WO2019119087A1 - Kit e processo para detecção de imunoglobulinas e e imunoglobulinas g1 - Google Patents

Kit e processo para detecção de imunoglobulinas e e imunoglobulinas g1 Download PDF

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WO2019119087A1
WO2019119087A1 PCT/BR2018/050219 BR2018050219W WO2019119087A1 WO 2019119087 A1 WO2019119087 A1 WO 2019119087A1 BR 2018050219 W BR2018050219 W BR 2018050219W WO 2019119087 A1 WO2019119087 A1 WO 2019119087A1
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immunoglobulins
food
pbs
saliva
allergy
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PCT/BR2018/050219
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Marília Porto Oliveira NUNES
Maria Izabel Florindo Guedes
Eridan Orlando Pereira Tramontina FLOREAN
Maurício Fraga Van TIUBURG
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Fundação Universidade Estadual Do Ceará - Funece
Greenbean Biotecnologia Ltda Me
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61BDIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to the detection of specific immunoglobulins E (IgE) and immunoglobulins G1 (IgG1) in biological samples using the indirect ELISA technique.
  • the present invention is in the field of medicine and pharmacy, nursing, nutrition, biomedicine and bioengineering, more specifically, biological material analysis.
  • AA Food allergy
  • AA is more common in children, it is estimated that a prevalence of approximately 6% to 8% in children under three years and of 3.5% in adults. This higher prevalence in childhood may be mainly because the immune system does not present complete maturation (Batista et al., 2009;
  • the determination of total IgE is usually required in the investigation of allergy, but numerous factors (genetic predisposition, sex, age, infections, pollution and smoking) contribute to the variation of the serum IgE level and must be considered for its correct interpretation .
  • the serum level of total IgE is detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showing quantitative results and is variable according to age, being undetectable in the neonate and reaching maximum concentrations in young adults (ASBAI, 2009).
  • the elevated IgE level does not indicate the presence of allergic disease, since it only evaluates its momentary quantity and does not specify the antigen causing the manifestations.
  • the high IgE results may also be associated with intestinal or cutaneous parasitoses, myeloma, hyper IgE syndrome, among others (BOYCE et al, 2010).
  • US201154401 uses body fluids to diagnose food allergy by means of a KIT called FIXANAL which detects the presence of IgE and IgG immunoglobulins. Unlike this document, the present invention discloses a process for investigating food allergy using crude extracts of the foods to be investigated by the ELISA technique which detects the presence of IgE and IgG1 immunoglobulins in biological samples from a patient.
  • Document RU2442980 uses IgA immunoglobulin in saliva after 5 days of contact with the allergen to diagnose food allergy by the ELISA technique. Differently from this document, this In the present invention, IgE and IgG1 immunoglobulins are detected in the saliva by the ELISA technique, and examination can be performed on the same day of contact with the allergen.
  • Document PI0114343-3 discloses the diagnosis of food allergy by detecting IgE and IgG in the blood of patients using the microarray technique. Unlike this document, the present invention provides a process for detecting IgE and IgG1 from saliva or serum using the ELISA technique and crude extract from the investigated foods.
  • WO2016094961 discloses the diagnosis of food allergy through the Methylation Patter technique which detects methylated regions / genes in the DNA of various body fluids, having saliva as one of them.
  • This patent does not carry out immunoenzymatic assays and therefore does not detect immunoglobulins, which makes it different from the present invention, which provides an investigation of food allergy by detecting IgE and IgG1 immunoglobulins in saliva and serum of the patient using the technique of ELISA and the crude extract of the food investigated.
  • US2014315749 discloses the diagnosis of food allergy through the detection of B lymphocytes in body fluids using the flow cytometry technique.
  • the present invention provides the investigation of food allergy in patients by detecting IgE and IgG1 immunoglobulins in saliva using crude extract from the investigated feed and the ELISA technique.
  • the present invention aims to solve the known problems in the state of the art from the development of the development of a method to detect food-specific IgE and IgG1 immunoglobulins involving the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) in a non-invasive, more reliable in their results, fast results, in a single test can be tested various foods.
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • the method described does not require the patient to be fasted and can be applied at any age.
  • the present invention describes a kit for detecting immunoglobulins E and immunoglobulins G1, comprising (1) a saliva collector, (2) components for preparing a food extract;
  • said component (2) should have at least 1X PBS, wherein the 1X PBS is composed of sodium chloride, dibasic potassium phosphate, dibasic sodium phosphate and distilled water.
  • the present invention describes a method for the detection of immunoglobulins E and immunoglobulins G1 carried out in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) having results collected and comprising the components:
  • an antigen in said antigen is obtained from a food or medicine which may cause allergies;
  • said biological sample selected from serum or saliva
  • the analysis of the results involves an analysis of the absorbances obtained at the end of the indirect immunoenzymatic assay performed to determine the values of immunoglobulins E and immunoglobulins G1,
  • cut-off point is defined by a statistical analysis of the sum of the mean absorbance of the negative control samples, with addition of three times the standard deviation.
  • inventive concept common to all claimed protection contexts is the detection of immunoglobulins E and G1 immunoglobulins, for the investigation of allergic food reactions.
  • Figure 1 shows an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with serum of allergic and non-allergic children at the 1: 100 dilution, revealing the presence of IgE for food proteins (maize, papaya, cow, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients when compared to non-allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • Figure 2 shows an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with serum of allergic and non-allergic children at a 1: 100 dilution, revealing the presence of IgG1 for food proteins (maize, papaya, cow's milk, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients when compared to non-allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • Figure 3 shows an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with saliva from allergic and non-allergic children at the dilution of 1: 100, revealing the presence of IgE for food proteins (corn, papaya, cow, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients when compared to non-allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • Figure 4 shows a comparison of the Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with serum and saliva of children at a 1: 100 dilution, revealing the presence of IgE in the food proteins (corn, papaya, cow's milk, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • Figure 5 shows a comparison of the Enzyme linked immunossorbent assay (ELISA) with serum and saliva of children at a 1: 100 dilution, revealing the presence of IgG1 for food proteins (corn, papaya, cow's milk, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunossorbent assay
  • Figure 6 shows a comparison of the Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with serum at 1: 100 dilution, revealing the presence of IgE and IgG1 specific for food proteins (maize, papaya , cow's milk, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients.
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • Figure 7 shows a comparison of the Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) with saliva from children at a 1: 100 dilution, revealing the presence of specific IgE and IgG1 for food proteins (maize, papaya , cow's milk, egg white, soy, peanut) in the group of allergic patients
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • the present invention relates to a process which uses a sample biological samples collected from human candidates for the investigation of specific food allergy markers from laboratory tests. It is noteworthy that once the biological sample is collected, the process described herein does not involve any other in vivo step. More precisely, the present invention describes the development of a method for detecting immunoglobulins E (IgE) and immunoglobulins G1 (IgG1) from biological samples of human candidates, preferably using saliva as a biological material. The objective of the process is to promote the investigation of food allergic reactions through the presence of IgE and IgG1, using crude food extract, collected saliva and the ELISA technique.
  • IgE immunoglobulins E
  • IgG1 immunoglobulins G1
  • the biological samples collected in the present invention may be diverse. Since for this purpose various methods of collecting material already known in the art can be used in the present invention.
  • the biological material used in the present invention is saliva.
  • the present invention provides a solution with respect to a process for investigating food allergy by detecting specific IgE and IgG1 immunoglobulins for certain foods. Since the determination of total IgE, used in existing diag- (genetic predisposition, sex, age, infections, pollution, and smoking), which does not make the results reliable. In addition, current diagnostic tests, except for oral challenge, can only detect immunoglobulin E by diagnosing only one type of allergy (IgE-mediated), or only diseases associated with its elevation of serum intestinal or cutaneous parasitoses, myeloma, hyper- -lgE, among others.
  • the present invention will be more reliable as it is the detection of specific immunoglobulins, in addition to being able to diagnose the three types of existing allergies (IgE-mediated, non-IgE-mediated and mixed) through the detection of lgG1 immunoglobulin, which is present in allergic individuals in general and do not suffer variations with external factors.
  • the technology used in the present invention is the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) already used today because it is a rapid result. In the present invention, with only one test it is possible to investigate various foods at the same time.
  • the extract of food used may be in its raw form or lyophilized.
  • the test can also be used to diagnose allergic reactions caused by medications (antibiotics such as penicillin, dipyrone, etc.).
  • the present invention describes a diagnostic kit, skilled at production on an industrial scale, to enable the test to be present in hospitals and even clinics and Health Units, as the present invention will be self-explanatory and can be performed by health professional, which facilitates the diagnosis of food allergy in the population.
  • the kit comprises a biological material collector (1) which aims to collect the saliva or serum for analysis.
  • Said biological material collector (1) may have numerous shapes and structures.
  • the biological material collector (1) is a saliva collector.
  • the kit further comprises a component for the preparation of the antigen (2), the function being to treat a food extract or medicament to provide the antigens present.
  • the antigen preparation component (2) is preferably a PBS solution, more preferably a 1X PBS solution, said solution being distinguished by comprising sodium chloride, potassium phosphate dibasic sodium phosphate, and distilled water.
  • the present invention describes a kit for detecting immunoglobulins E and immunoglobulins G1, comprising collecting biological material (1), (component for the preparation of the antigen (2);
  • said component (2) comprises a PBS providing antigens from a food extract, or an X providing antigens from a medicament.
  • the kit may be used in conjunction with an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to enable the detection of immunoglobulins E and immunoglobulins G1.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • KIT stands out to be used for the execution of the process for the detection of immunoglobulins E (IgE) and immunoglobulins G1 (IgG1).
  • IgE immunoglobulins E
  • IgG1 immunoglobulins G1
  • the present invention describes a process for the detection of immunoglobulins E and immunoglobulins G1 carried out in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the results of which are collected and comprising the components:
  • an antigen in said antigen is obtained from a food or medicine which may cause allergies;
  • said biological sample selected from serum or saliva
  • the analysis of the results involves an analysis of the absorbances obtained at the end of the indirect immunoenzymatic assay performed to determine the values of immunoglobulins E and immunoglobulins G1,
  • cut-off point is defined by a statistical analysis of the sum of the mean absorbance of the negative control samples, with addition of three times the standard deviation.
  • the allergen is a food extract selected from: cow's milk, corn, soy, peanut, egg white, and papaya.
  • the step of preparing the indirect ELISA immunoenzymatic assay comprises the step of sensitizing the indirect ELISA immunoenzymatic assay with allergen extracts.
  • the process comprises the following steps:
  • step viii repetition of step vii twice;
  • step ix the rest of the material obtained in step ix for 1 h at
  • step xii repetition of step xi twice;
  • the present invention is notable for having a non-invasive technique, which detects specific antigens, more reliable in its results, fast results, in a single test can be tested various foods, easy access and low cost. Also, it does not require fasting and can be applied at any age. When compared to the current test, these characteristics are not found.
  • Saliva samples were collected with a disposable plastic pipette in the morning, not requiring fasting. After the collection, the materials were placed in plastic tubes of 1, 5mL properly closed, identified and taken to a styrofoam containing ice. The saliva samples were centrifuged for 10 minutes and supernatants removed for then storing them at 20 Q C until analyzes.
  • the protein extracts were obtained from foods previously macerated and centrifuged to obtain the supernatant, containing the proteins soluble in phosphate buffer pH 7.4. Proteins from the supernatant were precipitated with 10% acetone TCA (trichloroacetic acid). The protein precipitate was resuspended in phosphate buffer pH 7.4 and used for plate sensitization
  • the indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) technique was used to evaluate the levels of IgE and IgG1 present in serum and saliva of allergic and non-allergic patients.
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • the plates were sensitized with the extracts of the food under study (5 pg / well). All antigens were diluted in 50 mM sodium carbonate buffer, pH 9.6, using 100 mI in each well.
  • the plates were incubated overnight at 4 ° C. The plates were then washed with PBS (NaCl, KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 .12H 2 O and KCl) -Tween (0.05%) and blocked for 2 h at 37 ° C with 200 pL of 1% PBS gelatin. After discarding the blocking solution, the plates were incubated with samples of serum and saliva of the patients also diluted in PBS gelatine in the ratio 1: 100 pg / ul, where they remained for 2 hours at 37 Q C according to the methodology cited by Paschoal (2010).
  • PBS NaCl, KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 .12H 2 O and KCl
  • the absorbance averages of the blood and saliva samples of the control group served to establish the cutoff, which was calculated by adding the average to three times the standard deviation, according to Oliveira et al. (2006).
  • the values found above cuttof were considered positive for food allergy.
  • Serum and saliva from allergic and non-allergic children were collected and tested with the food extracts produced.
  • the sample studied was composed of children being allergic to cow's milk protein (APLV) and lacking allergic symptoms.
  • the study population consisted of 55% of boys and 45% of girls with a mean age of 14.7 months ( ⁇ 1.1 months) and the diagnosis of APLV at 3.6 months ( ⁇ 4.1 months).
  • the symptoms presented were diarrhea, urticaria, abdominal distension, vomiting, bleeding, angioedema, atopic dermatitis, low weight gain and abdominal pain.
  • ABBAS Abul K .; LICHTMAN, Andrew H .; PILLAI, Shiv. Cellular and Molecular Immunology. ⁇ -edition. Rio de Janeiro, Elsevier: 2012.
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Abstract

A presente invenção tem por objetivo o diagnóstico de reações alérgicas por meio detecção de Imunoglobulinas IgE e IgG1 específicas para alimentos in natura, alimentos industrializados, aditivos alimentares e medicamentos. O teste é específico, não invasivo, fidedigno em seus resultados, de rápido resultado, o qual em um único teste podem ser testados vários alérgenos, além de ser de fácil acesso e baixo custo, não necessitando de jejum e podendo ser aplicado em pessoas de qualquer idade. A presente invenção se situa no campo da medicina e farmácia, enfermagem, nutrição, biomedicina e bioengenharia, mais especificamente, a análise de material biológico.

Description

Relatório Descritivo de Criação Industrial
KIT E PROCESSO PARA DETECÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS E E
IMUNOGLOBULINAS G1
Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se à detecção de Imunoglobulinas E (IgE) e Imunoglobulinas G1 (lgG1 ) específicas em amostras biológicas, utilizando a técnica ELISA indireta. A presente invenção se situa no campo da medicina e farmácia, enfermagem, nutrição, biomedicina e bioengenharia, mais especificamente, a análise de material biológico.
Antecedentes da Invenção
[0002] A alergia alimentar (AA) é um problema de saúde pública que apresentou um crescimento nas últimas décadas, provavelmente devido à maior exposição da população a um número maior de alérgenos alimentares disponíveis, como também o acesso mais fácil a esses alimentos. Ela vem se tornando um problema de saúde pública em todo o mundo e está associada a um impacto negativo significativo na qualidade de vida (CHARLES et al, 201 1 ).
[0003] A AA é mais comum em crianças, estima-se uma prevalência de aproximadamente 6% a 8% em menores de três anos e de 3,5% em adultos. Esta maior prevalência na infância pode ser principalmente devido ao sistema imunológico não apresentar sua maturação completa (BATISTA; FREITAS; HAACK, 2009).
[0004] Apesar das diferenças de culinárias regionais, existem dados de prevalência mundial que responsabilizam um grupo de oito alimentos que causam de 80 a 90% das reações alérgicas, entre eles estão o leite, ovo, soja, trigo, peixes, frutos do mar, amendoim e castanhas (SAMPSON et al, 201 1 ), no Brasil o milho pode ser incluído neste grupo, por ser muito utilizado na alimentação brasileira (PALMA et al, 2009).
[0005] Estudos realizados na Inglaterra e Estados Unidos (EUA), têm demonstrado que a alergia ao amendoim dobrou na última década em crianças, e que a tolerância ocorre em 20% dos casos por volta dos 5 anos de idade. Já os adultos apresentaram mais alergia a mariscos (2%), seguido pelo amendoim (0,6%), castanha (0,5%) e peixe (0,4%). As reações alérgicas a frutas e vegetais não são consideradas severas, porém cerca de 5% da população desse estudo são alérgicas (SICHERER, 2011 ). Por volta de 35% das crianças com dermatite atópica, moderada e grave, apresentaram alergia alimentar mediada pela IgE e em de 6% à 8% das crianças asmáticas têm manifestações alérgicas induzidas por alimentos (HALKEN, 2003; BARAL; MANDAL; CHATTOPADHYAY, 2005). Além disso, a AA parece ser a causa mais importante de anafilaxia fora dos hospitais levando ao atendimento de cerca de 30 casos tratados nas emergências hospitalares a cada ano nos EUA (SAMPSON, 2005).
[0006] A identificação e a eliminação das proteínas alergênicas da dieta devem levar à resolução dos sintomas. Na criança, o alimento considerado maior responsável pela AA são as proteínas do leite de vaca (2,5%), seguido pelas proteínas do ovo (1 ,3%), amendoim (0,8%), trigo (0,4%), castanhas (0,2%), peixes (0,1 %) e mariscos (0,1 %) (SICHERER, SAMPSON, 2006), e a alergia a aditivos alimentares (corantes, conservantes, edulcorantes, espessantes, etc.) são responsáveis por menos de 1 % dos casos (GAZOLA, 2008).
[0007] Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando incrementar o diagnóstico de alergia para que seja rápido, de baixo custo e eficaz, já que a população infantil é a mais afetada, levando a um fator negativo na qualidade de vida tanto dos pacientes quando dos familiares envolvidos.
[0008] Mesmo com o avanço dos conhecimentos atuais sobre os mecanismos alérgicos, e com a variedade existente de métodos in vivo e in vitro para o diagnóstico nessa área (ASBAI, 2009), a investigação laboratorial das doenças alérgicas pode ser uma tarefa difícil tanto para médicos quanto para profissionais da área da saúde. No entanto, o diagnóstico correto da alergia alimentar é fundamental para o tratamento adequado e para que não se instituam dietas desnecessárias (CHEHADE; MAYER, 2005).
[0009] A determinação de IgE total costuma ser solicitada na investigação de alergia, porém numerosos fatores (predisposição genética, sexo, idade, infecções, poluição e tabagismo) contribuem para variação do nível sérico de IgE e devem ser considerados para a sua interpretação correta. O nível sérico de IgE total é detectado por ensaio imunoenzimático (ELISA) mostrando resultados quantitativos e é variável de acordo com a idade, sendo indetectável no neonato e atingindo concentrações máximas em adultos jovens (ASBAI, 2009).
[0010] Vale ressaltar que o nível de IgE elevado não indica a presença de doença alérgica, pois avalia apenas sua quantidade momentânea e não especifica o antígeno causador das manifestações. Os resultados elevados de IgE também podem estar associados à parasitoses intestinais ou cutâneas, mieloma, síndrome de hiper-lgE, entre outras (BOYCE et al, 2010).
[0011] Outro dado importante a ser destacado é que os testes in vitro apresentam algumas desvantagens em relação ao custo, tempo de execução e sensibilidade para alguns alérgenos. Porém são considerados a melhor alternativa para pacientes em uso de anti-histamínicos, pós-quadro de anafilaxia (até 6 semanas), quando não há disponibilidade de certos extratos em testes cutâneos, quando há risco de reações sistémicas, dentre outros (ASBAI, 2009).
[0012] Importante destacar que o teste hoje considerado padrão ouro é o teste de provocação oral (PAYOT et al, 2013), o qual consiste na oferta de alimentos em doses crescentes e em intervalos regulares, sob supervisão médica, com monitoramento das reações clínicas possíveis. Entretanto é um método invasivo, custo elevado, requer ambiente hospitalar para sua realização já que pode levar o paciente a um quadro anafilático. Outro fator a ser mencionado, é por esse método consistir da ingestão gradativa do alérgeno pelo paciente, este apresentará reações alérgicas levando a um desconforto imediato (WANG, SAMPSON, 2011 ).
[0013] Outros métodos sorológicos vêm sendo estudados no sentido de confirmar o diagnóstico de AA, já que hoje os testes encontrados são feitos com o sangue ou na pele do paciente e necessitam de vários parâmetros para um diagnóstico mais fidedigno, pois com a utilização de apenas 1 deles não se pode dar diagnóstico de alergia (SOLÉ et al, 2012).
[0014] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:
[0015] O documento de AMADO. L. A. Saliva como espécime clínico para o estudo da hepatite A: aplicações no diagnóstico, na epidemiologia molecular e na patogênese. 2010. 148f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2010, revela a aplicabilidade das amostras de saliva para o diagnóstico da hepatite A através da detecção de anti-HAV IgM.
[0016] O documento de Liu J, Duan Y. Saliva: A mídia potencial para diagnóstico de doenças e monitoramento. Oncologia Oral. 2012; 48: 569-577, revela o diagnóstico de câncer bucal através detecção eletroquímica de proteínas salivares e ácidos nucleicos.
[0017] O documento de Oliveira S. A. et al, Diagnosis of rubella infection by detecting specific immunoglobulin M antibodies in saliva samples: a clinic based study in Niterói, RJ, Brazil. Ver Soc Bras Med Trop. 2000; 33 (4): 335- 339, revela o diagnóstico de rubéola através detecção da imunoglobulina M.
[0018] O documento de Berroterán A et al. Prevalecia de Helicobacter pylori em amostras de placa dental de um grupo de pacientes venezuelanos, mediante técnica de PCR. Acta Odontol Venez 2002; 40 (2):2002, revela o diagnóstico da infecção por Helicobacter pylori através detecção do DNA da bactéria pela técnica do PCR.
[0019] O documento de Rujner j. et al, Séricos antigliadina e IgA salivar e anticorpos anti-endomísio soro como teste de triagem para a doença celíaca, Acta Pediatr 1996; 85: 814-7, revela o diagnóstico de doença celíaca através detecção da IgA salivar gliadina.
[0020] O documento de Mortimer P. P.; Parry J. V., Detection of antibody to HIV in saliva: a brief review Clin. Diagn. Virol, Agosto 1994; 2 (4-5): 231 -43 (doi: doi:10.1016/0928-0197(94)90048-5), revela o diagnóstico de HIV através detecção da IgG salivar.
[0021] O documento de Mortimer P. P.; Parry J. V., Detection of antibody to HIV in saliva: a brief review Clin. Diagn. Virol., Agosto 1994; 2 (4-5): 231 -43 (doi: doi:10.1016/0928-0197(94)90048-5), revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE total e específico bem como IgG específico no soro de pacientes pelo ensaio imunoenzimático.
[0022] O documento de Carvalho S. et al: ImmunoCAP ISAC®:
Tecnologia microarray no estudo da alergia alimentar em contexto de reactividade cruzada. Ver. Port. Imunoalergologia 2010; 18 (4): 331 -352, revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE no soro de pacientes pelo ImmunoCAP®.
[0023] O documento de Ferrer M et al: Molecular diagnosis in
Allergology: application of the microarray tecnique. J Investig Allergol Clin Immunol 2009, 19 (1 ): 19-24, revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE no soro de pacientes pelo microarray.
[0024] O documento US201 1 195401 utiliza fluidos corporais para diagnosticar alergia alimentar por meio de um KIT chamado FIXANAL que detecta a presença de das imunoglobulinas IgE e IgG. Diferentemente desse documento, a presente invenção revela um processo para investigar a alergia alimentar, utilizando extratos brutos dos alimentos a serem investigados, por meio da técnica de ELISA, que detecta a presença de imunoglobulinas IgE e lgG1 em amostras biológicas de um paciente.
[0025] O documento RU2442980 utiliza a imunoglobulina IgA na saliva, após 5 dias do contato com o alérgeno, para diagnosticar alergia alimentar através da técnica de ELISA. Diferentemente desse documento, a presente invenção detecta as imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva por meio da técnica de ELISA, podendo ser realizado o exame no mesmo dia do contato com o alérgeno.
[0026] O documento PI0114343-3 revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE e IgG no sangue de pacientes utilizando a técnica microarray. Diferentemente desse documento, a presente invenção apresenta um processo para detecção de IgE e lgG1 a partir da saliva ou do soro utilizando a técnica de ELISA e extrato bruto dos alimentos investigados.
[0027] O documento WO2016094961 revela o diagnóstico de alergia alimentar através da técnica Methylation Patter que detecta regiões/genes metilados no DNA de diversos fluidos corporais, tendo a saliva como um deles. Esta patente não realiza ensaios imunoenzimáticos e por isso não detecta imunoglobulinas, o que a torna diferente da presente invenção, que provê uma investigação da alergia alimentar por meio da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva e no soro do paciente, utilizando a técnica de ELISA e o extrato bruto dos alimentos investigados.
[0028] O documento US2014315749 revela o diagnóstico de alergia alimentar através da detecção de linfócitos B em fluidos corporais com a técnica de citometria de fluxo. Diferentemente desse documento, a presente invenção realiza a investigação de alergia alimentar em pacientes por meio da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva utilizando extrato bruto dos alimentos investigados e a técnica de ELISA.
[0029] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.
[0030] Não obstante, em vista dos métodos atuais utilizados para a investigação de sinalizadores fisiológicos de alergias alimentares em pacientes, não exaustivamente, destaca-se o problema constante no estado da técnica de alguns processos serem invasivos (coleta de sangue), e necessitarem a repetição dos testes, o que pode causar dor e desconforto ao paciente investigado, tornando um problema principalmente quando se trata de um público infantil; além disso os outros processos não invasivos, não permitirem o detecção de sinalizadores fisiologicos de alergia alimentar, utilizando extratos brutos dos alimentos investigados, por meio da técnica de ELISA que detecta a presença das imunoglobulinas Ige e lgG1 na saliva e no soro.
[0031] Outro ponto importante, é que nos testes existentes atualmente há necessidade de jejum por de 8 horas em crianças aproximadamente e 4 horas em adultos, o que muitas vezes causam angústia, ansiedade e/ou tristeza aos candidatos a serem investigados, assim como os pais destes (no caso de crianças).
Sumário da Invenção
[0032] Desta forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir do desenvolvimento do desenvolvimento de um método detectar Imunoglobulinas IgE e lgG1 específicas para alimentos, envolvendo a técnica de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) de forma não invasivo, mais fidedigno em seus resultados, de rápido resultado, em um único teste podem ser testados vários alimentos. Além disso, o método descrito não requer que o paciente esteja de jejum e pode ser aplicado em qualquer idade.
[0033] Em um primeiro objeto a presente invenção descreve um kit para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , compreendendo (1 ) um coletor de saliva, (2) componentes para preparar um extrato de alimentos;
em que o dito componente (2), deve apresentar pelo menos um PBS 1X, em que o PBS 1 X é composto por cloreto de sódio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio dibásico e água destilada.
[0034] Em um segundo objeto a presente invenção descreve um processo para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , executado em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), tendo seus resultados coletados e compreendendo os componentes:
- um antígeno, em o dito antígeno é obtido a partir de um alimento ou medicamento que podem ocasionar alergias;
- amostra biológica, em que a dita amostra biológica selecionada entre soro ou saliva;
em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,
em que o resultado positivo para alergia é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte,
em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.
[0035] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados é a detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , para a investigação reações alérgicas de alimentos.
[0036] Este e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.
Breve Descrição das Figuras
[0037] A Figura 1 mostra um teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.
[0038] A Figura 2 mostra um teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de lgG1 para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.
[0039] A Figura 3 mostra um Teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com saliva de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.
[0040] A Figura 4 mostra uma comparação dos testes“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro e saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.
[0041] A Figura 5 mostra uma comparação dos testes“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro e saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de lgG1 para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.
[0042] A Figura 6 mostra uma comparação do Teste“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE e lgG1 específicas para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.
[0043] A Figura 7 mostra uma comparação do Teste“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE e lgG1 específicas para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos
Descrição Detalhada da Invenção
[0044] A presente invenção refere-se a um processo que utiliza amostra biológica coletadas de candidatos humanos, para a investigação de sinalizadores específicos para alergias alimentares, a partir de testes laboratoriais. Vale ressaltar que uma vez coletada a mostra biológica, o processo aqui descrito não envolve nenhuma outra etapa in vivo. Mais precisamente, a presente invenção descreve o desenvolvimento de processo para detecção de imunoglobulinas E (IgE) e imunoglobulinas G1 (lgG1 ) de amostras biológicas de candidatos humanos, preferencialmente utilizando a saliva como material biológico. O processo tem com objetivo fomentar a investigação de reações alérgicas alimentares através da presença de IgE e lgG1 , utilizando extrato brutos de alimentos, saliva coletada e a técnica de ELISA.
[0045] As amostras biológicas coletadas na presente invenção podem ser diversas. Sendo que para isso diversos métodos de coletadas de material já conhecidos na técnica podem ser utilizados na presente invenção. Preferencialmente, o material biológico utilizado na presente invenção é a saliva.
[0046] Entre as vantagens da presente invenção, destaca-se que pelo fato do material biológico ser a saliva, por tal motivo o processo torna-se não invasivo. Interessante dizer que, em outros processos, na fase do diagnóstico de alergia os pacientes podem ter seu sangue coletado inúmeras vezes. Assim, a construção de um teste não invasivo a repetição dos testes poderiam acontecer de uma forma que não causasse dor nem desconforto ao paciente investigado, tornando um argumento importante por se tratar de um maior público infantil. Outro fato importante a mencionar e a presente invenção não necessitara grandes quantidades do material (saliva) para realização do teste, tornando-o mais viável.
[0047] A presente invenção apresenta uma solução no que refere-se a um processo para investigação de alergia alimentar através da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 específicas para determinados alimentos. Uma vez que a determinação de IgE total, utilizada nos testes diagósticos existentes atualmente, pode variar com numerosos fatores (predisposição genética, sexo, idade, infecções, poluição e tabagismo) o que não torna os resultados fidedignos. Além disso, os testes diagnóstico atuais, exceto o por provocação oral, só consegue detectar a imunoglobulina E diagnosticando apenas um tipo de alergia (mediada por IgE), ou apenas doenças associadas com sua elevação sérica parasitoses intestinais ou cutâneas, mieloma, síndrome de hiper-lgE, entre outras . Dessa forma, a presente invenção será mais fidedigna por se tratar da detecção de imunoglobulinas especificas, além de conseguir diagnosticar os três tios de alergias existentes (mediada por IgE, não mediada por IgE e mistas) através da detecção da imunoglobulina lgG1 , a qual está presente em pessoas alérgicas em geral e não sofrem variações com fatores externos.
[0048] A tecnologia utilizada na presente invenção é o ensaio imunoenzimático (ELISA) já utilizado atualmente por ser de rápido resultado. Na presente invenção, com apenas um teste é possível investigar a vários alimentos ao mesmos tempo. Além disso, o extrato de alimentos utilizados pode ser em sua forma bruta ou liofilizadas.
[0049] Além da detecção de IgE e lgG1 específicas para alimentos, o teste também pode ser utilizada para o diagnóstico de reações alérgicas causadas por medicamentos (antibióticos como penicilina, dipirona etc).
[0050] Ainda, a presente invenção descreve um para kit diagnóstico, hábil à produção em escala industrial, para possibilitar que o teste esteja presente em hospitais e até mesmo consultórios e Unidades de Saúde, já que a presente invenção será autoexplicativa podendo ser executada por qualquer professional de saúde, o que facilita o diagnóstico de alergia alimentar na população.
KIT para Detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1
[0051] O Kit compreende um coletor de material biológico (1 ) que tem como objetivo coletar a saliva ou soro para ser analisado. O dito coletor de material biológico (1 ) pode ter inúmeras formas e estruturas. Preferencialmente, o coletor de material biológico (1 ) é um coletor de saliva.
[0052] O kit ainda compreende um componente para preparação do antígeno (2), sendo tem a função de tratar um extrato de alimento ou medicamento para prover os antígenos presentes. Para a preparação de um extrato de alimentos, o componente para preparação do antígeno (2) é preferencialmente uma solução PBS, mais preferencialmente é uma solução PBS 1 X, em que a dita solução destaca-se por compreender cloreto de sódio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio dibásico e água destilada.
[0053] Dessa forma, em um primeiro objeto a presente invenção descreve um kit para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , compreendendo coletor de material biológico (1 ), (componente para preparação do antígeno (2);
em que o dito componente (2), compreende um PBS prover antígenos de a partir de um extrato de alimentos, ou um X prover antígenos de a partir de um medicamento.
[0054] Na invenção, o kit pode ser utilizado junto com um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para poder realizar a detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1.
[0055] Dessa forma, KIT descrito destaca-se para ser utilizado para a execução do processo para detecção de imunoglobulinas E (IgE) e imunoglobulinas G1 (lgG1 ). Sendo que tal processo é mais bem descrito abaixo.
Processo para Detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1
[0056] Em um segundo objeto a presente invenção descreve um processo para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , executado em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), tendo seus resultados coletados e compreendendo os componentes:
- um antígeno, em o dito antígeno é obtido a partir de um alimento ou medicamento que podem ocasionar alergias;
- amostra biológica, em que a dita amostra biológica selecionada entre soro ou saliva;
em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,
em que o resultado positivo para alergia é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte,
em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.
[0057] Em outra concretização do segundo objeto, o alérgeno é um extrato de alimento selecionado entre: leite de vaca, milho, soja, amendoim, clara de ovo e mamão.
[0058] Em outra concretização do segundo objeto, a etapa de preparo de ensaio imunoenzimático ELISA indireto, compreende a etapa de sensibilização do ensaio imunoenzimático ELISA indireto com extratos de alergênicos.
[0059] Em outra concretização do segundo objeto, o processo compreende as seguintes etapas:
i. sensibilização das placas através da adição de 5 pg dos extratos dos alimentos por poço;
ii. adição de 100 mI de tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6em cada poço;
iii. incubação de pernoite das placas a uma temperatura de 4°C;
iv. lavagem das placas com PBS;
v. bloqueio, utilizando 200 pL de PBS gelatina à 1 % por 2h em uma temperatura de 37 °C;
vi. incubação das placas com as amostras biológicas diluídas em PBS gelatina na proporção de 1 :100 pg/pL por 2 horas à 37QC;
vii. lavagem utilizando PBS Tween;
viii. repetição por duas vezes da etapa vii;
ix. adição de anticorpos anti-lgE e anti-lgG1 , diluídos em PBS gelatina (1 :2000);
x. descanso do material obtido na etapa ix por 1 h à temperatura de
37QC;
xi. lavagem utilizando PBS Tween;
xii. repetição por duas vezes da etapa xi;
xiii. adição de 100 mI_ por poço da solução reveladora tetrametilbenzidina;
xiv. descanso do material obtido na etapa xiii por 15 minutos;
xv. medição das absorbâncias em comprimento de onda de 620nm.
[0060] A presente invenção se destaca por apresentar uma técnica não invasiva, que detecta antígenos específicos, mais fidedigna em seus resultados, de rápido resultado, em um único teste podem ser testados vários alimentos, de fácil acesso e baixo custo. Além disso, não necessitando de jejum e pode ser aplicado em qualquer idade. Quando comparado ao teste existente atualmente, essas características não são encontradas.
Exemplos - Concretizações
[0061] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.
Exemplo 1. Processo para o Desenvolvimento do Teste Diagnóstico para Alergia a Alimentos e Medicamentos
Coleta da Saliva
[0062] As amostras de saliva foram coletadas com pipeta plástica descartável no período da manhã, não necessitando de jejum. Após a coleta, os materiais foram colocados em tubos plásticos de 1 ,5mL devidamente fechados, identificados e levados a um isopor contendo gelo. As amostras salivares foram centrifugadas durante 10 minutos e retirados os sobrenadantes para em seguida armazená-los à 20QC até as análises.
Preparo dos extratos alimentares [0063] Para os testes imunológicos, foram utilizados os extratos proteicos do leite de vaca, milho, soja, amendoim, clara de ovo e mamão, preparados no Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular da UECE. Os alimentos foram escolhidos por fazer parte da alimentação habitual das crianças brasileiras, porém o amendoim foi escolhido devido ao seu poder alergênico.
[0064] Os extratos proteicos foram obtidos dos alimentos previamente macerados e centrifugados para obtenção do sobrenadante, contendo as proteínas solúveis em tampão fosfato pH 7,4. As proteínas do sobrenadante foram precipitadas com acetona 10% TCA (ácido tricloroacético). O precipitado proteico foi ressuspendido em tampão fosfato pH 7,4 e utilizado para a sensibilização das placas
Técnica Utilizada
ELISA (Enzvme Linked Immunosorbent Assav)
[0065] A técnica de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indireta foi utilizada para avaliar os níveis de IgE e lgG1 presentes no soro e saliva dos pacientes alérgicos e não alérgicos. Para esse ensaio, foram usadas as placas de 96 poços.
[0066] As placas foram sensibilizadas com os extratos dos alimentos em estudo (5 pg/orifício), Todos os antígenos foram diluídos em tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6, sendo usado 100 mI em cada poço.
[0067] As placas foram incubadas‘overnight’ a uma temperatura de 4°C. Em seguida, as placas foram lavadas com PBS (NaCI, KH2P04, Na2HP04.12H20 e KCI)-Tween (0,05 %) e bloqueadas por 2 h a uma temperatura de 37 °C com com 200 pL de PBS gelatina à 1 %. Logo após o descarte da solução de bloqueio, as placas foram incubadas com amostras dos soros e salivas dos pacientes também diluídos em PBS gelatina na proporção de 1 :100 pg/pL, onde permaneceram por mais 2 horas à 37QC, de acordo com a metodologia citada por Paschoal (2010).
[0068] Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween e adicionados anticorpos anti-lgE e anti-lgG1 (anticorpos secundários conjugados à peroxidase), diluídos em PBS gelatina (1 :2000), permanecendo por mais 1 h à temperatura de 37QC. Para finalizar o processo as placas foram novamente lavadas 3 vezes com PBS Tween, para então receber 100 pL/poço da solução reveladora TMB (tetrametilbenzidina) para após 15 minutos medir as densidades ópticas em leitor de ELISA (PASCHOAL, 2010; FLORINDO et al., 2002).
[0069] Para a análise dos resultados, as médias das absorbâncias das amostras de sangue e saliva do grupo controle serviram para estabelecer o ponto de corte (cuttof), o qual foi calculado pela soma da média com três vezes o desvio padrão, segundo Oliveira et al (2006). Os valores encontrados acima do cuttof foram considerados positivos para alergia alimentar.
Testes com soro e saliva de crianças alérgicas e não alérgicas
[0070] O soro e a saliva de crianças alérgicas e não alérgicas foram coletados e testados com os extratos alimentares produzidos.
[0071] A amostra estudada foi composta por crianças sendo alérgicas à proteína do leite de vaca (APLV) e com ausência de sintomas alérgicos. A população alérgica do estudo foi composta por (55%) meninos e (45%) meninas com idade média de 14,7 meses (± 1 1 ,2 meses) e o diagnóstico de APLV aos 3,6 meses (± 4,1 meses). Os sintomas apresentados foram diarréia, urticária, distensão abdominal, vómitos, sangramentos, angioedema, dermatite atópica, baixo ganho de peso e dor abdominal.
[0072] Das amostras estudadas, 70,7% das crianças receberam leite materno, porém o tempo médio de amamentação foi de 3,7 meses (± 3,1 ). Em relação à avaliação antropométrica das pacientes, o peso médio encontrado de 0 a 12 meses de idade foi 7.161 Kg (± 1.973), dos 13 aos 24 meses de idade 9.456Kg (± 2.216) e as crianças dos 25 aos 51 meses foi de 12.263Kg (± 3.023).
[0073] A classificação segundo o Escore Z das crianças, de acordo com os parâmetros da Organização Mundial da Saúde - (WHO, 2007), a grande maioria apresentou adequação quanto à estatura/idade, peso/idade e peso/estatura, apresentando apenas 1 criança acima e 8 abaixo da curva.
[0074] No presente estudo, o soro e a saliva de todas as crianças foram submetidos ao teste de ELISA indireto para detectar a presença de imunoglobulinas lgG1 e IgE como indicadoras de reações alérgicas.
[0075] No grupo dos alérgicos foi feita uma análise de variância pela ANOVA e comparado as médias através do Teste Turkey entre os alimentos com o soro e a imunoglobulina E. A diferença estatisticamente significante (p<0,05) foi encontrada quando o mamão foi comparado com a albumina e o leite de vaca, bem como o leite de vaca com a soja e amendoim.
[0076] Quando analisados os soros e a lgG1 , os resultados estatisticamente significativos (p<0,05) foram obtidos quando comparado o leite de vaca com o milho, a albumina e o amendoim. O mesmo cruzamento foi feito entre os alimentos e a saliva, resultado o qual não mostrou significância.
[0077] Quando a placa foi sensibilizada com os precipitados de proteínas dos alimentos analisados, observou-se que em 85% das crianças alérgicas foi detectada a presença de IgE e em 98% a presença de lgG1 para o soro no leite de vaca. Já na saliva foi de 88% da população detectando a IgE e 100% de lgG1 , mostrando que tanto a saliva quanto o lgG1 foram mais sensíveis diante do sangue e IgE. Por outro lado, nenhuma reação nem variação relevantes foram observadas com os soros das 19 crianças não alérgicas, resultados semelhantes foram observados com os demais alimentos, como pode ser observado na figura 4 e tabela 1.
[0078] Quando comparado o grupo alérgico com o grupo o controle não alérgico, observa-se que utilizando o“teste QUI-QUADRADO”, os resultados de IgE e lgG1 no sangue e na saliva são significativamente diferentes com p < 0,05 para todos os alimentos, podendo ser dito o mesmo para o experimento com a saliva.
[0079] Enquanto a comparação entre os alimentos tanto utilizando o soro quanto a saliva, foi observado que o leite de vaca e o milho foram os alimentos com maior tendência a induzir a produção de IgE e lgG1.
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Claims

Reivindicações
1. Kit para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , caracterizado por compreender (1 ) um coletor de saliva, (2) componentes para preparar um extrato de alimentos;
em que o dito componente (2), deve apresentar pelo menos um PBS 1X, em que o PBS 1 X é composto por cloreto de sódio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio dibásico e água destilada.
2. Processo para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , caracterizado pelo fato ser executado em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) e ter seus resultados obtidos no dito ensaio coletados e compreender os componentes:
- um antígeno, em o dito antígeno é obtido a partir de um alimento ou medicamento que podem ocasionar alergias;
- amostra biológica, em que a dita amostra biológica selecionada entre soro ou saliva;
em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,
em que o resultado positivo para alergia é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte,
em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender os componentes:
- alérgeno, em o dito alérgeno é obtido a partir de um extrato de alimento, em sua forma bruta ou liofilizada;
- amostra biológica, em que a dita amostra biológica é saliva;
em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,
em que o resultado positivo para alergia alimentar é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte.
em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 3, caracterizado, pela amostra biológica, ser uma saliva preparada pelas seguintes etapas:
- Adição da Saliva em um recipiente fechado, que permita ser centrifugado em centrífugas;
- centrifugação à 4000rpm, durante 10 minutos;
- coleta do sobrenadante para ser analisado no ensaio imunoenzimático indireto.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizado, componente alérgeno ser um extrato de alimento preparado pelas seguintes etapas:
- trituração do alimento em PBS 1 X,
em que o dito PBS1 X é produzido a partir da junção de 80g de cloreto de sódio, 2g de fosfato de potássio dibásico, 21 , 7g de fosfato de sódio dibásico em 1 litro de água destilada que resultou em PBS 10X, e quando diluído 100 mL deste em 900 mL de água destilada, ajustado o pH para 7,4 com ácido clorídrico resulta em PBS 1 X.
em que tampão de cobertura usado para a diluição de todos extratos foi o tampão carbonato (0,01 M) obtido através da mistura de 1 ,59g de carbonato de sódio com 2,93g de bicarbonato de sódio para cada 1 litro de água destilada e pH 9,6.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 2 a 5, caracterizado pelo alérgeno ser um extrato de alimento selecionado entre: leite de vaca, milho, soja, amendoim, clara de ovo e mamão.
7. Processo para detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pela etapa de preparo de ensaio imunoenzimáticoELISA indireto, compreender a etapa de sensibilização do ensaio imunoenzimático ELISA indireto com extratos de alergênicos.
8. Processo para detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1 de acordo com as qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
i. sensibilização das placas através da adição de 5 pg dos extratos dos alimentos por poço;
ii. adição de 100 mI de tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6em cada poço;
iii. incubação de pernoite das placas a uma temperatura de 4°C;
iv. lavagem das placas com PBS;
v.bloqueio,utilizando200 pL de PBS gelatina à 1 % por 2h em uma temperatura de 37 °C;
vi. incubação das placas com as amostras biológicas diluídas em PBS gelatina na proporção de 1 :100 pg/pL por 2 horas à 37QC;
vii. lavagem utilizando PBS Tween;
viii. repetição por duas vezes da etapa vii;
ix. adição de anticorpos anti-lgE e anti-lgG1 , diluídos em PBS gelatina (1 :2000);
x. descanso do material obtido na etapa ix por 1 h à temperatura de
37QC;
xi. lavagem utilizando PBS Tween;
xii. repetição por duas vezes da etapa xi;
xiii. adição de 100 pL por poço da solução reveladora tetrametilbenzidina;
xiv. descanso do material obtido na etapa xiii por 15 minutos;
xv. medição das absorbâncias em comprimento de onda de 620nm.
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