WO2018231090A1 - Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк - Google Patents

Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк Download PDF

Info

Publication number
WO2018231090A1
WO2018231090A1 PCT/RU2017/000423 RU2017000423W WO2018231090A1 WO 2018231090 A1 WO2018231090 A1 WO 2018231090A1 RU 2017000423 W RU2017000423 W RU 2017000423W WO 2018231090 A1 WO2018231090 A1 WO 2018231090A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
combinatorial
derivatives
rna oligonucleotides
rna
synthesis
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000423
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Борис Славинович ФАРБЕР, Софья Борисовна ФАРБЕР filed Critical Борис Славинович ФАРБЕР
Priority to EA202090752A priority Critical patent/EA202090752A1/ru
Priority to US16/771,364 priority patent/US11053608B2/en
Priority to PCT/RU2017/000423 priority patent/WO2018231090A1/ru
Publication of WO2018231090A1 publication Critical patent/WO2018231090A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/08—Liquid phase synthesis, i.e. wherein all library building blocks are in liquid phase or in solution during library creation; Particular methods of cleavage from the liquid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays

Definitions

  • scavengers from the English scavenger - scavenger
  • a modified polymer is introduced into the solution, which selectively removes excess reagent from the reaction mixture.
  • programmed industrial robots are increasingly being used, performing a sequence of routine uniform procedures for the isolation and purification of substances (automatic synthesizers).
  • the developers protected the 5'-end of the oligonucleotide from the action of nucleases, in others, they modified the 3'-end.
  • researchers from the USA replaced deoxyribosyl residues with morpholine fragments in order to create DNA fragments (RNAs) resistant to the action of nucleases.
  • RNAs DNA fragments
  • the principle of inactivation of genes by their complementary interaction with antisense nucleotides remained the same - the formation of hydrogen bonds.
  • complementary miRNAs that selectively block the synthesis of certain proteins in the cell. The ability of many adenocarcinomas to capture oligonucleotides and nanoparticles through pinocytosis is known.
  • nucleic acid chains (or uracil) and guanine-cytosine in the interaction of nucleic acid chains.
  • Complementary oligonucleotides (antisense) - chain B complementary chain A of the original oligonucleotide, capable of specifically hybridizing to chain A
  • RNA hybridization - the formation of double-stranded DNA (RNA) or duplexes of DNA: RNA as a result of the interaction of complementary nucleotides.
  • Blood nuclease - blood enzymes that destroy free RNA and DNA in the blood to mononucleotides.
  • Formylation is the process of attaching the remainder of formic acid to amino groups, alcohol groups with the formation of the remainder of the aldehyde group.
  • reactions of formylation Duff reaction, Hatterman reaction, Huben-Gösch reaction, Hatterman-Koch reaction
  • Combinatorial synthesis - synthesis using methods of combinatorial chemistry includes the simultaneous reaction between three or more reagents with the formation of a combinatorial product synthesis consisting of dozens of derivatives. These derivatives are then separated chromatographically, confirm their structure and study the biological activity.
  • modified anti-complementary oligonucleotides with anticancer properties and a method for their preparation characterized in that the oligonucleotides are a mixture of products of hydrolysis of polynucleotides, and the modification is carried out by changing to the opposite the sign of the charges of the molecules of nucleotide bases, acquiring anti-complimentary properties.
  • Hydrolysis of polynucleotides is carried out using natural or synthetic nucleases, acid or alkaline hydrolysis, and the structure is modified by acylating the amino groups of the mononucleotides in the structure of the oligonucleotides with dicarboxylic acid anhydrides or by alkylation with halocarboxylic acids.
  • Nz-NH 2 + R-COOCO-X- Nz-NH-COR (exocyclic amino groups of the nucleoside are acylated)
  • Rib- ribose residue in the nucleoside structure of alanine tRNA oligonucleotides X is a closed hydrocarbon chain in the structure of dicarboxylic and tricarboxylic acid anhydrides.
  • RNA oligonucleotide To obtain a complementary RNA oligonucleotide, simultaneous combinatorial synthesis was used with two reagents: succinic anhydride and formic acid.
  • Modifiers - succinic anhydride or formic acid can be introduced either simultaneously or sequentially - or first inject succinic anhydride, warm the mixture for 30-100 0 C for 1-60 minutes, and then inject formic acid and also warm the mixture for another 30-100 0 C 1 -60 minutes.
  • maleic anhydride, aconitic anhydride, glutaric, phthalic anhydride and acetic anhydride can be used as one of the modifiers instead of succinic anhydride.
  • Antitumor activity was evaluated by the following physiological indicators:
  • N is the number of animals in this group.
  • Pancreatic pancreas was determined by the number of days elapsed from the moment of tumor inoculation to the death of the last animal in this group. Data on the biological activity of MATR. given in table 5.
  • Lethal dose 4200 2700 180 180 LDioo, mcg / kg
  • Example 7 Wound healing activity Determination of the effect of the compositions MATP (combinatorial derivative of 3'-UUGGG-5 ') (D1) and MATP2 (combinatorial derivative of 3'-UUGAA-5') (D2) on tissue regeneration
  • the gel was changed every other day. Animals of the control group at the same time were similarly applied to the skin with a placebo - carbopol gel without active ingredients. The effect of the drug was evaluated by blood indices on 1.10.30.60.90.90 days of the experiment.
  • the proliferative activity of CD34 + stem cells was studied using the CD34 Count kit [2] for cytofluorimetry using a FACS Calibur flow cytofluorimeter. Digital material was processed using nonparametric statistics with the definition of the criterion “U” according to Wilcoxon – Mann – Whitney.
  • Table 7 shows the results of a study of the effect of the compositions on the number of pluripotent CD34 + cells in rat blood.
  • the normal level of CD34 cells in the blood ranges from 3 to 6 * 10 6 cells / liter.
  • Table 7 The number of pluripotent CD34 + cells in rat blood under the influence of compositions D1 and D2
  • the action of D1 / D2 leads to selective stimulation of pluripotent cell division in the wound and stimulation of excretion of fibroblast growth factors, contributes to a 6-fold acceleration of restoration of animal immunity after induced immunodeficiency.
  • the gel formulations D1 and D2 have significant regenerative ability to wounds, accelerating the epithelization and healing of wounds on average twice. Gels D1 and D2 have the ability to be absorbed through the skin and have a beneficial effect on the immune system of the whole organism through stimulation of the division of pluripotent cells CD34.
  • the treatment was carried out by immersing the sheet disks in solutions containing the corresponding concentrations of the active compounds (using DMSO as a co-solvent in an amount of not more than 5% in the test solution). The dive lasted 5 s. After processing, the disks were dried on dry filter paper, then stored on wet filter paper at 26-28 ° C in a Petri dish until they were removed from the untreated control eggs, and then the excretion coefficient was determined. Each experiment was repeated four times using at least three similar experiments for each concentration. The efficacy values given for each concentration show the average value of treatments carried out on at least 250 tick eggs. Corrected mortality was calculated according to Abbott. The results, expressed as percentages, are shown in table. 8. Table 8. Survival of eggs of the spider mite after processing by the developed MATAT combinatorial library
  • Example 1 Plastic trays were lined with a plastic wrap and filled with Sassafras (H 6.5, 1% OM), a sterilized sandy loamy soil.
  • One tray was inoculated with wheat (Triticum acstivum), barley (Hordeum vulgare), wild oats (Avena fatua), roofing poker (Bromus Secalinus), leaf-tailed mouse-tailed (Alopecurus myosurocdes), annual bluegrass (Rocha annua) viridis), Italian chaff (Liolium multiflorum), and rapeseed (Brassica napus).
  • stage 2 leaf development (Stage II Ladors). Before Spraying for pre-emergence treatments, another set of trays was prepared identically. The herbicides were diluted in a non-phytotoxic solvent and applied to the trays using a belt sprayer. Additionally, three other species were evaluated: Veronica hederae folia, starfish (Stellaria media) and Viola arveusis. These plants were grown in five-inch pots containing the same soil as previously described. Plants were grown for 22 days prior to treatment. The application of the herbicide was carried out in the same way as when screening trays. Plants were grown in a greenhouse for 21 days, during which time a visual assessment was made when compared with the untreated control. The assessment was based on a scale from 0-no effect to 100-total death. The results are shown in table.9-1 1.
  • the proposed MATR combinatorial library has herbicidal activity on a wide range of weeds, and on cultivated plants has a less pronounced growth-inhibitory effect and can be successfully used as a herbicidal agent.
  • Heteroptera Semi-winged insect bugs
  • bean bug Riptortus clavatus
  • southern green bug-shield bug Nezara vi ndula
  • bugs of the Lygus sp family white-winged bug
  • Bhssus leucopterus white-winged bug
  • pear-bug Steppha mtis nashi
  • thick-headed Circuhfer sp
  • green rice thick-headed Nephotettix cmcticeps
  • thick-headed bugs of the species Enpoasca sp sp Eryhferferura Delphacidae
  • brown rice delphacid Nilaparvata lugens
  • white-winged delphacid Sogatella furcifera
  • small brown delphacid Laodelphax stnatellus
  • jumping plant fleas Psylhdae
  • leaf flies Prydeida spryca
  • Bubbles - insects yellow tea tripods (Scirtothnps dorsahs), trips of the species Trips palmi, greenhouse tripe (Hehothnps haemorrhohdahs), flower tripe (Frankhmella occidentahs) and mossy tripod rice (Harlothnps aculeatus) Red apple (red) , spider mite (Tetranychus kanzawai), citrus red mite (Panonychus citn), European red mite (Panonychus ulmi), yellow spider mite (Eotetranychus carpim), Texas citrus mite (Phyllocoptruta oleivonus polyus), spider web false (Brevipalpus sp) root cod - howl (Rhizoglyphus robim) and mildew (Tyrophagus putrescentiae) nematodes, parasitic plants, southern root nematode (Meloidogyne incognita),
  • the compounds of the present invention exhibit excellent pesticidal activity against a wide range of pests, including winged insects, lepidopteran insects, winged insects, dipteran insects, hymenoptera insects, orthoptera insects, orthoptera insects, insects in which only a part is covered with scales. , ticks and parasitic nematodes on plants, and are also able to control pests that have become resistant to common pesticides. Insecticidal test against cabbage moth
  • MATR based on the oligonucleotide 3'-UUAGA-5 ⁇ diluted with water so that the concentration of the active ingredient was 500 ppm.
  • Cabbage leaves are immersed in the resulting diluted solution, air dried and placed in a polyvinyl chloride cup.
  • Cabbage moth larvae are released into the cup and the cup is covered with a lid, then the cup is placed in a thermostatic chamber for 6 days at a temperature of 25 ° C and the number of dead insects is counted. in order to determine the percentage of mortality. Spend two consecutive experiments. The average mortality rate for this version of MATR was 100%.
  • Rice Delphacid Insecticide Test MATP based on 3'-UUAGA-5 'oligonucleotide is diluted with water so that the concentration of the active ingredient is 500 ppm. Stems and rice leaves are immersed in the resulting diluted solution, which are then dried in air and placed in a test tube. 5 larvae of brown rice delphacide are released into the test tube and the tube is plugged with a porous substance. Then the test tube for 6 days is placed in a temperature-controlled chamber with a temperature of 25 ° C and count the number of dead insects, in order to determine the percentage of mortality. Two consecutive experiments are performed. The average mortality rate for this version of MATR was 100%. Insecticidal test against radiant bean weevil
  • MATR based on 3'-UUAGA-5 'oligonucleotide is diluted with water so that the concentration of the active ingredient is 100 ppm. 0.75 ml of the resulting diluted solution is applied as drops on filter paper with a diameter of 6 cm, which is placed in a polyvinyl chloride cup with a capacity of 60 ml. Five adult females of radiant bean weevil are released into the cup and the cup is covered with a lid. Then the cup is placed for 4 days in a temperature-controlled chamber with a temperature of 25 ° C and the number of dead insects is counted in order to determine the percentage of mortality. Spend two consecutive experiments. The average mortality rate for this version of MATR was 100%.
  • RNA oligonucleotides Various methods of administering supramolecular combinatorial derivatives of RNA oligonucleotides (MATP) can be used.
  • the MATP composition can be given orally or can be administered by intravascular, subcutaneous, intraperitoneal injection, in the form of an aerosol, by ocular route of administration, into the bladder, topically and so on.
  • inhalation methods are well known in the art.
  • the dose of the therapeutic composition will vary widely depending on the particular MATR administered, the nature of the disease (destination), frequency of administration, route of administration, clearance of the agent used from the host, and the like. The initial dose may be higher with subsequent lower maintenance doses.
  • the dose can be administered at a frequency of once a week or once every two weeks, or divided into smaller doses and administered once or several times a day, twice a week and so on to maintain an effective dose level. In many cases, a higher dose will be required for oral administration than for intravenous administration.
  • the compounds of this invention may be included in a variety of compositions for therapeutic administration.
  • the compounds of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions in combination with suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and can be incorporated into preparations in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as capsules, powders, granules, ointments, creams, foams, solutions, suppositories, injections, inhalation forms, gels, microspheres, lotions and aerosols.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents can be incorporated into preparations in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as capsules, powders, granules, ointments, creams, foams, solutions, suppositories, injections, inhalation forms, gels, microspheres, lotions and aerosols.
  • the administration of the compounds can be carried out in various ways, including oral, buccal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, percutaneous, intratracheal administration and so on.
  • the MATP of the invention can be distributed systemically after administration, or can be localized using an implant or other composition that holds the active dose at the site of implantation.
  • the compounds of the present invention can be administered alone, in combination with each other, or they can be used in combination with other known compounds (for example, classic anti-cancer agents, anti-inflammatory agents, immunomodulators and so on).
  • the compounds may be administered in the form of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the following methods and excipients are given by way of example only and are not in any way limiting.
  • the compounds can be used alone or in combination with suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato starch or sodium carboxymethyl cellulose; with lubricants such as talc or magnesium stearate; and, if desired, with diluents, buffering agents, moisturizing agents, preservatives and flavoring agents.
  • suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato starch or sodium carboxymethyl cellulose; with
  • the compounds may be included in injectable compositions by dissolving, suspending or emulsifying them in an aqueous or non-aqueous solvent, such as a vegetable or other such oils, synthetic glycerides of aliphatic acids, esters of higher aliphatic acids or propylene glycol; and, if desired, with conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • the compounds may be used in an aerosol composition for inhalation administration.
  • the compounds of the present invention may be incorporated into suitable pressure propellants such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.
  • the compounds can be incorporated into suppositories by mixing with a variety of bases, such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • bases such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • the compounds of the present invention can be administered rectally using a suppository.
  • the suppository may contain excipients, such as cocoa butter, carboax, and polyethylene glycols, which melt at body temperature but are solid at room temperature.
  • Standard dosage forms for oral or rectal administration such as syrups, elixirs and suspensions, where each unit dose, for example, a teaspoon, tablespoon, tablet or suppository, can contain a predetermined amount of a composition containing one or more - Lea compounds of the present invention.
  • unit dosage forms for injection or intravenous administration may contain the compound of the present invention in the composition in the form of a solution in sterile water, normal saline, or another pharmaceutically acceptable carrier.
  • Implants for sustained release of compositions are well known in the art. Implants are made in the form of microspheres, plates, and so on, with biodegradable or non-biodegradable polymers. For example, lactic and / or glycolic acid polymers form a degradable polymer that is well tolerated by the host.
  • An implant containing the anticancer MATP of the invention is positioned close to the tumor, so that the local concentration of the active agent is increased compared to other areas of the body.
  • unit dosage form refers to physically discrete units suitable for use as single doses for subjects of humans and animals, each unit containing a predetermined number of compounds of the present invention, which, according to calculations is sufficient to provide the desired effect, together with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.
  • a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient Opi- The dosage forms of the present invention depend on the particular compound used, and the effect to be achieved, and the pharmacodynamics of the compound used in the host.
  • Pharmaceutically acceptable excipients such as excipients, adjuvants, carriers or diluents, are generally available.
  • Typical doses for systemic administration range from 0.1 pg to 100 milligrams per kg of subject body weight per administration.
  • a typical dose may be one tablet for administration from two to six times a day, or one capsule or sustained release tablet for administration once a day with a proportionally higher content of the active ingredient.
  • the effect of prolonged release may be due to the materials of which the capsule is made, dissolving at different pH values, capsules providing a slow release under the influence of osmotic pressure or by any other known controlled release method.
  • liposomes are designed to produce an aerosol for pulmonary administration.
  • Liposomes can be made with purified proteins or peptides that mediate membrane fusion, such as Sendai virus or influenza virus and so on.
  • Lipids can be any useful combination of known liposome forming lipids, including cationic or zwitterionic lipids, such as phosphatidylcholine. The remaining lipids will usually neutral or acidic lipids such as cholesterol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and the like.
  • To obtain liposomes the method described by Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361.
  • lipids and a composition for incorporation into liposomes containing MATP are mixed in a suitable aqueous medium, suitably in a salt medium, where the total solids content will be in the range of about 110 wt.%.
  • a suitable aqueous medium suitably in a salt medium, where the total solids content will be in the range of about 110 wt.%.
  • the tube is placed in a warm water bath at approximately 25-40 ° C and this cycle is repeated approximately 5-10 times.
  • the composition is then sonicated for a suitable period of time, typically approximately 1-10 seconds, and optionally further mixed with a vortex mixer.
  • the volume is then increased by adding an aqueous medium, usually increasing the volume by about 1-2 times, followed by stirring and cooling.
  • the method allows the incorporation of supramolecular structures with high total molecular weight into liposomes.
  • compositions with other active agents are provided.
  • the MATR of the invention can be formulated with other pharmaceutically active agents, in particular other anticancer, immunomodulatory, wound healing, antiviral agents.
  • Other agents of interest include a wide range of unmodified preparations known in the art, including antibiotics.
  • Classes of antibiotics include penicillins, for example, penicillin G, penicillin V, methicillin, oxacillin, carbenicillin, nafcillin, ampicillin and so on; penicillins in combination with betalactamase inhibitors; cephalosporins, for example, cefaclor, cefazolin, cefuroxime, moxalactam and so on; carbapenems; monobactams; aminoglycosides; tetracyclines; macrolides; lincomycins; polymyxins; sulfonamides; quinolones; chloramphenicol; metronidazole; spectinomycin; trimethoprim; vancomycin; and so on.
  • penicillins for example, penicillin G, penicillin V, methicillin, oxacillin, carbenicillin, nafcillin, ampicillin and so on
  • penicillins in combination with betalactamase inhibitors cephalosporins,
  • Classes of antiviral agents include interferons, lamivudine, ribavirin, and so on; amantadine; remantadine, for example, zinamivir, oseltavi-world, and so on; acyclovir, valaciclovir, valganciclovir; and so on.
  • antiviral agents include adefovir, wbacavir, didanosine, emtricitabine, lamivudine, stavudine, tenofovir, efavirenz, nevirapine, indinavir, lopinavir and ritonavir, nelfinavir, ritonavir, sakinavir, daclofasvir.
  • Cytokines for example, interferon gamma, tumor necrosis factor alpha, interleukin 12, and so on, may also be included in the MATP composition of the invention.
  • the present invention is further described by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the invention.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

Область применения: Изобретение относится к химии нуклеотидов и позволяет синтезировать новые комбинаторные библиотеки супрамолекулярных олигонуклеотидов для применения в медицине, косметологии и фармации, в том числе для создания средств омоложения организма, лечения таких заболеваний человека, как рак и трофические язвы, создания новых гербицидов и пестицидов. Суть изобретения Комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК, отличающиеся тем, что для их получения проводят ковалентную модификацию исходных олигонуклеотидов РНК путем одновременного комбинаторного карбоксилирования и формилирования входящих в их состав экзоциклических аминогрупп аденина, гуанина, цитозина и спиртового остатка рибозы в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных, а в результате синтеза образуется комбинаторная смесь производных каждого олигонуклеотида и в дальнейшем используют полученную комбинаторную смесь целиком без разделения на фрагменты для создания биологически активных композиций. Технический результат: Модифицированные комплементарные защищенные олигонуклеотиды РНК с омолаживающими, противораковыми и др. свойствами на основе которых может быть получен лекарственный, ветеринарный, агрохимический или косметический препарат с широким спектром активности. Средство имеет широкий спектр действия, мало токсично и доступно для промышленного производства.

Description

Комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК
Область техники
Изобретение относится к химии нуклеотидов и позволяет синтезировать новые ком- бинаторные библиотеки супрамолекулярных олигонуклеотидов для применения в меди- цине, косметологии и фармации, в том числе для создания средств омоложения организма, лечения таких заболеваний человека, как рак и трофические язвы, создания новых гербици- дов и пестицидов.
Предшествующий уровень техники
Комбинаторная химия, методология органического химического синтеза, имеющая своей целью синтез большого массива однотипных химических соединений (комбинатор- ных библиотек) наиболее быстрым и экономичным способом, используя специфические подходы и технологии. Необходимость синтеза обширных комбинаторных библиотек воз- никла в 1990-х годах и была продиктована запросами тех областей промышленности, где поиск веществ с полезными свойствами нередко эффективнее вести путём эмпирического перебора свойств на больших выборках однотипных соединений. Основой для разработки нового направления химического синтеза послужил предложенный Р. Меррифилдом твер- дофазный пептидный синтез. Особенно интенсивно методы комбинаторной химии приме- няются в фармацевтике (дизайн новых лекарственных средств), при поиске эффективных катализаторов (полимеризации и пр.), дизайне наноматериалов. Для тестирования комби- наторных библиотек разработаны автоматизированные системы-роботы, производитель- ность которых достигает 100 тысяч образцов в день (так называемый высокопроизводитель- ный скрининг; от английского screening - просеивание).
На практике комбинаторная химия представляет собой совокупность приёмов и ме- тодов комбинирования многообразных исходных химических реагентов для получения как можно более разнообразных массивов химических продуктов путём проведения десятков, сотен, а иногда и тысяч параллельных химических превращений с образованием огромного числа конечных продуктов. Комбинаторная химия решает задачи, редко возникавшие в классическом химическом синтезе, а именно - быстро синтезировать много веществ, как правило, сложных по структуре и достаточно чистых. Разработка новых экономичных и скоростных технологий параллельного синтеза и параллельной очистки веществ достига- ется разнообразными путями. Вместо стандартного жидкофазного синтеза (одно вещество в одном сосуде за один приём) ставится множество синтезов (например, в пластиковой плашке с множеством ячеек, куда вещества вносят многоканальными пипетками). Вместо кипячения с обратным холодильником используют нагревание множества герметичных капсул (в ячеистом термостате или СВЧ-печи). Для фильтрования множества веществ ис- пользуют «сосуды-фильтры» (например, плашки с пористым дном). Упаривание осуществ- ляют вакуумным вымораживанием растворителя из центрифугируемых (для предотвраще- ния вспенивания) плашек. Для очистки используют методы параллельной хроматографии, объединяя в блоки множество хроматографических колонок. В методах жидкофазной ком- бинаторной химии стараются использовать лишь те реакции, которые протекают с высо- кими выходами и требуют минимальных усилий по очистке веществ. Для достижения боль- шего разнообразия продуктов обычные двухкомпонентные реакции заменяют на многоком- понентные.
Мощной технологией комбинаторной химии является твердофазный синтез - прове- дение реакций на модифицированной полимерной подложке. В этом случае сложная моле- кула (например, полипептид требуемой последовательности или сложное гетероцикличе- ское соединение) иммобилизуется («наращивается») на поверхность полимера в ходе по- следовательности реакций, а затем, на заключительном этапе, отщепляется с твёрдой под- ложки вследствие каких-либо химических превращений. Поэтому реакции можно прово- дить при большом избытке реагента, отмывая последний от полимера с целевым веществом и сводя синтез к принципу «чайного пакетика» (пористые пакеты с гранулами полимера последовательно помещают в стаканчики с реагентами). Новой технологией является за- мена твёрдых полимеров на перфторированные жидкости (не смешивающиеся с водой и стандартными растворителями). Для иммобилизации (перевода вещества в перфторирован- ную фазу) к молекуле исходного реагента присоединяют протяжённый перфторалкильный фрагмент. Это позволяет проводить синтез в эмульсиях с последующим разделением жид- ких фаз. Комбинированным методом комбинаторной химии является использование твердо- фазных реагентов (окислитель, кислота, основание иммобилизованы на полимере). Избы- ток твёрдого реагента вносят в растворы веществ, а затем отделяют фильтрованием. Другим приёмом является использование так называемых скавенджеров (от английского scavenger - мусорщик) - в раствор вносят модифицированный полимер, который селективно удаляет из реакционной смеси ненужный реагент, взятый в избытке. Всё шире используются про- граммируемые промышленные роботы, выполняющие последовательность рутинных одно- образных процедур по выделению и очистке веществ (автоматические синтезаторы).
Эффективность использования комбинаторной химии доказана на примерах обнару- жения новых лекарственных препаратов и катализаторов.
Лит.: Accounts of Chemical Research. 1996. Vol. 29. N2 3; Chemical Reviews. 1997. j4° 3-4; Handbook of combinatorial chemistry: drugs, catalysts, materials. Weinheim, 2002. Vol. 1- 2; Combinatorial chemistry on solid supports. В., 2007. Применение комбинаторных библиотек, актуальность
Одним из новых направлений в лечении онкологических заболеваний является раз- работка средств генной терапии рака. Одним из наиболее перспективным направлением генной терапии являются средства для инактивации генов на основе комплементарных по- линуклеотидов. Одной из основных проблем на пути внедрения средств генной терапии рака является разрушение синтетических комплементарных нуклеотидов нуклеазами крови, ограниченность проникающей способности внутрь клеток, чувствительность к си- стемам репарации генома клеток. Существуют разные подходы к проектированию antisense олигонуклеотидов, но принцип их взаимодействия с мишенями остается один: образование водородных связей между комплементарными нуклеотидами при увеличении степени устойчивости к нуклеазам. В одних случаях разработчики защищали от действия нуклеаз 5'- конец олигонуклеотида, в других- модифицировали 3'- конец. Исследователи из США заменили дезоксирибозильные остатки на фрагменты морфолина с целью создать устойчи- вые к действию нуклеаз фрагменты ДНК (РНК). При этом принцип инактивации генов пу- тем их комплементарного взаимодействия с antisense-нуклеотидами остался прежним - об- разование водородньк связей. Известны также комплементарные микроРНК, селективно блокирующие синтез определенных белков в клетке. Известна способность многих аденокарцином захватывать из межклеточного мат- рикса посредством пиноцитоза олигонуклеотиды и наночастицы. При этом здоровые клетки не способны захватывать малые олигонуклеотиды и липосомы. Это обеспечивает селективность накопления предлагаемых защищенных олигонуклеотидов (МАТР - моди- фицированная анти- тРНК) в раковых клетках и отсутствие токсичности у препарата МАТР. Для получения МАТР нами были использованы олигомерные фрагменты тРНК - распозна- ющиеся рибосомами. Этим олиго-РНК свойство комплементарное™ и защищенности от нуклеаз придавали путем одновременного комбинаторного формилирования и ацилирова- ния без последующего разделения комбинаторной библиотека на индивидуальные соеди- нения. Селективное накопление в раковой клетке МАТР приводит к его гибридизации с комплементарными мишенями в тРНК раковой клетки и к постепенной остановке синтеза белка из-за блокады синтеза белка в фазе включения в полипептидную цепь аминокислот. Действие МАТР основано на индукции апоптоза через остановку синтеза белка. МАТР фак- тически не влияет на здоровые клетки, блокирует синтез всех клеточных белков, исключает адаптацию раковой опухоли к терапии и селекцию устойчивых клеток за счет избыточного количества комбинаторных фрагментов РНК и невозможности со стороны опухоли адапти- роваться к такому огромному количеству фрагментов.
МАТР кроме противораковой активности in vitro, также проявил высокую актив- ность in vivo на моделях асцитной аденокарциномы Эрлиха у мышей, карциноме Льюиса мышей (мощный антиметастатический эффект по редукции на 50% количества метастаз и уменьшения вдвое размера центральной опухоли), продлении жизни мышей.
Терминология
Комплементарность - (в генетике и химии нуклеиновых кислот)— свойство азотистых оснований образовывать с помощью водородных связей парные комплексы аденин— тимин
(или урацил) и гуанин— цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот.
Комплементарные олигонуклеотиды (antisense) - цепь В, комплементарная цепь А исход- ного олигонуклеотида, способная специфично гибридизоваться с цепью А
Гибризидация ДНК (РНК) - образование двуцепочечной ДНК (РНК) или дуплексов ДНК:РНК в результате взаимодействия комплементарных нуклеотидов.
Инактивация генов- отключение процесса экспрессии гена через его гибридизацию с ком- плементарной цепью РНК или ДНК. Репарация ДНК— исправление повреждений молекулы ДНК, восстанавливающее её пер- воначальную структуру, считается, что система репарации генома раковых клеток ответ- ственна как за резистентность раковых клеток к классическим химиопрепаратам на основе антиметаболитов мононуклеотидов, так и за выживание опухоли при массивной химиоте- рапии и высокой изначальной чувствительности опухоли к лечению.
Адено арцино ы - вид раковых опухолей железистого происхождения (более 80% всех видов рака)
Нуклеазы крови- ферменты крови, разрушающие свободные РНК и ДНК в крови до мо- нонуклеотидов .
Формилирование- процесс присоединения остатка муравьиной кислоты к аминогруппам, спиртовым группам с образованием остатка альдегидной группы. Известно множество именных реакций формилирования (реакция Даффа, реакция Гаттермана, реакция Губена- Гёша, реакция ГАттермана-Коха)
Ацилирование- введение ацильного остатка RCO- (ацила) в состав органического соеди- нения, как правило, путём замещения атома водорода, введение остатка уксусной кислоты
СНзСО- называют ацетилированием, бензойной CeHsCO бензоилированием, муравьи- ной НСО формилированием. В зависимости от атома, к которому присоединяется ацильный остаток, выделяют С-ацилирование, Ν-ацилирование, О-ацилирование. В каче- стве ацилирующих агентов используют галогенангидриды и ангидриды кислот.
Алкилированис- введение алкильного заместителя в молекулу органического соединения. Типичными алкилирующими агентами являются алкилгалогениды, алкены, эпоксисоеди- нения, спирты, реже альдегиды, кетоны, эфиры, сульфиды, диазоалканы. Катализаторами алкилирования являются минеральные кислоты, кислоты Льюиса а также цеолиты. Алки- лирование широко применяется в химической и нефтехимической промышленности. Микро-РНК- малые некодирующие молекулы РНК длиной 18— 25 нуклеотидов (в среднем 22), обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов путём РНК-интер- ференции. Помимо внутриклеточной обнаружена внеклеточная (циркулирующая) мик- роРНК.
Комбинаторный синтез- синтез методами комбинаторной химии, включает одновремен- ную реакцию между тремя и более реагентами с образованием комбинаторного продукта синтеза, состоящего из десятков производных. Эти производные затем разделяют хромато- графически, подтверждают их структуру и изучают биологическую активность.
Одновременная комбинаторная модификация двумя модификаторами - если в реак- ции комбинаторного синтеза используют полифункциональную молекулу, имеющую более двух доступных для модификации групп и в реакцию, сразу вводят два модифицирующих агента, например, уксусный ангидрид и янтарный ангидрид. В результате реакции образу- ется смесь ацилированных производных в разных положениях - ацетил-сукцинил произ- водных.
Комбинаторная библиотека (combinatorial library) [лат. combinare— соединять, соче- тать; греч. biblion— книга и theke— хранилище]— набор большого числа всевозможных химических соединений, белков, генов или олигонуклеотидов, позволяющий осуществлять в нем быстрый поиск целевых генов или белков-мишеней. Напр., набор, состоящий из мил- лионов различных химических веществ, или совокупность рекомбинантных молекул ДНК, полученная встраиванием в вектор кДНК легкой и тяжелой цепей различных антител, и др.
Известны олигонуклеотиды содержащие модифицированные и неприродные нук- леотидные основания [1]. Механизм действия запатентованных олигонуклеотидов был ана- логичен antisense RNA и micro RNA, а препараты могли применяться в лечении, в том числе онкологических заболеваний. Недостатком патентуемых олигонуклеотидов является сложный многостадийный и дорогостоящий синтез производных РНК, трудно воспроизво- димый в промышленных условиях. Кроме того, патентуемый в прототипе способ не позво- лял получать комбинаторные смеси из тысяч производных, способных предотвращать эф- фект привыкания или мутации мишени. Применение объекта данного патента не было эф- фективным в экспериментах на моделях животных при онкологических заболеваниях, кроме того, данная разработка больше применима для диагностических и скрининговых исследований in vitro, чем для создания препаратов для лечения животных и человека в связи с тем, что предлагаемые модификации нуклеотидных оснований являются новыми ксенобиотиками и не подлежат безопасному метаболизму и биодеградации в организме. Известны модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противорако- выми свойствами и способ их получения [2]. Суть изобретения: модифицированные анти- комплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получе- ния, отличающиеся тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь продуктов гид- ролиза полинуклеотидов, а модификацию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретающих при этом антикомплимен- тарные свойства. Гидролиз полинуклеотидов проводят с применением природных или син- тетических нуклеаз, кислотного или щелочного гидролиза, а модификацию структуры пу- тем ацилирования аминогрупп мононуклеотидов в структуре олигонуклеотидов ангидри- дами дикарбоновых кислот или путем алкилирования галогенкарбоновыми кислотами. Раз- работанная смесь обладает способностью селективно связываться с тРНК и останавливать тем самым синтез белка в раковых клетках подобно действию микроРНК. Применение пре- паратав связи с его способностью адаптироваться к организму позволяет преодолевать при- выкание опухоли к препарату. Средство имеет широкий спектр действия, малотоксично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях ракового про- цесса. Недостатком данного изобретения является непостоянство состава исходной РНК для модификации и, соответственно, непостоянство фармакологического эффекта конеч- ного продукта, сложность его стандартизации, наличие остатков фермента - рибонуклеазы, наличие только одного химического механизма взаимодействия с тРНК раковых клеток - через ионные связи. В связи с этим, эффект такой композиции нестойкий и рост опухоли останавливается не на долго.
Данные недостатки устраняются путем использования сразу двух модификаторов, позволяющих задействовать в комплементарных фрагментах не только ионные связи между карбоксильными и амино-группами, но и водородные связи, значительно увеличить количество производных, исключив адаптацию опухоли к препарату; использования изна- чально олигонуклеотидов с четко известными последовательностями, что значительно упрощает их стандартизацию, валидацию, регистрацию и дает возможность полного хими- ческого синтеза на нуклеотидных синтезаторах; позволяет обеспечить повторяемость фар- макологических эффектов между сериями. Кроме того, применение таких бинарно моди- фицированных олигонуклеотидов значительно продливает фармакологический эффект препарата в виде более длительного эффекта (выживаемость мышей). Ранее двойная одно- временная модификация олигонуклеотидов РНК и ДНК не использовалась.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать биологически активные ком- бинаторные производные олигонуклеотидов РНК (комбинаторные библиотеки). Поставленная задача решается путем получения смеси комплиментарных комби- наторных производных олигонуклеотидов РНК, у которых свойство комплиментарности и защиты от нуклеаз придают путем одновременного двойного комбинаторного формилиро- вания и карбоксилирования (ацилирования или алкилирования) экзоциклических амино- групп мононуклеозидов и спиртовых остатков в структуре рибозы в составе РНК по схеме:
Nz-NH2 + НСООН= Nz-NH-COH (экзоциклические аминогруппы нуклеозида формилиру- ются)
Nz-NH2 + R-COOCO-X- = Nz-NH-COR (экзоциклические аминогруппы нуклеозида ацили- руются)
Figure imgf000010_0001
(экзоциклические аминогруппы нуклеозида ацилируются)
NzNH2 + X-COHal Nz-NH-CO-X
-HHal
(экзоциклические аминогруппы нуклеозида алкилируются)
Figure imgf000010_0002
(свободный остаток рибозы в структуре РНК ацилируется)
Rib-OH + X-COHal Νζ-0-CO-X
-HHal
(свободный остаток рибозы в структуре РНК алкилируется)
R-OH+HCOOH=R-0-COH (остаток рибозы формилируется)
Nz- остаток нуклеозида в структуре олигонуклеотидов аланиновой тРНК
Rib- остаток рибозы в структуре нуклеозидов олигонуклеотидов аланиновой тРНК Х- замкнутая углеводородная цепь в структуре ангидридов дикарбоновых и трикарбоно- вых кислот.
Полученную комбинаторную смесь не очищают на отдельные компоненты, а ис- пользуют целиком в качестве противоракового препарата для предотвращения адаптации опухоли либо для создания фармацевтических композиций с ранозаживляющим действием. При использовании в данном комбинаторном синтезе других комбинаций нуклеотидных последовательностей РНК наблюдается мощная стимуляция регенерации тканей у живот- ных и подобные комбинаторные смеси могут соответственно использоваться в косметоло- гии в качестве омолаживающих кремов. Изменение нуклеотидной последовательности ис- ходного модифицируемого олигонуклеотида также позволяет создавать новые гербициды и пестициды, а также акарициды в связи с возможностью селективно блокировать опреде- ленные гены и синтез белка в быстрорастущих клетках.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. - Химическая реакция комбинаторного ацилирования и формилирования остатка аденозина с образованием суммы формил-сукцинил производных. В результате такой ком- бинаторной модификации образуется: 2 сукцинил аденозина (замещенные как по амино- группе, так и по гидроксильной группе рибозы), 2 формил аденозина (замещённые как по аминогруппе, так и по гидроксильной группе рибозы), 2 сукцинил-формил аденозина, 2 мо- ноформил аденозина (один по аминогруппе, один по спиртовой), 2 моносукцинил адено- зина (один по аминогруппе, один по спиртовой). Таким образом, двойная комбинаторная модификация только одного аденозина в структуре РНК на выходе дает 10 новых произ- водных. Именно такая комбинаторная смесь обладает максимальной активностью и предот- вращает развитие резистентности у раковых опухолей к химиопрепаратам. Отдельно каж- дое производное мало активно и только в виде супрамолекулярной системы обладает мощ- ной биологической активностью.
Фиг. 2. ВЭЖХ исходного олигонуклеотида 3'-UUGGG-5' Фиг. 3. ВЭЖХ полностью сукцинилированного по 8 доступным группам олигонуклеотида 3'-UUGGG-5' (Контроль полного завершения реакции при избытке одного модификатора) Фиг. 4. ВЭЖХ полностью карбоксиметилированного по 8 доступным группам олигонуклеотида 3'-UUGGG-5' (Контроль полного завершения реакции при избытке од- ного модификатора) Фиг. 5. ВЭЖХ после двойной комбинаторной неполной модификации олигонуклеотида 3'- UUGGG-5' путем одновременного сукцинилирования и формилирования
Пример 1. Получение комплементарных производных олигонуклеотидов РНК (МАТР).
Исходную последовательность 3'-UUGGG-5' синтезируют классическим путем с применением полинуклеотидных синтезаторов и амплифицируют с применения полиме- разной цепной реакции в модификации с применением РНК-РНК-полимеразы, что оче- видно специалисту в данной области знания.
Для получения комплементарного олигонуклеотида РНК использовали одновремен- ный комбинаторный синтез с двумя реагентами: янтарным ангидридом и муравьиной кис- лотой.
В 1 мл диоксана растворяют 10 мМ 3'-UUGGG-5', добавляют 20 мМ янтарного ан- гидрида и 20 мМ муравьиной кислоты, раствор перемешивают и греют при 30-100 0 С 1-60 минут. Раствор переливают в ампулы и лиофилизируют для удаления растворителя и непро- реагировавшей муравьиной кислоты. Комбинаторную смесь используют в изучении проти- вораковой активности.
Одна исходная молекула 3'-UUGGG-5', содержит 5 доступных для модификации спиртовых остатков рибозы и три экзоциклических аминогруппы гуанозина - всего 8 до- ступных групп. Неполная комбинаторная модификация только одним модификатором - или янтарным ангидридом или муравьиной кислотой даст на выходе комбинаторную смесь из 255 производных с разной степенью замещения в разных положениях. Введение второго модификатора увеличивает на выходе количество производных одного олигонуклеотида до 380. Вместо последовательности 3'-UUGGG-5' может быть использована последователь- ность 3'-UUCCC-5' либо последовательность 3'-UUAAA-5\ либо любая последователь- ность в качестве исходного олигонуклеотида РНК следующей нуклеотидной последова- тельности: 3'-UUNiN2N3-5'; где NiN2N3 соответствуют хотя бы одной из следующих после- довательностей, включая их смесь: UUC; UUA; UUG; CUU; CUC; CUA; CUG; AUU; AUC;AUA; AUG; GUU; GUC; GUA; GUG; UCU; UCC; UCA; UCG; CCU; CCA; CCG; ACU; ACC; АСА; ACG; GCU; GCC; GCA; GCG; UAU; UAC; UAA; UAG; GAU; CAC; GAA; GAG; AAU; AAC; AAG; GAU; GAC; GAA; GAG; UGU; UGC; UGA; UGG; CGU; CGC; CGA; CGG; AGU; AGC; AGA; AGG; GGU; GGC; GGA. Указанные последовательности представляют собой распознающие триплеты нуклеотидов в составе тРНК для каждой из известных ами- нокислот. Комплементарная блокада такого/таких триплетов в клетке приведет к утрате тРНК способности присоединяться к полирибосоме и соответственно к утрате синтеза белка.
Расчеты количества молей модификатора ведут согласно формул комбинаторики: т=4х (3 х 2n"2- 1); k= n* (2П - 1), где т- количество разных производных молекул в комби- наторной смеси; п- количество доступных для модификации групп (и молей) в структуре олигонуклеотида (например, для 3 -UUGGG-5' п= 3 гуанозиновых аминогруппы и 5 гидрок- сильных групп в структуре рибозы, итого п=8); к- количество молей каждого модификатора модификаторов (например, только для одного модификатора 3'-UUGGG-5' m=764; k=2040, а мольное соотношение равно 1 :2.67). Таким образом, имея только один олигонуклеотид 3 -UUGGG-5' после его модификации мы получаем 764 комбинаторных комплементарных производных с разной степенью афинности и гибридизуемости с исходной молекулой. Да- лее полученную комбинаторную смесь (условное название МАТР) используют для изуче- ния противораковой активности и стимуляции регенерации тканей при местном примене- нии. Производные других олигонуклеотидов из представленного выше списка обладают пестицидной, гербицидной и акарицидной активностями.
Модификаторы - янтарный ангидрид либо муравьиную кислоту можно вводить как одновременно, так и последовательно - либо сперва ввести янтарный ангидрид, прогреть смесь 30-100 0 С 1-60 минут, а затем ввести муравьиную кислоту и также прогреть смесь еще 30-100 0 С 1-60 минут.
На фиг. 2 приведена хроматограмма немодифицированного олигонуклеотида струк- туры 3'-UUGGG-5'. На фиг. 3 и 4 показаны ВЭЖХ - хроматограммы двух производных: полностью сукцинилированного и полностью формилированного нуклеотида. Как видно из графиков, время (объем) удержания производных отличается как от исходного олигонук- леотида, так и между собой. Это свидетельствует о завершении реакции ацилирования и формилирования в структуре олигонуклеотида. Также на хроматограммах отсутствуют пики других производных, что исключает гидролиз олигомера до мономерных фрагментов или открытие пуринового гетероцикла аденина.
Аналогично в этой реакции в качестве одного из модификаторов вместо янтарного ангидрида можно использовать малеиновый ангидрид, аконитовый ангидрид, глутаровый, фталевый ангидрид и уксусный ангидрид.
Аналогично в этой реакции в качестве одного из модификаторов вместо муравьиной кислоты можно использовать этиловый эфир муравьиной кислоты, монохлороуксусную кислоту, пропиолактон, этиленоксид и другие низкомолекуляные алкилирующие вещества (мтилхлорид, этилхлорид, пропилхлорид).
Аналогично были синтезированы производные 3'-UUGGG-5, с другими соотноше- ниями модификаторов (янтарного ангидрида и муравьиной кислоты) и проведен скрининг их биологической активности в отношении трех видов рака: карциномы Льюиса (КЛ), ас- цитного рака Эрлиха (АРЭ) и HeLa-2 (ХЛ) in vitro. В таблице 1 приведены результаты био- логического скрининга производных. Расчеты проводили с применением мортального кра- сителя кумаяси синего, процент гибели клеток определяли спектрофотометрически по окраске мертвых клеток против контролей (живой культуры и полностью погибшей). По- грешность спектрофотометра 3%. Полученные результаты обрабатывали с применением метода хи-квадрат для п=5 (5 лунок в планшете). Статистическая гипотеза об значительном отличии в эффективности структуры с максимальным количеством разных производных (N° 17 или МАТР) от других производных, полученных эмпирически подтвердилась (Р<0,05).
Таблица 1. - Противораковая активность супрамолекулярных комбинаторных производных олигонуклеотида 3'-UUGGG-5, полученных в реакции с разным мольным соотношением модификаторов
N° п/п Мольные соотношения реагентов* % гибели клеток**
m kl k2 КЛ АРЭ ХЛ
1 16320 1 0 0 0
2 764 8160 1 0 0 0
3 -II- 4080 5 0 0 0
4 -II- 2040 15 0 0 0 -II- 1020 31 0 0 0
-II- 510 63 15 20 20
-II- 255 127 20 17 17
-II- 127 255 25 25 20
-II- 63 510 0 0 0
-II- 31 1020 0 0 0
-II- 15 2040 0 0 0
-II- 5 4080 0 0 0
-II- 1 8160 0 0 0
-II- 1 16320 0 0 0
-II- 8160*** 8160*** 15 5 5
-II- 4080 4080 17 19 22(MATP) -II- 2040 2040 99 95 100
.-II- 1020 1020 15 25 27
-II- 510 510 0 0 0
-II- 255 255 0 0 0
-II- 127 127 0 0 0
-II- 63 63 0 0 0
-II- 31 31 0 0 0
-II- 15 15 0 0 0
-II- 5 5 0 0 0
-II- 1 1 0 0 0
-II- 16320 0 0 0 0
-II- 8160 0 30 44 18
-II- 4080 0 22 25 17
-II- 2040 0 20 20 15
-II- 1020 0 0 0 0
-II- 510 0 0 0 0
-II- 255 0 0 0 0
-II- 127 0 0 0 0
-II- 63 0 0 0 0 36 -II- 31 0 0 0 0
37 -II- 15 0 0 0 0
38 -II- 5 0 0 0 0
39 -II- 1 0 0 0 0
40 -II- 0 16320 0 0 0
41 -II- 0 8160 15 25 17
42 -II- 0 4080 30 25 27
43 -II- 0 2040 0 0 0
44 -II- 0 1020 0 0 0
45 -II- 0 510 0 0 0
46 -II- 0 255 0 0 0
47 -II- 0 127 0 0 0
48 -II- 0 63 0 0 0
49 -II- 0 31 0 0 0
50 -II- 0 15 0 0 0
51 -II- 0 5 0 0 0
52 -II- 0 1 0 0 0
* m- количество молей олигонуклеотида 3'-UUGGG-5 в реакции комбинаторного синтеза; к1- количество молей янтарного ангидрида в реакции; к2 - количество молей муравьиной кислоты в реакции;
** % гибели клеток в культуре после 24 инкубации в присутствии исследуемого вещества, добавленного в предварительно подобранной концентрации (ED9o=0,2 мкг/мл);
*** максимальное мольное соотношение, при котором замещаются все группы в олигонук- леотиде, превышение этого соотношения приводит к тому, что в реакционной среде оста- ются непрореагировавшие модификаторы - янтарный ангидрид и муравьиная кислота Как видно из таблицы 1, только у одного производного N° 17 (МАТР) обнаружен противо- раковый эффект на уровне 95-100% цитотоксического эффекта на все три типа культур ра- ковых клеток, тогда как другие мольные соотношения реагентов, в т.ч. моно-модифициро- ванное производное не обладали достаточной цитотоксической активностью в отношении раковых клеток Пример 2. Синтез сукцинилированного аденина (контроль реакции сукцинилирова- ния)
В 1 мл диоксана растворяют 10 мМ аденина, ЮмМ янтарного ангидрида и греют с обратным холодильников 1-60 минут. Затем к колбе присоединяют вакуумный насос и от- гоняют диоксан. Осадок перекристаллизовывают из смеси диоксан: ледяная уксусная кис- лота. т.р= 163-165 0 С. Спектр полностью подтверждает структуру сукциниладенина. Ана- логично вместо янтарного ангидрида можно использовать малеиновый ангидрид, аконито- вый ангидрид, глутаровый, фталевый ангидрид и уксусный ангидрид.
ЯМР HI : m 2,4-2,7 (-СН2-); m 4,2-6,0 (-СНОН-); d 8,35; 8,63 (-СН-); s 10,60 (- H-); s 12,2 (- -COOH); s 13,82 (-COOH)
Элементный анализ (по данным дериватограммы): С, 45.1; Н, 3.9; N, 10.98; О, 40.09
Пример 3. Синтез формилированного аденина (контроль реакции формилирования)
В 1 мл диоксана растворяют 10 мМ аденина, 40 мМ муравьиной кислоты и греют с обратным холодильником на водяной бане 45 минут. Затем к колбе присоединяют вакуум- ный насос и отгоняют диоксан и избыток муравьиной кислоты. Осадок перекристаллизо- вывают из смеси диоксан: муравьиная кислота. m.p= 1 13-115 0 С. (ЯМР 1Н-спектр полно- стью подтверждает структуру формиладенина. Аналогично вместо муравьиной кислоты можно использовать этиловый эфир муравьиной кислоты, монохлороуксусную кислоту, пропиолактон, этиленоксид.
ЯМР HI : d 4,22-4,40 (-СНОН-); s 8.35 (=СН-); s 8,19; 8,63 (=СН-); s 10,51 (-NH-); s 8.59 (-- СОН); s 8,10 (-СОН)
Элементный анализ (по данным дериватограммы): С, 42.70; Н, 3.61 ; N, 22.66; О, 31.07 Пример 4- Противораковая активность МАТР
Определение противораковой активности МАТР в клеточной культуре проводили в культуре клеток HeLa-2. Для этого к среде 199 добавляли разное количество МАТР от 2 до 12 мкг/мл среды, (см.таб 1) Для контроля использовали культуру без МАТР. Наблюдение за культурами клеток вели в течение 5 суток с ежедневным просмотром. Минимальной ак- тивной дозой (МАД) МАТР считали такое его минимальное количество, которое вызывало дегенерацию 90-95% клеток (Таб. 2) Таблица 2. - Сравнительная характеристика чувствительности культуры опухоле- вых клеток HeLa-2 относительно МАТР.
Figure imgf000018_0001
Цитопатическое действие; ++++ дегенерация 100% клеток; 0 отсутствие дегенерации.
При установлении минимальной концентрации МАТР, которая тормозит рост кле- ток проведено сопоставление количества клеток, которые выжили, и концентрацией МАТР в растворе.
Таблиця 3. - Влияние МАТР на клетки HeLa
Figure imgf000018_0002
Как видно из таблицы 3, эффективная доза МАТР находится в пределах между 8-12 мкг/мл раствора.
МАТР приводил к 95 % дегенерации опухолевых клеток. Для подтверждения проти- воопухолевого действия in vivo МАТР был исследован на модели асцитной аденокарци- номы Эрлиха. Пример 5. - Исследование противоопухолевого действия МАТР на асцитной аденокар- циноме Эрлиха
Противоопухолевое действие композиций исследовали на моделях асцитной карци- номы Эрлиха у молодых неимбредных мышей обоего пола массой 1 -17 г (68 штук), кото- рых выдерживали на рационе вивария.
45 мышам инокулировали от мыши с аденокарциномой инсулиновым шприцем 0,1 мл асцитной жидкости в область печени. Через 7 суток у 42 мышей появились признаки опухоли (увеличилась масса тела и размеры живота), 2 мыши погибли на второй день, 1 мышь не выявила признаков опухоли.
Десяти мышам вводили МАТР (см. таб 4) Еще 10 мышам вводили субстанцию
МАТР, еще десяти - 0,9% раствор натрия хлорида.
Таблица 4 - Количественные биологические и статистические характеристики при исследовании противоопухолевой активности МАТР.
Figure imgf000019_0001
Примечание: п=10, р<0,05.
МАТР вводили тем мышам, в которых брали кровь. Мыши с аденокарциномой Эр- лиха после перевивки опухоли и лечения жили 47 суток при использовании МАТР, что в 12 раз дольше, чем в контроле. При достоверности больше 99,5% можно утверждать о зна- чительном усилении противораковой активности МАТР против контроля - таксотера. По- еле анатомирования животных было установлено, что в среднем количество метастаз было на 70% меньше у животных, леченных МАТР и средняя масса метастаз составила 20% он контроля (таксотер).
Пример 6. Противоопухолевая активность МАТР на примере лейкоза Швеца Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно с интервалом в два часа по 0,5 мл. Для инъекций МАТР использовали водный раствор. Суммарные дозы препаратов состав- ляли 34,0, 68,0, 84,0, 102.0 и 136 мг/кг. Количество погибших животных в каждой группе отмечали через каждые 24-48 часов. Расчет токсичной дозы, ЛД50, проводили по методике. Летальную дозу, ЛДюо, определяли экспериментально. В результате проведенных опытов установлено, что для соединения МАТР ЛД5о = 3100 мкг/кг, ЛДюо = 4200 мкг/кг. Из срав- нения приведенных величин следует, что токсичность водного МАТР значительно ниже, чем у соединения контроля таксотера (120 мгк/кг). Согласно, гистологическим исследова- ниям гибель животных, получавших токсические дозы препаратов обусловлена энтероток- сичностью. Имеет место выраженная дисплазия клеток эпителия в кишечнике, нарушение его регенераторной функции, сокращение количества митозов. Незначительные изменения отмечены в почках: небольшой отек стромы, зернистая дистрофия канальцев, мелкоочаго- вые кровоизлияния. Противоопухолевую активность МАТР оценивали из экспериментов, проведенных на пяти группах животных (в каждой группе по 10 животных). Белым беспо- родным крысам весом 150-200 г под кожу бедра трансплантировали 2. 108 - 2 х1010 клеток перевивного штамма лейкоза Швеца. Животные 1 группы служили для контроля, II группа получала таксотер, III— таксотер+ МАТР, IV - МАТР в растворе, V— МАТР в суспензии с ТВИН-80. Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно на 4-6 сутки после транс- плантации опухоли, т.е. в период логарифмической фазы ее роста, второй и третий раз - с интервалами 24 - 48 часов соответственно. Суммарные дозы препаратов составляли 27,3 мг/кг в расчете на чистый препарат.
Противоопухолевую активность оценивали по следующим физиологическим пока- зателям:
- по объему опухоли, v (см 3);
- по степени угнетения роста опухоли (Т/С, %);
- выживаемости животных на 10-е сутки (ВЖ, %);
- продолжительность жизни животных (ПЖЖ, сутки). Расчеты производили по следующим формулам:
4 ΓΠΐ+ηΐ2+ηΐ3
ν=— π R3; R= 3 23
где m 1( m 2, m 3 - три взаимно-перпендикулярных измерения опухолевого узла;
Т/С=
Figure imgf000021_0001
где VKOH И VON - объем опухоли в контрольной и опытной группах соответственно:
А* 100
ВЖ=
N
где А - число животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли,
N - число животных в данной группе.
ПЖЖ определяли по числу суток, прошедших от момента перевивки опухоли до ги- бели последнего животного в данной группе. Данные о биологической активности МАТР. приведенные в таблице 5.
Анализ данных, представленных в таблице 5, показывает, что препарат МАТР в чи- стом виде (суспензии) по сравнению с контролем тормозит рост опухоли на 94%. Его при- менение позволяет получить 100%-ную выживаемость животных. МАТР водного раствора тормозит рост опухоли на 95%, обеспечивает 100%-ную выживаемость животных. В тоже время продолжительность их жизни увеличивается по сравнению контролем на 7-8 суток. Сравнительный анализ данных, приведенных в таблице, позволяет заключить, что заявляе- мое соединение, МАТР в суспензии, более токсично, чем препарат МАТР водный раствор. По уровню противоопухолевой активности и выживаемости он не уступает соединению МАТР в истинном растворе, а по такому показателю, как продолжительность жизни, суще- ственно превосходит его, так как увеличивает продолжительность жизни в два раза.
Таблица 5. Противораковая эффективность МАТР в разных формах— истинном
творе и концентрированной суспензии
Наименование Группа животных
показателя 1 2 3 4 5 (кон- (введена (введена (введена (введен троль) МАТР сус- МАТР рас- смесь таксо- чистый пензия) твор) тера и таксотер)
МАТР)
Введенная доза, 9,1*3=27,3
мг/кг
Токсичная доза, 3100 1500 130 120 LD50, мкг/кг
Летальная доза, 4200 2700 180 180 LDioo, мкг/кг
Объем опухоли, 15,0±0,75 1,00±0,05 0,60±0,03 0,75±0,03 0,73±0,03 см3
Степень тормо- 0 94 95
жения роста
опухоли, Т/С, %
Выживае- 0 100
мость, %
Продолжитель- 14,6±0,5 11,б±1,0 21,0±1,0
ность жизни,
сутки
Таким образом, создание МАТР, привело к получению вещества более эффектив- ного, чем известные противоопухолевые препараты, так как по показателям физиологиче- ской активности, характеризующим его противоопухолевый эффект, предлагаемый препа- рат превосходит или сопоставим с известными веществами и выгодно отличается от них из-за уменьшения токсичности. Выявлен ряд новых свойств у МАТР: высокая степень тор- можения роста опухоли, значительная выживаемость животных и увеличение их продол- жительности жизни при одновременном уменьшении токсичности, что дает сделать вывод о его перспективности для создания препаратов, эффективных в лечении злокачественных опухолей.
Пример 7. Ранозаживляющая активность Определение влияния композиций МАТР (combinatorial derivative of 3'-UUGGG-5') (Д1) и МАТР2 (combinatorial derivative of 3'-UUGAA-5') (Д2) на регенерацию тканей
Изучение ранозаживляющих свойств композиций проводили на самцах белых крыс
Vistar.
У 38 животных, которых анестезировали диэтиловым эфиром в течение 2-4 мин., на дор- сальном боку тела, сзади правой лопатки выстригали область кожи размеров 2 на 2 см. Кожу брали пинцетом, оттягивали ее, срезали фрагмент кожи размером 2 см, глубина раны 2 мм, средняя площадь раны составила 4±1,0 см2. Полученную раны многоугольной формы ин- тенсивно кровоточили. Затем животным первой и второй групп (по 10 в каждой) на рану наносили Д1 и Д2. Раны крыс 3-й группы обрабатывали Декспантенолом (ДП), 4-ю группу из 8 животных составляла контрольная группа, раны этих животных не обрабатывали. Пре- параты наносили таким образом, чтобы образовавшиеся гели покрывали всю поверхность раны и захватывали небольшой фрагмент вокруг раны. Сверху на гель наносили клей БФ- 6, высушивали и животных отпускали в клетки. Через 3, 6, 9, 11 и 13 дней от начала экспе- римента (до заживления ран у животных всех групп) проводилось планиметрическое иссле- дование, которое позволило судить об особенностях репаративных процессов. Измерение площади ран проводилось таким образом: на целлюлоидную пленку, которая прикладыва- лась к ране, наносили ее контуры, после чего с помощью миллиметровой бумаги опреде- ляли площадь раневой поверхности.
Стимуляция роста плюрипотентных гемопоэтических клеток CD34+
Препараты изучали в эксперименте на модели цитостатической гемо-иммунодепрес- сии.
Эксперименты, выполнены на 90 крысах-самцах линии Вистар массой 160-200 г. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. Две опытные и контрольную группы составили по 30 животных в каждой. В обеих группах гемо-иммунодепрессия вы- зывалась пятикратным, с интервалами в 24 ч, внутрибрюшинным введением циклофосфана в дозе 10 мг/кг, рубомицина 2 мм/кг, и преднизолона 2 мг/кг в 3 мл физиологического рас- твора. На следующие сутки после окончания введений гемоиммуннодепрессивных препа- ратов животным опытной группы животным смазывали участок кожи на холке одним из гелей в количестве 0,5 г/животное и наносили клей БФ6. Гель меняли через день. Животным контрольной группы в те же сроки аналогично наносили на кожу плацебо - карбополовый гель без действующих веществ. Действие препарата оценивалось по показателям крови на 1,10,30,60,90 сутки эксперимента. Пролиферативная активность CD34+ стволовых клеток изучена с использованием набора CD34 Count kit [2] для цитофлюориметрии с применением проточного цитофлюориметра FACS Calibur. Цифровой материал обрабатывался методами непараметрической статистики с определением критерия «U» по Вилкоксон - Манн - Уитни.
Результаты первой серии опытов по изучению ранозаживляющих свойств (Табл. 6) показали, что под влиянием композиций Д1 и Д2 значительно ускорилось заживление ран на всех стадиях исследования. Эффективность композиции Д1 была статистически выше, чем у композиции Д2 и ДП.
Таблица 6. Показатели заживления кожных ран у крыс под влиянием композиций Д1 и Д2.
Figure imgf000024_0001
* Р<0,05
Как видно из таблицы 6, фактически в 2 раза быстрее заживали раны у животных, раны которых, были обработаны композицией Д1 (с 13 до 6 суток), тогда как эффективность кон- трольного образца ДП была близка к контрольным значениям. Эпителизация ран иниции- ровалась уже на второй день после нанесения композиции. Интересным является факт от- личия варианта Д1 и Д2, хотя они по составу идентичны.
В таблице 7 приведены результаты изучения влияния композиций на количество плюрипотентных клеток CD34+ в крови крыс. Нормальный уровень клеток CD34 в крови колеблется от 3 до 6 * 10 6 клеток/литр. Таблица 7. Количество плюрипотентных клеток CD34+ в крови у крыс под влиянием композиций Д1 и Д2
Figure imgf000025_0001
* Р<0,05 ** Средний показатель в контрольной группе без иммунодефицита составил 4,2±0,3
Введение цитостатических препаратов приводило к снижению уровня CD34 к мо- менту начала терапии в 3-4 раза, по сравнению с исходным уровнем. При этом животные обеих групп были способны восстанавливать их до нормальных величин. Однако процессы регенерации костного мозга с восстановлением показателей периферической крови проте- кали по-разному. Местное применение на кожу крыс образцов Д1 и Д2 способствовало ускорению этих процессов примерно в 2 раза, о чем свидетельствовало превышение пока- зателей крови животных опытной группы к 30-м суткам более чем в 2 раза, в то время как эти показатели у животных контрольной группы приходили к нормальным значениям только на 60-е сутки. Увеличение количества плюрипотентных клеток, которое коррели- ровало с ускорением регенерации ран свидетельствует о преимущественной стимуляции деления стволовых клеток на периферии, а не об усилении функций костного мозга. Мак- симальный эффект от применения Д1/Д2 наблюдался на 60-е сутки, а восстановление фи- зиологического уровня плюрипотентных клеток наблюдалось уже на 10-е сутки после начала применения геля. В связи с тем, что гель наносили на неповрежденную кожу, можно говорить о высоких резорбтивных свойствах геля и общем его эффекте на весь организм.
Таким образом, действие Д1/Д2 приводит к селективной стимуляции деления плю- рипотентных клеток в ране и стимуляции экскреции факторов роста фибробластов, способ- ствуют 6-и кратному ускорению восстановления иммунитета животных после индуциро- ванного иммунодефицита. Также варианты композиций в форме геля Д1 и Д2 обладают значительной регенерирующей способностью на раны, ускоряя эпителизацию и заживле- ние ран в среднем в два раза. Гели Д1 и Д2 обладают способностью всасываться через кожу и оказывать благоприятный эффект на иммунную систему всего организма через стимуля- цию деления плюрипотентных клеток CD34.
Пример 8. Акарицидная активность
Овицидное испытание на клещике паутинном (Tetranychus urticae) методом погру- жения при использовании комбинаторной смеси МАТР на основе олигонуклеотида 3'- UU UAA -5'.
Четыре взрослых самки клещика паутинного (Tetranychus urticae), являющихся чув- ствительной разновидностью, поместили на каждый диск листа размером 15 мм, взре- занный из молодых листьев. После отложения яиц, продолжающегося 24 ч при 26- 28°С, самок удалили, а яйца, отложенные на дисках, посчитали.
Обработку проводили путем погружения дисков листа в растворы, содержащие соот- ветствующие концентрации активных соединений (с использованием в качестве со- растворителя ДМСО в количестве не более 5% в испытуемом растворе). Погружение продолжалось 5 с. После обработки диски сушили на сухой фильтровальной бумаге, затем сохраняли на мокрой фильтровальной бумаге при 26-28°С в чашке Петри до вы- ведения из необработанных контрольных яиц, затем определили коэффициент выведе- ния. Каждый эксперимент повторили четыре раза с использованием по крайней мере трех аналогичных опытов для каждой концентрации. Значения эффективности, приве- денные для каждой концентрации, показывают среднее значение обработок, проведен- ных по крайней мере на 250 яйцах клеща. Откорректированную смертность вычисляли согласно Abbott. Результаты, выраженные в виде процентного содержания, показаны в табл. 8. Таблица 8. Выживаемость яиц клещика паутинного после обработки разработанной комбинаторной библиотекой МАТР
Образец % выживших яиц
1 2 3 4 5
Опыт,МАТР 11±2 5±1 12±2 8±1 17±3
Контроль 67±8 72±9 60±9 64±10 53±9
Р<0,01 Как видно из таблицы, обработка раствором МАТР образцов приводит к достоверному сни- жению процента выживаемости, что свидетельствует о наличии акарицидного действия комбинаторной библиотеки МАТР на основе олигонуклеотида З'-UU UAA -5' Пример 9. Гербицидная активность
Пример 1. Пластиковые подносы выстилались полиэтиленовой пленкой и заполнялись па- стеризованной песчаносуглинистой почвой Sassafras ( Н 6,5, 1% О.М.). Один поднос засе- вался пшеницей (Triticum acstivum), ячменем (Hordeum vulgare), овсюгом (Avena fatua), ко- стером кровельным (Bromus Secalinus), листохвостом мышехвостниковидным (Alopecurus myosurocdes), мятликом однолетним (Роа annua), щетинником зеленым (Setaria viridis), ита- льянским плевелом (Liolium multiflorum), и семенами рапса (Brassica napus). Второй поднос засевался следующими растениями: Matricaria inodora, подмаренник цепкий (Galium aparine), солянка русская (Salsola kali), пастушья сумка обыкновенная (Capsella bursapastoria), кочия (КосЫа scoparia), паслен черный (Solarium, nigrum), вероника (Veronica persica), горец вьющийся (Polyconum convolvulus) и сахарная свекла (Beta vulgaris). Для по- слевсходовой обработки первый поднос или лоток засевался за 14 дней до опрыскивания, а второй лоток засаживался за 24 дня до обработки. Растения при послевсходовых обработ- ках классифицировались по высоте от 1 до 15 см в зависимости от вида. Пшеница, ячмень и овсюг находились на
стадии развития 2 листа (Стадия II Ladors). Перед Опрыскиванием для проведения предвсходовых обработок идентичным образом подготавливался еще один комплект лот- ков. Гербициды разбавлялись в нефитотоксичном растворителе и применялись по отноше- нию к лоткам с использованием ленточного опрыскивателя. Дополнительно производилась оценка трех других видов: Veronica hederae folia, звездчатки (Stellaria media) и Viola arveusis. Эти растения выращивались в пятидюймовых горшках, содержащих такую же почву, что описана ранее. Растения до обработки выращивались в течение 22 дней. Приме- нение гербицида производилось аналогичным образом, как при скрининге лотков. Растения выращивались в теплице в течение 21 дня, за это время производилась визуальная оценка при сравнении с необработанным контролем. Оценка основывалась на шкале от 0-отсут- ствие эффекта до 100-полная гибель. Результаты приведены в табл.9- 1 1.
Таблица. 9 - Гербицидное действие заявляемого способа МАТР
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Пшеница (озимая) 0 0 0
Горец омощийся 70 50 30
Овсюг 0 0 0
Таблица 10.- Фитотоксическое действие заявленного способа МАТР
Figure imgf000031_0002
Таблица П.- Фитотоксическое действие прототипа
Figure imgf000031_0001
9 г/га (инкубиро- 95 70 85
вание а течение
95 суток)
Как видно из таблиц 9-11, предложенная комбинаторная библиотека МАТР обладает гер- бицидной активностью на широкий спектр сорных растений, а на культурные растения имеет менее выраженное рост-тормозящее действие и может с успехом применяться как гербицидное средство.
Пример 10. Пестицидная активность
Соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную пестицидную актив- ность по отношению к таким вредителям, как полукрылые насекомые, чешуекрылые насе- комые, жесткокрылые насекомые, двукрылые насекомые, перепончатокрылые насекомые, прямокрылые насекомые, равнокрылые насекомые, насекомые, у которых чешуйками по- крыта лишь часть крыла, клещи и паразитирующие на растениях нематоды Среди них можно назвать следующих вредителей Полукрылые насекомые клопы (Heteroptera), такие как бобовый клоп (Riptortus clavatus), южный зеленый клоп-щитник (Nezara vindula), клопы семейства Lygus sp , клоп белокрылый (Bhssus leucopterus) и клоп грушевый (Stepha mtis nashi), толстоголовки (Circuhfer sp), такие как зеленая рисовая толстоголовка (Nephotettix cmcticeps) и толстоголовки вида Enpoasca sp Erythroneura sp circuhgfer sp , дельфациды (Delphacidae), такие как коричневая рисовая дельфацида (Nilaparvata lugens), белокрылая дельфацида (Sogatella furcifera) и малая коричневая дельфацида (Laodelphax stnatellus), пры- гающие растительные блохи (Psylhdae), такие как листоблошки (Psylla sp ), белокрыпки (Aleyrodidae), такие как картофельная белокрылка (Bemisia tabaci) и тепличная белокрылка (Tnaleurodes vaporanorum), тли (Aphdidae), такие как винофадная блошка (Viteus vitifoln), тля персиковая (Myzus persicae), яблочная тля (Aphis ροτϊ), хлопковая тля (Aphis gossypn), Aphis fabae, тля ложно капустная (Rhopalosiphum psedodrassicas), тепличная картофельная тля (Aulacorthuim solan!) и тля злаковая обыкновенная (Schizaphis graminum), червецы муч- нистые или щитовки, такие как червецы семейства Pseudococcus comstocki, красная воско- вая шитовка (Ceroplastes rubens), щитовка калифорнийская (Comstockaspis perniciosa) и во- сточная цитрусовая щитовка (Unaspis yanonensis) Чешуекрылые насекомые листовертки (Tortncidae), такие как листовертка восточная чайная (Hornona magnamma), петняя листо- вертка плодовых деревьев (Adoxphyes orana), листовертки семейства Sparganothis pillenana, листовертка восточная персиковая (Graphohtha molesta), бобовый точильщик (Legumimvora glycimvorella), плодожорка яблонная (Laspeyresia pomonella), листовертки семейства Eucosma sp и виноградная листовертка (Lobesia botrana), слизни, такие как виноградный слизень (Eupocilha ambiquella), мешочницы (Psychidae), такие как мешочницы вида Bambahna sp , моли (Tmeidae), такие как европейская зерновая моль (Nemapogon granellus) и платяная моль (Tinea translucens), моли семейства Lyonetndae, такие как Lyonetia prumfohella, пестрянки, такие как моль яблонная листовая (Phyllonorycter ngoniello), Phyllocmstidae, такие как моль цитрусовая (Phyllocnistis cetrella), ипонометиды, такие как моль капустная (Plutella xyloctella) и ипонометидная моль (Prays citn) стеклянницы (Synanthedon sp), такие как виноградная моль (Paranthene regahs) и стеклянницы семейства Synanthedon sp , моли семейства Gelechndae, такие как розовый коробочный червь хлопчат- ника (Pectinophora gossypiella), картофельный клубневый червь (Phthonmaea operculella) и Stomopteryx sp, Ca osimdae, такие как листовертка персиковая (Carposma mponensis), слиз- невые ложногусеничные листовертки, такие как слизневка восточная (Monema flavescens), пиралидные моли, такие как огневка стеблевая рисовая (Chilo suppressahs), листовертка ри- совая (Cnaphalocrocis medinahs), мотылек кукурузный европейский (ostrmia nubilahs), мо- тылек кукурузный восточный (Ostrmia furnacahs), огневка капустная (Hellula undahs), моль большая восковая (Gallena mellonella), малый мотылек кукурузный (Elasmopalpus hgnosellus) и мотылек луговой (Loxostege sticticahs), белянки, такие как обычные гусеницы капустной белянки (Piens гарае), геометридные моли, такие как полынная пяденица (Ascotis selenana), гусеницы коконопрядов, таких как коконопряды вида Malacosoma neustna, браж- ники, такие как бражник табачный (Manduca sexta), волнянки, такие как волнянка чайная (Euproctis pseudoconspersa) и непарный шелкопряд (Lymantna dispar), медведицы, такие как американская белая бабочка (Hyphantna cunea), совки, такие как совка табачная (Hehothis virescens), совка хлопковая (Hehcoverpa zea), свекловичный ратный червь (Spodoptera exigua), совка хлопковая (Hehcoverpa armigera), совка обычная (Spodoptera htura), капуст- ный ратный червь (Mamestra brassicae), совка ипсилон (Agrotis ipsilon), рисовый ратный червь (Pseudaletia separata) и совка ни (Tnchoplusiani) Жесткокрьшые насекомые хрущи, та- кие как медный хрущ (Anomala cuprea), хрущик японский (Popilhajapomca), соевый хрущик (Anomala rufocuprea) и Eutheola rugiceps, жуки-щелкуны (Conodeus sp ,), такие как личинки щелкуна видов Agnotes sp и Conodeus sp , божьи коровки, такие как двадцативосьмипятни- стая божья коровка (Epilachna vigmticetopunetata), и мексиканская божья коровка (Epilachna vanvestis), чернотелки, такие как красно-коричневый хрущик рисовый (Tnbolum castaneum), длиннорогие жуки, такие как бело-пятнистый длиннорогой жук (Anoplophora malasiaca) и усач черный (Monochamus alternatus), семенные жучки, такие как долгоносик фасоли (Acanthoscehdes obtectus) и лучистый долгоносик фасоли (Callosotruchus chmensis), листо- еды, такие как (Leptmotarsa decemlmeata), блошка длинноусая (Diabrotica sp), листоед рисо- вый (Oulema oryzae), свекловичный листоед мелкий (Chaetocnema concmna), горчичный жук (Phaedon cochleanas), злаковый листоед (Oulema melanopus) и листоеды семейства Dicladispa armigere Apionidae, такие как Apion godmani, долгоносики, такие как долгоносик рисовый (Anthonomus grandis), Rhynchophondae, такие как долгоносик кукурузный (Sitophilus zeamais), короеды, трогиды, точильщик хлебный Двукрылые насекомые долго- ножка рисовая (Tipra апо), галлица рисовая (Tanytarsus oryzae), Orseoha oryzae, Ceratitis cap- itata, моль рисовая (Hydrelha gnseola), дрозофила вишневая (Drosophila suzukn), мушка шведская (Oscmella frit), рисовая стеблевая личинка (Chlorops oryzae), бобовая минирующая мушка (Ophiomyia phascoh), моль бобовая (Linomyza trifoln), муха свекловичная (Pegomya hyoscyami), личинка кукурузная (Hylemia platura), мушка сорго (Athengona soccata), муха настоящая (Musca domestica), Gastrophilus sp , мухи семейства Stomoxys sp , Aedes aegypti, Culex pipiens, Anopheles slensis и Culex tntaemorhynohus Перепончатокрылые насекомые хлебные пилильщики (Cephus sp), эвритомиды (Harmohta sp ,), пилильщик капустный (Athaha sp), шершни (Vespa sp) и муравей Рихтера Прямокрылые насекомые таракан рыжий (Blatella germamca), таракан американский (Penplaneta amencana), медведка (Gryllotapla afncana), саранча перелетная (Locusta migratona migratonodes), и Melanoplus sangumipes Tep- митные насекомые термиты вида Reticuhtermes speratus и Coptotermes formosanus. Пузыре- ногие насекомые желтый чайный трипе (Scirtothnps dorsahs), трипе вида Trips palmi, теп- личный трипе (Hehothnps haemorrhohdahs), цветочный трипе (Frankhmella occidentahs) и мох-натый трипе рисовый (Harlothnps aculeatus) Кпещи кпещик паутинный двупятнистый (Tetranychus urticae), клещик паутинный (Tetranychus kanzawai), клещик красный цитрусо- вый (Panonychus citn), клещ красный европейский (Panonychus ulmi), желтый паутинный клещик (Eotetranychus carpim), техасский цитрусовый клещик (Phyllocoptruta oleivora), кле- щик Polyhagotarsonemus latus), клещики паутинные ложные (Brevipalpus sp) кпещик корне- вой (Rhizoglyphus robim) и кпещик плесневый (Tyrophagus putrescentiae) Нематоды, парази- тирующие на растениях южная корневая нематода (Meloidogyne incognita), корневая нема- тода (Pratylenchus sp), соевая циста (Heterodera glycines), рисовая белая нематода (Aphelenchoides besseyi) и нематода сосновая (Bursaphelenehus xylophilus) Другие вреди- тели и паразиты Gastropoda, такие как улитка яблонная (Pomacea canahculata), слизни (Indiana sp) и ахатина (Achatina fiihca), мокрицы (Isopoda), такие как равноногие и многоно- гие мокрицы, вши (Liposcehs sp), Ctenplepisma sp , Pulex sp , Tnchodectes sp , Cimex sp„ клещи, паразитирующие на животных, такие как Boophilus microplus, Aemaphysahs longicorms и Epidermoptidae Далее, MATP по настоящему изобретению эффективны также против вредителей, которые устойчивы к действию фосфорорганических соединений, кар- баматных соединений, синтетических пиретроидных соединений, производных ацилмоче- вины или обычных инсектицидов. Так, соединения по настоящему изобретению проявляют превосходную пестицидную активность по отношению к широкому кругу вредителей, включая полукрылых насекомых, чешуекрылых насекомых, жесткокрылых насекомых, двукрылых насекомых, перепончатокрылых насекомых, прямокрылых насекомых, равно- крылых насекомых, насекомых, у которых чешуйками покрыта лишь часть крыла, клещей и паразитирующих на растениях нематод, а также способны контролировать вредителей, которые приобрели устойчивость к действию обычных пестицидов. Инсектицидный тест против моли капустной
МАТР на основе олигонуклеотида 3'-UUAGA-5\ разбавляют водой таким образом, чтобы концентрация активного ингредиента составила 500 частей на миллион. Листья капусты погружают в полученный разбавленный раствор, сушат на воздухе и помещают в чашку из поливинилхлорида В чашку выпускают личинки капустной моли и чашку закрывают сверху крышкой затем чашку на 6 дней помещают в термостатируемую камеру с темпера- турой 25°С и подсчитывают количество умерших насекомых, с целью определить процент смертности. Проводят два последовательных эксперимента. Средний процент смертности для данной версии МАТР составил 100%. Инсектицидный тест против рисовой дельфациды MATP на основе олигонуклеотида 3'-UUAGA-5', разбавляют водой таким образом, чтобы концентрация активного ингредиента составила 500 частей на миллион. В полученный раз- бавленный раствор погружают стебли и листья риса, которые затем сушат на воздухе и по- мещают в пробирку В пробирку выпускают 5 личинок коричневой рисовой дельфациды и отверстие пробирки затыкают пористым веществом. Затем пробирку на 6 дней помещают в термостатируемую камеру с температурой 25°С и подсчитывают количество умерших насекомых, с целью определить процент смертности. Проводят два последовательных экс- перимента. Средний процент смертности для данной версии МАТР составил 100%. Инсектицидный тест против долгоносика лучистой фасоли
МАТР на основе олигонуклеотида 3'-UUAGA-5', разбавляют водой таким образом, чтобы концентрация активного ингредиента составила 100 частей на миллион.0,75мл полученного разбавленного раствора наносят в виде капель на фильтровальную бумагу диаметром 6 см, которую помещают в чашку из поливинилхлорида емкостью 60мл. В чашку выпускают пять взрослых самок долгоносика лучистой фасоли и чашку закрывают крышкой. Затем чашку на 4 дня помещают в термостатируемую камеру с температурой 25°С и подсчиты- вают количество умерших насекомых с целью определить процент смертности. Проводят два последовательных эксперимента. Средний процент смертности для данной версии МАТР составил 100%.
Пример 11. Фармацевтические композиции
Могут быть использованы различные способы введения супрамолекулярных комби- наторных производных олигонуклеотидов РНК (МАТР). МАТР композицию можно давать перорально или можно вводить внутрисосудистой, подкожной, внутрибрюшинной инъек- цией, в форме аэрозоля, глазным способом введения, в мочевой пузырь, местно и так далее. Например, способы ингаляционного введения хорошо известны в данной области техники. Доза терапевтической композиции будет варьировать в широких пределах в зависимости от конкретного вводимого МАТР, природы заболевания (назначения), частоты введения, способа введения, клиренса используемого агента из организма хозяина и тому подобного. Начальная доза может быть более высокой с последующими более низкими поддерживаю- щими дозами. Дозу можно вводить с частотой один раз в неделю или один раз в две недели, или делить на меньшие дозы и вводить их один или несколько раз в сутки, два раза в неделю и так далее для поддержания эффективного уровня дозы. Во многих случаях для перораль- ного введения будет необходима более высокая доза, чем для внутривенного введения. Со- единения по данному изобретению могут быть включены во множество композиций для терапевтического введения. Более конкретно, соединения по настоящему изобретению мо- гут быть включены в фармацевтические композиции в сочетании с подходящими фарма- цевтически приемлемыми носителями или разбавителями и могут быть включены в препа- раты в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах, таких как капсулы, по- рошки, гранулы, мази, кремы, пены, растворы, суппозитории, инъекции, формы для инга- ляционного применения, гели, микросферы, лосьоны и аэрозоли. Как таковое, введение со- единений может быть осуществлено различными способами, включая пероральное, трансбуккальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутрикожное, чрезкож- ное, внутритрахеальное введение и так далее. МАТР по изобретению могут распределяться системно после введения или могут быть локализованы с использованием имплантата или другой композиции, удерживающей активную дозу в месте имплантации. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены сами по себе, в комбинации друг с другом, или они могут быть использованы в комбинации с другими известными соединениями (например, классическими противораковыми средствами, противовоспалительными аген- тами, иммуномодуляторами и так далее). В фармацевтических лекарственных формах со- единения могут быть введены в форме их фармацевтически приемлемых солей. Следующие способы и эксципиенты приведены лишь в качестве примеров и никоим образом не явля- ются ограничивающими. Для препаратов для перорального введения соединения могут быть использованы сами по себе или в комбинации с подходящими добавками для изготов- ления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связывающими агентами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатины; с разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия; со смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния; и, если желательно, с разбавителями, бу- ферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами и корригентами. Соединения могут быть включены в композиции для инъекций путем их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или неводном растворителе, таком как растительные или дру- гие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, эфиры высших али- фатических кислот или пропил енглико ля; и, если желательно, с обычными добавками, та- кими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. Соединения могут быть использованы в аэрозольной компо- зиции для ингаляционного введения. Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в приемлемые пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, про- пан, азот и тому подобное. Кроме того, соединения могут быть включены в суппозитории смешиванием с множеством основ, таких как эмульгирующие основы или водораствори- мые основы. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены ректально с ис- пользованием суппозитория. Суппозиторий может содержать наполнители, такие как масло какао, карбоваксы и полиэтиленгликоли, расплавляющиеся при температуре тела, но твер- дые при комнатной температуре. Могут быть изготовлены стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспен- зии, где каждая единица дозы, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суп- позиторий, содержит предопределенное количество композиции, содержащей одно или бо- лее соединений по настоящему изобретению. Сходным образом, стандартные лекарствен- ные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать соединение по настоящему изобретению в композиции в форме раствора в стерильной воде, нормальном физиологическом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе. Имплан- таты для длительного высвобождения композиций хорошо известны в данной области тех- ники. Имплантаты изготавливают в форме микросфер, пластинок и так далее с биодегради- руемыми или не являющимися биодеградируемыми полимерами. Например, полимеры мо- лочной и/или гликолевой кислот образуют деградируемый полимер, хорошо переносимый хозяином. Имплантат, содержащий противораковый МАТР по изобретению, располагают близко к опухоли, так чтобы локальная концентрация активного агента была повышенной по сравнению с остальными областями тела. При использовании здесь термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим для ис- пользования в качестве однократных доз для субъектов людей и животных, при этом каж- дая единица содержит предопределенное количество соединений по настоящему изобрете- нию, которого, согласно вычислениям, достаточно для оказания желаемого эффекта, сов- местно с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Опи- сания стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению зависят от конкрет- ного используемого соединения, и эффекта, который должен быть достигнут, и фармакоди- намики используемого соединения у хозяина. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, общедоступны. Кроме того, общедоступны фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты для регулирования рН и буферные агенты, агенты для регулирования тоничности, стабили- заторы, смачивающие агенты и тому подобное. Типичные дозы для системного введения варьируют от 0,1 пг до 100 миллиграмм на кг массы тела субъекта на одно введение. Ти- пичная доза может представлять собой одну таблетку для приема от двух до шести раз в сутки или одну капсулу или таблетку с длительным высвобождением для приема один раз в сутки с пропорционально более высоким содержанием активного ингредиента. Эффект длительного высвобождения может быть обусловлен материалами, из которых изготовлена капсула, растворяющимися при различных значениях рН, капсулами, обеспечивающими медленное высвобождение под воздействием осмотического давления или любым другим известным способом контролируемого высвобождения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что уровни доз могут варьировать в зависимости от конкретного со- единения, тяжести симптомов и предрасположенности субъекта к побочным эффектам. Не- которые из конкретных соединений обладают большей активностью, чем другие. Предпо- чтительные дозы данного соединения могут быть легко определены специалистами в дан- ной области техники множеством способов. Предпочтительным способом является измере- ние физиологической активности данного соединения. Один из интересующих способов представляет собой применение липосом в качестве наполнителя для доставки. Липосомы сливаются с клетками целевой области и обеспечивают доставку содержимого липосом внутрь клеток. Контакт липосом с клетками поддерживают в течение времени, достаточ- ного для слияния, с использованием различных способов поддержания контакта, таких как выделение, связывающие агенты и тому подобное. В одном аспекте изобретения липосомы разработаны для получения аэрозоля для легочного введения. Липосомы могут быть изго- товлены с очищенными белками или пептидами, опосредующими слияние мембран, такими как вирус Сендай или вирус гриппа и так далее. Липиды могут представлять собой любую полезную комбинацию известных липидов, образующих липосомы, включая катионные или цвиттерионные липиды, такие как фосфатидилхолин. Остальные липиды будут обычно нейтральными или кислыми липидами, такими как холестерин, фосфатидилсерин, фосфа- тидилглицерин и тому подобное. Для получения липосом может быть использован способ, описанный Kato et al.(1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Кратко, липиды и композицию для включения в липосомы, содержащую МАТР, смешивают в подходящей водной среде, под- ходящим образом в солевой среде, где общее содержание твердых веществ будет нахо- диться в диапазоне приблизительно 110 масс.%. После интенсивного перемешивания в те- чение коротких периодов времени, приблизительно 5-60 сек, пробирку помещают в теплую водяную баню при приблизительно 25-40° С и этот цикл повторяют приблизительно 5-10 раз. Затем композицию обрабатывают ультразвуком на протяжении подходящего периода времени, обычно приблизительно 1-10 сек, и, возможно, дополнительно перемешивают на вихревой мешалке. Затем объем увеличивают добавлением водной среды, обычно увеличи- вая объем в приблизительно 1-2 раза, с последующим взбалтыванием и охлаждением. Спо- соб позволяет включать в липосомы супрамолекулярные структуры с высокой суммарной молекулярной массой.
Композиции с другими активными агентами
Для применения в рассматриваемых способах МАТР по изобретению могут быть включены в композиции с другими фармацевтически активными агентами, в частности дру- гими противораковыми, иммуномодулирующими, ранозаживляющими, противовирус- ными агентами. Другие интересующие агенты включают широкий спектр немодифициро- ванных препаратов, известных в данной области техники, в том числе антибиотики. Классы антибиотиков включают пенициллины, например, пенициллин G, пенициллин V, метицил- лин, оксациллин, карбенициллин, нафциллин, ампициллин и так далее; пенициллины в ком- бинации с ингибиторами беталактамазы; цефалоспорины, например, цефаклор, цефазолин, цефуроксим, моксалактам и так далее; карбапенемы; монобактамы; аминогликозиды; тет- рациклины; макролиды; линкомицины; полимиксины; сульфонамиды; хинолоны; хлорам- феникол; метронидазол; спектиномицин; триметоприм; ванкомицин; и так далее. Также по- лезны противогрибковые агенты, включая полиены, например, амфотерицин В, нистатин, флукозин; и азолы, например, миконазол, кетоконазол, итраконазол и флуконазол. Проти- вотуберкулезные лекарственные средства включают изониазид, этамбутол, стрептомицин и рифампин. Другие интересующие агенты включают широкий спектр антивирусных про- изводных мононуклеотидов и других средств-ингибиторов РНК-полимераз, известных в данной области техники. Классы антивирусных средств включают интерфероны, ла- мивудин, рибавирин и так далее; амантадин; ремантадин, например, зинамивир, озельтави- мир и так далее; ацикловир, валацикловир, валганцикловир; и так далее. Другие группы антивирусных средств включают адефовир, вбакавир, диданозин, эмтрицитабин, ла- мивудин, ставудин, тенофовир, эфавиренз, невирапин, индинавир, лопинавир и ритонавир, нельфинавир, ритонавир, сакинавир, даклатасвир, совофбувир. В композицию МАТР по изобретению могут также быть включены цитокины, например, интерферон гамма, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 12 и так далее. Далее настоящее изобретение описано следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие объем изоб- ретения.
Промышленная применимость
Изобретение относится к органической химии и может быть использовано в косметоло- гии, фармации и химической промышленности для создания новых более эффективных косметических, фармацевтических композиций, пестицидов, акаридцидов и гербицидов на основе комплементарных комбинаторных защищенных олигонуклеотидов РНК. Получен- ные таким образом средства являются полностью экологически безопасными, биодегради- руемыми и полностью метаболизируемыми как в организме, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство по- добных средств осуществимо на имеющемся оборудовании химических, фармацевтиче- ских и косметологических предприятий и не требует уникального оборудования. Сырье- вая база доступна и не требует дополнительных усилий для выращивания или производ- ства.
Список литературы
[1] Патент США N° 7579451 Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleo- base
[2] Евразийский патент EA 025625 Модифицированные антикомплементарные олигонук- леотиды с противораковыми свойствами и способ их получения
[3] Sutherland D. R., Keeney М. Enumeration of CD34+ cells by Flow Cytometry //Cellular Therapy: Principles, Methods and Regulations. An American Association of Blood Bankers Cell Therapy Technical Manual. - The American Association of Blood Bankers (AABB), Bethesda MD, 2009. - C. 538-554.

Claims

Формула изобретения
1. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК, отличающиеся тем, что для их по- лучения проводят ковалентную химическую модификацию исходных олигонуклеотидов РНК путем одновременного комбинаторного карбоксилирования и формилирования вхо- дящих в их состав экзоциклических аминогрупп аденина, гуанина, цитозина и спиртового остатка рибозы в рассчитанном мольном соотношении в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных, а в результате синтеза об- разуется комбинаторная смесь производных каждого олигонуклеотида, которую в дальней- шем используют целиком без разделения на фрагменты для создания биологически актив- ных композиций .
2. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что реагенты в комбинаторном синтезе берут в мольном соотношении компонентов, рассчи- танных согласно формулы:
(1) k= n x (2n - l)
(2) m= 4 χ (3χ2η·2 - 1)
где
п=количество доступных для замещения групп в олигонуклеотиде;
т=количество молей исходного олигонуклеотида для введения в реакцию синтеза и количество разных молекул его комбинаторных производных после синтеза;
к=количество молей каждого из двух модификаторов - карбоксилирующего и формилиру- ющего.
3. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что карбоксилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят путем ацилирования ангидридом дикарбоновой кислоты.
4. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., п.1., отличающиеся тем, что карбоксилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят путем ацилирования ангидридом трикарбоновой кислоты.
5. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что карбоксилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят путем алкилирования монохлоруксусной кислотой.
6. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что формилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят после предварительного частичного их карбоксилирования.
7. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что формилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят перед их частичным карбоксилированием.
8. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что формилирование и карбоксилирование экзоциклических аминогрупп нуклеозидов A, G, С и спиртового остатка рибозы проводят одновременно комбинаторным синтезом.
9. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.1., отличающиеся тем, что в качестве фрагментов РНК используют РНК - олигонуклеотиды следующей нуклеотидной последовательности: 3'-UUNiN2N3-5'; где N1N2N3 соответствуют хотя бы одной из следую- щих последовательностей, включая их смесь: UUC; UUA; UUG; CUU; CUC; CUA; CUG; AUU; AUC;AUA; AUG; GUU; GUC; GUA; GUG; UCU; UCC; UCA; UCG; CCU; CCC; CCA; CCG; ACU; ACC; АСА; ACG; GCU; GCC; GCA; GCG; UAU; UAC; UAA; UAG; GAU; CAC; GAA; GAG; AAU; AAC; AAA; AAG; GAU; GAC; GAA; GAG; UGU; UGC; UGA; UGG; CGU; CGC; CGA; CGG; AGU; AGC; AGA; AGG; GGU; GGC; GGA; GGG
10. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.п.1-9., отличающиеся тем, что полученные комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК используют в биоло- гически активных фармацевтических композициях с противораковой активностью.
11. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.п.1-9., отличающиеся тем, что полученные комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК используют в биоло- гически активных косметических композициях с регенерирующей и омолаживающей ак- тивностью.
12. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.п.1-9., отличающиеся тем, что полученные комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК используют в биоло- гически активных композициях с акарицидной активностью.
13. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.п.1-9., отличающиеся тем, что полученные комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК используют в биоло- гически активных композициях с гербицидной активностью.
14. Комбинаторные производные олигонуклеотиов РНК по п.п.1-9., отличающиеся тем, что полученные комбинаторные производные олигонуклеотидов РНК используют в биоло- гически активных композициях с пестицидной активностью.
PCT/RU2017/000423 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк WO2018231090A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA202090752A EA202090752A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк
US16/771,364 US11053608B2 (en) 2017-06-16 2017-06-16 Combinatorial derivatives of RNA oligonucleotides
PCT/RU2017/000423 WO2018231090A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000423 WO2018231090A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018231090A1 true WO2018231090A1 (ru) 2018-12-20

Family

ID=64660253

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000423 WO2018231090A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11053608B2 (ru)
EA (1) EA202090752A1 (ru)
WO (1) WO2018231090A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614617A (en) * 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US6867290B2 (en) * 1999-04-30 2005-03-15 Cyclops Genome Sciences, Ltd. Modified polynucleotides and uses thereof
US20120130060A1 (en) * 2010-11-22 2012-05-24 Artur Martynov Modified antisense oligopeptides with anticancer properties and method of obtaining them
US20140309276A1 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 Artur Martynov Pharmaceutical Composition Comprising a Mixture of Carboxylated Oligonucleotides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614617A (en) * 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US6867290B2 (en) * 1999-04-30 2005-03-15 Cyclops Genome Sciences, Ltd. Modified polynucleotides and uses thereof
US20120130060A1 (en) * 2010-11-22 2012-05-24 Artur Martynov Modified antisense oligopeptides with anticancer properties and method of obtaining them
US20140309276A1 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 Artur Martynov Pharmaceutical Composition Comprising a Mixture of Carboxylated Oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
EA202090752A1 (ru) 2020-06-15
US11053608B2 (en) 2021-07-06
US20210071317A1 (en) 2021-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Devi et al. Microbial efficacy and two step synthesis of uridine derivatives with spectral characterization
FR2567892A1 (fr) Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
Feder-Kubis et al. Ionic liquids with natural origin component: a path to new plant protection products
CN105884634A (zh) 棉酚衍生物和它们的制备,在农药上的应用及抗癌活性
Song et al. Dehydrozingerone inspired discovery of potential broad-spectrum fungicidal agents as ergosterol biosynthesis inhibitors
Garcia-Mendez et al. Phytotoxic potential of secondary metabolites and semisynthetic compounds from endophytic fungus Xylaria feejeensis strain SM3e-1b isolated from Sapium macrocarpum
Pernak et al. Conversion of Quinine derivatives into biologically active ionic liquids: Advantages, multifunctionality, and perspectives
Yan et al. Target-directed design, synthesis, antiviral activity, and SARs of 9-substituted phenanthroindolizidine alkaloid derivatives
CN109824742B (zh) 一类海藻糖酶抑制剂及其制备方法
US6281201B1 (en) Base-modified derivatives of 2′,5′-oligoadenylate and antiviral uses thereof
US11053608B2 (en) Combinatorial derivatives of RNA oligonucleotides
EA041558B1 (ru) Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк
Sekhar et al. Amino acid esters substituted phosphorylated emtricitabine and didanosine derivatives as antiviral and anticancer agents
CN115462383B (zh) Almazole D生物碱及其衍生物在抗植物病毒和病原菌中的应用
EP0713877A1 (en) Qinghaosu derivatives against aids
Liu et al. Novel galactosyl moiety-conjugated furylchalcones synthesized facilely display significant regulatory effect on plant growth
JP2015524436A5 (ru)
Liu et al. Pyrido [1, 2-a] pyrimidinone mesoionic compounds containing vanillin moiety: design, synthesis, antibacterial activity, and mechanism
RU2188203C2 (ru) 2&#39;,3&#39;-дидегидро-2&#39;,3&#39;-дидезокситимидин-5&#39;[(этоксикарбонил)(этил)фосфонат]- ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека
CN110156685B (zh) 芳香的环戊烯并吡啶及其合成方法和应用
CN110759864B (zh) 一类京尼平内酰胺衍生物及其制备和应用
CN107033134B (zh) 含吡啶盐和1,3,4-噁二唑基的双酰胺类化合物及其制备方法及应用
CN100569764C (zh) 一种取代苯甲酰胺基甲酸甲酯类化合物及其制备方法与应用
Tkachuk 2'-5'-Oligoadenylates as a tool of innate immunity
EP0937037B1 (en) Sodium salt of [poly-(2,5-dihydroxyphenylene)]-4-thiosulphuric acid of linear structure as regulator of cell metabolism and production method thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17913295

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17913295

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1