WO2019019529A1 - 一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在 5- 羟甲基糠酸合成中的应用 - Google Patents

一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在 5- 羟甲基糠酸合成中的应用 Download PDF

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Definitions

  • HMF 5-hydroxymethylfurfural
  • DFF 2,5-formylfuran
  • HMF microbial catalyzed HMF conversion
  • the present invention screens for a strain of Comamonas testosteroni SC1588 which is highly resistant to the substrate HMF and which can efficiently catalyze the selective oxidation of HMF to HMFCA. It is an object of the present invention to provide a strain of C. testosteroni and a method for catalyzing the selective oxidation of HMF to HMFCA.
  • an amino acid having a concentration of ⁇ 70 mM is further added to the buffer.
  • Figure 1 is a structural diagram of HMF and its oxidation products.

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Abstract

本发明提供了一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在5-羟甲基糠酸合成中的应用，该菌为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)SC1588，于2016年10月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO：M 2016562。

Description

一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在5-羟甲基糠酸合成中的应用 技术领域
本发明属于生物催化及化学工程领域，具体涉及一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在催化5-羟甲基糠醛选择性氧化合成5-羟甲基糠酸中的应用。
 背景技术
近年来由于化石资源的日益匮乏及环境污染的加剧，以可再生的生物质为原料生产生物基能源和平台化合物受到了人们的广泛关注。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, HMF）被美国能源部列为“Top 10+4”平台化合物（Green Chem., 2010, 12, 539），该生物基平台化合物可以通过碳水化合物脱水制备得到。HMF分子有多个活性基团如羟基、醛基及碳碳双键，易转化为各种有用的中间体。例如，HMF经选择性氧化可分别转化为2,5-二甲酰基呋喃（DFF）、5-羟甲基糠酸（5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid, HMFCA）、5-甲酰基糠酸(FFCA)及2,5-呋喃二甲酸（FDCA），结构如图1所示。这些氧化衍生物都是重要合成砌块，在能源、医药、高分子等领域具有重要的应用价值（Green Chem., 2015, 17, 3718）。例如，HMFCA既可用于生产各种生物基聚酯材料（Makromol. Chem., 1984, 185, 2347），又是合成一种白细胞介素抑制剂的原料(J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 3714)。并且，研究发现HMFCA具有抗肿瘤活性(Agric. Biol. Chem., 1981, 45, 2149)。
当前，HMFCA主要通过化学法制备。Kang及Subbiah等以HMF为底物，通过Cannizzaro反应制备得到HMFCA及2,5-二羟甲基呋喃，但该方法的最大缺点在于除了有氧化产物HMFCA生成外，还有等摩尔的还原产物2,5-二羟甲基呋喃形成，导致理论选择性仅为50%（J. Ind. Eng. Chem., 2012, 18, 174; Green Chem., 2013, 15, 2849）。惰性载体担载的贵金属如铂、金等是合成HMFCA的常见催化剂（J. Mol. Catal. A: Chem., 2014, 388-389, 123; Catal. Today, 2011, 160, 55; ChemSusChem, 2009, 2, 1138）。Zhang等报道二氧化钼乙酰丙酮酸盐能高效催化HMF氧化合成HMFCA，3h后目标产物产率为87%（Green Chem., 2014, 16, 2762）。
 技术问题
尽管化学法合成HMFCA已取得了长足进展，但化学法通常以重金属为催化剂，并且反应在强碱性水溶液或有机溶剂（如甲苯）中进行，环境不友好。此外，化学反应条件较激烈（高温，高氧气压力下），并且部分化学催化剂选择性不甚理想，容易导致产物中的活性羟基和羧基的进一步转化，从而无法实现目标产物的积累。与化学法相比，生物催化途径具有诸多优势，如反应条件温和、选择性高、步骤简单、无需利用环境不友好溶剂和催化剂，工艺绿色环保，对社会、经济的可持续发展具有重要意义。然而，生物催化HMF选择性氧化合成HMFCA仍颇具挑战，因为当前能够催化HMFCA合成的生物催化剂仍较少。Krystof等以H 2O 2为氧化剂，在乙酸乙酯-叔丁醇体系中利用脂肪酶催化HMF氧化合成HMFCA，尽管底物转化率几乎到达100%，但选择性不佳，会产生约20%副产物——HMFCA乙酸酯（ChemSusChem, 2013, 6, 826）。最近，Zong等报道了黄嘌呤氧化酶能够高选择性催化HMF氧化合成HMFCA（Green Chem., 2015, 17, 3718），反应7 h后目标产物产率达94%。尽管黄嘌呤氧化酶在低底物浓度（26 mM）下能高效、高选择性催化HMF氧化合成HMFCA，但该酶的底物谱非常窄；此外，黄嘌呤氧化酶价格昂贵。因此，迫切需要开发其他高效、高选择性、且对HMF具有高耐受性的生物催化剂。微生物具有生长快、营养要求低等特点，并且内源酶系丰富，是一类重要的工业生物催化剂（Biotechnol. Adv., 2009, 27, 686）。然而，微生物催化HMF转化的一个主要问题在于HMF不仅对微生物具有强烈的抑制作用，而且会破坏微生物细胞的细胞膜和细胞壁、抑制RNA的合成（Bioresour. Technol., 2000, 74, 25; Biochem. J., 2002, 363, 769;Biotechnol. Bioeng., 1999, 65, 24）。因此，大部分微生物通常对HMF的耐受性较差、且催化HMF转化速度慢。
技术解决方案
针对现有技术存在的问题，本发明筛选获得一株对底物HMF具有高耐受性，并且能高效催化HMF选择性氧化合成HMFCA的睾丸酮丛毛单胞菌（ Comamonas testosteroni）SC1588。本发明的目的在于提供一株睾丸酮丛毛单胞菌及其催化HMF选择性氧化合成HMFCA的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一株睾丸酮丛毛单胞菌（ Comamonas testosteroni）SC1588，为革兰氏阴性杆菌，运动型、严格需氧；在营养肉汤琼脂平板上，该菌菌落表面湿润、光滑、呈乳白色、质地均匀，如图2所示。
所述睾丸酮丛毛单胞菌SC1588在5-羟甲基糠酸合成中的应用。包括如下步骤：
（1）睾丸酮丛毛单胞菌SC1588在营养肉汤培养基中活化和培养，收集菌体细胞；
（2）将上述收集的菌体细胞加入含有5-羟甲基糠醛的缓冲液中，所述5-羟甲基糠醛浓度为10～180 mM，在温度10～45 ℃条件下反应8~96 h，得到5-羟甲基糠酸。
步骤（2）所述缓冲液中还加入浓度≤70 mM的氨基酸。
步骤（2）所述氨基酸为甘氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-色氨酸或L-天门冬氨酸，氨基酸浓度为20～50 mM。
步骤（2）所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液；所述缓冲液pH介于6.0～9.0。
步骤（2）所述反应过程中控制体系pH为7.0~8.0。
步骤（1）所述营养肉汤培养基浓度为1.8%。
在培养过程中添加浓度为0～5 mM的诱导物，所述诱导物为糠醛或糠醇。
步骤（2）所述菌体细胞浓度为10～30 mg/mL。
步骤（2）所述5-羟甲基糠醛浓度为40～160 mM。
步骤（2）反应条件为温度25～35 ℃、时间为11~60 h、转速为150 r/min。
 有益效果
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
1)    利用睾丸酮丛毛单胞菌SC1588作为催化剂，能高效、高选择性地催化HMF转化为目标产物HMFCA，并且克服了化学催化剂环境不友好的缺点。
2)    本发明利用的生物催化剂睾丸酮丛毛单胞菌SC1588对HMF具有高耐受性，能够催化高浓度底物（160 mM）选择性氧化合成目标产物，产率达98%。与已报道的生物催化工艺相比，本发明不仅底物浓度更高、反应效率更优异，而且选择性也更好。
3)    本发明反应过程简单，无需添加培养基（添加培养基会使反应体系更加复杂），易控、条件温和，有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。
本发明所述睾丸酮丛毛单胞菌SC1588，于2016年10月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC ，保藏号：CCTCC NO. M 2016562，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
 附图说明
图1为HMF及其氧化产物的结构图。
图2为睾丸酮丛毛单胞菌SC1588 菌落形态图。
图3为HMF及HMFCA分析的液相色谱图（FDCA、HMFCA、2,5-二羟甲基呋喃及HMF的保留时间分别为4.5、6.1、8.1及9.8 min）。
 本发明的最佳实施方式
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
实施例1
睾丸酮丛毛单胞菌SC1588活化与培养：接种于1.8%营养肉汤培养基（蛋白胨 10 g/L，牛肉膏粉3 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.2）中，在30 ℃及150 r/min下，活化12 h；随后，按1%的接种量接入新鲜营养肉汤培养基（1.8%）中，于30 ℃及150 r/min下，培养5 h，收集菌体细胞。
实施例2
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于35 ℃及150 r/min下反应。利用液相色谱监控反应（图3）。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为94%。
实施例3
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于25 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为91%。
实施例4
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于45 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为83%，HMFCA产率为53%。
实施例5
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 6.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为79%。
实施例6
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 8.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为92%。
实施例7
在4 mL Tris-HCl缓冲液（50 mM, pH 9.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。24 h后，HMF转化率为99%，HMFCA产率为82%。
实施例8
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.44 mmol HMF（110 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。48 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为96%。
实施例9
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.52 mmol HMF（130 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。60 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为82%。
实施例10
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.52 mmol HMF（130 mM）及0.08 mmol组氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。60 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为91%。
实施例11
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.52 mmol HMF（130 mM）及0.08 mmol甘氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。48 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为86%。
实施例12
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.52 mmol HMF（130 mM）及0.08 mmol L-丙氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。48 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为88%。
实施例13
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.52 mmol HMF（130 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应，至24 h时，加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。54 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为94%。
实施例14
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.64 mmol HMF（160 mM）及0.08 mmol组氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应，每隔24 h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。60 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为92%。
实施例15
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.72 mmol HMF（180 mM）及0.08 mmol组氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应，每隔24 h加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。96 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为46%。
实施例16
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.6 mmol HMF（150 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30℃及150 r/min下反应。60 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为76%。
实施例17
睾丸酮丛毛单胞菌SC1588接种于1.8%营养肉汤培养基中，在30 ℃及150 r/min下，活化12 h；随后，按1%的接种量接入含有5 mM糠醇的新鲜营养肉汤培养基（1.8%）中，于30 ℃及150 r/min下，培养5 h，收集菌体细胞。
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.6 mmol HMF（150 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经上述活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。36 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为76%。
实施例18
睾丸酮丛毛单胞菌SC1588接种于1.8%营养肉汤培养基中，在30 ℃及150 r/min下，活化12 h；随后，按1%的接种量接入含有5 mM糠醛的新鲜营养肉汤培养基（1.8%）中，于30 ℃及150 r/min下，培养5 h，收集菌体细胞。
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.6 mmol HMF（150 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经上述活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应。36 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为75%。
实施例19
睾丸酮丛毛单胞菌SC1588接种于1.8%营养肉汤培养基中，在30 ℃及150 r/min下，活化12 h；随后，按1%的接种量接入含有5 mM糠醇的新鲜营养肉汤培养基（1.8%）中，于30 ℃及150 r/min下，培养5 h，收集菌体细胞。
在50 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入8 mmol HMF（160 mM）及1 mmol组氨酸（20 mM），混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经上述活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于30 ℃及150 r/min下反应；反应至24 h时，加入碳酸氢钠将反应体系pH调至7.0。反应36 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为98%。
对比例1
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM）和0.9%营养肉汤，混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于35 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为73%。
对比例2
在4 mL磷酸盐缓冲液（200 mM, pH 7.0）中加入0.16 mmol HMF（40 mM）和0.32 mmol丙酮，混合均匀后，按30 mg/mL（按细胞湿重计）的浓度加入经实施例1活化和培养的睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞，于35 ℃及150 r/min下反应。11 h后，HMF转化率为100%，HMFCA产率为81%。

Claims (10)

  1. 一株睾丸酮丛毛单胞菌，其特征在于，该菌为睾丸酮丛毛单胞菌（ Comamonas testosteroni）SC1588，于2016年10月13日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO：M 2016562。
  2. 权利要求1所述睾丸酮丛毛单胞菌在5-羟甲基糠酸合成中的应用。
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
    （1）睾丸酮丛毛单胞菌SC1588在营养肉汤培养基中活化和培养，收集菌体细胞；
    （2）将上述收集的菌体细胞加入含有5-羟甲基糠醛的缓冲液中，所述5-羟甲基糠醛浓度为10～180 mM，在温度10～45 ℃条件下反应8~96 h，得到5-羟甲基糠酸。
  4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述缓冲液中还加入浓度≤70 mM的氨基酸。
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述氨基酸为甘氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-色氨酸或L-天门冬氨酸，氨基酸浓度为20～50 mM。
  6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液；所述缓冲液pH介于6.0～9.0。
  7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述反应过程中控制体系pH为7.0~8.0。
  8. 根据权利要求3或4或5或6或7所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述营养肉汤培养基浓度为1.8%；在培养过程中添加浓度为0～5 mM的诱导物，所述诱导物为糠醛或糠醇。
  9. 根据权利要求3或4或5或6或7所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述菌体细胞浓度为10～30 mg/mL；所述5-羟甲基糠醛浓度为40～160 mM。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤（2）反应条件为温度25～35 ℃、时间为11~60h、转速为150 r/min。
PCT/CN2017/116126 2017-07-25 2017-12-14 一株睾丸酮丛毛单胞菌及其在 5- 羟甲基糠酸合成中的应用 Ceased WO2019019529A1 (zh)

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