WO2018214087A1

WO2018214087A1 - 抗生物、胞外基质黏附涂层及其制备方法及应用

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Publication number: WO2018214087A1
Application number: PCT/CN2017/085826
Authority: WO
Inventors: 赵鹏; 李丘沐; 贺昊彦; 刘静; 文学军
Original assignee: 苏州睿研纳米医学科技有限公司
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2018-11-29

Abstract

一种抗生物、胞外基质黏附的涂层，该涂层为蛋白质塑化层，该蛋白质塑化层中包括清蛋白以及亲水性辅料。该涂层的制备方法包括以下步骤：将清蛋白、亲水性辅料以及水配制成胶液；将该胶液涂覆在基材表面形成膜层；将该膜层进行塑化处理，得到抗生物、胞外基质黏附的涂层。该涂层应用于医用导管、骨钉、心血管支架、手术器械、生物培养制品、玻璃、石英或陶瓷器具。

Description

抗生物、胞外基质黏附涂层及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医疗器械领域，特别是涉及一种抗生物、胞外基质黏附涂层及其制备方法及应用。

背景技术

细菌、细胞等生物体、以及胞外基质在材料表面的有害黏附一直是生物、医学、防污染、水过滤等领域的一个难题。上述有害黏附，通过在材料表面的繁殖、扩散、堆积，进而可能产生细菌感染、血管栓塞、表面污染、有毒分解物等，影响人类健康并降低材料使用效果。

目前，抗生物、胞外基质黏附材料研究取得了一定进展，其中以微纳仿生结构材料、肝素、类聚乙烯氧结构材料(PEG/PEO)、以及甜菜碱型两性离子复合材料这四类材料的抗生物、胞外基质黏附性能最为突出，受到的研究关注也最多。但这些材料都有较明显的缺陷，如合成工艺复杂、提取代价昂贵、稳定性差、抗黏附机理不明确，这也使它们的应用受到一定的限制。

因此，急需一种新型的抗生物、胞外基质黏附涂层。

发明内容

基于此，有必要提供一种新型的抗生物、胞外基质黏附涂层。

一种抗生物、胞外基质黏附涂层，其为蛋白质塑化层，所述蛋白质塑化层中包括清蛋白、以及亲水性辅料。

上述抗生物、胞外基质黏附涂层，由于其主体材料为清蛋白，生物相容性好，进而在临床上可安全使用；清蛋白原料易得、且物美价廉。上述抗生物、胞外基质黏附涂层，适用范围广，可以适用于高分子材料基体、无机材料基体、金属材料基体上；并且该涂层与基材结合牢固，无降解和扩散，体内稳定性好。上述抗生物、胞外基质黏附涂层，其亲水性高、浸润快，从而方便医疗操作及日常使用。

更重要的是，上述抗生物、胞外基质黏附涂层，可阻抗大多数细菌(例如大肠杆菌、金葡球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、粪链球菌等)、细胞(例如成纤维细胞、血小板等)、以及胞外基质(例如多糖、血浆纤维蛋白原、血清白蛋白等)在其表面的黏附和沉积，集抗菌、抗细胞黏附、抗血小板黏附多项功能于一身，具有广谱抗生物、胞外基质黏附的效果。

在其中一个实施例中，所述清蛋白选自血清白蛋白、乳清蛋白、麦清蛋白、卵清白蛋白、和大豆清蛋白中的一种或几种。

在其中一个实施例中，所述亲水性辅料选自极性亲水蛋白质、氨基酸、多糖及其衍生物中的一种或几种。

在其中一个实施例中，所述亲水性辅料选自白明胶、丝胶蛋白、丝氨酸、天冬氨酸、透明质酸钠、羧甲基纤维素钠、和阿拉伯胶中的一种或几种。

在其中一个实施例中，所述蛋白塑化层中还包括纤维状蛋白。

在其中一个实施例中，以所述清蛋白的质量为基准，所述亲水性辅料的质量分数为0.5wt％～10wt％。

在其中一个实施例中，所述蛋白质塑化层中的蛋白质的等电点在3.5～5.5之间。

本发明还提供了一种抗生物、胞外基质黏附涂层的制备方法。

一种抗生物、胞外基质黏附涂层的制备方法，包括如下步骤：

将清蛋白、亲水性辅料、以及水配制成胶液；

将所述胶液涂覆在基材表面形成膜层；

将所述膜层进行塑化处理，得到抗生物、胞外基质黏附涂层。

上述抗生物、胞外基质黏附涂层的制备方法，环保、简单、方便易行。

本发明还提供了一种抗生物、胞外基质黏附的器械。

一种抗生物、胞外基质黏附的器械，包括本发明所提供的抗生物、胞外基质黏附涂层。

上述抗生物、胞外基质黏附的器械，由于其具有本发明所提供的抗生物、胞外基质黏附涂层，故而生物相容性好，进而在临床上可安全使用。并且抗生物、胞外基质黏附涂层与基材结合牢固，无降解和扩散，体内稳定性好。另外，其亲水性高、浸润快，从而方便医疗操作及日常使用。更重要的是，集抗菌、抗细胞黏附、抗血小板黏附多项功能于一身。

在其中一个实施例中，所述抗生物、胞外基质黏附的器械为医用导管、骨钉、心血管支架、手术器械、生物培养制品、玻璃、石英、或陶瓷器具。

附图说明

图1为导尿管上所黏附细菌菌落的平板计数对比图——大肠杆菌(上排为导尿管A1，下排为导尿管AC1)。

图2为导尿管上所黏附细菌菌落的平板计数对比图——绿脓杆菌(上排为导尿管A1，下排为导尿管AC1)。

图3为导尿管上所黏附细菌菌落的平板计数对比图——粪链球菌(上排为导尿管A1，下排为导尿管AC1)。

图4为大肠杆菌菌落结晶紫染色效果对比图(左侧为载玻片A3，右侧为载玻片AC3)。

图5为金黄色葡萄球菌菌落结晶紫染色效果对比图(左侧为载玻片A3，右侧为载玻片AC3)。

图6为人血浆纤维蛋白原(HFg)的黏附荧光对比图(左侧为载玻片A3，右侧为载玻片AC3)。

图7为人血浆纤维蛋白原(HFg)和人血清白蛋白(HSA)的荧光强度对比图。

图8为人血清白蛋白(HSA)的黏附荧光对比图(左侧为载玻片A3，右侧为载玻片AC3)。

图9为兔血小板的黏附效果对比图(左侧为载玻片A3，右侧为载玻片AC3)。

图10为兔富血小板血浆在光学显微镜下的形态图。

图11为L929细胞的黏附的OD值对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

一种抗生物、胞外基质黏附涂层，其为蛋白质塑化层，蛋白质塑化层包括清蛋白、以及亲水性辅料。

其中，清蛋白为抗生物、胞外基质黏附涂层的主体材料。清蛋白，又称白蛋白，英文名称albumin，简写为Alb。清蛋白广泛存在于天然动植物或微生物中，一般通过化学或物理手段从天然动植物或微生物中体内提取或再生而获得。

清蛋白是一种水溶的、负电性的、球状蛋白质，其易成胶，且和大多数水溶性生物大分子材料都有较好的相容性。更重要的是，清蛋白有特殊的电荷和基团结构，以及优先吸附的特点，对大多数细菌、细胞、蛋白质、核酸的非特异性吸附或黏附有一定的阻抗作用。

优选地，本发明的清蛋白选自血清白蛋白、乳清蛋白、麦清蛋白、卵清白蛋白、大豆清蛋白中的一种或几种。

当然，可以理解的是，本发明的清蛋白并不局限于上述清蛋白，还可以是其他清蛋白；例如清蛋白还可以是通过生物或化学手段改性的大豆清蛋白或乳清蛋白、亦或是人工合成的清蛋白。

在一优选实施方式中，蛋白质塑化层中还包括起增强作用的纤维状蛋白。在清蛋白主体中，加入纤维状蛋白，可以克服清蛋白不易成膜，成膜困难的问题，可以很好的提高整体蛋白质的成膜性能，及成膜后的力学强度。

优选地，纤维状蛋白选自丝素蛋白、胶原蛋白、和溶菌酶中的一种或几种。

优选地，以清蛋白的质量为基准，纤维状蛋白的质量分数为5wt％～30wt％。

当然，可以理解的是，本发明的纤维状蛋白并不局限于上述蛋白，还可以是其他纤维状蛋白；例如肌凝蛋白、角蛋白等。

优选地，蛋白质塑化层中蛋白质整体仍然具有强负电性。

更优选地，蛋白质塑化层中蛋白质的等电点在3.5～5.5之间，更优选地在3.5～4.8之间。这样可以进一步提高抗生物、胞外基质黏附涂层的抗黏附性能。

其中，亲水性辅料的主要作用是，提高抗生物、胞外基质黏附涂层的表面亲水性能。本发明的发明人发现蛋白质在塑化处理后，会导致蛋白质分子上的一部分侧链亲水基团向内部翻转，从而使蛋白质的亲水性降低，进而降低了抗黏附性能；加入亲水性辅料后，可以抵消蛋白质塑化处理后所造成的亲水性下降的变化，从而有效提高了整个抗生物、胞外基质黏附涂层的抗黏附性能。

优选地，亲水性辅料选自极性亲水蛋白质、氨基酸、多糖及其衍生物中的一种或几种。

更优选地，亲水性辅料选自白明胶、丝胶蛋白、丝氨酸、天冬氨酸、透明质酸钠、羧甲基纤维素钠、和阿拉伯胶中的一种或几种。

优选地，以清蛋白的质量为基准，亲水性辅料的质量分数为0.5wt％～10wt％。

更优选地，若亲水性辅料选自白明胶、丝胶蛋白、丝氨酸、天冬氨酸中的一种或几种时，则亲水性辅料的添加量为清蛋白的3wt％～10wt％。若亲水性辅料选自透明质酸钠或/和羧甲基纤维素钠时，则亲水性辅料的添加量为清蛋白的0.5wt％～1.5wt％。若亲水性辅料选自阿拉伯胶时，则阿拉伯胶的添加量为清蛋白的2wt％～5wt％。

优选地，抗生物黏附涂层的厚度为10nm～500nm。这样对基体的柔韧性几乎没有影响。

优选地，抗生物黏附涂层的均方根粗糙度不大于100nm。这样抗生物黏附涂层的表面更加光滑，能在水环境中表现出非常好的润滑性，方便医生手术操作，患者使用感舒适。

上述抗生物、胞外基质黏附涂层，由于其主体材料为清蛋白，为天然蛋白质，生物相容性好，进而在临床上可安全使用；天然蛋白质原料易得、且物美价廉。上述抗生物、胞外基质黏附涂层，适用范围广，可以适用于高分子材料基体、无机材料基体、金属材料基体上；并且该涂层与基材结合牢固，无降解和扩散，体内稳定性好。上述抗生物、胞外基质黏附涂层，其亲水性高、浸润快，从而方便医疗操作及日常使用。

上述抗生物、胞外基质黏附涂层，可以应用于医用和民用抗菌。

上述抗生物、胞外基质黏附涂层，具有阻抗大多数细菌在涂层表面黏附、定殖的作用，能防止细菌菌落的形成，但并不杀灭细菌。本发明的抗生物、胞外基质黏附涂层可以有效防止革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌及其形成的菌落在材料表面的黏附，抗黏附率可达80％以上。

本发明的发明人认为本发明的抗生物、胞外基质黏附的机理如下：

根据Van Oss、Fowkes等科学家关于表面能的“利夫施茨-范德华-路易斯酸碱”学说(Lifshitz-Van der Waals-Lewis acid-base theory)，材料与细菌、细胞、胞外基质等之间的黏附作用取决于材料表面能当中的路易斯碱性分量(γ_S^-)和路易斯酸性分量(γ_S^+)的相对大小，γ_S^-越大，材料越倾向于电子供体，越不容易和负电性的细菌、细胞、蛋白质等产生黏附。本发明的抗生物、胞外基质黏附涂层是由强负电性蛋白质为主要原材料制备的，从材料属性上来说是路易斯碱，即电子供体，所以对生物黏附具有较强的阻抗作用。

从细菌、细胞、胞外基质的角度来讲，材料的抗生物、胞外基质黏附能力取决于细菌、细胞、胞外基质对材料的黏附自由能(ΔG_adh)，ΔG_adh值越大，黏附越难发生。而一般的304不锈钢、医用硅橡胶、玻璃等材料来说，其ΔG_adh值都是负值，细菌、细胞、胞外基质容易在这些材料表面自发黏附；而本发明的抗生物、胞外基质黏附涂层，其ΔG_adh为正值，故而与其他材料相比，细菌、细胞、胞外基质自发黏附相对困难；从而具有更突出、更广谱的抗细菌、细胞、胞外基质黏附性能。

人及动物体内的蛋白质和细胞，大多数都是呈现负电性的，而本发明所述的抗生物、胞外基质黏附涂层具有强负电特性及强亲水作用，因此也具有阻抗细胞及其所分泌胞外基质在其表面黏附、吸附的作用。

S1、将清蛋白、亲水性辅料、以及水配制成胶液；

S2、将所述胶液涂覆在基材表面形成膜层；

S3、将所述膜层进行塑化处理，得到抗生物、胞外基质黏附涂层。

在步骤S1中，水的主要作用是，将蛋白质材料与亲水性辅料分散均匀，形成水性分散体系。优选地，水可以选自纯化水、去离子水、蒸馏水、双蒸水。当然，可理解的是，亦可以在水中添加物质形成水系缓冲液，如PBS、MES-Tris等，用水系缓冲液分散蛋白质材料与亲水性辅料。

优选地，首先将清蛋白、纤维状蛋白(可选择地)、与水配制成初始胶液，然后再向初级胶液中加入亲水性辅料配置成二级胶液。

更进一步，步骤S1还包括：对二级胶液进行过滤、离心，除泡后，得到澄清的二级胶液。

在步骤S1中，在配制胶液时，在加入亲水性辅料时，还可以添加其他辅料，其他辅料包括但不限于交联剂、增稠剂、分散剂中的一种或几种。交联剂可以大幅提高涂层的塑化性能，使抗生物、胞外基质黏附涂层更稳定、牢固。若使用交联剂，一般在混合均匀后在常温下静置5min～30min。

更优选地，交联剂选自乙二醛、戊二醛、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平、原花青素中的一种或几种。交联剂的添加量是蛋白质材料总质量的0.1％～2％。增稠剂选自黄原胶或海藻酸钠的一种或几种。增稠剂的添加量优选为初始胶液总重量的0.5％～1.5％。分散剂选自三聚磷酸钠、聚乙二醇400、或吐温60中的一种或几种。分散剂的添加量优选为初始胶液总重量的0.5％～1.5％。

在步骤S2中，优选地，基材在涂覆之前，可以经过预处理，例如超声清洗、酸洗、碱洗、亦或其他他有机/无机溶剂洗涤、等离子体处理、层层自组装、光接枝改性、超分子化学表面吸附改性等方式。

胶液涂覆方法可以是浸渍法、涂刷法、旋转喷涂法或超声喷涂法。胶液涂覆可以是单次涂布，亦可以是多次涂布。

在步骤S3中，塑化处理是指将材料由溶体或熔体变成稳定的固态，在此过程中，材料分子链构型和链间距发生重大转变，并可能产生物理或化学交联。

优选地，塑化处理可以采用自然固化、热固化、微波固化、紫外光固化或化学交联塑化、放射辐照等。

在步骤S3中，更优选地，采用热固、光波或放射辐照、化学交联方式的塑化处理。

在本实施方式中，塑化处理方式为热固。优选地，塑化处理条件为：温度为60℃～180℃、压力为0.1MPa～1.5MPa、时间为10min～45min。更优选地，塑化处理条件为：温度为80℃～150℃、压力为1MPa～1.3MPa、时间为20min。

优选地，在塑化处理过程中还可以使用增塑剂，增塑剂选自甘油、山梨醇、尿素、或柠檬酸三乙酯中的一种或几种。

本发明还提供了一种抗生物、胞外基质黏附的器械。

也就是说，抗生物、胞外基质黏附的器械包括器械本体，以及至少部分涂覆于器械本体表面上的抗生物、胞外基质黏附涂层。

优选地，抗生物、胞外基质黏附的器械为医用导管、骨钉、心血管支架、手术器械、生物培养制品、玻璃、石英、或陶瓷器具。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

将无涂层的硅橡胶材质的导尿管，在纯化水中超声清洗30min并干燥，再经紫外光照射15min进行灭菌。

将灭菌后的导尿管，放入真空等离子体处理设备中进行表面活化处理。等离子体处理使用的气氛是NH₃-O₂-Ar三元混合气体，真空度为50Pa，放电功率为30W，处理时长为10min。

将乳清蛋白、大豆清蛋白、丝素蛋白、丝胶蛋白按7:10:1.5:1.5的质量比混合，加入纯化水，得到总质量分数为7wt％的初始胶液。然后根据初始胶液的体积以50:1(v/v)的比例，加入分散剂(5mg/ml的PEG-400水溶液)，混合均匀形成二级胶液。然后将二级胶液再经离心、过滤等步骤，去除气泡和悬浮颗粒，得到澄清的二级胶液。

将澄清的二级胶液，使用超声喷涂的方式对表面活化处理后的导尿管整个外表面进行单次、单层的精密涂覆，形成膜层。

将膜层进行塑化处理，其中塑化处理的条件为：温度为70℃、压力为1.5MPa、时长为20min。

得到的导尿管，记作A1。

实施例2

将无涂层的镍钛合金的圆柱形骨钉，截成2cm左右的骨钉段，依次在丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗30min，然后用N₂气吹干并用75vol％的酒精消毒。

将消毒后的骨钉段，放入真空等离子体处理设备中进行表面活化处理。等离子体处理使用的气氛是丙烯酸-O₂二元混合气体，真空度为30Pa，放电功率为50W，处理时长为15min。

将表面活化处理后的骨钉段，浸入0.5mg/ml的聚乙烯亚胺水溶液(支化PEI，MW＝10000)，浸涂保持5min，从而使骨钉段的表面吸附富集正电的PEI涂层。

将大豆清蛋白、胶原蛋白、羧甲基纤维素钠按16:3:1的质量比混合，加入纯化水，并置于37℃的恒温水浴中搅拌直至完全溶解，得到总质量分数为10wt％的初始胶液。然后根据初始胶液的体积以50:1(v/v)的比例，加入分散剂(5mg/ml的PEG-400水溶液)，混合均匀形成二级胶液。然后将二级胶液再经离心、过滤等步骤，去除气泡和悬浮颗粒，得到澄清的二级胶液。

按质量比50:1的比例向澄清的二级胶液中加入5wt％的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(质量比1:1)的交联剂，进行预交联，得到涂覆液。

用层层自组装的模式进行蛋白胶液的多层涂覆。将正电荷化后的骨钉段取出，后用去离子水冲洗3遍，然后再投入涂覆液浸涂10min；之后取出用去离子水轻轻冲洗3遍，再浸入0.5mg/ml的聚乙烯亚胺水溶液(支化PEI，MW＝10000)，浸涂保持5min，然后取出用去离子水冲洗3遍，再投入涂覆液浸涂10min，取出后用去离子水轻轻冲洗3遍。重复以上步骤若干次，使最外层涂覆涂覆液。

将膜层进行塑化处理，其中塑化处理的条件为：温度为70℃、压力为1.5MPa、时长为45min。

得到的骨钉，记作A2。

实施例3

取无涂层的载玻片依次在丙酮、乙醇、去离子水中各超声清洗30min。

将超声清洗后的载玻片浸入Piranha洗液(浓H₂SO4:30％H₂O₂(v/v)＝3:1)中在70℃下水浴30min，以去除载玻片上残留的有机物并使载玻片负电荷化。

在水浴结束后，用去离子水冲洗载玻片，并将载玻片浸入0.5mg/ml的聚乙烯亚胺水溶液(支化PEI，MW＝10000)，浸涂保持10min，使载玻片表面吸附富集正电的PEI涂层。然后将载玻片取出，用去离子水冲洗3次，自然晾干备用。

将乳清蛋白、麦清蛋白、阿拉伯胶按3:16:1的质量比混合，加入去离子水得到总质量分数12wt％的初始胶液，然后根据初始胶液的体积以50:1(v/v)的比例，加入分散剂(5mg/ml的PEG-400水溶液)，然后再经离心、过滤等步骤，去除气泡和悬浮颗粒，得到澄清的二级胶液。

按100:1(v/v)的比例向澄清的二级胶液中加入2wt％的原花青素水溶液进行预交联，得到涂覆液。

将晾干的载玻片浸入涂覆液中10min，然后取出用去离子水冲洗载玻片3次。

将冲洗后的载玻片进行塑化处理，其中塑化处理的条件为：温度为95℃、压力为1.5MPa、时长为45min。

得到的载玻片，记作A3。

对比例1

得到的导尿管，记作AC1。

对比例2

将无涂层的镍钛合金的圆柱形骨钉，截成2cm左右的骨钉段，依次在丙酮、乙醇、去离子水中各超声清洗30min，然后用N₂气吹干并用75vol％的酒精消毒。

得到的骨钉，记作AC2。

对比例3

得到的载玻片，记作AC3。

性能测试：

导尿管抗细菌黏附测试：

将三组导尿管(每组均为一个导尿管A1以及一个导尿管AC1)，从排尿腔体处剪成7cm小段，放入15ml的离心管中，然后分别加入6ml的1×10³～5×10³cfu/ml浓度的菌悬液(第一组为大肠杆菌、第二组为铜绿假单胞菌、第三组为粪链球菌)，然后置于35±2℃的恒温培养箱中培养。大肠杆菌和铜绿假单胞菌培养17～19小时，粪链球菌培养45～48小时，培养后的导尿管分别用无菌镊取出，投入50ml离心管内，注入30ml无菌生理盐水上下颠倒10次，润洗导尿管段内外表面浮游细菌，重复此步骤3次。

将润洗后的每个导尿管段分别投入一个含10ml生理盐水的15ml离心管中超声10min洗脱导尿管表面黏附的菌落(40kHz，100％)。

适当稀释，分别取0.5ml超声清洗液置于平皿，用凉至40～50℃营养琼脂培养基15ml～20ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀琼脂凝固后翻转平板，(35±2)℃培养24～48h。

菌落呈片状生长的平板不宜采用，分别记录不同稀释倍数平板上得到的肉眼可见菌落数。

按公式计算抗细菌黏附率：X＝(A–B)/A×100％，式中X为抗细菌黏附率(％)，A为对比例组菌落数平均值，B为实施例组菌落数平均值。

按上述步骤，最终计算得到导尿管A1对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的抗黏附率分别为89％、86％和83％。大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的抗黏附结果分别见图1、图2和图3。

从图1、图2、图3可以看出：大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌分别在导尿管AC1表面大量黏附，平板上细菌已不可计数；而在导尿管A1上细菌黏附量比较少，二者有着数量级差距。这说明本发明的导尿管对细菌有着明显的抗黏附作用。

骨钉抗细菌黏附测试：

采用上述抗细菌黏附方法对骨钉A2以及AC2进行细菌黏附定量实验，最终计算得到骨钉A2对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌的抗黏附率分别为99％、93％和87％。

载玻片的抗细菌黏附测试：

细菌培养：将载玻片A3及载玻片AC3经高温高压灭菌，待冷却后在每个载玻片上各滴加浓度为1×10⁵～9×10⁵cfu/ml浓度的菌悬液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)，载玻片放入一次性无菌平皿并置于(35±2)℃恒温培养箱中开始培养细菌。

菌落染色：18h后，取出盛有载玻片的平皿，用一次性无菌滴管吸除载玻片表面菌悬液，然后用纯化水冲洗，洗去浮游细菌后在每片载玻片上滴加0.5ml结晶紫水溶液(1wt％)，对载玻片上残留的菌落进行染色。

菌落观察：染色30min后，用纯化水冲洗每片载玻片5遍，洗去染色液，在光学显微镜下用100倍油镜观察菌落，结果见图4以及图5。

从图4、图5可以看出：载玻片AC3经结晶紫染色后呈现密集的蓝紫色点或片状区域，说明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在载玻片AC3上大量黏附生长并形成生物膜，而载玻片A3只有极少的几个染色点。这说明本发明能明显抑制细菌生物膜的形成。

人血浆纤维蛋白原黏附测试：

配制人纤维蛋白原(Human Fibrinogen,HFg)稀释液：将人纤维蛋白原(Human Fibrinogen,HFg)溶于0.2M、pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，HFg最终浓度为0.5mg/ml；

配制牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封闭液：将牛血清白蛋白溶于0.1M、pH7.4的PBS缓冲液中，BSA最终浓度为10mg/ml；

配制羊抗HFg-FITC工作液：将浓度5mg/ml的异硫氰酸荧光素标记(FITC)的羊抗人血浆纤维蛋白原原液用PBS缓冲液稀释30倍后作为工作液。

向放置有载玻片A3以及载玻片AC3的培养板中加入HFg稀释液，将材料完全浸没，放人恒温水箱中，37℃孵育1h；孵育结束后将稀释液全部吸出，用PBS缓冲液漂洗3次，每次10min；漂洗结束后加入BSA封闭液，于37℃条件下封闭1h；封闭结束后，将封闭液吸出，再次用PBS缓冲液进行漂洗，10min×3次；漂洗结束后加入羊抗HFg-FITC工作液，于37℃条件下孵育1h；孵育结束后用去离子水漂洗，10min×3次，然后用荧光显微镜和荧光分光光度计进行表征，其结果分别如图6和图7所示。

从图6、图7可以看出：载玻片AC3表面有较多FITC特征荧光点，而载玻片A3上的特征荧光点很少。羊抗HFg-FITC示踪的结果说明，HFg在载玻片AC3表面有较多非特异性黏附，而载玻片A3的HFg非特异性黏附较少；整片荧光强度测试结果显示，载玻片AC3的FITC荧光强度高出载玻片A3的4～5 倍。这说明本发明对人血浆纤维蛋白原(HFg)的非特异性黏附有显著阻抗作用。

人血清白蛋白黏附测试：

配制HSA-FITC工作液：将FITC标记的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)原液用0.1M、pH7.4的PBS缓冲液稀释30倍后作为工作液。

向放置有载玻片A3以及载玻片AC3的培养板中加入HSA-FITC工作液，将材料完全浸没，放人恒温水箱中，37℃孵育1h；孵育结束后将工作液全部吸出，用去离子水漂洗3次，每次10min，然后分别用荧光分光光度计和荧光显微镜进行表征，结果分别如图7和图8所示。

从图7、图8可以看出：载玻片AC3表面有较多FITC特征荧光点，而载玻片A3上的几乎没有特征荧光点；HSA-FITC示踪的结果说明，HSA在载玻片AC3表面有大量非特异性黏附，而载玻片A3很少；整片荧光强度测试结果显示，载玻片AC3的FITC荧光强度高出载玻片A3的8～9倍。这说明本发明对人血清白蛋白(HSA)的非特异性黏附有显著阻抗作用。

兔血小板黏附测试：

将载玻片A3以及载玻片AC3均放入超净台紫外光波或放射辐照灭菌1h，然后再将二者分别放入培养板中，并加入家兔富血小板血浆(PRP)至材料完全浸没，放入恒温水箱中，37℃孵育1h；孵育结束后将家兔PRP全部吸出，用去离子水漂洗3次，每次10min，然后用光学显微镜观察，结果见图9。

图10为家兔PRP在光学显微镜下加盖玻片观察的形态对比。

从图9、图10可以看出：原家兔PRP活性和密度都比较好，但是经过相同条件下的孵育后，载玻片A3上的血小板黏附量明显少于载玻片AC3且血小板形态也没有显著变化，即没有明显激活。这说明本发明能明显阻抗血小板在表面黏附，且没有刺激血小板激活。

L929细胞黏附测试：

将载玻片A3以及载玻片AC3均放入超净台紫外光波或放射辐照灭菌1h，再用无菌的PBS吹打冲洗，晾干后装入24孔板。将生长至对数增长期的L929细胞用胰酶消化下来，用新鲜的1640完全培养基终止消化并重悬至密度为1×10⁵/ml。每孔滴加0.5ml细胞悬液，轻轻摇匀后放入CO₂培养箱(37℃，5％CO₂)孵育24h。将载玻片转移到干净孔板中，用无菌的PBS溶液冲洗三次后加入新鲜的培养基。每孔加入50μl的MTT溶液孵育4h，吸弃孔板中溶液加入200μl的DMSO，孔板置于摇床摇匀10min后取150μl溶液转移到96孔板中，酶标仪测定吸光度(OD)值，结果见图11。

从图11可以看出：在0～24h内，载玻片A3上的细胞OD值和载玻片AC3一直都有统计学差异，载玻片A3上黏附的L929细胞数量明显更少。这说明本发明对细胞黏附也有阻抗作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

一种抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述抗生物、胞外基质黏附涂层为蛋白质塑化层，所述蛋白质塑化层中包括清蛋白、以及亲水性辅料。
根据权利要求1所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述清蛋白选自血清白蛋白、乳清蛋白、麦清蛋白、卵清白蛋白、和大豆清蛋白中的一种或几种。
根据权利要求1所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述亲水性辅料选自极性亲水蛋白质、氨基酸、多糖及其衍生物中的一种或几种。
根据权利要求3所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述亲水性辅料选自白明胶、丝胶蛋白、丝氨酸、天冬氨酸、透明质酸钠、羧甲基纤维素钠、和阿拉伯胶中的一种或几种。
根据权利要求1所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述蛋白塑化层中还包括纤维状蛋白。
根据权利要求1所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，以所述清蛋白的质量为基准，所述亲水性辅料的质量分数为0.5wt％～10wt％。
根据权利要求1～6任一项所述的抗生物、胞外基质黏附的涂层，其特征在于，所述蛋白质塑化层中的蛋白质的等电点在3.5～5.5之间。
一种抗生物、胞外基质黏附的涂层的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将清蛋白、亲水性辅料、以及水配制成胶液；

将所述胶液涂覆在基材表面形成膜层；

将所述膜层进行塑化处理，得到抗生物、胞外基质黏附涂层。
一种抗生物、胞外基质黏附的器械，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的抗生物、胞外基质黏附涂层。
根据权利要求9所述的抗生物、胞外基质黏附的器械，其特征在于，所述抗生物、胞外基质黏附的器械为医用导管、骨钉、心血管支架、手术器械、生物培养制品、玻璃、石英、或陶瓷器具。