube.
  • a microplate can be used in analysis of many samples, there is a possibility that a uniform reaction environment can not be realized by stirring using a vortex mixer. Therefore, there is a part lacking in versatility such as having to control the stirring speed strictly.
  • Patent Document 4 discloses a method of performing tapping rotation stirring, but this improved method also has a point to be solved in terms of versatility. It was left.
  • nSMOL reaction can be applied to any experimental device.
  • any experimental device for example, in addition to the box-shaped and water-incubated incubator, we are studying to enable nSMOL to be implemented using various devices such as block heaters, thermal cyclers, space-saving incubators, water baths, etc. did.
  • the present invention provides the following. 1. The following steps: (a) capturing and immobilizing monoclonal antibodies in a sample in pores of a porous body, (b) contacting the porous body on which the monoclonal antibody is immobilized with nanoparticles on which the protease is immobilized to carry out selective protease digestion of the monoclonal antibody for 30 minutes or more, and (c) selective protease
  • a method for detecting a monoclonal antibody in a sample comprising the step of detecting a peptide fragment obtained by digestion by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS),
  • step (b) 2. The method according to 1 above, further comprising one or more additional stirrings for 10 seconds to 1 minute in addition to the stirring for 10 seconds to 1 minute at the beginning of the reaction in step (b). 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the stirring is achieved by pipetting operation with an automated dispenser. 4. The method according to any one of 1 to 3, wherein step (b) is carried out in a heating vessel set to a predetermined reaction temperature. 5. A method according to any of the preceding claims, which gives quantifiable results for an antibody concentration range of 0.05 to 300 ⁇ g / ml in the sample.
  • the reaction procedure can be simplified, and the range of containers that can be used for detection of monoclonal antibodies by nSMOL method is expanded, and at the same time, the experimental facilities that can be performed are also expanded.
  • the use of microplates especially for multi-analyte processing becomes possible, and application to automated multi-analyte analysis is expected.
  • the analysis result of trastuzumab in three kinds of reaction conditions is shown.
  • (A) performs step (b) for 1 hour
  • (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when B_1, B_3 and B-5 are stirred every hour for 10 seconds
  • C_3 and C_5 are the results when left to stand after the first stirring.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • the analysis results of bevacizumab in three reaction conditions are shown.
  • step (A) performs step (b) for 1 hour
  • step (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • step (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when B_1, B_3 and B-5 are stirred every hour for 10 seconds
  • C_3 and C_5 are the results when left to stand after the first stirring.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • the analysis result of adalimumab in 2 types of reaction conditions is shown.
  • step (A) performs step (b) for 1 hour
  • step (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • step (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when left stirring after initial stirring and C_1, C_3 and C_5 when stirring for a long time.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • the analysis result of nivolumab in two kinds of reaction conditions is shown.
  • step (A) performs step (b) for 1 hour
  • step (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • step (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when left stirring after initial stirring and C_1, C_3 and C_5 when stirring for a long time.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • Figure 2 shows the results of analysis of infliximab in two reaction conditions.
  • step (A) performs step (b) for 1 hour
  • step (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • step (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when left stirring after initial stirring and C_1, C_3 and C_5 when stirring for a long time.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • the analysis result of rituximab in 2 types of reaction conditions is shown.
  • step (A) performs step (b) for 1 hour
  • step (B) shows the result when step (b) is performed for 3 hours
  • step (C) shows the result when step (b) is performed for 5 hours
  • A_1, A_3 and A_5 Shows the results when left stirring after initial stirring and C_1, C_3 and C_5 when stirring for a long time.
  • the vertical axis indicates relative peak intensity.
  • the present invention comprises the following steps: (a) capturing and immobilizing monoclonal antibodies in a sample in pores of a porous body, (b) contacting the porous body on which the monoclonal antibody is immobilized with nanoparticles on which the protease is immobilized to carry out selective protease digestion of the monoclonal antibody for 30 minutes or more, and (c) selective protease
  • a method for detecting a monoclonal antibody in a sample comprising the step of detecting a peptide fragment obtained by digestion by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), wherein step (b) is carried out for 10 seconds at the beginning of the reaction
  • LC-MS liquid chromatography mass spectrometry
  • Step (a) of the method of the present invention corresponds to the step of capturing the monoclonal antibody in the sample and immobilizing it in the pores of the porous body.
  • a “sample” is a liquid sample to be detected for the presence of a monoclonal antibody, and is not particularly limited, but generally, mice, rats, rabbits, goats, cattle, humans, etc.
  • the sample may be a liquid sample comprising artificially added monoclonal antibodies and plasma, for example to demonstrate the effects of the invention.
  • the concentration of monoclonal antibodies in the sample may be in the range of 0.05 to 300 ⁇ g / ml.
  • monoclonal antibodies examples include, but are not limited to, human antibodies such as panitumumab, ofatumumab, golimumab, ipilimumab, nivolumab, lamsylumab, adalimumab, etc .; And humanized antibodies such as rituximab, cetuximab, infliximab, basiliximab, and the like, and palivizumab, ranibizumab, seltrizumab, ocrelizumab, mogamulizumab, eculizumab, eculizumab, tricizumab, mepolizumab, and the like;
  • a complex with additional functions while maintaining the specificity of the monoclonal antibody such as Fc fusion protein (etanercept, abatacept etc.), antibody-drug complex (eg, brentuximab bedotin, gemtuzumab ozogamicin, trastuzumab- Emtansine etc.) can also be a monoclonal antibody to be measured.
  • the binding of the complex may be dissociated prior to measurement, and only the antibody portion may be subjected to analysis, but it may also be subjected to analysis in the form of a complex.
  • the information etc. of the amino acid sequence of the monoclonal antibody can be obtained, for example, from Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
  • the porous body used in the method of the present invention those having a large number of pores and capable of site-specifically binding an antibody can be used.
  • the average pore size of the porous body is appropriately set in the range of about 10 nm to 200 nm and in a range smaller than the average particle size of the nanoparticles.
  • step (a) of the present invention the monoclonal antibody to be measured is immobilized in the pores of the porous body.
  • a linker molecule that specifically interacts with the antibody is immobilized in the pores of the porous body.
  • linker molecule Protein A, Protein G, etc. which bind site-specifically with the Fc domain of an antibody are preferably used.
  • the Fc domain of the antibody is immobilized in the pore, and the Fab domain is located near the surface of the pore, so the Fab by protease is used. Regioselective digestion of the domain is possible.
  • the porous body that can be suitably used in the present invention is not particularly limited, but for example, Protein G Ultralink resin (manufactured by Pierce), Toyopearl TSKgel (manufactured by TOSOH), Toyopearl AF-rProtein A HC-650F resin ( Tosoh Inc.), Protein A Sepharose (GE Healthcare), KanCapA (KANEKA) and the like.
  • the method for immobilizing the antibody in the pores of the porous body is not particularly limited.
  • the porous body By mixing the body suspension and the solution containing the antibody, the antibody can be easily immobilized in the pore.
  • the quantitative ratio of the porous body to the antibody can be appropriately set according to the purpose.
  • Step (b) of the method of the present invention comprises contacting the porous body on which the monoclonal antibody obtained in the above step (a) is immobilized with nanoparticles on which a protease is immobilized to selectively cleave the monoclonal antibody by the protease. Corresponds to the step of taking 30 minutes or more.
  • the type of protease to be immobilized on the nanoparticles may be appropriately selected according to the type of monoclonal antibody to be quantified or identified by mass spectrometry, and is not limited.
  • trypsin chymotrypsin, lysyl endopeptidase, V8
  • the protease, AspN protease (Asp-N), ArgC protease (Arg-C), papain, pepsin, dipeptidyl peptidase can be used alone or in combination.
  • trypsin is preferably used as a protease.
  • the protease that can be suitably used in the method of the present invention include Trypsin Gold (manufactured by Promega), Trypsin TPCK-treated (manufactured by Sigma), and the like.
  • the nanoparticles have an average particle size larger than that of the porous body, and the shape is not particularly limited. However, from the viewpoint of uniform access of the protease to the pores of the porous body, the nanoparticles are spherical. Nanoparticles are preferred. In addition, the nanoparticles preferably have high dispersibility and uniform average particle size.
  • the type of nanoparticles is preferably magnetic nanoparticles that can be dispersed or suspended in an aqueous medium and can be easily recovered from the dispersion or suspension by magnetic separation or magnetic precipitation separation.
  • magnetic nanoparticles, the surface of which is coated with an organic polymer are more preferable in that aggregation is less likely to occur.
  • organic polymer-coated magnetic nanobeads include FG beads, SG beads, Adembeads, nanomag and the like.
  • FG beads polymer magnetic nanoparticles having a particle size of about 200 nm in which ferrite particles are coated with polyglycidyl methacrylate (polyGMA) manufactured by Tamagawa Seiki Co., Ltd. is suitably used.
  • the above nanoparticles are preferably modified with a spacer molecule capable of binding to a protease for the purpose of suppressing nonspecific protein adsorption and selectively immobilizing the protease.
  • a spacer molecule capable of binding to a protease for the purpose of suppressing nonspecific protein adsorption and selectively immobilizing the protease.
  • Nanoparticles surface-modified with such spacer molecules are also commercially available, for example, nanoparticles modified with spacer molecules having N-hydroxysuccinimide-activated ester groups (active ester groups) are commercially available. It is marketed under the name “FG beads NHS” (Tamakawa Seiki Co., Ltd.).
  • the method for immobilizing the protease on the surface of the nanoparticle is not particularly limited, and an appropriate method can be adopted according to the properties of the protease and the nanoparticle (or the spacer molecule that modifies the surface of the nanoparticle).
  • the above-mentioned pretreatment kit for LC / MS / MS “nSMOL Antibody BA Kit” (Shimadzu Corporation) contains FG beads Trypsin DART (registered trademark), which is a nanoparticle on which trypsin is immobilized as a protease. And can be suitably used in the method of the present invention.
  • the monoclonal antibody By contacting the porous body on which the monoclonal antibody is immobilized with the nanoparticles on which the protease is immobilized, the monoclonal antibody is selectively protease-digested to produce a peptide fragment.
  • Protease digestion is performed, for example, in a buffer solution adjusted to around the optimum pH of the protease.
  • the reaction temperature for protease digestion may be about 37 ° C., but it is preferable to carry out at about 50 ° C. under saturated vapor pressure.
  • the reaction time can be in the range of 30 minutes to 20 hours, for example 1 hour to 8 hours, 3 to 5 hours.
  • step (b) is carried out under agitation conditions of 10 seconds to 5 minutes, for example, 10 seconds to 1 minute, at the beginning of the reaction and under stationary conditions thereafter.
  • “initial reaction initiation” is intended to be the first time of step (b) carried out over 30 minutes, but under various experimental conditions, the porous body and the nanoparticles It will be appreciated that it is not always possible to stir immediately after strict contact with.
  • the method of stirring is not particularly limited, and may be stirring with a vortex mixer, a stirrer, a rotary mixer, or a tapping rotary mixer. Stirring can also be effected, for example, by pipetting operations in an automated dispenser, ie suction and discharge of the reaction solution with a micropipette.
  • step (b) surprisingly proceeds sufficiently even under the condition of constant stirring, which was conventionally considered to be essential, by sufficiently stirring prior to the reaction. It has been confirmed that it is possible to serve the purpose of quantitative detection of monoclonal antibodies in a sample.
  • stirring may be performed at the initial stage of the reaction, and subsequent stirring is not necessarily required, but the method of the present invention is, for example, stirring for 10 seconds to 1 minute at the initial stage of the reaction and further 10 seconds to It is not excluded to carry out one or more additional stirrings for 1 minute.
  • the present invention can provide a more simplified method for detecting a monoclonal antibody by performing the reaction of step (b) under agitation conditions at the beginning of the reaction and subsequent standing conditions. .
  • step (b) can be performed in a heating vessel set to a predetermined reaction temperature, which can be effective for automation of the detection method.
  • the peptide digested by protease digestion is dissolved and released in the reaction solution. Therefore, in order to subject the peptide fragment of interest to mass spectrometry, it is necessary to remove the porous body and the nanoparticles. This can be achieved by performing operations such as filtration, centrifugation, magnetic separation, dialysis, etc. on the sample after protease digestion.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • Step (c) of the method of the present invention corresponds to the step of detecting peptide fragments obtained by selective protease digestion by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).
  • the ionization method in mass spectrometry and the analysis method of the ionized sample are not particularly limited.
  • MS / MS analysis, MS three or more multi-step mass spectrometry, and multiple reaction monitoring (MRM) can be performed using a triple quadrupole mass spectrometer or the like.
  • the apparatus particularly suitable for the method of the present invention is not particularly limited.
  • a monoclonal antibody of interest by detecting a peptide fragment containing an amino acid sequence of a Fab region specific to the monoclonal antibody of interest, such as CDR1 region, CDR2 region or CDR3 region of heavy chain and / or light chain by mass spectrometry etc. Identification and quantification of
  • amino acid sequence information etc. of the monoclonal antibody intended to be used as an antibody drug has been published, and amino acid sequences of heavy chain and light chain, Fab and Fc domain, complementarity determining region (CDR), disulfide bond etc. It is possible to obtain information on Therefore, although multiple peptides can be obtained by protease digestion by the nSMOL method, if amino acid sequence information for each peptide is obtained, it will be easily understood at which position of the monoclonal antibody the peptide is present. be able to. Therefore, among the plurality of peptides derived from the Fab region, particularly suitable peptides can be selected as an analysis target. The peptides selected in this way are called "signature peptides".
  • nSMOL method The details of the nSMOL method are described, for example, in WO 2015/033479; WO 2016/143223; WO 2016/143224; WO 2016/143226; WO 2016/143227; WO 2016/194114; WO 2014/194114; Analyst. 2014 Feb 7; 139 (3): 576- Methods: 80. doi: 10.1039 / c3an 02104a; Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183. Doi: 10.1039 / c5ay01588j; Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50. Doi: 10.1016 / j.dmpk. Doi: 10.4155.
  • nSMOL registered trademark
  • Antibody BA Kit those provided by Shimadzu as "nSMOL Antibody BA Kit" together with the instruction manual can be used.
  • the following reagents are contained in nSMOL (registered trademark) Antibody BA Kit.
  • Immunoglobulin Collection Resin suspension of porous material in the present invention
  • Wash Solution 1 Wash Solution 1
  • Wash Solution 2 Wash Solution 2
  • FEG Beads Trypsin DART trademark, suspension of nanoparticles immobilized with protease (particle size 200 nm)
  • nSMOL The general protocol of the nSMOL method is as follows. ⁇ Step (a)> Take 25 ⁇ l of Immunoglobulin Collection Resin (suspension). Take 90 ⁇ l of Wash solution 1 and add to the above. Take 10 ⁇ L of sample (eg human plasma) containing monoclonal antibody and add to above. Stir gently for about 5 minutes. Transfer the suspension to a filter cup or filter plate. Centrifuge (10,000 g x 1 min, or 3,000 g x 2 min) to remove the supernatant. Add 200 ⁇ l Wash solution 1 and centrifuge similarly to remove the supernatant (twice). Add 200 ⁇ l Wash solution 2 and centrifuge similarly to remove the supernatant (twice).
  • ⁇ Step (b)> Add 75 ⁇ L of Reaction buffer or Enhanced reaction buffer. Add 10 ⁇ L of FG beads Trypsin DART. Stir at 50 ° C. for 5 hours under saturated vapor pressure. Add 10 ⁇ l of Reaction Stop Solution. Centrifugal filtration to recover the solution. Recovery is performed by magnetic separation or centrifugal filtration with two stacked filter plates.
  • Example 1 The reaction at 50 ° C. in step (b) of the conventional general nSMOL method was performed for 5 hours under the following three conditions, using trastuzumab as a measurement target. Stirring was performed with a vortex mixer (200-1000 rpm). Condition A: Continue Stirring Condition B: After 1 minute of stirring repeat standing for 1 hour (stirring every hour) Condition C: after stirring for 1 minute
  • trastuzumab manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
  • human plasma manufactured by Kojin Bio Co., Ltd.
  • Enhanced Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • step (b) The reaction solution was visually observed during the course of step (b). As a result, it was observed that Immunoglobulin Collection Resin and FG beads Trypsin DART sediment at the bottom of the vessel as the standing time increased.
  • Reaction Stop Solution (10% formic acid) is rapidly added to the samples reacted for 1 hour, 3 hours, and 5 hours, and the solution is recovered, and NexeraX2 system (Shimadzu Corporation) and LCMS-8050 / 8060 (Shimadzu Corporation) LC-MS measurements were performed using.
  • IYPTNGYTR As a peptide fragment (signature peptide) for trastuzumab quantification, IYPTNGYTR (SEQ ID NO: 1) present in the CDR2 region of the heavy chain was selected.
  • Example 2 The same study as in Example 1 was performed using bevacizumab as the measurement target.
  • Bevacizumab (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) at a concentration of 50 ⁇ g / ml was added to human plasma (Cordin Bio Co., Ltd.) and used, and Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • FTFSLDTSK SEQ ID NO: 2 present in the CDR2 region of the heavy chain was selected.
  • the results of LC-MS measurement are shown in FIG. In this example, no significant difference was found in the detection results depending on the stirring conditions.
  • Example 3 The same study as in Example 1 was performed under conditions A and C using adalimumab as a measurement target.
  • the sample was prepared by adding 50 ⁇ g / ml of adalimumab (Avivi Co., Ltd.) concentration to human plasma (manufactured by Kojin Bio Co., Ltd.), and the Enhanced Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • APYTFGQGTK SEQ ID NO: 3 present in the CDR3 region of the light chain was selected as a signature peptide for the quantification of adalimumab.
  • Example 4 The same study as in Example 1 was performed under conditions A and C, using nivolumab as the measurement target.
  • Nivolumab Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Enhanced Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • ASGITFSNSGMHWVR SEQ ID NO: 4
  • the results of LC-MS measurement are shown in FIG. In this example, no significant difference was found in the detection results depending on the stirring conditions.
  • Example 5 The same study as in Example 1 was performed under conditions A and C, using infliximab as a measurement target.
  • infliximab Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Ltd.
  • Enhanced Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • SINSATHYAESVK SEQ ID NO: 5 present in the CDR2 region of the heavy chain was selected as a signature peptide for the determination of infliximab.
  • the results of LC-MS measurement are shown in FIG. In this example, no significant difference was found in the detection results depending on the stirring conditions.
  • Example 6 The same study as in Example 1 was performed under conditions A and C, using rituximab as a measurement target.
  • the sample was prepared by adding 50 ⁇ g / ml concentration of rituximab (Zhuyaku Kogyo Co., Ltd.) to human plasma (manufactured by Kojin Bio Co., Ltd.), and the Enhanced Reaction Solution contained in nSMOL Antibody BA Kit was used as a reaction liquid.
  • GLEWIGAIYPGNGDTSYNQK SEQ ID NO: 6 present in the CDR2 region of the heavy chain was selected as a signature peptide for the determination of rituximab.
  • the protocol of the nSMOL method is improved, and simplification of a method of detecting a monoclonal antibody using mass spectrometry and application to multi-analyte analysis, automated analysis, particularly an automatic dispenser can be expected.
  • it can be widely applied in pharmacokinetic tests and therapeutic drug monitoring tests.

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Abstract

本発明は、以下のステップ：(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を30分間以上かけて行うステップ、及び(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ、を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(b)を、反応開始初期の10秒間～5分間の撹拌条件下と、その後の静置条件下で実施する方法を提供する。本発明により、質量分析を用いたモノクローナル抗体の検出方法の簡素化および多検体分析への応用が可能となる。

Description

モノクローナル抗体の簡素化された定量方法
　本発明は、モノクローナル抗体の簡素化された定量方法に関し、具体的には、質量分析を利用した自動化定量システムにより適合した定量方法に関する。より具体的には、本発明は、モノクローナル抗体の定量のために既に確立されたプロトコールの改良に関する。
　近年、ELISA法に代わる定量法として、LC-MS/MS法を用いた抗体医薬のバイオアナリシスの開発が盛んに行われている。
　本発明者等のグループは、測定対象のモノクローナル抗体と、これを基質として消化し得るプロテアーゼの両方を固相に固定化することで、位置選択的な固相-固相反応によるモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化が可能であることを見出し、個々のモノクローナル抗体特有のペプチドを取得することに成功している（特許文献１～６及び非特許文献１～８）。この方法は、モノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体のFab領域選択的プロテアーゼ消化を行う質量分析の前処理方法であり、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって効果的に検出及び定量することができる画期的な技術である。本発明者等は本方法を「ナノ表面及び分子配向制限的タンパク分解（nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis）方法（nSMOL法）」と命名している。
　nSMOL法による血中抗体医薬の定量は、抗体医薬の特異的配列を有するFab領域のみを限定的にプロテアーゼ消化し、LC-MS/MS分析において最も問題視される、イオンサプレッション効果を抑制し、より安定した信頼性の高い定量値を提供することが可能な方法である。本発明者等は既に、nSMOL法及びLC-MS/MS法を組み合わせて用いたモノクローナル抗体の定量方法が、15種類以上にわたる抗体医薬の血中濃度測定において、日本、米国及び欧州における生物学的分析方法のバリデーションのためのガイドラインの基準を満たすものであることを確認している。
国際公開 WO2015/033479号 国際公開 WO2016/143223号 国際公開 WO2016/143224号 国際公開 WO2016/143226号 国際公開 WO2016/143227号 国際公開 WO2016/194114号
Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. doi: 10.1039/c3an02104a Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183. doi:10.1039/c5ay01588j Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50. doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004 Bioanalysis. 2016; 8(10):1009-20. doi: 10.4155. bio-2016-0018 Biol Pharm Bull, 2016;39(7):1187-94. doi: 10.1248/bpb.b16-00230 J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci; 2016; 1023-1024:9-16. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.04.038 Clin Pharmacol Biopharm 2016; 5:164. doi:10.4172/2167-065X.1000164 J. Pharm Biomed Anal; 2017; 145:33-39. doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
　nSMOL法は、直径約200 nmのナノ粒子表面に固相したプロテアーゼが、細孔径約100 nmの多孔質体に固定した抗体分子に接触することで、制限された反応場において、抗体分子のFabを選択的に切断する反応メカニズムを持っている。このため、nSMOL法による抗体分子の選択的プロテアーゼ消化を進めるためには、ナノ粒子表面と多孔質体との均質な接触が必要であり、反応中は混合若しくは攪拌により、これらが反応液中に均質に分散することが必須と考えられていた。
　例えば、nSMOL法の実施のために、LC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）が市販されており、キットと合わせて提供されているプロトコルでは、ナノ粒子と多孔質体との接触時にボルテックスミキサーなどを用いた撹拌をすることが記載されている。マイクロリットルオーダーの微量サンプルをボルテックスミキサー上に立て、攪拌しながら反応を進めることにより、再現性の高い反応を実現することができた。
　一方、ボルテックスミキサーを使う場合、反応後の収率が容器形状の影響や、特にインキュベーターの形状に大きく依存し、ある種の機種依存性が発生する。従って、nSMOL法の実施は、一般的な研究室では可能であっても、初期導入や病院内に設置されたクリニカルラボなどでは難しい可能性があった。
　nSMOL法において使用する容器は、マイクロチューブの形態であることが必須であり、特殊な形状のチューブ、もしくは低容量のチューブでは実施しにくいと考えられる。また、多検体の分析においてはマイクロプレートを用いることができるが、ボルテックスミキサーを用いた攪拌をすることで均一な反応環境を実現できない可能性がある。従って攪拌スピードを厳格にコントロールしなければならないなど、汎用性に欠ける部分もあった。
　低速での撹拌を行うために、上記特許文献４（WO 2016/143226号）では、タッピングローテーション撹拌をする方法を開示しているが、この改良方法も、汎用性の点では解決すべき点が残されていた。
　上記の課題に鑑み、我々は、nSMOL法の汎用性を高めることを目的とし、反応条件の更なる検討を実施した。
　具体的には、容器特殊性を排除することを目的として、nSMOL反応がどんな実験機器にも対応できるような条件を検討した。例えば、箱形でかつ水バットを張れるインキュベーター以外にも、ブロックヒーター、サーマルサイクラー、省スペースインキュベーター、ウォーターバスなど、様々な機器を用いてnSMOLを実施することができるようにすることを目的として検討した。
　その結果、ナノ粒子と多孔質体とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行う場合に、消化反応中に常時撹拌をせずに、サンプル中で双方の粒子が沈殿した状態であっても、検出結果を大きく損なうことなく、定量的な検出を可能とするものであることを見出した。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．　以下のステップ：
　　(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
　　(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を30分間以上かけて行うステップ、及び
　　(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(b)を、反応開始初期の10秒間～5分間の撹拌条件下と、その後の静置条件下で実施する、上記方法。
２．　ステップ(b)において、反応開始初期の10秒間～1分間の撹拌に加えて、更に10秒間～1分間の1回以上の追加の撹拌を含む、上記１記載の方法。
３．　撹拌が、自動化された分注器によるピペッティング操作によって達成される、上記１又は２記載の方法。
４．　所定の反応温度に設定された加熱容器内でステップ(b)を実施する、上記１～３のいずれか記載の方法。
５．　サンプル中の0.05～300μg/mlの抗体濃度範囲に対して定量可能な結果をもたらす、上記１～４のいずれか記載の方法。
　本発明により、反応手技を簡素化できると共に、nSMOL法によるモノクローナル抗体の検出のために使用可能な容器の範囲が拡大し、同時に実施可能な実験施設も拡大する。また、特に多検体処理のためのマイクロプレートの使用が可能となり、自動化された多検体分析への応用が期待される。
3種の反応条件におけるトラスツズマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、B_1、B_3及びB-5は1時間毎に10秒間撹拌した場合、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。 3種の反応条件におけるベバシズマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、B_1、B_3及びB-5は1時間毎に10秒間撹拌した場合、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。 2種の反応条件におけるアダリムマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、C_1、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。 2種の反応条件におけるニボルマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、C_1、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。 2種の反応条件におけるインフリキシマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、C_1、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。 2種の反応条件におけるリツキシマブの分析結果を示す。(A)はステップ(b)を1時間実施し、(B)はステップ(b)を3時間、（C)はステップ(b)を5時間行った場合の結果であり、A_1、A_3及びA_5はずっと撹拌した場合、C_1、C_3及びC_5は最初の撹拌後は静置した場合の結果を示す。縦軸は相対ピーク強度を示す。
　本発明は、以下のステップ：
　　(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
　　(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を３０分間以上かけて行うステップ、及び
　　(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(b)を、反応開始初期の10秒間～5分間の撹拌条件下と、その後の静置条件下で実施する、上記方法を提供する。
＜ステップ(a)＞
　本発明の方法のステップ(a)は、サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップに相当する。
　本明細書において、「サンプル」とは、モノクローナル抗体の存在を検出すべき液体サンプルであって、特に限定するものではないが、一般的にはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒト等の哺乳動物、特にヒト被験者、主としてヒト患者由来の生物学的サンプルであり、好ましくは血漿または血清、もしくは組織ホモジネート抽出液である。あるいは、サンプルは、例えば発明の効果を実証するために、人為的に添加されたモノクローナル抗体と血漿とを含む液体サンプルであり得る。本発明の方法におけるモノクローナル抗体の検出のためには、サンプル中のモノクローナル抗体の濃度は、0.05～300μg/mlの範囲内であれば良い。
　測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばパニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ラムシルマブ、アダリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ、トリシズマブ、メポリズマブ等のヒト化抗体；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、等のキメラ抗体等が挙げられる。
　また、モノクローナル抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えばFc融合タンパク質（エタネルセプト、アバタセプト等）、抗体-薬物複合体（例えばブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トラスツズマブ-エムタンシン等）も測定対象のモノクローナル抗体となり得る。測定に先立って複合体の結合を解離させ、抗体部分のみを分析に供しても良いが、複合体の形態のままで分析に供することもできる。
　モノクローナル抗体のアミノ酸配列の情報等は、例えば京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）から取得することができる。
　本発明の方法に使用する多孔質体としては、多数の細孔を有し、抗体を部位特異的に結合可能なものを使用することができる。多孔質体の平均細孔径は、１０ｎｍ～２００ｎｍ程度の範囲で、かつナノ粒子の平均粒径よりも小さい範囲で適宜に設定される。
　本発明のステップ(a)では、測定対象のモノクローナル抗体を多孔質体の細孔内に固定化する。この目的で、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。
　リンカー分子としては、抗体のFcドメインと部位特異的に結合するProtein AやProtein G等が好ましく用いられる。細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内に抗体のFcドメインが固定化され、Fabドメインが細孔の表層付近に位置するため、プロテアーゼによるFabドメインの位置選択的消化が可能となる。
　本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）、トヨパール TSKgel（TOSOH社製）、トヨパール AF-rProtein A HC-650F resin（TOSOH社製）、Protein A Sepharose（GEヘルスケア）、KanCapA（KANEKA）等が挙げられる。
　抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、例えば、細孔内にProtein AやProtein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。
＜ステップ(b)＞
　本発明の方法のステップ(b)は、上記ステップ(a)で得られたモノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を３０分間以上かけて行うステップに相当する。
　ナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量又は同定の対象となるモノクローナル抗体の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ（Asp-N）、ArgCプロテアーゼ（Arg-C）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼを単独又は組み合わせて使用することができる。プロテアーゼとして、特にトリプシンが好ましく用いられる。本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
　ナノ粒子は、その平均粒径が、多孔質体の平均細孔径よりも大きいものであり、形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスの均一化の観点から、球状のナノ粒子が好ましい。また、ナノ粒子は、分散性が高く、平均粒径が均一であることが好ましい。
　ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomagなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。
　上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
　このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。
　プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。尚、上記のLC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）には、プロテアーゼとしてトリプシンが固定化されたナノ粒子であるFG beads Trypsin DART（登録商標）が含まれており、本発明の方法に好適に用いることができる。
　上記モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させることにより、モノクローナル抗体が選択的にプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。
　プロテアーゼ消化は、例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で実施する。プロテアーゼ消化のための反応温度は３７℃程度であって良いが、飽和蒸気圧下、約５０℃で行うことが好適である。反応時間は、３０分間～２０時間、例えば１時間～８時間、３～５時間の範囲とすることができる。
　本発明の方法では、ステップ(b)を、反応開始初期の１０秒間～５分間、例えば１０秒間～１分間の撹拌条件下と、その後の静置条件下で実施する。ここで、「反応開始初期」とは、３０分間以上かけて実施するステップ(b)のうちの最初の時間であることが意図されるが、種々の実験環境下において、多孔質体とナノ粒子との厳密な接触直後に撹拌することが必ずしも可能ではないことは理解されるであろう。しかしながら、通常は、モノクローナル抗体を固定化した多孔質体にプロテアーゼを固定化したナノ粒子を添加した段階、又はプロテアーゼを固定化したナノ粒子にモノクローナル抗体を固定化した多孔質体を添加した段階で撹拌を行う。
　撹拌の方法は、特に限定するものではなく、ボルテックスミキサー、スターラー、ロータリーミキサー、タッピングロータリーミキサーによる撹拌とすることができる。撹拌はまた、例えば自動化された分注器におけるピペッティング操作、すなわちマイクロピペットによる反応液の吸い込み及び吐出によって撹拌効果を得ることができる。
　実施例で実証するように、ステップ(b)の反応は、驚くべきことに、反応前に十分撹拌しておくことで、従来必須と考えられていた常時撹拌する条件下でなくても十分進行し、サンプル中のモノクローナル抗体の定量的検出という目的を果たすことが可能であることが確認された。
　従って、反応開始初期に攪拌すれば良く、その後の攪拌は必ずしも必要ではないが、本発明の方法は、ステップ(b)において、例えば反応開始初期の10秒間～1分間撹拌し、更に10秒間～1分間の1回以上の追加の撹拌を行うことを除外するものではない。
　このように、本発明は、ステップ(b)の反応を反応開始初期の撹拌条件と、その後の静置条件下で行うことにより、より簡素化されたモノクローナル抗体の検出方法を提供することができる。
　反応液の蒸発を防ぐために、反応を飽和蒸気圧下で維持することが好ましい。この目的で、例えば省スペースインキュベーターでは、水を張った小さな箱などを置くことが想定される。ヒートブロックでは、例えば水を湿らせたワイパーとサンプルを一緒に、サランラップ等で密封して加熱することができる。そのような汎用的な手技でも、nSMOL反応が十分に進行し、抗体医薬のバイオアナリシスが可能である。また、例えば、ステップ(b)を、所定の反応温度に設定された加熱容器内で実施することができ、これは検出方法の自動化のために有効であり得る。
　プロテアーゼ消化によって消化されたペプチドは、反応液中に溶解して放出される。従って、目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。
　例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社製）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、ミリポア社製）等を用いてろ過することにより、多孔質体及びナノ粒子を簡便に除去することができる。ろ過は、遠心ろ過とすると迅速かつ簡便なろ過が可能である。
＜ステップ(c)＞
　本発明の方法のステップ(c)は、選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップに相当する。
　質量分析におけるイオン化法、及びイオン化された試料の分析方法は特に限定されない。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring, MRM）を行うことができる。
　本発明の方法において特に適した装置は、特に限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060、（いずれも島津製作所）、LCMS-IT-TOF、（島津製作所）を挙げることができる。
　質量分析等により、目的のモノクローナル抗体に特異的なFab領域、例えば重鎖及び／又は軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、CDR3領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片を検出することで、目的のモノクローナル抗体の同定・定量が可能である。
　抗体医薬として使用することが意図されるモノクローナル抗体は、そのアミノ酸配列情報等が公開されており、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、Fab及びFcドメイン、相補性決定領域（CDR）、ジスルフィド結合等の情報を入手することが可能である。従って、nSMOL法によるプロテアーゼ消化で複数のペプチドが得られるが、それぞれのペプチドについてのアミノ酸配列情報が得られれば、そのペプチドがモノクローナル抗体のいずれの位置に存在するものであるかを容易に理解することができる。従って、Fab領域由来の複数のペプチドのうち、特に好適なペプチドを分析対象として選択することができる。このように選択されるペプチドは「シグネチャーペプチド」と呼ばれている。
　nSMOL法の詳細は、例えばWO2015/033479号；WO2016/143223号；WO2016/143224号；WO2016/143226号；WO2016/143227号；WO2016/194114号；Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. doi: 10.1039/c3an02104a；Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183. doi:10.1039/c5ay01588j；Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50. doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004；Bioanalysis. 2016; 8(10):1009-20. doi: 10.4155. bio-2016-0018；Biol Pharm Bull, 2016;39(7):1187-94. doi: 10.1248/bpb.b16-00230；J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci; 2016; 1023-1024:9-16. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.04.038；Clin Pharmacol Biopharm 2016; 5:164. doi:10.4172/2167-065X.1000164；及びJ. Pharm Biomed Anal; 2017; 145:33-39. doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032等に開示されている。これらの文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　まず、本実施例で行ったnSMOL法の手順を以下に記載する。尚、使用する試薬及び容器等は、取扱説明書と共に「nSMOL Antibody BA Kit」として島津製作所から提供されているものを使用することができる。
　尚、nSMOL（登録商標）Antibody BA Kitには、以下の試薬が含まれている。
　　Immunoglobulin Collection Resin（本発明における多孔質体の懸濁液）
　　Wash Solution 1（洗浄溶液）
　　Wash Solution 2（洗浄溶液）
　　Reaction Solution（反応溶液）
　　Enhanced Reaction Solution（反応促進溶液）
　　Reaction Stop Solution（反応停止溶液）
　　FEG Beads Trypsin DART（登録商標、プロテアーゼを固定したナノ粒子(粒径200nm)の懸濁液）
　nSMOL法の一般的なプロトコルは以下に示すようなものである。
＜ステップ(a)＞
　　Immunoglobulin Collection Resin（懸濁液）を25μLとる。
　　Wash solution 1を90μLとり、上記に加える。
　　モノクローナル抗体を含むサンプル（例えばヒト血漿）を10μLとり、上記に加える。
　　5分程度軽く攪拌する。
　　懸濁液をフィルターカップもしくはフィルタープレートに移す。
　　遠心（10,000 g x 1分間、もしくは3,000 g x 2分間）し上清を除去する。
　　Wash solution 1を200μL加え、同様に遠心して上清を除去する（２回）。
　　Wash solution 2を200μL加え、同様に遠心して上清を除去する（２回）。
＜ステップ(b)＞
　　Reaction bufferもしくはEnhanced reaction bufferを75μL加える。
　　FG beads Trypsin DARTを10μL加える。
　　飽和蒸気圧下、50℃にて、5時間撹拌する。
　　Reaction Stop Solutionを10μL加える。
　　遠心ろ過をして、溶液を回収する。回収は、磁気分離、又はフィルタープレートを二段重ねにして、遠心ろ過をする。
＜ステップ(c)＞
LC-MS分析を行う。
［実施例１］
　測定対象としてトラスツズマブを用い、従来の一般的なnSMOL法のステップ(b)における50℃での反応を、以下の３通りの条件でそれぞれ5時間実施した。尚、撹拌はボルテックスミキサー（200-1000 rpm）で行った。
　　条件A：撹拌し続ける
　　条件B：1分間撹拌後に1時間静置を繰り返す（1時間ごとに撹拌）
　　条件C：1分間撹拌後、静置する
　サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のトラスツズマブ（中外製薬株式会社製）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるEnhanced Reaction Solutionを使用した。
　ステップ(b)の進行中に、反応液を目視で観察した。その結果、静置時間が長くなるにつれて、Immunoglobulin Collection Resin及びFG beads Trypsin DARTが容器底部に沈降するのが観察された。
　1時間、3時間、及び5時間反応させたサンプルに速やかにReaction Stop Solution（10％ギ酸）を添加して溶液を回収し、NexeraX2 システム（島津製作所）及びLCMS-8050/8060（島津製作所）を使用してLC-MS測定を行った。トラスツズマブの定量のためのペプチド断片（シグネチャーペプチド）として、重鎖のCDR2領域に存在するIYPTNGYTR（配列番号１）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図１に示す。図１の結果から明らかなように、継続して撹拌した条件Aにおいて、最も高いイオン収率が得られている。しかしながら、条件B及び条件Cの結果は、条件Aと比較して10～20％低い値を示すのみであり、測定に使用するには問題ないレベルであることが確認された。また、いずれの条件においても反応時間を長くすることによって値が高くなっていることから、ステップ(b)の反応時間を調整することでも対応可能であることが明らかである。
［実施例２］
　実施例１と同様の検討を、測定対象としてベバシズマブを用いて実施した。サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のベバシズマブ（中外製薬株式会社）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるReaction Solutionを使用した。ベバシズマブの定量のためのシグネチャーペプチドとして、重鎖のCDR2領域に存在するFTFSLDTSK（配列番号２）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図２に示す。本実施例では、撹拌条件による検出結果に顕著な差は認められなかった。
［実施例３］
　実施例１と同様の検討を、測定対象としてアダリムマブを用い、条件A及びCで実施した。サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のアダリムマブ（アッヴィ合同会社）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるEnhanced Reaction Solutionを使用した。アダリムマブの定量のためのシグネチャーペプチドとして、軽鎖のCDR3領域に存在するAPYTFGQGTK（配列番号３）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図３に示す。図１の結果から明らかなように、継続して撹拌した条件Aにおいて、高いイオン収率が得られている。しかしながら、条件Cの結果は、条件Aと比較して10～20％低い値を示すのみであり、測定に使用するには問題ないレベルであることが確認された。また、いずれの条件においても反応時間を長くすることによって値が高くなっていることから、ステップ(b)の反応時間を調整することでも対応可能であることが明らかである。
［実施例４］
　実施例１と同様の検討を、測定対象としてニボルマブを用い、条件A及びCで実施した。サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のニボルマブ（小野薬品工業株式会社）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるEnhanced Reaction Solutionを使用した。ニボルマブの定量のためのシグネチャーペプチドとして、重鎖のCDR1領域に存在するASGITFSNSGMHWVR（配列番号４）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図４に示す。本実施例では、撹拌条件による検出結果に顕著な差は認められなかった。
［実施例５］
　実施例１と同様の検討を、測定対象としてインフリキシマブを用い、条件A及びCで実施した。サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のインフリキシマブ（田辺三菱製薬株式会社）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるEnhanced Reaction Solutionを使用した。インフリキシマブの定量のためのシグネチャーペプチドとして、重鎖のCDR2領域に存在するSINSATHYAESVK（配列番号５）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図５に示す。本実施例では、撹拌条件による検出結果に顕著な差は認められなかった。
［実施例６］
　実施例１と同様の検討を、測定対象としてリツキシマブを用い、条件A及びCで実施した。サンプルは、ヒト血漿（コージンバイオ株式会社製）中に50μg/ml濃度のリツキシマブ（全薬工業株式会社）を添加して用い、反応液としてnSMOL Antibody BA Kitに含まれるEnhanced Reaction Solutionを使用した。リツキシマブの定量のためのシグネチャーペプチドとして、重鎖のCDR2領域に存在するGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK（配列番号６）を選択した。
　LC-MS測定の結果を図６に示す。図６の結果から明らかなように、継続して撹拌した条件Aにおいて、高いイオン収率が得られている。しかしながら、条件Cの結果は、条件Aと比較して10～20％低い値を示すのみであり、測定に使用するには問題ないレベルであることが確認された。また、いずれの条件においても反応時間を長くすることによって値が高くなっていることから、ステップ(b)の反応時間を調整することでも対応可能であることが明らかである。
　本発明により、nSMOL法のプロトコールが改良され、質量分析を用いたモノクローナル抗体の検出方法の簡素化および多検体分析、自動化分析、特に自動分注器への応用が期待できる。特に薬物動態試験、治療薬物モニタリング試験において、広く応用が可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (5)

  1. 　以下のステップ：
    　　(a)サンプル中のモノクローナル抗体を捕捉して多孔質体の細孔内に固定化するステップ、
    　　(b)該モノクローナル抗体を固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を30分間以上かけて行うステップ、及び
    　　(c)選択的プロテアーゼ消化によって得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するステップ
    を含む、サンプル中のモノクローナル抗体の検出方法であって、ステップ(b)を、反応開始初期の10秒間～5分間の撹拌条件下と、その後の静置条件下で実施する、上記方法。
  2. 　ステップ(b)において、反応開始初期の10秒間～1分間の撹拌に加えて、更に10秒間～1分間の1回以上の追加の撹拌を含む、請求項１記載の方法。
  3. 　撹拌が、自動化された分注器によるピペッティング操作によって達成される、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　所定の反応温度に設定された加熱容器内でステップ(b)を実施する、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　サンプル中の0.05～300μg/mlの抗体濃度範囲に対して定量可能な結果をもたらす、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
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