WO2019022385A1 - 금 나노입자의 응집을 이용한 유전자의 변이를 검출하는 방법 - Google Patents

금 나노입자의 응집을 이용한 유전자의 변이를 검출하는 방법 Download PDF

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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/155—Particles of a defined size, e.g. nanoparticles

Definitions

  • a common method for detecting a mutation in a specific gene is to capture the mutated gene using a gene strand complementary to the mutation to be detected, and then to generate a detection signal using a change in the nanoparticle or compound.
  • the gold nanoparticles exhibit various physical properties depending on their size and agglomeration state. In particular, the difference in absorbance in the visible light region is conspicuous. Using these properties, gold nanoparticles are being used for the detection of various biomaterials such as cells, proteins, and genes. However, since it is a visible light region, the detection limit is relatively low, and there is a problem that the generation condition of gold nanoparticles is very difficult to control.
  • Xue Bai et al. Disclose a technology for detecting gene mutation by immobilizing a complementary gene in a target to be detected in a nanoparticle, capturing the target, increasing the size of the particle, and measuring the resulting absorbance .
  • U.S. Patent Publication No. 2010-0075335 discloses a technique for detecting a gene mutation by immobilizing a gene complementary to a target to be detected in nanoparticles, capturing the target, and then forming an aggregate by controlling the ionic strength.
  • Patent Document 1 U.S. Published Patent Application No. 2010-0075335.
  • Non-Patent Document 1 Xue Bai et al., Biosensors and Bioelectronics, 2010, vol. 25, pp. 1984-1988.
  • Non-Patent Document 2 (Non-Patent Document 2) Paola Valentini et al., ACS Nono, 2013, 7 (6), pp. 5530-5538.
  • One aspect provides a method of detecting a mutation of a gene using a catalyst or an enzyme that controls the concentration of a compound that affects the production of metal nanoparticles.
  • One aspect is a method for detecting a mutation of a gene, more specifically,
  • a first hybridization reaction comprising contacting a first probe immobilized on a solid support with a target substance and comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence comprising a mutated portion of the mutation gene;
  • the method of detecting a gene mutation may be a method of detecting a gene mutation using a catalyst or an enzyme that controls the concentration of a compound that affects the production of metal nanoparticles.
  • the compound that affects the formation of the metal nanoparticles may mean a compound that increases, promotes, decreases, or inhibits the formation or aggregation of metal nanoparticles, and may specifically be a reducing agent that reduces the metal ion solution.
  • Compounds that affect the production of metal nanoparticles include sodium citrate, sodium ascorbate, hydroquinone, sodium borohydride, glucose, hydrogen peroxide , H 2 O 2 ), and the like, and may be, for example, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), but is not limited thereto.
  • the catalyst or enzyme that regulates the compound concentration may be a catalyst or an enzyme that decomposes the compound. Therefore, the concentration of the compound that affects the production of metal nanoparticles by the catalyst or the enzyme can be controlled. Since the concentration-adjusted compound ultimately affects the production of metal nanoparticles, the detection sensitivity can be increased by using the catalyst or the enzyme.
  • a method for detecting a mutation of a gene includes a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence comprising a mutated portion of a mutant gene, wherein a first probe immobilized on a solid support is contacted with a target substance to perform a first hybridization reaction .
  • mutation is used interchangeably with “ mutation ", which may refer to a change in the genetic character of a gene due to a change in the nucleotide sequence of the gene. Specifically, the mutation may occur by deletion, substitution, insertion, etc. of one or more bases of the gene.
  • the type of mutation may include, but is not limited to, for example, a mismatch mutation, a nonsense mutation, a silence mutation, a frame shift mutation, and the like.
  • mutant gene may mean that a mutation has occurred in a part of the nucleotide sequence of a gene.
  • the mutated gene may be a mutant gene derived from an individual to be mutated.
  • the subject may be a vertebrate, and may be, but is not limited to, mammals, amphibians, reptiles, birds, and the like, and more particularly a mammal including humans ( Homo sapiens ).
  • complementary may mean hybridization or base pairing between two strands of a nucleotide or nucleic acid, e. G., A double stranded DNA molecule.
  • nucleotide refers to a unit of nucleic acid such as DNA or RNA, consisting of one base, one pentane, and one or more phosphoric acids.
  • nucleotide constituting the nucleotide include a purine-based adenine (A), guanine (G), pyrimidine-based cytosine (C), thymine (T), and uracil (U), and the oligosaccharide constituting the nucleotide includes ribose (ribose) and deoxyribose (deoxyribose).
  • the types of nucleotides can be variously divided depending on the type of nucleotide and oligosaccharide constituting the nucleotide, and the number of phosphoric acid bound.
  • probe refers to RNA, DNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), and the like, which can be complementarily bound to a specific nucleotide sequence, ) And the like.
  • the probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • the probes can be chemically synthesized using the phospharamidite solid support method, or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences may incorporate additional features that do not alter the basic properties. Examples of additional features that may be incorporated include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more nucleic acids with homologues, and modifications between nucleic acids.
  • the first probe comprises a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence comprising a mutated portion of the mutated gene.
  • the first probe comprises a nucleotide sequence comprising a mutated portion of the mutant gene or a sequence complementary to the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence comprising 80% or more, 85%, 90%, 95%, 97% Or more and 99.9% or more homology, but may contain a nucleotide sequence having 99% or more homology to increase the detection specificity.
  • homology is intended to indicate the degree of similarity between nucleic acid sequences.
  • the first probe comprises at least 5, 10 or more, 10 to 1000, 10 to 500, 10 to 300, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30, 15 15 to 300, 15 to 200, 15 to 100, 15 to 50, 15 to 30 nucleotides, but may be of any length suitable for increasing detection specificity You can choose.
  • the first probe is immobilized on a solid support.
  • the solid support may be, but is not limited to, a magnetic bead, a silica bead, a polymer bead, and the like.
  • the first probe may be DNA, RNA, PNA, LNA, or the like, but is not limited thereto.
  • target material means a substance for confirming whether or not it is a mutation gene, and specifically, it may be a nucleic acid extracted from a biological sample.
  • the biological sample may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine or the like separated from the individual to be examined for mutation of the gene.
  • the nucleic acid may be DNA, or RNA, but is not limited thereto.
  • the contact may be contact by incubation, but is not limited thereto.
  • hybridization reaction may mean a reaction in which two different single-stranded nucleic acids hybridize to form a double-stranded nucleic acid. Stable double strands can be formed if two different single stranded nucleic acids have high sequence complementarity.
  • the hybridization reaction may be performed by a method known in the art, and specifically, may be performed in a hybridization solution.
  • a hybridization solution those known in the art can be used.
  • the hybridization solution may be, for example, a solution containing saline sodium citrate (SSC), polysorbate 20 (Tween 20) and the like.
  • the reaction time and the reaction temperature may be appropriately selected to perform the hybridization reaction.
  • the reaction time may be from 1 minute to 24 hours, from 10 minutes to 24 hours, from 10 minutes to 20 hours, from 10 minutes to 15 hours, from 10 minutes to 10 hours, from 10 minutes to 5 hours, from 30 minutes to 24 hours, 30 minutes to 10 hours, 30 minutes to 5 hours, 1 hour to 24 hours, 1 hour to 20 hours, 1 hour to 15 hours, 1 hour to 10 hours, 1 hour to 20 hours, 30 minutes to 15 hours, 5 hours, 1 hour to 3 hours, but is not limited thereto.
  • the reaction temperature may be 5 to 35 ⁇ ⁇ , 5 to 30 ⁇ ⁇ , 5 to 25 ⁇ ⁇ , 10 to 35 ⁇ ⁇ , 10 to 30 ⁇ ⁇ , 10 to 25 ⁇ ⁇ , 10 to 20 ⁇ ⁇ , but is not limited thereto.
  • a method for detecting a mutation of a gene comprises contacting a second probe, which is complementary to a nucleotide sequence that does not include a mutated portion of a mutant gene, to a catalyst or an enzyme that oxidizes a reducing agent, with a first hybridization reaction, Hybridization reaction.
  • the second probe includes a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence not including a mutated portion of the mutated gene. Therefore, only when the target substance is hybridized with the first probe in the first hybridization reaction step, the second probe can be hybridized with the target substance contained in the first hybridization reaction product.
  • the second probe may comprise at least 5, 10 or more, 10 to 1000, 10 to 500, 10 to 300, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30, 15 15 to 300, 15 to 200, 15 to 100, 15 to 50, 15 to 30 nucleotides, but may be of any length suitable for increasing detection specificity You can choose.
  • the second probe is connected to a catalyst or an enzyme for oxidizing the reducing agent.
  • the catalyst for oxidizing the reducing agent may be potassium iodide (KI), phosphoric acid (H 3 PO 4 ), manganese dioxide (MnO 2 ), or the like, but is not limited thereto.
  • the enzyme capable of decomposing hydrogen peroxide may be, but not limited to, catalase, oxidase, peroxidase, and the like.
  • the second probe may be immobilized on a nanoparticle immobilized with a catalyst or enzyme for oxidizing a reducing agent.
  • the kind of the nanoparticles may include, but is not limited to, metal nanoparticles, magnetic nanoparticles, silica nanoparticles, and the like.
  • the second probe may be DNA, RNA, PNA, LNA, or the like, but is not limited thereto.
  • the reaction time and the reaction temperature may be appropriately selected to perform the hybridization reaction.
  • the reaction time may be from 1 minute to 24 hours, from 10 minutes to 24 hours, from 10 minutes to 20 hours, from 10 minutes to 15 hours, from 10 minutes to 10 hours, from 10 minutes to 5 hours, from 30 minutes to 24 hours, 30 minutes to 20 hours, 30 minutes to 15 hours, 30 minutes to 10 hours, 30 minutes to 5 hours, 30 minutes to 3 hours, 30 minutes to 2 hours, 30 minutes to 1 hour and 30 minutes.
  • the reaction temperature may range from 0 to 35 ⁇ , 0 to 30 ⁇ , 0 to 25 ⁇ , 0 to 20 ⁇ , 0 to 15 ⁇ , 0 to 10 ⁇ , 0 to 5 ⁇ , 1 to 10 ⁇ , Deg.] C, 3 to 10 [deg.] C, and 3 to 5 [deg.] C.
  • the method for detecting a mutation of a gene may further include a step of washing with a high salt solution after the second hybridization reaction.
  • the high salt solution may be saline sodium citrate (SSC) or phosphate buffered saline (PBS), but is not limited thereto.
  • SSC saline sodium citrate
  • PBS phosphate buffered saline
  • the reactants not participating in the second hybridization reaction can be removed.
  • all of the enzymes not bound to the target substance are removed. That is, when the target substance is a mutant gene, the enzyme is bound by the second probe, and the enzyme bound to the target substance can serve to oxidize the reducing agent in the next step.
  • the enzyme can not bind because the second probe does not bind, and the enzyme is removed by washing, so that the reducing agent can not be oxidized in the next step.
  • the method for detecting a mutation of a gene includes contacting a reducing agent to a second hybridization reaction product to oxidize the reducing agent with the catalyst or enzyme.
  • the reducing agent can be oxidized by, for example, hydrogen peroxide by the catalyst or enzyme contained in the second hybridization reaction, that is, the catalyst or enzyme that oxidizes the reducing agent.
  • a non-limiting example of the hydrogen peroxide decomposition reaction formula is shown in Equation 1.
  • the concentration of the reducing agent for example, hydrogen peroxide, which is brought into contact with the second hybridization reactant may be 0.01 to 100 ⁇ M, 0.1 to 100 ⁇ M, 1 to 100 ⁇ M, 1 to 90 ⁇ M, 1 to 80 ⁇ M, 1 to 70 ⁇ M, mu M, 10 to 60 mu M, 15 to 60 mu M, 30 to 60 mu M, but is not limited thereto.
  • concentration of the reducing agent is more than 60 ⁇ M, the change in color or absorbance of the metal nanoparticles according to the concentration of the reducing agent may be small, which may be difficult to detect.
  • the reducing agent for example, hydrogen peroxide, which is brought into contact with the second hybridization reactant, may be dissolved in an MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer, but is not limited thereto.
  • the MES can serve as a weak reducing agent to assist the reaction of hydrogen peroxide or as a stabilizer to enhance the stability of metal nanoparticles.
  • the method of detecting a mutation of a gene includes a step of contacting the remaining reducing agent after oxidation with a metal ion solution to produce metal nanoparticles.
  • the metal ion solution may be a gold ion solution, or a silver ion solution, but is not limited thereto.
  • the metal nanoparticles may be gold nanoparticles, or silver nanoparticles, but are not limited thereto.
  • the color and absorption characteristics of the metal nanoparticles may vary depending on the concentration of the reducing agent. For example, when the concentration of the reducing agent is high, the gold ion is rapidly reduced to form a gold nanoparticle having a relatively uniform size, and a purple color is formed. When the concentration is low, the reduction occurs slowly, Nanoparticles can form and become blue-based (Roberto de la Rica et al., Nature Nanotechnology, 2012, 7, 821-824).
  • the amount of the reducing agent can be controlled by the catalyst or the enzyme, and the metal nanoparticles having different color and light absorbing characteristics can be obtained depending on the concentration of the reducing agent.
  • the method for detecting a mutation of a gene includes comparing the color of the produced metal nanoparticles with a control to determine whether a mutation of the gene is present.
  • the control group may be the color of the metal nanoparticles produced by performing the same steps for a sample lacking the mutation gene to be detected. If the method is performed on a sample lacking the mutated gene to be detected, the first and second hybridization reactants may not be generated. If the second hybridization reaction product is not produced, the catalyst or enzyme that decomposes the reducing agent does not work and the reducing agent may not decompose. The remaining unreduced reducing agent has a high concentration and can react with the metal ion solution to produce metal nanoparticles having color and absorption characteristics different from those of the mutant gene.
  • the color of the metal nanoparticles can be visually confirmed.
  • the mutation of the gene can be detected up to about 50 fM of the target substance with the naked eye.
  • the color of the metal nanoparticles may be confirmed by measuring the absorbance.
  • the measurement of the absorbance may be performed according to a method known in the art, for example, an absorbance measuring apparatus may be used.
  • the absorbance may be measured at 450 to 650 nm, 500 to 600 nm, for example, 550 nm, but is not limited thereto.
  • the mutation of the gene can be detected up to about 5 fM of the target substance by absorbance measurement.
  • Metal nanoparticles generally have a low detection limit.
  • the concentration of a specific compound is controlled using a catalyst or an enzyme, and metal nanoparticles having different color and light absorbing characteristics The femtomolar concentration can be detected with the naked eye and the detection limit is very high.
  • the method of detecting a mutation of a gene it is possible to detect a mutation of a gene to a femtomole concentration with high sensitivity without a separate detection device, and thus, a specific mutation And can be used for personalized treatment and prognosis monitoring.
  • 1 is a photograph showing the result of incubation with a gold ion solution when the concentration of hydrogen peroxide is 0, 15, 30, 45, 60, 75, or 90 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 2 shows the result of measuring the absorbance at 550 nm after the incubation with the gold ion solution when the concentration of hydrogen peroxide was 0, 15, 30, 45, 60, 75, or 90 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method for detecting a gene mutation according to one embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing the decomposition of hydrogen peroxide by catalase and the production of gold nanoparticles by hydrogen peroxide (Roberto de la Rica et al., Nature Nanotechnology, 2012, 7, 821-824).
  • FIG. 5 is a photograph showing the generation of gold nanoparticles according to the concentration of a mutated target (TM) and a mutation-free target (TW).
  • Fig. 6 is a graph showing the amount of absorbance change relative to the control group according to the concentration of the target (TM) with the mutation and the target (TW) without the mutation.
  • 100 ⁇ l of magnetic beads (Dynabeads® MyOne TM Streptavidin C1) was placed in an Eppendorf tube and the solution was removed using a magnet. The remaining beads were mixed with 100 ⁇ l of washing solution (1 ⁇ TE buffer, 1 M NaCl), and the beads were separated using a magnet and the solution was removed twice. To the remaining beads, 150 ⁇ l of the washing solution and 50 ⁇ l of the 10 ⁇ M solution of the first probe were added, followed by mixing at room temperature for 1 hour. 10 ⁇ l of a blocking solution (100 ⁇ M) was added thereto, followed by mixing for an additional hour. Again, 30 ⁇ l of 1 mM biotin solution was added and mixed for an additional hour.
  • 1 is a photograph showing the result of incubation with a gold ion solution when the concentration of hydrogen peroxide is 0, 15, 30, 45, 60, 75, or 90 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 2 shows the result of measuring the absorbance at 550 nm after the incubation with the gold ion solution when the concentration of hydrogen peroxide was 0, 15, 30, 45, 60, 75, or 90 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method for detecting a gene mutation according to one embodiment.
  • Fig. 4 is a diagram showing the decomposition of hydrogen peroxide by catalase and the production of gold nanoparticles by hydrogen peroxide.
  • FIG. 5 is a photograph showing the generation of gold nanoparticles according to the concentration of a mutated target (TM) and a mutation-free target (TW).
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of absorbance change with respect to the negative control according to the concentration of the target (TM) with the mutation and the target (TW) without the mutation.
  • the negative control group was a test group in which the concentration of TM and TW was 0 ⁇ M.

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Abstract

금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물 농도를 조절하는 촉매 또는 효소를 이용하여 유전자의 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법에 의하면, 별도의 검출 장비 없이도 유전자의 변이를 펨토몰 농도까지 고감도로 검출이 가능하므로, 조직, 혈액과 같은 다양한 시료에서 추출된 유전자의 특정 변이의 존재 여부를 확인하고, 이를 개인별 맞춤 치료 및 예후 모니터링에 이용할 수 있다.

Description

금 나노입자의 응집을 이용한 유전자의 변이를 검출하는 방법
금 나노입자의 응집을 이용한 유전자의 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특정 유전자의 변이를 검출하는 일반적인 방법은 검출하고자 하는 변이와 상보적인 유전자 가닥을 이용하여 변이 유전자를 포획(capture)한 다음, 나노입자나 화합물의 변화를 이용하여 검출 신호를 발생시키는 순서로 이루어진다.
금 나노입자는 그 크기 및 응집 상태에 따라 다양한 물리적인 특성을 나타내는데, 특히 가시광선 영역에서 흡광도의 차이가 두드러지게 나타난다. 이러한 특성을 이용하여 금 나노입자는 세포, 단백질, 유전자와 같은 다양한 바이오물질의 검출에 이용되고 있다. 그러나, 가시광선 영역이어서 검출한계가 상대적으로 낮으며, 금 나노입자의 생성 조건 조절이 매우 까다롭다는 문제가 있다.
Xue Bai 등의 논문은 나노입자에 검출하고자 하는 표적에 상보적인 유전자를 고정화시킨 후 표적을 포획한 다음, 입자의 크기를 증가시키고, 이에 따라 변화하는 흡광도를 측정하여 유전자 변이를 검출하는 기술을 개시하고 있다.
Paola Valentini 등의 논문은 나노입자에 검출하고자 하는 표적에 상보적인 유전자를 고정화시킨 후 표적을 포획한 다음, 이를 다시 자성 입자에 포획하여 자성 입자 주변에 금 나노입자의 농도를 증가시키는 유전자 변이 검출 기술을 개시하고 있다.
미국 공개특허 제2010-0075335호는 나노입자에 검출하고자 하는 표적에 상보적인 유전자를 고정화시킨 후 표적을 포획한 다음, 이온 강도를 조절하여 응집을 형성시킴으로써 유전자 변이를 검출하는 기술을 개시하고 있다.
상기 기술들은 모두 나노입자를 이용하여 유전자 변이를 검출하는데, 가시광선 영역에서 검출하기 때문에 검출한도 (limit of detection: LOD)가 나노몰(nanomolar) 내지 피코몰(picomolar) 수준이어서 형광에 비해 상대적으로 높지 않다.
따라서, 표적의 결합 여부에 따라 나노입자의 물리적, 화학적 상태변화를 일으켜 흡광도를 변화시키거나, 특정 화합물의 농도를 변화시켜 신호를 증폭시킴으로써 검출을 가능하게 하는 기술이 필요하다.
(특허문헌 1) 미국 공개특허공보 제2010-0075335호.
(비특허문헌 1) Xue Bai 등, Biosensors and Bioelectronics, 2010, vol. 25, pp. 1984-1988.
(비특허문헌 2) Paola Valentini 등, ACS Nono, 2013, 7 (6), pp. 5530-5538.
일 양상은 금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물 농도를 조절하는 촉매 또는 효소를 이용하여 유전자의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 유전자의 변이를 검출하는 방법, 보다 구체적으로
변이 유전자의 변이 부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고체 지지체에 고정화된 제1 프로브를 표적 물질과 접촉시켜 제1 혼성화 반응시키는 단계;
상기 변이 유전자의 변이 부분을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 연결된 제2 프로브를 상기 제1 혼성화 반응물과 접촉시켜 제2 혼성화 반응시키는 단계;
상기 제2 혼성화 반응물에 환원제를 접촉시켜 상기 촉매 또는 효소에 의해 상기 환원제를 산화시키는 단계;
산화 후 남아있는 환원제를 금속 이온 용액과 접촉시켜 금속 나노입자를 생성하는 단계; 및
상기 생성된 금속 나노입자의 색깔을 대조군과 비교하여 유전자의 변이가 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 유전자의 변이를 검출하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 따른 유전자 변이를 검출하는 방법은 금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물 농도를 조절하는 촉매 또는 효소를 이용하여 유전자 변이를 검출하는 방법일 수 있다.
상기 금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물은 금속 나노입자의 생성 또는 응집을 증가, 촉진, 감소, 또는 억제시키는 화합물을 의미할 수 있고, 구체적으로 금속 이온 용액을 환원시키는 환원제일 수 있다. 금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물은 시트르산 나트륨 (sodium citrate), 아스코르브산 나트륨 (sodium ascorbate), 하이드로퀴논 (hydroquinone), 테트라히드로붕산나트륨 (sodium borohydride), 글루코스 (glucose), 과산화수소 (hydrogen peroxide, H2O2) 등일 수 있고, 예를 들어 과산화수소(H2O2)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 화합물 농도를 조절하는 촉매 또는 효소는 화합물을 분해시키는 촉매 또는 효소일 수 있다. 따라서, 상기 촉매 또는 효소에 의해 금속 나노입자의 생성에 영향을 주는 화합물의 농도를 조절할 수 있다. 농도가 조절된 화합물은 결과적으로 금속 나노입자의 생성에 영향을 주기 때문에, 상기 촉매 또는 효소를 이용하여 검출감도를 증가시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 변이 유전자의 변이 부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고체 지지체에 고정화된 제1 프로브를 표적 물질과 접촉시켜 제1 혼성화 반응시키는 단계를 포함한다.
용어, "변이(mutation)"란 "돌연변이"와 상호교환적으로 사용되며, 유전자의 뉴클레오티드 서열의 변화로 유전정보가 변하면서 유전형질이 달라지는 현상을 의미할 수 있다. 구체적으로, 변이는 유전자의 하나 이상의 염기의 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 등에 의해 발생할 수 있다. 변이의 종류는, 예를 들어, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어, "변이 유전자(mutant gene)"란 유전자의 뉴클레오티드 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미할 수 있다. 변이 유전자는 유전자의 변이 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 유래된 변이 유전자일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 보다 구체적으로 인간(Homo sapiens)을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어, "상보적(complementary)"은 뉴클레오티드 또는 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA 분자의 2개의 가닥 간의 혼성화 또는 염기 짝지음을 의미할 수 있다.
용어, "뉴클레오티드(nucleotide)"란 DNA나 RNA 같은 핵산을 이루는 단위체로서, 염기 하나, 오탄당 하나, 한 개 이상의 인산으로 구성되어 있다. 뉴클레오티드를 구성하는 염기에는 퓨린 계열인 아데닌 (A), 및 구아닌 (G)과 피리미딘 계열의 시토신 (C), 티민 (T), 및 우라실 (U)이 있고, 뉴클레오티드를 구성하는 오탄당으로는 리보오스(ribose)와 데옥시리보오스(deoxyribose)가 있다. 뉴클레오티드를 구성하는 염기와 오탄당의 종류, 결합한 인산의 수에 따라 뉴클레오티드의 종류는 다양하게 나뉠 수 있다.
용어, "프로브(probe)"란 특정 염기 서열에 대해 상보적으로 결합할 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA, DNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid) 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트(phospharamidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 제1 프로브는 변이 유전자의 변이 부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 제1 프로브는 변이 유전자의 변이 부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 단편에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.9% 이상의 상동성(homology)을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 99% 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 용어, "상동성"은 핵산 서열 간의 유사도를 나타내기 위한 것이다. 상기 제1 프로브는 5개 이상, 10개 이상, 10개 내지 1000개, 10개 내지 500개, 10개 내지 300개, 10개 내지 100개, 10개 내지 50개, 10개 내지 30개, 15개 내지 500개, 15개 내지 300개, 15개 내지 200개, 15개 내지 100개, 15개 내지 50개, 15개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
상기 제1 프로브는 고체 지지체에 고정화되어 있다. 상기 고체 지지체는 자성 비드 (magnetic bead), 실리카 비드 (silica bead), 고분자 비드 (polymer bead) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제1 프로브는 DNA, RNA, PNA, LNA 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어, "표적 물질(target material)"이란 변이 유전자인지 여부를 확인하기 위한 물질을 의미할 수 있고, 구체적으로 생물학적 시료로부터 추출한 핵산일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 유전자의 변이 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 핵산은 DNA, 또는 RNA일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 접촉은 인큐베이션(incubation)에 의한 접촉일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어, "혼성화 반응(hybridization reaction)"이란 서로 다른 두 개의 단일 가닥 핵산이 혼성화하여 이중 가닥의 핵산이 형성되는 반응을 의미할 수 있다. 서로 다른 두 개의 단일 가닥 핵산이 서열 상보성이 높으면 안정된 이중 가닥이 형성될 수 있다.
상기 혼성화 반응은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있고, 구체적으로 혼성화 용액에서 수행될 수 있다. 상기 혼성화 용액은 당해 기술분야에 공지된 것을 사용할 수 있다. 상기 혼성화 용액은, 예를 들어, 살린 소듐 시트레이트 (saline sodium citrate: SSC), 폴리솔베이트 20 (Tween 20) 등을 포함하는 용액일 수 있다.
상기 제1 혼성화 반응은 반응 시간 및 반응 온도를 혼성화 반응을 수행하기에 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 반응 시간은 1분 내지 24시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 20시간, 10분 내지 15시간, 10분 내지 10시간, 10분 내지 5시간, 30분 내지 24시간, 30분 내지 20시간, 30분 내지 15시간, 30분 내지 10시간, 30분 내지 5시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 20시간, 1시간 내지 15시간, 1시간 내지 10시간, 1시간 내지 5시간, 1시간 내지 3시간일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 반응 온도는 5 내지 35℃, 5 내지 30℃, 5 내지 25℃, 10 내지 35℃, 10 내지 30℃, 10 내지 25℃, 10 내지 20℃일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 변이 유전자의 변이 부분을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 연결된 제2 프로브를 제1 혼성화 반응물과 접촉시켜 제2 혼성화 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 제2 프로브는 변이 유전자의 변이 부분을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 상기 제1 혼성화 반응 단계에서 표적 물질이 제1 프로브와 혼성화된 경우에만, 제2 프로브는 제1 혼성화 반응물에 포함된 표적 물질과 혼성화될 수 있다.
상기 제2 프로브는 5개 이상, 10개 이상, 10개 내지 1000개, 10개 내지 500개, 10개 내지 300개, 10개 내지 100개, 10개 내지 50개, 10개 내지 30개, 15개 내지 500개, 15개 내지 300개, 15개 내지 200개, 15개 내지 100개, 15개 내지 50개, 15개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
상기 제2 프로브는 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 연결되어 있다.
상기 환원제를 산화시키는 촉매는 요오드화칼륨 (KI), 인산 (H3PO4), 이산화망가니즈 (MnO2) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 과산화수소를 분해하는 효소는 카탈라제 (catalase), 옥시다제 (oxidase), 페록시다제 (peroxidase) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제2 프로브는 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 고정화된 나노입자에 고정화된 것일 수 있다. 상기 나노입자의 종류는 금속 나노입자, 자성 나노입자, 실리카 나노입자 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제2 프로브는 DNA, RNA, PNA, LNA 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제2 혼성화 반응은 반응 시간 및 반응 온도를 혼성화 반응을 수행하기에 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 반응 시간은 1분 내지 24시간, 10분 내지 24시간, 10분 내지 20시간, 10분 내지 15시간, 10분 내지 10시간, 10분 내지 5시간, 30분 내지 24시간, 30분 내지 20시간, 30분 내지 15시간, 30분 내지 10시간, 30분 내지 5시간, 30분 내지 3시간, 30분 내지 2시간, 30분 내지 1시간30분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 반응 온도는 0 내지 35℃, 0 내지 30℃, 0 내지 25℃, 0 내지 20℃, 0 내지 15℃, 0 내지 10℃, 0 내지 5℃, 1 내지 10℃, 1 내지 5℃, 3 내지 10℃, 3 내지 5℃일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 제2 혼성화 반응 후, 고염 용액(high salt solution)으로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 고염 용액은 SSC (saline sodium citrate), 또는 PBS (phosphate buffer saline)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세척에 의하여 제2 혼성화 반응에 참여하지 않은 반응물이 제거될 수 있다. 제2 혼성화 반응 후 고염 용액으로 세척하면, 표적 물질과 결합하지 않은 효소들은 모두 제거된다. 즉, 표적 물질이 변이 유전자인 경우에 제2 프로브에 의해 효소가 결합되고, 그 표적 물질에 결합된 효소가 다음 단계에서 환원제를 산화시키는 역할을 할 수 있다. 반면, 표적 물질이 변이 유전자가 아니라면 제2 프로브가 결합하지 못해 효소가 결합되지 못하고, 세척에 의해 효소가 제거되어, 다음 단계에서 환원제를 산화시키지 못한다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 제2 혼성화 반응물에 환원제를 접촉시켜 상기 촉매 또는 효소에 의해 상기 환원제를 산화시키는 단계를 포함한다.
상기 단계에서, 제2 혼성화 반응물에 포함된 촉매 또는 효소, 즉 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소에 의해 환원제가 산화될 수 있고, 예를 들어 과산화수소가 분해될 수 있다. 과산화수소 분해 반응식의 비제한적인 예는 식 1과 같다.
[식 1]
2H2O2 → 2H20 + O2
상기 제2 혼성화 반응물에 접촉시키는 환원제, 예를 들어 과산화수소의 농도는 0.01 내지 100 μM, 0.1 내지 100 μM, 1 내지 100 μM, 1 내지 90 μM, 1 내지 80 μM, 1 내지 70 μM, 1 내지 60 μM, 10 내지 60 μM, 15 내지 60 μM, 30 내지 60 μM일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 환원제의 농도가 60 μM을 초과하는 경우, 환원제의 농도에 따른 금속 나노입자의 색깔 또는 흡광도의 변화가 작아 검출이 어려울 수 있다.
상기 제2 혼성화 반응물에 접촉시키는 환원제, 예를 들어 과산화수소는 MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼에 용해된 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 MES는 과산화수소의 반응을 도와주는 약한 환원제, 또는 금속 나노입자의 안정성을 높여주는 안정제의 역할을 할 수 있다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 산화 후 남아있는 환원제를 금속 이온 용액과 접촉시켜 금속 나노입자를 생성하는 단계를 포함한다.
상기 금속 이온 용액은 금 이온 용액, 또는 은 이온 용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 또는 은 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 생성된 금속 나노입자는 환원제의 농도에 따라 색깔 및 흡광 특성이 달라질 수 있다. 예를 들어, 환원제의 농도가 높은 경우 금 이온의 환원이 빠르게 일어나 비교적 일정한 크기의 큰 금 나노입자가 형성되어 보라색 계열의 색깔을 띄게 되고, 농도가 낮은 경우 환원이 느리게 일어나 크기의 편차가 큰 금 나노입자가 형성되어 파란색 계열의 색깔을 띄게 될 수 있다 (Roberto de la Rica 등, Nature Nanotechnology, 2012, 7, 821-824).
따라서, 표적 물질이 변이 유전자인지 여부 및 그 양에 따라 촉매 또는 효소에 의해 환원제의 양이 조절되고, 조절된 환원제의 농도에 따라 색깔 및 흡광 특성이 다른 금속 나노입자를 얻을 수 있다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법은 생성된 금속 나노입자의 색깔을 대조군과 비교하여 유전자의 변이가 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
상기 대조군은 검출하고자 하는 변이 유전자가 없는 시료에 대해 동일한 단계들을 수행하여 생성된 금속 나노입자의 색깔일 수 있다. 상기 검출하고자 하는 변이 유전자가 없는 시료에 대해 상기 방법을 수행하면, 제1 및 제2 혼성화 반응물이 생성되지 않을 수 있다. 제2 혼성화 반응물이 생성되지 않으면 환원제를 분해시키는 촉매 또는 효소가 작용하지 않아 환원제가 분해되지 않을 수 있다. 분해되지 않고 남아 있는 환원제는 농도가 높아 금속 이온 용액과 반응하여 변이 유전자가 있는 경우와 다른 색깔 및 흡광 특성을 가지는 금속 나노입자를 생성할 수 있다.
상기 금속 나노입자의 색깔은 육안에 의해 확인할 수 있다. 일 구체예에 따른 방법에 의하면 육안으로 50 fM의 표적 물질에 대해서까지 유전자의 변이를 검출할 수 있다.
상기 금속 나노입자의 색깔은 흡광도 측정에 의해 확인하는 것일 수 있다. 흡광도의 측정은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있고, 예를 들어 흡광도 측정 장치를 사용할 수 있다. 상기 흡광도는 450 내지 650 nm, 500 내지 600 nm, 예를 들어 550 nm에서 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 방법에 의하면 흡광도 측정으로 5 fM의 표적 물질에 대해서까지 유전자의 변이를 검출할 수 있다.
금속 나노입자는 일반적으로 검출한계가 낮은 반면, 일 구체예에 따른 방법에 의하면 촉매 또는 효소를 이용하여 특정 화합물의 농도를 조절하고, 그 화합물의 농도에 따라 색깔 및 흡광 특성이 다른 금속 나노입자를 생성할 수 있으므로, 육안으로도 펨토몰(femtomolar) 농도까지 검출이 가능한 바 검출한계가 매우 높다.
일 구체예에 따른 유전자의 변이를 검출하는 방법에 의하면, 별도의 검출 장비 없이도 유전자의 변이를 펨토몰 농도까지 고감도로 검출이 가능하므로, 조직, 혈액과 같은 다양한 시료에서 추출된 유전자의 특정 변이의 존재 여부를 확인하고, 이를 개인별 맞춤 치료 및 예후 모니터링에 이용할 수 있다.
도 1은 과산화수소의 농도가 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 또는 90 μM일 때, 금 이온 용액과 인큐베이션한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 과산화수소의 농도가 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 또는 90 μM일 때, 금 이온 용액과 인큐베이션 후, 550 nm에서 흡광도를 측정한 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 유전자 변이의 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 카탈라제에 의한 과산화수소의 분해, 및 과산화수소에 의한 금 나노입자의 생성을 나타낸 도면이다 (Roberto de la Rica 등, Nature Nanotechnology, 2012, 7, 821-824).
도 5는 변이가 있는 표적 (TM)과 변이가 없는 표적 (TW)의 농도에 따른 금 나노입자의 생성을 나타낸 사진이다.
도 6은 변이가 있는 표적 (TM)과 변이가 없는 표적 (TW)의 농도에 따라 대조군 대비 흡광도 변화량을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제1 프로브가 고정화된 고체 지지체의 제조
자성 비드 (Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1) 100μl를 에펜도르프 튜브에 넣고 자석을 이용해 용액을 제거하였다. 남은 비드에 세척 용액 100μl (1X TE 버퍼, 1M NaCl)을 가하여 섞은 뒤 자석을 이용해 비드를 분리하고 용액을 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 남은 비드에 세척 용액 150 μl와 제1 프로브 10μM 용액 50 μl를 가한 뒤 상온에서 1시간 동안 혼합하였다. 여기에 블로커(Blocker) 100 μM 용액 10μl를 가하고 한 시간 더 혼합하였다. 다시 1mM 비오틴 용액 30 μl를 가하고 한 시간 더 혼합하였다. 자석을 이용해 비드를 분리한 후, 남은 비드에 세척 용액 100μl를 가하여 섞은 뒤 자석을 이용해 비드를 분리하고 용액을 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 남은 비드에 보관 용액 100μl (1X TE 버퍼, 0.05% Tween 20)를 가하여 섞은 후, 자석을 이용해 비드를 분리한 뒤 용액을 제거하는 과정을 2회 반복하였다. 남은 비드에 보관 용액 100μl를 넣고 잘 섞은 뒤 냉장 보관하였다. 하기 표 1에 제1 프로브 서열 및 블로커 서열을 나타내었다.
명칭 서열번호 서열
제1 프로브 1 5'-GGC CCG CCC AAA ATC TGT- Biotin 3'
블로커 2 5'-TTT TT-Biotin 3'
실시예 2: 과산화수소 농도에 따라 생성된 금 나노입자의 흡광도 변화
상기 실시예 1에서 제작된 비드 10μl를 혼성화 용액 (6× SSC 및 0.05% Tween 20)에서 2시간 동안 인큐베이션 후, 3× SSC로 세척하였다. 용액을 제거하고 6mM MES 버퍼에 들어있는 과산화수소(H2O2)를 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 또는 90 μM 농도로 넣었다. 1시간 동안 인큐베이션 후, 자석을 이용해 비드를 분리하고 남은 용액을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 증류수에 금 이온을 용해시킨 금 이온 용액 (200μM)을 넣고, 1시간 동안 인큐베이션 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1은 과산화수소의 농도가 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 또는 90 μM일 때, 금 이온 용액과 인큐베이션한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 과산화수소의 농도가 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 또는 90 μM일 때, 금 이온 용액과 인큐베이션 후, 550 nm에서 흡광도를 측정한 결과이다.
도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 과산화수소의 농도가 60μM 이하에서는 색깔의 차이가 보이며 550nm에서 흡광도가 증가하였다. 그러나, 과산화수소의 농도가 60μM 이상인 경우 색깔 변화 및 흡광도의 변화가 거의 일어나지 않았다.
따라서, 과산화수소의 농도에 따라 금 나노입자의 물성 및 이에 따른 흡광도가 변화하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 변이를 가지는 유전자의 검출
상기 실시예 1에서 제작된 비드 10μl를 혼성화 용액 (6× SSC 및 0.05% Tween 20) 50 μl로 2회 세척하였다. 세척 후, 변이가 있는 표적 (Target Mutant: TM)과 변이가 없는 표적 (Target Wild: TW)을 각각 농도 별로 혼성화 용액(6× SSC 및 0.05% Tween 20)과 혼합하여 50 μl를 만든 후, 비드와 2시간 동안 15℃에서 혼성화하였다. 3× SSC 및 0.05% Tween 20 용액 50μl로 세척 후, 문헌(Anal. Chem. 2013, 85, 6945-6952)에 따라 합성된 카탈라제(catalase)를 스트렙토아비딘이 고정화된 나노입자와 결합된 제2 프로브와 1시간 동안 4℃에서 혼성화하였다. 이때 혼성화 용액은 동일한 것을 사용하였다. 3× SSC 용액 50μl로 세척 후 용액을 제거하고, 6mM MES 버퍼에 들어있는 60μM 과산화수소 용액 100μl를 넣었다. 1시간 동안 인큐베이션 후 용액을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 증류수에 금 이온을 용해시킨 200μM 금 이온 용액 100μl을 넣고 1시간 동안 인큐베이션 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 변이가 있는 표적 (TM) 및 변이가 없는 표적 (TW)의 농도가 0μM인 것을 음성대조군으로 사용하였다. 하기 표 2에 변이가 있는 표적 (TM), 변이가 없는 표적 (TW), 및 제2 프로브의 서열을 나타내었다.
명칭 서열번호 서열
변이가 있는 표적 (TM) 3 5'-GGC GGG CCA AAC TGC T-3'
변이가 없는 표적 (TW) 4 5'-GGC TGG CCA AAC TGC T-3'
제2 프로브 5 5'Biotin - TTC CGC ACC CAG CAG TTT-3'
도 3은 일 구체예에 따른 유전자 변이의 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 카탈라제에 의한 과산화수소의 분해, 및 과산화수소에 의한 금 나노입자의 생성을 나타낸 도면이다.
도 5는 변이가 있는 표적 (TM)과 변이가 없는 표적 (TW)의 농도에 따른 금 나노입자의 생성을 나타낸 사진이다.
도 6은 변이가 있는 표적 (TM)과 변이가 없는 표적 (TW)의 농도에 따른 음성대조군 대비 흡광도 변화량을 나타낸 그래프이다. 이때, 음성대조군은 TM 및 TW의 농도가 0μM인 시험군이다.
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 육안으로 50fM까지 변이가 있는 표적 (TM)의 검출이 가능하였으며, 흡광도 측정으로는 5fM 수준까지 검출이 가능하였다.

Claims (18)

  1. 변이 유전자의 변이 부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고체 지지체에 고정화된 제1 프로브를 표적 물질과 접촉시켜 제1 혼성화 반응시키는 단계;
    상기 변이 유전자의 변이 부분을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 연결된 제2 프로브를 상기 제1 혼성화 반응물과 접촉시켜 제2 혼성화 반응시키는 단계;
    상기 제2 혼성화 반응물에 환원제를 접촉시켜 상기 촉매 또는 효소에 의해 상기 환원제를 산화시키는 단계;
    산화 후 남아있는 환원제를 금속 이온 용액과 접촉시켜 금속 나노입자를 생성하는 단계; 및
    상기 생성된 금속 나노입자의 색깔을 대조군과 비교하여 유전자의 변이가 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 유전자의 변이를 검출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 자성 비드, 실리카 비드, 또는 고분자 비드인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로브는 각각 DNA, RNA, PNA, 또는 LNA인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 물질은 생물학적 시료로부터 추출한 핵산인 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨인 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산은 DNA, 또는 RNA인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 환원제는 시트르산나트륨, 아스코르브산나트륨, 하이드로퀴논, 테트라히드로붕산나트륨, 글루코스, 또는 과산화수소인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 환원제를 산화시키는 효소는 카탈라제 (catalase), 옥시다제 (oxidase), 또는 페록시다제 (peroxidase)인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 프로브는 상기 환원제를 산화시키는 촉매 또는 효소가 고정화된 나노입자에 고정화된 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 제2 혼성화 반응 후, 고염 용액으로 세척하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 고염 용액은 SSC (saline sodium citrate), 또는 PBS (phosphate buffer saline)인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 혼성화 반응물에 접촉시키는 환원제의 농도는 1 내지 100 μM인 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 혼성화 반응물에 접촉시키는 환원제는 MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼에 용해된 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 이온 용액은 금 이온 용액, 또는 은 이온 용액인 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 또는 은 나노입자인 것인 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 대조군은 검출하고자 하는 변이 유전자가 없는 시료에 대해 동일한 단계들을 수행하여 생성된 금속 나노입자의 색깔인 것인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자의 색깔은 육안에 의해 확인하는 것인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 금속 나노입자의 색깔은 흡광도 측정에 의해 확인하는 것인 방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4347049B2 (ja) * 2001-10-09 2009-10-21 ナノスフェアー インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法
US20100075335A1 (en) * 2007-05-04 2010-03-25 Stab Vida, Investigação E Serviços Em Ciências Bio Colorimetric method and kit for the detection of specific nucleic acid sequences using metal nanoparticles functionalized with modified oligonucleotides
KR20130065159A (ko) * 2011-12-09 2013-06-19 고려대학교 산학협력단 부정합을 갖는 ｄｎａ 서열의 검출방법
KR20140097679A (ko) * 2013-01-28 2014-08-07 고려대학교 산학협력단 금 나노입자를 이용한 ｄｎａ 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4347049B2 (ja) * 2001-10-09 2009-10-21 ナノスフェアー インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法
US20100075335A1 (en) * 2007-05-04 2010-03-25 Stab Vida, Investigação E Serviços Em Ciências Bio Colorimetric method and kit for the detection of specific nucleic acid sequences using metal nanoparticles functionalized with modified oligonucleotides
KR20130065159A (ko) * 2011-12-09 2013-06-19 고려대학교 산학협력단 부정합을 갖는 ｄｎａ 서열의 검출방법
KR20140097679A (ko) * 2013-01-28 2014-08-07 고려대학교 산학협력단 금 나노입자를 이용한 ｄｎａ 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, FENG ET AL : "Catalase-functionalized Si02 nanoparticles mediate growth of gold nanoparticles for plasmonic biosensing of attomolar microRNA with the naked eye", RSC ADVANCES, vol. 6, no. 19, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 15709 - 15715, XP055680352, DOI: 10.1039/C5RA27574A *
DE LA RICA, ROBERTO ET AL : "Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye", NATURE NANOTECHNOLOGY, vol. 7, no. 12, 2012, pages 821 - 824, XP055317555 *

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