WO2019023817A1 - Extracto polifenolico natural y composicion que lo contiene, y su uso como agente de biocontrol y metodo para controlar el deterioro del vino causada por la levadura brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino - Google Patents

Extracto polifenolico natural y composicion que lo contiene, y su uso como agente de biocontrol y metodo para controlar el deterioro del vino causada por la levadura brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino Download PDF

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extract
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yeast
matrices
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Gustavo Emilio ZUÑIGA NAVARRO
María Angélica GANGA MUÑOZ
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Universidad De Santiago De Chile
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/38—Solanaceae [Potato family], e.g. nightshade, tomato, tobacco or chilli pepper
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B08—CLEANING
    • B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
    • B08B9/00—Cleaning hollow articles by methods or apparatus specially adapted thereto 
    • B08B9/08—Cleaning containers, e.g. tanks

Definitions

  • the present invention relates to a polyphenolic extract obtained from seedlings of Cestrum parqui, known by its common name as black duraznillo, cultivated in vitro, as a biocontrol agent against the deterioration of wine caused by the yeast Brettanomyces bruxellensis in different wine matrices. It also refers to the composition containing said extract, and its use and method to control the deterioration of the wine caused by the yeast B. bruxellensis.
  • the yeast Ascomycete Brettanomyces bruxellensis has been described as the main contaminant in the wine industry, due to its ability to transform the hydroxycinnamic acids naturally present in the grape must into vinyl and ethyl derivatives (Chatonnet, P., Dubourdieu, D., Boidron, J. and Pons M. The origin of ethylphenols in wine, J. Sci. Food Agrie 60 (65): 1 78 (1992), Chatonnet, P., Dubourdieu, D. and Boidron, J. The influence of Brettanomyces / Dekkera spheres and lactic acid bacteria on ethylphenol content of red wine, Am. J.
  • Sulfur dioxide is the chemical preservative commonly used in the wine industry, given its antioxidant and antimicrobial properties, especially on bacteria Lactic acid contaminants of the genus Lactobacillus and Pediococcus.
  • bruxellensis shows resistance to this compound depending on the strain (Curtin, C, Kennedy, E. and Henschke, PA Genotype-dependent sulphite tolerance of Australian Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis wine isolates, Lett. Appl. Microbiol., 55: 56-61, 2012. Vigentini, I., Joseph, CM, Picozzi, C, Foschino, R. , and Bisson, L. Assessment of the Brettanomyces bruxellensis metabolome during sulfur dioxide exposure, FEMS Yeast Res. 13: 597-608 2013).
  • CN105368623 which teaches a method to inhibit Brettanomyces bruxellensis in wine, which comprises adding an acidic solution in original wine liquid so that the concentration of the acidic solution in the original wine liquid is up to 0.036.
  • the acidic solution is 1 -20 mol / L in concentration
  • the growth of B. bruxellensis in the wine can be effectively inhibited, the bad taste 'wooden board' of the wine is eliminated, the stages are simple, the cost is low, and it does not cause a negative impact on the appearance, color and taste of wine
  • CN 103396930 teaches a method to inhibit the growth of B. bruxellensis, in red wine, which comprises adding dimethyl dicarbonate in red wine, where the ratio of dimethyl dicarbonate in red wine is 120-200 mg / L; and this is added before bottling the wine.
  • the method is simple and high in the antimicrobial rate (up to 90-99%) to reduce the consumption of sulfur dioxide in the production process of red wine, safe for the human body, ensures a favorable aroma and improves the aesthetic quality of the wine.
  • Ruiz-Moreno et al Ruiz-Moreno, M., Raposo, R., Moreno-Rojas, J., Zafrilla, P., Cayuela, J., Mulero, J., Puertas, B., Guerrero , R., Pi ⁇ eiro, Z., Giron, F. and Cantos-Villar, E. Efficacy of olive oil mili extract in replacing sulfur dioxide in wine model, Food Sci.
  • the present invention develops and characterizes a plant extract that exhibits antioxidant and preservative activities.
  • the present extract has antifungal activity on B. bruxellensis CECT1451, without affecting the growth of S. cerevisiae CECT1492 in laboratory medium. This result confirms that the present extract behaves as a selective inhibitor of B. bruxellensis.
  • the present invention then demonstrates the antifungal effect of the present extract on two wine isolates of B. bruxellensis and a commercial strain of S. cerevisiae in laboratory medium, synthetic wine and natural wine.
  • it is evaluated whether the present plant extract presents affinity to fungal cell wall components, with the aim of making an initial approach to its possible mechanism of action.
  • This invention shows the selective antifungal action of a vegetal extract in wine matrices, with the derived application that it implies for the wine industry.
  • the present invention relates to a plant extract that presents antioxidant and preservative activities.
  • the present extract has antifungal activity on B. bruxellensis CECT1451, without affecting the growth of S. cerevisiae CECT1492 in laboratory medium. That is, the present extract behaves as a selective inhibitor of B. bruxellensis.
  • the present invention also relates to the composition containing said extract, and its use and method for controlling the deterioration of wine by the yeast Brettanomyces bruxellensis in different wine matrices.
  • C. parqui seedlings grown in in vitro conditions are used. Plants were grown in growth chambers at 24 ⁇ 2 C and photoperiod 16/8 hour light / dark. Plants of 30 days of culture were used for the preparation of extracts. Also, an ethanolic extract of C. parqui is prepared, determining the structure of the main molecules of the extract by liquid chromatography coupled to a mass detector. Likewise, the biocidal minin concentration of the plant extract is determined on the strain C. cerevisiae EC1 18 and the strains B. bruxellensis LAMAP1359 and LAMAP2480 in enriched medium (YPD), synthetic wine, white wine and red wine.
  • YPD enriched medium
  • the affinity of the plant extract for commercial components of the cell wall is determined.
  • Fig. 1 Seedlings of C. parqui grown in in vitro conditions. The plants were grown in growth chambers at 24 ⁇ 2 a .
  • Fig. 2 Structure of the main molecules present in the ethanol extract of C. parqui. The structures were determined from the ethanol extracts, using liquid chromatography coupled to a mass detector. These molecules were synergy, myristicin, quercetin 3-galloyl- ⁇ -L-arabinopyranoside, sinensetin, 1-O-synapoyl beta-D-glucoside, epigallocatechin-3-O-caffeate.
  • Figures 3A-3L Determination of the minimum biocidal concentration (MBC) of the plant extract on the strain S. cerevisiae EC1 1 18 and the strains B.
  • MBC minimum biocidal concentration
  • FIGS 4A-4B affinity assay of C. palqui extract by commercial cell wall components.
  • White bars Control without addition of wall components;
  • Gray bars 9 mg mL "1 of Laminarina (LM), Ma ⁇ ano (MN), Pullulano (PL), Curdulano (CR) and Pustulano (PT).
  • LM Laminarina
  • MN Ma ⁇ ano
  • PL Pullulano
  • CR Curdulano
  • PT Pustulano
  • the present invention relates to an ethanol extract obtained from C. parqui (palqui) grown in wfro with antioxidant activities and preservatives.
  • the present extract presents antifungal activity on B. bruxellensis CE CT 1451, without affecting the growth of S. cerevisiae CECT1492 in laboratory medium. That is, the present extract behaves as a selective inhibitor of B. bruxellensis.
  • the present invention also relates to the composition containing said extract, and its use and method for controlling the deterioration of wine by the yeast Brettanomyces bruxellensis in different wine matrices.
  • the product is used as a hydroalcohilca solution for the treatment of wine storage barrels.
  • Seedlings are grown parqui C. under in vitro conditions in growth chambers at 24 ⁇ 2 C and photoperiod 1 6/8 hour light / dark. Plants of 30 days of culture were used for the preparation of extracts.
  • the structure of the main molecules of the ethanolic extract thus obtained from C. parqui is determined by liquid chromatography coupled to a mass detector. These molecules are syringin, myricin quercetin, 3-galloyl-aL-arabinopyranoside sinensetin, 1-O-sinapoyl beta-D-glucoside, epigallocatechin-3-O-caffeate.
  • the extract obtained from C. parqui corresponds to an extract of polyphenolic nature, obtained by organic extraction in 85% ethanol (v / v).
  • Strains of B. bruxellensis LAMAP1359 and LAMAP2480 correspond to native wine isolates deposited in the cepario whereas S. cerevisiae EC1 1 18 corresponds to a commercial wine strain (Lallemand Inc).
  • the identification at the species level of each isolated yeast was performed by analysis of the internal spacer region of the ribosomal RNA 5.8S, as described by Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C, Uruburu, F. and Querol, A. Identification of yeast by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two robosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 329-337 (1999).
  • the extracts were analyzed in a liquid chromatograph coupled to a tripiecuadrupole mass spectrometer (LG-S / S, Agilent 1200s-6410). For this, it was eluted in a reverse stationary phase G18 (Agilent XDB-C18, 150 x 4.6 mm, 5 ⁇ pore) and an elution gradient of linear steps using HCOOH 1% v / v (A) and acetonitrile (8 ). The gradient corresponded from 0 to 5 min, 10% of B; from 5 to 8 min.
  • the parameters of! Mass spectrometer were 330 S C of nitrogen temperature, 9 L min 1 of flow, 45 psi of nebulization pressure, 4000 V of ionization voltage, in negative mode, with a range of 50 to 1000 m / z.
  • the chromatograms were analyzed using the Metlin database (https: //metiin.scripps.8du/) contrasting the ionization patterns.
  • Comparative analyzes between treatments are carried out by uploading the files from the instrument to the XCMS database (https://xcmsoniine.scripps.edu) where the software iterates the entire chromatogram, comparing the relative abundances between treatments and Contrast them with the Metlin database to identify the signals.
  • YPD medium 0.5% w / v yeast extract, 0.5% w / v peptone, 2% w / v glucose.
  • YPD agar was used by supplementation of 2% (w / v) agar.
  • Synthetic wine (0.6 g L “1 glucose, 1, 2 g L “ 1 fructose, 0.3 g L “1 trehalose, 2 g L “ 1 yeast extract, 1 g L “1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.4 g L “1 MgSO 4 , 2 g L “ 1 KH 2 P0 4 , 0.25 mg L “ 1 biotin, 0.0045 mg L " 1 thiamin, 10% ethanol, pH 3.7) was prepared as described by Sturm et al., (Sturm, E., Rojo, M., Ciclic, I., Ram ⁇ rez, M. and Combina, M.
  • MBC Minimum Biocidal Concentration
  • the MCB was defined as the percentage (v / v) of the supplemented extract necessary to kill 99.9% of the yeasts studied, as described by Portugal et al., (Portugal, C, Sáenz, Y., Red-Bezares, B., Zarazaga, M., Torres, C, Cacho, J. and Ruiz-Larrea, F. Brettanomyces susceptibility to antimicrobial agents used in winemaking: in vitro and practical approaches, Eur. Food Res. Technol. 238 (4): 641-652, 2013).
  • the percentage of viability was defined as the percentage of the logarithm of the number of viable colonies obtained after treatment compared to the logarithm of the initial inoculum. Affinity assay of the plant extract by cell wall components
  • the assay was carried out in 96-well plates where 200 ⁇ l of a 1 ⁇ 10 6 CFU / mL suspension of B. bruxellensis LAMAP1359, LAMAP2480 and S. cerevisiae EC1 18 strains was placed in triplicate in red wine (RW) supplemented with 9 mg mL "1 of the commercial components Laminarina, Ma ⁇ ano, Curdulano, Pustulano (Sigma) and Pullulano (Elicittl) . These plates were incubated for 5 days at 28'C without agitation and the yeast count was performed by sowing on YPD agar. .
  • the growth of the yeasts in the different matrices was analyzed by exposing them to different percentages (v / v) of the palqui extract. With these results, the MBC was determined and the calculation of the viability percentage was made. Considering that palqui extract corresponds to an organic extraction with 85% ethanol (v / v), an ethanol solution was used as control. same percentage. Thus, the final concentrations of ethanol present in each matrix are shown in Table 1.
  • bruxellensis LAMAP1359 shows no growth when inoculated in white wine (WW) supplemented with volumes greater than 2% (v / v) ethanol 85% (v / v), which is indicative of greater susceptibility to alcohol in this matrix.
  • cerevisiae EC1 1 18 does not show a significant variation in its growth when it is supplemented with 2% palqui extract (v / v) in natural wine matrices (WW and RW). Thus, it was defined that the MBC of the palqui extract corresponds to the 2% (v / v) supplementation in SW, WW and RW. With this volume of extract, S. cerevisiae EC1 1 18 has a viability greater than 95% in YPD, WW and RW, while in SW its viability is close to 50% (Table 3). In contrast, B. bruxellensis LAMAP1359 shows no viability in any of the matrices supplemented with palqui extract, while B.
  • bruxellensis LAMAP2480 has a viability greater than 90% in YPD, whereas in the wine matrices there is no viability. This result demonstrates that the extract of palqui directly affects the survival of the strains of B. bruxellensis in natural wine, without affecting the growth of the commercial fermentative yeast S. cerevisiae EC1 1 18.
  • YPD Nutrient medium
  • SW Synthetic wine
  • WW White Wine
  • RW Red wine

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Abstract

La presente invención se refiere a un extracto polifenolico obtenido de plantulas de Cestrum parqui, conocido por su nombre común como duraznillo negro, cultitivadas in vitro, como agente de biocontrol 5 contra el deterioro del vino causada por la levadura Brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino. También se refiere a la composición que contiene dicho extracto, y su uso y método para controlar el deterioro del vino causada por la levadura B. bruxellensis.

Description

EXTRACTO POLIFENOLICO NATURAL Y COMPOSICION QUE LO CONTIENE, Y SU USO COMO AGENTE DE BIOCONTROL Y METODO PARA CONTROLAR EL DETERIORO DEL VINO CAUSADA POR LA LEVADURA BRETTANOMYCES BRUXELLENSIS EN DIFERENTES MATRICES DEL VINO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un extracto polifenolico obtenido de plántulas de Cestrum parqui, conocido por su nombre común como duraznillo negro, cultitivadas in vitro, como agente de biocontrol contra el deterioro del vino causada por la levadura Brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino. También se refiere a la composición que contiene dicho extracto, y su uso y método para controlar el deterioro del vino causada por la levadura B. bruxellensis.
ANTECEDENTES
La levadura Ascomycete Brettanomyces bruxellensis ha sido descrita como la principal contaminante en la industria vitivinícola, debido a su capacidad de transformar los ácidos hidroxicinámicos presentes de manera natural en el mosto de la uva en vinil y etil-derivados (Chatonnet, P., Dubourdieu, D. , Boidron, J. and Pons M. The origin of ethylphenols in wine. J. Sci. Food Agrie. 60(65):1 78 (1992); Chatonnet, P., Dubourdieu, D. and Boidron, J. The influence of Brettanomyces/ Dekkera sp. yeasts and lactic acid bacteria on ethylphenol content of red wine. Am. J. Enol. Vitic. 46:463-468 (1995)). Éstos son causantes del deterioro aromático del vino y responsables del denominado "Brett characte (Romano, A., Perello, MC, Lonvaud-Funel, A., Sicard, G. and de Revel G. Sensory and analytical re-evaluation of "Brett character". Food Chem. 1 14:15-19. 2000). Se ha descrito que B. bruxellensis puede asentarse en la microestructura porosa de las barricas y sobrevivir en ambientes bajos en nutrientes y altos en etanol, por lo que su crecimiento se ve favorecido durante el proceso de maduración de vinos en barrica (Oelofse, A., Pretorius, I. and du Toit, M. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking: A synoptic review. S. Afr. J. Enol. Vitic. 29(2):128-144 (2008)). Es por esto que como método convencional de preservación se realiza la suplementación del vino con agentes químicos que impidan su crecimiento y reproducción (Portugal, C, Sáenz, Y., Rojo-Bezares, B., Zarazaga, M., Torres, C, Cacho, J. and Ruiz-Larrea, F. Brettanomyces susceptibility to antimicrobial agents used ¡n winemaking: ¡n vitro and practical approaches. Eur. Food Res. Technol. 238(4):641 -652. 2013) El anhídrido sulfuroso (S02) es el preservante químico comúnmente utilizado en la industria vitivinícola, dadas sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas, especialmente sobre bacterias lácticas contaminantes del género Lactobacillus y Pediococcus. (García-Ruiz, A., Cueva, C, González-Rompinelli, E., Yuste, M., Torres, M., Martín-Álvarez, P., Bartolomé, B. and Moreno-Arribas M. Antimicrobial phenolic extracts able to inhibit lactic acid bacteria growth and wine malolactic fermetation. Food Control 28:212-219 (2012)) Sin embargo, se ha descrito que B. bruxellensis presenta resistencia a este compuesto dependiendo de la cepa (Curtin, C, Kennedy, E. and Henschke, P.A. Genotype-dependent sulphite tolerance of Australian Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis wine isolates. Lett. Appl. Microbiol. 55:56-61 . 2012; Vigentini, I., Joseph, C.M., Picozzi, C, Foschino, R., and Bisson, L. Assessment of the Brettanomyces bruxellensis metabolome during sulphur dioxide exposure. FEMS Yeast Res. 13:597-608 2013). Además, se ha identificado en su genoma la presencia de un gen ortólogo a SSU1 de Saccharomyces cerevisiae, el cual codifica una bomba de expulsión de S02 y podría ser el responsable de estos perfiles de resistencia (Curtin, C, Borneman, A., Chambers, P. and Pretorius, I. De-novo assembly and analysis of the heterozygous triploid genome of the wine spoilage yeast Dekkera bruxellensis AWRI 1499. PLoS ONE 7(3):e33840 (2012a)). En estos últimos años se está registrando una tendencia a disminuir la concentración S02 en vinos, debido a sus posibles efectos sobre las propiedades organolépticas finales del producto y los riesgos potenciales para la salud de los consumidores (Devalia, J., Rusznak, C, Herdman, M., Trigg, C, Tarraf H. and Davies R. Effect of nitrogen dioxide and sulphur dioxide on airway response of mild asthmatic patients to allergen inhalation. Lancet 344: 1668-1671 (1994); du Toit, M and Pretorius I. Microbial spoilage and preservation of wine: Using weapons from natrure's own arsenal - A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. 21 :74-96 (2000); García-Ruiz, A., Cueva, C, González-Rompinelli, E., Yuste, M., Torres, M., Martín-Álvarez, P., Bartolomé, B. and Moreno-Arribas M. Antimicrobial phenolic extracts able to ¡nhibit lactic acid bacteria growth and wine malolactic fermetation. Food Control 28:212-219 (2012)).
Entre los documentos de patentes es posible referir a CN105368623 que enseña un método para inhibir Brettanomyces bruxellensis en vino, que comprende agregar una solución acidica en liquido original de vino de modo que la concentración de la solución acidica en el líquido original de vino es hasta 0,036 mol/L a 0,36 mol/L, la solución acidica es 1 -20 mol/L en concentración, agregando quitosano en el líquido original de vino con la solución acidica para que el contenido del quitosano en el líquido original de vino sea 1 ,5-5 g/L, y disuelva completamente el quitosano por agitación; agregando un solución alcalina o sal en el líquido original de vino con quitosano para neutralizar la solución acida en el líquido original del vino; fermentando luego el líquido original de vino neutralizado. El crecimiento de B. bruxellensis en el vino puede ser efectivamente inhibido, el mal sabor 'tabla de madera' del vino se elimina, las etapas son simples, el costo es bajo, y no se causa un impacto negativo en la apariencia, color y sabor del vino.
CN 103396930 enseña un método para inhibir el crecimiento de B. bruxellensis, en vino rojo, que comprende agregar dimetil dicarbonato en vino rojo, donde la razón de dimetil dicarbonato en vino rojo es 120-200 mg/L; y este se agrega antes de embotellar el vino. El método es simple y alto en la tasa antimicrobiana (hasta 90-99%) para reducir el consumo de dióxido de azufre en el proceso de producción de vino rojo, seguro para el cuerpo humano, asegura un aroma favorable y mejora la calidad estética del vino.
Así, el estudio y la aplicación de preservantes naturales en la industria alimentaria ha ido ganando terreno como una posible estrategia de conservación.
Diversos productos naturales han sido estudiados como potenciales agentes antioxidantes y antimicrobianos en los procesos de fermentación y maduración de vinos. Así, se ha estudiado el efecto de extractos polifenólicos de diversas hojas, granos, semillas, frutas, especias y compuestos de origen agroindustrial en el control de bacterias ácido-lácticas que se desarrollan en etapas posteriores a la fermentación alcohólica, demostrando que éstos presentan actividad antimicrobiana selectiva contra estos organismos (García-Ruiz, A., Cueva, C, González-Rompinelli, E., Yuste, M., Torres, M., Martín-Álvarez, P., Bartolomé, B. and Moreno-Arribas M. Antimicrobial phenolic extracts able to inhibit lactic acid bacteria growth and wine malolactic fermetation. Food Control 28:212-219
(2012) ). Junto con esto, se ha estudiado a nivel escalativo los cambios químicos y sensoriales que provoca la suplementacion de extractos polifenólicos obtenidos desde hojas de eucaliptus y piel de almendras, en vinos madurados en barricas de roble. De estos, se determinó que la suplementacion de ambos extractos genera cambios significativos en la concentración de algunos ésteres, furanos, norisoprenoides C13 y fenoles volátiles (García-Ruiz, A., Rodríguez-Bencomo J., Garrido I., Martín- Álvarez, P., Moreno-Arribas, M. and Bartolomé, B. Assessment of the impact of the addition of antimicrobial plant extract to wine: Volatile and phenolic composition. J. Sci. Food Agrie. 93:2507-2516
(2013) ; González-Rompinelli, E., Rodríguez-Bencomo, J., García-Ruiz A., Sánchez-Patán, F., Martín- Álvarez, P., Bartlomé, B. and Moreno-Arribas, M. A winery-scale trial of the use of antimicrobial plant phenolic extracts as preservatives during ageing in barréis. Food Control 33:440-447 (2013)). Sin embargo, se demostró que estas variaciones no provocan cambios en la apreciación sensorial del producto, por lo que su utilización podría constituir una alternativa parcial a la suplementacion de S02 durante el proceso de maduración (González-Rompinelli, E., Rodríguez-Bencomo, J., García-Ruiz A., Sánchez-Patán, F., Martín-Álvarez, P., Bartolomé, B. and Moreno-Arribas, M. A winery-scale trial of the use of antimicrobial plant phenolic exracts as preservatives during ageing in barréis. Food Control 33:440-447 (2013)). Desafortunadamente, estas estrategias sólo han sido estudiadas para el biocontrol de bacterias ácido-lácticas, por lo que su efecto sobre el crecimiento de levaduras contaminantes no ha sido reportado. En este sentido, Ruiz-Moreno et al (Ruiz-Moreno, M., Raposo, R., Moreno-Rojas, J., Zafrilla, P., Cayuela, J., Mulero, J., Puertas, B., Guerrero, R., Piñeiro, Z., Girón, F. and Cantos-Villar, E. Efficacy of olive oil mili extract in replacing sulfur dioxide in wine model. Food Sci. Technol-Leb. 61 :1 17-123 2015), estudiaron el efecto de un extracto enriquecido en hidroxitirosol (obtenido desde los desechos sólidos de la producción de aceite de oliva) sobre levaduras y bacterias de interés enológico en vino modelo. Así, determinaron que la suplementacion de 80 mg/L del extracto enriquecido presentaba una actividad antimicrobiana similar a la suplementación de 80 mg/L de S02 sobre Hanseniaspora uvarum, Candida stellata, Lactobacillus plantarum, Pediococcus damnosus, Acetobacter aceti y Oenococcus oeni. Sin embargo, dicho tratamiento no generó diferencias en la fase lag (λ) ni en la velocidad específica de crecimiento máxima (/ max) de B. bruxellensis (Ruiz-Moreno, M., Raposo, R., Moreno-Rojas, J., Zafrilla, P., Cayuela, J., Mulero, J., Puertas, B., Guerrero, R., Piñeiro, Z., Girón, F. and Cantos-Villar, E. Efficacy of olive oil mili extract in replacing sulfur dioxide in wine model. Food Sci. Technol-Leb. 61 :1 17-123. 2015), dejando en evidencia la ineficacia de este extracto como biocontrolador de ésta levadura contaminante. Es por esto que, hasta la fecha, no se ha descrito un extracto de origen vegetal que permita controlar el crecimiento de B. bruxellensis en los procesos de producción de vinos.
La presente invención desarrolla y caracteriza un extracto vegetal que presenta actividades antioxidantes y preservantes. El presente extracto tiene actividad antifúngica sobre B. bruxellensis CECT1451 , sin afectar el crecimiento de S. cerevisiae CECT1492 en medio de laboratorio. Este resultado avala que el presente extracto se comporta como un inhibidor selectivo de B. bruxellensis.
La presente invención entonces demuestra el efecto antifúngico del presente extracto sobre dos aislados vínicos de B. bruxellensis y una cepa comercial de S. cerevisiae en medio de laboratorio, vino sintético y vino natural. Además, se evalúa si el presente extracto vegetal presenta afinidad a componentes de pared celular fúngica, con el objetivo de realizar una aproximación inicial a su posible mecanismo de acción. Esta invención muestra la acción antifúngica selectiva de un extracto vegetal en matrices vínicas, con la aplicación derivada que implica para la industria vitivinícola.
Breve Descripción de la Invención
La presente invención se refiere a un extracto vegetal que presenta actividades antioxidantes y preservantes. El presente extracto tiene actividad antifúngica sobre B. bruxellensis CECT1451 , sin afectar el crecimiento de S. cerevisiae CECT1492 en medio de laboratorio. Es decir, el presente extracto se comporta como un inhibidor selectivo de B. bruxellensis. La presente invención también se refiere a la composición que contiene dicho extracto, y su uso y método para controlar el deterioro del vino por la levadura Brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino.
En la presente invención, se usan plántulas de C. parqui crecidas en condiciones in vitro. Las plantas fueron crecidas en cámaras de crecimiento a 24 ± 2aC y fotoperiodo 16/8 horas luz/oscuridad. Plantas de 30 dias de cultivo fueron usadas para la preparación de extractos. También, se prepara un extracto etanólico de C. parqui, determinándose la estructura de las principales moléculas del extracto por cromatografía liquida acoplada a un detector de masa. Asimismo, se determina la concentración minina biocida del extracto vegetal sobre la cepa C. cerevisiae EC1 18 y las cepas B. bruxellensis LAMAP1359 y LAMAP2480 en medio enriquecido (YPD), vino sintético, vino blanco y vino tinto.
Además, se determina la afinidad del extracto vegetal por componentes comerciales de la pared celular.
Breve Descripción de las Figuras.
Fig. 1 Plántulas de C. parqui crecidas en condiciones in vitro. Las plantas fueron crecidas en cámaras de crecimiento a 24 ± 2aC.
Fig. 2. Estructura de las principales moléculas presentes en el extracto etanólico de C. parqui. Las estructuras fueron determinadas a partir de los extractos etanolicos, usando cromatografía liquida acoplada a un detector de masas. Estas moléculas fueron síringína, mirísticína, quercetina 3-galloíl- α-L-arabínopiranosída, sinensetín, 1 -O-sinapoíl beta-D-glucosido, epígallocatequina-3-O-cafeato. Figuras 3A-3L: Determinación de la concentración mínima biocida (MBC) del extracto vegetal sobre la cepa S. cerevisiae EC1 1 18 y las cepas B. bruxellensis LAMAP1359 y LAMAP2480 en medio enriquecido (YPD), vino sintético (SW), vino blanco (WW) y vino tinto (RW). Barras blancas: Control de (etanol 85% v/v) suplementado en las concentraciones (v/v) indicadas; Barras grises: Extracto de palquil suplementado en las concentraciones (v/v) indicadas.
Figuras 4A-4B: Ensayo de afinidad del extracto de C. palqui por componentes comerciales de pared celular. Barras blancas: Control sin adición de componentes de pared; Barras grises: 9 mg mL"1 de Laminarina (LM), Mañano (MN), Pululano (PL), Curdulano (CR) y Pustulano (PT).
Descripción Detallada del Invento
La presente invención se refiere a un extracto etanolico obtenido a partir de C. parqui (palqui) cultivado in wfro con actividades antioxidantes y preservantes. El presente extracto presenta actividad antifúngica sobre B. bruxellensis CE CT 1451 , sin afectar el crecimiento de S. cerevisiae CECT1492 en medio de laboratorio. Es decir, el presente extracto se comporta como un inhibidor selectivo de B. bruxellensis.
La presente invención también se refiere a la composición que contiene dicho extracto, y su uso y método para controlar el deterioro del vino por la levadura Brettanomyces bruxellensis en diferentes matrices del vino. El producto se usa como solución hidroalcohilca para el tratamiento de las barricas de almacenaje de vino.
Las plántulas de C. parqui son crecidas en condiciones in vitro en cámaras de crecimiento a 24 ± 2aC y fotoperiodo 1 6/8 horas luz/oscuridad. Plantas de 30 días de cultivo fueron usadas para la preparación de extractos. Se determina la estructura de las principales moléculas del extracto etanólico así obtenido de C. parqui mediante cromatografía liquida acoplada a un detector de masa. Estas moléculas son siringina, miristicina quercetina, 3-galloil-a-L-arabinopiranosida sinensetin, 1 -O-sinapoil beta-D-glucosido, epigallocatequina-3-O-cafeato. También, se determina la concentración minina biocida del extracto vegetal sobre la cepa C. cerevisiae EC1 18 y las cepas B. bruxellensis LAMAP1359 y LAMAP2480 en medio enriquecido (YPD), vino sintético, vino blanco y vino tinto, además, se determina la afinidad del extracto vegetal por componentes comerciales de la pared celular.
Ejemplos
Producción de plántulas de C. parqui.
Plántulas de C. parqui crecidas en condiciones in vitro. Las plantas fueron crecidas en cámaras de crecimiento a 24 ± 2aC y fotoperiodo 16/8 horas luz/oscuridad. Plantas de 30 dias de cultivo fueron usadas para la preparación de extractos. Figura 1
Extracto vegetal y levaduras en estudio
El extracto obtenido desde C. parqui corresponde a un extracto de naturaleza polifenólica, obtenido mediante extracción orgánica en etanol al 85% (v/v). Las cepas de B. bruxellensis LAMAP1359 y LAMAP2480 corresponden a aislados vínicos nativos depositados en el cepario mientras que S. cerevisiae EC1 1 18 corresponde a una cepa vínica comercial (Lallemand Inc). La identificación a nivel de especie de cada levadura aislada fue realizada mediante análisis de la región espadadora interna del RNA ribosomal 5,8S, según lo descrito por Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C, Uruburu, F. and Querol, A. Identification of yeast by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two robosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:329-337 (1999).
Determinación de las principales moléculas presentes en el extracto etanolico de C. parqui.
Los extractos se analizaron en un cromatógrafo líquido acoplado a un espectrómetro de masas de tripiecuadrupoio (LG- S/ S, Agilent 1200s-6410). Para ello se eluyó en una fase estacionaria reversa G18 (Agilent XDB-C18, 150 x 4,6 mm. 5 μτη de poro) y un gradiente de elusión de pasos lineales utilizando HCOOH 1 % v/v (A) y acetonitrilo (8). El gradiente correspondió de 0 a 5 mín, 10% de B; de 5 a 8 min. 25% de B; de 8 a 15 min, 35% de B, de 15 a 7 min, 35% de B y finalmente de 1 7 a 20 min, 10% de B, con un flujo de 0,6 mL min"' y 20 de volumen de inyección. Los parámetros de! espectrómetro de masas fueron 330SC de temperatura de nitrógeno, 9 L mín 1 de flujo, 45 psi de presión de nebulización, 4000 V de voltaje de ionización, en modo negativo, con un rango de 50 a 1000 m/z. Para el análisis untarget de! pool de metaboiitos, los cromatogramas fueron analizados utilizando la base de datos Metlin (https://metiin.scripps.8du/) contrastando los patrones de ionización. Análisis comparativos entre tratamientos se llevan a cabo subiendo los archivos desde el instrumento a la base de datos XCMS (https://xcmsoniine.scripps.edu) en donde el software itera todo el cromatograma, hace una comparación entre las abundancias relativas entre tratamientos y las contrasta con la base de datos Metlin para identificar las señales. Condiciones de cultivo
Las cepas de B. bruxellensis y S. cerevisiae fueron crecidas en medio YPD (0,5% p/v extracto de levadura, 0,5% p/v peptona, 2% p/v glucosa). Cuando fue requerido se utilizó agar YPD mediante la suplementación de 2% (p/v) de agar. El vino sintético (0,6 g L"1 glucosa, 1 ,2 g L"1 fructosa, 0,3 g L"1 trehalosa, 2 g L"1 extracto de levadura, 1 g L"1 (NH4)2S04, 0,4 g L"1 MgS04, 2 g L"1 KH2P04, 0,25 mg L" 1 biotina, 0,0045 mg L"1 tiamina, 10% etanol, pH 3,7) fue preparado según lo descrito por Sturm et al., (Sturm, E., Rojo, M., Ciclic, I., Ramírez, M. and Combina, M. Development of a model wine media to evalúate Dekkera bruxellensis growth in mimic wine conditions. Biocell 34:MIC-22 2010), mientras que los vinos naturales corresponden a los varietales Cabernet sauvignon y Sauvignon blanc (Valle Central, Chile). Éstos fueron desalcoholizados hasta 10% p/v de etanol mediante destilación osmótica (Valdéz et al 2009) y esterilizados por filtración utilizando un filtro de 0,22 μιτι de diámetro de poro (Edlab). Previo a la realización de los ensayos en vino natural y sintético, las cepas de B. bruxellensis y S. cerevisae fueron adaptadas a estas matrices según lo descrito por Coronado, P., Aguilera, S., Carmona, L, Godoy, L, Martínez, C. and Ganga M.A. Comparision of the behaviour of Brettanomyces bruxellensis strain LAMAP L2480 growing in authentic and synthetic wines. A. Van Leeuw. J. Microb. 107(5):1217-1223 (2015).
Determinación de la Concentración Mínima Biocida (MBC) y del porcentaje de viabilidad La determinación se realizó en placas de 96 pocilios en las cuales se colocó por triplicado 250 μί de una suspensión 1 x106 UFC/mL de las cepas B. bruxellensis LAMAP1359, LAMAP2180 y S. cerevisiae EC1 1 18, en medio YPD, vino sintético (SW), vino natural tinto (RW) y vino natural blanco (WW). Cada cultivo fue suplementado con el extracto de palqui desde 0% (v/v) hasta 4% (v/v). Como control se utilizó el mismo esquema de suplementación usando una solución 85% (v/v) de etanol. Éstas mezclas fueron incubadas a 28'C sin agitación durante 5 día s y luego se realizó el recuento de levaduras en agar YPD. Con estos recuentos se definió la MCB como el porcentaje (v/v) del extracto suplementado necesario para matar el 99,9% de las levaduras estudiadas, según lo descrito por Portugal et al., (Portugal, C, Sáenz, Y., Rojo-Bezares, B., Zarazaga, M., Torres, C, Cacho, J. and Ruiz-Larrea, F. Brettanomyces susceptibility to antimicrobial agents used in winemaking: in vitro and practical approaches. Eur. Food Res. Technol. 238(4):641 -652. 2013). El porcentaje de viabilidad fue definido como el porcentaje del logaritmo del número de colonias viables obtenidas luego del tratamiento en comparación al logaritmo del inoculo inicial. Ensayo de afinidad del extracto vegetal por componentes de pared celular
El ensayo se realizó en placas de 96 pocilios donde se colocó por triplicado 200 μί de una suspensión 1 x106 UFC/mL de las cepas B. bruxellensis LAMAP1359, LAMAP2480 y S. cerevisiae EC1 1 18 en vino natural tinto (RW) suplementado con 9 mg mL"1 de los componentes comerciales Laminarina, Mañano, Curdulano, Pustulano (Sigma) y Pululano (Elicittl). Estas placas fueron incubadas durante 5 días a 28'C sin agitación y el recuento de levaduras se realizó mediante siembra en agar YPD.
Crecimiento levaduras en distintas matrices
El crecimiento de las levaduras en las distintas matrices se analizó mediante la exposición de éstas a distintos porcentajes (v/v) del extracto de palqui. Con esos resultados se determinó la MBC y se realizó el cálculo del porcentaje de viabilidad. Considerando que el extracto de palqui corresponde a una extracción orgánica con etanol al 85% (v/v) se utilizó como control una solución de etanol del mismo porcentaje. Así, las concentraciones finales de etanol presentes en cada matriz se muestran en la tabla 1 .
Tabla 1. Concentraciones finales de etanol en las matrices luego de la suplementación del extracto vegetal y el control de etanol al 85% (v/v)
Suplementación Etanol (v/v)
(v/v) YPD SW RW WW
0 % 0 % 10 % 10 % 10 %
1 % 0,85 % 10,85 % 10,85 % 10,85 %
2 % 1 ,70 % 1 1 ,70 % 1 1 ,70 % 1 1 ,70 %
3 % 2,55 % 12,55% 12,55 % 12,55%
4 % 3,40 % 13,40 % 13,40 % 13,40%
Determinación de la MCB y de la viabilidad de las levaduras tratadas con el extracto de palqui Las cepas de B. bruxellensis LAMAP1359 y LAMAP2480, junto a la levadura comercial S. cerevisiae EC1 1 18 fueron adaptadas a las matrices vínicas antes de realizar los tratamientos. De manera general se observa que las tres cepas de levadura crecen en YPD y en las matrices vínicas sintéticas y naturales suplementadas con etanol al 85% (v/v), obteniendo recuentos muy similares (Fig. 3A-3L, barras blancas). Sin embargo, B. bruxellensis LAMAP1359 no muestra crecimiento cuando es inoculada en vino blanco (WW) suplementado con volúmenes superiores al 2% (v/v) de etanol al 85% (v/v), lo que es indicativo de una mayor susceptibilidad al alcohol en esta matriz.
Al comparar los controles con las levaduras tratadas con el extracto de palqui (Fig. 3, barras grises), se observa que éste afecta el crecimiento de ambas cepas de B. bruxellensis cuando el volumen suplementado supera el 3% (v/v) en medio YPD y el 2% (v/v) en los medios SW, WW y RW. No obstante, S. cerevisiae EC1 1 18 presenta crecimiento en estas condiciones. Resultados similares habían sido obtenidos al evaluar el crecimiento de S. cerevisiae en medio YPD. Esto queda nuevamente en evidencia, ya que su crecimiento no muestra diferencias significativas entre la suplementación de etanol y de extracto vegetal al 4% (v/v). Junto con esto, al comparar los comportamientos de ambas cepas de B. bruxellensis se observa que, a diferencia de la cepa LAMAP1359, la cepa LAMAP2480 presenta crecimiento en YPD suplementado con extracto vegetal al 2% (v/v) y WW suplementado con el extracto al 1 % (v/v). Esto refuerza que B. bruxellensis LAMAP1359 es más sensible a las condiciones de cultivo que la cepa LAMAP2480, lo que sería indicativo de diferencias a nivel de respuesta de ambas levaduras a condiciones de estrés ambiental. A pesar de estas diferencias, los recuentos indican que la suplementación de 2% (v/v) de extracto vegetal presenta un efecto fungicida efectivo sobre el crecimiento de ambas cepas de B. bruxellensis en SW, WW y RW, eliminando al 99,9% de las células inoculadas. En contraste, S. cerevisiae EC1 1 18 no muestra una variación significativa en su crecimiento cuando se suplementa el extracto de palqui al 2% (v/v) en matrices vínicas naturales (WW y RW). Así, se definió que la MBC del extracto de palqui corresponde a la suplementación del 2% (v/v) en SW, WW y RW. Con este volumen de extracto, S. cerevisiae EC1 1 18 presenta una viabilidad superior al 95% en YPD, WW y RW, mientras que en SW su viabilidad es cercana al 50% (Tabla 3). En contraste, B. bruxellensis LAMAP1359 no muestra viabilidad en ninguna de las matrices suplementadas con el extracto de palqui, mientras que B. bruxellensis LAMAP2480 presenta una viabilidad superior al 90% en YPD, mientras que en las matrices vínicas no existe viabilidad. Este resultado demuestra que el extracto de palqui afecta directamente la supervivencia de las cepas de B. bruxellensis en vino natural, sin afectar el crecimiento de la levadura fermentativa comercial S. cerevisiae EC1 1 18.
Tabla 2. Viabilidad (UFC/mL) de S. cerevisiae y B. bruxellensis en distintas matrices suplementadas con 2% (v/v) del extracto vegetal.
S. cerevisiae B. bruxellensis B. bruxellensis
Matriz
EC1 1 18 LAMAP1359 LAMAP2480
YPD 9,67 x107 ± 1 ,53 x107 d *ND 2,73 x107 ± 1 ,53 x106 c SW 1 ,07 x104 ± 2,08 x103 a *ND *ND
WW 2,00 x107 ± 5,26 x106 b *ND *ND
RW 3,47 x108 ± 6,43 x107 e *ND *ND
YPD: Medio nutritivo; SW: Vino sintético; WW: Vino Blanco; RW: Vino rojo
Valores con la misma letra en superíndice no tienen diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05) *ND: No Detectado (recuento igual a cero)
Tabla 3. Porcentaje de viabilidad de S. cerevisiae y B. bruxellensis en distintas matrices suplementadas con 2% (v/v) del extracto de palqui.
. cerevisiae B. bruxellensis B. bruxellensis
Matriz
EC1 1 18 LAMAP1359 LAMAP2480
YPD 95,48 ± 2,24 % 0,00 ± 0,00 % 91 ,44 ± 0,43 %
SW 48,22 ± 0,91 % 0,00 ± 0,00 % 0,00 ± 0,00 %
WW 96,02 ± 3,72 % 0,00 ± 0,00 % 0,00 ± 0,00 %
RW 100,00 ± 0,00 % 0,00 ± 0,00 % 0,00 ± 0,00 %
Valores en columnas con la misma letra en superíndice no tienen diferencia significativa (p < 0.05)
Afinidad del extracto vegetal por componentes de pared celular fúngica
Con el fin de realizar una aproximación inicial al mecanismo de acción antifúngica del extracto de palqui, se realizó un ensayo de unión a distintos glucanos identificados en paredes celulares de levaduras como S. cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe y el hongo unicelular Cryptococcus neoformans (Free, 2013). Este ensayo indirecto está basado en la premisa que un compuesto antifúngico con afinidad por uno o más glucanos de pared, cuando se encuentre en un vino saturado de éstos se unirá ellos, disminuyendo su concentración libre en el medio y minimizando su acción antifúngica sobre una levadura presente en la mezcla. Para esto, se suplemento RW con la MBC de extracto vegetal determinada en este estudio (2% v/v) y se saturó con 9 mg/mL de laminarina ([β-1 ,3]η glucano), pustulano ([β-1 ,6]η glucano), curdulano ([β-1 ,3]η-[β-1 ,6]n glucano), pululano ([a- 1 ,6]n glucano) y mañano ([a-1 ,2]-[a-1 ,3]-[a-1 ,6]n glucano). Luego de esto, se inocularon ambas cepas de B. bruxellensis por separado y se determinó la viabilidad post-tratamiento mediante recuento en agar YPD. Luego del tratamiento, podemos observar que la actividad antifúngica del extracto sobre ambas cepas de B. bruxellensis se mantiene. Sin embargo, en 6. bruxellensis LAMAP 1359 se registra viabilidad celular en RW saturado con laminarina (7,46%) y pustulano (6,24%), mientras que en B. bruxellensis LAMAP2480 se registra viabilidad en RW saturado con laminarina (21 ,01 %), mañano (25,51 %), pustulano (19,83%) y pululano (45,42%).
Dentro del proceso de producción de vinos, la etapa que presenta mayor riesgo de contaminación por B. bruxellensis corresponde a la etapa de maduración en barrica. Este proceso es frecuentemente realizado para vinos tintos, a modo de favorecer la acumulación de compuestos orgánicos que aporten a la complejidad aromática del producto (Oelofse, A., Pretorius, I. and du Toit, M. Significance of Brettanomyces and Dekkera during winemaking: A synoptic review. S. Afr. J. Enol. Vitic. 29(2):128- 144. 2008).
Uso del extracto hidroalcohólico de palqui para el sanitizado de barricas de almacenaje de vino.
Para este procedimiento se utilizó la metodología descrita por Guzzon et al., (Guzzon R. , Bernard M., Barnaba C, Bertoldi D., Pixner K., Larcher R. (201 7). The impact of different barrel sanitation approaches on the spoilage microflora and phenols composition of wine. J Food Sci Technol 54 (3). 810-821 ). Se lavó el interior de la barrica con agua fría presurizada (1 x105 Pa) durante 5 min. Se introducen en la barrica 50 L de una solución al 3% (v/v) de extracto de palqui. Se mantiene la barrica en agitación constante durante 120 h. Luego de este tratamiento se debe vaciar la barrica y dejar secar durante 24 h a temperatura ambiente para finalmente realizar un nuevo lavado de la barrica con agua fría presurizada (1 x105 Pa) durante 5 min. La barrica se debe usar inmediatamente después del lavado.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Extracto antifungico natural caracterizado porque es un extracto polifenolico de Cestrum parqui.
2. Una composición antifúngica natural caracterizada porque comprende el extracto de la reivindicación 1 .
3. Uso del extracto de la reivindicación 1 caracterizado porque sirve para el control de la levadura Brettanomyces bruxellensis.
4. Uso del extracto de la reivindicación 1 caracterizado porque sirve para controlar el deterioro del vino causada por la levadura Brettanomyces bruxellensis.
5. Método para controlar el deterioro del vino por la levadura Brettanomyces bruxellensis caracterizado comprende adicionar una solución hidroalcohólica de un extracto polifenolico de Cestrym parqui.
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