WO2018188679A1 - Verfahren zum nachweis sekundärer botenstoffe mit fluoreszenzbasierten sensorproteinen und vorrichtung zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zum nachweis sekundärer botenstoffe mit fluoreszenzbasierten sensorproteinen und vorrichtung zur durchführung des verfahrens Download PDF

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Arnd Baumann
Nadine GRUTESER
Sabine BALFANZ
Viktoria KOHLHAS
Arne Franzen
Andreas Offenhäusser
Frank Müller
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Forschungszentrum Juelich GmbH
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Forschungszentrum Juelich GmbH
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the invention relates to a highly sensitive measuring method for the quantitative determination of the concentration of secondary messengers with fluorescence-based sensor proteins and to an apparatus for carrying out the method.
  • Cyclic adenosine 3 ', 5'-monophosphate is a major second messenger and is involved in many cellular signaling processes.
  • the cAMP is synthesized by adenylate cyclases from ATP.
  • the activity of adenylate cyclases can be stimulated but also inhibited via cell surface receptors. Subsequently, the intracellular cAMP concentration increases or decreases.
  • various methods are available.
  • a first method for the separation and quantification of the analyte relates to the high performance liquid chromatography (short: HPLC). With measuring times of approx. 20 min. Per sample, the HPLC is only of limited suitability for sample numbers as obtained in medium and high-throughput experiments. In order to be able to make reliable statements on the mode of action of a ligand, multiple determinations, at least 4-fold, are necessary and must cover this over a concentration range of the ligand of several orders of magnitude (eg 0, 1 nM-0.1 mM). Typical sample numbers, which occur per measurement series, are between 100 and 200. Calculated, this results in a pure measurement time without sample preparation between 33 and 67 h when using an HPLC system. This is unacceptable for most issues in this area.
  • cAMP determinations are carried out either as radioimmunoassays (RIA) or as enzyme-linked immunoassays (EIAs).
  • RIA radioimmunoassays
  • EIA enzyme-linked immunoassays
  • RIA radioactively labeled
  • EIA fluorophore- or enzyme-labeled cAMP
  • signal detection either liquid scintillation detectors or fluorescence readers are required.
  • Cells primarily record signals from their environment using cell surface receptors. These receptors transfer the specific recognition of a signal to the intracellular side by means of a conformational change, where they activate further proteins that, for example, modulate the activity of enzymes or ion channels. Intracellular signal transduction often involves small secondary boron molecules whose concentration is dynamically influenced by receptor activity can be regulated. For a detailed understanding of cellular signal processing, it is important to quantify changes in messenger levels to correlate with the output signal.
  • the object of the invention is to provide a fast, robust, highly sensitive method for detecting secondary messengers with fluorescence-based sensor proteins and a device for carrying out the method.
  • Another object of the invention is to provide a method for the quantitative determination of the concentration of secondary messengers with fluorescence-based sensor proteins and a corresponding device for carrying out the method.
  • the method according to the invention for detecting secondary messengers has the following steps:
  • the method ensures the detection and quantification of messenger concentrations to correlate with an output signal. This is why a method by which a detailed understanding of cellular signal processing processes can be ensured.
  • the method is used in particular outside the cell.
  • the method is characterized in an embodiment of the invention by the choice of a fluorescence-based sensor protein, which by cloning and providing the coding for the fluorescence-based sensor protein DNA with a tag, z. B. a histidine tag was obtained in an expression vector.
  • Epad-camps is a genetically encoded Förster resonance energy transfer (FRET) sensor that consists of two fluorescent proteins (eCFP and eYFP) linked by a cAMP binding module (Epad).
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • eCFP and eYFP are spatially close together.
  • eCFP is excited with light at 436 nm, part of the energy can be transferred to eYFP without radiation and the eYFP fluoresces (525 nm).
  • eYFP fluoresces 525 nm.
  • eCFP and eYFP separate. Therefore, when the eCFP is exposed, less energy is transferred to the eYFP.
  • the eYFP fluorescence consequently decreases and at the same time the eCFP fluorescence increases.
  • the fluorescence-based sensor protein Epad-camps (AF103905) known from Nikolaev et al., J. Biol. Chem., 279, 36, 37215 (2004) can be used for the first time for the direct quantification of cAMP.
  • the method may be characterized by the choice of a fluorescence-based sensor protein obtained by expression in a bacterium.
  • the method may be characterized by the choice of a fluorescence-based sensor protein obtained by purification by affinity chromatography and size-exclusion chromatography. This provides the fluorescence-based sensor protein.
  • affinity chromatography Ni-NTA affinity chromatography is preferably carried out.
  • the apparatus for carrying out the method comprises, in its simplest form, a container and, best of all, a multi-well shell in the wells.
  • gene present fluorescence-based sensor protein, in particular dried and / or immobilized fluorescence-based sensor protein.
  • the Epad-camps-His protein as a fluorescence-based sensor protein is particularly interesting because it can be used for the quantitative detection of cAMP outside a cell.
  • the invention is not limited to this. Rather, the subject of the present patent application is also a kit comprising
  • a container such.
  • the material of the multiwell can z. B. made of plastic or glass or other material.
  • the color coding is not significant and does not affect the measurement and the procedure performed.
  • the Epad-camps sensor has been used in living cells, in acute tissue sections, and in living organisms to monitor cAMP dynamics as an optogenetic sensor. Therefore, according to the invention, a cAMP detection method has also been developed that uses the "Exchange Protein directly activated by cAMP 1.” Thereby, a quantitative cAMP detection method was developed using the "Exchange Protein directly activated by cAMP 1".
  • the fluorescence-based sensor protein is preferably provided in multiwell shells.
  • Epac1-camps-His is stable in multiwell shells for a long time, and does not lose its activity even after a long storage period, for example of several weeks, compared to cAMP. This finding is beyond belief seeing as it was not to be expected that Epac1-camps-His protein in multi-well dishes without any further modifications of the storage buffer, eg. B. with glycerol, submitted and stored for further use. It is thus possible to introduce Epac1-camps-His protein into the container and to dry to obtain a device according to the invention.
  • the present invention relates on the one hand to rapid, highly sensitive measurement methods for the quantitative determination of the concentration of secondary messengers with fluorescence-based sensor proteins and, on the other hand, to corresponding devices for carrying out the methods in particular for the detection of cAMP and cGMP.
  • the fluorescence-based sensor protein cGES-DE5 (Nikolaev et al., Nature Methods 3 (1), 23 (2006) can be used.)
  • IP3 4,5-trisphosphate
  • the fluorescence-based sensor protein LIBRAvIII Tanimura et al., J. Biol. Chem 279, 38095 (2004) and (Tanimura et al., J. Biol. Chem. 284, 89 0 (2009)).
  • the primary object of the invention to utilize the Epad-camps sensor for the cell-free determination of cAMP quantities.
  • the protein was bacterially overexpressed and biochemically purified both affinity and size exclusion chromatographically.
  • the purified fluorescence-based sensor protein is presented in a defined concentration in the container, in particular the multiwell shells.
  • the purified protein is adjusted in buffer to a defined concentration. Concentrations between 0.01-0.75 mg / ml, preferably 0.025-0.075 mg / ml and in particular 0.05 mg / ml have proved necessary and sufficient.
  • the protein is ready to use. However, it can be dried advantageously in the container and in particular the depression of the multiwell.
  • fluorescence-based sensor protein in particular the Epac1-camps-His protein
  • Epac1-camps-His protein without loss of function in the container or in the well of the multi-well shell. dry, reconstitute with buffer at a later date and then use for cAMP determinations.
  • the method is well suited to use the Epad-camps sensor to determine cAMP amounts also from cell or tissue extracts.
  • the change of the fluorescence signals in the individual wells of a multi-well dish (96 MWP) can advantageously be recorded with a fluorescence reader.
  • the process is particularly advantageously suitable for detecting cAMP over four orders of magnitude from about 0.15 to 1000 pmol of cAMP. For the first time, a highly sensitive, inexpensive, robust and fast method for the detection of cAMP is provided.
  • the method and the kit according to the invention in the form described here therefore advantageously require only two components: (1) the purified sensor protein in the container and
  • the sensor protein may also be dried in the container to a carrier or in the wells of a multi-well shell or be covalently coupled thereto. It should be ensured that the overall mobility of the protein is not compromised in order to increase the distance between the fluorescent proteins CFP and YFP, which is crucial for changing the fluorescence emission signals.
  • the method described for the determination of cAMP amounts of substance by means of Epad - camps can in principle be applied to the determination of other messenger substances.
  • fluorescence-based sensor proteins which specifically bind cyclic guanosine 3 ', 5'-monophosphate (cGMP) or inositol-1, 4,5, trisphosphate (IP3). These sensor proteins are produced and purified in the same way as the Epad camp, which also allows the messengers cGMP and IP3 to be quantified with high sensitivity and relatively little time.
  • cGMP cyclic guanosine 3 ', 5'-monophosphate
  • IP3 inositol-1, 4,5, trisphosphate
  • Quantifying the concentration of second messengers in cell lysates is another advantage of the method.
  • the presented, bacterially expressed and biochemically purified fluorescence-based sensor protein is advantageously suitable for determining the concentration of cellular messengers in a cell-free system.
  • the bacterial overexpression of the sensor proteins was optimized, with different parameters, e.g. Bacterial strain, expression vector and expression conditions were compared. Particularly advantageous may be an incubation of E. coli BL21 (DE3) -Codon Plus RIL with pET1 1a vector overnight at 30 ° C.
  • Proteins were preferably purified by two sequential chromatographic methods, in particular nickel-NTA affinity chromatography for HIS-tag and size-exclusion chromatography.
  • the addition of defined concentrations (10 8 to 10 -3 M) of cAMP to the purified protein in multiwell shells resulted in a reliable concentration-dependent and saturable decrease in the FRET signal.
  • the amounts of cAMP are in the range of levels achieved in cellular signal transduction
  • the optimization of the expression and the purification of FRET-based cGMP or IP3 sensors is possible in an analogous manner.
  • the senor can be used to determine cAMP levels produced after stimulation of defined signaling chains in eukaryotic cell lines.
  • Another object of the invention is also a manufacturing method for fluorescence-based sensor proteins, such.
  • the Epac1-camps-His protein and the thus prepared fluorescence-based sensor protein itself in particular the Epad-camps-His protein.
  • the process for the production of fluorescence-based sensor proteins, in particular Epad-Camps-His protein is characterized by the steps:
  • the protein can be surprisingly stable over many weeks, for. B. stored at 4 ° C.
  • the fluorescence-based sensor protein may be dried or stored in storage buffer without modification of the buffer e.g. B. be stored with glycerol or other substances.
  • the Epad-camps-His protein shows a concentration-dependent and saturable decrease in the FRET signal when cAMP is added.
  • the change in the optical properties can be registered in cuvette measurements or in fluorescence readers in multiwell shells. In principle, however, any suitable and readable container can be selected.
  • FIG. 1 SDS-PAGE of the Ni-NTA-purified Epad-Camps-His protein.
  • the bacterially overexpressed protein was enriched by Ni-NTA affinity chromatography. Aliquots of 8 ⁇ each of individual fractions were fractionated on a denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE; 12.5%) and the proteins stained with Coomassie Brilliant Blue. The sizes of the reference proteins of the marker are given on the left.
  • FIG. 2A Absorbance profile of the size exclusion chromatography of the Epad - camps - His protein at 280 nm. The eluate fractions are numbered and the elution volume is indicated (ml). The absorption is indicated on the y-axis (mAU).
  • Figure 2B SDS-PAGE of selected fractions of the size exclusion chromatographic purification of the Epad camp His protein.
  • Lane 1 "PageRuler Plus Prestained”
  • Lane 2 Fraction 6
  • Lane 3 Fraction 20
  • Lane 4 Fraction 22
  • Lane 5 fraction 24
  • Lane 6 fraction 26
  • Lane 7 fraction 28
  • Lane 8 fraction 30
  • Lane 9 fraction 32
  • Lane 10 fraction 34
  • Lane 1 1 "PgeRuler Plus Prestained”
  • lane 2 fraction 36
  • lane 3 fraction 38
  • lane 14 fraction 40
  • lane 15 fraction 42
  • lane 16 fraction 44
  • lane 17 fraction 55
  • lane 18 Fraction 77
  • FIG. 3 Creation of a concentration-effect curve for calibrating the
  • FIG. 4 Creation of a concentration-activity curve for the octopamine-dependent activation of DmOct ⁇ RI in a cell line constitutively expressing the receptor protein. Activation of the receptor with octopamine results in G-protein mediated stimulation of cell-derived adenylyl cyclases (AC), which synthesize the secondary messenger cAMP from ATP. Cell extracts were prepared and the cAMP contained therein was determined in a 96-well multiwell dish with pre-charged Epad-camps-His. For the evaluation, the calibration shown in FIG. 3 was used. The EC50 value for octopamine of 2,475 10 "8 M is in very good agreement with the values obtained using commercial cAMP detection assays.
  • AC cell-derived adenylyl cyclases
  • FIG. 5 Schematic mechanism of the cAMP metabolism (production and
  • the DNA encoding the sensor protein (AF103905) plus the corresponding sequences for the fluorescence-based portions for eCFP and eYFP was first cloned into the bacterial expression vector pET11a (Novagen, Merck / Millipore). For this purpose, the cDNA was amplified in two steps by PCR. To the 3 'end of the construct was added a sequence coding for six histidines (6 x His), through which the protein can be purified. The PCR products were cut with the restriction enzymes Ndel and XbaI and XbaI and BamHI, purified and then ligated into the Ndel and BamHI cut pET1 1a vector. After purification of the plasmid DNA, the nucleic acid sequence was checked for completeness and correctness by sequencing.
  • the expression of the sensor protein was optimized with regard to the yield and stability in different bacterial strains, with different growth conditions (temperature, time) and induction conditions (concentration of the IPTG, inducing the expression of the gene). The best results were achieved with the following conditions:
  • the bacteria were harvested after overnight incubation, see Figure 2).
  • the E. coli cell pellet was washed in 15 ml lysis and equilibration buffer (Buffer A, 50 mM Na 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole). Subsequently, the cells were resuspended in 12 ml of buffer A.
  • the bacterial suspension was mixed with 1 mg / ml lysozyme and incubated on ice for 30 min.
  • the suspension was sonicated (18x20s, Sonifier W-450D, Branson Sonic Power Company) and then centrifuged (3-16K, Sigma, 5,500xg, 4 ° C, -60min). The supernatant contained the recombinant protein.
  • Ni-NTA agarose was used to isolate the fusion protein (Macherey and Nagel, Düren).
  • the histidines (6 x His) attached to the Epad camps His protein can form stable chelate complexes with the Ni 2+ ions immobilized on the matrix.
  • the target protein is retained by the Ni-NTA agarose.
  • the protein was then batch-enriched: 1 ml Ni-NTA agarose was equilibrated twice in a 50 ml reaction vessel with 10 column volumes (SV) buffer A.
  • the matrix was pelleted by centrifugation (3-16K, Sigma, 500xg, 4 ° C, 5 min).
  • the cell lysate was then added to the agarose, gently mixed and panned at 4 ° C for 30-60 min (Mini Rocker Shaker, Biosan, Riga, Norway). After the supernatant was separated from the matrix (3-16 K, Sigma, 500xg, 4 ° C, 5 min), the protein bound to the Ni-NTA agarose was washed twice with each 20 CV wash buffer (Buffer B; 50 mM Na 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 30 mM imidazole). After the second washing step, the matrix was resuspended in 5 ml of Buffer B and transferred to a single-use column (Poly-Prep® Chromatography Columns, Biorad, Kunststoff).
  • Buffer B 50 mM Na 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 30 mM imidazole
  • the recombinant protein was finally eluted with elution buffer (buffer E, 50 mM Na 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 150 mM imidazole) in 500 ⁇ steps. Enrichment of the protein was documented by separating aliquots of individual fractions in a denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and then staining the proteins with Coomassie Brilliant Blue ( Figure 1). Fractions containing the largest amount of eluted protein were pooled and concentrated via a 1 ml Amicon Ultra centrifugation filter (Merck / Millipore, cut off 50,000) according to the manufacturer's instructions.
  • buffer E 50 mM Na 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 150 mM imidazole
  • the fluorescence change of the sensor protein after addition of the secondary messenger cAMP was measured with a fluorescence reader (Fluostar Omega, BMG
  • the purified proteins were diluted in IC buffer (135 mM potassium gluconate, 12 mM NaHCO 3 , 4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , pH 7.4) to a defined concentration of 0.05 mg / ml. 90 ⁇ each of the solution was pipetted into the individual wells of a 96-well multiwell dish. First, the baseline fluorescence in the individual wells was measured. Subsequently, a dilution series of the messenger substance cAMP was prepared and the protein solutions were mixed with 10 ⁇ l each of these cAMP solutions.
  • the Epad camps His protein was excited at a wavelength of 430 nm and the emission measured at 475 nm (CFP) and 530 nm (YFP). Each measurement consisted of five to fifteen cycles.
  • the ratio of the emission values YFP / CFP (R) in each well was normalized to the basal fluorescence (R0) ratio and plotted against the cAMP concentration used. The result is a concentration-effect curve from which the value for the half-maximal response (EC50) can be determined.
  • the evaluation and graphing was done with the program GraphPad Prism 5.04
  • a cell line was used in which a G protein-coupled receptor (GPCR) of Drosophila melanogaster (DmOA2, today DmOct ⁇ RI) is constitutively expressed. (Balfanz et al., 2005). This receptor is specifically activated by the biogenic amine octopamine and triggers a reaction cascade intracellularly, at the end of which cAMP is produced. Cells of this cell line were seeded in 24-well multi-well dishes and propagated to a density of about 240,000. The cells were washed twice with PBS buffer containing 100 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the measurement method is universally suitable for all cell- and tissue-based samples in which the intracellular cAMP concentration is changed, as shown in excerpts in FIG.
  • octopamine receptors In addition to octopamine receptors, these allow many other GPCRs to be stimulated by biogenic amines such as dopamine, serotonin, epinephrine, norepinephrine and histamine or even peptides.
  • biogenic amines such as dopamine, serotonin, epinephrine, norepinephrine and histamine or even peptides.
  • an increase in the intracellular cAMP concentration can also be achieved by the direct stimulation of cell-derived and additionally introduced into the cells adenylyl cyclases eg via forskolin as well as the inhibition of cell-own and additionally introduced into the cells phosphodiesterases (PDE), which hydrolyze the cAMP to AMP, eg by IBMX.
  • PDE phosphodiesterases
  • the measurement method is further suitable for the decrease of intracellular cAMP Concentration to be detected, which takes place either by stimulating specific GPCR, inhibiting the cell's own and additionally introduced into the cells adenylyl cyclases or substances that lead to an increase in PDE activity.
  • the method is thus suitable for quantifying cAMP levels, which are generated, for example, by the stimulation of receptors (GPCR 1a), which in turn activate adenylyl cyclases (AC; II). This results in an increase in cAMP concentration.
  • the method is not limited to this signal path.
  • the decrease in the intracellular cAMP concentration can also be detected, as is the case for example after the activation of GPCR (Ib), which inhibit adenylyl cyclases (AC, II) and lead to a decrease in the cAMP concentration.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe gekennzeichnet durch die Schritte: - Zugabe eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins in ein Behältnis, - Messung der Grundfluoreszenz ohne den sekundären Botenstoff, - Zugabe des sekundären Botenstoffs zum Behältnis, - Messung der Fluoreszenzänderung zum Nachweis des sekundären Botenstoffs. Eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung des Verfahrens sind offenbart.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein hochsensitives Messverfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Stand der Technik Cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) ist ein bedeutender sekundärer Botenstoff und ist in viele zelluläre Signalprozesse eingebunden. Das cAMP wird von Adenylatzyklasen aus ATP synthetisiert. Die Aktivität der Adenylatzyklasen kann über Zelloberflächenrezeptoren stimuliert aber auch inhibiert werden. Nachfolgend steigt bzw. sinkt die intrazelluläre cAMP Konzentration. Um cAMP Stoffmengen zu quantifizieren, stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung.
Ein erstes Verfahren zur Auftrennung und Quantifizierung des Analyten (hier cAMP) betrifft die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (kurz: HPLC). Mit Messzeiten von ca. 20 Min. je Probe ist die HPLC für Probenzahlen, wie sie in Mittel- und Hochdurchsatzexperimenten anfallen, nur bedingt geeignet. Um zuverlässige Aussagen zur Wirkungsweise eines Liganden treffen zu können, sind Mehrfachbestimmungen, mindestens 4-fach, notwendig und dies über einen Konzentrationsbereich des Liganden der mehrere Größenordnungen (z. B. 0, 1 nM - 0,1 mM) abdecken muss. Typische Probenzahlen, die je Messreihe anfallen, liegen zwischen 100 bis 200. Rechnerisch ergibt sich hieraus bei Verwendung einer HPLC Anlage eine reine Messzeit ohne Probenvorbereitung zwischen 33 und 67 h. Dies ist für die meisten Fragestellungen in diesem Bereich inakzeptabel.
Alternativ stehen kommerziell erhältliche Komplettsysteme zur Verfügung. Die cAMP Bestimmungen werden entweder als Radio Immunoassays (RIA) oder als Enzyme- linked Immunoassays (EIA) durchgeführt. Bei diesen Verfahren konkurriert radioaktiv markiertes (RIA) oder Fluorophor- bzw. Enzym-markiertes cAMP (EIA) mit nicht- markiertem cAMP aus der Probe um Bindungsstellen an spezifischen cAMP Bindungsproteinen. Für die Signaldetektion werden entweder Flüssigkeit Szintillations- detektoren oder Fluoreszenzlesegeräte benötigt. Diese Assays ermöglichen den Nachweis von cAMP Stoffmengen zwischen ca. 0,2 und > 200 pmol. Die Nutzung radioaktiv markierter Verbindungen stellt nachteilig hohe Anforderungen an die Laborstandards, in denen die Experimente durchgeführt werden sollen. Dazu gehören Umgangsgenehmigungen für die jeweiligen Nuklide, spezifische bauliche und sicherheitsrelevante Anforderungen an die Laborräume, spezielle Apparaturen zur Detektion der radioaktiv markierten Verbindungen, sowie spezifische Kontroll- und Schutzmaßnahmen für die Mitarbeiter, die die Experimente durchführen. In den letzten 10 Jahren ist zudem ein deutlicher Rückgang in Bezug auf den kommerziellen Vertrieb von Radioimmuno (RIA)-Assays zu verzeichnen, sodass es mittelfristig notwendig sein wird auf Alternativverfahren umzustellen.
Eine Reihe der in den zurückliegenden Jahrzehnten verwendeten RIA-Assays sind inzwischen durch Enzyme-Iinked Immunoassays (EIA) abgelöst worden. Ein zentraler Bestandteil dieser Messverfahren ist der Einsatz hochspezifischer Antikörper, die den Analyten (hier cAMP) binden können. Weiterhin sind fluoreszenzmarkierte oder enzymgekoppelte Liganden notwendig, die mit dem cAMP, das in einer Probe nachgewiesen werden soll, um die Bindestelle an dem Antikörper konkurrieren (Kompe- titor). Sowohl die Herstellung, Reinigung und Qualitätssicherung der Antikörper als auch der jeweiligen Kompetitoren ist sehr aufwändig. Ähnlich wie bereits für die HPLC-basierten Nachweisverfahren beschrieben, gilt sowohl für die RIA- als auch die EIA-Verfahren, dass die Inkubationsschritte bis zur finalen Bestimmung der Ana- lytkonzentration sehr zeitintensiv sind. Bei RIA-Assays kann der Zeitaufwand bis zu 24 Std. betragen, bei EIA-Assays sind in der Regel zwischen 4 - 5 Std. erforderlich.
Zellen registrieren Signale aus ihrer Umgebung überwiegend mithilfe von Zelloberflächenrezeptoren. Diese Rezeptoren übertragen die spezifische Erkennung eines Signals mittels einer Konformationsänderung auf die intrazelluläre Seite und aktivieren dort weitere Proteine, die z.B. die Aktivität von Enzymen oder lonenkanälen mo- dulieren. An der intrazellulären Signalübertragung sind häufig kleine sekundäre Bo- tenstoffmoleküle beteiligt, deren Konzentration dynamisch über die Rezeptoraktivität reguliert werden kann. Für das detaillierte Verständnis zellulärer Signalverarbeitungsprozesse ist es wichtig, die Änderungen der Botenstoffkonzentrationen zu quantifizieren, um sie mit dem Ausgangssignal zu korrelieren.
Aufgabe der Erfindung Aufgabe der Erfindung ist es, ein schnelles, robustes, hochsensitives Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sensorproteinen und eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1 und der Vorrichtung bzw. dem Kit gemäß den Nebenansprüchen. Vorteilhafte Ausgestaltungen hier- zu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe weist die nachfolgenden Schritte auf:
- Zugabe eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins in ein Behältnis, vor- zugsweise in die Vertiefungen einer Multiwellschale,
- Messung der Grundfluoreszenz ohne den sekundären Botenstoff,
- Zugabe des sekundären Botenstoffs zum Behältnis, vorzugsweise in die Vertiefungen einer Multiwellschale,
- Messung der Fluoreszenzänderung zum Nachweis des sekundären Boten- Stoffs.
Das Verfahren gewährleistet den Nachweis und die Quantifizierung der Botenstoffkonzentrationen, um sie mit einem Ausgangssignal zu korrelieren. Dies stellt daher ein Verfahren dar, mit dem ein detailliertes Verständnis zellulärer Signalverarbeitungsprozesse gewährleistet werden kann.
Das Verfahren wird insbesondere außerhalb der Zelle angewendet.
Das Verfahren ist in einer Ausgestaltung der Erfindung gekennzeichnet durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mit einem tag, z. B. einem Histidin tag in einen Expressionsvektor erhalten wurde.
Es wird Epad-camps genannt. Epad-camps ist ein genetisch kodierter Förster- Resonanzenergietransfer (FRET)-Sensor, der aus zwei Fluoreszenzproteinen (eCFP und eYFP) besteht, die über ein cAMP Bindemodul (Epad ) miteinander verbunden sind. In Abwesenheit von cAMP befinden sich eCFP und eYFP räumlich dicht beieinander. Wird eCFP mit Licht bei 436 nm angeregt, kann ein Teil der Energie strahlungslos auf eYFP übertragen werden und das eYFP fluoresziert (525 nm). In Anwesenheit von cAMP entfernen sich das eCFP und eYFP voneinander. Bei Belichtung des eCFP wird daher weniger Energie auf das eYFP übertragen. Die eYFP Fluoreszenz nimmt folglich ab und gleichzeitig steigt die eCFP Fluoreszenz.
Dadurch kann das aus Nikolaev et al., J. Biol. Chem., 279, 36, 37215 (2004) bekannte fluoreszenzbasierte Sensorprotein Epad-camps (AF103905) erstmalig für die direkte Quantifizierung von cAMP genutzt werden. Das Verfahren kann in einer Ausgestaltung der Erfindung durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch die Expression in einem Bakterium erhalten wurde, gekennzeichnet sein.
Das Verfahren kann im Übrigen durch die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins gekennzeichnet sein, welches durch eine Reinigung durch eine Affinitäts- Chromatographie und eine Größenausschlusschromatographie erhalten wurde. Hierdurch wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein bereitgestellt. Als Affinitätschromatographie wird vorzugsweise eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie durchgeführt.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst in seiner einfachsten Ausprägung ein Behältnis und am besten eine Multiwellschale mit in den Vertiefun- gen vorliegendem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein. Das Epad-camps- His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein ist besonders interessant, da es zum quantitativen Nachweis des cAMP außerhalb einer Zelle genutzt werden kann. Die Erfindung ist hierauf noch nicht beschränkt. Vielmehr ist der Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung auch ein Kit umfassend,
- ein Behältnis, wie z. B. eine Multiwellschale mit in den Vertiefungen vorliegendem fluoreszenzbasiertem Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem Epac1-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein;
- einem sekundären Botenstoff, insbesondere cAMP.
Zur Immobilisierung kann Avidin und/oder Streptavidin verwendet werden.
In Bezug auf die Multiwellschale kann der Fachmann frei aus den aus dem Stand der Technik bekannten Varianten, Materialien und Farben auswählen. Das Material der Multiwellschale kann z. B. aus Kunststoff oder auch aus Glas oder einem anderen Material bestehen. Die Farbcodierung ist dabei nicht erheblich und beeinflusst die Messung und das durchgeführte Verfahren nicht.
Der Epad-camps Sensor ist bisher in lebenden Zellen, in akuten Gewebeschnitten sowie in lebenden Organismen zur Beobachtung der cAMP Dynamik als optogeneti- scher Sensor benutzt worden. Erfindungsgemäß wurde daher auch ein cAMP Nachweisverfahren entwickelt, das das„Exchange Protein directly activated by cAMP 1" nutzt. Dadurch wurde ein quantitatives cAMP Nachweisverfahren entwickelt, das das „Exchange Protein directly activated by cAMP 1" nutzt.
In der vorliegenden Patentanmeldung wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein entsprechend vorzugsweise in Multiwellschalen bereitgestellt.
Es wurde festgestellt, dass das Protein Epac1 -camps-His in Multiwellschalen lang- zeitstabil ist, und seine Aktivität auch nach langer Lagerdauer beispielweise von mehreren Wochen gegenüber cAMP nicht verliert. Dieser Befund ist insofern überra- sehend, da es nicht zu erwarten war, dass Epac1-camps-His Protein in Multiwell- schalen ohne jegliche weitere Modifikationen des Lagerungspuffers, z. B. mit Glyce- rol, vorgelegt und zur weiteren Verwendung gelagert werden kann. Es ist also möglich, Epac1-camps-His Protein in das Behältnis vorzulegen und zu trocknen um eine erfindungsgemäße Vorrichtung zu erhalten.
Da es möglich ist, dass auch andere zyklische Nukleotide durch fluoreszenzbasierte Sensorproteine nachgewiesen werden können, handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung einerseits um schnelle, hochsensitive Messverfahren zur quantitativen Konzentrationsbestimmung sekundärer Botenstoffe mit fluoreszenzbasierten Sen- sorproteinen und andererseits auch um entsprechende Vorrichtungen zur Durchführung der Verfahren, insbesondere für den Nachweis von cAMP und cGMP.
Für den Nachweis von cGMP kann beispielhaft das fluoreszenzbasierte Sensorprotein cGES-DE5 (Nikolaev et al., Nature Methods 3 (1), 23 (2006) verwendet werden. Für den Nachweis von Inosital 1 ,4,5-trisphosphat (IP3) kann beispielhaft das fluores- zenzbasierte Sensorprotein LIBRAvIll (Tanimura et al., J. Biol. Chem 279, 38095 (2004) sowie (Tanimura et al., J. Biol. Chem 284, 89 0 (2009) verwendet werden.
Es war das primäre Ziel der Erfindung, den Epad-camps Sensor zur zellfreien Bestimmung von cAMP Stoffmengen nutzbar zu machen. Dazu wurde das Protein bakteriell überexprimiert und biochemisch sowohl affinitäts- als auch größenausschluss- chromatographisch aufgereinigt.
Das gereinigte fluoreszenzbasierte Sensorprotein wird in definierter Konzentration in das Behältnis, insbesondere die Multiwellschalen vorgelegt. Das gereinigte Protein wird in Puffer auf eine definierte Konzentration eingestellt. Als notwendig und hinreichend haben sich Konzentrationen zwischen 0,01 - 0,75 mg/ml, vorzugsweise 0,025 - 0,075 mg/ml und insbesondere 0,05 mg/ml erwiesen. Das Protein ist sofort einsatzbereit. Es kann aber vorteilhaft im Behältnis und insbesondere der Vertiefung der Multiwellschale getrocknet werden.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass es vorteilhaft möglich ist, fluoreszenzbasiertes Sensorprotein, und zwar insbesondere das Epac1-camps-His Protein, ohne Funktionsverlust im Behältnis bzw. in der Vertiefung der Multiwellschale einzu- trocknen, zu einem späteren Zeitpunkt mit Puffer zu rekonstituieren und erst dann für cAMP Bestimmungen einzusetzen.
Vorteilhaft ist das Verfahren gut geeignet, mit dem Epad-camps Sensor cAMP Mengen auch aus Zell- oder Gewebeextrakten zu bestimmen. Die Änderung der Fluoreszenzsignale in den einzelnen Vertiefungen einer Multiwell- schale (96er MWP) kann vorteilhaft mit einem Fluoreszenzlesegerät aufgezeichnet werden.
Mithilfe einer gleichzeitig durchgeführten Kalibrierung mit einer bekannten Menge cAMP werden dann die Stoffmengen der Proben korrekt quantifiziert. Besonders vorteilhaft ist das Verfahren geeignet, cAMP über vier Größenordnungen von ca. 0,15 bis 1000 pmol cAMP hinweg nachzuweisen. Damit wird erstmals ein hochsensitives, preiswertes, robustes und schnelles Verfahren zum Nachweis von cAMP bereitgestellt.
Neben der Sensitivität des Verfahrens ist ein weiterer wesentlicher Vorteil, dass die Bestimmung bereits ca. 30 Min. nach der Zugabe einer Probe zu der Epad-camps Lösung in der Multiwellschale erfolgen kann. Damit entfallen vorteilhaft zeitaufwendige Inkubations- und Waschschritte.
Das Verfahren und das erfindungsgemäße Kit in der hier beschriebenen Form benötigen daher vorteilhaft lediglich zwei Komponenten: (1 ) das gereinigte Sensorprotein im Behältnis und
(2) den Analyt.
Dabei ist es nicht zwingend erforderlich, dass das Sensorprotein in Lösung vorliegt, es kann ebenso im Behältnis an einen Träger bzw. in den Vertiefungen einer Multiwellschale getrocknet vorliegen oder hieran kovalent gekoppelt sein. Dabei sollte gewährleistet sein, dass die Gesamtbeweglichkeit des Proteins nicht beeinträchtigt ist, um die Vergrößerung des Abstands zwischen den Fluoreszenzproteinen CFP und YFP zu erreichen, der für die Änderung der Fluoreszenzemissionssignale entscheidend ist. Das beschriebene Verfahren zur Bestimmung von cAMP Stoffmengen mittels Epad - camps lässt sich prinzipiell auf die Bestimmung anderer Botenstoffe übertragen.
So sind fluoreszenzbasierte Sensorproteine bekannt, die zyklisches Guanosin-3',5'- monophosphat (cGMP) oder lnositol-1 ,4,5,trisphosphat (IP3) spezifisch binden. Die- se Sensorproteine werden in derselben Weise produziert und gereinigt, wie das Epad -camps, wodurch auch die Botenstoffe cGMP und IP3 mit hoher Sensitivität und relativ geringem zeitlichen Aufwand quantifiziert werden können.
Die Quantifizierung der Konzentration von sekundären Botenstoffen in Zelllysaten ist ein weiterer Vorteil des Verfahrens. Das vorgestellte, bakteriell exprimierte und bio- chemisch gereinigte fluoreszenzbasierte Sensorprotein ist vorteilhaft geeignet, um die Konzentration zellulärer Botenstoffe in einem zellfreien System zu bestimmen. Dabei wurde die bakterielle Überexpression der Sensorproteine optimiert, wobei verschiedene Parameter, z.B. Bakterienstamm, Expressionsvektor und Expressionsbedingungen verglichen wurden. Besonders vorteilhaft kann eine Inkubation von E. coli BL21 (DE3)-Codon Plus-RIL mit pET1 1a vector Übernacht bei 30°C erfolgen.
Proteine wurden vorzugsweise mittels zwei aufeinanderfolgenden chromatographischen Methoden, hier insbesondere der Nickel-NTA-Affinitätschromatographie in Bezug auf HIS-tag und einer Größenausschlusschromatographie, gereinigt. Die Zugabe definierter Konzentrationen (10~8 bis 10"3 M) cAMP zu dem gereinigten Protein in Multiwellschalen führte zu einer zuverlässigen konzentrationsabhängigen und saturierbaren Abnahme des FRET-Signals. Die cAMP-Stoffmengen liegen im Bereich der Werte, die bei zellulärer Signaltransduktion erreicht werden. Die Optimierung der Expression und der Reinigung von FRET-basierten cGMP bzw. IP3 Sensoren ist in analoger Weise möglich.
Der Sensor kann insbesondere genutzt werden, um cAMP Konzentrationen zu bestimmen, die nach der Stimulierung definierter Signalketten in eukaryotischen Zelllinien produziert wurden.
Die hier etablierten Expressions- und Reinigungsverfahren liefern zuverlässig hohe Ausbeuten an intaktem und funktionellem Protein. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung auch ein Herstellungsverfahren für fluoreszenzbasierte Sensorproteine, wie z. B. das Epac1-camps-His Protein und das auf diese Weise hergestellte fluoreszenzbasierte Sensorprotein selbst, insbesondere das Epad -camps-His Protein. Das Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzbasierten Sensorproteinen, insbesondere Epad -camps-His Protein, ist dabei gekennzeichnet durch die Schritte:
- Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mit tag, insbesondere hexa-Histidin tag, in einen Expressionsvektor, - Expression des fluoreszenzbasierten Sensorproteins, insbesondere des E- pac1-camps-His Protein in einem Bakterium,
- Reinigung durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch eine Ni- NTA Affinitätschromatographie,
- Optional weitere Reinigung durch Größenausschlusschromatographie. Hierdurch wird das fluoreszenzbasierte Sensorprotein bereitgestellt, insbesondere das Epad-camps-His Protein.
Das Protein kann überraschend über viele Wochen stabil z. B. bei 4°C gelagert werden. Das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kann getrocknet oder in Lagerungspuffer ohne eine Modifikation des Puffers z. B. mit Glycerol oder anderen Stoffen gelagert werden.
Das Epad-camps-His Protein zeigt bei einer Zugabe von cAMP eine konzentrationsabhängige und saturierbare Abnahme des FRET-Signals. Die Änderung der optischen Eigenschaften kann in Küvettenmessungen oder auch in Fluoreszenzlesegeräten in Multiwellschalen registriert werden. Grundsätzlich kann aber jedes geeig- nete und auslesbare Behältnis gewählt werden.
Es wurde festgestellt, dass das auf diese Weise hergestellte Epad-camps-His Protein unterschiedliche Pufferbedingungen problemlos toleriert. Verschiedene Salz- und pH-Bedingungen beeinflussen die Messergebnisse nicht. Die dargestellte Sensi- tivität und Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Messverfahrens kann dabei mit kommerziell erhältlichen, fluoreszenzbasierten cAMP Bestimmungskits uneingeschränkt konkurrieren.
Damit wird erstmals ein kostengünstiges, schnell durchführbares, zuverlässiges, unkompliziertes, hochsensitives und aus wenigen Komponenten bestehendes Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung bereit gestellt, das bzw. die gegenüber verfügbaren kommerziell erhältlichen Verfahren und Vorrichtungen hinsichtlich der Kosten, der Schnelligkeit, der Robustheit und der Nutzerfreundlichkeit überlegen sind und hinsichtlich der Sensitivität uneingeschränkt konkurrenzfähig oder sogar besser sind.
Ausführungsbeispiele
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Beschränkung der Erfindung auf cAMP als sekundärer Botenstoff und Epac1-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein kommen soll.
Es zeigen:
Figur 1 : SDS-PAGE des über Ni-NTA gereinigten Epad -camps-His Proteins. Das bakteriell überexprimierte Protein wurde mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie angereichert. Aliquots von je 8 μΙ einzelner Fraktionen wurden auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE; 12.5%) aufgetrennt und die Proteine mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt. Die Größen der Referenzproteine des Markers sind links angegeben. CE = Rohextrakt; FT = Durchlauf; W = Waschfraktion; E = Eluat
Figur 2A: Absorptionsprofil der Größenausschlusschromatographie des Epad - camps-His Proteins bei 280 nm. Die Eluatfraktionen sind nummeriert und das Elutionsvolumen ist angeben (ml). Die Absorption ist auf der y-Achse angegeben (mAU).
Figur 2B: SDS-PAGE ausgewählter Fraktionen der größenausschlusschromatogra- phischen Reinigung des Epad -camps-His Proteins. Spur 1 :„PageRuler Plus Prestained"; Spur 2: Fraktion 6; Spur 3: Fraktion 20; Spur 4: Fraktion 22; Spur 5: Fraktion 24; Spur 6: Fraktion 26; Spur 7: Fraktion 28; Spur 8: Fraktion 30; Spur 9: Fraktion 32; Spur 10: Fraktion 34; Spur 1 1 :„Pa- geRuler Plus Prestained"; Spur 2: Fraktion 36; Spur 3: Fraktion 38; Spur 14: Fraktion 40; Spur 15: Fraktion 42; Spur 16: Fraktion 44; Spur 17: Fraktion 55; Spur 18: Fraktion 77
Figur 3: Erstellung einer Konzentrations-Wirkungskurve zur Kalibrierung des
Messverfahrens mit Epad-camps-His und definierten Konzentrationen von cAMP.
Figur 4: Erstellung einer Konzentrations-Wirkungskurve für die Octopamin- abhängige Aktivierung des DmOctßRI in einer Zelllinie, die das Rezeptorprotein konstitutiv exprimiert. Die Aktivierung des Rezeptors mit Octopa- min führt G-Protein-vermittelt zur Stimulierung zelleigener Adenylyl Zykla- sen (AC), die aus ATP den sekundären Botenstoff cAMP synthetisieren. Es wurden Zellextrakte hergestellt und das darin enthaltene cAMP wurde in einer 96er Multiwellschale mit vorgelegtem Epad-camps-His bestimmt. Für die Auswertung wurde die in der Figur 3 gezeigte Kalibrierung verwendet. Der EC50 Wert für Octopamin von 2.475 10"8 M stimmt sehr gut mit den Werten überein, die bei Verwendung kommerzieller cAMP Detek- tionsassays erhalten werden.
Figur 5: Schematischer Mechanismus des cAMP Stoffwechsels (Erzeugung und
Abbau) in Zellen und Anwendungen des Verfahrens.
Für die Durchführung der Experimente wurden mehrere molekularbiologische und biochemische Verfahren durchgeführt.
1 ) Klonierung und Bereitstellung der für Epad-camps kodierenden DNA in einem bakteriellen Expressionsvektor
Die DNA, die für das Sensorprotein (AF103905) kodiert plus der entsprechenden Sequenzen für die fluoreszenzbasierten Anteile für eCFP und eYFP, wurde zunächst in den bakteriellen Expressionsvektor pET11 a (Novagen, Merck/Millipore) kloniert. Hierzu wurde die cDNA in zwei Schritten mittels PCR amplifiziert. An das 3' Ende des Konstrukts wurde eine Sequenz angefügt, die für sechs Histidine (6 x His) kodiert, über die das Protein aufgereinigt werden kann. Die PCR Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen Ndel und Xbal sowie Xbal und BamHI geschnitten, gereinigt und dann in den Ndel und BamHI geschnittenen pET1 1a Vektor ligiert. Nach der Aufreinigung der Plasmid DNA wurde die Nukleinsäuresequenz auf Vollständigkeit und Richtigkeit durch Sequenzierung überprüft.
2) Expression des Epad-camps-His Proteins in Bakterien
Die Expression des Sensorproteins wurde hinsichtlich der Ausbeute und Stabilität in verschiedenen Bakterienstämmen, bei verschiedenen Wachstumsbedingungen (Temperatur, Zeit) sowie Induktionsbedingungen (Konzentration des IPTG; induziert die Expression des Gens) optimiert. Die besten Ergebnisse wurden mit folgenden Konditionen erzielt:
Expression in E.coli BL21 (DE3)-CodonPlusRIL (Stratagene), Anzucht bis zu einer OD von 0,4 - 0,6 bei 37°C, Induktion der Genexpression mit 1 mM Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG), fortführen der Inkubation bei 30°C über Nacht (ca. 20 Std.).
3) Reinigung des Epad-camps-His Proteins mittels Ni-NTA Affinitätschromatographie
Die Bakterien wurden nach der über Nacht Inkubation, siehe 2), geerntet. Das E. coli- Zellpellet wurde in 15 ml Lysis- und Äquilibrierungspuffer (Puffer A; 50 mM Na2PO4, 300 mM NaCI, 20 mM Imidazol) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 12 ml Puffer A resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde mit 1 mg/ml Lysozym versetzt und für 30 Min. auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde sonifiziert (18 x 20 s, Sonifier W-450 D, Branson Sonic Power Company) und dann zentrifugiert (3-16K, Sigma, 5.500 x g, 4 °C, -60 Min). Der Überstand enthielt das rekombinante Protein.
Zur Isolierung des Fusionsproteins wurde Ni-NTA Agarose verwendet (Macherey und Nagel, Düren). Die Histidine (6 x His), die an das Epad -camps-His Protein angefügt sind, können stabile Chelat-Komplexe mit den an der Matrix immobilisierten Ni2+- lonen bilden. Dadurch wird das Zielprotein durch die Ni-NTA Agarose zurückgehal- ten. Das Protein wurde sodann im Batch-Verfahren angereichert: 1 ml Ni-NTA Agarose wurde hierzu in einem 50 ml Reaktionsgefäß zwei Mal mit 10 Säulenvolumen (SV) Puffer A äquilibriert. Die Matrix wurde durch Zentrifugation pelletiert (3-16K, Sigma, 500 x g, 4 °C, 5 min). Anschließend wurde das Zelllysat zu der Agarose gegeben, vorsichtig gemischt und für 30 - 60 min bei 4 °C geschwenkt (Mini Rocker-Shaker, Biosan, Riga, Lettland). Nachdem der Überstand von der Matrix getrennt wurde (3- 16K, Sigma, 500 x g, 4 °C, 5 min), wurde das an die Ni-NTA Agarose gebundene Protein zwei Mal mit jeweils 20 SV Waschpuffer (Puffer B; 50 mM Na2P04, 300 mM NaCI, 30 mM Imidazol) gewaschen. Nach dem zweiten Waschschritt wurde die Mat- rix in 5 ml Puffer B resuspendiert und in eine Einmalsäule (Poly-Prep® Chromato- graphy Columns, Biorad, München) überführt. Das rekombinante Protein wurde schließlich mit Elutionspuffer (Puffer E; 50 mM Na2P04, 300 mM NaCI, 150 mM Imidazol) in 500 μΙ Schritten eluiert. Die Anreicherung des Proteins wurde dokumentiert, indem Aliquots einzelner Fraktionen in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und die Proteine anschließend mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt wurden (Figur 1). Fraktionen, die die größte Menge des eluierten Proteins enthielten wurden vereinigt und über ein 1 ml Amicon Ultra Zentrifugationsfilter (Merck/Millipore; cut off 50.000) nach Herstellerangaben aufkonzentriert.
4) Größenausschlusschromatoqraphie Die affinitätschromatographisch (Ni-NTA) und aufkonzentrierten Proteine wurden durch eine Größenausschlusschromatographie (ÄKTA) ihrer Größe nach aufgetrennt. Hierzu wurde eine HiLoad 16/600 Superdex 200 Säule (GE Healthcare) und ein ÄKTA Chromatographiesystem (GE Healthcare) benutzt. Vor der Chromatographie wurde die Säule mit zwei SV H20 gewaschen und anschließend mit 2 SV Laufpuffer (LP; 150 mM NaCI, 50 mM Tris/HCI pH 7,4) äquilibriert. Die Chromatographie der Proteine erfolgte bei einer Flussrate von 1 ml/Min. Es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Aliquots einzelner Fraktionen wurden in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und die Proteine anschließend mit Coomassie Brilliant Blau angefärbt (Figur 2). Fraktionen, die das gewünschte monomere Protein enthielten, wurden vereinigt und wie unter 3) beschrieben aufkonzentriert. Einzelne Aliquots wurden in N2 flüssig schockgefroren und bis zur ihrer Verwendung bei -80°C gelagert.
5) Verwendung des gereinigten Epad -camps-His Proteins in Multiwellschalen als Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, insbesondere der Quantifizierung von cAMP Stoff mengen
Die Fluoreszenzänderung des Sensorproteins nach Zugabe des sekundären Botenstoffs cAMP wurde mit einem Fluoreszenzlesegerät (Fluostar Omega; BMG
LABTECH, Ortenberg) gemessen. Die gereinigten Proteine wurden in IC-Puffer (135 mM Kaliumgluconat, 12 mM NaHC03, 4 mM KCl, 0,8 mM MgCI2, pH 7,4) auf eine definierte Konzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Von der Lösung wurden je 90 μΙ in die einzelnen Vertiefungen einer 96er Multiwellschale pipettiert. Zunächst wurde die Grundfluoreszenz in den einzelnen Vertiefungen gemessen. Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe des Botenstoffs cAMP erstellt und die Proteinlösungen mit jeweils 10 μΙ dieser cAMP Lösungen versetzt. Das Epad -camps-His Protein wurde mit einer Wellenlänge von 430 nm angeregt und die Emission bei 475 nm (CFP) und 530 nm (YFP) gemessen. Jede Messung bestand aus fünf bis fünfzehn Zyklen. Das Verhältnis der Emissionswerte YFP/CFP (R) in jeder Vertiefung wurde auf das Verhältnis der Basalfluoreszenz (R0) normiert und gegen die verwendete cAMP Kon- zentration aufgetragen. Es resultiert eine Konzentrations-Wirkungskurve aus der der Wert für die halbmaximale Antwort (EC50) bestimmt werden kann. Die Auswertung und graphische Darstellung wurde mit dem Programm GraphPad Prism 5.04
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Eine Messung, wie sie hier beschrieben ist, wurde als Referenzmessung verwendet, um eine Kalibrierung zu erstellen (Figur 3), wenn Proben aus Zell- oder Gewebelysaten eingesetzt wurden, um darin die cAMP Stoffmengen zu bestimmen.
Das oben beschriebene Messverfahren wurde an Proben validiert, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration durch die Aktivierung von Membranrezeptoren mit Konzentrationsreihen spezifischer Liganden gezielt erhöht wurde.
Es wurde eine Zelllinie verwendet, in der ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) von Drosophila melanogaster (DmOA2; heute DmOctßRI ) konstitutiv expri- miert wird (Balfanz et al., 2005). Dieser Rezeptor wird durch das biogene Amin Oc- topamin' spezifisch aktiviert und löst intrazellulär eine Reaktionskaskade aus, an deren Ende cAMP produziert wird. Zellen dieser Zelllinie wurden in 24er Multiwell- schalen ausgesät und bis zu einer Dichte von ca. 240.000 vermehrt. Die Zellen wur- den zwei Mal mit PBS-Puffer gewaschen, der 100 μΜ Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid (IPTG) enthielt. Die Inkubation mit verschiedenen Octopamin Konzentrationen wurde in PBS/IBMX Puffer für 30 Min bei 37°C durchgeführt. Die Inkubationslösung wurde abgenommen und die Zellen durch Zugabe von 200 μΙ eiskaltem Ethanol lysiert. Die Zelllysate wurden im Vakuum getrocknet und bis zur ihrer Verwendung bei -20°C aufbewahrt. Die getrockneten Proben wurden mit IC
Puffer solubilisiert und zu dem in der Multiwellschale vorgelegten Epad-camps-His Protein pipettiert. Nach ca. 20 Minuten wurde die Fluoreszenzänderung des Sensors im Fluoreszenzlesegerät gemessen und die Konzentrations-Wirkungskurve berechnet (Figur 4). Es wird deutlich, dass damit ein kostengünstiges und schnell durchführbares, zuverlässiges, unkompliziertes, hochsensitives und aus wenigen Komponenten bestehendes Messverfahren und eine entsprechende Vorrichtung erstmals bereitgestellt wird. Diese sind gegenüber verfügbaren kommerziell erhältlichen Verfahren hinsichtlich der Kosten, Schnelligkeit, Robustheit und Nutzerfreundlichkeit überlegen und hin- sichtlich der Sensitivität uneingeschränkt konkurrenzfähig.
Das Messverfahren ist dabei universell für alle zell- sowie gewebebasierten Proben geeignet, bei denen die intrazelluläre cAMP Konzentration verändert wird, wie Auszugsweise in der Figur 5 dargestellt wird.
Diese ermöglichen neben Octopamin Rezeptoren viele weitere GPCR, die durch biogene Amine, wie z.B. Dopamin, Serotonin, Adrenalin, Noradrenalin und Histamin oder auch Peptide stimuliert werden. Eine Erhöhung der intrazellulären cAMP Konzentration kann aber auch über die direkte Stimulierung zelleigener sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachter Adenylyl Zyklasen z.B. über Forskolin sowie über die Inhibition zelleigener sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachter Phosphodiestera- sen (PDE), die das cAMP zu AMP hydrolysieren, z.B. durch IBMX erfolgen. Das Messverfahren ist weiterhin dazu geeignet, die Abnahme der intrazellulären cAMP Konzentration zu detektieren, die entweder durch die Stimulierung spezifischer GPCR erfolgt, die zelleigene sowie zusätzlich in die Zellen eingebrachte Adenylyl Zyklasen inhibieren oder aber Substanzen, die zu einer Erhöhung der PDE Aktivität führen. Das Verfahren ist somit geeignet cAMP Mengen zu quantifizieren, die beispielhaft durch die Stimulierung von Rezeptoren (GPCR la) erzeugt werden, welche ihrerseits Adenylyl Zyklasen (AC; II) aktivieren. Es resultiert ein Anstieg der cAMP Konzentration.
Das Verfahren ist nicht auf diesen Signalweg beschränkt. Auch die Abnahme der intrazellulären cAMP Konzentration kann erfasst werden, wie sie beispielhaft nach der Aktivierung von GPCR (Ib) erfolgt, die Adenylyl Zyklasen (AC; II) inhibieren und zu einer Abnahme der cAMP Konzentration führen.
Weiterhin können Änderungen der cAMP Konzentration quantifiziert werden, die beispielhaft aus einer direkten Aktivierung (= Zunahme des cAMP) oder Inaktivierung (= Abnahme des cAMP) von Adenylyl Zyklasen (AC; II) resultieren oder auch solche Änderungen, die beispielhaft aus einer direkten Aktivierung (= Abnahme des cAMP) oder Inaktivierung (= Zunahme des cAMP) von Phosphodiesterasen (PDE; III) resultieren.
Es ist denkbar, das erfindungsgemäße Nachweisverfahren in umgekehrter Reihen- folge durchzuführen. Dann werden zuerst der sekundäre Botenstoff und sodann das fluoreszenzbasierte Sensorprotein in definierter Konzentration zum Behältnis hinzugegeben.
L i t e r a t u r
Nikolaev, V.O., Bünemann, M., Hein, L, Hannawacker, A., and Lohse, M.J. (2004). Novel Single chain cAMP sensors for receptor-induced Signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218; doi 10.1074/jbc.C400302200 Balfanz, S., Strünker, T., Frings, S. and Baumann, A. (2005). A family of octopamine receptors that specifically induce cyclic AMP production or Ca2+ release in Drosophi- la melanogaster. J. Neurochem. 93, 440-451.
Nikolaev, V.O., Gambaryan, S., Lohse, M.J. (2006)Fluoresscent sensors for rapid monitoring of intracellular cGMP. Nature Methods 3, 23-25; doi: 10.1038/nmeth 816 Tanimura, A., Nezu, A., Morita, T., Turner, R.J. and Tojyo, Y. (2004) Fluorescent biosensors for quantitative real-time measurements of insositol 1 ,4,5-trisphosphate in Single living cells. J. Biol. Chem. 279, 38095-38098; doi 10.1074/jbc.C400312200
Tanimura, A., Morita, T., Nezu, A., Shitara, A., Hashimoto, N., and Tojyo, Y. (2009) Use of fluorescence resonance energy transfer-based biosensors for the quantitative analysis of insositol 1 ,4,5-trisphosphate dynamics in calcium oscillations. J. Biol. Chem. 284 (13), 8910-8917; doi 10.1074/jbc.M80586200

Claims

Pate nta nsp rü che
1. Verfahren zum Nachweis sekundärer Botenstoffe
gekennzeichnet durch die Schritte:
- Zugabe eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins in ein Behältnis,
- Messung der Grundfluoreszenz ohne den sekundären Botenstoff,
- Zugabe des sekundären Botenstoffs zum Behältnis,
- Messung der Fluoreszenzänderung zum Nachweis des sekundären Botenstoffs.
2. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
gekennzeichnet durch
die Wahl einer Multiwellschale als Behältnis, in deren Vertiefungen das fluoreszenzbasierte Sensorprotein angeordnet vorliegt.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
gekennzeichnet durch
die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mittag, insbesondere hexa-Histidin tag, in einen Expressionsvektor erhalten wurde.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
gekennzeichnet durch
die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch die Expression in einem Bakterium erhalten wurde.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
gekennzeichnet durch
die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch eine Reinigung durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch eine Ni-NTA Affinitätschromatographie, erhalten wurde.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
geken nzeich net d u rch
die Wahl eines fluoreszenzbasierten Sensorproteins, welches durch eine Reinigung durch Größenausschlusschromatographie erhalten wurde.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
gekennzeich net d u rch
die Wahl von Epad-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein.
8. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
geken nzeichnet d u rch
die Wahl von cAMP als sekundärer Botenstoff.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch geken nzeich net, dass
eine Konzentrationsbestimmung des sekundären Botenstoffs über bis zu vier Größenordnungen erfolgen kann.
1 0. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend
ein Behältnis, insbesondere eine Multiwellschale mit in den Vertiefungen vorliegendem fluoreszenzbasierten Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem Epad-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein.
11. Kit u mfassend ,
- ein Behältnis, insbesondere eine Multiwellschale mit in den Vertiefungen vorliegendem fluoreszenzbasierten Sensorprotein, insbesondere getrocknetem und/oder immobilisiertem Epad-camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein;
- sekundärer Botenstoff, insbesondere cAMP.
12. Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzbasierten Sensorprotein
gekennzeichnet durch die Schritte:
- Klonierung und Bereitstellen der für das fluoreszenzbasierte Sensorprotein kodierenden DNA mit tag, insbesondere hexa-Histidin tag, in einen Expres- sionsvektor,
- Expression des fluoreszenzbasierten Sensorproteins in einem Bakterium,
- Reinigung durch Affinitätschromatographie, insbesondere durch eine Ni- NTA Affinitätschromatographie,
- Optional weitere Reinigung durch eine Größenausschlusschromatographie.
13. Verfahren nach vorherigem Anspruch,
gekennzeich net d u rch
die Wahl von Epac1 -camps-His Protein als fluoreszenzbasiertes Sensorprotein.
14. Fluoreszenzbasiertes Sensorprotein, hergestellt nach einem der vorherigen zwei Ansprüche.
15. Fluoreszenzbasiertes Sensorprotein,
gekennzeich net d u rch
Epad-camps-His Protein.
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