WO2019107256A1 - 脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー - Google Patents
脳梗塞の発症リスクを高感度に検出する体液抗体バイオマーカー Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a means for detecting a disease, and more specifically, the risk of developing a cerebral infarction by detecting a humoral antibody against DIDO1 protein, CPSF2 protein, or a peptide having these partial sequences as a biomarker. It is an invention about grasping means.
- Cerebral infarction often leads to direct death, and even if it does not lead to death, long rehab is required and it is the leading cause of bedriding. Therefore, cerebral infarction is a heavy burden for patients themselves and their families, and it leads to an increase in national medical expenses socially, and prevention of the onset is an important issue. If it is possible to grasp minute signs of cerebral infarction and predict the onset of subsequent cerebral infarction, there is a very high possibility that cerebral infarction may be prevented by treatment before the onset or improvement of lifestyle.
- Hsp60 nonpatent literature 1
- RPA2 nonpatent literature 2
- SOSTDC1 nonpatent literature 3
- HDL high-density lipoprotein
- LDL low-density lipoprotein
- TC total cholesterol
- Non-patent document 5 uric acid
- Non-patent document 6 ATP2B4
- BMP-1 non-patent document 7
- DHPS oxidized low-density lipoprotein
- SH3BP5 non-patent document 9
- heart Phospholipids of vascular disease Non-patent document 10
- apolipoprotein A-1 Non-patent document 11
- oxidized low-density lipoprotein Non-patent
- Cerebral angiopathy such as cerebral infarction is the fourth leading cause of death in Japan, and as mentioned above, cerebral infarction is the first cause of bedriding, and once a cerebral infarction develops, it leads to death. You are forced to take medicine for long rehab. Therefore, it is important to prevent the onset of cerebral infarction, for which various risk factors have been identified, high blood pressure, hyperlipidemia, diabetes, smoking habits, and blood test neutral fat, bad cholesterol level, Various low adiponectin levels and the like are known (Non-patent Documents 18 and 5). However, diabetes and the like are difficult to treat, and even if the blood test item has an abnormal value, cerebral infarction does not immediately occur. Attempts to predict onset using a combination of risk factors have also been tried, but it is not sufficient yet.
- the present inventors have been able to accurately grasp the symptoms leading to the onset of cerebral infarction by measuring the level of antibody against body fluid against DIDO1 protein, CPSF2 protein, or a peptide having a partial sequence thereof in body fluid.
- the present invention has been completed.
- Cerebral infarction is a disease in which cerebral nerve cells are damaged due to oxygen and nutrient deprivation due to narrowing of blood vessels in the brain due to arteriosclerosis and clogging of thrombus.
- the present invention primarily comprises measuring antibody levels in a body fluid sample separated from a living body against DIDO1 protein or a part thereof and / or CPSF2 protein or a part thereof.
- a data acquisition method relating to onset hereinafter also referred to as a data acquisition method of the present invention.
- DIDO1 protein as an antigen which is a basis for capturing a humoral antibody to be measured
- DIDO1 protein is a 1 to 6 splicing variant of DIDO1 protein also called death inducer-obliterator 1 (accession The numbers are one of NM_022105.4, NM_080796.3, NM_080797.3, NM_033081.2, NM_001193369.1, and NM_001193370.1 are registered in NCBI from 1 to 6, respectively.
- the base sequence of the DIDO1 splicing variant 4 gene is as shown in SEQ ID NO: 1.
- Splicing variants 1 and 2 of the DIDO1 protein consist of 562 amino acids, splicing variants 3 and 6 consist of 1189 amino acids, and splicing variants 4 and 5 consist of 2240 amino acids.
- the amino acid sequence of the longest splicing variant 4 gene of DIDO1 is shown in SEQ ID NO: 2.
- the DIDO1 protein used as an antigen in the examples described later is an N-terminal region portion (SEQ ID NO: 3) of 275 amino acids from the N-terminus, and this region is a sequence common to all of the DIDO1 splicing variants.
- DIDO1 peptide used as an antigen in the same example is the amino acid sequence at position 543-560 (SEQ ID NO: 4), and this region is a sequence common to DIDO1 splicing variants 3 to 6. Since similar results are obtained with the protein antigen of DIDO1 and the peptide antigen, it is considered that the DIDO1 protein recognized by the humoral fluid antibody does not distinguish between different splicing variants. That is, DIDO1 of the present invention is not limited to a specific splicing variant.
- the CPSF2 protein is referred to as another name cleavage and polyadenylation specific factor 2 or CPSF100, and is registered in NCBI under the accession number "NM_017437".
- the nucleotide and amino acid sequences of the CPSF2 gene are as shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
- the present invention secondly provides a data acquisition kit (hereinafter also referred to as the kit of the present invention) for carrying out the data acquisition method of the present invention.
- a data acquisition kit hereinafter also referred to as the kit of the present invention
- the antibody level against DIDO1 protein or a part thereof and / or CPSF2 protein or a part thereof in a body fluid sample separated from a living body is measured
- a kit for performing a method of grasping the onset of cerebral infarction which is characterized by
- the present invention provides a means for accurately grasping the risk of cerebral infarction by using, as a biomarker, a fluid antibody against DIDO1 protein, CPSF2 protein, or a peptide having a partial sequence thereof. This provides prevention of the onset of cerebral infarction and provides a therapeutic motive for cerebral infarction. Furthermore, accurate medical condition understanding of arteriosclerosis related diseases leading to cerebral infarction development can be performed.
- the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the DIDO1 protein (splicing variant 4) is shown in one-letter notation, and the portion corresponding to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the DIDO1 peptide used in the examples is underlined.
- the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the CPSF2 full-length protein is shown in one-letter notation, and the portion corresponding to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the CPSF2 peptide used in the Examples is underlined.
- the results of quantifying DIDO1 serum antibody and CPSF2 serum antibody levels by AlphaLISA method in healthy (HD), transient ischemic attack (TIA) and acute cerebral infarction (aCI) patients are shown.
- the results when the DIDO1 protein antigen is used are shown by a, and the results when the CPSF2 peptide antigen is used are shown by b, in a box-and-whisker plot, respectively.
- the vertical axes of these box plots are alpha counts indicating antibody levels, and the boundaries shown in each ark are the tenth from the bottom (the bottom horizontal bar), the 20th (the bottom of the box), 50 The second (center line of the box), the 80th (upper side of the box), and the 90th (uppermost horizontal bar) percentiles are shown.
- the results of measurement of DIDO1 serum antibody and CPSF2 serum antibody levels in patients with HD, acute myocardial infarction (AMI) and diabetes (DM) by the AlphaLISA method are shown.
- the results when the DIDO1 protein antigen is used are shown by a, and the results when the CPSF2 peptide antigen is used are shown by b, in a box-and-whisker plot, respectively.
- the box view is as described in the description of FIG.
- the results of measurement of DIDO1 serum antibody and CPSF2 serum antibody levels in patients with HD and chronic kidney disease (CKD) by the AlphaLISA method are shown.
- the results when the DIDO1 protein antigen is used are shown by a, and the results when the CPSF2 peptide antigen is used are shown by b, in a box-and-whisker plot, respectively.
- the box view is as described in the legend of FIG.
- Data acquisition method of the present invention (a) Body fluid sample separated from a living body Body fluid of "a body fluid sample separated from a living body” used as a target of data acquisition in the data acquisition method of the present invention Etc., and the "sample” is the body fluid itself or a processed product in a state of being separated from the body.
- a blood sample is preferred. Blood samples include samples of whole blood, serum, plasma and the like, but serum samples or plasma samples are preferable, and serum samples are particularly preferable.
- the blood sample may be subjected to anticoagulation treatment such as heparin treatment.
- Body fluid antibody capture antigen SEQ ID NO: 2 which is the amino acid sequence of DIDO1 protein which is the basis for capturing body fluid antibodies in the data acquisition method of the present invention, and SEQ ID NO: 6 which is the amino acid sequence of CPSF2 protein are all body fluid antibodies. It is possible to use as a capture antigen, or to use a part.
- amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 When a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is used as a humoral antibody capture antigen, 7-1189 amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and 7-782 consecutive amino acid sequences are selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
- an amino acid sequence (peptide) of short chain length in which case the number of amino acid sequences is preferably about 7-30. More preferably, it is about 10-20.
- a target fluid antibody DIDO1 protein, CPSF2 protein, or a fluid antibody to a peptide having a partial sequence thereof
- a fluid antibody capture antigen candidate having an amino acid residue modified is, for example,
- the humoral fluid antibody is captured by the same method as the method of the example of the present specification, it is necessary to be able to grasp the risk of the objective cerebral infarction development from the captured antibody level.
- the “deletion” is a deletion of any amino acid residue in the target amino acid sequence, and the amino acid residue at the N-terminal side (before) and the C-terminal side (after) of the deleted amino acid residue.
- Group is linked by peptide bond (in the case of deletion of N-terminal amino acid residue and C-terminal amino acid residue, the corresponding amino acid residue is simply deleted), and The number is counted as "the number of amino acid deletions".
- substitution any amino acid residue in the target amino acid sequence is replaced with “other amino acid residue”, and the replaced amino acid residue is N-terminal (front) and C-terminal ( (Attachment) with each amino acid residue by peptide bond (in the case of substitution of N-terminal amino acid residue, only peptide bond with amino acid residue at C-terminal side), substitution of C-terminal amino acid residue
- the number of substitution residues is counted as "the number of amino acid substitutions", and only the peptide bond with the amino acid residue at the N-terminal side).
- “Addition” means a state in which a new peptide bond is formed with one or more new amino acid residues inserted at any one or more peptide bond positions in the target amino acid sequence. It is. The addition of one or more new amino acid residues at the N-terminus and C-terminus is also included in the concept of “addition”. The number of these "added” amino acid residues is counted as "the number of amino acid additions”.
- amino acid sequence of the peptide used as a humoral antibody capture antigen include, for example, SEQ ID NO: 4 (AMAASKKTAPPPGSAVGKQ) as a DIDO1 protein-derived, and as CPSF protein, for example, SEQ ID NO: 7 (CPSF2- 607: QVRLKDSLVSSLQFC).
- SEQ ID NO: 4 AMAASKKTAPPPGSAVGKQ
- CPSF protein for example, SEQ ID NO: 7 (CPSF2- 607: QVRLKDSLVSSLQFC).
- the modifiable number of amino acids of these capture peptides is one according to the above criteria.
- a humoral antibody capture antigen of a predetermined amino acid sequence can be secured according to a conventional method. Specifically, for example, based on the nucleotide sequence of the DIDO1 gene shown in SEQ ID NO: 1, or the CPSF2 gene shown in SEQ ID NO: 6, for amplifying double-stranded DNA having all or part of these nucleotide sequences.
- a primer for nucleic acid amplification is designed, and a gene amplification product by PCR or the like using the amplification primer is obtained as all or part of the DIDO1 gene or CPSF2 gene, and is used to prokaryote pGEX-4T or the like.
- the transformant is incorporated into an expression vector, the vector is incorporated, and a transformant transformed is selected, and a drug such as IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside) is further added to thereby all of a predetermined DIDO1 gene or CPSF2 gene.
- a drug such as IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside) is further added to thereby all of a predetermined DIDO1 gene or CPSF2 gene.
- induced expression of part of the expressed DIDO1 protein Quality, or the whole or a part of CPSF2 proteins, for example, can be purified by affinity chromatography using glutathione-Sepharose and (GE Healthcare Life Sciences).
- a peptide having a partial sequence of DIDO1 protein or CPSF2 protein is a chemical synthesis of a known peptide It can be easily manufactured according to the law.
- peptide synthesis it is possible to produce using a liquid phase peptide synthesis method or solid phase peptide synthesis method which is now established as a conventional method. And, it is possible to use Boc solid phase method or Fmoc solid phase method as a solid phase peptide synthesis method generally recognized as a suitable chemical synthesis method.
- a modification structure can be appropriately added to the proteins or peptides (essential parts for antibody capture of humoral fluid) used as these humoral antibody capture antigens.
- proteins or peptides essential parts for antibody capture of humoral fluid
- GST glutthione S-transferase
- AlphaLISA Aminescence Proximity Homogeneous Assay-Linked Immunosorbent Assay
- DIDO1 protein or a part thereof in a body fluid sample separated from a living body such as a blood sample And / or quantify the antibody level in a body fluid sample separated from a living body against CPSF2 protein or a portion thereof (hereinafter, also referred to as "CPSF2 antigen"), and the quantified value is higher than a standard value (cut-off value) If large, it is possible to identify the enhancement of DIDO1 antigen and / or CPSF2 antigen in the body fluid sample donor, and use this as an index for data on the onset of cerebral infarction in the subject sample donor.
- the quantitative value is larger than the standard value (cut-off value)
- the promotion of DIDO1 antigen or CPSF2 antigen in a body fluid sample provider separated from the living body is identified, and this is used as an index. It can be data on the onset of cerebral infarction in a sample donor.
- the standard value of the fluid antibody level against DIDO1 antigen or CPSF2 antigen in the test sample is a control sample population consisting of those in whom no abnormality such as a sign of cerebral infarction is found in the head MRI examination,
- a cutoff value can be derived including a quantitative value of the fluid antibody against the test sample DIDO1 antigen or CPSF2 antigen, and performing statistical processing thereon to determine an average, a standard deviation, and the like.
- the measurement of the body fluid antibody level may be carried out, for example, by contacting a body fluid sample separated from a living body with the immobilized body fluid antibody capture antigen (including protein and peptide, ie, “DIDO1 antigen” and “CPSF2 antigen”) described above,
- the detection may be carried out by detecting the binding of an antibody against DIDO1 protein in a body fluid sample separated from the living body or an antibody against CPSF2 protein (both body fluid antibodies) based on an antigen-antibody reaction with the body fluid antibody capture antigen as a signal. it can.
- quantitative measurement is carried out using means such as AlphaLISA method, ELISA method, indirect fluorescent antibody method, western blot method (immunoblot method), nephelometry, nephelometry, latex agglutination nephelometric method, CLEIA method, etc. It can be carried out.
- Any quantitative measurement means exemplified here is an established quantitative measurement means when the quantitative target substance is an antibody in a body fluid sample separated from a living body.
- a glutathione-conjugated donor bead is used, and a biotinylated DIDO1 peptide or a biotinylated biological CPSF2 peptide is a bodily fluid antibody
- a streptavidin antibody-bound donor bead is used, and a humoral antibody capture antigen, a blood sample, and an acceptor bead conjugated with an anti-human IgG antibody are mixed, and incubated for several hours to several days at room temperature to form
- the desired antigen-antibody complex can be quantified by irradiating the light of 680 nm and detecting the generated light of 520-620 nm.
- a body fluid sample separated from a living body is brought into contact with a protein array on which a predetermined body fluid antibody capture antigen is immobilized, and the formed body fluid antibody capture antigen-anti-DIDO1 body fluid antibody complex, or CPSF2 body fluid antibody
- the complex can be further contacted with a fluorescently labeled secondary antibody to quantify the humoral antibody against DIDO1 protein or CPSF2 protein.
- quantification is performed by using the label of the secondary antibody used in the indirect fluorescent antibody method as an enzyme label.
- the label of the secondary antibody can be selected in various ways.
- a body fluid antibody capture antigen is electrophoresed on an SDS-polyacrylamide gel, and then transferred from the gel to a carrier such as nitrocellulose membrane, and brought into contact with a body fluid sample separated from a living body to capture the resulting body fluid antibody capture.
- Quantitative measurement can be performed by detecting the antigen-anti-DIDO1 humoral antibody complex or the same CPSF2 humoral antibody complex using a secondary antibody.
- a fluid antibody capture antigen-anti-DIDO1 fluid antibody complex formed by contacting a fluid sample separated from a living body with a fluid antibody capture antigen
- the quantification can be performed by detecting the turbidity (turbidimetric method) or the change in the scattered light intensity (specifical method).
- turbidimetric method by bringing latex particles bound to a fluid antibody capture antigen into contact with a fluid sample separated from a living body, interaction of fluid antibody binding to an aggregate of the latex particles to latex particles Can be quantified by detecting it.
- a bound magnetic particle of a fluid antibody capture antigen is brought into contact with a fluid sample separated from a living body to form a fluid antibody capture antigen-anti-CPSF2 antibody complex or the same DIDO1 antibody complex on the magnetic particle. It is possible to conduct quantitative measurement by collecting the magnetism, removing the non-reacted substance, and performing an appropriate fluorescence treatment or the like to detect the complex.
- DIDO1 antigen and CPSF2 antigen two types of antigens for measuring and quantifying antibodies against these antigens in a sample separated from the living body as biomarkers are both the onset of cerebral infarction Although they are common in terms of detecting biomarkers for risk, each has unique features, and by using these alone or in combination, it is possible for the onset of a precise cerebral infarction corresponding to various situations. Data can be obtained.
- CKD Chironic kidney disease
- CKD is a renal disease in which renal damage lasts for 3 months or more, and it is known that affected persons are at high risk of cardiovascular disease such as stroke and myocardial infarction.
- CKD Chironic kidney disease
- the anti-DIDO1 humoral antibody level rises rapidly immediately before the onset of acute phase cerebral infarction, it has a feature that the antibody level decreases in chronic phase cerebral infarction.
- kits of the present invention for example, a combination of GST-fused DIDO1 antigen or GST-fused CPSF2 antigen (protein), glutathione-bound donor beads, and anti-human IgG-bound acceptor beads, Alternatively, a set of biotinylated DIDO1 antigen or biotinylated CPSF2 antigen (peptide), streptavidin-conjugated donor beads, and anti-human IgG-conjugated acceptor beads can be mentioned as a configuration for performing the AlphaLISA method as a quantitative measurement means .
- the plate on which the above-mentioned humoral fluid antibody capture antigen is immobilized, a secondary antibody labeled with a humoral fluid antibody, and a reagent for eliciting a label of the secondary antibody are used as a quantitative measurement means by ELISA. It can be mentioned as the composition of the kit of the present invention.
- latex particles to which the above-mentioned humoral fluid antibody capture antigen is bound can be mentioned as a kit configuration for performing latex agglutination turbidimetry.
- kits for performing the CLEIA method is a magnetic particle to which the above-mentioned humoral fluid antibody capture antigen is bound, a secondary antibody labeled with a humoral fluid antibody, and a reagent for eliciting a secondary antibody label. It can be mentioned.
- kits for performing other quantitative measurement means are also included in the scope of the kit of the present invention.
- the configuration of the above-described elements exemplified here can be further reduced to increase the degree of outsourcing or self-provisioning of the test, and conversely, tubes for dilution liquid and reagents etc. It is also possible to set up an immediate use of the kit of the invention in an increasing configuration. Moreover, it is also possible to consider other elements according to a specific examination.
- Antigen protein or peptide used in this example (1) List of Antigen Proteins or Peptides In the present example, the following antigen proteins or peptides were used.
- DIDO 1 -"DIDO1 protein (SEQ ID NO: 3): N-terminal region of 275 amino acids from the N-terminus of GST-modified N-terminal portion (SEQ ID NO: 3) of DIDO 1 protein (SEQ ID NO: 2) -"DIDO1 peptide” (SEQ ID NO: 4): a peptide of the 543-560th amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the above-mentioned DIDO1 protein (SEQ ID NO: 2) modified by biotinylation at the N terminus.
- the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 2) is shown in one-letter notation, and the portion corresponding to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the DIDO1 peptide is underlined.
- CPSF2 -"CPSF2 peptide (SEQ ID NO: 7): amino acid sequence at position 607-620 (SEQ ID NO: 6) of the full-length protein (SEQ ID NO: 6) encoded by the DNA of CPSF 2 (SEQ ID NO: 5) 7)
- the amino acid sequence of the CPSF2 protein (SEQ ID NO: 6) is shown in one-letter notation in FIG. 2, and the portion corresponding to the amino acid sequence of the CPSF2 peptide (SEQ ID NO: 7) is underlined.
- RNA is isolated from human U2OS osteosarcoma cells using High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Switzerland), and Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Thermo Fisher) CDNA was synthesized using Scientific).
- the N-terminal region (275 amino acids; SEQ ID NO: 3) of the DIDO1 protein (SEQ ID NO: 2) is amplified by PCR using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) using it as a template and Insert the Glutathione S-transferase (GST) gene site into the EcoRI / SalI site of the plasmid vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa.) Located upstream of the cloning site for gene expression A recombinant plasmid pGEX-4T-1-DIDO1 was prepared, and the nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencing.
- GST Glutathione S-transferase
- pGEX-4T-1-DIDO1 was introduced into E. coli BL-21 for transformation, and treated with 0.1 mM IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside) at 25 ° C. for 4 hours for expression of DIDO1 cDNA. It induced. After induction, the E. coli was recovered and dissolved by adding BugBuster Master Mix (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) to obtain a protein extract. The GST-DIDO1 protein in the protein extract was purified by glutathione-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences) column chromatography, the buffer solution was exchanged to PBS, and this was used as the above-mentioned "DIDO1 protein". GST was similarly purified as a control.
- the number of each candidate is the number of the amino acid selected as the epitope candidate in SEQ ID NO: 6, for example, 547 to 550, which represents a peptide consisting of a series of amino acid sequences of 547 to 550 in SEQ ID NO: 6.
- Each peptide of these epitope candidates is synthesized as a peptide having a biotinylation modification at the N terminus using the Fmoc method, and CPSF 2-607 to 620 (SEQ ID NO: 7) are selected by antibody level analysis, It was used as "CPSF2 peptide".
- BCPSF2-607 biotin-QVRLKDSLVSSLQFC (SEQ ID NO: 7)
- the amino acid sequence of the DIDO1 protein (SEQ ID NO: 2) is also searched in the same manner as CPSF 2 described above, and DIDO 1-543 to 560, DIDO 1-568 to 585, DIDO 1-643 to 658, and NDO of DIDO 1 to 802 to 819.
- a crude product having a biotinylation modification was synthesized, and bDIDO1-543 to 560 that best responded to cerebral infarction were selected by the analysis of antibody levels to obtain the above-mentioned "DIDO1 peptide".
- the structure is as follows.
- BDIDO1-543 biotin-AMAASKKTPAPPGSAVGKQ (SEQ ID NO: 4)
- AlphaLISA method Analogous Luminescence Proximity Homogeneous Assay
- Luminescence Proximity Homogeneous Assay specifically, was performed using 384-well microtiter plates (white opaque OptiPlate TM, Perkin Elmer , Waltham, MA). Each well is diluted 100-fold with AlphaLISA buffer (25 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% casein, 0.5% Triton X-100, 1 mg / mL dextran-500, 0.05% Proclin-300).
- AlphaLISA buffer 25 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% casein, 0.5% Triton X-100, 1 mg / mL dextran-500, 0.05% Proclin-300.
- Example 1 Examination in patients with transient ischemic attack (TIA) and patients with acute cerebral infarction (aCI) using AlphaLISA method Acute cerebral infarction (aCI) is caused by stagnation of cerebral blood flow Suddenly large damage occurs in motor function and sense function.
- Transient ischemic attack (TIA) is a disease in which cranial nerve cells are damaged due to the same cause as cerebral infarction, but recovery within 24 hours, often within minutes. Each serum sample was collected within 2 weeks after onset.
- Serum antibody levels against DIDO1 protein and CPSF2 peptide in healthy individuals (HD), TIA patients, and aCI patients were measured by AlphaLISA method. Serum samples from healthy subjects were obtained from subjects with no evidence of abnormal head MRI on Port Square Shishido clinic. Patient sera from TIA and aCI were obtained from Chiba Prefectural Sahara Hospital, Chiba Rosai Hospital, Chiba Aoba Hospital, and Chiba Medical Center.
- Table 1 shows data analysis results by the AlphaLISA method shown in FIG. From the top of Table 1, mean value of healthy subject samples, SD, cut-off value (mean value + 2SD), total sample number, positive sample number showing cut-off value or more, positive rate, and TIA patient and aCI patient sample
- the average value, SD, total sample number, positive sample number indicating a cut-off value or more, positive rate, and P value when a healthy subject sample and a patient sample are compared are shown.
- the P value is 0.05 or less, or the positive rate is shown in bold in 10% or more.
- the positive rate of antibody level in serum samples of HD, TIA and aCI with respect to DIDO1 protein when the cut-off value is set to the average value + 2SD of normal subject samples is 0.0% and 11.7%, respectively. , 9.5%, while the positive rate of the same antibody level against CPSF2 peptide is 4.1%, 6.5%, 9.5%, respectively. That is, in FIG. 3 and Table 1, it is shown that antibody levels of DIDO1 protein and CPSF2 peptide were significantly higher in both TIA and aCI patient sera.
- Example 2 Examination in acute myocardial infarction (AMI) and diabetes (DM) patients using AlphaLISA method Serum antibody levels against DIDO1 protein and CPSF2 peptide in AMI patients and DM patients are measured by AlphaLISA method Compared to (HD).
- AMI acute myocardial infarction
- DM diabetes
- Table 2 shows data analysis results by the AlphaLISA method shown in FIG. The items in the table are as described for Table 1.
- DIDO1 antibody levels in AMI and DM patients did not differ significantly from HD (FIG. 4a, Table 2).
- CPSF2 antibody showed significantly higher value in DM patients as compared to HD, but no significant difference was found in AMI patients as compared with normal subjects (FIG. 4 b, Table 2).
- Example 3 Examination in chronic kidney disease (CKD) patients using AlphaLISA method Serum antibody levels against DIDO1 protein and CPSF2 peptide in healthy people (HD) and CKD patients are measured by AlphaLISA method, and healthy people (HDD) Compared with).
- Table 3 shows data analysis results by the AlphaLISA method shown in FIG. The items in the table are as described for Table 1. Also, “Type 1-CKD” indicates diabetic nephropathy, “Type 2-CKD” indicates renal sclerosis, and “Type 3-CKD” indicates glomerulonephropathy.
- DIDO1 antibody levels showed significantly higher values than HD in any type of CKD (FIG. 5a, Table 3), and in particular, showed large differences in Type 1-CKD.
- CPSF2 antibody and HD showed significantly higher values than HD in any type of CKD (Fig. 5b, Table 3).
- Example 4 ROC analysis results According to Example 1-3 above, areas under the curve (AUC) obtained by further ROC analyzing DIDO1 serum antibody levels obtained by AlphaLISA method and serum antibody levels against CPSF2 for each disease.
- Table 4 (Table 4-1: DIDO1, Table 4-2: CPSF2) shows the values, 95% Confidence interval (CI), cutoff value, sensitivity, specificity, and P value.
- the numbers obtained by ROC analysis indicate AUC value, 95% CI, cutoff value, sensitivity, specificity, and P value in order from the top.
- DIDO1 vs TIA when “DIDO1 vs TIA” is described in Table 4-1, it indicates that this is a column for “antibody level in TIA patient serum to DIDO1 protein”, “DIDO1-pep vs TIA” If it is described, it indicates that it is a column for “antibody level in TIA patient serum for DIDO1 peptide”.
- the serum antibody values against DIDO1 protein showed significantly higher AUC values against CKD as shown in Table 4-1.
- TIA and aCI also showed significantly higher values, but no significant difference between AMI and DM.
- serum antibody values against DIDO1 peptide also showed high AUC values against TIA and aCI.
- CPSF2 serum antibody level by CPSF2 peptide showed high AUC for TIA, aCI and DM as shown in Table 4-2, but significant difference for AMI, Type 1-CKD and Type 3-CKD Only a slight significant difference was recognized for Type 2-CKD.
- Subject data include gender, current symptoms [no (HD), diffuse white matter softening (DSWMH), asymptomatic cerebral infarction (asympt-CI), TIA, aCI, chronic stroke (cCI), diabetes (DM) Hypertension (HT), cardiovascular disease (CVD), dyslipidemia (Lipidemia)], and lifestyle (smoking habit, drinking habit) were used as a group.
- Table 5 Table 5-1, Table 5-2, Table 5-3).
- Table 5-1, Table 5-2, and Table 5-3 the number of samples per group, the mean value and SD of serum antibody levels (alpha count) against DIDO1 peptide antigen and CPSF2 peptide antigen, and each group and control group P value by Mann-Whitney U analysis in A
- the serum antibody level against DIDO1 peptide antigen showed the highest value against aCI, like the serum antibody level against DIDO1 protein antigen. Also, significant differences were observed in TIA and cCI. In addition, although there was a significant correlation with hypertension, cardiovascular disease and dyslipidemia, it was unrelated to diabetes and gender. In addition, lifestyle habits were strongly correlated with smoking habits, but were unrelated to drinking habits.
- Subject data include age, height, body weight, body mass index (BMI), maximum carotid intima-media thickness (max IMT), blood test data [albumin / globulin ratio (A / G)] , Aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), lactate dehydrogenase (LDH) ⁇ , total bilirubin (tBil), cholinesterase (CHE), ⁇ -glutamyltranspeptidase ( ⁇ -GTP), total protein (total protein ( TP), albumi (ALB), blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CRE), estimated glomerular filtrating ratio (eGFR), uric acid (UA), amylase (AMY), total cholesterol (T-CHO), HDL-cholesterol (HDL-C) ), Triglyceride (TG), sodium (Na), potassium (K), chlorine (Cl), calcium (Ca), inorganic phosphat
- Table 6 shows the results of correlation analysis between serum antibody levels against DIDO1 peptide antigen and CPSF2 peptide antigen and subject data.
- Table 6 shows the results of correlation analysis between serum antibody levels against DIDO1 peptide antigen and CPSF2 peptide antigen and subject data.
- the relation number (r) and P value are shown.
- DIDO1 serum antibody level and CPSF2 serum antibody level correlate with age, max IMT, CRP, smoking period, height, weight, ALB And TP were found to be inversely correlated.
- DIDO1 serum antibody levels were correlated to BP, while CPSF2 serum antibody levels were inversely correlated to A / G, ALT, tBIL, T-CHO, LDL-C.
- Example 6 Multi-objective cohort sample analysis Targeted in 1990 and 1993 in Iwate Prefecture Ninohe, Akita Prefecture Yokote, Nagano Prefecture Saku, Okinawa Prefecture Central, Ibaraki Prefecture Mito, Niigata Prefecture Nagaoka, Kochi Prefecture Central East, Nagasaki Prefecture Among the 40- and 69-year-old men and women who lived in 9 health centers in Miyago, Okinawa Prefecture, about 5 in which plasma is stored in a multipurpose cohort (JPHC: Japan Public Health Center-based Cohort Study) study It is a million people.
- JPHC Japan Public Health Center-based Cohort Study
- Cases with onset of acute cerebral infarction from the start of follow-up to 2008 as “case group”, survivors who did not develop cerebral infarction at that time as “control group” Gender, age, and region were matched, one control was randomly selected, and a total of 404 cases of 202 cases and 202 controls were identified.
- Plasma antibody levels against DIDO1 antigen (DIDO1 protein and DIDO1 peptide) and CPSF2 antigen (CPSF2 peptide) were measured by AlphaLISA method, and the relationship between quartile and aCI onset was analyzed by a conditional logistic model.
- DIDO1 fluid serum or plasma
- TIA patient fluids of TIA
- aCI patient fluids of aCI
- CKD patient fluids of AMI and DM
- DIDO1 humoral antibody levels showed high AUC values over 0.8 in CKD, it is a biomarker that corresponds well to renal failure and hypertension.
- the DIDO1 humoral antibody level showed a greater difference in aCI than in cCI and TIA in cerebral infarction, thus identifying those who develop aCI from renal failure.
- DIDO1 humoral antibody levels are biomarkers that spike rapidly before the onset of acute stroke because they do not respond to asympt-CI. Since people with high levels of this biomarker are considered to be extremely pressing for the onset of cerebral infarction, immediate preventive measures are needed for the treatment of kidney disease and blood pressure control.
- cDI can be applied to post-treatment monitoring because DIDO1 humoral antibody levels are lowered.
- CPSF2 body fluid antibody levels are not significantly related to CKD and respond well to AMI, DM, aCI and TIA, in particular identifying aCI and AMI caused by DM.
- CPSF2 humoral antibody levels are not correlated with the DM biomarkers HbA1c and BS. It is believed that this is because many patients are receiving treatment and these biomarker values are decreasing. Therefore, even if other DM biomarker levels are lowered, if this CPSF2 humoral antibody level is high, it is presumed that the risk of developing cerebral infarction is still not reduced. Furthermore, if there is a decrease in total protein and albumin in the blood and a decrease in cholesterol level is observed, it is presumed that the risk of the onset of cerebral infarction has not decreased if this biomarker is high.
- the patient's fluid sample of aCI is collected within 2 weeks after the onset of cerebral infarction, and it is unlikely that new autoantibodies will appear after the onset, therefore DIDO1 humoral antibody and CPSF2 humoral antibody will cause cerebral infarction. It is thought that it existed before. Therefore, this biomarker is also applicable to predicting the onset of arteriosclerosis.
- DIDO1 humoral antibody level and CPSF2 humoral antibody level were significantly higher in aCI patients, and were shown to be useful biomarkers for cerebral infarction prediction.
- DIDO1 fluid antibody levels and CPSF2 fluid antibody levels correspond to the different underlying diseases of kidney disease and diabetes, respectively. That is, these biomarkers can identify those who develop cerebral infarction among those who have underlying diseases such as kidney disease and diabetes. Furthermore, the combined use of these DIDO1 humoral antibody biomarkers and CPSF2 humoral antibody biomarkers makes it possible to detect in advance those at high risk of developing a wide range of cerebral infarction.
- evaluation is made by combining the CPSF2 humoral antibody biomarker that gradually rises as aCI approaches from the stage of Asympt-CI or TIA, which is said to be the previous stage of aCI, and the DIDO1 humoral antibody biomarker that spikes just before aCI. If so, it is possible to estimate how much danger is imminent. Furthermore, it is possible to predict causes of diabetes and kidney disease etc. by measuring these biomarkers, and high-risk people will need immediate preventive measures corresponding to each cause.
- Cerebral infarction is the leading cause of bedridden in the future, and if prediction of its onset makes it possible to prevent onset, it has social significance.
- the data acquisition method of the present invention and the kit of the present invention for embodying the same it is possible to detect the onset risk of cerebral infarction either individually or comprehensively according to the respective conditions. Because it can take preventive and therapeutic measures, its industrial utility value is very large.
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Abstract
本発明は、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞の発症に関するデータ取得方法、および、当該方法を行うための、データ取得用キットを提供する。本発明により、脳梗塞の発症につながる兆候を的確に把握することができる。
Description
本発明は疾患の検出手段に関する発明であり、より具体的にはＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はこれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体をバイオマーカーとして検出することによる、脳梗塞の発症リスクの把握手段に関する発明である。
脳梗塞は、直接死に至る場合も多く、たとえ死に至らなくともその後の長いリハビリを余儀なくされ、寝たきりになる原因の第一位である。従って脳梗塞は、患者本人やその家族にとって負担が重いものであり、社会的にも国民医療費の増大につながり、その発症の予防は重要な課題である。もし、脳梗塞の微細な兆候を把握し、その後の脳梗塞の発症を予測できるなら、発症前の治療や生活習慣の改善により、脳梗塞発症を予防できる可能性が極めて高い。
そこで、脳梗塞の病状把握のために、Ｈｓｐ６０（非特許文献１）、ＲＰＡ２（非特許文献２），ＳＯＳＴＤＣ１（非特許文献３）が報告されている。また、脳梗塞に関連する疾患バイオマーカーとしては、動脈硬化のｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ）－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＬ）－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＴＣ）（非特許文献４）、アディポネクチン（非特許文献５）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（非特許文献６）、ＡＴＰ２Ｂ４（非特許文献７）、ＢＭＰ－１（非特許文献７）、ＤＨＰＳ（非特許文献８），ＳＨ３ＢＰ５（非特許文献９），心血管障害のｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（非特許文献１０）、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－１（非特許文献１１）、ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（非特許文献１２）、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｓｐｓ）（非特許文献１３）、糖尿病のｉｎｓｕｌｉｎ（非特許文献１４）、ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）（非特許文献１５）、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）（非特許文献１６）、ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＩＡ－２（非特許文献１７）等が知られている。
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脳梗塞等の脳血管障害は日本人の死因の第４位を占め、前述のように、脳梗塞は寝たきりになる原因の第１位となっており、脳梗塞を一度発症すると、たとえ死に至らなくとも長いリハビリと薬の服用を余儀なくされる。従って、脳梗塞の発症を未然に防ぐことが重要であり、そのためのさまざまなリスクファクターが同定され、高血圧、高脂血症、糖尿病、喫煙習慣、及び血液検査の中性脂肪、悪玉コレステロール値、低アディポネクチン値等さまざまなものが知られている（非特許文献１８、５）。しかし、糖尿病等は治療が難しく、一方で、血液検査項目が異常値でもただちに脳梗塞を発症するわけではない。リスクファクターを組み合わせた発症予測も試みられているが、まだ十分とは言えない。
本発明者らは、体液中のＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体レベルを測定することにより、脳梗塞の発症につながる兆候を的確に把握することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明において「脳梗塞」とは、脳の血管が動脈硬化により狭くなり、血栓が詰まることによって酸素や栄養が欠乏するために脳神経細胞が障害を受ける疾患、である。
本発明は、第一に、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞の発症に関するデータ取得方法（以下、本発明のデータ取得方法ともいう）を提供する。
本発明のデータ取得方法における測定対象である体液抗体を捕捉する基礎である、抗原としてのＤＩＤＯ１蛋白質は、death inducer-obliterator 1とも称されるＤＩＤＯ１蛋白質の、１から６までのスプライシングバリアント（アクセッションナンバーは１から６までそれぞれＮＭ＿０２２１０５．４、ＮＭ＿０８０７９６．３、ＮＭ＿０８０７９７．３、ＮＭ＿０３３０８１．２、ＮＭ＿００１１９３３６９．１、ＮＭ＿００１１９３３７０．１がＮＣＢＩに登録されている）の一つである。ＤＩＤＯ１スプライシングバリアント４遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示す通りである。ＤＩＤＯ１蛋白質のスプライシングバリアント１と２は５６２アミノ酸、スプライシングバリアント３と６は１１８９アミノ酸、スプライシングバリアント４と５は２２４０アミノ酸から成る。ＤＩＤＯ１の最長のスプライシングバリアント４遺伝子のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。後述する実施例で抗原として用いたＤＩＤＯ１蛋白質はＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）であり、この領域はＤＩＤＯ１すべてのスプライシングバリアントで共通する配列である。また、同じく実施例で抗原として用いたＤＩＤＯ１ペプチドは５４３－５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）であり、この領域はＤＩＤＯ１スプライシングバリアント３から６に共通する配列である。ＤＩＤＯ１の蛋白質抗原でもペプチド抗原でも類似の結果を得ていることから、体液抗体が認識するＤＩＤＯ１蛋白質は異なるスプライシングバリアントを識別しているものではないと考えられる。即ち、本発明のＤＩＤＯ１とは特定のスプライシングバリアントに限定されるものではない。
ＣＰＳＦ２蛋白質は、別名cleavage and polyadenylation specific factor 2、又はＣＰＳＦ１００と称され、アクセッションナンバー「ＮＭ＿０１７４３７」としてＮＣＢＩに登録されている。ＣＰＳＦ２遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列は、配列番号５と６に示す通りである。
本発明のデータ取得方法の別の表現として、例えば、「生体から分離された体液サンプル中の、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞発症の把握方法」が挙げられる。
さらに、本発明は、第二に、本発明のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。
本発明のデータ取得用キットの別の表現として、例えば、「生体から分離された体液サンプル中の、ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部、に対する抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞発症の把握方法を行うためのキット」が挙げられる。
本発明により、ＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体、をバイオマーカーとして用いることによって、脳梗塞発症のリスクを的確に把握する手段が提供される。これにより脳梗塞発症の予防を行うこと、及び、脳梗塞の治療動機が提供される。さらに、脳梗塞発症につながる動脈硬化関連疾患の的確な病状把握を行うことができる。
（１）本発明のデータ取得方法
（ａ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
（ａ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。
（ｂ）体液抗体捕捉抗原
本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎であるＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列である配列番号２、及びＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列である配列番号６は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。配列番号２のアミノ酸配列の一部を体液抗体捕捉抗原として用いる場合は、配列番号２のアミノ酸配列から７－１１８９個、及び配列番号６のアミノ酸配列から７－７８２個の連続したアミノ酸配列を選んで体液抗体捕捉抗原とすることが可能であり、ＤＩＤＯ１の全てのスプライシングバリアントにおいて共通する配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことが好ましい。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７－３０個程度が好適であり、さらに好適には１０－２０個程度である。
本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎であるＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列である配列番号２、及びＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列である配列番号６は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。配列番号２のアミノ酸配列の一部を体液抗体捕捉抗原として用いる場合は、配列番号２のアミノ酸配列から７－１１８９個、及び配列番号６のアミノ酸配列から７－７８２個の連続したアミノ酸配列を選んで体液抗体捕捉抗原とすることが可能であり、ＤＩＤＯ１の全てのスプライシングバリアントにおいて共通する配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことが好ましい。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７－３０個程度が好適であり、さらに好適には１０－２０個程度である。
また、これらのアミノ酸配列の全部又は一部のうち、１０％以下の個数のアミノ酸残基（小数点以下は切り捨て）が、改変（欠失、置換、又は、追加）されていてもよい。ただし、目的の体液抗体（ＤＩＤＯ１蛋白質、ＣＰＳＦ２蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体）の捕捉が可能であること、すなわち、アミノ酸残基を改変した体液抗体捕捉抗原候補が、例えば、本明細書の実施例の手法と同様の手法で体液抗体の捕捉を行った場合に、その捕捉抗体レベルから、目的とする脳梗塞発症のリスク把握が可能であることが必要である。
「欠失」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、対象となるアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。Ｎ末端とＣ末端における新たな１個以上のアミノ酸残基の付加も、この「付加」の概念に含まれる。これらの「付加」されたアミノ酸残基の個数が「アミノ酸付加の個数」として数えられる。
体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチドのアミノ酸配列の好適な具体例として、ＤＩＤＯ１蛋白質由来としては、例えば、配列番号４（ＡＭＡＡＳＫＫＴＡＰＰＧＳＡＶＧＫＱ）が挙げられ、ＣＰＳＦ蛋白質由来としては、例えば、配列番号７（ＣＰＳＦ２－６０７: ＱＶＲＬＫＤＳＬＶＳＳＬＱＦＣ）が挙げられる。なお、これらの捕捉ペプチドのアミノ酸の改変可能な個数は、上記の基準より１個である。
所定のアミノ酸配列の体液抗体捕捉抗原は、常法に従って確保することが可能である。具体的には、例えば、配列番号１に示すＤＩＤＯ１遺伝子の塩基配列、又は配列番号６に示すＣＰＳＦ２遺伝子に基づいて、これらの塩基配列の全部若しくは一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物を、ＤＩＤＯ１遺伝子、又はＣＰＳＦ２遺伝子の全部若しくは一部として得て、これを用いてｐＧＥＸ－４Ｔ等の原核細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択し、さらにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の薬物を添加することにより所定のＤＩＤＯ１遺伝子、又はＣＰＳＦ２遺伝子の全部若しくは一部の発現を誘導し、発現されたＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の全部若しくは一部を、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
特に、ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の一部の配列を持つペプチド（典型的には、上記のアミノ酸残基数７－３０個の体液抗体捕捉抗原として用いられるペプチド）は、公知のペプチドの化学合成法に従い容易に製造することが可能である。ペプチド合成に関しては、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法として、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能である。
ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質の全部若しくは一部としては、市販品を用いることも可能である。市販品には、既製品はもとより、注文に応じて製造される外注品も含まれる。
また、これらの体液抗体捕捉抗原として用いられる蛋白質又はペプチド（体液抗体捕捉のための本質部分）には、必要に応じて適宜修飾構造を付加することができる。例えば、後述するように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法において用いられる、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）－融合化蛋白質又はペプチドや、ビオチン融合化蛋白質又はペプチドとすること等も可能である。
（ｃ）脳梗塞の発症に関するデータ取得方法について
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部（以下、「ＤＩＤＯ１抗原」ともいう）、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部（以下、「ＣＰＳＦ２抗原」ともいう）、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、及び／又は、ＣＰＳＦ２抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部（以下、「ＤＩＤＯ１抗原」ともいう）、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部（以下、「ＣＰＳＦ２抗原」ともいう）、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、及び／又は、ＣＰＳＦ２抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
具体的には、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、生体から分離された体液サンプル提供者におけるＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の脳梗塞の発症に関するデータとすることが可能である。
被験試料におけるＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原に対する体液抗体レベルの標準値は、頭部ＭＲＩ検査において脳梗塞の兆候等の異常が認められない者からなる対照の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＩＤＯ１抗原、又はＣＰＳＦ２抗原に対する当該体液抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
当該体液抗体レベルの測定は、例えば、上述した体液抗体捕捉抗原（蛋白質、及びペプチドを含む。すなわち「ＤＩＤＯ１抗原」と「ＣＰＳＦ２抗原」）の固定化物に生体から分離された体液サンプルを接触させ、当該生体から分離された体液サンプル内のＤＩＤＯ１蛋白質に対する抗体、又はＣＰＳＦ２蛋白質に対する抗体（共に体液抗体）の当該体液抗体捕捉抗原との抗原抗体反応に基づく結合をシグナルとして検出することにより、行うことができる。具体的には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量測定を行うことができる。ここに例示したいずれの定量測定手段も、定量標的物質を生体から分離された体液サンプル中の抗体とした場合の、確立した定量測定手段である。
例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法では、ＧＳＴ－融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ－融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）を体液抗体捕捉抗原とする場合は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズを用い、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１ペプチド又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２ペプチドを体液抗体捕捉抗原とする場合はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－結合ドナービーズを用い、体液抗体捕捉抗原、血液サンプル、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させたアクセプタービーズを混合し、数時間から数日、室温でインキュベートし、形成された抗原抗体複合体に６８０ｎｍの光を照射し、発生した５２０－６２０ｎｍの光を検出することにより、所望の体液抗体の定量を行うことができる。間接蛍光抗体法では、所定の体液抗体捕捉抗原を固定化したプロテインアレイに生体から分離された体液サンプルを接触させて、形成された体液抗体捕捉抗原－抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又はＣＰＳＦ２体液抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＤＩＤＯ１蛋白質、又はＣＰＳＦ２蛋白質に対する体液抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、体液抗体捕捉抗原をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、生体から分離された体液サンプルを接触させて、生じた体液抗体捕捉抗原－抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又は同ＣＰＳＦ２体液抗体複合体を、二次抗体を用いて検出することにより定量測定を行うことができる。比濁法や比朧法では、生体から分離された体液サンプルと体液抗体捕捉抗原を接触させることにより形成された体液抗体捕捉抗原－抗ＤＩＤＯ１体液抗体複合体、又は同ＣＰＳＦ２体液抗体複合体を、濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子と生体から分離された体液サンプルとを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体をラテックス粒子に結合した体液抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、体液抗体捕捉抗原の結合磁性粒子と生体から分離された体液サンプルを接触させて、磁性粒子上に体液抗体捕捉抗原－抗ＣＰＳＦ２抗体複合体、又は同ＤＩＤＯ１抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量測定を行うことができる。
ここに「ＤＩＤＯ１抗原」と「ＣＰＳＦ２抗原」という、「生体から分離されたサンプル中の、これらの抗原に対する抗体をバイオマーカーとして測定・定量するための２種類の抗原」は、共に脳梗塞の発症リスクに対するバイオマーカーを検出する、という面において共通するが、それぞれに独自の特徴を有しており、これらを単独又は組み合わせて用いることにより、様々な状況に対応した的確な脳梗塞の発症についてのデータを取得することができる。
第１に、「ＤＩＤＯ１抗原」に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの上昇を測定することにより、特に慢性腎臓病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得を行うことができる。「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」は、腎障害が３ヶ月以上持続した腎疾患であり、罹患者は、脳卒中や心筋梗塞等の心血管病のリスクが高いことが知られている。さらに、急性期脳梗塞発症の直前で抗ＤＩＤＯ１体液抗体レベルは急上昇する反面、慢性期脳梗塞では当該抗体レベルは低下する特徴を有している。
すなわち、慢性腎臓病患者に対して定期的に「ＤＩＤＯ１抗原」に対する体内抗体レベルをモニタリングすることにより、当該患者における脳梗塞の発症の予測を確度良く行うことができる。また、同時に脳梗塞の発症が極めて差し迫っていることを示す指標でもあるので、このバイオマーカーが高値の場合には、腎臓病の治療や血圧管理等による早急な予防対策を講ずる必要を示すものでもある。さらに、急性脳梗塞発症後のこのバイオマーカー値の低下をモニタリングすることにより、慢性期への移行を確認することも可能である。
第２に、「ＣＰＳＦ２抗原」に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの上昇を測定することにより、特に糖尿病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得を行うことができる。糖尿病の治療により、他のバイオマーカー値が低下する場合であっても、このＣＰＳＦ２に対する体液抗体値が高値であれば、依然として脳梗塞の発症の高いリスクが存在することを示すものである。また、上記の「ＤＩＤＯ１抗原」に対する抗体レベルの上昇に比べると、脳梗塞発症の継続的なリスクに鋭敏に反応する傾向が認められ、無症状であって「ＣＰＳＦ２体液抗体の亢進」が認められた脳梗塞前段階に対して、リスクファクターを減ずる措置、例えば、食事指導、運動指導、禁煙指導等の生活習慣改善指導を行うことにより、脳梗塞のリスクを減少させることが可能である。
これらのそれぞれ特徴のある２種類の脳梗塞発症バイオマーカーを組み合わせて用いることにより、糖尿病や慢性腎臓病等の動脈硬化関連疾患患者における脳梗塞発症のリスクを、短期的にも、長期的にも把握することが可能である。また、特定の病態や症状に着目して、各々のバイオマーカーに絞り込んで単独で用いることにより、多数のバイオマーカーを用いる場合に比べて医療費の節約を行うことができると同時に、患者個人に合わせた脳梗塞発症のリスクを的確に把握することができる。
（２）本発明のキットについて
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ－融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ－融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組、あるいは、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１抗原又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２抗原（ペプチド）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ－融合ＤＩＤＯ１抗原又はＧＳＴ－融合ＣＰＳＦ２抗原（蛋白質）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組、あるいは、ｂｉｏｔｉｎ化ＤＩＤＯ１抗原又はｂｉｏｔｉｎ化ＣＰＳＦ２抗原（ペプチド）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を固定化したプレート、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＥＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための、本発明のキットの構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。
また、上記の体液抗体捕捉抗原を結合させた磁性粒子と、体液抗体に対する標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。
ここに挙げたこれらのキットの構成はあくまでも例示であり、他の定量測定手段を行うためのキットも本発明キットの範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、本発明のキットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査に応じた他の要素を加味することも可能である。
以下、本発明の実施例を開示する。
［製造例と解析手法］
＜本実施例において用いた抗原蛋白質又はペプチド＞
（１）抗原蛋白質又はペプチドのリスト
本実施例においては、下記の抗原蛋白質又はペプチドを用いた。
＜本実施例において用いた抗原蛋白質又はペプチド＞
（１）抗原蛋白質又はペプチドのリスト
本実施例においては、下記の抗原蛋白質又はペプチドを用いた。
（ａ）ＤＩＤＯ１
・「ＤＩＤＯ１蛋白質」（配列番号３）：ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がＧＳＴ修飾されたＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）
・「ＤＩＤＯ１ペプチド」（配列番号４）：上記ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された５４３－５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）のペプチド
図１に、ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）を一文字表示で示し、ＤＩＤＯ１ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）に相当する部分に下線を施した。
・「ＤＩＤＯ１蛋白質」（配列番号３）：ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がＧＳＴ修飾されたＮ末端から２７５アミノ酸のＮ末端領域部分（配列番号３）
・「ＤＩＤＯ１ペプチド」（配列番号４）：上記ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された５４３－５６０番目のアミノ酸配列（配列番号４）のペプチド
図１に、ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）を一文字表示で示し、ＤＩＤＯ１ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）に相当する部分に下線を施した。
（ｂ）ＣＰＳＦ２
・「ＣＰＳＦ２ペプチド」（配列番号７）：ＣＰＳＦ２のＤＮＡ（配列番号５）がコードする全長蛋白質（配列番号６）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された６０７－６２０番目のアミノ酸配列（配列番号７）のペプチド
図２に、ＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）を一文字表示で示し、ＣＰＳＦ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）に相当する部分に下線を施した。
・「ＣＰＳＦ２ペプチド」（配列番号７）：ＣＰＳＦ２のＤＮＡ（配列番号５）がコードする全長蛋白質（配列番号６）のうち、Ｎ末端がビオチン化修飾された６０７－６２０番目のアミノ酸配列（配列番号７）のペプチド
図２に、ＣＰＳＦ２蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）を一文字表示で示し、ＣＰＳＦ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）に相当する部分に下線を施した。
（２）抗原蛋白質又はペプチドの調製
上記リストの抗原蛋白質とペプチドは下記の要領で調製した。
上記リストの抗原蛋白質とペプチドは下記の要領で調製した。
（ａ）ＤＩＤＯ１蛋白質の発現と精製
ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。それを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲ法により、ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端領域（２７５アミノ酸；配列番号３）を増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＤＩＤＯ１を作製し、ＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認した。さらに、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＤＩＤＯ１を大腸菌ＢＬ－２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、ＤＩＤＯ１ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ－ＤＩＤＯ１蛋白質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＤＩＤＯ１蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて全ＲＮＡを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。それを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いたＰＣＲ法により、ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２）のうち、Ｎ末端領域（２７５アミノ酸；配列番号３）を増幅し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＤＩＤＯ１を作製し、ＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を確認した。さらに、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＤＩＤＯ１を大腸菌ＢＬ－２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、ＤＩＤＯ１ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ－ＤＩＤＯ１蛋白質は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＤＩＤＯ１蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。
（ｂ）ペプチドの設計
ＣＰＳＦ２蛋白質の公開されているアミノ酸配列（配列番号６）からウェブ公開のエピトープ検索サイトプログラムＰｒｏＰｒｅｄ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて抗体認識部位を検索した。その結果、当該エピトープ候補の配列、ＣＰＳＦ２－５４７～５５０、ＣＰＳＦ２－６０７～６２０、ＣＰＳＦ２－７１２～７２５を得た。なお、各候補の数字は配列番号６においてエピトープ候補として選ばれたアミノ酸の番号：例えば、５４７～５５０であれば、配列番号６の５４７～５５０番の一連のアミノ酸配列からなるペプチドを表す。これらのエピトープ候補の各ペプチドを、Ｎ端にビオチン化修飾を持つペプチドとして、Ｆｍｏｃ法を用いて合成し、抗体レベルの解析によりＣＰＳＦ２－６０７～６２０（配列番号７）を選別し、上記の「ＣＰＳＦ２ペプチド」として用いた。
ＣＰＳＦ２蛋白質の公開されているアミノ酸配列（配列番号６）からウェブ公開のエピトープ検索サイトプログラムＰｒｏＰｒｅｄ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)を用いて抗体認識部位を検索した。その結果、当該エピトープ候補の配列、ＣＰＳＦ２－５４７～５５０、ＣＰＳＦ２－６０７～６２０、ＣＰＳＦ２－７１２～７２５を得た。なお、各候補の数字は配列番号６においてエピトープ候補として選ばれたアミノ酸の番号：例えば、５４７～５５０であれば、配列番号６の５４７～５５０番の一連のアミノ酸配列からなるペプチドを表す。これらのエピトープ候補の各ペプチドを、Ｎ端にビオチン化修飾を持つペプチドとして、Ｆｍｏｃ法を用いて合成し、抗体レベルの解析によりＣＰＳＦ２－６０７～６２０（配列番号７）を選別し、上記の「ＣＰＳＦ２ペプチド」として用いた。
ｂＣＰＳＦ２－６０７: biotin-ＱＶＲＬＫＤＳＬＶＳＳＬＱＦＣ（配列番号７）
ＤＩＤＯ１蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）についても、上記のＣＰＳＦ２と同様に検索し、ＤＩＤＯ１－５４３～５６０、ＤＩＤＯ１－５６８～５８５、ＤＩＤＯ１－６４３～６５８、及びＤＩＤＯ１－８０２～８１９のＮ末端にビオチン化修飾を持つ未精製品を合成し、抗体レベルの解析により、脳梗塞に最もよく反応したｂＤＩＤＯ１－５４３～５６０を選別し、上記の「ＤＩＤＯ１ペプチド」とした。その構造は以下のとおりである。
ｂＤＩＤＯ１－５４３：biotin-ＡＭＡＡＳＫＫＴＡＰＰＧＳＡＶＧＫＱ（配列番号４）
＜ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析＞
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）は、具体的には、３８４穴マイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅTM，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行った。各ウェルに、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１％ ｃａｓｅｉｎ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１ｍｇ／ｍＬ ｄｅｘｔｒａｎ－５００，０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００）で１００倍希釈した血清を２．５μＬ、及び、抗原となるＧＳＴ、又はＤＩＤＯ１蛋白質（１０μｇ／ｍＬ）、あるいはビオチン化ペプチド（ＤＩＤＯ１ペプチド又はＣＰＳＦ２ペプチド）（４００ｎｇ／ｍｌ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。６－８時間室温でインキュベートした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）、及び、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－、又はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）をＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。１－１４日間、室温で放置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生じた光子の数を測定して、「Ａｌｐｈａ Ｃｏｕｎｔ」とした。ＤＩＤＯ１蛋白質の場合はコントロールのＧＳＴを、上記ビオチン化ペプチドの場合は緩衝液コントロールの値を差し引いて、ＣＰＳＦ２、又はＤＩＤＯ１抗原に特異的な抗体レベルを算出した。
［実施例１］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ａＣＩ）患者における検討
急性期脳梗塞（ａＣＩ）とは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
急性期脳梗塞（ａＣＩ）とは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。
健常者（ＨＤ）、ＴＩＡ患者、及びａＣＩ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質、及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した。健常者の血清サンプルはポートスクエア柏戸クリニックにおいて頭部ＭＲＩ検査で異常の認められない被験者から得た。ＴＩＡとａＣＩの患者血清は千葉県立佐原病院、千葉労災病院、千葉市立青葉病院、及び千葉メディカルセンターにおいて入手した。
検討結果を図３と表１に示す。図３の内容は、図面の簡単な説明において記した。表１は、図３に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表１の上から、健常者サンプルの平均値、ＳＤ、カットオフ値（平均値＋２ＳＤ）、全サンプル数、カットオフ値以上を示す陽性サンプル数、陽性率、及び、ＴＩＡ患者とａＣＩ患者サンプルの平均値、ＳＤ、全サンプル数、カットオフ値以上を示す陽性サンプル数、陽性率、及び、健常者サンプルと患者サンプルを比較した時のＰ値を示す。Ｐ値が０．０５以下、又は陽性率が１０％以上の値を太字で示した。
表１において、カットオフ値を健常者サンプルの平均値＋２ＳＤに設定した時のＤＩＤＯ１蛋白質に対する、ＨＤ、ＴＩＡ、ａＣＩの血清サンプルにおける抗体レベルの陽性率は、それぞれ０．０％、１１．７％、９．５％であり、一方、ＣＰＳＦ２ペプチドに対する同抗体レベルの陽性率は、それぞれ４．１％、６．５％、９．５％、であったことが分かる。すなわち、図３と表１において、ＤＩＤＯ１蛋白質、及びＣＰＳＦ２ペプチドの抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩのどちらの患者血清においても有意に高かったことを示している。
［実施例２］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた急性心筋梗塞（ＡＭＩ）患者と糖尿病（ＤＭ）患者における検討
ＡＭＩ患者とＤＭ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
ＡＭＩ患者とＤＭ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
検討結果を図４と表２に示す。図４の内容は、図面の簡単な説明において記した。表２は、図４に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表中の項目は、表１について説明した通りである。
上記の検討の結果、ＡＭＩ患者とＤＭ患者におけるＤＩＤＯ１抗体レベルは、ＨＤに比べて有意な差を認めなかった（図４ａ、表２）。一方、ＣＰＳＦ２抗体は、ＤＭ患者においてＨＤに比べ有意な高値を示したが、ＡＭＩ患者では健常者と比較して有意な差を認めなかった（図４ｂ、表２）。
［実施例３］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における検討
健常者（ＨＤ）とＣＫＤ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
健常者（ＨＤ）とＣＫＤ患者における、ＤＩＤＯ１蛋白質及びＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、健常者（ＨＤ）と比較した。
検討結果を図５と表３に示す。図５の内容は、図面の簡単な説明において記した。表３は、図５に示すＡｌｐｈａＬＩＳＡ法によるデータ解析結果を示している。表中の項目は、表１について説明した通りである。また、「Ｔｙｐｅ １－ＣＫＤ」は糖尿病性腎症、「Ｔｙｐｅ ２－ＣＫＤ」は腎硬化症を、「Ｔｙｐｅ ３－ＣＫＤ」は糸球体腎症を示す。
上記の検討の結果、ＤＩＤＯ１抗体レベルはいずれのタイプのＣＫＤにおいてもＨＤに比べ有意な高値を示し（図５ａ、表３）、特にＴｙｐｅ １－ＣＫＤにおいて大きな差を示した。一方、ＣＰＳＦ２抗体はいずれのタイプのＣＫＤにおいてもＨＤと比べて有意な差は認められなかった（図５ｂ、表３）。
［実施例４］ ＲＯＣ解析結果
上記実施例１－３により、各疾患についてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により得られたＤＩＤＯ１血清抗体レベル及びＣＰＳＦ２に対する血清抗体レベルを、さらにＲＯＣ解析して得たａｒｅａｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値、９５％ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＣＩ）、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値について、表４（表４－１：ＤＩＤＯ１、表４－２：ＣＰＳＦ２）に示した。表４－１と表４－２において、ＲＯＣ解析により得られた数字は、上から順番にＡＵＣ値、９５％ ＣＩ、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値を示す。表４－１において、例えば、「ＤＩＤＯ１ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１蛋白質に対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示し、「ＤＩＤＯ１－ｐｅｐ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１ペプチドに対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示している。
上記実施例１－３により、各疾患についてＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により得られたＤＩＤＯ１血清抗体レベル及びＣＰＳＦ２に対する血清抗体レベルを、さらにＲＯＣ解析して得たａｒｅａｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）値、９５％ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ（ＣＩ）、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値について、表４（表４－１：ＤＩＤＯ１、表４－２：ＣＰＳＦ２）に示した。表４－１と表４－２において、ＲＯＣ解析により得られた数字は、上から順番にＡＵＣ値、９５％ ＣＩ、カットオフ値、感度、特異度、Ｐ値を示す。表４－１において、例えば、「ＤＩＤＯ１ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１蛋白質に対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示し、「ＤＩＤＯ１－ｐｅｐ ｖｓ ＴＩＡ」と記載されている場合には、「ＤＩＤＯ１ペプチドに対するＴＩＡ患者血清中の抗体レベル」についての欄であることを示している。
ＤＩＤＯ１蛋白質に対する血清抗体値は表４－１に示す通りに、ＣＫＤに対して著しく高いＡＵＣ値を示した。ＴＩＡとａＣＩについても有意な高値を示したが、ＡＭＩとＤＭに対しては有意差を認めなかった。同様にＤＩＤＯ１ペプチドに対する血清抗体値もＴＩＡ及びａＣＩに対して高いＡＵＣ値を示した。
ＣＰＳＦ２ペプチドによるＣＰＳＦ２血清抗体値は表４－２に示す通りに、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＤＭに対して高いＡＵＣを示したが、ＡＭＩやＴｙｐｅ １－ＣＫＤとＴｙｐｅ ３－ＣＫＤに対しては有意差を認めず、Ｔｙｐｅ ２－ＣＫＤについてもわずかな有意差を認めたのみであった。
［実施例５］ 血清抗体レベルと被験者データの相関解析
（１）Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルと被験者データについて、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析（対応のない２群のデータについての、母集団分布の同一性の検定手法）を行った。
（１）Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する血清抗体レベルと被験者データについて、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析（対応のない２群のデータについての、母集団分布の同一性の検定手法）を行った。
具体的には、千葉県立佐原病院において採取された８５１血清サンプルについて、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドを抗原とした場合の、これらに対する血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定して、得られた測定値と被験者のデータの間における上記検定を行った。
被験者データは、性別、現在の症状［無し（ＨＤ）、びまん性白質軟化（ＤＳＷＭＨ）、無症候性脳梗塞（ａｓｙｍｐｔ－ＣＩ）、ＴＩＡ、ａＣＩ、慢性期脳梗塞（ｃＣＩ）、糖尿病（ＤＭ)、高血圧症（ＨＴ)、心血管障害（ＣＶＤ)、脂質異常症（Ｌｉｐｉｄｅｍｉａ)］、及び生活習慣（喫煙習慣、飲酒習慣）、を群として用いた。
結果を表５（表５－１、表５－２、表５－３）に示す。表５－１、表５－２、表５－３には、群ごとのサンプル数、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原とＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベル（アルファカウント）の平均値とＳＤ、そして各群と対照群におけるＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析によるＰ値を示した。
表５－１、表５－２、表５－３に示す通りに、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原に対する血清抗体レベルは、ＤＩＤＯ１蛋白質抗原に対する血清抗体レベルと同様に、ａＣＩに対して最も高値を示した。また、ＴＩＡやｃＣＩでも有意差を認めた。また、高血圧症、心血管障害、脂質異常症と有意な相関を認めたが、糖尿病や性別とは無関係であった。また、生活習慣では喫煙習慣と強い相関が認められたが、飲酒習慣とは無関係であった。
一方、ＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する抗体レベルは、ａＣＩのみならず、ｃＣＩでも高度に有意な差を示した。さらにＴＩＡやａｓｙｍｐｔ－ＣＩでも有意差を示した。このことは、ＣＰＳＦ２抗体は脳梗塞に関係する微細な異変をも感知するものであると推定された。さらに他疾患ではＤＭ、ＨＴには対応していたが、ＬｉｐｉｄｅｍｉａやＣＶＤでは有意差が認められなかった。生活習慣では喫煙習慣と相関していたが、飲酒習慣とは無関係であった。
（２）Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルにおける上記血清抗体レベルと、被験者データについて、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析（２変数間に、どの程度、順位づけの直線関係（単純増加あるいは単純減少関係）があるかを数値で表す分析）を行った。被験者データは、年齢、身長、体重、ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ（ＢＭＩ）、最大頸動脈内膜中膜肥厚（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｉｍａ－ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍａｘ ＩＭＴ）、血液検査データ［ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ）］、ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）｝、ｔｏｔａｌ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ｔＢｉｌ）、ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＣＨＥ）、γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（γ－ＧＴＰ）、ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ）、ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ）、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｒａｔｉｏ（ｅＧＦＲ）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（ＵＡ）、ａｍｙｌａｓｅ（ＡＭＹ)、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ－ＣＨＯ）、ＨＤＬ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ－Ｃ）、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、ｓｏｄｉｕｍ（Ｎａ）、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Ｋ）、ｃｈｌｏｒｉｎｅ（Ｃｌ）、ｃａｌｃｉｕｍ(Ｃａ)、ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ＩＰ)、ｉｒｏｎ（Ｆ）、Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ)、ＬＤＬ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＬＤＬ－Ｃ）、ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／白血球（ＷＢＣ）、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／赤血球（ＲＢＣ）、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨＧＢ)、ｈａｍａｔｏｃｒｉｔ（ＨＣＴ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ／平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ／平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）、Ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＲＤＷ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ／血小板（ＰＬＴ）、ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ（ＭＰＶ）、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（ＰＣＴ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＰＤＷ）、ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ（ＢＳ）、ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）〕、血圧（ＢＰ）、及び喫煙期間（年数）、を用いた。
次に、ＤＩＤＯ１ペプチドとＣＰＳＦ２ペプチドに対する、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルにおける上記血清抗体レベルと、被験者データについて、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析（２変数間に、どの程度、順位づけの直線関係（単純増加あるいは単純減少関係）があるかを数値で表す分析）を行った。被験者データは、年齢、身長、体重、ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ（ＢＭＩ）、最大頸動脈内膜中膜肥厚（ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｔｉｍａ－ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；ｍａｘ ＩＭＴ）、血液検査データ［ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ）］、ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）、ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）、ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）｝、ｔｏｔａｌ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ（ｔＢｉｌ）、ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ（ＣＨＥ）、γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ（γ－ＧＴＰ）、ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ）、ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ（ＣＲＥ）、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｒａｔｉｏ（ｅＧＦＲ）、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ（ＵＡ）、ａｍｙｌａｓｅ（ＡＭＹ)、ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｔ－ＣＨＯ）、ＨＤＬ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ－Ｃ）、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）、ｓｏｄｉｕｍ（Ｎａ）、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ（Ｋ）、ｃｈｌｏｒｉｎｅ（Ｃｌ）、ｃａｌｃｉｕｍ(Ｃａ)、ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ＩＰ)、ｉｒｏｎ（Ｆ）、Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ)、ＬＤＬ－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＬＤＬ－Ｃ）、ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／白血球（ＷＢＣ）、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ／赤血球（ＲＢＣ）、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨＧＢ)、ｈａｍａｔｏｃｒｉｔ（ＨＣＴ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ／平均赤血球容積（ＭＣＶ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ／平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）、Ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＲＤＷ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ／血小板（ＰＬＴ）、ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ（ＭＰＶ）、ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（ＰＣＴ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ（ＰＤＷ）、ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ（ＢＳ）、ｇｌｙｃａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ）〕、血圧（ＢＰ）、及び喫煙期間（年数）、を用いた。
表６（表６－１、表６－２）は、ＤＩＤＯ１ペプチド抗原及びＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベルと被験者データの相関解析結果を示している。これらの表では、千葉県立佐原病院において採取された９１７血清サンプルについて、群ごとのサンプル数、ＤＩＤＯ１ペプチド、及びＣＰＳＦ２ペプチド抗原に対する血清抗体レベル（アルファカウント）のＳｐｅｒａｍａｎの相関解析により得られた順位相関係数（ｒ）とＰ値を示した。
表６－１、表６－２に示す通り、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析の結果、ＤＩＤＯ１血清抗体レベルとＣＰＳＦ２血清抗体レベルはいずれも、年齢、ｍａｘ ＩＭＴ、ＣＲＰ、喫煙期間と相関し、身長、体重、ＡＬＢ、ＴＰとは逆相関していることがわかった。また、ＤＩＤＯ１血清抗体レベルはＢＰに相関していた、一方で、ＣＰＳＦ２血清抗体レベルはＡ／Ｇ、ＡＬＴ、ｔＢＩＬ、Ｔ－ＣＨＯ、ＬＤＬ－Ｃに逆相関を示した。これらの結果から、ＤＩＤＯ１とＣＰＳＦ２の血清抗体バイオマーカーはいずれも、年齢、ＩＭＴ、喫煙習慣に関係し、動脈硬化を反映していると考えられるが、一方で、ＤＩＤＯ１血清抗体バイオマーカーは高血圧に、またＣＰＳＦ２血清抗体バイオマーカーは血中蛋白質の減少やコレステロールの減少を反映しているとも考えられる。
［実施例６］ 多目的コホートサンプル解析
対象は、１９９０年、及び１９９３年に岩手県二戸、秋田県横手、長野県佐久、沖縄県中部、茨城県水戸、新潟県長岡、高知県中央東、長崎県上五島、沖縄県宮古の９保健所管内在住であった４０－６９歳の男女のうち、多目的コホート（ＪＰＨＣ：Ｊａｐａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ）研究に参加し、血漿が保存されている約３万人である。
対象は、１９９０年、及び１９９３年に岩手県二戸、秋田県横手、長野県佐久、沖縄県中部、茨城県水戸、新潟県長岡、高知県中央東、長崎県上五島、沖縄県宮古の９保健所管内在住であった４０－６９歳の男女のうち、多目的コホート（ＪＰＨＣ：Ｊａｐａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙ）研究に参加し、血漿が保存されている約３万人である。
追跡開始から２００８年までの間に急性期脳梗塞（ａＣＩ）の発症があった症例を「症例群」、その時点で脳梗塞を発症していない生存者を「対照群」として、各症例について性別、年齢、地域をマッチさせ、無作為に１例の対照を選び出し、症例２０２人、対照２０２人の合計４０４人を同定した。ＤＩＤＯ１抗原（ＤＩＤＯ１蛋白質とＤＩＤＯ１ペプチド）と、ＣＰＳＦ２抗原（ＣＰＳＦ２ペプチド）のそれぞれに対する血漿抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定し、四分位とａＣＩ発症との関連を、条件付きロジスティックモデルにより分析した。
結果を表７に表す。
その結果、ＤＩＤＯ１蛋白質に対する血漿抗体レベルはａＣＩ発症と強い関連を示した。血漿抗体レベルの最も低い群に対し、第２四分位でのａＣＩ発症の条件付オッズ比（９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）は３．９９ (１．９３－８．２３)、第３四分位では３．４０ (１．６２－７．１３)、最も高い群では４．０２ (１．９４－８．３５)であった。ＤＩＤＯ１ペプチドに対する血漿抗体レベルもＤＩＤＯ１蛋白質抗原と同様の結果を示したが、オッズ比はやや低かった。また、ＣＰＳＦ２ペプチドに対する血漿抗体レベルもａＣＩ発症と関連を示し、条件付きオッズ比はそれぞれ１．１９ (０．６３－２．２３)、１．６６ (０．８９－３．０９)、２．４１ (１．３３－４．３７)であった。この結果は、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルはａＣＩの発症予測に有用なバイオマーカーであることを意味している。
［実施例のまとめ］
ＤＩＤＯ１体液（血清又は血漿）抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＣＫＤの患者体液において高値を示し、ＡＭＩとＤＭの患者体液においては有意な上昇は認められなかった。
ＤＩＤＯ１体液（血清又は血漿）抗体レベルは、ＴＩＡ、ａＣＩ及びＣＫＤの患者体液において高値を示し、ＡＭＩとＤＭの患者体液においては有意な上昇は認められなかった。
特に、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルはＣＫＤにおいて０．８を越す高いＡＵＣ値を示したことから、腎不全と高血圧によく対応するバイオマーカーである。ＤＩＤＯ１体液抗体レベルは、脳梗塞では、ｃＣＩやＴＩＡよりａＣＩに大きな差を示したことから、腎不全からａＣＩを発症する人を識別している。さらにＤＩＤＯ１体液抗体レベルは、ａｓｙｍｐｔ－ＣＩには反応しないことから、急性期脳梗塞発症の直前で急増するバイオマーカーである。このバイオマーカーが高値の人は、脳梗塞発症が極めて差し迫っていると推定されるので、腎臓病の治療や血圧管理により早急な予防対策が必要である。
また、ｃＣＩではＤＩＤＯ１体液抗体レベルが下がることから、これを治療後のモニタリングにも適用できる。
一方、ＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ＣＫＤにはあまり関係せず、ＡＭＩ、ＤＭ、ａＣＩ及びＴＩＡに良く反応しており、特にＤＭの原因によるａＣＩとＡＭＩを識別している。ＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ＤＭバイオマーカーであるＨｂＡ1ｃやＢＳには相関が認められない。これは、多くの患者は治療を受けているためにこれらのバイオマーカー値が減少している故と考えられる。従って、他のＤＭバイオマーカー値が下がっていても、このＣＰＳＦ２体液抗体レベルが高値であれば、脳梗塞発症のリスクは依然として下がっていないと推定される。さらに、血中総蛋白質やアルブミンの減少が見られ、コレステロール値の低下が観察される場合にも、このバイオマーカーが高値であれば、脳梗塞発症のリスクは下がっていないと推定される。
ａＣＩの患者体液サンプルは、脳梗塞の発症後２週間以内に採取したものであり、発症後に新しく自己抗体が出現する可能性は低いことから、ＤＩＤＯ１体液抗体とＣＰＳＦ２体液抗体は、脳梗塞の発症前から存在していたと考えられる。従って、このバイオマーカーは動脈硬化症の発症予測にも適用可能である。
より実際的なＪＰＨＣコホートサンプルの解析においても、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、ａＣＩの発症者において有意に高く、脳梗塞予測に有用なバイオマーカーとなることが示された。
上述したように、ＤＩＤＯ１体液抗体レベルとＣＰＳＦ２体液抗体レベルは、それぞれ腎臓病と糖尿病という異なる基礎疾患に対応している。即ち、これらのバイオマーカーは腎臓病や糖尿病等の基礎疾患を持つ人の中において、脳梗塞を発症する人を識別できる。さらに、これらのＤＩＤＯ１体液抗体バイオマーカーとＣＰＳＦ２体液抗体バイオマーカーを併用することにより、広範囲の脳梗塞発症の高リスク者を前もって検出することが可能となる。
例えば、ａＣＩの前段階と言われるＡｓｙｍｐｔ－ＣＩやＴＩＡの段階からａＣＩが近づくに従って、徐々に上昇するＣＰＳＦ２体液抗体バイオマーカーと、ａＣＩの直前になって急増するＤＩＤＯ１体液抗体バイオマーカーを合わせて評価すれば、どの程度の危険が差し迫っているかを推定することが可能である。さらにこれらのバイオマーカー測定により、糖尿病や腎臓病等の原因をも予測することが可能で、ハイリスクの人はそれぞれの原因に対応した早急な予防措置が必要となるであろう。
脳梗塞は将来寝たきりになる原因の第一位であり、その発症を予測することにより発症予防が可能になれば、社会的に大きな意味を持つ。本発明のデータ取得方法とこれを具現化する本発明キットの使用により、脳梗塞の発症リスクを、病態個別的に、又は、総合的に検出することが可能であり、それぞれの状況に応じた予防措置や治療措置を講じることができるので、その産業上の利用価値は非常に大きい。
日本国特許出願第２０１７－２３０６３９号（出願日：２０１７年１１月３０日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが、具体的かつ個々に記された場合と同程度に参照により本明細書に取り込まれる。
Claims (13)
- ＤＩＤＯ１蛋白質（配列番号２のアミノ酸配列）又はその一部、並びに／或いは、ＣＰＳＦ２蛋白質（配列番号６のアミノ酸配列）又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定することを特徴とする、脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- ＤＩＤＯ１蛋白質又はその一部に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの測定による脳梗塞の発症に関するデータ取得は、慢性腎臓病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得であることを特徴とする、請求項１に記載の脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- ＣＰＳＦ２蛋白質又はその一部に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルの測定による脳梗塞の発症に関するデータ取得は、糖尿病を基礎疾患とする脳梗塞の発症に関するデータ取得であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の脳梗塞の発症に関するデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７－２２４０個であり、配列番号６のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７－７８２個であることを特徴とする、請求項１－３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基の個数は、７－３０個であることを特徴とする、請求項１－３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部におけるアミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部を含む、あるいは、配列番号３のアミノ酸配列の全部又は一部である、ことを特徴とする、請求項１－５のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列の一部は、配列番号４に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項６に記載のデータ取得方法。
- 配列番号６のアミノ酸配列の一部は、配列番号７に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項５に記載のデータ取得方法。
- 配列番号２のアミノ酸配列又はその一部、並びに／或いは、配列番号６のアミノ酸配列又はその一部は、１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、又は、追加されていることを特徴とする、請求項１－８のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 生体から分離された体液サンプルは、血液サンプルであることを特徴とする、請求項１－９のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 血液サンプルは、血清サンプル又は血漿サンプルであることを特徴とする、請求項１０に記載のデータ取得方法。
- 抗体レベル測定法は、ＥＬＩＳＡ法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、又は、ＣＬＥＩＡ法であることを特徴とする、請求項１－１１のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
- 請求項１－１２のいずれか１項に記載のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット。
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