WO2019083204A1 - 말단 뉴클레오티드 전이효소를 이용한 단일 뉴클레오티드가 도입된 dna 올리고머의 제조방법 - Google Patents

말단 뉴클레오티드 전이효소를 이용한 단일 뉴클레오티드가 도입된 dna 올리고머의 제조방법

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WO2019083204A1
WO2019083204A1 PCT/KR2018/012038 KR2018012038W WO2019083204A1 WO 2019083204 A1 WO2019083204 A1 WO 2019083204A1 KR 2018012038 W KR2018012038 W KR 2018012038W WO 2019083204 A1 WO2019083204 A1 WO 2019083204A1
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dna oligomer
reaction
tdt
rntps
dna
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PCT/KR2018/012038
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Inventor
백승필
장의경
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고려대학교 세종산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a DNA oligomer into which a single nucleotide is introduced using a terminal nucleotide transferase.
  • DNA oligomers are highly bioassayable biomaterials and are used as essential materials in nanobiotechnology research for the development of DNA-based sensors, drug delivery systems or new catalysts.
  • the self-assembling properties of DNA are determined by the combination of nuclear bases (adenine-thymine, guanine-cytosine) contained in four common nucleotides (NT) It serves as a basic element of design.
  • NT common nucleotides
  • DNA molecules composed of a combination of normal NTs have limited functional performance.
  • DNA constructs work in conjunction with probes or functional auxiliary molecules (coenzymes, peptides, proteins, lipids, etc.).
  • Such functional diversification becomes possible by a DNA oligomer modification method of introducing a modified nucleotide capable of binding to or binding to an auxiliary molecule onto DNA.
  • the DNA oligomer modification method using enzymes is a post-modification method and is used as a useful tool in the research and development stage because it can introduce a customized substrate according to research purpose.
  • many modified NTs have been developed for DNA modification enzymes such as DNA polymerase and ligase, and they are mostly made of nucleotide triphosphate (NTP), which is an enzyme substrate.
  • NTP nucleotide triphosphate
  • Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) is a type of DNA polymerase that is capable of introducing nonspecific substrates at the end of a single strand of DNA and is widely used as a DNA modification enzyme.
  • TdT is easy to use because it can introduce NT without the help of a template strand, but its use is limited because it can not control the length of the extension reaction.
  • it is useful for introducing multiple signal substrates for signal amplification purposes in the field of cell death measurement or gene probe reading, but it is impossible to introduce a single reactor for quantitative cross-linking reaction without using a special substrate for continuous extension .
  • the special substrate is dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP) developed for the purpose of DNA sequence analysis.
  • ddNTP dideoxynucleotide triphosphate
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a method for preparing a DNA oligomer in which various general and modified nucleotides are introduced singly to maximize the utility of the TdT-based DNA modification method.
  • NT nucleotide
  • A preparing a DNA oligomer and a plurality of rNTPs (ribonucleotide triphosphate); And (b) reacting the DNA oligomer with a plurality of rNTPs in the presence of a Tdt reaction buffer containing Tris borate to form a ribose-boric acid complex to inhibit binding between the plurality of rNTPs, To prepare a DNA oligomer having a single NT (nucleotide) introduced thereinto, and a step of preparing a DNA oligomer having a single rNTP introduced at its terminus.
  • rNTPs ribonucleotide triphosphate
  • the rNTP is adenosine triphosphate (Adenosine triphosphate, ATP),, N 6 uridine triphosphate (Uridine triphosphate, UTP), guanosine triphosphate (Guanosine triphosphate, GTP), oxazolyl didanosine triphosphate (Oxanosine triphosphate, OTP) - A group consisting of propargyl-ATP (N 6 -Propargyl-ATP, N 6 P -ATP), Aminoallyl-UTP and AA-UTP and Biotin-16-UTP and Bt-UTP And the like.
  • the basic solution is LiOH, NaOH, KOH, CsOH, RbOH, Mg (OH) 2, Ca (OH) 2, Sr (OH) 2, NH4OH, and Ba (OH) is selected from the group consisting of 2 It may be more than one kind.
  • the present invention it is possible to facilitate single introduction of common and modified nucleotides in a TdT enzyme-based DNA oligomer modification method by using a base hydrolysis reaction or a ribose-boric acid complex formation method. Also, since this method provides both the ease of TdT and the quantitative introduction of a transducer, it can be usefully used for the development of a crosslinking reaction or a quantitative detection technique in which quantitativeity is essential, and a single nucleotide
  • the DNA oligomer introduced therein has an advantage that it is possible to introduce additional enzymatic techniques such as primer extension or ligation since the 3 'hydroxyl end, which is an enzyme recognition site, is exposed.
  • Figure 1 shows the structure of common and modified ribonucleotide triphosphates (rNTPs) used as TdT enzyme reaction substrates.
  • rNTPs ribonucleotide triphosphates
  • FIG. 2 shows the principle of preparation of a DNA oligomer into which a single nucleotide has been introduced by using a TdT enzyme reaction according to the present invention, wherein (A) is a method for producing a DNA oligomer into which a single nucleotide has been introduced by using a base hydrolysis reaction , (B) show the principle of a method for producing a DNA oligomer into which a single nucleotide is introduced by using a ribose-boric acid complex formation method.
  • FIG. 3 shows a method of introducing a single ribonucleotide using a base hydrolysis reaction with an rNTP substrate according to the present invention.
  • (A) shows that the phosphate bond at the 3 'end of the 2' OH group of the ribose is autothigested at the base of the DNA oligomer
  • (B) shows the result of introducing single guanine using rGTP substrate
  • (C) shows the result of introducing single oxanine using rOTP substrate.
  • Images of each reaction were captured by FAM dye labeled at the 5 'end of DNA sequences (ODNs) after separation using 16% denaturing PAGE.
  • FIG. 4 shows the principle of introduction of a single ribonucleotide through formation of a ribose-boric acid complex according to the present invention.
  • a borate ion reversibly binds to ribose 2 'and 3' OH, Lt; / RTI > complex by introducing a single nucleotide by inhibiting the continuous extension of rNTPs following the TdT reaction.
  • FIG. 5 shows the results of single base introduction using rGTP and a ribose-boric acid complex formation reaction according to the present invention.
  • A 16% denaturing PAGE (7M urea) analysis showed that rGTP-borate complex formation it can be confirmed that the efficiency of the rGTP introduction reaction is inhibited. In the case of dGTP, the complex does not form a complex and thus does not exhibit an inhibitory effect on growth.
  • B The concentration of NT introduced per hour in the TdT reaction buffer containing different boric acid concentrations was quantified from the results of the PAGE. As a result, the inhibitory effect of rGTP on the elongation of rGTP increases with increasing boric acid concentration in the reaction buffer.
  • FIG. 6 shows the result of analyzing the initial rate of TdT enzyme reaction.
  • boric acid is included in the reaction buffer (B)
  • (d) ATPase activity is suppressed only in (A) rGTP, unlike dGTP.
  • the initial rate of rGTP and dGTP insertion was determined by PAGE analysis of the reaction product between 0.5 and 2 min.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of a single base incorporation reaction using a reaction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0) and a buffer containing boric acid (100 mM Tris-100 mM Borate, pH 8.0) was used as the reaction solution.
  • 3 ⁇ M of DNA F-10dA, 10 nt was used, and as the result of single introduction (11 nt) converged to 3 ⁇ M, the yield and purity were high.
  • the reaction efficiency was remarkably high when a reaction buffer containing boric acid was used. This result was obtained by quantifying the result of PAGE separation.
  • Figure 8 shows the results of single introduction of four strains of NT by the ribose-boric acid complex formation reaction according to the present invention.
  • the reactors introduced into the DNA were (A) oxanine, (B) biotin, (C) aminoallyl, (D) N6-propargyl group and poly- L-lysine, streptavidin, N-hydroxysuccinimide labeled Cy5 dye, azide-labeled Cy5.
  • E is the result of PAGE determination showing the total concentration of NT inserted into the enzyme reaction and the ratio of single introduction. As the single NT insertion efficiency reached 80% or more, the ligation efficiency was 64.5 ⁇ 77.5%.
  • the present invention provides a method for preparing a DNA oligomer in which various common and modified nucleotides are introduced singly.
  • A preparing a DNA oligomer and a plurality of rNTPs (ribonucleotide triphosphate); (b) subjecting the DNA oligomer and the plurality of rNTPs to a Tdt enzyme reaction in the presence of a Tdt reaction buffer containing Tris Acetate to continuously bind and extend a plurality of the rNTPs at the 3 'end of the DNA oligomer; And (c) separating the bond between the elongated rNTPs by adding a basic solution that induces a base hydrolysis reaction to convert the DNA oligomer into a DNA oligomer into which a single rNTP has been introduced at the 3 'end of the DNA oligomer.
  • NT nucleotide
  • A preparing a DNA oligomer and a plurality of rNTPs (ribonucleotide triphosphates); And (b) reacting the DNA oligomer with a plurality of rNTPs in the presence of a Tdt reaction buffer containing Tris borate to form a ribose-boric acid complex to inhibit binding between the plurality of rNTPs, To prepare a DNA oligomer having a single NT (nucleotide) introduced thereinto, and a step of preparing a DNA oligomer having a single rNTP introduced at its terminus.
  • rNTPs ribonucleotide triphosphates
  • the rNTPs include but are not limited to adenosine triphosphate (ATP), uridine triphosphate (UTP), guanosine triphosphate (GTP), oxanosine triphosphate (OTP), N 6 - propargyl -ATP (N 6 -Propargyl-ATP, N6P-ATP), amino-allyl -UTP (Aminoallyl-UTP, AA- UTP) and biotin -16-UTP (biotin-16- UTP, Bt-UTP) And at least one selected from the group consisting of
  • the basic solution must be, but are not limited to, consisting of LiOH, NaOH, KOH, CsOH, RbOH, Mg (OH) 2, Ca (OH) 2, Sr (OH) 2, NH4OH , and Ba (OH) 2 It is preferable that at least one member selected from the group
  • Oligo deoxynucleotides were prepared as follows using a commercial service (Integrated DNA Technologies Co., Coralville, IA, USA): DNA oligomers for optimization of oxanin incorporation (5 '- / FAM / -AAAAAAAAAA, (5'- / FAM / -CTCGGTCGACAGTCTGCGG), Downstream fragmentation (CCATTCCTGATTCTAAGTG), Template fragmentation (CACTTAGAATCAGGAATGGRCCGCAGACTGTCGACCTGAG, R is a sequence complementary to NT introduced at the end of the upstream, F- decision).
  • TdT and ligase were purchased from New England BioLabs (NEB, Ipswich, MA), except for OTP, and the modified NT was purchased from the reagent company: AA-UTP (Thermo); Biotin-16-UTP (ROCHE); GTP, ATP, UTP, N6P-ATP (Sigma Aldrich). OTP was chemically synthesized from GTP.
  • the synthesized OTP was purified from the mixture by HPLC purification (Young Lin Co., Korea, YL9100 system, column: ULTRON VX-ODS 150 ⁇ 6.0 mm, 5 ⁇ m; gradient buffer system: 0% ACN in 100 mM TEAA at 0 min to 20% ACN in 100 mM TEAA at 20 min, flow rate of 1 mL / min) and lyophilized.
  • the single NT introduction using the base hydrolysis reaction comprises (a) preparing a DNA oligomer and a plurality of rNTPs (ribonucleotide triphosphate); (b) subjecting the DNA oligomer and the plurality of rNTPs to a Tdt enzyme reaction in the presence of a Tdt reaction buffer containing Tris Acetate to continuously bind and extend a plurality of the rNTPs at the 3 'end of the DNA oligomer; And (c) separating the bond between the elongated rNTPs by adding a basic solution to induce a base hydrolysis reaction, thereby converting the DNA oligomer into a single rNTP-introduced DNA oligomer at the 3 'end of the DNA oligomer.
  • rNTPs ribonucleotide triphosphate
  • DNA oligomers final 4 ⁇ M
  • rNTP final 80-200 ⁇ M
  • CoCl 2 final 0.25 mM (1 ⁇ ) supplied by NEB
  • 10 ⁇ TdT reaction buffer 10 ⁇ TdT reaction buffer
  • TdT 10 units was subjected to TdT reaction at 37 ⁇ for 90 minutes to continuously bind and extend a plurality of rNTPs at the 3 'end of the DNA oligomer.
  • DNA oligomers final 3 ⁇ M and modified rNTPs (150 ⁇ M rOTP, 200 ⁇ M N6P-ATP, 50 ⁇ M AA-UTP, and 200 ⁇ M Bt-UTP) were borated with TdT enzyme (100 mM Tris, 100 mM Borate, 0.25 mM CoCl 2 , 10 mM MgCl 2 , pH 8.0 at 25 ° C) containing 25 ⁇ L of the final reaction mixture and reacted at 37 ° C for 60 minutes. To terminate the reaction, 4 ⁇ L of 0.3 M EDTA solution was added to the reaction solution to inhibit the activity of TdT and heated to 90 ° C. for 10 minutes. Extra rNTP and buffer components were removed using a 3 kDa MWCO (Molecular Weight Cutoff) filter (Amicon TM, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) or using a desalting column.
  • TdT enzyme 100 mM Tris, 100 mM Bor
  • the TdT reaction product by the ribose-boric acid complex formation method was purified by centrifugal filter for 3 kDa MWCO to remove buffer and excess rNTP.
  • the purified product was used as an upstream ligation fragment.
  • the downstream ligation fragment and the template fragment were mixed at a ratio of 1: 1.2: 1.2 ⁇ M in the ligation buffer, followed by incubation at 37 ° C for 2 hours. % 7M Urea denaturing PAGE.
  • Denaturing PAGE in 7 M urea (16% gel) method was used to isolate and analyze the reaction products in which the rNTP-introduced DNA and unreacted DNA were mixed.
  • the FAM dye (ex 495 nm / em 520 nm) signal labeled at the 5 'end of each DNA sequence was detected and quantified on a fluorescence image analyzer (LAS 4000, General Electric Co.).
  • the method of introducing a single ribonucleotide by base hydrolysis consists of a two-step reaction in which rNTP (FIG. 1) is supplied to a substrate of TdT and is continuously elongated and hydrolyzed through base hydrolysis (FIG.
  • the ribonucleotide NT has a hydroxyl group at 2 'so that the self-catalytic activity allows the phosphate group of the continuously stretched moiety to be hydrolyzed in a basic environment (FIG. 3A).
  • NT which is elongated at the 3'-end of the DNA oligomer by TdT, is hydrolyzed under heating conditions after addition of a basic solution (NaOH) and converted into a sequence (10dA-1rNp) into which a single ribonucleotide is introduced.
  • a basic solution NaOH
  • rGTP and rOTP were used as the substrates of TdT, respectively, as general and modified NT models, and they were applied to the base hydrolysis method (B, C in FIG. 3).
  • the boric acid and the ribose sugar form a complex through an esterification process (FIG. 4).
  • this phenomenon was used to form a complex of rNTP and boric acid used as a substrate of TdT and induce inhibition of the terminal nucleotide transfer process of TdT (FIG. 2B).
  • the enzymes and reagents involved in the reaction were the same as in the base hydrolysis method, but the reaction buffer was replaced with Tris-borate buffer in Tris-Acetate buffer (supplied by the manufacturer).
  • the inhibitory effect of boric acid on kidney inhibition was compared using two types of guanine base (rGTP, dGTP), which is the substrate with the highest affinity to TdT.
  • ribose-borate complex is caused by the combination of boric acid with two 2 ', 3'-OH groups present in the ribose sugar, so it does not occur in deoxyribose without 2'-OH groups. Therefore, it can be expected that dGTP does not have an inhibitory effect on elongation by addition of boric acid.
  • rGTP When rGTP was used, it was confirmed that the kidney inhibition rate was proportional to the concentration of boric acid (lane 2-4). On the other hand, in the case of dGTP, inhibition of growth by boric acid was not observed (lane 7-9). The inhibitory effect on the renal response in rGTP was also observed in the results of the enzyme reaction proceeding up to 2 hours (Fig. 5B).
  • boric acid causes inhibition of the TdT enzyme reaction by measuring the enzyme reaction rate (FIG. 6). Mixing inhibition is observed with decreasing substrate accessibility (Km value increase) and decreasing enzyme reaction rate (K cat reduction) with increasing boric acid content on the reaction buffer.
  • Km value increase the substrate accessibility
  • K cat reduction decreasing enzyme reaction rate
  • boric acid ions can not bind to dGTP in the form of deoxyribose, when dGTP is used as a substrate (Fig. 6B), the inhibitory effect of the TdT reaction due to an increase in boric acid does not appear. From this, it can be seen that the addition of boric acid does not directly affect the activity of the TdT enzyme.
  • the ribose-boric acid complex formation reaction is reversible and occurs depending on the boric acid concentration. Since the product with a single NT has a terminal ribose, the boric acid at the 3 'end is removed when the boric acid is bound, but the reaction buffer containing the boric acid is removed after purification. When the boric acid at the 3 'end is removed, the 3'-OH group is exposed, which can be used for the secondary enzymatic synthesis reaction.
  • Each strain NT was ligated into a DNA oligomer (F-20dN) of 20 sequences in an optimized reaction, followed by ligation treatment as a second-order reaction model.
  • the present invention relates to a method for producing a DNA oligomer in which a plurality of rNTPs are continuously bound and extended at the 3 'end of a DNA oligomer by base hydrolysis, and then a single ribonucleotide NT is introduced through hydrolysis or a ribose-borate complex is formed
  • a method for preparing a DNA oligomer having a single NT introduced by inhibiting the continuous elongation reaction of TdT enzyme is
  • rNTP ribonucleotide triphosphate
  • the method according to the present invention can be usefully used in the development of a crosslinking reaction or a quantitative detection technique in which quantitativeity is essential.
  • the DNA oligomer into which a single nucleotide is introduced which is a product of the TdT reaction according to the present invention, Since hydroxyl ends are exposed, additional enzymatic techniques such as primer extension or ligation can be readily utilized in the production of secondary products.

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Abstract

본 발명은 말단 뉴클레오티드 전이효소를 이용한 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 염기 가수분해 반응 또는 리보오스-붕산 착물 형성방법을 이용함으로써 TdT 효소 기반의 DNA 올리고머 수식 방법에서 일반 및 변형 뉴클레오티드의 단일 도입을 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 방법은 TdT의 용이함과 변형기 도입의 정량성을 동시에 제공하므로 정량성이 필수인 가교 반응이나 정량적 검출 기법의 개발에 유용하게 활용될 수 있으며, 본 발명에 따른 TdT 반응의 산물인 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머는 효소 인식 부위인 3' 히드록실 말단을 노출하므로, 프라이머 연장 (Primer extension) 또는 라이게이션 (ligation) 과 같은 추가 효소적 기법의 도입이 가능하다는 장점이 있다.

Description

말단 뉴클레오티드 전이효소를 이용한 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법
본 발명은 말단 뉴클레오티드 전이효소를 이용한 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법에 관한 것이다.
DNA 올리고머는 고도의 자가조립 특성을 보유한 생물재료로, DNA 기반 센서, 약물전달 체계 또는 신촉매 개발을 위한 나노 생명공학 연구의 필수 재료로 활용되고 있다. DNA의 자가조립 특성은 4가지의 일반 뉴클레오티드 (nucleotide; 이하 NT)에 포함된 핵염기의 조합 (아데닌-티민, 구아닌-시토신)에 의해 결정되며, 2-3차원 구조의 제작 및 온도 기반 탈부착 스위치 디자인의 기본 요소로 작용한다. 한편, 일반 NT의 조합으로 구성된 DNA 분자는 기능 수행이 제한적이다. 현재 보고된 다수의 DNA 활용 사례에서, DNA 구조체는 탐침용 또는 기능성 보조 분자 (조효소, 펩타이드, 단백질, 지질 등) 들과 연동하여 작동한다. 이와 같은 기능성 다각화는 보조 분자와 결합된 형태 또는 이와 결합 가능한 변형 뉴클레오티드 (modified nucleotide)를 DNA 상에 도입하는 DNA 올리고머 수식 (modification) 방법으로 가능해진다.
효소를 이용한 DNA 올리고머 수식 방법은 '합성 후 수식' (post-modification) 방식으로서 연구 목적에 따라 맞춤 기질을 도입할 수 있다는 장점으로 인해 연구 개발 단계의 유용한 도구로 사용되고 있다. 현재, 수많은 변형 NT들이 DNA 중합효소, 라이게이즈와 같은 DNA 수식효소용으로 개발되었으며, 대부분 효소 기질 형태인 뉴클레오티드 삼인산 (nucleotide triphosphate; NTP)으로 제작되고 있다. 말단 뉴클레오티드 전이 효소 (Terminal deoxynucleotidyl Transferase; TdT)는 DNA 중합효소의 일종으로 DNA 단일 가닥 말단에 비특이적 기질의 도입이 가능하여 DNA 수식 효소로 널리 사용되고 있다. 하지만, TdT는 주형가닥의 도움 없이 NT를 도입할 수 있어서 사용이 용이하나 신장반응의 길이를 제어할 수 없기 때문에 사용처가 제한된다. 예를 들어, 세포 사멸 측정이나 유전자 프로브 검침 분야에서 신호 증폭을 목적으로 여러 개의 신호 기질을 도입하는데 유용하나, 정량적 가교 반응을 위해 단일 반응기를 도입하는 것은 연속 신장 방지용 특수 기질을 활용하지 않으면 불가능하다. 여기에서 특수 기질은 DNA 서열 분석을 목적으로 개발된 다이데옥시뉴클레오티드삼인산 (ddNTP)으로 일반 변형 NT만큼의 다양한 종류의 반응기가 개발 되어있지 않고 이것을 이용하였을 시, 프라이머 연장 (Primer extension) 또는 라이게이션 (ligation)과 같은 추가 기법 도입이 불가하여 사용이 제한된다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 TdT 기반 DNA 수식 방법의 활용성을 극대화하기 위해 다양한 일반 및 변형 뉴클레오티드가 단일 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
(a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Acetate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 상기 rNTP를 연속적으로 결합신장시키는 단계; 및 (c) 염기 가수분해 반응을 유도하는 염기성 용액을 첨가하여 신장된 상기 rNTP 사이의 결합을 분리시켜 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머로 전환하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Borate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 복수개의 상기 rNTP 사이의 결합이 억제되도록 리보오스-붕산 착물을 형성하여, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 rNTP는 아데노신 삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 우리딘 삼인산(Uridine triphosphate, UTP), 구아노신 삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 옥사노신 삼인산(Oxanosine triphosphate, OTP), N6-프로파길-ATP(N6-Propargyl-ATP, N6P-ATP), 아미노알릴-UTP(Aminoallyl-UTP, AA-UTP) 및 비오틴-16-UTP(Biotin-16-UTP, Bt-UTP)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 염기성 용액은 LiOH, NaOH, KOH, CsOH, RbOH, Mg(OH)2, Ca(OH)2, Sr(OH)2, NH4OH 및 Ba(OH)2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따르면 염기 가수분해 반응 또는 리보오스-붕산 착물 형성방법을 이용함으로써 TdT 효소 기반의 DNA 올리고머 수식 방법에서 일반 및 변형 뉴클레오티드의 단일 도입을 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 방법은 TdT의 용이함과 변형기 도입의 정량성을 동시에 제공하므로 정량성이 필수인 가교 반응이나 정량적 검출 기법의 개발에 유용하게 활용될 수 있으며, 본 발명에 따른 TdT 반응의 산물인 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머는 효소 인식 부위인 3‘ 히드록실 말단을 노출하므로, 프라이머 연장 (Primer extension) 또는 라이게이션 (ligation) 과 같은 추가 효소적 기법의 도입이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 TdT 효소 반응 기질로 사용된 일반 및 변형 리보뉴클레오티드 삼인산 (rNTP)들의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 TdT 효소 반응을 이용하여 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머의 제조 원리를 도시한 것으로서, (A)는 염기 가수분해 반응을 이용하여 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 방법, (B)는 리보오스-붕산 착물 형성방법을 이용하여 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 방법의 원리를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 rNTP 기질과 염기 가수 분해 반응을 이용한 단일 리보뉴클레오티드 도입법을 나타낸 것으로, (A)는 염기성 조건에서 리보오스의 2' OH 기가 3'의 인산 결합이 자가 가수분해되어 DNA 올리고머 말단에 단일 리보뉴클레오티드가 남게 되는 원리를 나타내며, (B)는 rGTP 기질을 사용한 단일 구아닌 (Guanine) 도입 결과를 나타내며, (C)는 rOTP 기질을 사용한 단일 옥사닌 (Oxanine) 도입 결과를 나타낸 것이다. 각 반응 결과의 이미지는 16% denaturing PAGE를 이용한 분리 후 DNA 서열 (ODNs)의 5’말단에 표지된 FAM dye를 통해 촬영 되었다.
도 4는 본 발명에 따라 리보오스-붕산 착물 형성을 통한 단일 리보뉴클레오티드 도입 원리를 나타낸 것으로서, 도 4에 도시된 바와 같이 붕산 이온 (borate ion)이 리보오스 2', 3' OH와 가역적으로 결합하여 리보오스-붕산 착물을 형성함으로써 TdT 반응에 따른 rNTP의 연속 신장을 억제함으로써 단일 뉴클레오티드를 도입한다.
도 5는 본 발명에 따라 일반 기질인 rGTP와 리보오스-붕산 착물 형성 반응을 이용한 단일 염기 도입 결과를 나타낸 것으로서, (A) 16% denaturing PAGE (7M urea) 분석 결과를 통해 rGTP-borate 착물 형성에 의해 rGTP 도입 반응이 효율이 저해되는 것을 확인할 수 있다. dGTP의 경우 착물을 형성하지 않으므로 신장 저해 효과가 나타나지 않는다. (B) 각기 다른 붕산 농도를 함유하는 TdT 반응버퍼에서 시간당 도입된 NT의 농도를 PAGE 결과로부터 정량화한 것으로, 반응 버퍼 내의 붕산 농도가 증가함에 따라 rGTP의 신장 저해 효과가 증가함을 확인할 수 있다.
도 6은 TdT 효소반응의 초기 속도를 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 반응 버퍼에 붕산이 포함될 경우 (B) dGTP와 달리 (A) rGTP의 경우에서만 TdT 활성 억제되는 효과가 발생함을 확인할 수 있다. rGTP 와 dGTP 삽입의 초기 속도는 0.5 ~ 2 분 사이의 반응 산물의 PAGE 분석 후 이를 정량하여 측정되었다.
도 7은 본 발명에 따라 리보오스-붕산 착물 형성 반응을 이용한 단일 염기 도입 방법을 수행할 경우 일반 반응버퍼 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0)와 붕산 포함 버퍼 (100 mM Tris-100 mM Borate, pH 8.0)를 사용한 경우에 반응 효율을 측정한 결과를 나타낸다. 3 μM 농도의 DNA (F-10dA, 10 nt)를 사용하였으며, 단일 도입된 결과물 (11 nt)이 3 μM에 수렴할수록 수율과 순도가 높은 반응을 나타낸다. 측정 결과, 붕산이 포함된 반응 버퍼를 이용할 경우 반응 효율이 현저히 높은 것을 확인하였다. 본 결과는 PAGE 분리 결과를 정량화하여 얻었다.
도 8은 본 발명에 따라 리보오스-붕산 착물 형성 반응을 이용한 4종의 변형 NT를 단일 도입한 결과를 나타낸다. DNA에 도입된 반응기는 (A) oxanine, (B) biotin, (C) aminoallyl, (D) N6-propargyl group 이며 반응성 여부를 알기 위해 각각 poly-L-lysine, streptavidin, N-hydroxysuccinimide (NHS)-labeled Cy5 dye, azide-labeled Cy5 와 반응시켰다. (E)는 효소반응으로 삽입된 NT의 총 농도와 단일 도입된 비율을 나타낸 PAGE 정량 결과이다. 단일 NT 삽입 효율이 80% 이상에 달하는 만큼 라이게이션 효율은 이에 준하는 64.5 ~ 77.5%로 나타났다. 리보오스-붕산 착물 형성은 가역 반응이므로 서열의 정제 후 3'-OH 기가 노출되어 라이게이즈에 의해 기질로써 인식이 가능해진다. Gel 결과를 통해 2개 이상 신장된 산물은 라이게이션이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 TdT 기반 DNA 수식 방법의 활용성을 극대화하기 위해 다양한 일반 및 변형 뉴클레오티드가 단일 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공하고자 한다.
이를 위해, 본 발명은 (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Acetate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 상기 rNTP를 연속적으로 결합신장시키는 단계; 및 (c) 염기 가수분해 반응을 유도하는 염기성 용액을 첨가하여 신장된 상기 rNTP 사이의 결합을 분리시켜 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머로 전환하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Borate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 복수개의 상기 rNTP 사이의 결합이 억제되도록 리보오스-붕산 착물을 형성하여, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법을 제공한다.
상기 rNTP는 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, 아데노신 삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 우리딘 삼인산(Uridine triphosphate, UTP), 구아노신 삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 옥사노신 삼인산(Oxanosine triphosphate, OTP), N6-프로파길-ATP(N6-Propargyl-ATP, N6P-ATP), 아미노알릴-UTP(Aminoallyl-UTP, AA-UTP) 및 비오틴-16-UTP(Biotin-16-UTP, Bt-UTP)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 상기 염기성 용액은 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, LiOH, NaOH, KOH, CsOH, RbOH, Mg(OH)2, Ca(OH)2, Sr(OH)2, NH4OH 및 Ba(OH)2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
방법
DNA 올리고머와 시약 재료 준비
DNA 올리고머(Oligo deoxynucleotides, ODN)는 상용 서비스 (Integrated DNA Technologies Co., Coralville, IA, USA)를 이용하여 다음과 같이 제작하였다: 옥사닌 도입 최적화용 DNA 올리고머(5′-/FAM/-AAAAAAAAAA, F-10dA), 라이게이션 테스트용 Upstream 절편 F-20dN (5′-/FAM/-CTCGGTCGACAGTCTGCGG), Downstream 절편 (CCATTCCTGATTCTAAGTG), Template 절편 (CACTTAGAATCAGGAATGGRCCGCAGACTGTCGACCTGAG, R은 Upstream의 말단에 도입된 NT에 상보적인 서열로 결정). TdT 및 ligase는 New England BioLabs (NEB, Ipswich, MA)사의 제품을 구입하여 사용하였고, OTP를 제외한 일반 및 변형 NT는 시약회사로부터 구입하였다: AA-UTP (Thermo); Biotin-16-UTP (ROCHE); GTP, ATP, UTP, N6P-ATP (Sigma Aldrich). OTP는 GTP로부터 화학 합성하였다.
OTP 합성
OTP는 합성을 위해 10 mg의 dGTP를 2.6 mL의 DW에 녹이고 1 mL의 4 M acetate buffer (pH 3.7)를 첨가하였다. 40 ℃에서 5분간 예열 후 추가로 0.4 mL 의 1 M NaNO2(최종 100 mM)를 첨가하였다. 40 ℃에서 4시간 동안 반응 후, NaOH를 넣어 중성 pH로 만들어 반응을 종결시켰다. 합성된 OTP는 혼합물로부터 HPLC 정제 (Young Lin Co., Korea, YL9100 system, Column: ULTRON VX-ODS 150 × 6.0 mm, 5 μm; gradient buffer system: 0% ACN in 100 mM TEAA at 0 min to 20% ACN in 100 mM TEAA at 20 min, 1 mL/min flow rate)를 이용하여 분리하고 동결건조하였다.
염기가수분해법을 이용한 이용한 단일 NT 도입
염기 가수분해 반응을 이용한 단일 NT 도입은 (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Acetate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 상기 rNTP를 연속적으로 결합신장시키는 단계; 및 (c) 염기 가수분해 반응을 유도하는 염기성 용액을 첨가하여 신장된 상기 rNTP 사이의 결합을 분리시켜 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머로 전환하는 단계로 구성된다.
먼저, DNA 올리고머 (최종 4 μM), rNTP (최종 80~200 μM), CoCl2[최종 0.25 mM (1×), NEB 사 제공], 10× TdT 반응 버퍼(Tris Acetate)(최종 1×, NEB 제공), TdT (10 units)의 혼합물 25 μL를 37 ℃에서 90분 동안 TdT 반응시켜, DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 rNTP를 연속적으로 결합신장시켰다.
다음으로, 20 μL의 0.1 M NaOH 용액을 추가하고 90 ℃ 에서 60분간 추가 반응시켜서 인산기 말단에 단일 리보 NT가 도입된 DNA 올리고머 (ODNs-1rNp)를 제조하였다.
리보오스-붕산 착물 형성반응을 이용한 단일 NT 도입
리보오스-붕산 착물 형성반응을 이용한 단일 NT 도입은 (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Borate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 복수개의 상기 rNTP 사이의 결합이 억제되도록 리보오스-붕산 착물을 형성하여, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 단계로 구성된다.
먼저, DNA 올리고머 (최종 3 μM)와 각 변형 rNTP들 (150 μM rOTP, 200 μM N6P-ATP, 50 μM AA-UTP, 200 μM Bt-UTP)을 TdT 효소 (10 units, NEB 사)와 함께 borate를 포함한 반응 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM Borate, 0.25 mM CoCl2, 10 mM MgCl2, pH 8.0 @ 25 ℃)에 최종 25 μL으로 혼합하고 37 ℃에서 60 분 동안 반응시켰다. 반응 종결을 위해 4 μL 의 0.3 M EDTA 용액을 반응액에 투입하여 TdT의 활성을 억제하고 10 분간 90 ℃로 가열하였다. 3 kDa MWCO (분자량 컷오프) 필터 (Amicon TM , Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 이용하거나, desalting column을 이용하여 여분의 rNTP와 버퍼 성분을 제거하였다.
리보오스-붕산 착물 형성법에 의한 TdT 반응 산물의 라이게이션
리보오스-붕산 착물 형성법에 의한 TdT 반응 산물을 3kDa MWCO 용 centrifuge filter로 정제하여 버퍼와 여분의 rNTP를 제거하였다. 정제된 산물을 Upstream 라이게이션 절편으로 하여 Downstream 라이게이션 절편과 Template 절편을 라이게이션 버퍼 상에서 각각 1:1.2:1.2 μM의 비율로 혼합하고 라이게이즈를 넣은 후 37 ℃에서 2시간 반응시켰으며, 12% 7M Urea denaturing PAGE로 분석하였다.
PAGE 분석과 정량화 방법
rNTP가 도입된 DNA와 미반응 DNA가 혼재된 상태의 반응 산물을 분리하여 분석하기 위해 denaturing PAGE in 7 M urea (16% gel) 방법을 사용하였다. 각 DNA 서열의 5‘ 말단에 표지된 FAM dye (ex 495 nm/ em 520 nm) 신호를 검출하여 fluorescence image analyzer (LAS 4000, General Electric Co.) 상에서 정량화하였다.
결과 및 고찰
염기 가수분해법을 이용한 단일 NT 도입
염기 가수분해법에 의한 단일 리보 NT 도입 방법은 rNTP (도 1)를 TdT의 기질로 공급하여 연속 신장시키고 이것을 염기 가수분해 반응을 통해 가수분해 시키는 두 단계의 반응으로 구성된다(도 2의 A). 리보 NT는 2’에 수산화기를 갖고 있어서 자체 촉매 활성으로 인해 연속 신장된 부분의 인산기가 염기성 환경에서 가수분해 될 수 있다(도 3의 A). TdT에 의해 DNA 올리고머 3’말단에 2개 이상 신장된 NT는 염기성 용액(NaOH) 첨가 후 가열 조건에서 가수분해되어 단일 리보 NT가 도입된 서열(10dA-1rNp)로 전환된다. 본 발명에서는 일반 및 변형 NT의 모델로서 rGTP와 rOTP를 각각 TdT의 기질로 사용하였으며, 이들을 염기 가수분해법에 적용하였다(도 3의 B, C). 그 결과, rGTP의 경우 염기성 조건에서 10분 이상 반응 시, 연속 도입된 부분이 가수분해 되면서 분자량이 감소하고 단일 리보 NT만 남겨진 DNA 올리고머 서열이 증가하는 현상이 관찰되었으며(도 3의 B, lane 6-9), rOTP의 경우, 단일 신장 결과물 (ODNs-1rO)은 가수분해가 진행되지 않고 남아있는 것을 확인하였다 (도 3의 C, lane 3-5). 가수분해된 서열이 해당 올리고머 사이즈보다 아래 위치하는 이유는 3’말단에 남아있는 인산기의 마이너스 전하가 전기영동 시 걸리는 전기장에서 인산기가 없는 경우보다 젤 상에서 더 많은 거리를 이동하게 만들기 때문이다.
리보오스-붕산 착물 형성반응을 이용한 단일 NT 도입
도 4에 도시된 바와 같이 붕산(boric acid)과 리보오스 당은 에스테르화 과정을 통해 착물을 형성한다(도 4). 본 발명에서는 이러한 현상을 이용하여 TdT의 기질로 사용되는 rNTP와 붕산의 착물을 형성하고 TdT의 말단 뉴클레오티드 전이과정 저해를 유도하였다(도 2의 B). 반응에 참여하는 효소 및 시약은 염기 가수분해법과 동일하나 반응버퍼를 Tris-Acetate 버퍼 (제조사 제공)에서 Tris-borate 버퍼로 대체하였다. 먼저, TdT와 가장 친화도가 높은 기질인 구아닌 염기의 두 타입 (rGTP, dGTP)을 이용하여 붕산에 의한 신장 억제 효과를 비교하였다. 리보오스-붕산 착물 형성은 리보오스당에 존재하는 두 개의 2', 3'-OH 기와 붕산의 결합에 의해 발생하므로 2'-OH 기가 없는 데옥시리보오스에서는 발생하지 않는다. 따라서 dGTP의 경우 붕산 첨가에 의한 신장 억제 효과가 없을 것으로 예상할 수 있다. rGTP를 사용하였을 때 붕산의 농도에 비례하는 신장 억제율이 나타난 것을 확인하였다 (lane 2-4). 반면, dGTP의 경우 붕산에 의한 신장 억제 효과는 관찰되지 않았다 (lane 7-9). rGTP에서 나타나는 신장 반응 억제 효과는 2시간까지 진행한 효소 반응 결과에서도 동일하게 관찰되었다(도 5의 B). 또한, 효소 반응 속도 측정을 통해 붕산의 존재가 TdT 효소 반응의 억제현상을 유발하는 것을 확인하였다(도 6). 반응 버퍼 상 붕산 함량의 증가에 따라 기질 접근성의 감소(Km 값 증가)와 함께 효소 반응 속도(Kcat 감소)가 감소되는 혼합 억제 반응이 관찰된다. 반면, 붕산 이온은 데옥시리보오스 형태인 dGTP와 결합할 수 없으므로 dGTP 를 기질로 사용할 경우(도 6, B), 붕산 증가에 따른 TdT 반응의 억제 효과가 나타나지 않는다. 이를 통해, 붕산의 첨가가 TdT 효소의 활성에 직접 영향을 주는 것이 아님을 알 수 있다.
또한, 다른 변형 NT(도 1)를 사용한 경우에도 rGTP와 마찬가지로 Borate를 함유한 반응 버퍼에서 단일 리보 NT 도입 산물의 수율과 순도가 증가하는 것을 확인하였다(도 7). 붕산 포함 버퍼 (100 mM Tris-100 mM Borate, pH 8.0)에서 TdT 효소 반응을 진행한 경우, 모든 rNTP의 도입 반응에서 단일 도입된 NT의 농도가 DNA　올리고머의 초기농도인 3 μM에 수렴(점선 표시) 하고 전체/단일 도입의 비율이 감소함을 알 수 있다. 하지만, 일반 반응 버퍼 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0)상의 결과는 전반적으로 연속 신장 반응을 보인다. 따라서 리보오스-붕산 착물 형성 방법을 이용하면 NT의 종류와 농도 변화에 민감하지 않으며 고수율, 고순도의 단일 NT 도입 DNA 올리고머를 얻을 수 있는 TdT 효소 반응이 가능하다.
한편, 리보오스-붕산 착물 형성 반응은 가역적이고 붕산 농도에 의존하여 발생한다. 단일 NT가 도입된 산물은 말단의 ribose를 가지므로 붕산이 결합된 상태이나 정제 후 붕산 포함 반응 버퍼가 제거된 상태에서는 3' 말단의 붕산이 제거된다. 3' 말단의 붕산이 제거되면 3'-OH 기가 노출되므로, 이를 2차 효소적 합성 반응에 사용할 수 있다. 각 변형 NT를 최적화된 반응으로 20개 서열의 DNA 올리고머 (F-20dN)에 도입 후 2차 반응 모델로써 라이게이션 처리를 하였다. F-20dN과 라이게이션용 연장 서열 사이에 1개 뉴클레오티드 갭을 갖도록 디자인 하였으므로 2개 이상 신장된 산물은 라이게이션이 일어나지 않게 된다. 리보오스-붕산 착물 형성은 가역반응이므로 서열의 정제 후 3'-OH 기가 노출되어 라이게이즈에 의해 기질로써 인식 가능해진다. Denaturing PAGE 분석 결과, 단일 NT 삽입 효율이 80% 이상에 달하는 만큼 라이게이션 효율은 이에 준하는 64.5 ~ 77.5%로 나타났다(도 8, E). 단일 NT 도입 DNA와 라이게이션 산물을 각 변형 NT와 반응하는 짝 표지물질을 TdT 산물과 반응시켰을 때 (도 8, A-D), PAGE 상에서 변형 NT를 포함한 DNA 올리고머와 표지물질 결합체가 예상 위치에 위치하는 것으로 보아 TdT 반응과 라이게이션 후 각 NT의 기능성이 유지되는 것을 확인하였다 (도 8, A-D; lane 4a, 5a).
본 발명은 염기 가수분해 반응을 이용하여 DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 상기 rNTP를 연속적으로 결합신장시킨 후 가수분해를 통해 단일 리보 NT가 도입된 DNA 올리고머를 제조하거나, 리보오스-붕산 착물을 형성을 통해 TdT 효소의 연속 신장반응을 억제함으로써 단일 NT가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 효소 기질로 사용되는 리보뉴클레오티드 삼인산 (ribonucleotide triphosphate; rNTP)을 단일 도입을 용이하게 할 수 있으며, 본 발명의 최종 산물인 말단에 단일 리보 NT가 결합된 DNA 올리고머는 DNA 수식 효소의 인식 부위 (3' 말단의 수산화기)를 보존하므로 추가 수식합성에 활용되거나 프라이머 연장 (Primer extension) 또는 라이게이션 (ligation) 과 같은 기법으로 2차 산물 제작에 용이하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 정량성이 필수인 가교 반응이나 정량적 검출 기법의 개발에 유용하게 활용될 수 있으며, 본 발명에 따른 TdT 반응의 산물인 단일 뉴클레오티드가 도입된 DNA 올리고머는 효소 인식 부위인 3‘ 히드록실 말단을 노출하므로, 프라이머 연장 (Primer extension) 또는 라이게이션 (ligation) 과 같은 추가 효소적 기법으로 2차 산물 제작에 용이하게 활용될 수 있다.

Claims (4)

  1. (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계;
    (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Acetate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 복수개의 상기 rNTP를 연속적으로 결합신장시키는 단계; 및
    (c) 염기 가수분해 반응을 유도하는 염기성 용액을 첨가하여 신장된 상기 rNTP 사이의 결합을 분리시켜 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머로 전환하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법.
  2. (a) DNA 올리고머와 복수개의 rNTP(ribonucleotide triphosphate)를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 DNA 올리고머와 복수개의 rNTP를 Tris Borate를 함유하는 Tdt 반응 버퍼 존재하에서 Tdt 효소 반응시켜, 복수개의 상기 rNTP 사이의 결합이 억제되도록 리보오스-붕산 착물을 형성하여, 상기 DNA 올리고머의 3' 말단에 단일 rNTP가 도입된 DNA 올리고머를 제조하는 단계;를 포함하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 rNTP는 아데노신 삼인산(Adenosine triphosphate, ATP), 우리딘 삼인산(Uridine triphosphate, UTP), 구아노신 삼인산(Guanosine triphosphate, GTP), 옥사노신 삼인산(Oxanosine triphosphate, OTP), N6-프로파길-ATP(N6-Propargyl-ATP, N6P-ATP), 아미노알릴-UTP(Aminoallyl-UTP, AA-UTP) 및 비오틴-16-UTP(Biotin-16-UTP, Bt-UTP)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염기성 용액은 LiOH, NaOH, KOH, CsOH, RbOH, Mg(OH)2, Ca(OH)2, Sr(OH)2, NH4OH 및 Ba(OH)2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단일 NT(nucleotide)가 도입된 DNA 올리고머의 제조방법.
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